CN112444544A - 一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体公开了一种基于羧基化纳米氧化锌的检测甘油的酶生物传感器及其制备方法与应用。所述酶生物传感器采用经典的三电极体系，其中工作电极上固化特定的物质识别膜，所述物质识别膜主要由羧基化氧化锌材料层、甘油激酶溶液、甘油三磷酸氧化酶溶液及壳聚糖溶液混合制备而成，将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测甘油的酶生物传感器。本发明所得检测甘油的酶生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度，具有良好的选择性、重现性和稳定性。

Description

一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于羧基化纳米氧化锌的检测甘油的酶生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
甘油，也称为1,2,3-丙三醇，是葡萄酒发酵早期的主要副产物之一。由于其具有甜度和粘度，一定量的甘油可以减弱酒的苦味，使葡萄酒口感圆润，是评价葡萄酒质量的重要指标之一。在葡萄酒的正常发酵过程中，其产生的甘油含量通常为4～15g/L，甘酒比为6％～10％。为了牟取更多利润，一些不法商家可能会在勾兑葡萄酒中加入甘油，以提高葡萄酒的口感，这在我国和其它国家都是严厉禁止的。目前，检测甘油的方法有：高效液相色谱、气相色谱、分光光度法、电化学方法等。传统测定方法所用仪器复杂、检测时间久、选择性较低、费用较高、干扰较多。而电化学方法具有检测简单、快捷、成本低、灵敏度高、检测结果准确等优点。因此，开发简便、快速、低成本和高灵敏的测定甘油含量的电化学传感器具有重要意义。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，其具有良好的选择性、灵敏度和稳定性；
本发明的另一目的在于提供一种上述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法；
本发明的再一目的在于提供上述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在甘油检测中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，由参比电极、对电极和基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极组成；
所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂电极。
所述基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成；其中，所述物质识别膜主要由羧基化氧化锌材料层(c-ZnO)、甘油激酶水溶液(GK)、甘油三磷酸氧化酶水溶液(GPO)及壳聚糖乙酸溶液(CHIT)混合制备而成；所述工作电极优选为金电极。
优选地，所述的羧基化纳米氧化锌材料的制备过程如下：
将氧化锌前驱体煅烧后制备得到纳米氧化锌，然后通过自由基聚合制备羧基化纳米氧化锌材料。
其中，所述氧化锌前驱体制备方法为：将(NH4)2CO3水溶液加入ZnSO4水溶液中得到混合溶液，然后加热反应，反应完成后纯化干燥得到氧化锌前驱体。
氧化锌前驱体制备过程中，所述(NH4)2CO3水溶液和ZnSO4水溶液的浓度独立地为0.5～5mol/L，所述(NH4)2CO3水溶液和ZnSO4水溶液的用量满足所得混合溶液的pH＝7～9，优选为pH＝8；
氧化锌前驱体制备过程中，所述加热反应为在55～70℃反应0.5～2h，优选为在60℃反应1h；所述纯化为反应完成后，用水反复洗涤抽滤反应液，直到滤液中检测不到SO4 2-为止(用BaCl2检验)；所述干燥为将所得到的白色产物置于90～120℃真空干燥箱中干燥8～12h。
其中，所述煅烧为在400～600℃高温管式炉中煅烧1～5h；煅烧温度优选为500℃。
其中，所述自由基聚合具体为：将所述纳米氧化锌与水混合均匀后，将所得纳米氧化锌分散液调节至酸性，再加入乙烯基三乙氧基硅烷进行加热反应，反应完成后加入甲基丙烯酸和引发剂水溶液，在相同的温度下继续反应，反应完成后将反应液纯化干燥得到羧基化纳米氧化锌材料。
自由基聚合中，所述纳米氧化锌、水和乙烯基三乙氧基硅烷的质量比为1～5：50～65：0.5～2；优选为2.5:60:1.25。所述乙烯基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸与引发剂的质量比为0.75～2.5：1～10：0.5～1.5；优选为1.25：5：0.91。所述引发剂水溶液的浓度为0.01～1.5g/mL，优选为0.1g/mL；所述引发剂由质量比0.5～0.9：0.09～0.32的过硫酸铵和亚硫酸氢钠组成，质量比优选为0.73:0.18。
自由基聚合中，所述混合均匀为超声分散3～5小时；所述酸性为pH＝5.5～6.7，优选为pH＝6.5；所述加热反应的温度为70～95℃，时间为0.5～4h；优选地，所述反应温度为85℃，时间为2h。所述继续反应的时间为1～5h，优选为3.5h；所述纯化为待反应液冷却至室温后，用水离心洗涤，冷冻干燥后制得羧基化纳米氧化锌材料。
一种上述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将壳聚糖乙酸溶液、氯化钾水溶液混合均匀得复合溶液A；将羧基化纳米氧化锌材料分散水溶液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液、N-羟基丁二酰亚胺水溶液混合均匀得复合溶液B；将复合溶液A和复合溶液B混合均匀得复合溶液C；
(2)将基底电极放入复合溶液A进行电聚合；然后再放入复合溶液C中进行电聚合；
(3)将甘油激酶水溶液、甘油三磷酸氧化酶水溶液混合均匀得复合溶液D；然后将复合溶液D涂覆于步骤(2)的电极上表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极；
(4)将基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述的甘油酶生物传感器。
优选地，步骤(1)中所述壳聚糖乙酸溶液的浓度为0.5～3％，氯化钾水溶液的浓度为0.5～2g/L；所述壳聚糖乙酸溶液和氯化钾水溶液的体积比为1：100～150，优选为1:125。
优选地，步骤(1)中所述羧基化纳米氧化锌材料分散液的浓度为2～25mg/mL、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液的浓度为0.1～1mol/L、N-羟基丁二酰亚胺水溶液的浓度为0.1～1mol/L。
优选地，步骤(1)中所述羧基化纳米氧化锌材料分散液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液、N-羟基丁二酰亚胺水溶液的体积比为1～5：10～20：1～8，优选为2:15:5，复合溶液B的pH为5.0～6.0。
优选地，步骤(1)中所述复合溶液A和复合溶液B的体积比为1：5～20，优选为1:10。
优选地，步骤(2)中所述的基底电极表面需要进行预处理，具体过程如下：a、将基底电极的表面依次用直径为0.2～0.4μm和0.02～0.07μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，室温晾干；b、将上述步骤所得电极置于1mol/L H2SO4溶液中进行极化处理，并用水洗净电极表面；随后置于铁氰化钾溶液中进行电极检测；更优选地，所述铁氰化钾溶液的溶质为5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl。
优选地，步骤(2)中所述基底电极在复合溶液A的电聚合时间为1～10min，所述基底电极在复合溶液C的电聚合时间为10～50min。
优选地，步骤(3)中所述甘油激酶水溶液中酶含量为2U～15U，所述甘油三磷酸氧化酶水溶液的酶含量为2U～15U，所述两种酶溶液是采用磷酸盐缓冲溶液配制的(pH 7.0，0.1mol/L)。
优选地，步骤(3)中所述甘油激酶水溶液与甘油三磷酸氧化酶水溶液的体积比为0.2～5：0.2～5；优选为1:1。
优选地，步骤(3)中所述复合溶液D的用量满足每7mm2滴加3～10μL复合溶液D。
上述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在甘油定量检测中的应用。
本发明的原理：
本发明首先是制备纳米氧化锌材料，随后进行羧基化处理引入羧基基团，进而增强材料在电极表面的固定性以及对酶的吸附性和稳定性。然后，利用壳聚糖的成膜性和结构自带的氨基基团，有力增加材料在电极表面的固定量和稳定性，以利于后续酶的结合与固定；再通过电流的作用下，使壳聚糖在电极表面聚合成均匀平整的膜并与材料共价结合；最后，将酶溶液滴于已修饰材料的工作电极上，使酶与材料共价结合，以利于对底物的催化；再利用所述的修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成三电极体系，制得一种新型的检测甘油的酶生物传感器。
本发明将羧基化纳米氧化锌材料应用于酶生物传感器，制备得到的检测甘油的传感器检测性能良好，检测范围为2.5×10-5～6×10-2mol/L，线性方程为I(μA)＝39.719+1.0808C(mmol/L)，相关系数为R2＝0.9985。检测限为1.11×10-4mol/L，灵敏度为15.44mAmol-1cm-2。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明所述的检测甘油的酶生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度。
(2)本发明所述的检测甘油的生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对甘油进行准确检测，抗干扰能力强。
(3)本发明所述的检测甘油的酶生物传感器可用于葡萄酒中甘油的检测，制备简单，具有较宽的检测范围，较低的检测限，反应在室温中性环境下进行，性能稳定，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中经不同电聚合时间所得羧基化纳米氧化锌材料制备的甘油酶修饰电极在铁氰化钾溶液中的交流阻抗图谱。
图2为实施例2中制备的基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在磷酸盐缓冲溶液中加入不同浓度的甘油后的电流-时间曲线图。
图3为实施例2中制备的基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在磷酸盐缓冲溶液中加入不同浓度的甘油后产生的响应电流与不同浓度甘油之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中所用纳米氧化锌的制备如下：
(1)将1mol/L的(NH4)2CO3溶液逐滴滴加到1mol/L的ZnSO4溶液中，边滴边搅拌至pH＝8，随后60℃水浴加热反应1h；
(2)反应完成后，用蒸馏水反复洗涤抽滤反应液，直到滤液中检测不到SO4 2-为止(用BaCl2检验)；
(3)将所得到的白色产物置于110℃真空干燥箱中干燥10h，制得氧化锌前驱体；
(4)将所得氧化锌前驱体置于500℃高温管式炉中煅烧2h，即可制得纳米氧化锌材料。
实施例1
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g纳米氧化锌于锥形瓶中，加入60g蒸馏水超声分散4小时；分散结束后，将得到的氧化锌分散液pH调节为6.5，倒入装有搅拌和冷凝回流装置的三口烧瓶中，随后加入1.25g乙烯基三乙氧基硅烷，在85℃温度下水浴加热反应2h；再往三口烧瓶分3次加入5g的甲基丙烯酸和引发剂水溶液(分别用10倍质量的蒸馏水溶解0.73g过硫酸铵和0.18g亚硫酸氢钠)，在85℃温度下继续水浴反应3.5h；反应结束后，待溶液冷却至室温，用蒸馏水离心洗涤3次，冷冻干燥24h后制得羧基化纳米氧化锌材料。
(2)将直径为3mm的金电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，取出用蒸馏水洗净；再于10mL的1mol/L H2SO4溶液中在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定，随后在-0.1V下极化3min，最后在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定以完成金电极极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极检测，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的金电极。
(3)将浓度为1wt％的壳聚糖溶液、浓度为1g/L的氯化钾溶液以1:125体积比混合均匀得到复合溶液A；将步骤(2)中的金电极放入复合溶液A在-1.5V下采用恒电位法电聚合3min，制得壳聚糖修饰电极。
(4)将羧基化纳米氧化锌材料分散为浓度为2.5mg/mL的水溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为0.2mol/L，将三种溶液以2:15:5体积比混合均匀得到复合溶液B并调节pH为6.0；随后将复合溶液A和复合溶液B以1:10体积比混合均匀得到复合溶液C；再将步骤(3)制得的电极放入复合溶液C在-1.5V下采用恒电位法电聚合15min，制得羧基化纳米氧化锌材料修饰电极。
(5)采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油激酶溶液，采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油三磷酸氧化酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合均匀得到复合溶液D。
(6)取5μL复合溶液D涂覆到步骤(4)制得的电极表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极。
(7)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
将所述检测甘油的酶生物传感器在室温下进行电化学试验，在10mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)或铁氰化钾溶液(10mmol/L K4Fe(CN)6+10mmol/L K3Fe(CN)6+0.1mol/L KCl)中进行测试，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法、计时电流法和交流阻抗法。其中空白对照未滴加甘油溶液，测试稳定后依次滴加10μL甘油溶液。
本实施例在甘油浓度为10mmol/L时，测试的氧化峰催化电流为47.42μA。
实施例2
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g纳米氧化锌于锥形瓶中，加入60g蒸馏水超声分散4小时；分散结束后，将得到的氧化锌分散液pH调节为6.5，倒入装有搅拌和冷凝回流装置的三口烧瓶中，随后加入1.25g乙烯基三乙氧基硅烷，在85℃温度下水浴加热反应2h；再往三口烧瓶分3次加入5g的甲基丙烯酸和引发剂水溶液(分别用10倍质量的蒸馏水溶解0.73g过硫酸铵和0.18g亚硫酸氢钠)，在85℃温度下继续水浴反应3.5h；反应结束后，待溶液冷却至室温，用蒸馏水离心洗涤3次，冷冻干燥24h后制得羧基化纳米氧化锌材料。
(2)将直径为3mm的金电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，取出用蒸馏水洗净；再置于10mL的1mol/L H2SO4溶液中在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定，随后在-0.1V下极化3min，最后在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定以完成金电极极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极检测，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的金电极。
(3)将浓度为1wt％的壳聚糖溶液、浓度为1g/L的氯化钾溶液以1:125体积比混合均匀得到复合溶液A；将步骤(2)中的金电极放入复合溶液A在-1.5V下采用恒电位法电聚合3min，制得壳聚糖修饰电极。
(4)将羧基化纳米氧化锌材料分散为浓度为5mg/mL的水溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为0.2mol/L，将三种溶液以2:15:5体积比混合均匀得到复合溶液B并调节pH为6.0；随后将复合溶液A和复合溶液B以1:10体积比混合均匀得到复合溶液C；再将步骤(3)制得的电极放入复合溶液C在-1.5V下采用恒电位法电聚合15min，制得羧基化纳米氧化锌材料修饰电极。
(5)采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油激酶溶液，采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油三磷酸氧化酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合均匀得到复合溶液D。
(6)取5μL复合溶液D滴加到步骤(4)制得的电极表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极。
(7)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
将所述检测甘油的酶生物传感器在室温下进行电化学试验，在10mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)或铁氰化钾溶液(10mmol/L K4Fe(CN)6+10mmol/L K3Fe(CN)6+0.1mol/L KCl)中进行测试，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法、计时电流法和交流阻抗法。其中空白对照未滴加甘油溶液，测试稳定后依次滴加10μL甘油溶液。
本实施例在甘油浓度为10mmol/L时，测试的氧化峰催化电流为48.3μA。
本实施例中不同羧基化纳米氧化锌电聚合时间制备的甘油酶修饰电极在铁氰化钾溶液中的所测得的交流阻抗图谱如图1所示。从图1可知，随着羧基化纳米氧化锌在复合溶液C中的电聚合时间的增加，修饰电极的阻抗先减小后增大，且在电聚合时间为15min时修饰电极的阻抗达到最小值，并与裸电极的阻抗大小相近。电聚合时间不足15min时，羧基化纳米氧化锌负载量不足，修饰电极的阻抗增大；当电聚合时间超过15min，羧基化纳米氧化锌负载量过多，修饰电极的阻抗增大。证明羧基化纳米氧化锌过于密集时易发生团聚，不利于促进电子的转移，弱化其导电性能。
图2是实施例2所得基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在0.1mo1/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，不断加入甘油得到的电流-时间曲线。其中，曲线从左到右依次对应的甘油浓度为0.01mmo1/L、0.02mmo1/L、0.025mmo1/L、0.05mmo1/L、2mmo1/L、4mmo1/L、6mmo1/L、8mmo1/L、10mmo1/L、20mmo1/L、30mmo1/L、40mmo1/L、50mmo1/L、60mmo1/L、70mmo1/L、80mmo1/L。说明了本发明利用了羧基化纳米氧化锌的载体特性和壳聚糖的成膜性，有力增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化。
本实施例制备的基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在磷酸盐缓冲溶液中滴加不同浓度的甘油后产生的响应电流与不同浓度甘油之间的线性关系图如图3所示。该修饰电极对底物检测范围为2.5×10-5～6×10-2mol/L，线性方程为I(μA)＝39.719+1.0808C(mmol/L)，相关系数为R2＝0.9985。检测限为1.11×10-4mol/L，灵敏度为15.44mAmol-1cm-2。
实施例3
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g纳米氧化锌于锥形瓶中，加入60g蒸馏水超声分散4小时；分散结束后，将得到的氧化锌分散液pH调节为6.5，倒入装有搅拌和冷凝回流装置的三口烧瓶中，随后加入1.25g乙烯基三乙氧基硅烷，在85℃温度下水浴加热反应2h；再往三口烧瓶分3次加入5g的甲基丙烯酸和引发剂水溶液(分别用10倍质量的蒸馏水溶解0.73g过硫酸铵和0.18g亚硫酸氢钠)，在85℃温度下继续水浴反应3.5h；反应结束后，待溶液冷却至室温，用蒸馏水离心洗涤3次，冷冻干燥24h后制得羧基化纳米氧化锌材料。
(2)将直径为3mm的金电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，取出用蒸馏水洗净；再置于10mL的1mol/L H2SO4溶液中在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定，随后在-0.1V下极化3min，最后在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定以完成金电极极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于10mL铁氰化钾水溶液中(5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极检测，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的金电极。
(3)将浓度为1wt％的壳聚糖溶液、浓度为1g/L的氯化钾溶液以1:125体积比混合均匀得到复合溶液A；将步骤(2)中的金电极放入复合溶液A在-1.5V下采用恒电位法电聚合3min，制得壳聚糖修饰电极。
(4)将羧基化纳米氧化锌材料分散为浓度为10mg/mL的水溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为0.2mol/L，将三种溶液以2:15:5体积比混合均匀得到复合溶液B并调节pH为6.0；随后将复合溶液A和复合溶液B以1:10体积比混合均匀得到复合溶液C；再将步骤(3)制得的电极放入复合溶液C在-1.5V下采用恒电位法电聚合15min，制得羧基化纳米氧化锌材料修饰电极。
(5)采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油激酶溶液，采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油三磷酸氧化酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合均匀得到复合溶液D。
(6)取5μL复合溶液D滴加到步骤(4)制得的电极表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极。
(7)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
将所述检测甘油的酶生物传感器在室温下进行电化学试验，在10mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)或铁氰化钾溶液(10mmol/L K4Fe(CN)6+10mmol/L K3Fe(CN)6+0.1mol/L KCl)中进行测试，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法、计时电流法和交流阻抗法。其中空白对照未滴加甘油溶液，测试稳定后依次滴加10μL甘油溶液。
本实施例在甘油浓度为10mmol/L时，测试的氧化峰催化电流为47.98μA。
实施例4
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g纳米氧化锌于锥形瓶中，加入60g蒸馏水超声分散4小时；分散结束后，将得到的氧化锌分散液pH调节为6.5，倒入装有搅拌和冷凝回流装置的三口烧瓶中，随后加入1.25g乙烯基三乙氧基硅烷，在85℃温度下水浴加热反应2h；再往三口烧瓶分3次加入5g的甲基丙烯酸和引发剂水溶液(分别用10倍质量的蒸馏水溶解0.73g过硫酸铵和0.18g亚硫酸氢钠)，在85℃温度下继续水浴反应3.5h；反应结束后，待溶液冷却至室温，用蒸馏水离心洗涤3次，冷冻干燥24h后制得羧基化纳米氧化锌材料。
(2)将直径为3mm的金电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，取出用蒸馏水洗净；再将上述步骤所得电极置于10mL的1mol/L H2SO4溶液中在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定，随后在-0.1V下极化3min，最后在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定以完成金电极极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极检测，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的金电极。
(3)将浓度为1wt％的壳聚糖溶液、浓度为1g/L的氯化钾溶液以1:125体积比混合均匀得到复合溶液A；将步骤(2)中的金电极放入复合溶液A在-1.5V下采用恒电位法电聚合3min，制得壳聚糖修饰电极。
(4)将羧基化纳米氧化锌材料分散为浓度为15mg/mL的水溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为0.2mol/L，将三种溶液以2:15:5体积比混合均匀得到复合溶液B并调节pH为6.0；随后将复合溶液A和复合溶液B以1:10体积比混合均匀得到复合溶液C；再将步骤(3)制得的电极放入复合溶液C在-1.5V下采用恒电位法电聚合15min，制得羧基化纳米氧化锌材料修饰电极。
(5)采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油激酶溶液，采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油三磷酸氧化酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合均匀得到复合溶液D。
(6)取5μL复合溶液D滴加到步骤(4)制得的电极表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极。
(7)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
将所述检测甘油的酶生物传感器在室温下进行电化学试验，在10mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)或铁氰化钾溶液(10mmol/L K4Fe(CN)6+10mmol/L K3Fe(CN)6+0.1mol/L KCl)中进行测试，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法、计时电流法和交流阻抗法。其中空白对照未滴加甘油溶液，测试稳定后依次滴加10μL甘油溶液。
本实施例在甘油浓度为10mmol/L时，测试的氧化峰催化电流为47.93μA。
实施例5
一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g纳米氧化锌于锥形瓶中，加入60g蒸馏水超声分散4小时；分散结束后，将得到的氧化锌分散液pH调节为6.5，倒入装有搅拌和冷凝回流装置的三口烧瓶中，随后加入1.25g乙烯基三乙氧基硅烷，在85℃温度下水浴加热反应2h；再往三口烧瓶分3次加入5g的甲基丙烯酸和引发剂水溶液(分别用10倍质量的蒸馏水溶解0.73g过硫酸铵和0.18g亚硫酸氢钠)，在85℃温度下继续水浴反应3.5h；反应结束后，待溶液冷却至室温，用蒸馏水离心洗涤3次，冷冻干燥24h后制得羧基化纳米氧化锌材料。
(2)将直径为3mm的金电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，取出用蒸馏水洗净；再将上述步骤所得电极置于10mL的1mol/LH2SO4溶液中在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定，随后在-0.1V下极化3min，最后在-0.1～1.2V下采用循环伏安法扫描至稳定以完成金电极极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K3Fe(CN)6+0.2mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极检测，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的金电极。
(3)将浓度为1wt％的壳聚糖溶液、浓度为1g/L的氯化钾溶液以1:125体积比混合均匀得到复合溶液A；将步骤(2)中的金电极放入复合溶液A在-1.5V下采用恒电位法电聚合3min，制得壳聚糖修饰电极。
(4)将羧基化纳米氧化锌材料分散为浓度为20mg/mL的水溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为0.2mol/L，将三种溶液以2:15:5体积比混合均匀得到复合溶液B并调节pH为6.0；随后将复合溶液A和复合溶液B以1:10体积比混合均匀得到复合溶液C；再将步骤(3)制得的电极放入复合溶液C在-1.5V下采用恒电位法电聚合15min，制得羧基化纳米氧化锌材料修饰电极。
(5)采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油激酶溶液，采用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)配制酶含量为7.5U的甘油三磷酸氧化酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合均匀得到复合溶液D。
(6)取5μL复合溶液D滴加到步骤(4)制得的电极表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极。
(7)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极)，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
将所述检测甘油的酶生物传感器在室温下进行电化学试验，在10mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.0)或铁氰化钾溶液(10mmol/L K4Fe(CN)6+10mmol/L K3Fe(CN)6+0.1mol/L KCl)中进行测试，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法、计时电流法和交流阻抗法。其中空白对照未滴加甘油溶液，测试稳定后依次滴加10μL甘油溶液。
本实施例在甘油浓度为10mmol/L时，测试的氧化峰催化电流为47.74μA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，由参比电极、对电极和基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极组成，其特征在于：
所述基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极组成由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中所述物质识别膜由羧基化纳米氧化锌材料层、甘油激酶溶液、甘油三磷酸氧化酶溶液及壳聚糖溶液混合制备而成。
2.根据权利要求1所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，其特征在于，所述羧基化纳米氧化锌材料的制备方法为：
将氧化锌前驱体煅烧后制备得到纳米氧化锌，然后通过自由基聚合制备羧基化纳米氧化锌材料；其中，
所述氧化锌前驱体制备方法为：将(NH4)2CO3水溶液加入ZnSO4水溶液中得到混合溶液，然后加热反应，反应完成后纯化干燥得到氧化锌前驱体；
所述煅烧为在400～600℃高温管式炉中煅烧1～5h；
所述自由基聚合具体为：将所述纳米氧化锌与水混合均匀后，将所得纳米氧化锌分散液调节至酸性，再加入乙烯基三乙氧基硅烷进行加热反应，反应完成后加入甲基丙烯酸和引发剂水溶液，在相同的温度下继续反应，反应完成后将反应液纯化干燥得到羧基化纳米氧化锌材料。
3.根据权利要求2所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，其特征在于所述氧化锌前驱体制备方法中：
所述(NH4)2CO3水溶液和ZnSO4水溶液的浓度独立地为0.5～5mol/L，所述(NH4)2CO3水溶液和ZnSO4水溶液的用量满足所得混合溶液的pH＝7～9；
所述加热反应为在55～70℃反应0.5～2h。
4.根据权利要求2所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器，其特征在于所述自由基聚合中：
所述纳米氧化锌、水和乙烯基三乙氧基硅烷的质量比为1～5：50～65：0.5～2；所述乙烯基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸与引发剂的质量比为0.75～2.5：1～10：0.5～1.5；所述引发剂水溶液的浓度为0.01～1.5g/mL；所述引发剂由质量比0.5～0.9：0.09～0.32的过硫酸铵和亚硫酸氢钠组成；
所述酸性为pH＝5.5～6.7；所述加热反应的温度为70～95℃，时间为0.5～4h；所述继续反应的时间为1～5h。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
(1)将壳聚糖乙酸溶液、氯化钾水溶液混合均匀得复合溶液A；将羧基化纳米氧化锌材料分散水溶液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液、N-羟基丁二酰亚胺水溶液混合均匀得复合溶液B；将复合溶液A和复合溶液B混合均匀得复合溶液C；
(2)将基底电极放入复合溶液A进行电聚合；然后再放入复合溶液C中进行电聚合；
(3)将甘油激酶水溶液、甘油三磷酸氧化酶水溶液混合均匀得复合溶液D；然后将复合溶液D涂覆于步骤(2)的电极上表面，室温晾干，得到基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极；
(4)将基于羧基化纳米氧化锌的酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测甘油的酶生物传感器。
6.根据权利要求5所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述壳聚糖乙酸溶液的浓度为0.5～3％，氯化钾水溶液的浓度为0.5～2g/L；所述壳聚糖乙酸溶液和氯化钾水溶液的体积比为1：100～150；
步骤(1)中所述羧基化纳米氧化锌材料分散液的浓度为2～25mg/mL、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液的浓度为0.1～1mol/L、N-羟基丁二酰亚胺水溶液的浓度为0.1～1mol/L；
步骤(1)中所述复合溶液A和复合溶液B的体积比为1：5～20。
7.根据权利要求5所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述基底电极在复合溶液A的电聚合时间为1～10min，所述基底电极在复合溶液C的电聚合时间为10～50min。
8.根据权利要求5所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述甘油激酶水溶液中酶含量为2U～15U，所述甘油三磷酸氧化酶溶液的酶含量为2U～15U；
步骤(3)中所述甘油激酶水溶液与甘油三磷酸氧化酶水溶液的体积比为0.2～5:0.2～5；
步骤(3)中所述复合溶液D的用量满足每7mm2滴加3～10μL复合溶液D。
9.根据权利要求5所述基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的基底电极表面需要进行预处理，具体过程如下：a、将基底电极的表面依次用直径为0.2～0.4μm和0.02～0.07μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗；然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，取出用蒸馏水洗净，室温晾干；b、将上述步骤所得电极置于1mol/L H2SO4溶液中进行极化处理，并用蒸馏水洗净电极表面；随后置于铁氰化钾溶液中进行电极检测。
10.权利要求1～4任一项所述的基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器在甘油定量检测中的应用。
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