JP5302993B2 - 標的細菌またはその標的糖質抗原成分の存在を検出する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、本出願の全てにおいて割り当てられた権利を有するバイナックス(Binax,Inc)社にその全てが割り当てられた、以下の米国特許出願の各々の一部継続出願である。
(1)1998年8月25日に出願された、米国特許出願第09/139,720号
(2)その一部継続出願を優先して現在放棄されている、1998年9月16日に出願された、米国特許出願第09/156,486号、
(3)1999年9月16日に出願された、米国特許出願第09/397,110号、
(4)米国特許出願第09/139,720号の一部継続出願として1999年12月10日に出願された、米国特許出願第09/458,998号。
本発明は、糖質抗原を有することにより特徴付けられる細菌によって引き起こされる細菌感染の、感受性および特異性の高い、迅速および正確な診断を達成することに関連する。特に、本発明は、そのような糖質抗原を本質的にタンパク質を含まない状態にまで初期精製し、続いてそのように精製された各糖質抗原を、該抗原に対する未処理の多価抗体をアフィニティー精製するために使用し、そのように精製された該抗体を、元の細菌の存在を検出するために、正確性、特異性および感受性の高い診断試験において使用することに関わる。
グラム陰性菌は、少なくとも1つのリポ多糖抗原または他のリポポリ糖質抗原を共通にもつ一方、グラム陽性菌は、リポテイコ酸またはテイコ酸またはそのいずれかの誘導体である、少なくとも1つの糖質抗原をもつ共通の特徴があることが知られている。グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両者の幾つかはまた、莢膜抗原である糖質抗原をも有する。即ち、これらの抗原は各々、その天然の状態において厚い莢膜層に封入されている。この莢膜層は、ほとんどの細菌の細菌細胞壁を取り囲む粘液様の物質を構成する。
(1)レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型1抗原は、疾患状態の早期に尿中に現れ、適切な治療を開始した後でさえも数日間残存する;
(2)試験用試料の採集は非侵襲的かつ簡単であり、患者には最小限の負担を生じ、および特別に訓練を受けた職員または特別に設計された機器を必要としない;および
(3)例えば痰由来の試料は、試料を得ることまたは培養することの困難、患者の鼻または咽喉において慢性的に存在するが、疾患の原因ではない細菌コロニーの潜在的な存在、および他の同様な困難によって、偽陰性または偽陽性の結果を与える可能性があるからである。
本発明は、液体、特にヒトまたは他の哺乳動物の体液、および特に尿中の、細菌の糖質抗原の存在を検出するための、特別に精製された、抗原特異性の高い新規の抗体に関する。
(a)本質的にタンパク質を含まない抗原、即ち、約10パーセントを超えないタンパク質を含む抗原を得るため、未処理の標的抗原を精製する段階、
(b)そのように精製された抗原を、共有結合によってスペーサー分子に結合する段階、
(c)スペーサー分子の遊離末端を、クロマトグラフィーカラムに充填したアフィニティーゲルに共有結合する段階、
(d)未処理の抗原に対する未処理の多価抗体を、カラムのゲルに通す段階、および
(e)精製抗体を溶出する段階。
本発明は、細菌感染の検出法における著しい進歩を示すものである。
インフルエンザb型菌(ATCC番号#10211)を、栄養分を補足したミュラーヒントン(Mueller Hinton)ブロスにおいて、37℃、5%CO2にて、撹拌せずに24時間増殖させた。
カゼインの酸水解物 17.5g
ウシ心臓抽出物 3.0g
デンプン 1.5g
以下のような栄養分も含まれた:
ヘマチン 15mg/ml
NAD(ニコチンアデニンジヌクレオチド)15mg/ml
酵母抽出物 5mg/ml
本混合物のpHは、25℃にて測定して7.3±0.1であった。
24時間後、1.82gの臭化セチルトリメチルアンモニウムCAS#57−09−0を30mlの蒸留水中で溶解し、500mlのブロスの上清に溶液を加え、最終濃度0.01Mの臭化セチルトリメチルアンモニウムを生じた。氷浴において撹拌しながら混合物を1時間インキュベートし、4℃において一晩インキュベートした。
5mgの凍結乾燥したインフルエンザb型菌多糖抗原を、4.52mlの蒸留水に溶解し、HClでpHを5〜6に調整した;pH 5〜6、15.64mgのウシ血清アルブミン−ヒドラジン結合体をその後加え、続いて3分間混合した。
ウサギ−α−インフルエンザb型菌血清に対し、最終濃度0.5M NaCl となるまでNaClを加え、血清中に溶解した。混合物を5,000×Gにて20分間遠心分離し、脱脂綿を通してろ過した。実施例3より得られたアフィニティーゲルを標準強のリン酸緩衝生理食塩水を用いて平衡化し、このゲルに血清ろ過物を4回アプライした。その後ゲルを3倍強のリン酸緩衝生理食塩水、続いて標準強のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、結合していない血清成分を除去した。
A.試験装置の準備
試験結果および対照結果の両方を見ることができる観察窓を備えた、蝶番のついた厚紙の構造物を含む試験装置を、図1にて示されるように用意した。装置には、その右側部分に、試料で湿らせたスワブを受け取るために、事前に形成されたプラスチックのスワブウェルが置かれる凹所がある(図面においては1と称される)。図1Aにて示される上部ラベルをその後、装置の右側部分の全体に被せ置く。上部ラベルには2つの穴が備えられ、下の穴(図1AにおいてはBと示される)には、浸されたスワブが挿入され、上の穴(図1AにおいてはAと示される)には、穴Bへのその挿入後にスワブが押し込まれる。穴AおよびBをもつ上部ラベルの配置およびスワブウェルにより、アッセイの間中スワブは適切な位置に保持され、吸収された試験用試料液のスワブからの排出が促進される。
図1Cにて示されるように、アッセイのための試験用細片は、金の粒子およびアフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌B抗体の結合体を充填した、吸収性材料のパッドからなる。使用においては、この結合体は、液体の試験用試料と接触させることにより、流動可能なように変えられる。金結合体と反応させた試料についての捕捉ラインが、アフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌B抗体をそこに埋め込むことによりその上で確立されているようなニトロセルロースパッドと、結合体パッドを接触させる。ニトロセルロースパッドはまた、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(IgG)によってパッドにすじをつけることにより確立された、下流の対照ラインをも含む。ニトロセルロースパッドを通した後、液体の貯水槽としての役割を担う吸収パッドにまで試料残渣を流す。
本発明に従ったアッセイ法の実行においては、図に示されるように配置された、スワブウェルを有する完成した試験装置、穴を備えた上層部分および試験用細片を使用する。ダクロン(Dacron)繊維から製造したスワブを尿試料にしばらく浸し、その後試料から取り除き、装置の右側部分にある上層部分の穴Bを通して、試験装置のサンプルウェルに直ちに挿入する。2または3滴の「試薬A」、この場合は、pH 6.5の0.05Mのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した、2.0%のトゥイーン 20、0.05%のアジ化ナトリウムおよび0.5%のドデシル硫酸ナトリウムの溶液を、同じ穴を通して試料に加える。右側部分の縁にある粘着性細片を剥離し、その後装置を閉じる。試料を結合体パッドと直ちに接触し、免疫クロマトグラフィー用の細片を通して流す。15分後、試験用試料および対照のための観察窓を見て、結果を記録する。
上記に説明されたように、2つの型の多くの尿検体を試験装置において分析した。評価された2つの型の尿試料は、如何なる肺炎型の感染もない患者由来の尿および、インフルエンザb型菌を含む尿であった。全ての試料を2通り試験した。以下の表は試験の結果を要約する:
インフルエンザb型菌結合体ワクチンとして、パスツール・メリュー・コンノート研究所(Pasteur−Merieux−Connaught Laboratories)により「ACT−HIB」という商品名で販売されている、市販の合成インフルエンザb型菌調製物をウサギに注射し、約60日間経過した後、ウサギから採血した。
以下のように、改良ELISA法を用いて、適合試験を行った:
ダイネックス・テクノロジー社(Dynex Technologies,Inc)の96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートを、様々な菌株のインフルエンザ菌細胞懸濁液(0.5〜0.7×108細胞/ml)の、100mclのアリコートで被覆した。プレートを37℃において2時間インキュベートし、0.02%のトゥイーン 20を含むpH 8.0のPBS(「PBST」)で4回洗浄した。1mg/mlの濃度でBSAを含むpH 7.2のPBS 200mclを用いて、マイクロタイターウェルを室温にて1時間ブロッキングした。プレートをその後、再度PBSTで4回洗浄した。
これらの試験においては、本実施例の抗原特異的な精製インフルエンザb型菌抗体を、図2の適合試験について説明される試験プロトコールに従い、それらの試験について説明されるものと同じ対照を用い、2つのバッチにおいて、他種のインフルエンザ菌に対して試験した。
Claims (4)
- 以下の段階を含む液体試料中におけるインフルエンザ菌(Haemophilis influenzae)の検出方法:
(a)液体試料を多孔性試験用細片に加える段階;ここで前記多孔性細片は流体流路を形成し、以下を含むものである。
(i)液体試料を受け取るための試料受領区画、
(ii)前記試料受領区画から下流方向に試料細片の流体流路に沿って結合区画配置された乾燥状態の複数の結合剤、前記結合剤はそれぞれ以下を含む;
a)検出可能な粒子
b)アフィニティ精製され、前記検出可能な粒子に結合した、インフルエンザ菌の標的糖質抗原と結合するポリクローナル抗体、ただし、前記結合剤は本質的にインフルエンザ菌の標的糖質抗原のタンパク質に結合する抗体を含まない前記抗体、
(iii)捕捉区画に乾燥状態で配置された複数の捕捉剤;ここで前記捕捉剤は、それぞれ同一のアフィニティ精製されたポリクローナル抗体を含む、
(iv)試料受領区画の下流方向にある前記捕捉区画、
(b)前記試料を、試験用細片の流路に沿って横方向に流す段階;及び
(c)インフルエンザ菌の標的糖質抗原成分の存在下で、捕捉区画内の抗原に結合した結合剤の一つと複合体を形成し、呈色線の形成が液体試料中のインフルエンザ菌の存在を示唆する段階。 - 前記標的糖質抗原がインフルエンザb型菌の莢膜糖質抗原である請求項1に記載の方法。
- 前記液体サンプルがヒトの尿である請求項1に記載の方法。
- 抗原特異的な抗体が、抗原:抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり7.7ng/mm2〜385ng/mm2の間の濃度で存在する請求項1に記載の方法。
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