CN102787097B - 经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术及医药领域。本发明提供一种经修饰的树突状细胞，利用病毒载体将SYK基因转染至其中，本发明还提供一种活性成分为该经修饰的树突状细胞的疫苗，该疫苗用于针对肿瘤的预防和主动免疫治疗。本发明的转染有SYK基因的DC细胞成熟度、所得LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比及杀瘤率、细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量等方面均高于对照组。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体地，本发明涉及一种经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗。
背景技术
树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前已知抗原递呈能力最强的抗原提呈细胞，引起当前肿瘤免疫治疗的密切关注。DC能摄取、加工抗原，表达高水平MHC分子、共刺激分子、细胞粘附分子ICAM-1、ICAM-3以及淋巴细胞功能相关抗原-3(1ymphocyte function associated antigen LFA-3)等有助于抗原提呈的分子，并分泌高水平Thl型细胞因子IL-12，有效地向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性杀瘤免疫反应。但大量的实验表明肿瘤患者体内的DC处于一种“无能状态”，在体内对肿瘤抗原的提呈作用较弱。DC与肿瘤的发生发展及预后关系密切，肿瘤的发生可能与肿瘤浸润性DC或宿主DC功能缺陷有关，此情况下它们无法有效地提呈肿瘤抗原，激活T细胞识别并杀伤肿瘤细胞；产生此情况的机制为肿瘤细胞释放的可溶性因子作用于DC使其表面分子的表达发生变化，引起肿瘤的免疫逃逸。大多数研究表明体内肿瘤抑制了DC的成熟而非直接抑制DC的功能。Lissoni等在对40例癌症病人的临床研究中发现癌症患者外周血中成熟和不成熟DC百分比均明显低于对照组，且有转移灶者显著低于无转移者，说明DC的缺乏在诱发肿瘤的免疫抑制中起重要作用。故体外诱导功能性DC用于主动免疫治疗有重要的临床应用价值。
不同类型的肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，有的甚至无效，因此，寻找合适的肿瘤抗原刺激DC尤为重要。目前主要有以下两种肿瘤抗原刺激DC的方式：
（1）全细胞性肿瘤抗原致敏方式：由于目前大多数肿瘤特异性抗原类型尚未明确鉴定，因而可对DC给予全细胞性肿瘤抗原刺激，由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、提呈。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。
（2）肿瘤相关抗原（Tumor Associated Antigen,TAA）基因转染方式：大多数MHC限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原肽的DC。若将TAA基因以DNA或RNA的形式导入DC，使DC持续以合适的方式将肿瘤抗原的多个表位与MHC结合，表达于DC的表面，能更有效地激活T细胞产生针对TAA的强烈的、特异性的抗肿瘤免疫反应。以TAA基因转染DC制成DC疫苗进行肿瘤基因免疫治疗已成为当前的研究热点。
在基因运载方面，病毒载体以其高效和良好的靶向性在基因治疗中得到广泛的应用。目前用于基因修饰的病毒载体主要有：逆转录病毒（RV）、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）。它们各自的优缺点简述于表1中。
表1
由表1可知，慢病毒载体与其它病毒载体相比有着巨大的优越性，且有研究表明，慢病毒感染后的DC细胞的抗原提呈能力与正常DC细胞相比没有明显差异，因此慢病毒可作为基因修饰DC的良好载体，介导特异性的抗肿瘤免疫应答。
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB），发生于视网膜核层，是儿童眼部最常见的原发性恶性肿瘤，近年来发病率有所上升。目前针对RB的研究显示，原致癌基因SYK（spleen tyrosine kinase）在RB细胞中表达增强，SYK的小分子抑制剂能诱导RB细胞死亡（Zhang等，Nature，DOI:10.1038/nature10733（2012））。而SYK基因在肿瘤疫苗中的应用却未见报道。
发明内容
针对目前视网膜母细胞瘤高发的情况，本发明提供一种SYK基因修饰的DC细胞及包含该DC细胞的疫苗，用于针对视网膜母细胞瘤的主动免疫治疗。
本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
一种经修饰的树突状细胞，包含利用病毒载体转染至其中的SYK基因。
一种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其活性成分为本发明的经修饰的树突状细胞。
本发明的SYK基因修饰的DC疫苗制备工艺简便，所得的慢病毒转染的DC细胞在以下方面：细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达水平，与CIK细胞共培养后得到的LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比及该LV-DC-CIK的杀瘤率，细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量，均显著高于对照组，因此本发明的DC疫苗有良好的主动免疫治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例中获得的LV-DC细胞（a）及对照Con-DC细胞（b）表面CD80分子的流式检测结果；
图2为本发明实施例中获得的LV-DC细胞（a）及对照Con-DC细胞（b）表面CD83分子的流式检测结果；
图3为本发明实施例中获得的LV-DC细胞（a）及对照Con-DC细胞（b）表面CD86分子的流式检测结果；
图4为本发明实施例中获得的LV-DC-CIK细胞（a）及对照Con-DC-CIK细胞（b）中CD3+CD56+T细胞的流式检测结果；
图5为本发明实施例中获得的LV-DC-CIK细胞（a）及对照Con-DC-CIK细胞（b）对RB细胞杀伤作用的流式检测结果；
图6为本发明实施例1中步骤1中的PCR反应条件；
图7为本发明实施例1中步骤9中的PCR反应条件。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种基因修饰的DC细胞，包含利用载体转染至其中的SYK基因。
优选地，所述DC细胞来源于哺乳动物外周血，更优选地，所述DC细胞来源于人外周血。
优选地，所述载体为病毒载体。病毒载体在基因转染方面具有高效性和非常好的靶向性等优点，在基因修饰领域得到广泛应用。目前用于基因修饰的病毒载体主要有：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。
更优选地，所述载体为慢病毒载体，在本发明的优选实施例中使用TOPO表达载体。此类慢病毒载体由HIV病毒经基因改造获得，可使外源基因SYK基因持续稳定表达，并具有较高的转导效率及安全性。
本发明实施例中使用SYK基因作为长期刺激DC细胞的肿瘤抗原基因，所述基因为人的SYK基因的全长编码序列（SEQ ID NO:1），其全长编码序列（CDS）长约1.9kb，该全长编码序列携带其全部功能基因，以使得更全面地刺激DC细胞发生抗肿瘤免疫反应。该SYK基因序列可由生产商合成或直接购买自生物公司。
本发明实施例中，通过PCR反应进行该SYK基因的扩增，该PCR技术为本领域技术人员所熟知。
优选地，用于扩增SYK基因的PCR反应的引物序列为：
正向引物P1：5’-ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3’（SEQ ID NO:2）；
反向引物P2：5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’（SEQ ID NO:3）。
本发明实施例中，将SYK基因克隆至慢病毒载体TOPO，构建含SYK基因的TOPO载体。然后将所得TOPO载体转化至感受态细胞，本发明实施例中使用大肠杆菌作为感受态细胞，其为常用的感受态细胞，具有繁殖快速，培养方式简单等优点。
将转化有含目的基因的重组慢病毒载体的大肠杆菌扩大培养后提取质粒并鉴定，以确定正确转入，然后将重组慢病毒质粒及其辅助包装质粒共转染至包装细胞中，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在HT1080细胞中测定并标定病毒滴度。
将上述携带有SYK基因的慢病毒转染至体外诱导获得的树突状细胞中即得到本发明的DC细胞疫苗，对所得DC细胞进行相关的免疫学分析以确定其作为疫苗的效力，其中所述免疫学分析包括DC细胞成熟度检测，即DC细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达水平的检测，体外杀瘤率检测，细胞表型及分泌细胞因子的检测。
本发明实施例还提供一种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其活性成分为本发明的树突状细胞。优选地，本发明实施例的疫苗用于预防视网膜母细胞瘤。
本发明实施例中获得的转染有SYK基因的DC细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达水平为对照组的1.61-1.79倍；在与CIK细胞共培养后得到的LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比约为对照组的4.8倍，细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量约为对照组的2倍；在效靶比为40:1时所得LV-DC-CIK对RB细胞的杀瘤率约为对照组的2.2倍，因此本发明的DC疫苗有良好的主动免疫治疗效果。
现以具体的SYK基因修饰的DC疫苗制备及免疫学分析方案为例，对本发明进行详细描述。
实施例1
一种经修饰的树突状细胞，包含利用病毒载体转染至其中的SYK基因。其中，该经修饰的树突状细胞制备方法如下：
1.SYK基因片段的扩增
PCR扩增模板为携带有SYK基因（NCBI RefSeq:NM 003177.3）全长cDNA的质粒（pCMV6-XL5），该质粒购自OriGen生物公司，其中SYK基因的CDS序列（SEQ ID NO:1）长约1.9kb。
用于PCR扩增引物序列为：
P1：5’-ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3’（SEQ ID NO:2）
P2：5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’（SEQ ID NO:3）
其中P1为正向引物，P2为反向引物。
用于扩增SYK基因的PCR反应体系如下：
PCR反应条件如图6所示。
2.SYK基因扩增片段的纯化
对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1.9kb处得到一条带，用Promega公司的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System进行胶回收，纯化PCR产物。
3.含SYK基因片段的TOPO的构建
慢病毒TOPO表达载体（pLenti6.3/V5-TOPOVector）购买自Invitrogen公司。构建含目的基因的TOPO载体的反应体系，具体操作按说明书指示进行，反应体系如下：
反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温（21-23℃）下孵育5min。孵育结束后将反应体系置于冰上。
4.TOPO载体的转化
在冰上将一管E.coli感受态细胞（Invitrogen,Cat.No.C7373-03）解冻，然后向其中加入2-3μl步骤3构建的含SYK基因的TOPO载体，轻柔混匀。冰上孵育30min，42℃水浴30s，冰上再孵育2min，最后加入225μl室温的S.O.C.培养基，37℃孵育1h。然后取100μl转化产物均匀涂布到预热的LB固体培养基（含氨苄青霉素）上，37℃孵育过夜。
5.重组质粒的纯化与鉴定
从步骤4得到的LB固体培养基上挑选10-20个克隆，置于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃孵育过夜。收集菌体，用质粒DNA纯化试剂盒（Promega，Cat.No.A7500）纯化重组质粒DNA并酶切鉴定，酶切体系如下：
其中，限制性内切酶Afl II和Xho I在其它反应物加好并混匀后加入。反应条件为37℃水浴1h。由于目的基因中没有Afl II和Xho I酶切位点，pLenti6.3/V5-TOPO表达载体的两个LTR区各含一个Afl II位点，靠近3’插入位点处有一个Xho I位点，因此Afl II和Xho I双酶切后应该得到3个DNA片段，相应地在电泳图谱中应该可以看到3个条带（1.6kb、3.0kb、4.5kb）。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定。
6、慢病毒的包装
第1天：取5×106个293FT细胞（Invitrogen,Cat.No.R700-07），离心弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基（D-MEM+10%FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必需氨基酸+1mM丙酮酸钠+1%P/S）重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第2天：
弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10%FBS的Opti-MEMI培养液（Invitrogen,Cat.No.31985-062）。
制备DNA-Lipofectamine2000复合物，其中ViraPowerTM包装质粒混合物和Lipofectamine2000来自ViraPowerTM Lentiviral Support Kit（Invitrogen），实验操作简述如下：
（1）将1.5ml无血清的Opti-MEMI培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg步骤5中经纯化与鉴定得到的重组质粒，轻柔混合。
（2）将1.5ml无血清的Opti-MEMI培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl Lipofectamine2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
（3）将（1）（2）两步得到的溶液转移到同一个离心管中，轻柔混合均匀，室温孵育20min，得到DNA-Lipofectamine2000复合物。
将得到的DNA-Lipofectamine2000复合物逐滴缓慢加入到上述培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第3天：取上述培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5%CO2培养箱中孵育48-72h。
第5天或第6天：将上述培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，4℃条件下2000g离心15min，取上清液，为慢病毒溶液，分装入1ml冻存管中，-80℃保存。
7、慢病毒滴度检测
第1天：接种HT1080细胞（ATCC,CCL-121）到六孔板中，2×105个细胞/孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第2天：
取上述步骤6中第5天或第6天得到的慢病毒溶液，用完全培养基进行10倍的梯度稀释，获得稀释102、103、104、105、106倍的慢病毒溶液，终体积分别为1ml，轻柔混匀。
将第1天孵育过夜的六孔板中的培养基弃去，将上述梯度稀释的慢病毒溶液分别加至其中5个孔中，第六个孔作为空白对照。每个孔中加入Polybrene溶液至终浓度为6μg/ml，轻柔混匀，37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第3天：弃去六孔板中的培养液，加入2ml完全培养基，37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第4天：弃去六孔板中的培养液，加入2ml完全培养基（含灭瘟素），37℃，5%CO2培养箱中继续孵育。
之后每隔4-5天用新鲜的完全培养基（含灭瘟素）进行完全换液。
至第15-17天：弃去六孔板中的培养液，将各孔中的细胞用PBS洗两次，然后每个孔中加入1ml结晶紫溶液，室温下孵育10min，弃去六孔板中的结晶紫溶液，用PBS洗两次，计算每个孔中的蓝色克隆数，以确定慢病毒的滴度。
8、慢病毒转染
第1天：
抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室温700g离心20min，吸取上层血浆，56℃水浴30min；然后4℃静置15min，900g离心30min，取自体血浆4℃保存备用。
取上述700g离心20min后下部细胞，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到2个装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温800g离心15min，吸取白膜层细胞，即外周血单个核细胞，加入到装有5ml RPMI 1640的50ml离心管中，加入RPMI 1640至总体积为50ml，600g离心10min，弃上清液。再次加入50ml RPMI 1640，600g离心10min，弃上清液。用含10%(V/V)上述保存的自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分装入六孔板中，5×106/ml，2ml/孔，于饱和湿度、37℃、5.0%CO2培养箱中培养2h。
洗涤并收集未贴壁的细胞进行CIK细胞培养。保留贴壁细胞于六孔板中进行DC细胞诱导，加入含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4及10%(V/V)上述得到的自体血浆的Alys-505培养液，置于饱和湿度、37℃、5.0%CO2培养箱中继续培养。
第3天：半量换液并补充新鲜的细胞因子，置于饱和湿度、37℃、5.0%CO2培养箱中继续培养。
第5天：收集DC细胞，计数，PBS洗涤细胞，离心（1500rpm×10min），以含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4及10%上述得到的自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分别接种于6孔板中，1×106个细胞/孔，2ml/孔；
第6天：
取上述获得的慢病毒溶液，用Alys-505完全培养基（含10%自体血浆）根据其滴度将其稀释至最佳MOI，混匀。
弃去六孔板中的培养液，将上述稀释后的慢病毒溶液加至六孔板中，每孔中加入终浓度为10μg/ml的Polybrene（Sigma,Cat.No.H9268），轻轻混合均匀，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第7天：弃去六孔板中的培养液，加入新鲜的Alys-505完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
第8天：弃去六孔板中的培养液，加入新鲜的含有灭瘟素的Alys-505完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。
之后每隔3-4天用新鲜的含有灭瘟素的Alys-505完全培养基进行完全换液，直至出现抗灭瘟素的克隆。挑取至少5个阳性克隆，分别对每个单克隆进行细胞扩增培养，从而获得稳定的慢病毒转染的含SYK基因的DC细胞（LV-DC），该DC细胞可作为疫苗用于视网膜母细胞瘤及其他肿瘤的预防和主动免疫治疗。
9.SYK基因表达的检测
利用RT-PCR在mRNA水平上检测SYK基因在LV-DC细胞内的表达情况，操作步骤简述如下：
用TRIzol提取步骤8获得的LV-DC细胞总RNA，操作步骤如下：弃六孔板中的培养液，加入1mlTRIzo制成细胞悬液，室温静置，将细胞悬液转移到EP管中，加入0.2ml氯仿/酚，手摇15s，静置2-3min，12000g，4℃离心15min；取上层水相，加入0.5ml异丙醇，12000g，4℃离心10min；弃上清加1ml预冷的75%乙醇洗涤，涡旋混匀，然后7500g，4℃离心5min。倒掉上清，沉淀置超净工作台开风机吹干，向该EP管中加20μlDEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。
反转录为cDNA：取0.65ml EP管，加入4.5μl DEPC水，1μl oligo(dT)15primer，1μl上述RNA溶液，稍离心，100℃沸水浴1min；加入0.5μl dNTP，2μl5×Buffer，1μl AMV逆转录酶，稍离心，封口膜封口，42℃水浴90min；100℃沸水浴3min灭活AMV，得cDNA。
PCR反应：取200ul EP管，加入如下试剂：
稍离心后100℃沸水浴1分钟，趁热加入Tag酶0.5μl（冰上操作），再加入50μl液体石蜡封闭，10000g离心1分钟。
PCR反应条件见图7。
PCR结束后，对PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以确认目的基因正确转入DC细胞中。
实施例2
DC疫苗及相关参数测定
1、DC细胞成熟度的检测
实施例1步骤8获得的LV-DC细胞可直接用作DC细胞疫苗。用流式细胞仪检测实施例1获得的LV-DC细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达情况，检测结果见表2和图1、2、3。
2、LV-DC-CIK细胞体外杀瘤率检测
将2×105个实施例1中步骤8获得的LV-DC细胞与2×106个步骤8中得到的CIK细胞共同培养（LV-DC:CIK=1∶10），每两天补充含0.5%(V/V)自体血浆、1000U/ml IL-2、100ng/ml GM-CSF的Alys-505培养基，5-7天后得到效应细胞LV-DC-CIK细胞。
取CFSE标记的RB细胞作为靶细胞，将其与LV-DC-CIK细胞分别用培养液调整细胞密度为1×105/ml和1×106/ml。
取1支流式管，分别加入效靶细胞800μl和200μl（效靶比40：1），轻轻混匀，200g离心1min使细胞相互接触。设三个平行对照。5%CO2，37℃培养箱中孵育4h，然后加入1μg/ml PI染液，混匀，室温避光孵育15min。
孵育后的细胞用流式细胞仪检测CFSE+PI+RB细胞(死亡的RB细胞)的百分率。
3、LV-DC-CIK细胞表型及分泌的细胞因子的检测
用流式细胞仪检测收获的LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比。收集LV-DC-CIK细胞的上清液，检测细胞因子IFN-γ的分泌水平。
结果
1.慢病毒滴定检测结果
用结晶紫法对收获的慢病毒进行滴度检测，实验结果表明，稀释105倍、106倍的慢病毒溶液对应的孔中分别有56个和6个蓝色克隆，因此可以计算出从293FT细胞中收获的慢病毒溶液的滴度为5.8×106。
2.LV-DC成熟标志表型检测结果
将经过慢病毒转染得到的LV-DC细胞与对照组Con-DC细胞分别检测其细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达情况，检测结果见表2和图1、2、3所示。结果表明，LV-DC细胞成熟标志分子的表达明显高于对照组Con-DC。表2DC细胞成熟标志表型检测结果（%，）
3.LV-DC-CIK细胞表型及分泌的细胞因子的检测结果
（1）LV-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比为（63.35±2.57）%，明显高于对照组Con-DC-CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的百分比（13.23±1.26）％。图4为三个平行组其中一组的流式检测图。
（2）LV-DC-CIK细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量为3025±156pg/ml，显著高于对照组DC-CIK细胞上清液中IFN-γ的分泌量1568±79pg/ml。
4.LV-DC-CIK细胞对RB细胞杀瘤活性的检测结果
将经过慢病毒转染的LV-DC细胞（或Con-DC细胞）与CIK细胞共培养一段时间后，用CFSE/PI双标法检测效靶比为40:1时DC-CIK细胞对RB细胞的杀伤效率，结果表明，LV-DC-CIK组在效靶比40:1时达到（75.39±3.39）%的杀瘤率，显著高于Con-DC-CIK组的杀瘤率（34.63±3.58）%。其中一组的流式检测图如图5所示。
Claims (1)
1.一种经修饰的树突状细胞用于制备树突状细胞疫苗的用途，所述树突状细胞疫苗用于预防和主动免疫治疗视网膜母细胞瘤，所述经修饰的树突状细胞包含利用病毒载体转染至所述经修饰的树突状细胞中的SYK基因；其中，所述病毒载体为TOPO表达载体。
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