CN105316288A - 特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性t细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法与应用。该特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞制备方法包括的步骤有：包含非受体依赖型脾酪氨酸激酶SYK基因的慢病毒的包装制备；SYK基因修饰的树突状细胞(DC)的制备；SYK基因修饰的树突状细胞诱导的特异性细胞毒性T细胞的制备。该特异性治疗方法首次以原致癌基因SYK为靶点治疗视网膜母细胞瘤，以慢病毒载体将SYK基因转染入DC细胞中，诱导制备出特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞，以激发细胞毒性T细胞特异性靶向识别并杀伤视网膜母细胞瘤，大大提高T细胞的抗肿瘤效应，且培养的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞稳定性强，治疗效果稳定。

Description

特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体的涉及一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是一种起源于视网膜核层原始细胞，儿童眼部最常见的原发性恶性肿瘤，具有遗传和家族特性。其生长部位特殊，严重损害视力，并且易向颅内浸润性生长，患者以婴幼儿占绝大多数，多发于5岁以下儿童，89％以上的病人在3岁之前发病，部分患儿出生时即已发病。RB高度恶性，生长迅速，转移快，若不及时治疗可发生眼框内、颅内及全身转移，危害患者的视力、眼球甚至生命。RB的发病率约为1/20000，75％病例均发生于3岁以前。目前，我国每年新增已确诊RB患者达2000人以上，全国累计病人数上万，且有逐年增长趋势，主要是人口增加、诊断技术提高、环境改变等因素引起。RB患儿生存期短，致残率高，死亡率高。可侵及单眼或双眼，RB单眼平均诊断年龄为24个月，双眼为12个月，双眼发病占30％-40％。RB的致盲率占儿童致盲的6％。部分RB患者有遗传性，约6％的病人有家族史。

RB的治疗：近年来，对单眼为Reese-EllsworthV级肿瘤的患者行眼球摘除术、I～IV级的患眼则采用化学减容法或局部治疗方法(包括激光光凝、经瞳孔温热疗法、冷冻治疗和巩膜敷贴放射治疗)；对大部分双眼RB患者采用化学减容治疗，而在双眼病变程度极不对称的患者，其高度进展的患眼仍不得不行摘除眼球，但肿瘤较小的对侧眼常可采用局部治疗方法。绝大部分双眼RB患儿至少有1只眼曾接受化学减容法治疗。现行治疗RB的方法虽有一定的疗效，但也具有明显的局限性。首先，眼球摘除术(尤其是30-40％的患儿为双眼患者)不但会使患儿致盲、致残，而且对其心灵造成创伤；其次，放疗和眼球摘除术会影响患儿面部发育，长大后要进行二次手术整容，极大地影响了生存质量，且对于晚期巨大RB及发生转移的肿瘤，上述方法的疗效也很有限；另外，由于人体存在血脑屏障，绝大多数抗癌药物都无法通过血脑屏障达到颅内肿瘤所在的部位，治疗效果有限，且化学治疗会产生严重的毒副作用及其它可能出现的新问题：①新的RB肿瘤形成，随诊5年的发生率为24％；②抑制骨髓功能，威胁患儿生命；③肾脏和听力受损；④RB耐药性出现，目前已发现有多种耐药蛋白不能为环孢素A所逆转。

近年来，发达国家RB的5年生存率已达90％以上。与之相比，国内RB疗效存在较大差距，单眼RB的5年生存率仅50％，双眼RB摘除1眼后的5年生存率为35％，大部分RB患儿仍采取眼球摘除或眼眶内容物剜除治疗。随着对RB治疗理念的不断更新和治疗手段的不断发展完善，目前的治疗已不单纯局限于仅以保护患儿生命为惟一目标，更重要的是立足于提高患儿的生存质量。目前国际上对RB的治疗提倡在挽救生命的前提下，尽量保留眼球，同时尽可能保存有用视力。

尽管当前的物理、化学治疗手段已使大部分RB患儿获得缓解，但仍有部分患儿因为体内存在的残留肿瘤细胞而复发，且在清除和杀灭肿瘤细胞的同时不可避免地会损伤宿主的免疫系统。鉴于RB常规治疗手段存在的一系列弊端，寻求有效的方法治疗RB成为目前的迫切任务之一。近年来生物免疫治疗己被众多学者认可，成为具有较大潜力的治疗措施，它能彻底清除残余的肿瘤细胞，是目前RB综合治疗的研究热点之一，有望为进一步提高RB的生存率，改善RB患者的生存质量提供保障。

树突状细胞(dendriticcell，DC)作为人体内已知的抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，成为当前肿瘤免疫治疗的热点之一。DC能摄取、加工抗原，表达高水平MHC分子、共刺激分子、细胞粘附因子ICAM-1、ICAM-3以及淋巴细胞功能相关抗原-3(1ymphocytefunctionassociatedantigenLFA-3)等有助于抗原提呈的分子，并分泌高水平Thl型细胞因子IL-12，有效地向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性杀瘤免疫反应。但大量的实验表明肿瘤患者体内的DC处于一种“无能状态”，在体内对肿瘤抗原的呈递作用较弱。DC与肿瘤的发生发展及预后关系密切，肿瘤的发生可能与肿瘤浸润性DC或宿主DC功能缺陷，使其无法有效地提呈肿瘤抗原，激活T细胞识别并杀伤肿瘤细胞有关；其机制为肿瘤细胞释放的可溶性因子作用于DC使其表面分子的表达发生变化，导致肿瘤的免疫逃逸。大多数研究表明体内肿瘤抑制了DC的成熟而非直接抑制DC的功能；肿瘤组织中DC的浸润程度与肿瘤的淋巴结转移及预后有明显相关，肿瘤邻近CD1α⁺DC浸润的病人其生存率明显提高、复发率降低，Lissoni等在对40例癌症病人的临床研究中发现癌症患者外周血中成熟和不成熟DC百分比均明显低于对照组，且有转移灶者显著低于无转移者，说明DC的缺乏在诱发肿瘤的免疫抑制中起重要作用。

另外，不同性质的肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，有的甚至无效。所以，寻找合适的肿瘤抗原负载DC尤为重要。目前主要有以下两种肿瘤抗原刺激DC的方式：

①全细胞性肿瘤抗原致敏方式：由于目前大多数肿瘤特异性抗原类型尚未明确鉴定，因而可对DC给予全细胞性肿瘤抗原刺激，由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、呈递。目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。

②肿瘤相关抗原(TumorAssociatedAntigen,TAA)基因转染方式：大多数主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原多肽的DC。

有效的基因治疗依赖于外源基因的高效、稳定的表达，而利用病毒载体介导基因转移，以其高效和良好的靶向性已成为基因治疗中应用最广泛的方法。近年来，随着病毒基因组研究技术的迅速发展和基因的不断克隆，越来越多的病毒载体被构建并应用于以DC为基础的肿瘤基因治疗。但是，并非所有的病毒载体都适用于DC的基因转染，主要原因是由于转染了携带目的基因的病毒载体的DC回输后会诱导机体产生针对病毒抗原和目的基因的免疫应答，并使得转染细胞即DC成为靶细胞而受到免疫系统的攻击；有些病毒载体可抑制DC的抗原呈递功能，从而影响了DC瘤苗的治疗效果；此外已存在的或新产生的抗病毒中和抗体会干扰初次或再次免疫，从而影响机体抗肿瘤效应的诱导效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法。旨在解决现有肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应不强以及不恰当选用病毒载体抑制DC的抗原呈递功能的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，包括如下步骤：

将视网膜母细胞瘤原致癌基因SYK基因片段与慢病毒表达载体连接后进行包装，获得含有SYK基因的慢病毒SYK-LV；

将所述SYK-LV感染树突状细胞，得到SYK基因修饰的树突状细胞；

将所述SYK基因修饰的树突状细胞与T细胞共同培养，得到以SYK为治疗靶点的能特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞。

以及，一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞，其由上述特异性抗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法制备获得。

以及，上述特异性抗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞在制备治疗视网膜母细胞瘤药物及化疗耐药性视网膜母细胞瘤药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优异技术效果：

上述特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法是以慢病毒载体将视网膜母细胞瘤细胞中过表达的原致癌基因SYK转染入DC细胞中，诱导制备出特异性靶向识别视网膜母细胞瘤细胞的CTL细胞，以激发CTL细胞针对视网膜母细胞肿瘤的特异性杀伤作用，大大提高抗肿瘤效应。且该CTL细胞对耐药性的视网膜母细胞瘤细胞同样具有较强的杀伤作用，因此临床上可将其制备治疗视网膜母细胞瘤药物及化疗耐药性的视网膜母细胞瘤药物以实现对化疗耐药视网膜母细胞瘤患者的治疗。另外，该方法各环节易控，使得培养的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞稳定性强，提高了培养该特异性抗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的效率，降低了其生产成本。

附图说明

图1是本发明实施例1中SYK基因扩增产物的电泳条带图；其中，M表示DNALadder；E表示SYK基因的PCR产物；

图2是本发明实施例1步骤S13中对重组质粒酶切产物的电泳条带图；其中，M表示DNALadder；E表示重组质粒酶切产物；

图3是本发明实施例1步骤S13获得的重组质粒DNA扩增产物的电泳条带图；其中，M表示DNALadder；E表示SYK基因的PCR产物；

图4是实施例1中SYK-DC和对比例1中的WT-DC中SYK基因的表达水平柱状图；

图5是实施例1中SYK-DC和对比例1中的WT-DC细胞表面CD80/83/86分子的表达水平柱状图；

图6是SYK基因在WT-RB和WT-RPE1中的表达水平；

图7是SYK蛋白在WT-RB和WT-RPE1细胞表面表达的免疫荧光染色图；

图8是实施例1、对比例1和对比例2中分别培养的SYK-DC-CTL、WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL对RB细胞和RPE1细胞的杀伤效率柱状图；

图9是实施例1、对比例1和对比例2中分别培养的SYK-DC-CTL、WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL对RB细胞和RPE1细胞的诱导凋亡比例柱状图；

图10是实施例1、对比例1和对比例2中分别培养的SYK-DC-CTL、WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL对耐药细胞株RB-DR细胞的杀伤效率柱状图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法。特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法包括如下步骤：

S01.SYK-慢病毒的包装制备：将视网膜母细胞瘤原致癌基因SYK基因片段与慢病毒表达载体连接后进行包装，获得含有SYK基因的慢病毒，即SYK-LV；

S02.SYK基因修饰的树突状细胞的制备：将步骤S01中包装获得的所述SYK-LV与树突状细胞一起于含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，得到SYK基因修饰的树突状细胞，即SYK-DC；

S03.特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备：将步骤S02中制备的所述SYK基因修饰的树突状细胞与T细胞共同培养，得到特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞。

上述步骤S01中的SYK(SpleenTyrosineKinase)基因所编码的蛋白是一种非受体型酪氨酸激酶。在细胞中，该SYK基因参与免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)介导的信号转导过程，与细胞的增殖、分化及吞噬等功能密切相关。发明人在研究中发现，SYK的小分子抑制剂能诱导RB细胞死亡，对RB细胞的存活至关重要，另外SYK在正常视网膜细胞中不表达。因此设计将SYK基因作为RB肿瘤相关抗原基因，利用慢病毒(LV)作为载体转染DC细胞，诱导刺激获得针对RB肿瘤的CTL细胞，从而介导针对RB肿瘤细胞的特异性免疫反应。

该步骤S01中含有SYK基因的慢病毒(SYK-LV)的制备包括如下步骤：

(1)将SYK基因片段、Taq聚合酶、扩增引物于扩增体系中进行PCR扩增、纯化。其中，SYK基因片段可以从购买自OriGen生物公司的携带有SYK基因(NCBIRefSeq:NM_003177.3)全长cDNA的质粒(pCMV6-XL5)中获得，将其作为PCR扩增模板。PCR反应体系中的扩增引物P1、P2分别如下：

P1：5’-ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3’；

P2：5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’；

(2)将进行所述扩增纯化处理后的SYK基因片段与慢病毒表达载体进行生物酶连接处理后，得到慢病毒克隆产物。其中，慢病毒表达载体可以选用慢病毒TOPO表达载体，如pLenti6.3/V5-TOPO表达载体；

(3)将所述慢病毒克隆产物与E.coli感受态细胞进行转化孵育，再通过抗氨苄青霉素筛选处理后于含有氨苄青霉素的培养基中再次孵育，分离纯化重组质粒DNA并进行鉴定，即得到SYK-慢病毒表达载体；

(4)将包装质粒混合物、所述SYK-慢病毒表达载体与转染试剂混合后进行孵育形成DNA转染试剂复合物后，将所述DNA转染试剂复合物与包装细胞293FT进行包装孵育处理，获得含有所述SYK基因的慢病毒(SYK-LV)，并进行慢病毒的滴度检测。

上述步骤S02中，将所述SYK-LV与树突状细胞(DC)一起于含有聚凝胺的完全培养基中感染培养，使得DC细胞携带SYK基因。慢病毒载体在有效负载SYK基因片段的同时，其携带的外源SYK基因可在感染的DC细胞内持续稳定表达、对DC细胞的感染和转导效率高、免疫原性低，对该DC细胞不产生任何有效的细胞免疫应答、安全性较高，能使得慢病毒感染后的DC细胞的抗原提呈能力与正常DC细胞相比没有明显差异。

在优选实施例中，将所述SYK-LV与DC细胞一起于含有聚凝胺的完全培养基中感染培养包含如下步骤：

将所述SYK-LV用含血浆的完全培养基稀释处理后与树突状细胞混合，再加入聚凝胺进行混合后进行感染培养。

其中，完全培养基可以选Alys-505完全培养基，完全培养基中血浆的含量可以控制在5％-15％v/v％，具体可以控制在10v/v％。该所述SYK-LV采用该血浆的完全培养基稀释后，应该控制其滴度，使得终体积尽量减小以提高转染效率。

在优选实施例中，当将该所述SYK-LV经稀释后与所述DC细胞混合后，其与DC细胞混合数量比例为(30-100):1(单位为个数)。

在另一优选实施例中，向所述SYK-LV与DC细胞的培养基中加入聚凝胺的量保证所述聚凝胺在完全培养基中的终浓度为5-20μg/ml，具体的可以是10μg/ml。

在上述各实施例的基础上，该DC细胞选用未成熟阶段的DC细胞。

该步骤S02中SYK-LV与DC细胞一起于含有聚凝胺的完全培养基中感染培养后，理所当然的应该还包括对培养产物SYK-DC进行DC细胞内SYK基因表达水平检测的步骤，其检测方法可以参照相关特性实验中第1点的检测方法。

上述步骤S03中，T细胞与SYK-DC细胞共同培养后，T细胞转化为特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞，记为SYK-DC-CTL细胞。而CTL细胞主要介导抗原特异性的杀伤作用，通过TCR-CD8复合物与靶细胞表面的抗原肽-MHCI复合物紧密结合，而后CTL细胞内的其它辅助分子LFA-1、CD28分子等可与靶细胞上相应的配体分子如ICAM-1、B7分子等结合，进一步增强CTL细胞与靶细胞的粘附作用，同时也向CTL细胞传递协同信号使之活化。CTL细胞的杀伤特点有：杀伤力强；反复杀伤靶细胞，而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤；MHC限制性。CTL杀伤靶细胞的机制有：①分泌穿孔素与颗粒酶，直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解；②分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-2等。不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞；③诱导肿瘤细胞凋亡：CTL细胞活化后大量表达FasL，与肿瘤细胞表面的Fas分子结合，通过Fas分子胞内段的死亡结构域激活一系列caspase，引起死亡信号的逐级转导，最终激活内源性DNA内切酶，使核小体断裂，导致细胞结构毁损，细胞死亡。

因此，上述特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法实施例中，将基于DC细胞的抗原提呈能力和CTL细胞强大的杀伤活性把负载肿瘤抗原的SYK-DC细胞与CTL细胞联合起来治疗视网膜母细胞肿瘤，该SYK-DC细胞将视网膜母细胞瘤原致癌基因SYK表达蛋白传递给CTL细胞后，可激发CTL细胞针对该视网膜母细胞肿瘤的特异性杀伤作用，大大提高治疗视网膜母细胞肿瘤效应。

在优选实施例中，SYK-DC与T细胞共同培养之前，将SYK-DC与T细胞按照细胞数量为1:(5-20)，具体的可以是1:10的比例加入培养基中。

在另一优选实施例中，该培养基含有0.1v/v％-1v/v％、500-2000U/mlIL-2、50-200ng/mlGM-CSF。在一具体实施例中，该培养基含有0.5％血浆、1000U/mlIL-2、100ng/mlGM-CSF。

因此，由上所述，特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法是以慢病毒载体将RB原致癌基因SYK转染入DC细胞中，诱导制备出特异性治疗RB肿瘤的CTL细胞，以激发CTL细胞针对视网膜母细胞肿瘤的特异性杀伤作用，大大提高抗肿瘤效应。另外，该方法各环节易控，使得培养的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞稳定性强，抗肿瘤效应强，提高了而且培养该特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的效率，降低了其生产成本。

相应地，在上述特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法实施例的基础上，本发明实施例还提供了一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞。该特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞由上述特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法制备获得。

另外，特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞对化疗耐药性的视网膜母细胞瘤细胞同样具有较强的杀伤作用，因此临床上可用于化疗耐药视网膜母细胞瘤患者的治疗。

现以具体的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法，对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞(SYK-DC-CTL)及其制备方法。其中SYK-DC-CTL制备方法包括如下步骤：

S1.SYK-LV的包装制备：

S11.SYK基因片段的扩增：

S111.PCR扩增模板：

购买自OriGen生物公司的携带有SYK基因(NCBIRefSeq:NM_003177.3)全长cDNA的质粒(pCMV6-XL5)。

S112.PCR扩增引物序列如下：

P1：5’-ATGGCCAGCAGCGGCATGGCTG-3’

P2：5’-TTAGTTCACCACGTCATAGTAG-3’

目的基因片段长度约为1.9kb。

S12.SYK基因片段的纯化：

以携带有SYK基因的pCMV6-XL5质粒为模板，用设计的引物P1、P2进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见一条特异性条带，长度为1.9kb左右，如图1所示，其与预期片段大小一致，证明通过PCR方法获得了正确的目的基因。将1.9kb处得到一条清晰的条带用Promega公司的SVGelandPCRClean-UpSystem进行胶回收，纯化PCR产物。

S13.SYK-慢病毒表达载体的构建：

慢病毒TOPO表达载体购买自Invitrogen公司(pLenti6.3/V5-Vector)。将SYK基因片段与慢病毒TOPO表达载体在室温(21-23℃)下进行连接获得TOPO克隆产物(即重组质粒)后，在E.coli感受态细胞中进行转化；用质粒DNA提取试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)提取纯化重组质粒DNA；用限制性内切酶AflII和XhoI对提纯的重组质粒进行酶切鉴定和PCR反应鉴定。分析电泳条带以判断质粒是否正常。由于目的基因中没有AflII和XhoI酶切位点，pLenti6.3/V5-TOPO表达载体的两个LTR区各含一个AflII位点，靠近3’插入位点处有一个XhoI位点，因此重组质粒经过AflII和XhoI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在大约1.6kb、3.0kb、4.5kb处可看到三条清晰的条带，如图2所示，与预期片段数和片段大小一致。将经过AflII和XhoI双酶切鉴定无误的重组质粒DNA进行PCR反应，随后电泳检测以鉴定目的基因SYK是否正确插入pLenti6.3/V5-TOPO表达载体中。若在1.9kb处出现清晰的条带(如图3所示)，则说明目的基因SYK成功插入到pLenti6.3/V5-TOPO表达载体中，从而获得SYK-慢病毒表达载体。

S14.SYK-LV的包装制备：

S141.Day1：取5×10⁶个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；

S142.Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的Opti-I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；

S143.DNA-2000复合物的制备：

S1431.将1.5ml无血清的Opti-I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPower^TM包装质粒混合物和3μgS152步中提纯出的重组质粒DNA，轻柔混合；

S1432.将1.5ml无血清的Opti-I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl2000，轻柔混合后在室温下孵育5min；

S1433.将S1431、S1432两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀；

S1434.室温下孵育20min，得到DNA-2000复合物。

注：ViraPower^TM包装质粒混合物和2000来自ViraPower^TMLentiviralSupportKit(Invitrogen)。Day1表第一天、Day2表示第二天、、、依次类推，下文也是相同的意思。

S144.将得到的DNA-2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；

S145.Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10mlDMEM完全培养基。37℃，5％CO₂培养箱中孵育48-72h；

S146.Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min；

S147.用1ml移液枪吸取上清液，分装入1ml冻存管中。-80℃保存。同时用结晶紫染色法检测慢病毒的滴度。

S2.慢病毒感染DC细胞：

S21.DC细胞的体外分离培养：

S211.抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用；

S212.取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到2个装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15min)；

S213.吸取白膜层细胞，加入到装有5mlRPMI1640的50ml离心管中；

S214.加入RPMI1640至总体积为50ml，离心(600g，10min)，弃上清液；

S215.加入50mlRPMI1640，离心(600g，10min)，弃上清液；

S216.用含10％自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分装入六孔板中，5×10⁶/ml，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养2h；

S217.洗涤并收集未贴壁的细胞进行CTL细胞培养(见S31)；保留贴壁细胞于六孔板中，加入含100ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4、及10％自体血浆的Alys-505培养液，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养；

S218.Day3：半量换液并补充新鲜的细胞因子，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养；

S219.Day5：收集DC细胞，计数，PBS离心洗涤细胞(1500rpm×10min)，以含100ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4及10％自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分别接种于6孔板中，1×10⁶个细胞/孔，2ml/孔。

S22.SYK-LV感染DC：

S221.Day6：解冻一管慢病毒溶液，用Alys-505完全培养基(含10％自体血浆)将其进行适当稀释以最终得到最佳MOI(终体积尽量减小以提高转染效率)；

S222.弃去六孔板中的培养液，用移液管将上述稀释后的慢病毒溶液轻轻吹打混匀后，加至六孔板中；

S223.孔中加入终浓度为10μg/ml的Polybrene(Sigma,Cat.No.H9268)，来回晃动六孔板轻轻混合均匀后，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；

S224.Day7：弃去六孔板中的培养液，加入新鲜的Alys-505完全培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育2-3天后，获得SYK基因修饰的DC细胞(SYK-DC)。

S23.DC细胞内SYK基因表达水平的检测：

S231.RNA提取：DC培养第9-10天，分别收集1×10⁶个成熟的WT-DC、SYK-DC细胞，利用RNA提取试剂盒(AurumTotalRNAMiniKit，BioRad，Cat.No.732-6820)提取出两种细胞内的总RNA；

S232.qRT-PCR检测SYK-mRNA水平：利用一步法qRT-PCR试剂盒(iScript^TMOne-StepRT-PCRKitWithGreen，Bio-Rad，Cat.No.170-8892)对提取出的总RNA进行SYK基因表达水平检测。

S24.DC细胞表型的检测：

DC培养第9-10天，用流式细胞仪检测DC细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达情况。

S3.DC与T细胞共培养得到SYK-DC-CTL：

S31.将S217中的未贴壁细胞用含0.5％自体血浆的Alys-505培养液调整细胞密度为1×10⁶/ml，转入六孔板中，2ml/孔，同时每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养；

S32.24h后，每孔分别加入50ng/mlCD3单抗，1000U/mlIL-2，1000U/mlIL-1α，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养；

S33.每3天调整细胞密度为1×10⁶/ml，添加含1000U/mlIL-2和0.5％自体血浆的Alys-505培养液；

S34.第9-10天将成熟的SYK-DC细胞分别与T细胞以1:10的比例混合，用含0.5％自体血浆、1000U/mlIL-2、100ng/mlGM-CSF的Alys-505培养液继续培养至第14天，获得成熟的SYK-DC-CTL细胞。

对比例1

一种WT-DC-CTL细胞及其制备方法。其中WT-DC-CTL细胞制备方法包括如下步骤：

先按照常规培养DC细胞，记为WT-DC细胞，然后按照实施例1中S3的方法将WT-DC细胞与T细胞进行共同培养，得到WT-DC-CTL细胞。

对比例2

一种Ag-DC-CTL细胞及其制备方法。其中Ag-DC-CTL细胞制备方法包括如下步骤：

先按照常规视网膜母细胞瘤RB细胞全抗原刺激DC得到Ag-DC细胞，然后按照实施例1中S3的方法将Ag-DC细胞与T细胞进行共同培养，得到Ag-DC-CTL细胞。

相关特性实验

将上述实施例1、对比例1和对比例2中的培养得到的相关细胞进行如下试验：

1.实施例1和对比例1中培养得到的SYK-LV慢病毒转染DC细胞(SYK-DC)细胞、普通DC细胞(WT-DC)细胞(取相同的培养阶段培养第9-10天的DC细胞)用流式细胞仪检测细胞表面CD80、CD83、CD86分子的表达情况。同时利用qRT-PCR法检测WT-DC及SYK-DC中SYK基因的表达水平。该SYK基因的表达水平实验结果见图4。DC细胞表面CD80/83/86分子的表达水平如图5所示。

由图4可知，SYK-DC细胞的SYK基因的表达水平明显高于WT-DC细胞的SYK基因的表达水平，且达到显著水平。

由图5可知，SYK-DC细胞中的CD80、CD83、CD86分子的表达水平明显高于WT-DC细胞的。

2.SYK-DC-CTL细胞对RB细胞的特异性杀伤及凋亡检测：

2.1RB细胞与RPE1细胞中SYK蛋白表达的检测：

2.1.1利用qRT-PCR法检测RB细胞与RPE1细胞中SYK蛋白的表达水平；

利用qRT-PCR法检测野生型RB(WT-RB)及野生型RPE1(WT-RPE1)中SYK基因的表达水平，实验结果见图6。由图6可明显看出，SYK基因在野生型RB(WT-RB)中表达水平明显高于野生型RPE1，而且达到显著水平。

2.1.2利用免疫荧光染色法观察SYK蛋白在RB细胞与RPE1细胞表面的表达差异，该检测结果如图7所示。由图7可知，SYK蛋白在RB细胞与RPE1细胞表面的表达差异明显，SYK蛋白在RB细胞表面的表达量明显高于其在RPE1细胞表面的表达量。

2.2CFSE/PI双染法检测杀伤效率方法：

步骤A：以实施例1、对比例1和对比例2中培养的三种DC-CTL细胞(SYK-DC-CTL、WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL)作为效应细胞，CFSE标记的RB细胞或RPE1细胞作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀；

步骤B：5％CO₂，37℃培养箱孵育24h，反应结束后，加入1μg/mlPI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE⁺PI⁺细胞(死亡的RB细胞和RPE1细胞)的百分率。测得结果如图8所示。由图8可知，WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL、SYK-DC-CTL对RB细胞和RPE1细胞的杀伤效率依次增强，且彼此之间均达到了显著水平。其中WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL、SYK-DC-CTL对RB细胞的杀伤效率要显著高于对RPE1细胞的杀伤效率。

2.3AnnexinV/PI法检测细胞凋亡比例方法：

2.3.1以实施例1、对比例1和对比例2中培养的三种DC-CTL细胞(SYK-DC-CTL、WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL)作为效应细胞，RB细胞或RPE1细胞作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀；

2.3.25％CO₂，37℃培养箱孵育24h，反应结束后，利用AnnexinV-FITC早期凋亡检测试剂盒(BD，Cat.No.556547)检测凋亡的RB细胞和RPE1细胞的百分率。测得结果如图9所示。由图9可知，WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL、SYK-DC-CTL对RB细胞和RPE1细胞的诱导凋亡比例依次增强，且彼此之间均达到了显著水平。其中WT-DC-CTL、Ag-DC-CTL、SYK-DC-CTL对RB细胞的诱导凋亡比例要显著高于对RPE1细胞的诱导凋亡比例。

3.实施例1培养的SYK-DC-CTL细胞对卡铂耐药RB细胞系RB-DR的杀伤及凋亡检测：

实验步骤与CFSE/PI双染法检测杀伤效率方法类似，不同之处在于靶细胞是RB-DR细胞系。检测结果如图10所示。实施例1培养的SYK-DC-CTL细胞对卡铂耐药视网膜母细胞瘤细胞系(RB-DR)同样具有较强的杀伤作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，包括如下步骤：

将视网膜母细胞瘤原致癌基因SYK基因片段与慢病毒表达载体连接后进行包装，获得含有SYK基因的慢病毒SYK-LV；

将所述SYK-LV感染树突状细胞，得到SYK基因修饰的树突状细胞；

将所述SYK基因修饰的树突状细胞与T细胞共同培养，得到以SYK为治疗靶点的能特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞。

2.根据权利要求1所述的特异性抗治疗网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，所述含有SYK基因的慢病毒SYK-LV的制备方法包括如下步骤：

将所述SYK基因片段与慢病毒表达载体进行生物酶连接及纯化处理后，得到SYK-慢病毒表达载体；

将包装质粒混合物、所述SYK-慢病毒表达载体与转染试剂混合后进行孵育形成DNA转染试剂复合物后，将所述DNA转染试剂复合物与包装细胞进行包装孵育处理，获得含有所述SYK基因的慢病毒SYK-LV。

3.根据权利要求1所述的特异性抗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，所述SYK-LV感染树突状细胞包含如下步骤：

将所述SYK-LV用含血浆的完全培养基稀释处理后与树突状细胞混合，再加入聚凝胺混合后进行感染培养。

4.根据权利要求3所述的特异性抗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于：所述SYK-LV与所述树突状细胞的混合数量比例为(30-100):100；所述聚凝胺在完全培养基中的终浓度为5-20μg/ml。

5.根据权利要求1所述的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，所述SYK基因修饰的树突状细胞与T细胞共同培养条件是：

所述SYK基因修饰的树突状细胞与细胞毒性T细胞的混合比例为1:(5-20)；

两者共同培养的培养基中含有0.1-1v/v％血浆、500-2000U/mlIL-2、50-200ng/mlGM-CSF。

6.一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞，其由权利要求1-5任一所述的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法制备获得。

7.如权利要求6所述的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞在制备治疗视网膜母细胞瘤药物及化疗耐药性的视网膜母细胞瘤药物中的应用。