JP6099075B2 - 核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキット - Google Patents
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Description
本発明は、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキットに関する。
医療分野等で利用される有用性の高いタンパク質の多くが、活性のために、糖鎖修飾やジスルフィド結合等の翻訳後修飾を必要としている。このため、工業的に前記有用タンパク質を生産するには、大腸菌等の微生物ではなく、真核細胞、特に動物細胞を宿主として利用し、組換えタンパク質として発現させる方法が一般的である。
しかしながら、真核細胞を宿主として使用した場合、微生物と比較して生産性が低いという問題がある。そこで、真核細胞による生産性を向上する方法として、転写を強力に誘導するプロモーターを使用して、ｍＲＮＡの転写量を増加させる方法が報告されている。具体的には、前記プロモーターとして、サイトメガロウイルスのプロモーター（ＣＭＶプロモーター）および転写伸長因子１αのプロモーター等が利用されている（非特許文献１および２）。
しかしながら、このような改良によっても、動物細胞等の真核細胞におけるタンパク質の生産性は、十分とはいえず、さらなる改善が望まれている。
Ｓｔｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｆ．，Ｒｏｅｈｒ，Ｔ．Ｊ．，（１９８５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ５５，４３１−４４１
Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ−Ｉｔｏ，Ｎ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，（１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９，２９８３１−２９８３７
そこで、本発明は、真核細胞におけるタンパク質の生産性を向上するための新たな方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のｍＲＮＡの輸送促進方法は、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、前記真核細胞において、下記（Ａ１）工程および下記（Ａ２）工程の少なくとも一方の工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
（Ａ１）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
本発明のタンパク質の発現方法は、真核細胞を用いたターゲットタンパク質の発現方法であって、前記本発明のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明のタンパク質の製造方法は、真核細胞を用いたターゲットタンパク質の製造方法であって、前記本発明のタンパク質の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を製造することを特徴とする。
本発明のキットは、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法に使用するキットであって、下記（ａ１）および下記（ａ２）の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
（ａ１）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）
（ａ２）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）
（ａ１）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）
（ａ２）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）
本発明のキットは、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法に使用するキットであって、下記（ａ１’）および下記（ａ２’）の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
（ａ１’）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
（ａ２’）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
（ａ１’）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
（ａ２’）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
本発明者は、鋭意研究の結果、真核細胞におけるタンパク質の生産性を向上する方法として、核内でのｍＲＮＡの転写の促進ではなく、核内で転写されたｍＲＮＡについて、核内から細胞質への輸送を促進することによって、細胞質でのタンパク質発現の効率を向上させるとの着想を得た。そして、真核細胞の核内において、（１）ターゲットタンパク質のｍＲＮＡをＭＳ２結合配列との融合ＲＮＡとして発現させ、且つ、ＭＳ２とＴＡＰとの融合タンパク質を発現させることによって、または、（２）ターゲットタンパク質のｍＲＮＡをＲＲＥとの融合ＲＮＡとして発現させ、且つ、Ｒｅｖを含むタンパク質を発現させることによって、前記ｍＲＮＡの核内から細胞質への輸送を促進し、前記ターゲットタンパク質の発現量を向上させるに到った。これは、（１）前記融合ＲＮＡにおけるＭＳ２結合配列と、前記融合タンパク質におけるＭＳ２とが結合することによって、または、（２）前記融合ＲＮＡにおけるＲＲＥと、前記Ｒｅｖとが結合することによって、核内から細胞質への輸送が促進されたことによると推測される。また、（１）ＭＳ２結合配列およびＭＳ２は、それぞれ、真核細胞由来のＲＮＡおよびタンパク質ではなく、ＭＳ２ファージ由来のＲＮＡおよびタンパク質であることから、前記ＭＳ２結合配列とターゲットｍＲＮＡとの融合ＲＮＡによって、宿主である真核細胞由来のＲＮＡではなく、前記ＭＳ２結合配列と前記ターゲットｍＲＮＡとを含む融合ＲＮＡの核内から細胞質への輸送を、特異的に促進できる。また、（２）ＲＲＥおよびＲｅｖは、それぞれ、真核細胞由来のＲＮＡおよびタンパク質ではなく、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス−１）由来のＲＮＡおよびタンパク質であることから、前記ＲＲＥとターゲットｍＲＮＡとの融合ＲＮＡによって、宿主である真核細胞由来のＲＮＡではなく、前記ＲＲＥと前記ターゲットｍＲＮＡとを含む融合ＲＮＡの核内から細胞質への輸送を、特異的に促進できる。つまり、真核細胞の核内におけるＲＮＡの中でも、前記ターゲットｍＲＮＡの輸送を特異的に促進できる。このため、前記ターゲットｍＲＮＡでコードされるターゲットタンパク質の発現を、特異的に向上することが可能となる。なお、本発明は、この推測に制限されない。
このように、本発明によれば、核内で転写されたｍＲＮＡの細胞質への輸送を促進できるため、真核細胞内で転写されたｍＲＮＡを、細胞質におけるタンパク質の発現に効率良く利用できる。このため、本発明によれば、例えば、翻訳後修飾のために、動物細胞等の真核細胞での発現が必要である有用タンパク質についても、より優れた生産性で製造できる。したがって、本発明は、例えば、製薬、医療等の分野において、極めて有用な技術といえる。
本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法は、前述のように、真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、下記（Ａ１）工程および下記（Ａ２）工程の少なくとも一方の工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
（Ａ１）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
本発明は、前記（Ａ１）工程および前記（Ａ２）工程のいずれか一方のみを有してもよいし、両方を有してもよい。後者の場合、前記（Ａ１）工程および前記（Ａ２）工程は、例えば、同じ真核細胞に対して、同時に行うことが好ましい。
以下、本発明について、前記（Ａ１）工程を採用する形態を実施形態１、前記（Ａ２）工程を採用する形態を実施形態２として、説明する。
（実施形態１）
（１）ｍＲＮＡ輸送促進方法
本発明の第１のｍＲＮＡ輸送促進方法は、前述のように、真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、前記真核細胞において、下記（Ａ１）工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
（１）ｍＲＮＡ輸送促進方法
本発明の第１のｍＲＮＡ輸送促進方法は、前述のように、真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、前記真核細胞において、下記（Ａ１）工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程
本発明において、宿主となる真核細胞の種類は、特に制限されない。前記真核細胞は、例えば、動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ等のげっ歯類等の哺乳類の細胞があげられる。前記真核細胞は、例えば、生体から採取した細胞でもよいし、継代培養した培養細胞でもよい。前記動物細胞の具体例としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞等のヒト細胞および霊長類細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等のげっ歯類細胞等があげられる。また、ＤＴ４０等のニワトリ細胞、Ｓ２、Ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ、ＳＦ９、ＳＦ２１等の昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞等があげられる。本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてもよい。
本発明において、ＭＳ２は、ＭＳ２ファージ由来のコートタンパク質であり、ＭＳ２結合配列は、前記ＭＳ２に結合するＭＳ２ファージ由来のＲＮＡであり、ＴＡＰは、ペプチド輸送に関与するタンパク質(ＴＡＰ；ｔｉｐ ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＸＦ1ともいう)である。本発明において、前記ターゲットｍＲＮＡは、何ら制限されず、例えば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、前記タンパク質も何ら制限されない。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）において、前記ＭＳ２結合配列の個数は、特に制限されず、１個でもよいし、２個以上でもよい。前記個数の下限は、例えば、２個が好ましく、より好ましくは４個であり、さらに好ましくは６個であり、上限は、例えば、２４個であり、好ましくは１２個である。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側に、前記ＭＳ２結合配列を有してもよいし、前記ターゲットｍＲＮＡの３’側に、前記ＭＳ２結合配列を有してもよい。また、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）が２個以上の前記ＭＳ２結合配列を有する場合、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および３’側のいずれ一方に、前記ＭＳ２結合配列を有してもよいし、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および３’側の両方に前記ＭＳ２結合配列を有してもよい。
前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および／または３’側に前記ＭＳ２結合配列を有するとは、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’末端および／または３’末端に、前記配列が、直接的に連結している状態でもよいし、間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡと前記ＭＳ２結合配列との間に、リンカー配列を有してもよい。前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）において、前記ターゲットｍＲＮＡは、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、前記ＭＳ２結合配列と連結していることが好ましい。
前記２個以上の前記ＭＳ２結合配列は、例えば、それぞれの５’末端と３’末端とが直接的に連結している状態でもよいし、それぞれの５’末端と３’末端とが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＭＳ２結合配列間に、リンカー配列を有してもよい。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）は、例えば、５’末端がキャップ構造を有し、３’末端がポリアデニル化されていることが好ましい。
前記融合タンパク質（Ｙ１）は、例えば、前記ＭＳ２のＮ末端側に、前記ＴＡＰを有してもよいし、前記ＭＳ２のＣ末端側に、前記ＴＡＰを有してもよい。
前記ＭＳ２のＮ末端側またはＣ末端側に前記ＴＡＰを有するとは、例えば、前記ＭＳ２のＮ末端側またはＣ末端側に、前記ＴＡＰが、直接的に連結している状態でもよいし、間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＭＳ２と前記ＴＡＰとの間に、リンカー配列を有してもよい。
本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法において、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）および前記融合タンパク質（Ｙ１）を真核細胞で発現させる方法は、特に制限されない。具体的な方法として、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）発現用の核酸分子と前記融合タンパク質（Ｙ１）発現用の核酸分子とを、真核細胞に導入する実施形態１−１、および、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）発現用の核酸分子を、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体に導入する実施形態１−２が例示できる。以下に、これらの実施形態を説明するが、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
本発明の実施形態１−１は、前述のように、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）と、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）と、宿主となる真核細胞を使用する方法である。
前記核酸分子（ｘ１）および前記核酸分子（ｙ１）は、それぞれ、宿主である前記真核細胞に対する外来の核酸分子であり、例えば、発現ベクターがあげられる。以下、前記核酸分子（ｘ１）および（ｙ１）が、発現ベクター（ｘ１）および（ｙ１）である例をあげて説明するが、本発明の核酸分子は、これには制限されない。
前記発現ベクター（ｘ１）は、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）をコードするＤＮＡ（ｘ１）を含む。前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）をコードするＤＮＡ（ｘ１）は、例えば、前記ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ、つまり、前記ターゲットｍＲＮＡをコードするＤＮＡと、前記ＭＳ２結合配列をコードするＤＮＡとを含む。以下、前記ターゲットｍＲＮＡをコードするＤＮＡを、ターゲットＤＮＡといい、前記ＭＳ２結合配列をコードするＤＮＡを、ＭＳ２結合配列コードＤＮＡという。前記発現ベクター（ｘ１）において、前記ターゲットＤＮＡと前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡとは、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）として転写されるように、機能的に挿入されている。本発明において、タンパク質またはｍＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、イントロンを含んでもよいし、含まなくてもよい。
前記発現ベクター（ｘ１）において、例えば、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡの個数は、特に制限されず、１個でもよいし、２個以上でもよい。前記個数の下限および上限は、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）における前記ＭＳ２結合配列の条件を援用できる。
前記発現ベクター（ｘ１）は、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’側に、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有してもよいし、前記ターゲットＤＮＡの３’側に、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有してもよい。また、前記発現ベクター（ｘ１）が２個以上の前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有する場合、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’側および３’側のいずれ一方に、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有してもよいし、前記ターゲットＤＮＡの５’側および３’側の両方に前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有してもよい。
前記ターゲットＤＮＡの５’側および／または３’側に前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有するとは、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’末端および／または３’末端に、前記コードＤＮＡが直接的に連結している状態でもよいし、５’末端または３’末端に、前記コードＤＮＡが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ターゲットＤＮＡと前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡとの間に、リンカー配列を有してもよい。前記発現ベクターにおいて、前記ターゲットＤＮＡは、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡと連結していることが好ましい。
前記２個以上の前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡは、例えば、それぞれの５’末端と３’末端とが直接的に連結している状態でもよいし、それぞれの５’末端と３’末端とが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡ間に、リンカー配列を有してもよい。
前記発現ベクター（ｘ１）は、例えば、さらに、バイシストロニック性制御配列を含んでもよく、前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、ＩＲＥＳ配列があげられる。前記発現ベクター（ｘ１）は、例えば、複数の前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを挿入する場合、前記バイシストロニック性制御配列を有することが好ましい。前記発現ベクター（ｘ１）がバイシストロニック性制御配列を有する場合、例えば、さらに、擬似ＤＮＡ配列を含むことが好ましい。前記発現ベクター（ｘ１）は、前記バイシストロニック性制御配列を介して、前記疑似ＤＮＡ配列と前記ターゲットＤＮＡとが連結され、この連結した配列の５’側および／または３’側に、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有することが好ましい。前記疑似ＤＮＡ配列と前記ターゲットＤＮＡの位置は、例えば、いずれが、前記バイシストロニック性制御配列の５’側でもよく、具体例としては、５’側に前記疑似ＤＮＡ配列、３’側に前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを有することが好ましい。また、前記ＭＳ２結合配列コードＤＮＡの位置は、例えば、前記連結した配列の５’側および３’側のいずれでもよく、具体例としては、５’側が好ましい。
他方、前記発現ベクター（ｙ１）は、例えば、前記融合タンパク質（Ｙ１）をコードするＤＮＡ（ｙ１）を含む。前記融合タンパク質（Ｙ１）をコードするＤＮＡ（ｙ１）は、例えば、前記ＭＳ２をコードするＤＮＡと、前記ＴＡＰをコードするＤＮＡとを含む。以下、前記ＭＳ２をコードするＤＮＡを、ＭＳ２コードＤＮＡといい、前記ＴＡＰをコードするＤＮＡを、ＴａｐコードＤＮＡという。前記核酸分子（ｙ１）において、前記ＭＳ２コードＤＮＡと前記ＴａｐコードＤＮＡとは、例えば、前記融合タンパク質（Ｙ１）として発現（転写および翻訳）されるように、機能的に挿入されている。
前記発現ベクター（ｙ１）は、例えば、前記ＭＳ２コードＤＮＡの５’側に、前記ＴａｐコードＤＮＡを有してもよいし、前記ＭＳ２コードＤＮＡの３’側に、前記ＴａｐコードＤＮＡを有してもよい。
前記ＭＳ２コードＤＮＡの５’側および／または３’側に前記ＴａｐコードＤＮＡを有するとは、例えば、前記ＭＳ２コードＤＮＡの５’末端および／または３’末端に、前記ＴａｐコードＤＮＡが直接的に連結している状態でもよいし、５’末端または３’末端に、前記ＴａｐコードＤＮＡが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＭＳ２コードＤＮＡと前記ＴａｐコードＤＮＡとの間に、リンカー配列を有してもよい。前記発現ベクター（ｙ１）において、前記ＭＳ２コードＤＮＡおよび前記ＴａｐコードＤＮＡは、例えば、それぞれのアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、連結していることが好ましい。
また、前記発現ベクター（ｘ１）および（ｙ１）は、例えば、それぞれ、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」という）に、前述した各種ＤＮＡを挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＥＦ６等の動物細胞発現用、ｐＢａｃｔ等の鳥類細胞発現用、ｐＦａｓｔＢＡＣ等の昆虫細胞発現用、ｐＹＥＳ２、ｐＰＩＫ３．５Ｋ、ｐＰＩＫ９Ｋ等の酵母細胞発現用等があげられる。
また、前記発現ベクター（ｘ１）および（ｙ１）は、それぞれ、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）および前記融合タンパク質（Ｙ１）の発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記発現ベクター（ｘ１）および（ｙ１）において、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記調節配列は、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）および前記融合タンパク質（Ｙ１）の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。
前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置換してもよい。
本実施形態は、例えば、前記真核細胞に、前記発現ベクター（ｘ１）を導入することで、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現させ、前記発現ベクター（ｙ１）を導入することで、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる。前記真核細胞に対する前記発現ベクター（ｘ１）および前記発現ベクター（ｙ１）の導入順序は、特に制限されず、いずれが先でもよいし、同時でもよい。
前記真核細胞への導入方法は、特に制限されず、例えば、真核細胞の種類、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。前記導入方法は、例えば、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター等を用いた感染導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、バクテリオファージ等を用いた感染導入法、超音波核酸導入法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、超音波核酸導入法、微小ガラス管を用いた直接注入法等のトランスフェクション法があげられる。
前記真核細胞における発現誘導の方法は、特に制限されず、例えば、トランスフェクション後の真核細胞の培養によって行うことができる。前記培養条件は、特に制限されず、前記真核細胞の種類、前記発現ベクターの種類等によって、適宜決定できる。具体例として、培養条件は、例えば、培養温度２５〜３７℃、培養時間１〜１０００時間が好ましく、より好ましくは、培養温度２７〜３７℃、培養時間５〜１００時間である。使用する培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｓｆ−９００ ＩＩ、ＹＰＤ、ＳＤ等があげられる。また、前記培地は、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加してもよい。
このように、本実施形態によれば、真核細胞に前記発現ベクター（ｘ１）および（ｙ１）を導入して、発現誘導を行うことによって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）と前記融合タンパク質（Ｙ１）とが発現され、両者が、ＭＳ２結合配列とＭＳ２とで結合し、前記ターゲットｍＲＮＡが、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）として、核内から細胞質に輸送される。この輸送は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡ単独の輸送よりも促進されることから、前記ターゲットｍＲＮＡを、細胞質における前記ターゲットタンパク質の発現に効率良く利用できる。
つぎに、本発明の実施形態１−２は、前述のように、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）と、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した、宿主となる真核細胞の組換え体とを使用する方法である。本実施形態は、特に示さない限り、前記実施形態１−１の記載を援用できる。
前記核酸分子（ｘ１）は、前記実施形態１−１と同様に、宿主である前記真核細胞に対する外来の核酸分子であり、発現ベクターがあげられる。前記核酸分子（ｘ１）は、前記実施形態１−１と同様である。
前記組換え体は、例えば、前記融合タンパク質（Ｙ１）を恒常的に発現するように形質転換された、真核細胞の組換え体である。前記組換え体の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
本実施形態は、例えば、前記組換え体に前記発現ベクター（ｘ１）を導入し、発現誘導を行えばよい。前記発現ベクター（ｘ１）の導入方法および前記発現誘導の方法は、前記実施形態１−１と同様である。
このように、本実施形態によれば、前記真核細胞の組換え体に前記発現ベクター（ｘ１）を導入して、発現誘導を行うことによって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）と前記融合タンパク質（Ｙ１）とが発現され、両者が、ＭＳ２結合配列とＭＳ２とで結合し、前記ターゲットｍＲＮＡが、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）として、核内から細胞質に輸送される。この輸送は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡ単独の輸送よりも促進されることから、前記ターゲットｍＲＮＡを、細胞質における前記ターゲットタンパク質の発現に効率良く利用できる。
本発明において、前記ＭＳ２結合配列は、前述のように、ＭＳ２に結合するＲＮＡであって、例えば、配列番号１の配列があげられる。前記ＭＳ２結合配列のコードＤＮＡは、例えば、配列番号１の配列において、ＵがＴに置換された配列（配列番号２）があげられる。前記ＭＳ２結合配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．１ＺＤＨ＿Ｒで登録されている。また、例えば、Cecile Keryer-Bibens, Carine Barreau1 and H. Beverley Osborne, Biol. Cell, (2008),100, 125-138にも記載されている。
ＭＳ２結合配列（配列番号１）
5'-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’
ＭＳ２結合配列コードＤＮＡ（配列番号２）
5'-ACATGAGGATCACCCATGT-3’
5'-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’
ＭＳ２結合配列コードＤＮＡ（配列番号２）
5'-ACATGAGGATCACCCATGT-3’
前記ＭＳ２は、前述のように、ＭＳ２ファージ由来のコートタンパク質であって、例えば、配列番号３のアミノ酸配列があげられる。前記ＭＳ２のコードＤＮＡは、例えば、配列番号４の塩基配列があげられる。前記ＭＳ２の配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＥＦ１０８４６５で登録されている。また、例えば、Cecile Keryer-Bibens, Carine Barreau1 and H. Beverley Osborne, Biol. Cell, (2008),100, 125-138にも記載されている。
ＭＳ２（配列番号３）
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
ＭＳ２コードＤＮＡ（配列番号４）
5'-ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTTGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCTCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGCTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATTAAAGTCGAGGTGCCTAAGGTGGCAACTCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAATTAACTATTCCAATTTTCGCTACGAACTCCGATTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAA-3'
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
ＭＳ２コードＤＮＡ（配列番号４）
5'-ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTTGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCTCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGCTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATTAAAGTCGAGGTGCCTAAGGTGGCAACTCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAATTAACTATTCCAATTTTCGCTACGAACTCCGATTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAA-3'
前記ＴＡＰは、前述のように、ｍＲＮＡ輸送に関与するタンパク質であって、例えば、配列番号５のアミノ酸配列があげられる。前記ＴＡＰのコードＤＮＡは、例えば、配列番号６の塩基配列における１３７〜１９９６番目にコードされている。前記ＴＡＰの配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６３６２で登録されている。
ＴＡＰ（配列番号５）
MADEGKSYSEHDDERVNFPQRKKKGRGPFRWKYGEGNRRSGRGGSGIRSSRLEEDDGDVAMSDAQDGPRVRYNPYTTRPNRRGDTWHDRDRIHVTVRRDRAPPERGGAGTSQDGTSKNWFKITIPYGRKYDKAWLLSMIQSKCSVPFTPIEFHYENTRAQFFVEDASTASALKAVNYKILDRENRRISIIINSSAPPHTILNELKPEQVEQLKLIMSKRYDGSQQALDLKGLRSDPDLVAQNIDVVLNRRSCMAATLRIIEENIPELLSLNLSNNRLYRLDDMSSIVQKAPNLKILNLSGNELKSERELDKIKGLKLEELWLDGNSLCDTFRDQSTYISAIRERFPKLLRLDGHELPPPIAFDVEAPTTLPPCKGSYFGTENLKSLVLHFLQQYYAIYDSGDRQGLLDAYHDGACCSLSIPFIPQNPARSSLAEYFKDSRNVKKLKDPTLRFRLLKHTRLNVVAFLNELPKTQHDVNSFVVDISAQTSTLLCFSVNGVFKEVDGKSRDSLRAFTRTFIAVPASNSGLCIVNDELFVRNASSEEIQRAFAMPAPTPSSSPVPTLSPEQQEMLQAFSTQSGMNLEWSQKCLQDNNWDYTRSAQAFTHLKAKGEIPEVAFMK
ＴＡＰコードＤＮＡ（配列番号６）
5'-cggcgcgcgacgtgctttgctgtataaatgcggtggcgcccggcgtagggacacttcggtcctgagcgcttgggagttaggttgtttgccggcgtagcggccagcgcctgagcccgcccttgatcttcgctgtggcatggcggacgaggggaagtcgtacagcgaacacgatgatgaacgcgttaatttccctcaaagaaagaagaaaggccggggtcccttccggtggaaatatggtgaaggaaaccgtaggtctggaagaggcggttctggtattcggtcttcccgccttgaggaagatgatggagatgtggcaatgagtgatgcccaggatggtccccgagtacgatacaacccctataccacccgacctaaccgtcggggtgatacttggcatgatcgagatcgcattcatgttactgtgcggagagacagagctcctccagagagaggaggggctggcaccagccaggatgggacctcaaagaactggttcaagattacaattccttatggcagaaagtatgacaaggcatggctcctgagcatgattcagagcaagtgcagtgtgcccttcacccctattgagtttcactatgagaatacacgggcccagttcttcgttgaagacgccagtactgcctctgcattgaaggctgtcaactataagattttggatcgggagaaccgaaggatatctatcatcatcaactcttctgctccaccccacactatactgaatgaactgaagccagaacaagtagaacagctaaagctgatcatgagcaaacgatacgatggctcccaacaagcccttgacctcaaaggcctccgttcagacccagatttggtggcccagaacattgacgttgtcctgaatcgcagaagctgtatggcagctaccctgaggatcattgaagagaacatccctgagctattgtccttgaacttgagcaacaacaggctgtacaggctggatgacatgtctagcattgttcagaaggcacccaacctgaagatcctaaacctttctggaaatgaattgaagtctgagcgggaattggacaagataaaggggctgaagctagaagagctctggctcgatggaaactccctgtgtgacaccttccgagaccagtccacctacatcagcgccattcgcgaacgatttcccaagttactacgcctggatggccatgagctacccccaccaattgcctttgatgttgaagcccccacgacgttaccgccctgcaagggaagctattttggaacagaaaacttgaagagtctggtcttgcacttcctgcaacagtactatgcaatttacgactctggagaccgacaagggctcctggatgcctaccatgatggggcctgctgttccctgagcattcctttcattcctcagaaccctgcccgaagcagcttagccgagtatttcaaggatagcagaaatgtgaagaagcttaaagaccctaccttgcggttccggctgctgaagcacacgcgtctcaacgttgttgccttcctcaatgagttgcccaaaacccagcacgacgtcaattccttcgtggtagacataagcgcccagacaagcacattgctgtgtttttctgtcaatggagtcttcaaggaagtggacggaaagtcccgggattctttgcgagccttcacccggacattcattgctgttcctgctagcaattcagggctatgtattgtaaatgatgagctatttgtgcggaatgccagttctgaagagatccaaagagccttcgctatgcctgcacccacgccttcctccagcccggtgcccaccctctctccagagcagcaggaaatgttgcaagcattctctacccagtctggcatgaacctcgagtggtcccagaagtgccttcaggacaacaactgggactacaccagatctgcccaggccttcactcatctcaaggccaagggcgagatcccagaagtggcattcatgaagtgatcgtagtcatgcctcagaagcagtcccccctgtaaatagtccttggatattaccgtctggttgtcgtctgtcatctcctcctgtctggcccgaggccgccccgtgactgtgaccgagggagggagggctgcctgatccctctcctcgcctgccttctggaagacttcagaagattgagcctcactggtgccaggaagccaaagcttactttgtagaactgacactaaactacccgaaggacttaggtgctttgtgtacttaaccccaggacctccttactttttaatataaagagtgatgttgtatttcgtgttctgcactttttaatataaagagtgatgttgtatttc-3'
MADEGKSYSEHDDERVNFPQRKKKGRGPFRWKYGEGNRRSGRGGSGIRSSRLEEDDGDVAMSDAQDGPRVRYNPYTTRPNRRGDTWHDRDRIHVTVRRDRAPPERGGAGTSQDGTSKNWFKITIPYGRKYDKAWLLSMIQSKCSVPFTPIEFHYENTRAQFFVEDASTASALKAVNYKILDRENRRISIIINSSAPPHTILNELKPEQVEQLKLIMSKRYDGSQQALDLKGLRSDPDLVAQNIDVVLNRRSCMAATLRIIEENIPELLSLNLSNNRLYRLDDMSSIVQKAPNLKILNLSGNELKSERELDKIKGLKLEELWLDGNSLCDTFRDQSTYISAIRERFPKLLRLDGHELPPPIAFDVEAPTTLPPCKGSYFGTENLKSLVLHFLQQYYAIYDSGDRQGLLDAYHDGACCSLSIPFIPQNPARSSLAEYFKDSRNVKKLKDPTLRFRLLKHTRLNVVAFLNELPKTQHDVNSFVVDISAQTSTLLCFSVNGVFKEVDGKSRDSLRAFTRTFIAVPASNSGLCIVNDELFVRNASSEEIQRAFAMPAPTPSSSPVPTLSPEQQEMLQAFSTQSGMNLEWSQKCLQDNNWDYTRSAQAFTHLKAKGEIPEVAFMK
ＴＡＰコードＤＮＡ（配列番号６）
5'-cggcgcgcgacgtgctttgctgtataaatgcggtggcgcccggcgtagggacacttcggtcctgagcgcttgggagttaggttgtttgccggcgtagcggccagcgcctgagcccgcccttgatcttcgctgtggcatggcggacgaggggaagtcgtacagcgaacacgatgatgaacgcgttaatttccctcaaagaaagaagaaaggccggggtcccttccggtggaaatatggtgaaggaaaccgtaggtctggaagaggcggttctggtattcggtcttcccgccttgaggaagatgatggagatgtggcaatgagtgatgcccaggatggtccccgagtacgatacaacccctataccacccgacctaaccgtcggggtgatacttggcatgatcgagatcgcattcatgttactgtgcggagagacagagctcctccagagagaggaggggctggcaccagccaggatgggacctcaaagaactggttcaagattacaattccttatggcagaaagtatgacaaggcatggctcctgagcatgattcagagcaagtgcagtgtgcccttcacccctattgagtttcactatgagaatacacgggcccagttcttcgttgaagacgccagtactgcctctgcattgaaggctgtcaactataagattttggatcgggagaaccgaaggatatctatcatcatcaactcttctgctccaccccacactatactgaatgaactgaagccagaacaagtagaacagctaaagctgatcatgagcaaacgatacgatggctcccaacaagcccttgacctcaaaggcctccgttcagacccagatttggtggcccagaacattgacgttgtcctgaatcgcagaagctgtatggcagctaccctgaggatcattgaagagaacatccctgagctattgtccttgaacttgagcaacaacaggctgtacaggctggatgacatgtctagcattgttcagaaggcacccaacctgaagatcctaaacctttctggaaatgaattgaagtctgagcgggaattggacaagataaaggggctgaagctagaagagctctggctcgatggaaactccctgtgtgacaccttccgagaccagtccacctacatcagcgccattcgcgaacgatttcccaagttactacgcctggatggccatgagctacccccaccaattgcctttgatgttgaagcccccacgacgttaccgccctgcaagggaagctattttggaacagaaaacttgaagagtctggtcttgcacttcctgcaacagtactatgcaatttacgactctggagaccgacaagggctcctggatgcctaccatgatggggcctgctgttccctgagcattcctttcattcctcagaaccctgcccgaagcagcttagccgagtatttcaaggatagcagaaatgtgaagaagcttaaagaccctaccttgcggttccggctgctgaagcacacgcgtctcaacgttgttgccttcctcaatgagttgcccaaaacccagcacgacgtcaattccttcgtggtagacataagcgcccagacaagcacattgctgtgtttttctgtcaatggagtcttcaaggaagtggacggaaagtcccgggattctttgcgagccttcacccggacattcattgctgttcctgctagcaattcagggctatgtattgtaaatgatgagctatttgtgcggaatgccagttctgaagagatccaaagagccttcgctatgcctgcacccacgccttcctccagcccggtgcccaccctctctccagagcagcaggaaatgttgcaagcattctctacccagtctggcatgaacctcgagtggtcccagaagtgccttcaggacaacaactgggactacaccagatctgcccaggccttcactcatctcaaggccaagggcgagatcccagaagtggcattcatgaagtgatcgtagtcatgcctcagaagcagtcccccctgtaaatagtccttggatattaccgtctggttgtcgtctgtcatctcctcctgtctggcccgaggccgccccgtgactgtgaccgagggagggagggctgcctgatccctctcctcgcctgccttctggaagacttcagaagattgagcctcactggtgccaggaagccaaagcttactttgtagaactgacactaaactacccgaaggacttaggtgctttgtgtacttaaccccaggacctccttactttttaatataaagagtgatgttgtatttcgtgttctgcactttttaatataaagagtgatgttgtatttc-3'
本発明において、前記ＭＳ結合配列、前記ＭＳ２および前記ＴＡＰは、例えば、前述の配列には制限されない。また、前記ＭＳ結合配列、前記ＭＳ２および前記ＴＡＰは、例えば、それぞれの本来の機能を使用可能な範囲で維持していればよく、例えば、前述のようなアミノ酸配列および塩基配列または公知のアミノ酸配列および塩基配列において、１または複数のアミノ酸または塩基が、欠失、置換、挿入および／または付加されている配列であってもよい。
前記ターゲットｍＲＮＡおよびこれをコードするＤＮＡは、特に制限されず、真核細胞内で発現させる前記ターゲットタンパク質の配列に基づいて決定できる。
前記各種コードＤＮＡの調製方法は、特に制限されず、例えば、細胞および生体等から単離してもよいし、既存のベクター等から単離してもよい、化学的手法により合成してもよいし、遺伝子工学的手法により合成してもよい。
（２）タンパク質の発現方法
本発明の第１のタンパク質の発現方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、前記本発明のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の第１のタンパク質の発現方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、前記本発明のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の発現方法は、前記本発明の第１のｍＲＮＡ輸送促進方法を行うことが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明の発現方法によれば、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法によって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）および前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現し、核内から細胞質に前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）におけるターゲットｍＲＮＡが輸送される。このため、引き続き前記ターゲットｍＲＮＡから、これがコードするターゲットタンパク質を合成できる。前記ターゲットｍＲＮＡからのターゲットタンパク質の合成は、例えば、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法における発現誘導によって行うことができる。具体例としては、例えば、真核細胞内で前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）と前記融合タンパク質を発現させる処理を行うことで、引き続き前記融合タンパク質における前記ターゲットｍＲＮＡからのターゲットタンパク質の翻訳を行うことができる。したがって、前記ターゲットタンパク質の合成の条件は、特に制限されず、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法における誘導方法の条件が、例示として援用できる。
（３）タンパク質の製造方法
本発明の第１のタンパク質の製造方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の製造方法であって、前記本発明のタンパク質の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の第１のタンパク質の製造方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の製造方法であって、前記本発明のタンパク質の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の製造方法は、前記本発明の第１のタンパク質の発現方法を行うことが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明の製造方法は、例えば、さらに、真核細胞において発現した前記ターゲットタンパク質を精製する工程を有してもよい。前記精製方法は、特に制限されず、前記ターゲットタンパク質の種類によって、適宜設定できる。前記精製方法としては、例えば、塩析、各種クロマトグラフィー、限外ろ過等があげられる。
（４）キット
本発明のキットは、前記本発明の第１のターゲットｍＲＮＡの輸送促進方法、前記本発明の第１のタンパク質の発現方法および／または前記本発明の第１のタンパク質の製造方法に使用するキットであり、２種類のキットがあげられる。
本発明のキットは、前記本発明の第１のターゲットｍＲＮＡの輸送促進方法、前記本発明の第１のタンパク質の発現方法および／または前記本発明の第１のタンパク質の製造方法に使用するキットであり、２種類のキットがあげられる。
本発明のキットは、下記（ａ１）を含むことを特徴とする。
（ａ１）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）
（ａ１）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）
本発明のキットは、下記（ａ１’）を含むことを特徴とする。
（ａ１’）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
（ａ１’）ターゲットｍＲＮＡとＭＳ２結合配列とを含む融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
本発明のキットにおいて、前記核酸分子（ｘ１）、前記核酸分子（ｙ１）および前記真核細胞の組換え体は、前述の通りである。本発明のキットは、例えば、さらに、前記核酸分子（ｘ１）を真核細胞に導入するための導入試薬、真核細胞を培養するための培養試薬、使用説明書等を含んでもよい。
（実施形態２）
（１）ｍＲＮＡ輸送促進方法
本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法は、前述のように、真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、下記（Ａ２）工程を有することを特徴とする。
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
（１）ｍＲＮＡ輸送促進方法
本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法は、前述のように、真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、下記（Ａ２）工程を有することを特徴とする。
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程
本発明の実施形態２は、特に示さない限り、本発明の実施形態１の説明を援用できる。本発明の実施形態２において、例えば、真核細胞、ターゲットｍＲＮＡ、ターゲットタンパク質、形質転換の方法等は、前記実施形態１と同様である。
本発明において、Ｒｅｖは、ＨＩＶ−１由来のコートタンパク質であり、イントロンを含むウイルスＲＮＡの核外輸送機構を刺激するタンパク質である。また、ＲＲＥは、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡであり、Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔと呼ばれ、５つのステムループ構造を有し、その中で、ステムループIIＢは、前記Ｒｅｖとの結合配列として機能するＲＮＡである。本発明において、ＲＲＥは、例えば、ステムループIIＢを含む配列でもよいし、ステムループIIＢからなる配列でもよい。本発明において、前記ターゲットｍＲＮＡは、前述のように、何ら制限されず、例えば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、前記タンパク質も何ら制限されない。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）において、前記ＲＲＥの個数は、特に制限されず、１個でもよいし、２個以上でもよい。前記個数の下限は、例えば、２個が好ましく、より好ましくは３個であり、さらに好ましくは４個であり、上限は、例えば、１０個であり、好ましくは５個である。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側に、前記ＲＲＥを有してもよいし、前記ターゲットｍＲＮＡの３’側に、前記ＲＲＥを有してもよい。また、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）が２個以上の前記ＲＲＥを有する場合、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および３’側のいずれか一方に、前記ＲＲＥを有してもよいし、前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および３’側の両方に前記ＲＲＥを有してもよい。
前記ターゲットｍＲＮＡの５’側および／または３’側に前記ＲＲＥを有するとは、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡの５’末端および／または３’末端に、前記配列が、直接的に連結している状態でもよいし、間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡと前記ＲＲＥとの間に、リンカー配列を有してもよい。前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）において、前記ターゲットｍＲＮＡは、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、前記ＲＲＥと連結していることが好ましい。
前記２個以上の前記ＲＲＥは、例えば、それぞれの５’末端と３’末端とが直接的に連結している状態でもよいし、それぞれの５’末端と３’末端とが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＲＲＥ間に、リンカー配列を有してもよい。
前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）は、例えば、５’末端がキャップ構造を有し、３’末端がポリアデニル化されていることが好ましい。
前記タンパク質（Ｙ２）は、Ｒｅｖを含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。前記タンパク質（Ｙ２）は、例えば、１分子のＲｅｖからなるタンパク質でもよいし、１分子のＲｅｖを含むタンパク質でもいし、また、２分子以上のＲｅｖを含む融合タンパク質でもよい。前記融合タンパク質の場合、前記Ｒｅｖの分子数は、特に制限されず、その下限は、例えば、１個が好ましく、より好ましくは２個であり、さらに好ましくは３個であり、上限は、例えば、５個であり、好ましくは４個である。
本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法において、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）および前記タンパク質（Ｙ２）を真核細胞で発現させる方法は、特に制限されない。具体的な方法として、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）発現用の核酸分子と前記タンパク質（Ｙ２）発現用の核酸分子とを、真核細胞に導入する実施形態２−１、および、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）発現用の核酸分子を、前記タンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体に導入する実施形態２−２が例示できる。以下に、これらの実施形態を説明するが、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
本発明の実施形態２−１は、前述のように、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）と、前記タンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）と、宿主となる真核細胞を使用する方法である。
前記核酸分子（ｘ２）および前記核酸分子（ｙ２）は、それぞれ、宿主である前記真核細胞に対する外来の核酸分子であり、例えば、発現ベクターがあげられる。以下、前記核酸分子（ｘ２）および（ｙ２）が、発現ベクター（ｘ２）および（ｙ２）である例をあげて説明するが、本発明の核酸分子は、これには制限されない。
前記発現ベクター（ｘ２）は、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）をコードするＤＮＡ（ｘ２）を含む。前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）をコードするＤＮＡ（ｘ２）は、例えば、前記ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ、つまり、前記ターゲットｍＲＮＡをコードするＤＮＡと、前記ＲＲＥをコードするＤＮＡとを含む。以下、前記ターゲットｍＲＮＡをコードするＤＮＡを、ターゲットＤＮＡといい、前記ＲＲＥをコードするＤＮＡを、ＲＲＥコードＤＮＡという。前記発現ベクター（ｘ２）において、前記ターゲットＤＮＡと前記ＲＲＥコードＤＮＡとは、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）として転写されるように、機能的に挿入されている。
前記発現ベクター（ｘ２）において、例えば、前記ＲＲＥコードＤＮＡの個数は、特に制限されず、１個でもよいし、２個以上でもよい。前記個数の下限および上限は、例えば、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）における前記ＲＲＥの条件を援用できる。
前記発現ベクター（ｘ２）は、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’側に、前記ＲＲＥコードＤＮＡを有してもよいし、前記ターゲットＤＮＡの３’側に、前記ＲＲＥコードＤＮＡを有してもよい。また、前記発現ベクター（ｘ２）が２個以上の前記ＲＲＥコードＤＮＡを有する場合、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’側および３’側のいずれ一方に、前記ＲＲＥコードＤＮＡを有してもよいし、前記ターゲットＤＮＡの５’側および３’側の両方に前記ＲＲＥコードＤＮＡを有してもよい。
前記ターゲットＤＮＡの５’側および／または３’側に前記ＲＲＥコードＤＮＡを有するとは、例えば、前記ターゲットＤＮＡの５’末端および／または３’末端に、前記コードＤＮＡが直接的に連結している状態でもよいし、５’末端または３’末端に、前記コードＤＮＡが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ターゲットＤＮＡと前記ＲＲＥコードＤＮＡとの間に、リンカー配列を有してもよい。前記発現ベクターにおいて、前記ターゲットＤＮＡは、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、前記ＲＲＥコードＤＮＡと連結していることが好ましい。
前記２個以上の前記ＲＲＥコードＤＮＡは、例えば、それぞれの５’末端と３’末端とが直接的に連結している状態でもよいし、それぞれの５’末端と３’末端とが間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＲＲＥコードＤＮＡ間に、リンカー配列を有してもよい。
前記発現ベクター（ｘ２）は、例えば、さらに、バイシストロニック性制御配列を含んでもよく、前記バイシストロニック性制御配列は、例えば、ＩＲＥＳ配列があげられる。前記発現ベクター（ｘ２）は、例えば、複数の前記ＲＲＥコードＤＮＡを挿入する場合、前記バイシストロニック性制御配列を有することが好ましい。前記発現ベクター（ｘ２）がバイシストロニック性制御配列を有する場合、例えば、さらに、擬似ＤＮＡ配列も含むことが好ましい。前記発現ベクター（ｘ２）は、前記バイシストロニック性制御配列を介して、前記疑似ＤＮＡ配列と前記ターゲットＤＮＡとが連結され、この連結した配列の５’側および／または３’側に、前記ＲＲＥコードＤＮＡを有することが好ましい。前記疑似ＤＮＡ配列と前記ターゲットＤＮＡの位置は、例えば、いずれが、前記バイシストロニック性制御配列の５’側でもよく、具体例としては、５’側に前記疑似ＤＮＡ配列、３’側に前記ＲＲＥコードＤＮＡを有することが好ましい。また、前記ＲＲＥコードＤＮＡの位置は、例えば、前記連結した配列の５’側および３’側のいずれでもよく、具体例としては、５’側が好ましい。
他方、前記発現ベクター（ｙ２）は、例えば、前記Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）をコードするＤＮＡ（ｙ２）を含む。前記タンパク質（Ｙ２）をコードするＤＮＡ（ｙ２）は、例えば、前記ＲｅｖをコードするＤＮＡを含む。以下、前記ＲｅｖをコードするＤＮＡを、ＲｅｖコードＤＮＡという。前記核酸分子（ｙ２）において、前記ＲｅｖコードＤＮＡは、例えば、前記タンパク質（Ｙ２）として発現（転写および翻訳）されるように、機能的に挿入されている。
前記発現ベクター（ｙ２）は、例えば、前記ＲｅｖコードＤＮＡを１個有してもよいし、２個以上有してもよく、後者の場合、各ＲｅｖコードＤＮＡは、例えば、直接的に連結している状態でもよいし、間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、前記ＲｅｖコードＤＮＡの間に、リンカー配列を有してもよい。前記発現ベクター（ｙ２）が複数の前記ＲｅｖコードＤＮＡを有する場合、例えば、それぞれのアミノ酸配列に従った読み枠を維持するように、連結していることが好ましい。
また、前記発現ベクター（ｘ２）および（ｙ２）は、例えば、それぞれ、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」という）に、前述した各種ＤＮＡを挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記実施形態１と同様である。
また、前記発現ベクター（ｘ２）および（ｙ２）は、それぞれ、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）および前記タンパク質（Ｙ２）の発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、前記実施形態１と同様である。前記発現ベクター（ｘ２）および（ｙ２）において、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記調節配列は、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）および前記タンパク質（Ｙ２）の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。
前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置換してもよい。
本実施形態は、例えば、前記真核細胞に、前記発現ベクター（ｘ２）を導入することで、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現させ、前記発現ベクター（ｙ２）を導入することで、前記タンパク質（Ｙ２）を発現させる。前記真核細胞に対する前記発現ベクター（ｘ２）および前記発現ベクター（ｙ２）の導入順序は、特に制限されず、いずれが先でもよいし、同時でもよい。
前記真核細胞への導入方法および前記真核細胞における発現誘導の方法は、特に制限されず、例えば、前記実施形態１と同様である。
このように、本実施形態によれば、真核細胞に前記発現ベクター（ｘ２）および（ｙ２）を導入して、発現誘導を行うことによって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）と前記タンパク質（Ｙ２）とが発現され、両者が、ＲＲＥとＲｅｖとで結合し、前記ターゲットｍＲＮＡが、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）として、核内から細胞質に輸送される。この輸送は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡ単独の輸送よりも促進されることから、前記ターゲットｍＲＮＡを、細胞質における前記ターゲットタンパク質の発現に効率良く利用できる。
つぎに、本発明の実施形態２−２は、前述のように、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）と、前記タンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した、宿主となる真核細胞の組換え体とを使用する方法である。本実施形態は、特に示さない限り、前記実施形態１および前記実施形態２−１の記載を援用できる。
前記核酸分子（ｘ２）は、前記実施形態２−１と同様に、宿主である前記真核細胞に対する外来の核酸分子であり、例えば、発現ベクターがあげられる。前記核酸分子（ｘ２）は、前記実施形態２−１と同様である。
前記組換え体は、例えば、前記タンパク質（Ｙ２）を恒常的に発現するように形質転換された、真核細胞の組換え体である。前記組換え体の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
本実施形態は、例えば、前記組換え体に前記発現ベクター（ｘ２）を導入し、発現誘導を行えばよい。前記発現ベクター（ｘ２）の導入方法および前記発現誘導の方法は、前記実施形態１と同様である。
このように、本実施形態によれば、前記真核細胞の組換え体に前記発現ベクター（ｘ２）を導入して、発現誘導を行うことによって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）と前記タンパク質（Ｙ２）とが発現され、両者が、ＲＲＥとＲｅｖとで結合し、前記ターゲットｍＲＮＡが、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）として、核内から細胞質に輸送される。この輸送は、例えば、前記ターゲットｍＲＮＡ単独の輸送よりも促進されることから、前記ターゲットｍＲＮＡを、細胞質における前記ターゲットタンパク質の発現に効率良く利用できる。
本発明において、前記ＲＲＥは、前述のように、Ｒｅｖと結合するＨＩＶ−１由来のＲＮＡであって、例えば、配列番号７の配列があげられる。配列番号７の塩基配列において、下線部の９１〜１０９番目が、ステムループIIＢの配列である。前記ＲＲＥのコードＤＮＡは、例えば、配列番号７の配列において、ＵがＴに置換された配列（配列番号８）があげられる。前記ＲＲＥの配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＦＪ６４９３３２で登録されている。
ＲＲＥ（配列番号７）
5'-gagcagugggaauaugagcuuuguuccuuggguucuugggagcagcaggaagcacuaugggcgcaccgucaaugacgcugacgguacaggccagacaauuauugucugauauagugcagcagcagaacaauuugcugagggcuauugaggcgcaacagcaucuguugcaacucacagucuggggcaucaaacagcuccaggcaagaauccuggcuguggaaagauaccuaaaggaucaacagcuccu-3'
ＲＲＥコードＤＮＡ（配列番号８）
5'-gagcagtgggaatatgagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcaccgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctgatatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct-3’
5'-gagcagugggaauaugagcuuuguuccuuggguucuugggagcagcaggaagcacuaugggcgcaccgucaaugacgcugacgguacaggccagacaauuauugucugauauagugcagcagcagaacaauuugcugagggcuauugaggcgcaacagcaucuguugcaacucacagucuggggcaucaaacagcuccaggcaagaauccuggcuguggaaagauaccuaaaggaucaacagcuccu-3'
ＲＲＥコードＤＮＡ（配列番号８）
5'-gagcagtgggaatatgagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcaccgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctgatatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct-3’
前記Ｒｅｖは、前述のように、ＨＩＶ−１由来のタンパク質であって、例えば、配列番号９のアミノ酸配列があげられる。前記ＲｅｖのコードＤＮＡは、例えば、配列番号１０の塩基配列があげられる。前記Ｒｅｖの配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００１８０２で登録されている。
Ｒｅｖ（配列番号９）
MAGRSGDSDEELIRTVRLIKLLYQSNPPPNPEGTRQARRNRRRRWRERQRQIHSISERILGTYLGRSAEPVPLQLPPLERLTLDCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPTVLESGTKE
ＲｅｖコードＤＮＡ（配列番号１０）
5'-atggcaggaagaagcggagacagcgacgaagagctcatcagaacagtcagactcatcaagcttctctatcaaagcaacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatccttggcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacagtattggagtcaggaactaaagaatag-3'
MAGRSGDSDEELIRTVRLIKLLYQSNPPPNPEGTRQARRNRRRRWRERQRQIHSISERILGTYLGRSAEPVPLQLPPLERLTLDCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPTVLESGTKE
ＲｅｖコードＤＮＡ（配列番号１０）
5'-atggcaggaagaagcggagacagcgacgaagagctcatcagaacagtcagactcatcaagcttctctatcaaagcaacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatccttggcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacagtattggagtcaggaactaaagaatag-3'
本発明において、前記ＲＲＥおよび前記Ｒｅｖは、例えば、前述の配列には制限されない。また、前記ＲＲＥおよび前記Ｒｅｖは、例えば、それぞれの本来の機能を使用可能な範囲で維持していればよく、前述のようなアミノ酸配列および塩基配列または公知のアミノ酸配列および塩基配列において、１または複数のアミノ酸または塩基が、欠失、置換、挿入および／または付加されている配列であってもよい。
（２）タンパク質の発現方法
本発明の第２のタンパク質の発現方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、前記本発明の第２のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の第２のタンパク質の発現方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、前記本発明の第２のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の発現方法は、前記本発明の第２のｍＲＮＡ輸送促進方法を行うことが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明の発現方法によれば、前記本発明の第２のｍＲＮＡ輸送促進方法によって、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）および前記タンパク質（Ｙ２）を発現し、核内から細胞質に前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）におけるターゲットｍＲＮＡが輸送される。このため、引き続き前記ターゲットｍＲＮＡから、これがコードするターゲットタンパク質を合成できる。前記ターゲットｍＲＮＡからのターゲットタンパク質の合成は、例えば、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法における発現誘導によって行うことができる。具体例としては、例えば、真核細胞内で前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）と前記タンパク質を発現させる処理を行うことで、引き続き前記融合タンパク質における前記ターゲットｍＲＮＡからのターゲットタンパク質の翻訳を行うことができる。したがって、前記ターゲットタンパク質の合成の条件は、特に制限されず、前記本発明のｍＲＮＡ輸送促進方法における誘導方法の条件が、例示として援用できる。
（３）タンパク質の製造方法
本発明のタンパク質の製造方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の製造方法であって、前記本発明の第２のタンパク質の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明のタンパク質の製造方法は、真核細胞におけるターゲットタンパク質の製造方法であって、前記本発明の第２のタンパク質の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とする。
本発明の製造方法は、前記本発明の第２のタンパク質の発現方法を行うことが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
本発明の製造方法は、例えば、さらに、真核細胞において発現した前記ターゲットタンパク質を精製する工程を有してもよい。前記精製方法は、特に制限されず、前記ターゲットタンパク質の種類によって、適宜設定できる。前記精製方法としては、例えば、塩析、各種クロマトグラフィー、限外ろ過等があげられる。
（４）キット
本発明の第２のキットは、前記本発明の第２のターゲットｍＲＮＡの輸送促進方法、前記本発明の第２のタンパク質の発現方法および／または前記本発明の第２のタンパク質の製造方法に使用するキットであり、２種類のキットがあげられる。
本発明の第２のキットは、前記本発明の第２のターゲットｍＲＮＡの輸送促進方法、前記本発明の第２のタンパク質の発現方法および／または前記本発明の第２のタンパク質の製造方法に使用するキットであり、２種類のキットがあげられる。
本発明のキットは、下記（ａ２）を含むことを特徴とする。
（ａ２）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）
（ａ２）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）
本発明のキットは、下記（ａ２’）を特徴とする。
（ａ２’）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
（ａ２’）ターゲットｍＲＮＡとＲＲＥとを含む融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
本発明のキットにおいて、前記核酸分子（ｘ２）、前記核酸分子（ｙ２）および前記真核細胞の組換え体は、前述の通りである。本発明のキットは、例えば、さらに、前記核酸分子（ｘ２）を真核細胞に導入するための導入試薬、真核細胞を培養するための培養試薬、使用説明書等を含んでもよい。
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
［実施例１］
本例では、ＭＳ結合配列とルシフェラーゼｍＲＮＡとの融合ＲＮＡを発現するＬｕｃ−ＭＳ２発現ベクターと、前記ＭＳ２結合配列が結合するＭＳ２とＴＡＰとの融合タンパク質を発現するＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとを使用し、動物細胞における、ルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定した。
本例では、ＭＳ結合配列とルシフェラーゼｍＲＮＡとの融合ＲＮＡを発現するＬｕｃ−ＭＳ２発現ベクターと、前記ＭＳ２結合配列が結合するＭＳ２とＴＡＰとの融合タンパク質を発現するＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとを使用し、動物細胞における、ルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定した。
（１）Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクター
以下の方法により、Ｌｕｃコード配列の３’末端にＭＳ２結合配列のコード配列を連結した、Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターを作製した。具体的には、ＭＳ２結合配列コードＤＮＡの連続数を６個（６×）、４個（４×）および２個（２×）とした３種類のＬｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターを作製した。また、コントロールとして、ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを含まないＬｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクター（０×）を作製した。
以下の方法により、Ｌｕｃコード配列の３’末端にＭＳ２結合配列のコード配列を連結した、Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターを作製した。具体的には、ＭＳ２結合配列コードＤＮＡの連続数を６個（６×）、４個（４×）および２個（２×）とした３種類のＬｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターを作製した。また、コントロールとして、ＭＳ２結合配列コードＤＮＡを含まないＬｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクター（０×）を作製した。
ｐＧＬ３ベクター（プロメガ社）を鋳型としてＰＣＲを行い、ルシフェラーゼのコード配列を増幅した。その際、以下のプライマーセットを用い、ルシフェラーゼのコード配列の開始コドン５’側および終止コドン３’側に、それぞれ、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩの認識配列を導入した。下記配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
ルシフェラーゼコード配列（配列番号１１）
5'-atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa-3’
5'-atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa-3’
ルシフェラーゼ用プライマーセット
Ｌｕｃ−Ｆ（配列番号１２）
5'-atggatccatggaagacgccgccaaaaacat-3'
Ｌｕｃ−Ｒ（配列番号１３）
5'-atctcgagttacacggcgatctttcc-3'
Ｌｕｃ−Ｆ（配列番号１２）
5'-atggatccatggaagacgccgccaaaaacat-3'
Ｌｕｃ−Ｒ（配列番号１３）
5'-atctcgagttacacggcgatctttcc-3'
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（インビトロゲン社）のＢａｍＨＩとＸｈｏＩサイトに連結し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃを得た。このベクターは、ＭＳ２結合配列のコード配列を有していない（０×）ことから、以下、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ−ＭＳ２−０×という。
つぎに、ｐＳＬ＿ＭＳ２−６Ｘ（Laboratory of Robert H Singer, PhDから分譲、http://www.singerlab.org）を鋳型として、ＰＣＲを行い、連続する６個のＭＳ２結合配列のコード配列を増幅した。１個のＭ２結合配列のコード配列を、配列番号２に示す。その際、以下のプライマーセットを用い、連続する６個のＭＳ２結合配列のコード配列の開始コドン５’側および終止コドン３’側に、それぞれ、ＸｈｏＩの認識配列を導入した。下記配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
ＭＳ２結合配列コードＤＮＡ（配列番号２）
5’-ACATGAGGATCACCCATGT-3’
ＭＳ２結合配列６×用プライマーセット
ＭＳ２−Ｆ（配列番号１４）
5'-tactcgaggaattcgaatggccatggga-3'
ＭＳ２−Ｒ（配列番号１５）
5'-atctcgaggccatatgcatcctaggccta-3'
5’-ACATGAGGATCACCCATGT-3’
ＭＳ２結合配列６×用プライマーセット
ＭＳ２−Ｆ（配列番号１４）
5'-tactcgaggaattcgaatggccatggga-3'
ＭＳ２−Ｒ（配列番号１５）
5'-atctcgaggccatatgcatcctaggccta-3'
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、前記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＬｕｃのＸｈｏＩサイトに連結し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ−ＭＳ２−６×を得た。このベクターは、連続する６個のＭＳ２結合配列のコード配列を有するベクターである。
つぎに、前記ｐＳＬ＿ＭＳ２−６Ｘ（Laboratory of Robert H Singer, PhDから分譲、http://www.singerlab.org）を鋳型として、ＰＣＲを行い、連続する２個または４個のＭＳ２結合配列のコード配列を増幅した。その際、以下のプライマーセットを用い、連続するＭＳ２結合配列のコード配列の開始コドン５’側および終止コドン３’側に、それぞれ、ＸｈｏＩの認識配列を導入した。下記配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
ＭＳ２結合配列４×または２×用プライマーセット
ＭＳ２−Ｆ（配列番号１６）
5'-tactcgaggaattcgaatggccatggga-3'
ＭＳ２−Ｒ２（配列番号１７）
5'-atctcgagccttaggatctaatgaacccgg-3'
ＭＳ２−Ｆ（配列番号１６）
5'-tactcgaggaattcgaatggccatggga-3'
ＭＳ２−Ｒ２（配列番号１７）
5'-atctcgagccttaggatctaatgaacccgg-3'
得られた２種類の長さのＰＣＲ産物（４×、２×）を、それぞれ制限酵素ＸｈｏＩで消化し、前記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＬｕｃのＸｈｏＩサイトに連結し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ−ＭＳ２−４×およびｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ−ＭＳ２−２×を得た。これらのベクターは、前者が、連続する４個のＭＳ２結合配列のコード配列を有するベクターであり、後者が、連続２個のＭＳ２結合配列のコード配列を有するベクターである。
（２）ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクター
ＭＳ２−ＴＡＰ融合タンパク質を発現するＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとして、ＭＳ２コード配列（配列番号４）と、その３’末端にＴＡＰコード配列（配列番号６における１３７〜１９９６番目）が連結されたｐＭＳ２−ＴＡＰを使用した。また、コントロールベクターとして、ＭＳ２−ＴＡＰ融合タンパク質を発現しないｐＭＳ２−ＧＣ８０を使用した。これらのベクターは、Ｂｒｙａｎ Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ博士（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）より分譲されたものを使用した。
ＭＳ２−ＴＡＰ融合タンパク質を発現するＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとして、ＭＳ２コード配列（配列番号４）と、その３’末端にＴＡＰコード配列（配列番号６における１３７〜１９９６番目）が連結されたｐＭＳ２−ＴＡＰを使用した。また、コントロールベクターとして、ＭＳ２−ＴＡＰ融合タンパク質を発現しないｐＭＳ２−ＧＣ８０を使用した。これらのベクターは、Ｂｒｙａｎ Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ博士（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）より分譲されたものを使用した。
なお、作製したいずれの発現ベクターについても、変異がないこと、および、読み枠にずれがないことを、シーケンスによって確認した。
（３）一過性発現のトランスフェクション
ＣＨＯ細胞は、ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を使用し、ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用し、それぞれの培養条件は、３７℃、ＣＯ２５％、湿度１００％とした。
ＣＨＯ細胞は、ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を使用し、ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用し、それぞれの培養条件は、３７℃、ＣＯ２５％、湿度１００％とした。
１２ウェルプレートでＣＨＯ細胞およびＨｅＬａ細胞を培養し、その培養細胞に、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクター、前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクター、さらに標準化用のｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した後、製品のプロトコールに基づいてトランスフェクションした。前記各発現ベクターは、１ウェルあたり１μｇのプラスミド量になるように添加した。また、コントロールとして、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターおよびコントロールベクターｐＭＳ２−ＧＣ８０をトランスフェクションした。なお、トランスフェクション効率については、コントロールとしてｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を用いて、標準化した。
（３）ルシフェラーゼアッセイ
つぎに、トランスフェクションした２４時間後の細胞を回収し、回収した細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後の細胞に、溶解試薬（商品名１×Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ、プロメガ社）を混合し、氷上で３０分間インキュベートした後、遠心処理（１２０００ｒｐｍ、５分）により、上清を細胞抽出液として得た。なお、細胞抽出液のウエスタンブロットにより、ＭＳ２とＴＡＰの融合タンパク質が発現していることは確認済みである。前記各トランスフェクション細胞から得られた細胞抽出液について、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて、そのプロトコールにしたがって、ルミノメータにより酵素活性を測定した。
つぎに、トランスフェクションした２４時間後の細胞を回収し、回収した細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後の細胞に、溶解試薬（商品名１×Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ、プロメガ社）を混合し、氷上で３０分間インキュベートした後、遠心処理（１２０００ｒｐｍ、５分）により、上清を細胞抽出液として得た。なお、細胞抽出液のウエスタンブロットにより、ＭＳ２とＴＡＰの融合タンパク質が発現していることは確認済みである。前記各トランスフェクション細胞から得られた細胞抽出液について、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて、そのプロトコールにしたがって、ルミノメータにより酵素活性を測定した。
そして、ＭＳ２結合配列が０×であり、ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターを導入していない比較例のルシフェラーゼ活性を１として、相対活性を求めた。この結果を、表１に示す。表１において、「ＭＳ２結合配列」の行における「０×、２×、４×および６×」は、それぞれ、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターの種類であって、前記ベクターに挿入されたＭＳ２結合配列コードＤＮＡの連続する個数を示し、「ＭＳ２−ＴＡＰ」の行において、「−」は、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターと前記コントロールベクターｐＭＳ２−ＧＣ８０を導入したこと（ＭＳ２−ＴＡｐ誘導タンパク質未発現）を示し、「＋」は、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターおよび前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターの両方を導入したこと（ＭＳ２−ＴＡｐ誘導タンパク質発現）を示す。
表１に示すように、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞のいずれにおいても、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターと前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとを共導入した実施例（２×、４×または６×、およびＭＳ２−ＴＡＰ（＋））は、前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターを導入していない比較例（０×およびＭＳ２−ＴＡＰ（−））と比べて、ルシフェラーゼの活性量を著しく増加できた。
また、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターを使用した各系について、ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターを導入していない比較例のルシフェラーゼ活性を１として、相対活性を求めた。この結果を、表２に示す。表２において、「ＭＳ２結合配列」の行における「２×、４×および６×」は、それぞれ、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターの種類であって、前記ベクターに挿入されたＭＳ２結合配列コードＤＮＡの連続する個数を示し、「ＭＳ２−ＴＡＰ（−）」は、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターと前記コントロールベクターｐＭＳ２−ＧＣ８０を導入したこと（ＭＳ２−ＴＡｐ誘導タンパク質未発現）を示し、「ＭＳ２−ＴＡＰ（＋）」は、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターおよび前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターの両方を導入したこと（ＭＳ２−ＴＡｐ誘導タンパク質発現）を示す。
表２に示すように、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞のいずれにおいても、前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとを共導入した実施例は、前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターを未導入の比較例と比較して、ルシフェラーゼの活性量を著しく増加できた。
これらの結果に示すように、前記実施例は、前記比較例と比べて、ルシフェラーゼの発現量が増加したといえる。そして、実施例および比較例は、いずれも、ＭＳ２結合配列のコード配列の個数が異なるのみであり、それ以外は同様のルシフェラーゼ発現ベクター（前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクター）を使用していることから、核内におけるｍＲＮＡの転写効率は、ほぼ同一である。したがって、これらの結果から、前記Ｌｕｃ−ＭＳ２結合配列発現ベクターと前記ＭＳ２−ＴＡＰ発現ベクターとの共導入により、ルシフェラーゼｍＲＮＡとＭＳ２結合配列との融合ＲＮＡ、および、ＭＳ２とＴＡＰとの融合タンパク質を発現させることで、核内から細胞質へのｍＲＮＡの輸送が促進され、結果として、前記ｍＲＮＡを有効に活用してルシフェラーゼタンパク質を合成できたといえる。
［実施例２］
本例では、ＲＲＥとルシフェラーゼｍＲＮＡとの融合ＲＮＡを発現するＬｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターと、前記ＲＲＥ配列が結合するＲｅｖを含むタンパク質を発現するＲｅｖ発現ベクターとを使用し、動物細胞における、ルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定した。
本例では、ＲＲＥとルシフェラーゼｍＲＮＡとの融合ＲＮＡを発現するＬｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターと、前記ＲＲＥ配列が結合するＲｅｖを含むタンパク質を発現するＲｅｖ発現ベクターとを使用し、動物細胞における、ルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定した。
（１）Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクター
以下の方法により、Ｌｕｃコード配列の３’末端にＲＲＥコード配列を連結した、Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターを作製した。また、コントロールとして、前記実施例１におけるｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃを使用した。
以下の方法により、Ｌｕｃコード配列の３’末端にＲＲＥコード配列を連結した、Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターを作製した。また、コントロールとして、前記実施例１におけるｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃを使用した。
ｐＬＵＣＳＡＬＲＲＥ（Guillaume M. Hautbergue, Ming-Lung Hung, Matthew J. Walsh, Ambrosius P.L. Snijders, Chung-Te Chang, Rachel Jones, Chris P. Ponting, Mark J. Dickman, and Stuart A. Wilson1, Curr Biol. (2009) 19, 1918−1924、Dr. Wilson Sから分譲）を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＲＲＥのコード配列を増幅した。ＲＲＥのコード配列を、配列番号８に示す。その際、以下のプライマーセットを用い、ＲＲＥのコード配列の開始コドン５’側および終止コドン３’側に、それぞれ、ＸｈｏＩの認識配列を導入した。下記配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
ＲＲＥコードＤＮＡ（配列番号８）
5'-gagcagtgggaatatgagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcaccgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctgatatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct-3’
5'-gagcagtgggaatatgagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcaccgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctgatatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct-3’
ＲＲＥのコード配列用プライマーセット
ＲＲＥ−Ｆ（配列番号１８）
5'-atctcgaggagcagtgggaatatgagct-3'
ＲＲＥ−Ｒ（配列番号１９）
5'-atctcgagaggagctgttgatcctttagg-3'
ＲＲＥ−Ｆ（配列番号１８）
5'-atctcgaggagcagtgggaatatgagct-3'
ＲＲＥ−Ｒ（配列番号１９）
5'-atctcgagaggagctgttgatcctttagg-3'
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、前記実施例１で作製した前記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＬｕｃのＸｈｏＩサイトに連結し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ−ＲＲＥを得た。
（２）Ｒｅｖ発現ベクター
Ｒｅｖタンパク質を発現するＲｅｖ発現ベクターとして、Ｒｅｖコード配列（配列番号１０）の５’末端に、ＨＡタグのコード配列が連結された、ｐＣＧ−ＨＡ−Ｒｅｖを使用した。また、コントロールとして、Ｒｅｖのコード配列を有さないｐＣＧ−ＨＡを使用した。これらのベクターは、木村 富紀博士（立命館大学総合理工学院薬学部薬学科）より分譲されたものを使用した。
Ｒｅｖタンパク質を発現するＲｅｖ発現ベクターとして、Ｒｅｖコード配列（配列番号１０）の５’末端に、ＨＡタグのコード配列が連結された、ｐＣＧ−ＨＡ−Ｒｅｖを使用した。また、コントロールとして、Ｒｅｖのコード配列を有さないｐＣＧ−ＨＡを使用した。これらのベクターは、木村 富紀博士（立命館大学総合理工学院薬学部薬学科）より分譲されたものを使用した。
なお、作製したいずれの発現ベクターについても、変異がないこと、および、読み枠にずれがないことを、シーケンスによって確認した。
（３）一過性発現のトランスフェクション
実施例１と同様にして、ＣＨＯ細胞およびＨｅＬａ細胞に、前述の発現ベクターを導入して、一過性で発現させた。
実施例１と同様にして、ＣＨＯ細胞およびＨｅＬａ細胞に、前述の発現ベクターを導入して、一過性で発現させた。
具体的には、実施例１と同様に、培養細胞に、前記Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターおよび前記Ｒｅｖ発現ベクターを同時に添加し、トランスフェクションした。また、コントロールとして、前記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃと、前記ｐＣＧ−ＨＡを共導入した。
（３）ルシフェラーゼアッセイ
実施例１と同様にして、細胞抽出液を調製し、ルシフェラーゼアッセイにより酵素活性を測定した。なお、前記細胞抽出液のウエスタンブロットにより、ＲＥＶタンパク質が発現していることは、確認済みである。
実施例１と同様にして、細胞抽出液を調製し、ルシフェラーゼアッセイにより酵素活性を測定した。なお、前記細胞抽出液のウエスタンブロットにより、ＲＥＶタンパク質が発現していることは、確認済みである。
そして、ＲＲＥコード配列を有さないコントロールベクターおよびＲｅｖのコード配列を有さないコントロールベクターを導入した比較例のルシフェラーゼ活性を１として、相対活性を求めた。これらの結果を、表３に示す。表３において、「ＲＲＥ（−）」は、ＲＲＥコード配列を有さないコントロールベクターを導入したことを示し、「ＲＲＥ（＋）」は、前記Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターを導入したことを示し、「Ｒｅｖ（−）」は、Ｒｅｖのコード配列を有さないコントロールベクターを導入したことを示し、「Ｒｅｖ（＋）」は、前記Ｒｅｖ発現ベクターを導入したことを示す。
表３に示すように、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞のいずれにおいても、前記Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターと前記ＨＡ−Ｒｅｖ発現ベクターとを共導入した実施例（ＲＲＥ（＋）、Ｒｅｖ（＋））は、これらの前記発現ベクターを共導入していない比較例（ＲＲＥ（−）、Ｒｅｖ（−））と比べて、ルシフェラーゼの活性量を著しく増加できた。つまり、前記実施例は、前記比較例と比べて、ルシフェラーゼの発現量が増加したといえる。そして、前記実施例および前記比較例は、いずれも、ＲＲＥのコード配列の有無が異なるのみであり、それ以外は同様の前記ルシフェラーゼ発現ベクター（前記Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクター、前記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−Ｌｕｃ）を使用していることから、核内におけるｍＲＮＡの転写効率は、ほぼ同一である。したがって、これらの結果から、前記Ｌｕｃ−ＲＲＥ発現ベクターと前記Ｒｅｖ発現ベクターとの共導入により、ルシフェラーゼｍＲＮＡとＲＲＥとの融合ＲＮＡ、および、Ｒｅｖを含むタンパク質を発現させることで、核内から細胞質へのｍＲＮＡの輸送が促進され、結果として、前記ｍＲＮＡを有効に活用してルシフェラーゼタンパク質を合成できたといえる。
以上のように、本発明によれば、核内で転写されたｍＲＮＡの細胞質への輸送を促進できるため、真核細胞内で転写されたｍＲＮＡを、細胞質におけるタンパク質の発現に効率良く利用できる。このため、本発明によれば、例えば、翻訳後修飾のために、動物細胞等の真核細胞での発現が必要である有用タンパク質についても、より優れた生産性で製造できる。したがって、本発明は、例えば、製薬、医療、研究支援等の分野において、極めて有用な技術といえる。
Claims (16)
- 真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットｍＲＮＡの輸送を促進する方法であって、
下記（Ａ１）工程および下記（Ａ２）工程の少なくとも一方の工程を有することを特徴とするｍＲＮＡ輸送促進方法。
（Ａ１）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡの３’側にＭＳ２結合配列を有する融合ＲＮＡ（Ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現させる工程であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である工程
（Ａ２）前記真核細胞において、前記ターゲットｍＲＮＡの３’側にＲＲＥを有する融合ＲＮＡ（Ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現させる工程であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である工程 - 前記（Ａ１）工程の前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）において、前記ＭＳ２結合配列の個数が、２個以上である、請求項１記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ１）工程の前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）において、２個以上の前記ＭＳ２結合配列が連結している、請求項１または２記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ１）工程において、前記真核細胞に、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）を導入して、前記融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現させる、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ１）工程において、前記真核細胞が、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現する形質転換体である、請求項４記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記真核細胞に、前記融合タンパク質（Ｙ１）を発現する核酸分子（ｙ１）を導入して、前記融合タンパク質を発現させる、請求項４記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記ＭＳ２が、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＴＡＰが、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。 - 前記（Ａ２）工程の前記タンパク質（Ｙ２）が、Ｒｅｖを含む融合タンパク質である、請求項１記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ２）工程において、前記真核細胞に、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）を導入して、前記融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現させる、請求項１または８記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ２）工程において、前記真核細胞が、前記タンパク質（Ｙ２）を発現する形質転換体である、請求項９記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記（Ａ２）工程において、前記真核細胞に、前記タンパク質（Ｙ２）を発現する核酸分子（ｙ２）を導入して、前記タンパク質を発現させる、請求項９記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記Ｒｅｖが、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１および９から１１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 前記真核細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ輸送促進方法。
- 真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、
前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞であり、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットｍＲＮＡを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の発現方法。 - 真核細胞を用いたターゲットタンパク質の製造方法であって、
前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞であり、
請求項１４記載の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の製造方法。 - 請求項１から１３のいずれか一項に記載のターゲットｍＲＮＡの輸送促進方法に使用するキットであって、下記（ａ１’）および下記（ａ２’）の少なくとも一方を含むことを特徴とするｍＲＮＡの輸送促進用キット。
（ａ１’）ターゲットｍＲＮＡの３’側にＭＳ２結合配列を有する融合ＲＮＡ（Ｘ１）を発現する核酸分子（ｘ１）、および、ＭＳ２とＴＡＰとを含む融合タンパク質（Ｙ１）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である組換え体
（ａ２’）ターゲットｍＲＮＡの３’側にＲＲＥを有する融合ＲＮＡ（Ｘ２）を発現する核酸分子（ｘ２）、および、Ｒｅｖを含むタンパク質（Ｙ２）を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体であり、前記真核細胞が、サル、チンパンジー、ハムスター、ラット、マウス、またはウサギの細胞である組換え体
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