CN105985995A - 一种利用家蚕生物反应器生产普兰林肽(pa)的方法 - Google Patents
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Abstract
本文发明公开了一种表达普兰林肽的方法，属于基因工程的技术领域。其特征在于：利用杆状病毒多基因表达系统，细菌感染家蚕卵巢细胞，产生一种能同时表达人源酰胺化酶与普兰林肽的杆状病毒，然后将病毒注射入五龄起家蚕体内，使家蚕共同表达出酰胺化酶与普兰林肽，其中，普兰林肽C端的甘氨酸直接被酰胺化酶酰胺化，从而生产出具有活性的普兰林肽，通过常规纯化手段纯化出普兰林肽。采用本发明的方法，能表达多个基因，利于共同表达人源酰胺化酶与普兰林肽；本发明利用家蚕生物反应器，蛋白表达量高，修饰更为完善；本发明工艺生产时间短，效率高，生产成本低。
Description
技术领域
一种生产重组人源酰胺化酶与普兰林肽的方法，属于基因工程的技术领域。
背景技术
α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽的重要的翻译后加工过程，这一过程由α-酰胺化酶全称肽酰甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶(peptidylglycine-α-amidating monoxygenase，简称PAM)催化完成，是酰胺化多肽生物合成途径中的限速步骤。大量具有药用价值的神经多肽和内分泌系统中活性肽C末端均为酰胺化修饰，酰胺化修饰加工对其生物活性和稳定性都是非常重要的，若C末端未被酰胺化修饰则其生物活性要下降数百倍乃至上千倍。α-酰胺化酶广泛地存在于两栖类到人的组织中，且有较高的同源性，但基因工程常用的大肠杆菌和酵母菌中都缺乏该酶活性，表达产物不能进行翻译后酰胺化加工，因而酰胺化酶的研究开发就显得十分必要。
酰胺化酶最早是在1982年由Bradbury等从猪垂体中发现并纯化。国际上也有不少专利报道从含量及活性高的组织中分离纯化的方法，但受到材料来源和纯化工艺繁琐的限制，另外纯化产物往往带有组织中蛋白酶的污染，对多肽修饰过程中的底物、酰胺化产物以及酰胺化酶本身会产生降解，因而难以扩大用于活性多肽的商业化生产。
随着PAMDNA从多种种属中被克隆，人们转向用DNA重组技术高效表达PAM，研究报道有利用细菌、哺乳动物细胞等体系进行表达，但仅限于基础研究，酶的产量与活性仍然是一个瓶颈。
在蛋白表达的系统有原核表达系统，酵母表达系统，昆虫杆状病毒病毒表达系统和哺乳细胞表达系统，各种系统各有其优势与不足。如原核表达与酵母表达系统简单易操作，而且成本低，但其翻译后修饰能力不足，存在表达的蛋白不能正确折叠等缺点；哺乳细胞表达系统用于表达多种蛋白，其表达后的加工能力强于其它表达系统，表达的分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然的高等生物蛋白质分子，但其所需要的表达成本非常高，大规模表达的模式并不成熟。昆虫表达系统与原核表达系统与酵母表达系统相比，具有较强的翻译后加工与修饰功能，且有较低的背景干扰；与哺乳细胞表达系统比较，培养费用低，不需要二氧化碳，容易大规模培养，另外其表达的哺乳动物蛋白大部分可正确折叠而且没有内毒素，且具有较低的乳酸盐累积效应，以及较低的氨敏感性，其表达量较大。
本专利利用杆状病毒表达载体构建重组人源PAM(rhPAM)表达载体，利用该系统可在昆虫细胞和虫体中高效表达外源基因，产量可远高于哺乳动物细胞，而且有较完善的翻译后加工体系，因此在基因工程药物生产中较细菌、酵母、哺乳动物细胞等体系更具潜在的优势。
糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性病，目前全球糖尿病患者已超过1.9亿人，我国患者人数居世界第二。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖尿病患者人数将增至3亿，而中国糖尿病患者人数将达到5000万。因此，控制高血糖症状及糖尿病并发症的新药研究开发显得极其重要和尤为紧迫。胰淀粉样多肽是由胰岛β细胞分泌的一种由37个氨基酸残基构成的多肽激素，在餐后由胰腺β细胞释放，具有多种生理功能，如减慢食物(包括葡萄糖)在小肠的吸收速度，通过抑制高血糖素减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机体调节血糖水平等。普兰林肽(pramlintide)是天然 胰淀粉样多肽的25，28，29位脯氨酸取代类似物，其注射剂目前已被FDA批准用进入临床研究，是继胰岛素后第二个获准用于治疗I型糖尿病的药物，主要是作为胰岛素的补充疗法用于强化单一胰岛素治疗血糖仍不能得到满意控制的病人。Pramlintide的安全性和有效性研究涉及约5000例病人，总的来说可改善血糖控制并降低体重。
到目前为止国内外生产的Pramlintide都是化学合成的，由于普兰林肽作为糖尿病药物和减肥药的临床使用剂量较大，导致了药物生产成价格相对昂贵。因此，寻找一条更有效、成本更低的途径来制备Pramlintide，同时解决多肽类药物在体内易降解、半衰期短等问题是本课题的关键所在。基因工程作为一种强有力的手段，已经使多种难以提取或者合成的蛋白类药物可以大量获得，但由于Pramlintide相对于常规蛋白药物来说分子量比较小，高效可溶性表达具有一定的难度。
利用杆状病毒表达系统共同表达酰胺化酶以及普兰林肽，其优点在于细胞表达的酰胺化酶在细胞内就可完成对没有活性的普兰林肽的酰胺化作用，使其直接产生出具有活性的普兰林肽，可避免在体外纯化酰胺化酶使其活性大大降低的影响。
与之前研究相比，本发明具有以下特点：
(1)本发明采用多基因家蚕生物反应器，可同时表达多个外源基因。
(2)本发明利用家蚕幼虫生物反应器表达人源酰胺化酶与普兰林肽，具有稳定的表达性与较完善的后加工能力，使得表达产物更加稳定。同时由于家蚕幼虫易于大规模饲养，使得蛋白表达量高，容易实现产业化。
(3)生产的普兰林肽相比化学合成，其性状和功能与天然蛋白更加接近。相比用哺乳动物细胞表达，家蚕饲养成本更低廉。
发明内容
本发明使用双载体来构建病毒，而且使用强启动子polh来驱动目的蛋白的表达，能构建出可以同时表达酰胺化酶以及普兰林肽。
本发明主要目的在于：利用多基因杆状病毒表达系统表达人源酰胺化酶与普兰林肽，在细胞内酰胺化酶直接对普兰林肽进行酰胺化作用，从而可以直接生产出具有活性C端的普兰林肽。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
(1)人源酰胺化酶基因的获得：合成获得所需目的基因。
(2)将步骤(1)所获得的人源酰胺化酶基因连接到转移载体pFBDM-IM，并转化感受态细胞，构建重组质粒pFBDM-PAM-IM；
(3)普兰林肽基因的获得：合成获得所需目的基因。
(4)将步骤(3)所获得的普兰林肽基因连接到转移载体pUCDM-IG，并转化感受态细胞，构建重组质粒pFBDM-PA-IG
(5)将重组质粒pFBDM-PAM-IM与pFBDM-PA-IG通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA：BmMulitbac-PAM-IM-PA-IG；
(6)对步骤(5)构建的重组大肠杆菌在Grace培养基中直接感染家蚕卵巢细胞BmN产生杆状病毒BmNPV-PAM-PA。
(7)将步骤(6)中构建的重组杆状病毒BmNPV-PAM-PA注射入5龄家蚕幼虫体内(10μl/头)，3d后取家蚕幼虫血淋巴液或者表皮细胞观察是否出现红色与绿色荧光。
(8)收取有荧光的家蚕幼虫血淋巴液，加入PMSF，15000rpm离心10分钟，取上清，稀释，通过镍亲和层析柱、分子筛、纯化出普兰林肽。
(9)利用L6细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)模型 来检测纯化的普兰林肽的活性并于标准品对照.
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：图 1：用本发明的方法制备普兰林肽表达产物PAGE图以及Western Blot检测图。A，普兰林肽表达产物PAGE图.1：PA standard；2：Very low molecular protein marker；3-5：Three samples from purification；6：PA standard.B，普兰林肽表达产物Western Blot检测图.1-2：PA样品；3：PA标准品
图 2：
A：携带红色荧光标签的BmMNPV-PAM-IM-PA-IG病毒感染细胞的红色荧光图。
B：携带红色荧光标签的BmMNPV-PAM-IM-PA-IG病毒感染细胞的绿色荧光图。
图 3：
A：携带红色荧光标签的BmMNPV-PAM-IM-PA-IG病毒感染家蚕蚕体幼虫，体表荧光图，1、2：空白对照家蚕，3、4：感染病毒家蚕。
B：携带红色荧光标签的BmMNPV-PAM-IM-PA-IG病毒感染家蚕蚕体幼虫，表皮细胞红色荧光图。
C：携带红色荧光标签的BmMNPV-PAM-IM-PA-IG病毒感染家蚕蚕体幼虫，表皮细胞绿色荧光图。
图 4：普兰林肽蛋白活性测定.NC：阴性对照组PC：阳性对照组
图 5：pFBDM质粒图谱(MultiBac Expression System User Manual，2004)。
图 6：pUCDM质粒图谱。
序列表说明
| SEQ ID No.1 | 合成人源酰胺化酶基因序列 |
| SEQ ID No.2 | 合成普兰林肽基因序列 |
| SEQ ID No.3 | IRES序列 |
| SEQ ID No.4 | mCherry荧光蛋白基因序列 |
| SEQ ID No.5 | GFP荧光蛋白基因序列 |
具体实施方式
以下结合具体事例详细说明本发明技术方案的实施方式和效果，并非对本发明的限制。
实施例1：重组工程菌E.coli SW106-BmNPV-PAM-PA病毒感染家蚕细胞BmN表达蛋白
把构建好的转移载体pFBDM-PAM-IM与pUCDM-PA-IG通过转化的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106，在转化过程中，转移载体发生转座，目的基因片段整合入病毒基因组，构建成病毒基因组BmMultiBacNPV-PAM-IM-PA-IG，将含有病毒基因组BmMulitBacNPV-PAM-IM-PA-IG的重组基因工程菌E.coli SW106，在LB-Kan-Tet-Spe-Gm-Cm-DAP固体培养基上培养过夜，挑单菌落接种于LB-Kan-Tet-Spe-Gm-Cm-DAP液体培养基中培养10-12h，OD值到0.8，取1ml菌液到1.5ml EP管，3000rpm离心3min，弃上清，用灭菌水重悬菌液，3000rpm离心3min，重复洗3次。吸尽上清液后，加入1ml Grace培养基，并用Grace培养基稀释配成菌液浓度为10-2与10-3。将BmN细胞铺于24孔板中，过夜，用Grace培养基洗细胞3次，将浓度为10-2与10-3的Grace培养基加入细胞中，28℃孵育4h，吸掉Grace培养基，加入500μl Grace完全培养基。3d后观察荧光。
实施例2：重组杆状病毒BmNPV-PAM-IM-PA-IG注射家蚕幼虫。
重组杆状病毒BmNPV-PAM-IM-PA-IG构建成功后，利用BmN细胞进行盲传。盲传3至4代后，直接收取细胞Grace培养基，12,000rpm离心2min，取上清，注射家蚕幼虫(5龄起)，10μl/头。3d后开始取家蚕幼虫血淋巴液观察是否出现红色和绿色荧光。
实施例3：重组普兰林肽的纯化
收集家蚕幼虫血淋巴液，加入PMSF，15000rpm离心10分钟，取上清，加入3倍体积的PB溶液(ph 6.0)。用20mM PB、200mM NaCl(ph 6.0)溶液3ml/min平衡Ni-NTA亲和柱，将表达上清液以1ml/min注入Ni-NTA亲和柱，用20mM PB、200mM NaCl、20mM咪唑洗脱杂蛋白，20mM PB、200mM NaCl、150mM咪唑洗脱蛋白。收集流穿蛋白、20mM咪唑洗脱杂蛋白、150mM咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAGE胶以及Western Blot检测纯化产物。
实施例4：重组普兰林肽的测活实验
将L6以5×104/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入0.4ml含2％FBS的DMEM培养基培养11天左右，每两天跟换一次培养基，直至肌管的形成。肌管形成后，去除培养基，将细胞与Krebs-Henseleit Hepes(KHH)buffer培养2h后，再将细胞与11mM的葡萄糖+KHH buffer及其溶解的PA样品组和PA标准品组溶液培养24h后(单独的11mm的葡萄糖+KHH buffer组为阴性对照组)，分别取20μl培养上清利用葡萄糖检测试剂盒检测上清中葡萄糖含量，从而计算出各组葡萄糖的消耗量，比较PA样品与标准品之间的活性差异。
Claims (7)
1.一种生产普兰林肽的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)获得SEQ ID No.1所示的人源酰胺化酶基因，并连接至转移载体pFBDM(购自深圳市宝珠生物科技有限公司，货号zt323)中构建重组质粒pFBDM-PAM；
(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-PAM中插入IRES(序列如SEQ ID No.3所示)和mCherry(序列如SEQ ID No.4所示)，得到重组质粒pFBDM-PAM-IM；
(3)获得SEQ ID No.2所示普兰林肽基因，并连接至转移载体pUCDM(Sun，Jingchen，et al，A High Efficient Method of Constructing RecombinantBombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based onZero-Background Tn7-Mediated Transposition in Escherichia coli，Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.2，pp524-529)，获得重组质粒pUCDM-PA；
(4)向步骤(3)构建的重组质粒pUCDM-PA中插入IRES和GFP(序列如SEQID No.5所示)，得到重组质粒pUCDM-PA-IG；
(5)将步骤(2)构建的重组质粒pFBDM-PAM-IM和步骤(4)构建的重组质粒pUCDM-PA-IG通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建能表达人源酰胺化酶与普兰林肽的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞(本实验室按照常规方法改造，改造方法参见Sun，Jingchen et al，Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)，57，117-125(Printed in Great Britain)doi：10.1042/BA20100148)；
(6)将步骤(5)制备的重组大肠杆菌SW106细胞在Grace培养基(购自Gibco)中直接感染昆虫细胞BmN(ATCC CRL-8910)产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染5龄家蚕幼虫(饲养环境为28℃，湿度60％至70％之间，每天给予足够的桑叶以及每天及时清除蚕粪)，进行重组蛋白的表达；
(7)收集感染的昆虫幼虫淋巴液，镍柱亲和纯化得到所述普兰林肽，并进行测活。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106通过在大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵inv基因，缺失asd基因改造获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中得到的感染成功的家蚕细胞BmN细胞的培养条件为：商业化Grace培养基成分，PH 6.4，温度28℃，静止培养3天。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中注射家蚕的病毒液为每头家蚕幼虫10ul。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中细菌感染昆虫细胞条件中，细菌浓度为OD值0.6，灭菌超纯水水洗重悬离心3次，用无血清无抗生素Grace培养基重悬。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中细菌感染昆虫细胞条件中，昆虫细胞在感染前，用无血清无抗生素Grace培养基洗涤细胞3次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中细菌感染昆虫细胞条件中，细菌感染昆虫细胞，静止培养4小时后，马上吸取细菌液，添加含10％胎牛血清的Grace培养基。
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