CN112830961A

CN112830961A - 一种植物选择性自噬受体小肽及其应用

Info

Publication number: CN112830961A
Application number: CN202110192003.XA
Authority: CN
Inventors: 王献兵; 佟昕; 赵加佳; 王颖
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN112830961B

Abstract

本发明涉及一种植物选择性自噬受体小肽及其应用。本发明提供一种新型选择性自噬受体VISP3，所述VISP3是一种小肽，在十字花科植物中保守分布，拟南芥中的VISP3蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述VISP3降解RNA沉默通路关键组分SGS3/RDR6小体，干扰外源病毒小干扰RNAs(vsiRNAs)和内源tasiRNAs合成，促进病毒侵染并影响植物发育。本发明所述VISP3的表达量提高可促进植物黄瓜花叶病毒及芜菁花叶病毒侵染；敲除VISP3可增强植物抗病毒能力。敲除突变体可单独或与其他植物药剂联合用于植物病害的防治，有利于提高植物的产量和质量。

Description

一种植物选择性自噬受体小肽及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及选择性自噬受体调控抗病毒RNA沉默关键因子蛋白积累量的原理与提高植物抗病能力的应用。

背景技术

植物在生长过程中会受到多种病原微生物攻击，在植物中RNA沉默(RNAsilencing)是一个广谱抗病毒过程。病毒在复制转录过程中形成的双链RNA，可被宿主的核酸内切酶dicer识别，切割成小的双链RNA(siRNAs)，其装配到RISC复合体(RNA-inducedsilencing complex)，去靶标与之配对的病毒RNA，进行切割靶标RNA和抑制翻译。被剪切破坏的异常的RNA又能被宿主的RNA聚合酶复合体RDR6、SGS3以其为模板，合成双链RNA进一步被dicer切割产生大量的siRNA，增强抗病效果。同时，SGS3和RDR6也负责合成内源tasiRNAs，因此RDR6和SGS3在病毒小RNA扩增方面以及植物生长发育方面发挥重要作用。

近年来越来越多的证据表明细胞自噬(autophagy)在病毒侵染过程中发挥多重功能。细胞自噬通过降解细胞内大分子物质、受损伤的蛋白及细胞器，帮助细胞正常生长发育，以及响应外界胁迫刺激，维持细胞稳态。细胞内多种细胞器以及一些蛋白的降解是通过选择性自噬受体介导降解的，通常这些受体与待降解的底物互作，同时也与自噬小泡上负责合成双层膜的关键蛋白ATG8互作，将底物拉入自噬小泡中被降解。选择性自噬降解特定的底物，具有更精细的调控作用。当自噬将病毒的关键组分带入自噬小体降解时，自噬发挥抗病毒作用，而当病毒逃离被自噬降解，或利用自噬降解植物抗病毒的关键组分时，自噬则促进病毒侵染。

近年来人们逐渐发现植物基因组中存在许多小的编码框，编码30-100个氨基酸的小肽，这些小肽分为分泌肽及非分泌肽，根据预测在拟南芥基因组中有超过8000个小肽，对于已知的这些小肽，发现他们在植物整个生长发育及响应非生物胁迫过程中发挥重要作用，已有文献报道，小肽在抵御细菌和真菌等病原侵染过程中发挥作用，但是，在病毒侵染中的作用未见报道，因此探究未知功能的小肽十分重要。

RNA沉默是一种广谱的免疫性抗病机制，而细胞自噬也对病原侵染具有广谱的调节机制，开发未知功能的小肽调控选择性自噬和RNA沉默意义重大，为提高植物抗病能力、加强植物病害防治提供新的靶标。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物选择性自噬受体及其应用。

第一方面，本发明提供植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在植物病毒感染防治中的应用。

第二方面，本发明提供植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在抗病植物遗传育种中的应用。

第三方面，本发明提供植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在调控植物免疫力或抗病性中的应用。

在本发明的上述应用中，所述植物自噬受体VISP3蛋白用于降解RNA沉默通路关键组分SGS3/RDR6小体，干扰外源病毒小干扰RNAs(vsiRNAs)和内源tasiRNAs合成。

本发明所述的植物选择性自噬受体蛋白VISP3主要包括两个结构域：ARM结构域和UIM结构域，其中，一个是³⁹IISAL/FXPS⁴⁶，X代表任意氨基酸，这个结构域基本符合新型ATG8互作结构域的特征——泛素互作结构域(ubiquitin-interacting motif，UIM)，UIM以ψ-ζ-X-A-ψ-X-X-S这样的基序为特征，ψ为小的疏水氨基酸，ζ为亲水氨基酸。另一个保守结构域为²⁸RKLVK³²，是一个富含精氨酸/赖氨酸的一个基序，因此将其命名为Arginine/Lysine-rich motif(ARM)。因为VISP3含有UIM基序，推测VISP3为自噬受体，参与自噬途径。

本领域技术人员可通过对所述植物选择性自噬受体蛋白的关键结构域以外的氨基酸序列进行替换、缺失或插入一个或多个氨基酸，获得具有相同功能的植物选择性自噬受体蛋白。

在本发明的上述应用中，通过降低所述植物自噬受体VISP3蛋白的表达量，增强植物抗病毒能力。

在本发明的上述应用中，植物病毒为烟草花叶病毒(Tobacco mosaic Firw1S,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)、完菁花叶病毒(Jurnip mosaicvirus，TuMV)、马铃薯Y病毒(Zbiaio virus Y,PVY)等，这些病毒代表不同科属和不同类型的病毒，说明VISP3的作用具有广谱性。

在本发明的上述应用中，所述植物自噬受体VISP3蛋白为以下任一：

(1)具有如SEQ ID NO.1-11任一所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.1-11任一所示的氨基酸序列经缺失、替换或添加一个或多个氨基酸得到的含有与自噬小体合成关键因子ATG8互作结构域的小肽。

在本发明的上述应用中，所述植物自噬受体VISP3蛋白编码基因的核苷酸序列为以下任一：

(1)如SEQ ID NO.12所示；

(2)在严格条件下能够与SEQ ID NO.12杂交的核酸序列；

(3)与SEQ ID NO.12互补的核苷酸序列；

(4)在SEQ ID NO.12的基础上，经过一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的具有提高植物抗病性功能的核酸的序列。

VISP3蛋白可发挥选择性自噬受体功能，超表达时可激活自噬，选择性地降解SGS3/RDR6小体，抑制植物抗病毒RNA沉默。而敲除VISP3的编码基因后，可降低VISP3对SGS3/RDR6的降解程度，从而提高植物抗病毒能力。因RNA沉默通路在抗病毒方面具有广谱抗性，故植物在敲除VISP3蛋白的编码基因后也可具有广谱的抗病毒能力。

第四方面，本发明提供一种抗病转基因植物的构建方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术构建敲除植物中用于编码VISP3蛋白的基因；所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-11任一所示。

具体地，所述构建方法包括：

(1)扩增所述植物选择性自噬受体蛋白的靶标序列；

(2)构建携带所述植物选择性自噬受体蛋白的靶标序列及Cas9的表达载体；

(3)将所述表达载体转化到宿主细胞；

(4)培养宿主细胞，获得敲除所述植物选择性自噬受体蛋白的转基因植株。

在本发明的上述应用中，所述植物为十字花科植物；

优选地，所述植物为拟南芥、甘蓝、芜菁或油菜。

第五方面，本发明提供一种防治植物病害的方法，降低植物中VISP3蛋白的表达量，

当所述植物为拟南芥时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

当所述植物为琴叶拟南芥时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

当所述植物为高山南芥时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

当所述植物为甘蓝时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.11所示；

当所述植物为花椰菜时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

当所述植物为林荫千里光南芥时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示；

当所述植物为芜菁时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.10所示；

当所述植物为油菜时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明提供一种防治植物病毒感染的药剂，包含VISP3蛋白表达抑制剂，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-11的一种或多种所示。

本发明的有益效果至少在于：

本发明发现了一种植物选择性自噬受体蛋白VISP3，该蛋白通过UIM与自噬相关基因ATG8互作，同时通过ARM与RNA沉默关键组分SGS3互作，降解SGS3/RDR6小体。在植物中提高VISP3蛋白的表达量能够负调控RNA沉默通路，促进CMV、TuMV、PVX等病原体的侵染；而敲除植物中的VISP3基因，则会提高植物的抗病毒能力。RNA沉默通路具有广谱的抗病性，可抵抗包括真菌、RNA病毒、DNA病毒的侵染，因此VISP3通过自噬调控RNA沉默能力进而调控植物抗病毒能力，具有广谱性。

附图说明

图1为本发明实施例1中VISP3基因的转录水平。Real-time PCR检测接种缓冲液mock、CMV-2blm和CMV-Fny 7天后的系统叶，三次独立生物学重复，经过Student’s t-test分析，*p<0.05，**p<0.01，误差线为标准差。

图2为本发明实施例1中VISP3同源蛋白遗传进化树示意图。基因的登录号或基因位置标注于所在物种之后，图中标尺为0.05。

图3为本发明实施例1中VISP3同源比对分析。左侧依次为基因登录号和物种，横线处标注的为保守结构域，ARM为富含精氨酸/赖氨酸基序(Arginine/Lysine-rich motif)，UIM为泛素结合基序(ubiquitin interacting motif)。

图4为本发明实施例2中载体pMDC32-3×Flag的载体图谱。

图5为本发明实施例2中VISP3敲除突变体植株的构建及鉴定。其中(A)为构建visp3突变体的靶点序列，黑色方框表示外显子，灰色横线表示基因间区，标尺为100bp；(B)为PCR鉴定野生型Col-0与两个转基因阳性植株中VISP3条带大小，M为DNA marker；(C)为鉴定visp3突变体突变位点，第一行为Col-0序列，第二行为突变体序列，中间省略显示部分序列，visp3-1缺失从38位到142位的104个碱基，visp3-2缺失37到142位的105个碱基。

图6为本发明实施例3中检测VISP3超表达及敲除植株中自噬激活情况。野生型Col-0、VISP3超表达植株及visp3突变体植株进一步转化YFP-ATG8e指示基因，阳性植株在1/2MS培养基生长5天，Col-0/35S:YFP-ATG8e移到缺氮培养基黑暗培养四天，同时Col-0/35S:YFP-ATG8e、VISP3/35S:YFP-ATG8e和visp3/35S:YFP-ATG8e移至不缺氮培养基，培养4天后，采整株苗进行Western blotting实验，Actin为蛋白上样量对照。

图7为本发明实施例3中培养5周后植株SGS3蛋白积累量。Col-0为野生型拟南芥，sgs3-1为SGS3突变体植株，采叶片提取蛋白进行Western blotting实验，蛋白上样loading中加入5μM MG132，以SGS3抗血清检测SGS3积累量，Flag标签检测超表达植株中VISP3-Flag表达情况，Actin作为蛋白上样量对照。

图8为本发明实施例4中超表达VISP3的植株对CMV-2blm的抗性分析。其中(A)为拟南芥Col-0、VISP3^OE转基因植株、rdr6-15和sgs3-1突变体分别接种缓冲液mock或CMV-2blm(30ng/μl)21天后的发病症状，标尺为2cm；(B)为上述植株接种CMV-2blm50天后的发病症状，标尺为2cm；(C)为Western blotting检测上述材料中病毒14dpi系统叶中CP积累量(α-CP)，α-Flag抗体检测VISP3小肽表达情况，核糖体大亚基RbcL作为上样定量，RA代表相对量，使用Quantity One软件对CP条带定量，将接种病毒的Col-0的CP积累量设为1.00，实验组VISP3^OE和rdr6-15和sgs3-1突变体CP相对积累量标注于CP条带下方；(D)为Northernblotting检测上述植株接病毒10dpi gRNA的积累量，取5μg RNA上样，以病毒3’UTR探针检测病毒基因组RNA，利用放射自显影显示条带，亚甲基蓝染色显示的rRNA用作总RNA的定量；(E)为Northern blotting检测上述样品中CMV vsiRNA的积累量，上样15μg总RNA，以病毒RNA3特异的小RNA探针进行杂交，放射自显影，核酸染料染色rRNA用作总RNA定量；(F)为Northern blotting结果的定量分析，纵坐标表示gRNA3、RNA3 vsiRNA以及vsiRNA/gRNA的相对积累水平，其中将Col-0的值定为1.00，三次实验重复，经过单因素方差分析，P<0.05。

图9为本发明实施例4中超表达VISP3拟南芥对TuMV的抗性分析。(A)为手持紫外灯下拍照观察植株发病症状，标尺为1cm；(B)为上述植株第5、6片系统叶提取蛋白做westernblotting检测GFP积累量，RbcL为蛋白上样定量。

图10为本发明实施例5中visp3突变体拟南芥对CMV-2blm的抗性分析。(A)为拟南芥Col-0、visp3-1、visp3-2、rdr6-15和sgs3-1突变体分别接种缓冲液mock或CMV-2blm 21天后的发病症状，标尺为2cm；(B)为上述植株接种病毒50天后的发病症状，标尺为2cm；(C)为Western blotting检测上述材料14dpi系统叶中CP积累量，RbcL作为上样定量，RA为CP相对积累量；(D)为Northern blotting检测上述植株接病毒10dpi gRNA的积累量，取5μg RNA用作检测gRNA，15μg RNA用作检测vsiRNA，亚甲基蓝染色后rRNA用作总RNA的定量；(E)为Northern blotting结果的定量分析，纵坐标为vsiRNA/gRNA的相对积累水平，数值表在柱形图上，其中将Col-0的值定为1.00，三次实验重复，ANOVA分析，P<0.05。

图11为本发明实施例5中visp3突变体拟南芥对TuMV-GFP的抗性分析。(A)为接种TuMV-GFP转接液6-9dpi，Col-0、visp3-1和visp3-2植株发病症状，标尺为1cm；(B)为上述植株第5、6片系统叶提取蛋白做western blotting检测GFP积累量，RbcL为蛋白上样定量，RA为GFP积累量，Col-0设为1。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 AtVISP3基因的获得及表达载体构建

本实施例对接种黄瓜花叶病毒(CMV)一周的拟南芥植株进行转录组测序。测序结果显示，相较于对照(mock)，接种CMV后基因AT1G21525的转录水平上调四倍以上，使用realtime验证该结果(如图1所示)。图1结果表明，接种野生型CMV或弱毒的突变体病毒CMV-2blm，均明显诱导基因AT1G21525的表达，将该基因命名为AtVISP3基因，拟南芥中VISP3蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。根据cDNA核苷酸序列设计扩增引物。

对VISP3进行氨基酸序列和核苷酸序列的分析，VISP3蛋白由72个氨基酸组成。系统进化树分析发现与其相似性高的基因均属于十字花科未知功能的基因(见图2)。通过序列分析发现VISP3含有两个保守的结构域，富含精氨酸组氨酸的基序ARM以及泛素结合基序UIM(见图3)。

实施例2 VISP3基因的超表达以及敲除突变体植株的构建

1、VISP3基因的超表达植株的构建

(1)植物组织总RNA的提取

利用Trizol法提取植物组织总RNA，具体方法如下：采集植物组织，液氮研磨，0.1g组织叶片加1ml Trizol(Invirtogen)，后加入200μL氯仿，室温静置5min，4℃12000rpm离心5min。取上层水相至离心管中，加入200μL氯仿再次抽提，重复上一步骤。取上层水相500μL至离心管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后室温放置20min，12000rpm 4℃离心20min。弃上清，加入500μL 70-80％乙醇(DEPC水配制)，4℃，12000rpm离心5min，吹干。加入50μLDEPC-H₂O过夜溶解。

(2)VISP3全长基因的扩增和真核表达载体的构建

将总RNA、oligo dT(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)，和DEPC-H₂O加入，95℃变性5min后，置于冰上。加入反转录酶(Invirtogen)，放置42℃，60-90min；75℃，10min；25℃，5min。以反转录得到的cDNA为模板扩增VISP3基因，使用的引物序列如下：正向引物(SEQ IDNO.17)：5’-GGGGTACCAAAGCAACAAACAAACACATATATAC-3’(含KpnI位点)；反向引物(SEQ IDNO.18)：5’-GACTAGT ACGATGAGTA CCGGGGTAC-3’(含SpeI位点)。

扩增体系：模板DNA 2μL，特异性引物2μL(10mM)，高保真2×Phanta Max MasterMix 25μL，去离子水补至50μL并混匀。反应程序：95℃预变性3min，之后每个循环为95℃变性10s，退火10s(退火温度根据引物Tm值而定)，72℃延伸适当时间20-30s/1000bp，30个循环，72℃充分延伸10min，25℃，1min。

将获得的VISP3全长序列连接到pMDC32-3×Flag载体(见图4)，(Wang X，Cao X，Liu M，et al.Scientific reports,2018，8(1):4526)，得到携带VISP3基因的重组载体pMDC32-VISP3。

(3)拟南芥的转基因

将重组载体pMDC32-VISP3转化到GV3101农杆菌中，利用农杆菌浸润花序法对野生型拟南芥进行转基因。转基因5％蔗糖悬浮液(100mL):称取0.2215g MS盐，5g蔗糖，调节pH值于5.8-6.0之间。转基因前加入0.02％的表面活性剂Silwet-L77。

农杆菌的培养与花序的浸染方法具体如下：

在相应抗生素的LB固体培养基上活化含有pMDC32-VISP3的GV3101农杆菌，28℃培养过夜，收集菌体，用含5％蔗糖的MS培养基重悬菌体，调OD₆₀₀值于1.5左右，加入0.02％silwet L77。农杆菌浸润花序1min，室温黑暗培养24h后，重新放置于光下培养。3周后收获转基因T0代种子，用含有25mg/L潮霉素的MS培养基筛选阳性植株。

2、VISP3敲除突变体植株的构建

利用CRISPR-Cas9技术对VISP3进行基因编辑(Xing et al.,2014，PlantBiol.14，327.)。

在http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPR-search.html网站上查找基因VISP3的靶点，靶点1：TCAGAGTGCCGGCCACAAC(SEQ ID NO.19)，靶点2:TCTCCGCCGTAGAACTAGA(SEQ ID NO.20)，针对该靶点序列设计引物，采用SEQ ID NO.13-16所示引物扩增gRNA，gRNA靶向VISP3的示意图见图5中的A。将PCR片段连接到pHEC401载体，转化构建好的质粒到GV3101农杆菌感受态中，菌落PCR鉴定阳性菌株。对抽薹的野生型拟南芥Col-0进行农杆菌浸润花序法转基因，收获T0代种子。用含有25mg/L潮霉素的MS培养基筛选阳性T1代植株。提取阳性植株基因组DNA，对靶标基因VISP3进行PCR检测以及测序分析(见图5中的B和图5中的C)，筛选拟南芥VISP3基因敲除突变株系(visp3)。

实施例3 VISP3超表达及敲除植株自噬水平和SGS3积累水平分析

1、VISP3超表达植株和敲除植株自噬情况分析

分析实施例2构建的VISP3基因的过表达植株和敲除突变体植株自噬情况分析，具体方法如下：

(1)将野生型Col-0、VISP3超表达植株及visp3突变体植株进一步转化YFP-ATG8e指示基因，所得阳性植株在1/2MS培养基生长5天，将Col-0/35S:YFP-ATG8e分别移到缺氮或不缺氮培养基，而VISP3/35S:YFP-ATG8e和visp3/35S:YFP-ATG8e移到不缺氮培养基培养4天后，取整株苗进行Western blotting实验。最后一个Col-0是非转基因的负对照。

(2)western blotting检测。分别对处理后的幼苗采样，加入钢珠，液氮打样后，加入2×SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，20％甘油，0.2％溴酚蓝，4％SDS，5％β-巯基乙醇)，沸水浴煮5min，室温13000rpm离心15min，进行SDS-PAGE电泳。用电转法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电流为200mA，时间为90min。将膜浸泡在10mL含5％脱脂牛奶的1×TBST溶液(10×TBST：1.5M NaCl，20％1M Tris-HCl pH 7.5，0.5％Tween-20)中，37℃封闭1h，封闭完成后，以1×TBST溶液洗去牛奶；量取10mL 1×TBST溶液，加入一抗anti-GFP，37℃孵育1h；然后用1×TBST洗膜三次；加入相应的二抗，37℃孵育45min，洗膜三次后，用辣根过氧化酶为底物进行显色，用Bio-Rad ChemiDoc^TMTouch Imaging System成像。

结果如图6所示，在1/2MS培养基上生长的Col-0只能检测到全长YFP-ATG8e，在缺氮培养基黑暗生长4天的Col-0，自噬激活，全长YFP-ATG8e积累量降低，游离YFP积累水平升高，visp3敲除突变体中与野生型一致，只能检测到全长YFP-ATG8e；而在超表达VISP3的两个lines中可以看到全长YFP-ATG8e积累水平较低，游离YFP积累量很高，说明超表达VISP3激活自噬通路。

2、VISP3超表达植株和敲除植株SGS3积累水平分析

分析实施例2构建的VISP3基因的过表达植株和敲除突变体植株SGS3积累水平分析，具体方法如下：

采取土里生长5周大植株叶片，利用western blotting检测VISP3超表达植株和visp3敲除突变体SGS3积累量，sgs3-1为阴性对照，以SGS3抗血清为一抗进行实验。结果如图7所示，超表达VISP3时，SGS3的积累水平较Col-0显著降低，而visp3突变体中SGS3积累量有所增加。说明VISP3介导SGS3通过自噬降解，且当VISP3缺失时，SGS3不能被自噬降解，积累量升高。

实施例4 VISP3基因超表达植株的抗性分析

1、超表达VISP3的植株对CMV的抗性分析

分析实施例2构建的VISP3基因的超表达植株对CMV抗性分析，具体方法如下：

(1)对5周大的拟南芥进行接种mock缓冲液或30ng/μL的CMV-2blm，接种21天后观察发病症状。当接种CMV-2blm后，VISP3^OE较Col-0相比新生叶片向下卷曲皱缩的症状更加严重，类似于sgs3-1和rdr6-15，说明VISP3^OE转基因植株更加感病(图8中的A)。长期观察发病症状，病毒侵染后Col-0植株矮化，而接种病毒的VISP3^OE转基因植株同sgs3-1和rdr6-15相似，植株严重矮缩并且抽薹开花延迟(图8中的B)。

(2)Western blotting检测接种病毒14天后的系统叶中病毒含量，利用CMV外壳蛋白(CP)的抗血清作为一抗，在VISP3^OE的两个株系中病毒CP积累量分别是Col-0的2.59倍和2.6倍(图8中的C)。

(3)Northern blotting检测上述系统叶中CMV基因组RNA(gRNA)和病毒小干扰RNA(vsiRNA)的积累量发现，VISP3^OE及rdr6-15和sgs3-1植株中的病毒RNA显著高于Col-0(图8中的D)，而它们的RNA3 vsiRNA积累量明显减少(图8中的E)。利用软件Quantity One分别对病毒gRNA3和vsiRNA的结果定量分析，vsiRNA反映植物合成病毒小RNA的能力，gRNA反映病毒积累量，vsiRNA/gRNA的比值反映植物RNA沉默的效率，将Col-0的vsiRNA与gRNA的比值定量为1.00，两个VISP3^OE转基因株系的比值分别为0.17和0.20，均显著低于Col-0(图8中的F)，说明超表达VISP3抑制vsiRNA扩增，干扰植物的RNA沉默通路，对病毒侵染更加敏感。

2、超表达VISP3的植株对TuMV的抗性分析

分析实施例2构建的VISP3基因的超表达植株对TuMV抗性分析，具体方法如下：

在5周大拟南芥叶片上摩擦接种TuMV-GFP汁液，每棵3片叶，每片4μL。如图9中的A所示，在接病毒第4天时，VISP3^OE和rdr6-15的顶端第1、2新叶处有绿色荧光，而Col-0中则没有或者非常少；第5天观察时VISP3^OE和rdr6-15的绿色荧光范围进一步扩大到3、4、5叶片，而Col-0中病毒刚侵染到第1、2叶片；接种病毒第7天后，VISP3^OE和rdr6-15从顶端开始的6片叶片均已全部被TuMV-GFP侵染，而Col-0中第4片叶片还未完全被侵染。

利用western blotting检测病毒GFP的积累量，可以看到在VISP3^OE和rdr6-15中病毒积累量高于Col-0(图9中的B)。以上结果说明超表达VISP3干扰RNA沉默能力，促进TuMV-GFP的侵染。

实施例4实验表明超表达VISP3促进CMV-2blm及TuMV-GFP的侵染。

实施例5 visp3敲除突变体植株的抗性分析

1、visp3敲除突变体植株对CMV的抗性分析

分析实施例2构建的visp3敲除突变体植株对CMV抗性分析，具体方法如下：

对5周大的Col-0、visp3敲除株系及rdr6-15和sgs3-1突变体分别摩擦接种缓冲液或CMV-2blm，21天后观察发病症状。未接种病毒时，visp3突变体在发育表型上与Col-0无明显差异；接种CMV-2blm后，Col-0表现出新生叶片向下卷曲皱缩的症状，而visp3突变体发病症状并不明显(图10中的A)。长期观察表型50天的Col-0受病毒影响导致植株矮化，而接种病毒的visp3突变体株高明显高于Col-0，与未接种病毒的Col-0类似，植株症状不显著(图10中的B)。

Western blotting检测接种病毒14天后的系统叶可以看到，与发病症状一致，在visp3-1和visp3-2中CMV-2blm CP积累量分别是Col-0的62％和49％(图10中的C)。

Northern blotting检测上述拟南芥系统叶中CMV gRNA和vsiRNA的积累量，visp3-1和visp3-2植株中的gRNA明显少于Col-0(图10中的D)，而RNA3 vsiRNA积累量显著增加。通过软件Quantity One结果定量分析(图10中的E)，可以看到在visp3-1和visp3-2突变体中vsiRNA/gRNA的比值分别高达4.64和5.41，表明visp3突变体植株RNA沉默的效率更高，可以合成更多病毒来源的次级sRNA，发挥抗病毒的作用，靶标CMV基因组RNA上，使得gRNA积累量显著降低。

以上结果说明敲除VISP3可以增强植株对CMV-2blm的抗病能力。

2、visp3敲除突变体植株对TuMV的抗性分析

分析实施例2构建的visp3敲除突变体植株对TuMV-GFP抗性分析，具体方法如下：

通过对生长5周的Col-0及visp3突变体两个株系摩擦接种TuMV-GFP汁液，在接病毒第6天时，Col-0顶端分生组织和第1片新叶开始出现绿色荧光，而visp3-1和visp3-2中则没有荧光；随着时间推移，病毒在Col-0中侵染的范围越来越大，但在visp3-1和visp3-2中，病毒侵染缓慢。病毒侵染第九天，Col-0的6片叶片全部被侵染时，visp3-1突变体中仅3片叶子被侵染，visp3-2突变体中第3、4片叶片仍未被完全侵染(图11中的A)。利用westernblotting检测病毒GFP的积累量，可以看到在visp3突变体中积累量仅为Col-0的55％和67％(图11中的B)。说明敲除VISP3增加植物抵抗TuMV-GFP侵染的能力。

以上结果表明，敲除VISP3能够增强植物对CMV和TuMV的抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种植物选择性自噬受体小肽及其应用

<130> KHP211110837.4

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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1 5 10 15

Lys Lys Gln Val Ala Ser Val Ile Pro Val Thr Arg Lys Leu Val Lys

20 25 30

Thr Met Ala Ala Lys Ala Ile Ile Ser Ala Leu Thr Pro Ser Gly Cys

35 40 45

Gly Arg His Ser Asp Ser Thr Gly Asp Gly Lys Gly Asn Gly Gly Arg

50 55 60

Val Tyr Pro Gly Thr His Arg

65 70

<210> 2

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ser Lys Gly Glu Gly Ser Ser Ser Thr Ala Glu Arg Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Gln Ala Ala Ser Val Ile Pro Val Lys Arg Lys Leu Val Lys

20 25 30

Thr Met Ala Ala Lys Ala Ile Ile Ser Ala Leu Thr Pro Ser Gly Cys

35 40 45

Gly Arg Asn Ser Asp Ser Thr Gly Asp Gly Lys Gly Asn Gly Gly Arg

50 55 60

Val Tyr Pro Gly Thr His Arg

65 70

<210> 3

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Thr Met Ala Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Leu Thr Pro Ser Gly Ser

35 40 45

Ser Arg Lys Ser Asp Ser Ala Gly Asp Asp Gly Asn Gly Gly Arg Val

50 55 60

Tyr Pro Thr Arg Pro

65

<210> 4

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Ala Ser Val Ile Pro Val Lys Arg Lys Leu Val Lys

20 25 30

Thr Met Ala Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ala Ile

35 40 45

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50 55 60

Pro

65

<210> 5

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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1 5 10 15

Lys Lys Glu Thr Ala Ser Val Ile Pro Val Lys Arg Lys Leu Val Lys

20 25 30

Thr Met Ala Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ala Ile

35 40 45

Ser Leu Pro Thr Gly Asp Gly Asn Gly Gly Arg Val Tyr Pro Thr Arg

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Pro

65

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<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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20 25 30

Thr Met Ala Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Leu Thr Pro Ser Gly Ser

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Ser Arg Ser Ser Glu Phe Ser Gly Asp Gly Asp Gly Asn Gly Gly Arg

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<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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Thr Arg Gly Ser Glu Pro Thr Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Val

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65

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<211> 69

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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65

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<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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Thr Met Ala Met Lys Ala Ile Ile Ser Ala Leu Ser Pro Ser Gly Ser

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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1 5 10 15

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20 25 30

Thr Met Val Leu Lys Thr Ile Ile Ser Ala Phe Thr Pro Ser Gly Cys

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Thr Gly Gly Ser Glu Pro Thr Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg

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65 70

<210> 12

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgagttcta aaggagaagg ctctagttct acggcggaga gggaggtgaa gaaacaagta 60

gcgagtgtga ttcccgttac gaggaagctg gtgaagacta tggccgcgaa agccattatc 120

tctgctctca cgccatccgg ttgtggccgg cactctgact ctaccggcga cggcaaaggt 180

aacggagggc gcgtgtaccc cggtactcat cgttga 216

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atatatggtc tcgattgtca gagtgccggc cacaacgtt 39

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtcagagtg ccggccacaa cgttttagag ctagaaatag c 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aactctccgc cgtagaacta gacaatctct tagtcgactc tac 43

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attattggtc tcgaaactct ccgccgtaga actagac 37

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggggtaccaa agcaacaaac aaacacatat atac 34

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<211> 26

<212> DNA

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<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctccgccgt agaactaga 19

Claims

1.植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在植物病毒感染防治中的应用。

2.植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在抗病植物遗传育种中的应用。

3.植物自噬受体VISP3蛋白或编码所述植物自噬受体VISP3蛋白的基因或含有所述基因的载体在调控植物免疫力或抗病性中的应用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过降低所述植物自噬受体VISP3蛋白的表达量，增强植物抗病毒能力。

5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物自噬受体VISP3蛋白为以下任一：

(1)具有如SEQ ID NO.1-11任一所示的氨基酸序列；

6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物自噬受体VISP3蛋白编码基因的核苷酸序列为以下任一：

(1)如SEQ ID NO.12所示；

(2)在严格条件下能够与SEQ ID NO.12杂交的核酸序列；

(3)与SEQ ID NO.12互补的核苷酸序列；

7.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为十字花科植物；

优选地，所述植物为拟南芥、甘蓝、芜菁或油菜。

8.一种抗病转基因植物的构建方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术构建敲除植物中用于编码VISP3蛋白的基因；所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-11任一所示。

9.一种防治植物病害的方法，其特征在于，降低植物中VISP3蛋白的表达量；

当所述植物为甘蓝时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示；

当所述植物为林荫千里光南芥时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQID NO.9所示；

当所述植物为芜菁时，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.10所示；

10.一种防治植物病毒感染的药剂，其特征在于，包含VISP3蛋白表达抑制剂，所述VISP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-11中的一种或多种所示。