CN106544322B - 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法 - Google Patents

一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106544322B
CN106544322B CN201611108955.4A CN201611108955A CN106544322B CN 106544322 B CN106544322 B CN 106544322B CN 201611108955 A CN201611108955 A CN 201611108955A CN 106544322 B CN106544322 B CN 106544322B
Authority
CN
China
Prior art keywords
kiss1
egfp
cas9
cell
pkiss1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611108955.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106544322A (zh
Inventor
周宇荀
李晓宁
王斯佳
李文文
肖君华
李凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Donghua University
Original Assignee
Donghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Donghua University filed Critical Donghua University
Priority to CN201611108955.4A priority Critical patent/CN106544322B/zh
Publication of CN106544322A publication Critical patent/CN106544322A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106544322B publication Critical patent/CN106544322B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Abstract

本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。

Description

一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法。
背景技术
自从1996年Lee等人在黑色素瘤细胞中首次发现具有肿瘤转移抑制效应的Kiss1基因起(Lee JH,Welch DR(1997).Identification of highly expressed genes inmetastasis-suppressed chromosome 6/human malignant melanoma hybrid cellsusing subtractive hybridization and differential display.Int J Cancer.；71:1035-44.)，经历20年的研究历程，人们对Kiss1基因功能的认识日渐清晰。现有的研究显示，Kiss1参与多种生命过程的调节，如性发育(Gottsch,M.L.,Cunningham,M.J.,Smith,J.T.et al(2004).A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropinsecretion in the mouse.Endocrinology 145(9):4073–4077.)，肿瘤转移(Cho SG,Yi Z,Pang X,Yi T,Wang Y,Luo J,et al(2009)Kisspeptin-10,a KISS1-deriveddecapeptide,inhibits tumor angiogenesis by suppressing Sp1-mediated VEGFexpression and FAK/Rho GTPase activation.Cancer research.69:7062-70.)，卵泡成熟(Castellano JM,Gaytan M,Roa J,et al(2006).Expression of KiSS-1 in ratovary:Putative local regulator of ovulation？Endocrinology.147:4852–4862.)，血糖调节(Hauge-Evans AC,Richardson CC,Milne HM,Christie MR,Persaud SJ,Jones PM(2006).A role for kisspeptin in islet function.Diabetologia.49:2131–2135.)等过程。其中，以Kiss1与性发育的研究最为广泛。哺乳动物下丘脑中存在两个不连续的Kiss1表达区域，分别为AVPV(anteroventral periventricular nucleus，前腹侧室周核)和ARC(arcuate nucleus，弓状核)区域(Gottsch,M.L.,Cunningham,M.J.,Smith,J.T.et al(2004).A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion inthe mouse.Endocrinology 145(9):4073–4077.Adachi,S.,Yamada,S.,Takatsu,Y.et al(2007).Involvement of anteroventral periventricular metastin/kisspeptinneurons in estrogen positive feedback action on luteinizing hormone releasein female rats.J.Reprod.Dev.53(2):367–378.)，他们以不同的代谢通路调控个体繁殖能力。
生物体内基因通过受到精密的调控从而实现其时空特异性表达。近些年来，越来越多的研究涉及Kiss1的表达调控。Mueller等人使用染色质免疫共沉淀技术结合荧光酶报告基因技术，鉴定了转录调控因子CUX1、YY1、EAP1、TTF1对Kiss1的表达调控作用(JohannaK.Mueller,Anja Dietzel,Alejandro Lomniczi,et al(2011).Transcriptionalregulation of the human KiSS1 gene.Molecular and Cellular Endocrinology,342:8-19.)。一些表观遗传因素对Kiss1启动子转录能力的影响也曾被报道(Sheila J.Semaan,Alexander S.Kauffman(2013).Emerging concepts on the epigenetic andtranscriptional regulation ofthe Kiss1gene.International Journal ofDevelopmental Neuroscience,31:452-462.)。Kiss1在性发育进程中显示出重要的功能，对其表达调控机制的研究至关重要。但是到目前为止，尚不存在一个能够用于体外研究Kiss1表达调控的报告系统。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，该系统既可以绿色荧光强度的变化，定性判断研究对象对Kiss1的调控效果；也可以通过红绿荧光比值变化来量化评估Kiss1所受到调控的程度。
本发明的一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。
所述系统为带有红色荧光背景，用2A-EGFP编码基因插入Kiss1终止密码子与3’非翻译区域之间的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。
本发明构建两个基因打靶系统：敲入绿色荧光蛋白编码基因的由42230-Kiss1和打靶载体pKiss1-2A-EGFP组成的打靶系统和敲入红色荧光蛋白编码基因的Ai9-dtomato打靶系统。以能稳定表达Kiss1的Cas9-GT1-7细胞为材料，转染Kiss1-2A-EGFP打靶系统后使用流式细胞分选术分选出EGFP定点敲入的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞；再以此细胞为材料，通过药物筛选构建Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato稳转细胞系，实现红色荧光蛋白在Cas9-GT1-7细胞的恒定表达；即红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。在研究Kiss1的表达调控时，该系统既可以通过绿色荧光强度的变化，定性判断研究对象对Kiss1的调控效果；也可以通过红绿荧光比值变化来量化评估Kiss1所受到调控的程度。
所述绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的方式为：42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞，2A-EGFP定点敲入的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞。
所述红色荧光蛋白稳定表达的方式为：Ai9-dtomato表达载体转染Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP。
本发明的一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统的构建方法，包括：
(1)构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9-dtomato；
(2)构建绿色荧光蛋白打靶系统；
(3)EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建；
(4)插入稳定表达的红色荧光背景，得到绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。
所述步骤(1)中红色荧光的Ai9-dtomato打靶系统的构建方法包括：Ai9质粒的线性化、线性化Ai9上Stop终止子序列的去除以及质粒环化和菌落PCR筛选Ai9-dtomato载体。
所述步骤(2)中绿色荧光蛋白打靶系统的构建方法包括：构建42230-Kiss1载体和绿色荧光蛋白打靶载体pKiss1-2A-EGFP构建。
所述构建42230-Kiss1载体的方法包括：在基因组中产生DNA双链断裂的sgRNA的设计，T7E1酶切鉴定42230-Kiss1的活性；所述绿色荧光蛋白打靶载体pKiss1-2A-EGFP构建的方法包括：构建FUGW-2A-EGFP，然后构建pKiss1-2A-EGFP。
所述步骤(3)中Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建包括：42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞、细胞扩大培养、流式分选表达EGFP的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP和Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的鉴定。
所述步骤(4)中插入稳定表达的红色荧光背景的方法包括：Cas9-GT1-7细胞G418最低致死浓度筛选、Ai9-dtomato表达载体转染Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞、G418筛选红色荧光Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞。
本发明建立在小鼠下丘脑肿瘤细胞系GT1-7之上，该细胞系是研究性发育为数不多的细胞模型。它通过在小鼠下丘脑中使用GnRH启动子表达SV40T抗原诱导产生，能稳定表达Kiss1(Kauffman A.S.et al(2013).Kisspeptin Signaling in ReproductiveBiology.)。在实现荧光蛋白EGFP的定点敲入时，借助当前在基因编辑领域使用最为广泛的CRISPR/Cas9系统。该系统在基因组特定位点产生DNA双链断裂，诱发DNA断裂修复机制，借助同源片段指导的修复途径，提高外源片段的基因打靶效率(Patrick D.Hsu,EricS.Lander,and Feng Zhang(2014).Development and Applications of CRISPR-Cas9forGenome Engineering.Cell 157,1263-1278.)。本发明使用Zhang等人构建的包含CRISPR/Cas9系统的两个重要元件的42230质粒：由CBh启动子启动的核酸酶Cas9表达阅读框和由U6启动子启动的指导Cas9特异性识别靶位点的sgRNA的表达阅读框。在构建EGFP打靶载体时，我们在两者之间引入能够在翻译时发生自我切割的多肽P2A的编码序列，避免Kisspeptin与EGFP发生融合影响彼此的活性(Yuancheng Wang,Feng Wang,Riyuan Wang,Ping Zhao,Qingyou Xia(2015).2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression systemin the silkworm Bombyx mori.Scientific reports 5:16273)。在实现红色荧光蛋白dtomato敲入时，借助Madisen等人构建的Ai9质粒将dtomato表达阅读框通过同源重组定点插入到小鼠基因组Rosa26位点中(Madisen L,Zwingman TA,Sunkin SM,et al(2010).Arobust and high-throughput Cre reporting and characterization system for thewhole mouse brain,13(1):133-40)。在本发明中用到的Cas9-GT1-7细胞，经过改造，在GT1-7基因组中插入Cas9的表达阅读框，实验证实能够显著提高CRISPR系统该细胞中的基因编辑效率。在打靶载体同源臂长度设计中，参考Bassett等人使用CRISPR技术在果蝇中进行基因打靶的研究结果，以打靶效率较为理想的1kb作为同源臂长度(Andrew R.Bassett,Charlotte Tibbit,Chris P.Ponting and Ji-Long Liu(2013).Mutagenesis andhomologous recombination in Drosophila cell lines using CRISPR/Cas9.BiologyOpen 3,42–49.)。
本发明将2A-EGFP编码序列插入到Kiss1编码序列下游，完整的地保留了Kiss1基因的转录调控区域，又因为2A序列的引入，能够在细胞水平真实地展现研究对象对Kiss1基因表达的影响；红绿双荧光的应用，为量化评估研究对象的调控作用提供方便。构建成功的Kiss1表达调控报告系统，结合当前已有的转录因子库和miRNA库，能够直接筛选出通过Kiss1影响性发育的相关基因。
有益效果
(1)本发明首次构建用于研究Kiss1的表达调控报告系统；
(2)本发明中红绿双荧光的结合使得该报告系统在使用中实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估；在研究Kiss1的表达调控时，该系统既可以通过光复合后发射光颜色的变化，定性判断研究对象对Kiss1的调控效果；也可以通过红绿荧光比值变化来量化评估Kiss1所受到调控的程度；
(3)本发明中构建成功的Kiss1表达调控报告系统，结合当前已有的转录因子库和miRNA库，能够直接筛选出通过Kiss1影响性发育的相关基因。
附图说明
图1为实施例1中红色荧光蛋白打靶载体Ai9-dtomato构建流程图；
图2为实施例1中红色荧光蛋白打靶载体Ai9-dtomato构建；图A为线性化处理Ai9质粒的电泳结果；图B为菌落PCR筛选阳性克隆的电泳图，图中数字表示不同单克隆；图C为测序验证Ai9-dtomato构建的测序峰图；
图3为实施例1中pKiss1-2A-EGFP载体构建流程图；
图4为实施例1中42230-Kiss1载体构建与活性验证；图A为42230-Kiss1测序验证结果；图B为T7E1酶切鉴定42230-Kiss1活性的电泳结果，箭头所示为异源DNA双链被T7E1酶切割后产生的片段；
图5为实施例1中FUGW-2A-EGFP的构建：图A为限制性AgeI线性化处理FGUW后的电泳图；图B为热循环合成插入片段2A的电泳图；图C为菌落PCR筛选2A插入阳性克隆的电泳图；图D为FUGW-2A-EGFP阳性克隆的测序峰图；
图6为实施例1中打靶载体5’同源臂的插入过程：图A为限制性EcoR I和BamH I线性化处理pUC19后的电泳图；图B为从基因组中扩增到的5’同源臂的PCR产物电泳图；图C为菌落PCR筛选5’同源臂插入阳性克隆的电泳图；图D为阳性克隆的测序峰图；
图7为实施例1中打靶载体2A-EGFP的插入过程：图A为限制性BamH I线性化处理pKiss1-5’arm后的电泳图；图B为从FUGW-2A-EGFP上扩增出2A-EGFP的PCR产物电泳图；图C为菌落PCR筛选2A-EGFP插入阳性克隆的电泳图；图D为阳性克隆的测序峰图；
图8为实施例1中打靶载体3’同源臂的插入过程：图A为限制性BamH I线性化处理pKiss1-5’arm-2A-EGFP后的电泳图；图B为从基因组中扩增到的3’同源臂的PCR产物电泳图；图C为菌落PCR筛选3’同源臂插入阳性克隆的电泳图；图D为阳性克隆的测序峰图；
图9为实施例1中Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP的鉴定：图A为基于PCR技术的基因分型检测结果；图B、图C为验证2A-EGFP定点插入的测序峰图，其中图B检测5’端插入，图C检测3’端插入；D图为EGFP蛋白质免疫印迹技术检测结果，其中WT表示Cas9-GT1-7，KI表示Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP；
图10为实施例1中Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞：A为在红色荧光蛋白激发场下观测到的细胞形态，B为在绿色蛋白激发场下观测到的细胞形态，C为AB两图整合后呈橘色的双色荧光报告系统；
图11为实施例1中雷帕霉素对EGFP的抑制作用效果图；
图12为实施例1中流式细胞仪量化分析雷帕霉素对EGFP的抑制效果；A为在不同处理中绿色荧光(EGFP)和红色荧光(dtomato)信号峰，B为在不同处理中EGFP的信号强度，C为在不同处理中dtomato的信号强度；
图13为实施例1中绿色荧光报告基因的敲入流程图；
图14为实施例1中红色荧光背景的敲入的流程图；
图15为本发明中绿色荧光Kiss1表达调控系统示意图；
图16为本发明中红色荧光背景系统示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、红色荧光蛋白打靶载体Ai9-dtomato构建，流程图如图1所示。
(1)Ai9质粒的线性化
按照PacI限制性内切酶(NEB公司)的说明书设计酶切体系对Ai9质粒进行酶切处理，如图2A所示，为通过1％琼脂糖凝胶电泳检测的酶切结果。
(2)线性化Ai9上Stop终止子序列的去除以及质粒环化
按照NEB公司Cre酶说明书设计酶切体系，利用Cre重组酶切除两个同向loxp位点间的Stop终止子序列。然后利用T4连接酶16℃过夜连接，实现去除Stop终止序列的线性化Ai9质粒的环化。
(3)菌落PCR筛选Ai9-dtomato载体
将经过酶连的Ai9-dtomato表达载体转化进入DH5ɑ感受态细胞中，铺于LB固体平板上，37℃过夜培养16h。设计并合成表1所示引物Ai9-Loxp-L和Ai9-Loxp-R，从平板上挑取单克隆进行菌落PCR。如图2B所示，产物大小为254bp的为阳性克隆。
表1.Ai9-dtomato载体构建相关引物
Ai9-Loxp-L GTGCTGGTTATTGTGCTGT
Ai9-Loxp-R TGAACTCTTTGATGACCTCCTC
(4)DNA测序验证Ai9-dtomato载体
将阳性克隆送到上海生工进行DNA测序，如图2C所示，两个loxp位点间的stop序列已被切除，且Ai9-dtomato表达载体中只保留了一个loxp位点。
2、绿色荧光蛋白打靶系统的构建
(1)构建42230-Kiss1载体，流程图如图3所示。
A.在基因组中产生DNA双链断裂的sgRNA的设计
使用张锋实验室开发的sgRNA在线设计软件(http://crispr.mit.edu)在小鼠Kiss1的终止密码子附近设计sgRNA CAGGCGGCGCGGGCAGCACG；送上海生工生物合成42230质粒所需的sgRNA插入片段单链42230-Kiss1-F和42230-Kiss1-R(序列信息见表2)，经过退火后将其插入42230相应位点；委托上海生工生物有限公司以42230-Bbs I-F为引物测序确认sgRNA片段的插入，测序峰图见图4A。
B.T7E1酶切鉴定42230-Kiss1的活性
按照T7E1酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)说明书的要求，设计引物Kiss1-T7E1-F和Kiss1-T7E1-R(序列信息见表1)扩增Kiss1-sgRNA靶位点附近片段，用于验证42230-Kiss1的活性。PCR富集的目的片段，经过T7E1酶切检测结果如图4B所示，42230-Kiss1转染后的Cas9-GT1-7细胞，696bp的PCR片段被T7E1酶切割产生了约320bp和380bp的两个小片段。因此，该质粒能够实现在相应位点的基因编辑。
表2.42230-Kiss1相关引物列表
(2)绿色荧光蛋白打靶载体pKiss1-2A-EGFP构建，流程图如图3所示。
为了降低载体长度对质粒转染效率的影响，打靶载体以分子量较小的pUC19为骨架，在其多克隆位点EcoR I和BamH I之间插入打靶序列，即由Kiss1基因终止密码子上下游同源臂包围的2A-EGFP编码序列。该打靶载体所要达到的最终效果为用2A-EGFP的编码序列替换掉Kiss1的终止密码子，实现Kiss1与2A-EGFP同时转录和翻译。打靶载体的构建使无缝克隆试剂盒，因此按照该试剂盒的要求设计插入片段的PCR扩增引物，引物列表见表3。
a.构建FUGW-2A-EGFP
使用AgeI(NEB公司)线性化处理FUGW序列，酶切结果见图5A。根据无缝克隆试剂盒(上海近岸蛋白质科技有限公司)的要求设计两端带有Age I上下游同源臂的2A序列合成片段2A-EGFP-F和2A-EGFP-R，按照生产商的提示将两个片段稀释到浓度分别为10uM的混合液；按照反应体系H2O 10ul,GT buffer 1.5ul,dNTP1.5ul,10uM片段混合液1.5ul,Taq酶1ul,BSA 0.2ul反应程序预变性95℃2分钟，10个热循环变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃1min合成插入片段2A，电泳图见图5B；将电泳条带正确的产物使用PCR产物纯化试剂盒回收备用。按照无缝克隆试剂盒的说明以载体与插入片段1:10的比例将2A序列插入EGFP起始密码子上游，完成FUGW-2A-EGFP的重组。转化并过夜培养后，使用FUGW-Age I-F和FUGW-Age I-R为引物，菌落PCR筛选出产物变为184bp的阳性克隆，电泳图片见图5C。委托上海生工生物有限公司以FUGW-Age I-F为测序引物对菌落PCR阳性克隆测序确认，测序峰图见图5D。
b.构建pKiss1-2A-EGFP
A构建5’同源臂插入的pKiss1-5’arm载体
使用EcoR I和BamH I线性化处理质粒pUC19作为载体骨架，酶切体系按照NEB公司提供的说明书设计，酶切结果见图6A。设计引物F1，R1从小鼠基因组中扩增打靶载体5’端同源臂，臂长594bp(起始于终止密码子上游594bp，终止于终止密码子上游第一个碱基)，电泳图片见图6B。按照无缝克隆试剂盒的说明以载体与插入片段1:10的比例完成的打靶载体中5’同源臂的插入。转化并过夜培养后，使用M13为引物，菌落PCR筛选出产物变为697bp的阳性克隆，电泳图片见图6C。委托上海生工生物有限公司以M13-F为测序引物对菌落PCR阳性克隆测序确认，测序峰图见图6D。
B构建2A-EGFP序列插入的pKiss1-5’arm-2A-EGFP载体
使用BamH I线性化处理质粒pKiss1-5’arm作为载体骨架，酶切体系按照NEB公司提供的说明书设计，酶切结果见图7A。设计引物F2，R2从FUGW-2A-EGFP质粒上扩增2A-EGFP的编码序列，电泳图片见图7B。按照无缝克隆试剂盒的说明以载体与插入片段1:10的比例完成的打靶载体中2A-EGFP的插入。转化并过夜培养后，使用M13为引物，菌落PCR筛选出产物变为1480bp的阳性克隆，电泳图片见图7C。委托上海生工生物有限公司以M13-R为测序引物对菌落PCR阳性克隆测序确认，测序峰图见图7D。
C构建3’同源臂插入的pKiss1-2A-EGFP载体
使用BamH I线性化处理质粒pKiss1-5’arm-2A-EGFP作为载体骨架，酶切体系按照NEB公司提供的说明书设计，酶切结果见图8A。设计引物F3，R3从小鼠基因组中扩增打靶载体3’端同源臂，臂长900bp(起始于终止密码子下游第一个碱基，终止于终止密码子下游900bp)，电泳图片见图8B。按照无缝克隆试剂盒的说明以载体与插入片段1:10的比例完成的打靶载体中3’同源臂的插入。转化并过夜培养后，使用Test-F2+M13-R为引物，菌落PCR筛选出产物变为1078bp的阳性克隆，电泳图片见图8C。委托上海生工生物有限公司以M13-R为测序引物对菌落PCR阳性克隆测序确认，测序峰图见图8D。
表3.绿色荧光蛋白打靶载体相关引物
3、EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建(图13)
1)42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞
转染前一天，将Cas9-GT1-7细胞铺于24孔板中，每孔20万个细胞。然后利用Lipo2000脂质(Invitrogen)体将42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞中，转染时细胞汇合度控制在80％左右。
2)细胞扩大培养
转染第三天，将24孔板中的细胞铺进T75培养瓶中，至于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至第十五天进行流式分选，每三天更换一次培养基。
3)流式分选同时表达EGFP的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP
以Cas9-GT1-7为阴性对照，在单克隆分选模式下，以96孔板收集，经Moflo XDP流式细胞仪(贝克曼公司)筛选出EGFP阳性的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP单克隆细胞。
4)Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的鉴定
A荧光显微镜观察
待流失细胞分选所得单细胞长成的单克隆细胞团时，使用荧光显微镜(奥林巴斯IX70)在绿色荧光蛋白激发场下观察能够发出绿色荧光的细胞继续扩大培养。
B基于PCR技术的基因分型
如绿色荧光蛋白打靶载体构建示意图所示，设计位于打靶5’同源臂上游的引物Test-F1和位于EGFP编码序列5’端的引物Test-R1以及位于EGFP编码序列3’端的引物Test-F2，打靶3’同源臂下游的引物Test-R2用于基于PCR技术的筛选，以确保2A-EGFP在正确的位置发生打靶。阳性克隆以Test-F1+Test-R1为引物的PCR大小为774bp，以Test-F2+Test-R2为引物的PCR大小为1064bp，初步判断克隆5为阳性克隆，电泳结果如图9A所示。同时，将正确克隆的PCR产物测序确认，克隆5的5’端同源臂下游有2A-EGFP编码序列的插入，同时3’端同源臂上游有EGFP的编码序列插入，测序峰图如图9B和9C所示。
C检测EGFP表达
为了验证2A-EGFP插入基因组相应位置后能够正常表达，排除荧光显微镜下观察到的绿色荧光为非特异性荧光的可能，使用β-actin抗体(santa cruz)，Kiss1抗体(santacruz)，EGFP抗体(thermo fisher)以蛋白质免疫印迹技术检测相应基因在蛋白水平的表达情况，检测结果如图9D所示。
4、稳定表达的红色荧光背景的插入(图14)
1)Cas9-GT1-7细胞G418最低致死浓度筛选
将Cas9-GT1-7细胞铺于24孔板中，铺7个孔，每个孔4万个细胞，分别在每孔中加入不同量的G418，使终浓度分别为0ug/mL、200ug/mL、400ug/mL、500ug/mL、600ug/mL、700ug/mL和800ug/mL，并且将G418筛选周期设置为10天。筛选8天后，G418浓度为400ug/mL细胞培养孔中尚有极少量Cas9-GT1-7细胞贴壁，而其他高浓度孔细胞都已经完全死亡，所以将400ug/mL定为Cas9-GT1-7细胞G418最低致死浓度。
2)Ai9-dtomato表达载体转染Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞
转染前一天，将Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞铺于24孔板中，每孔10万个细胞。然后利用Lipo2000脂质体将Ai9-dtmotato表达载体转染进入GT1-7细胞中，转染时细胞汇合度控制在50％左右。
3)G418筛选红色荧光Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞
转染48h后，用浓度为400ug/mL的G418筛选转染后的Cas9-GT1-7细胞，每两天换一次培养基，并观察Cas9-GT1-7细胞表达红色荧光的情况。筛选7天后，发现荧光显微镜视野下GT1-7细胞都呈现出红色荧光，撤去含有G418的培养基，换成正常培养基进行扩大培养，成功构建的稳定表达红色荧光蛋白EGFP受Kiss1转录调控元件控制的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞即红绿双色荧光的Kiss1基因表达调控报告系统如图10所示，红绿荧光整合后该系统呈橘黄色。
4)Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞对雷帕霉素的响应
雷帕霉素是mTOR信号通路的特异性抑制剂，而mTOR信号通路的抑制可以下调Kiss1基因的表达，因此推测用雷帕霉素作用于该细胞，可以使绿色荧光减弱。实验中用70nM雷帕霉素处理该细胞24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光的强度变化，并用流式细胞仪进行定量验证，结果如图11和图12所示。如图11所示，经过雷帕霉素处理后，双色荧光报告系统的绿色荧光强度明显减弱，这一结果与雷帕霉素对Kiss1表达的抑制作用相符。如图12A所示，在使用流式细胞仪定量分析红绿双色荧光强度时，无论以何种溶剂(DMSO或超纯水)溶解雷帕霉素，在dtomato信号不发生任何变化的前提下EGFP信号明显减弱；如图12B和12C所示，在三次独立试验中，雷帕霉素处理能够显著降低EGFP的信号强度(***表示p<0.001；差异极显著)，而红色荧光背景dtomato的强度却能在雷帕霉素处理后不发生任何变化。因此，本实施例所构建的Kiss1基因表达调控双色荧光报告系统Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞，不仅能借助荧光显微镜直接观察EGFP强度定量判断调控因子对Kiss1的调控作用；也可以借助荧光信号量化统计仪器，如流式细胞仪，对待测因子调控能力强弱进行量化评估，同时dtomato提供背景信号可以直观反映细胞状态、确保该系统的灵敏性和稳定性，在一定程度上指示待测因子对Kiss1表达调控的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法
<130> 1
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgctggtta ttgtgctgt 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaactcttt gatgacctcc tc 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccgcaggc ggcgcgggca gcacg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaccgtgct gcccgcgccg cctgc 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgtttgagg acctagcatc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taccgctggc tgttgggaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtggaaagga cgaaacacc 19
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atccccgggt accggtgcta gcgccactaa cttctccctg ttgaaacaag caggggatg 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcctcgccct tgctcaccat tggcccggga ttctcttcga catcccctgc ttgtttcaa 59
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttgtccgcta aattctggcc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtccagctcg accaggatg 19
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gacggccagt gaattccggt ccctcctttt gctctt 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgactctaga ggatccgccc cgtgctgccc gcgccg 36
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgggcagcac ggggcgctag cgccactaac ttctc 35
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgactctaga ggatccttac ttgtacagct cgtcca 36
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagctgtaca agtaagtgct gggctgcagg tggat 35
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgactctaga ggatcctctg tgtgttcaaa gccagc 36
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agcggataac aatttcacac agg 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gctcagactc cagacacact 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctgaacttg tggccgttta c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caaagacccc aacgagaagc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcttggggt tgggaatggt 20

Claims (2)

1.一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统，其特征在于，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统；其中，
所述红色荧光蛋白稳定表达的方式为：以Stop终止子序列去除的Ai9-dtomato表达载体转染Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP；所述绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的方式为：42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞，2A-EGFP定点敲入的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞；
构建42230-Kiss1载体的方法为：
使用sgRNA在线设计软件在小鼠Kiss1的终止密码子附近设计sgRNACAGGCGGCGCGGGCAGCACG；合成42230质粒所需的sgRNA插入片段单链42230-Kiss1-F和42230-Kiss1-R，经过退火后将其插入42230相应位点；
构建pKiss1-2A-EGFP的方法为：
A构建5’同源臂插入的pKiss1-5’arm载体；
B构建2A-EGFP序列插入的pKiss1-5’arm-2A-EGFP载体；
C构建3’同源臂插入的pKiss1-2A-EGFP载体；
Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建方法为：
42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞。
2.一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统的构建方法，包括：
(1)构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9-dtomato；所述红色荧光的Ai9-dtomato打靶系统的构建方法包括：Ai9质粒的线性化、线性化Ai9上Stop终止子序列的去除以及质粒环化和菌落PCR筛选Ai9-dtomato载体；
(2)构建绿色荧光蛋白打靶系统；所述绿色荧光蛋白打靶系统的构建方法包括：构建42230-Kiss1载体和绿色荧光蛋白打靶载体pKiss1-2A-EGFP构建；
所述构建42230-Kiss1载体的方法包括：在基因组中产生DNA双链断裂的sgRNA的设计，使用sgRNA在线设计软件在小鼠Kiss1的终止密码子附近设计sgRNACAGGCGGCGCGGGCAGCACG；合成42230质粒所需的sgRNA插入片段单链42230-Kiss1-F和42230-Kiss1-R，经过退火后将其插入42230相应位点；
所述绿色荧光蛋白打靶载体pKiss1-2A-EGFP构建的方法包括：构建FUGW-2A-EGFP，然后构建pKiss1-2A-EGFP的方法为：
A构建5’同源臂插入的pKiss1-5’arm载体；
B构建2A-EGFP序列插入的pKiss1-5’arm-2A-EGFP载体；
C构建3’同源臂插入的pKiss1-2A-EGFP载体；
(3)EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建；所述Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞的构建包括：42230-Kiss1和pKiss1-2A-EGFP共转染Cas9-GT1-7细胞、细胞扩大培养、流式分选表达EGFP的Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP；
(4)插入稳定表达的红色荧光背景，得到绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统；所述插入稳定表达的红色荧光背景的方法包括：Cas9-GT1-7细胞G418最低致死浓度筛选、Ai9-dtomato表达载体转染Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP细胞、G418筛选红色荧光Cas9-GT1-7-Kiss1-2A-EGFP-dtomato细胞。
CN201611108955.4A 2016-12-06 2016-12-06 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法 Active CN106544322B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611108955.4A CN106544322B (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611108955.4A CN106544322B (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106544322A CN106544322A (zh) 2017-03-29
CN106544322B true CN106544322B (zh) 2019-10-08

Family

ID=58396011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611108955.4A Active CN106544322B (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106544322B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110308123A (zh) * 2019-07-03 2019-10-08 南开大学 一种用于ogt抑制剂高通量筛选的荧光报告分子

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116813705A (zh) 2017-07-05 2023-09-29 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
CN107828732A (zh) * 2017-11-08 2018-03-23 扬州大学 一种稳定表达猪源RIG‑I受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞及其构建方法
CN110167522B (zh) * 2017-12-12 2022-05-31 科丝美诗株式会社 包括亲吻素的抗老化或抗炎症的组合物
CN108359692B (zh) * 2018-01-19 2022-03-15 陕西师范大学 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统
CN112080517A (zh) * 2020-09-08 2020-12-15 南京农业大学 一种提高获得基因编辑植株概率的筛选系统、构建方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948805A (zh) * 2010-09-27 2011-01-19 扬州大学 筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法
CN104212836A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 东华大学 一种在哺乳动物细胞系中敲除mir-505的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110308123A (zh) * 2019-07-03 2019-10-08 南开大学 一种用于ogt抑制剂高通量筛选的荧光报告分子

Also Published As

Publication number Publication date
CN106544322A (zh) 2017-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106544322B (zh) 一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法
EP3134728B1 (en) Optogenetic analysis of compounds
US9952216B2 (en) Brain-specific enhancers for cell-based therapy
Guo et al. A PiggyBac-based recessive screening method to identify pluripotency regulators
Emerson et al. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors
CN106893739A (zh) 用于靶向基因操作的新方法和系统
Shi et al. Human ureteric bud organoids recapitulate branching morphogenesis and differentiate into functional collecting duct cell types
Fossat et al. Context-specific function of the LIM homeobox 1 transcription factor in head formation of the mouse embryo
US10202656B2 (en) Dividing of reporter proteins by DNA sequences and its application in site specific recombination
CN109517826A (zh) 一种修饰的Bach1基因及其应用
Doetzlhofer et al. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea
CN105671045B (zh) 一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法
CN112813049B (zh) 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用
Hu et al. Offspring production of haploid spermatid-like cells derived from mouse female germline stem cells with chromatin condensation
CN101679952A (zh) 靶向神经元和神经胶质人类胚胎干细胞系
Garstang et al. TCF/Lef regulates the Gsx ParaHox gene in central nervous system development in chordates
CN108138165A (zh) 鸟类、鸟类的生产方法和鸟类的卵
Shi et al. Efficient and rapid fluorescent protein knock-in with universal donors in mouse embryonic stem cells
Ratnayake et al. Measurement of GPCR-G protein activity in living cells
CN113025578A (zh) 一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法
JP4570875B2 (ja) 生存可能なｃ−ｋｉｔ発現細胞を単離するための道具
Schumacher et al. Tissue-intrinsic Wnt signals antagonize Nodal-driven AVE differentiation
EP3748363A1 (en) Method for high-throughput analyzing proteins and applicable library thereof
CN105695509B (zh) 一种获得高纯度心肌细胞的方法
Nie et al. CHD7 regulates otic lineage differentiation and deafness gene expression in human inner ear organoids

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant