CN109777862A - 包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物信息学和基因工程技术领域，公开了一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA‑UTR相互作用的方法，确定5’UTR序列；获取靶UTR序列；获取双荧光报告基因系统骨架；构建含UTR的双荧光报告基因系统；将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；用流式细胞术分析相互作用关系，进行荧光强度定量分析。本发明操作十分简单；能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，便于批量操作利用的双荧光报告基因系统可用于定量分析相互作用的强度，也可以移植到除运动发酵单胞菌以外其他物种中使用。

Description

包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的 方法

技术领域

本发明属于生物信息学和基因工程技术领域，尤其涉及一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：随着高通量测序技术的快速发展，大量的物种基因组得以测序并给予注释，其中非编码序列中的小RNA(small RNAs，sRNAs)作为一个在细胞生长过程中起重要作用的调控因子，也被大量发现、挖掘和鉴定。sRNAs有不同的作用模式，它们大多数是与靶mRNA相互作用以控制mRNA的翻译过程，它们还可以与蛋白质相互作用形成作用复合物或控制蛋白质含量。其中，sRNA与其靶mRNA的相互作用可能发生在5’UTR(5’un-translational region)非编码区域，也可能发生在编码区域(codingregion)，因此对其相互作用位置的准确定位及相互作用的强度鉴定非常重要，有利用实现对基因表达的准确调控。

现有技术EMSAs(electrophoretic mobility shift assays)来检测RNA-RNA的相互作用需要在体外进行，需要对RNA进行体外转录或者带上标签后进行破细胞提取，并且RNA易降解，对环境及操作要求高，在体外进行相关凝胶实验、制备探针操作繁琐，也不便于批量操作，同时聚丙烯凝胶具有一定毒性。以上这些不足给相关研究的研究造成了困难，使得相关研究进展缓慢。

综上所述，现有技术存在的问题是：

传统的EMSA方法，操作十分繁琐。而且在体内进行检测时，不能免去体外获取实验材料及体外进行相关实验的麻烦，造成不能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，不便于批量操作，并且不能用于定量分析目的sRNA与其靶5’UTR之间的相互作用的强度。

解决上述技术问题的难度：

需要一种方便的实验材料获取方法。

需要一种可批量的、方便的操作方法。

需要提高实验的安全性。

解决上述技术问题的意义：

解决上述技术问题可以提供一种方便、快速、安全、可批量化的研究RNA-RNA相互作用的方法，有利于加快相关领域的研究进展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法。

本发明是这样实现的，一种基于所述包含UTR的双荧光报告基因系统的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括：

第一步，利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点；

第二步，以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；

第三步，以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；

第四步，利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统；

第五步，得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；

第六步，用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。

进一步，所述第一步中利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子ATG后99-bp作为靶5’UTR序列。

进一步，所述第二步中引物序列为：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

进一步，所述第三步中以含有Pgap启动子的双荧光报告基因系统为模板，用引物Prtt-F、PgapTSS-R进行PCR扩增得到载体骨架序列；引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。

进一步，所述第五步中用引物Pdual-F,Pdual-R进行PCR阳性克隆验证；引物序列为：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

本发明的另一目的在于提供一种包含UTR的双荧光报告基因系统，所述包含UTR的双荧光报告基因系统以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架；利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统。

本发明的另一目的在于提供一种所述鉴定sRNA-UTR相互作用的方法在物种基因组测序中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明方便快捷，相比于传统的EMSA方法，操作十分简单。本发明基于流式细胞术的双荧光报告基因系统，在体内进行检测，免去了体外获取实验材料及体外进行相关实验的麻烦，能快速确定sRNA与靶UTR之间是否存在相互作用关系，便于批量操作。本发明的方法利用的双荧光报告基因系统可用于定量分析相互作用的强度，也可以移植到除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用本发明提供一种鉴定sRNA与其靶mRNA的5’UTR相互作用的方法，建立可以快速高效的确定目的sRNA与其靶5’UTR之间的相互作用关系，并可以进行定量分析。本发明的方法简单易于操作，可容易推广到其它物种。

附图说明

图1是本发明实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法原理流程图；

图中：TSS表达转录起始位点，ATG表示起始密码子，WT表示野生型菌株，ΔsRNA表示目的sRNA敲除菌株，OE_sRNA表示目的sRNA过表达菌株。

图3是本发明实施例提供的Zms4与其靶UTR之间的相互作用示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)为模式菌株，建立了一套基于双荧光报告基因系统的检测及鉴定sRNA与靶mRNA 5’UTR区域的作用关系及相互作用的强度。本发明的检测基于流式细胞术，比传统的EMSA的方法快速方便，且相较于目前已有的单荧光报告基因系统而言，本发明中使用的双荧光报告基因系统可以对作用对之间的相互作用强度进行定量分析。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括以下步骤：

S101：利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子(ATG)后99-bp作为靶5’UTR序列。

S102：以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。

S103：以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。

S104：利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统。

S105：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株。

S106：用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：验证Zms4-UTR1754的相互作用

(1)取基因ZMO1754基因与前一个基因之间的基因间区序列，用BPROM(http:// www.softberry.com/berry.phtml？topic＝bprom&group＝programs&subgroup＝gfindb)进行启动子分析，得到转录起始位点(TSS)后，保留从TSS到ZMO1754基因后的99-bp序列为UTR1754序列，SEQ ID NO：1。

UTR1754

5’-GATCATTTCACAAAAAATGAGAAAAAATTAAGGATGAGTCCTTCTTTGTAAAAAGGAGGACTGTCCTAAGCTGAAGTAATAAGAAAGGTAGGCTCTTTTATGGCATATGAATCTGTCAATCCCGCCACTGGCGAAACCGTCAAAAAATATCCTGATTTTTCTGATAAACAGGTTAAAGATTCCGTTGATCGGGCGGCG-3’

(2)以Z.mobilis基因组为模板，用引物对UTR1754-F/R进行PCR扩增，以获得UTR1754序列。按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。(引物序列中小字母为同源臂，大写字母为引物序列。)

SEQ ID NO：2：

UTR1754-F

5’-atggtattgatgtttGATCATTTCACAAAAAATGAGAAAAAATTAAGGATGAG-3’

SEQ ID NO：3：

UTR1754-R 5’-gcccttgctcaccatCGCCGCCCGATCAACG-3’

(3)以含有Pgap启动子的双荧光报告基因系统为模板，用引物Prtt-F、PgapTSS-R进行PCR扩增得到载体骨架序列。按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。

SEQ ID NO：4：Prtt-F 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’

SEQ ID NO：5：

PgapTSS-R 5’-AAACATCAATACCATAACGAAGACC-3’。

(4)获得重组质粒：获得UTR序列和双荧光报告基因系统骨架后，通过Gibson装配的方法转化大肠杆菌DH5α，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒。(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)

(5)获取含有特定UTR序列的双荧光报告基因系统质粒的菌株：用提取的质粒对Z.mobilis野生型菌株，Zms4敲除和过表达菌株进行电转化。取相应的感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000rpm，1min离心，除去上清。加入200μL新鲜的RM培养基，取100μL涂布于300μg/mL卡那霉素抗性平板，30℃培养2天。再用引物Pdual-F,Pdual-R进行PCR阳性克隆验证。

SEQ ID NO：6：Pdual-F CCGCTCACAATTCCACACATTATAC

SEQ ID NO：7：Pdual-R ACCAGGATGGGCACCAC

(6)流式细胞术检测：将验证正确的单克隆于300μg/mL卡那霉素的RM培养基中进行活化，活化后每个样培养3个平行，培养至对数期后，取样200μg，12000rpm离心1min，去上清，并用1×PBS洗两次后重悬，用设定好的程序进行流式细胞仪检测，为防止小概率及偶然事件，将细胞收集事件设置为20，000。

(7)结果分析：根据流式细胞仪得到的数据，每个样品取所有事件的EGFP和opmCherry的平均荧光值进行计算，并用EGFP/opmCherry的比值进行标准化处理，以排除来自细胞内部及外部的干扰，结果如图3。

如图3所示，本发明实施例提供的Zms4与其靶UTR之间的相互作用示意图。结果表明，双荧光报告基因系统的检测与生物信息学预测结果相符合。当预测Zms4对靶UTR有稳定作用时(Zms4-UTR1754)，在Zms4敲除菌株中EGFP/opmCherry的值相较WT菌株中显著性降低。当预测Zms4对靶UTR有降解作用时(Zms6-UTR1993)，在Zms4敲除菌株中EGFP/opmCherry的值相较WT菌株中显著性升高。

利用本发明系统得到的实验结果，与传统实验方法得到的结果一致，但本发明方便快捷，安全高效，实验周期短(比传统方法至少节约一个星期的时间)，可批量操作。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 包含UTR的双荧光报告基因系统、鉴定sRNA-UTR相互作用的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatcatttca caaaaaatga gaaaaaatta aggatgagtc cttctttgta aaaaggagga 60

ctgtcctaag ctgaagtaat aagaaaggta ggctctttta tggcatatga atctgtcaat 120

cccgccactg gcgaaaccgt caaaaaatat cctgattttt ctgataaaca ggttaaagat 180

tccgttgatc gggcggcg 198

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtattga tgtttgatca tttcacaaaa aatgagaaaa aattaaggat gag 53

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcccttgctc accatcgccg cccgatcaac g 31

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgagca agggcgag 18

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacatcaat accataacga agacc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcacaa ttccacacat tatac 25

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accaggatgg gcaccac 17

Claims (7)

1.一种鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述鉴定sRNA-UTR相互作用的方法包括：

第一步，利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点；

第二步，以Z.mobilis基因组为模板，利用上下游引物对扩增得到靶UTR序列，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；

第三步，以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架，按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化；

第四步，利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统；

第五步，得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌及对应sRNA敲除或过表达菌株中，通过PCR及测序确定最终菌株；

第六步，用流式细胞术进行相互作用关系的分析，并进行荧光强度的定量分析。

2.如权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述第一步中利用生物信息学方法对靶序列进行分析，确定转录起始位点后，保留从转录起始位点开始至起始密码子ATG后99-bp作为靶5’UTR序列。

3.如权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述第二步中引物序列为：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

4.如权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述第三步中以含有Pgap启动子的双荧光报告基因系统为模板，用引物Prtt-F、PgapTSS-R进行PCR扩增得到载体骨架序列；引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。

5.如权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法，其特征在于，所述第五步中用引物Pdual-F,Pdual-R进行PCR阳性克隆验证；引物序列为：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

6.一种实施权利要求1所述的鉴定sRNA-UTR相互作用的方法的包含UTR的双荧光报告基因系统，其特征在于，所述包含UTR的双荧光报告基因系统以含Pgap的双荧光报告基因系统为模板，从Pgap启动的转录起始位点和EGFP为两端起始反向扩增得到骨架；利用Gibson装配，将靶UTR和双荧光报告基因系统骨架连接，得到含靶UTR的双荧光报告基因系统。

7.一种如权利要求1～5任意一项所述鉴定sRNA-UTR相互作用的方法在物种基因组测序中的应用。