CN104611429A - 一种miR-10b基因在胃癌基因表达调控中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种miR-10b基因在胃癌中的应用。本发明发现一种促进胃癌生长的微小RNA，miR-10b，KLF4是miR-10b的直接靶基因，miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达。在不同细胞中观察到miR-10b，KLF4 mRNA的表达水平呈相反趋势后，利用荧光素酶报告基因分析，初步验证了KLF4是miR-10b的靶基因；此后通过miR-10b稳定表达株的建立，进一步发现miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达，最后在临床胃癌组织中再次证实了以上的调控方式。所公开的为在胃癌细胞系中KLF4是miR-10b的靶基因的首次报道，该发明利用miRNA为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。本发明可为胃癌的诊断和预后提供有利的技术支持。

Description

一种miR-10b基因在胃癌基因表达调控中的应用
技术领域
本发明涉及一种miR-10b基因在癌症中的作用，具体涉及在胃癌中的应用。
背景技术
恶性肿瘤的侵袭转移能力是肿瘤治疗的一大难点。近些年来，微小RNA(microRNA,miRNA)的出现为研究肿瘤的发生及侵袭转移机制提供了新的思路和途径，微小RNA(miRNA)是一类内源性、保守、稳定的非编码短单链RNA，在转录后水平调节靶基因表达miRNA在机体发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生发展等生理和病理过程中发挥重要作用，成为当前生命科学研究的热点。miRNA(microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗与诊断的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3′-UTR或5′-UTR)存在着一对多的关系。在癌症病例中经常发现miRNA群表达失调的现象，而这些miRNA表达的改变与癌症发生密切相关。在体外实验中，改变一个或者多个miRNA的表达能够促进或者抑制癌细胞恶化，促进癌细胞恶化的miRNA可以认为是一类癌基因，反之，抑癌基因。miR-10b作为微小RNA家族中的一员，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、垂体瘤、急性髓性白血病等肿瘤组织中都有异常表达，并且与肿瘤的侵袭性和远处转移有密切关系。
胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。据世界卫生组织估计，2008年全球范围内大约100万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病的7.8％，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。超过70％的胃癌病例发生在发展中国家，其中50％发生在中国。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为41.3/10万，女性为18.5/10万，仅次于肺癌。大约90％-95％的胃癌为腺癌，起源于胃部上皮组织。已有文献报道miR-10b在多种癌中起到抑癌基因的作用。KLF4(Kriippel-like factor4)是一种在多种人类组织中广泛表达的锌指转录因子，在许多不同的生理活动中具有重要作用，研究表明KLF4基因与多种肿瘤的发生发展有关，通过检测癌组织中KLF4蛋白的表达，探讨KLF4蛋白与胃癌临床病理间的关系。
本发明拟在胃癌细胞中验证KLF4是否是miR-10b的靶基因，并探讨miR-10b在胃癌侵袭转移中的调控机制，为胃癌的临床治疗提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种miR-10b基因作为KLF4靶基因的调控者在制备下调胃癌细胞中KLF4表达水平药物中的应用。具体地，调节癌症细胞中KLF4表达水平为miRNA-10b抑制KLF4的表达，其中癌症细胞主要为胃癌细胞，并且其中所述miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因KLF4的表达。本发明还提供了一种KLF4作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物中的用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
本发明还提供了以下具体方法，研究KLF4是否是miR-10b的靶基因，具体为：
a)生物信息学方法对miR-10b的靶基因进行预测；
b)不同胃癌细胞中miR-10b、KLF4mRNA表达水平的相关性检测；
c)荧光素酶报告验证KLF4是miR-10b的靶基因；
d)建立稳定表达miR-10b的细胞株，荧光定量PCR技术和western blot技术阐明miR-10b作用于靶基因KLF4的核酸水平或蛋白水平；
e)胃癌组织中验证miR-10b和KLF4的表达相关性。
本发明培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检测不同细胞中miR-10b，KLF4mRNA的表达水平。发现miR-10b与KLF4mRNA表达呈相反趋势后，采用双荧光素酶检测法进一步验证KLF4是miR-10b的直接靶基因。进一步采用荧光定量PCR，WesternBlot检测上调miR-10b的表达对靶基因KLF4核酸和/或蛋白表达水平的调控方式。最后在临床胃癌组织样本中分析miR-10b和KLF4表达的相关性。
胃癌细胞中miR-10b的表达水平影响细胞的增殖，迁移能力等，在胃癌的发生起重要的作用。KLF4与癌症的发生密切相关。miR-10b通过与其靶基因KLF4的mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶mRNA。本实验通过软件预测、构建载体，然后在胃癌细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了KLF4是miR-10b的靶基因，并在AGS细胞中利用qRT-PCR技术，进一步验证了该发现。所公开的为在AGS细胞系中KLF4是miR-10b的靶基因的首次报道，该发明为利用miRNA-10b为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
附图说明
图1.不同胃癌细胞中miR-10b表达水平的检测；
图2.pCDH-RFP-miR10b sponge-EF1-GFP+puro质粒构建图谱；
图3.PCR验证pCDH-RFP-miR10b sponge-EF1-GFP+puro，扩增RFP序列。
1～6：挑取的克隆；7：阴性对照；
图4.EcoRI/BamHI双酶切验证pCDH-RFP-miR10b sponge-EF1-GFP+puro，
1：未酶切质粒对照；2：EcoRI/BamHI双酶切的质粒；
图5.pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro质粒构建图谱；
图6.PCR验证miR-10b表达载体，1～12：挑取的克隆，13：阴性对照；
图7.EcoRI/BamHI双酶切验证pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro载体，
1：未酶切质粒；2：EcoRI/BamHI酶切质粒；
图8.慢病毒包装示意图；
图9.过表达和抑制表达miR-10b后稳转细胞株中miR-10b的表达水平；
图10.过表达miR-10b后，KLF4mRNA和蛋白表达水平的检测；
图11.荧光素酶报告检测。
图12.miR-10b在胃癌组织中的表达分布。
图13.KLF4蛋白在胃癌组织中的定位和表达。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明。
实施例一：不同胃癌细胞中miR-10b，KLF4mRNA表达水平的检测
培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检测不同细胞中miR-10b，KLF4mRNA的表达水平。
结果可见，miR-10b与KLF4mRNA表达在不同的胃癌细胞中呈相反趋势，miR-10b在SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803依次下降，而在SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803中呈上升趋势，提示KLF4可能是miR-10b的靶基因(图1)。
实施例二：慢病毒缺失表达载体pCDH-RFP-miR10b sponge-EF1-GFP+puro和过表达载体pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro的构建以及KLF4靶基因细胞学观察
本实验设计miR-10b干扰载体，基于慢病毒表达载体
pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro，以RFP为报告基因，将miR-10b sponge序列连接到RFP序列后，作为RFP基因的3’UTR区域。miR-10b sponge序列由Generay公司合成并插入至pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体的BamHI/NotI之间，然后将RFP序列插入EcoRI/BamHI之间构建完成pCDH-RFP-miR10b
sponge-EF1-GFP+puro载体(图2)。miR10b sponge克隆部分验证由Generay公司测序并验证。插入的RFP基因的pCDH-RFP-miR10b sponge-EF1-GFP+puro由PCR(图3)和酶切验证(图4)显示质粒构建成功。
为构建miR-10b的过表达载体，miR-10b序列及其侧翼序列克隆至pMD19-T载体，由上海桑尼生物科技有限公司测序。结果显示miR-10b序列正确，将测序确认的miR-10b序列及其侧翼序列做亚克隆，插入pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体的EcoRI/BamHI之间(图5)。经过PCR(图6)和酶切验证(图7)，确认载体构建完成。载体命名为pCDH-CMV-miR10b-EF1-GFP+Puro。将载体转染入293T细胞中，构建慢病毒载体(图8)。
病毒感染及抗性筛选稳转细胞株：在六孔板中无抗完全培养基中接种6.4×105个细胞，37℃、5％CO2过夜，稀释病毒：稀释液(靶细胞维持液培养基)1000ul+终浓度5μg/ml Polybrene，将慢病毒原液(100ul)加入到稀释液中(此时细胞个数按1×106计，即MOI＝10)；移去细胞培养液，加入Step2稀释后的病毒液，同时建立对照(blank、negative)，37℃、5％CO2过夜(感染时细胞融合度为70-80％)，移去细胞侵染后的病毒液，加入2ml完全培液，37℃、5％CO2过夜；根据细胞状态，进行常规传代，传代同时(感染后48h)，换用含嘌呤霉素(puro终浓度1μg/ml)的完全培养基以进行抗性筛选；以后每隔两天换用新的含puro的培养基，直至Blank组细胞全部死亡；将存活下来的细胞换用含一半筛选浓度药物的培养基培养，进行为期一周的抗性维持。最后采用荧光定量PCR的实验方法，分析miR-10b的表达。由图可见，miR-10b在miR-10bmimic AGS细胞中的表达与AGS(Blank)细胞相比，上调了120多倍，而在spongeAGS细胞中的表达却未得到明显抑制，此后多次重复sponge实验，但均未能得到理想结果(图9)。因此，我们选择了过表达miR-10b来进行后续的实验。
分别培养AGS NC(Scramble)细胞和AGS miR-10b mimic(miR-10bmimic)细胞株，进入对数生长期后收集细胞，分别行荧光定量PCR，WesternBlot检测，分析miR-10b和KLF4核酸和蛋白表达水平的变化。结果(图10)显示，过表达miR-10b后，KLF4mRNA表达水平下降了近两倍(P<0.05)，而KLF4蛋白表达也呈现显著的下调(P<0.05)。
实施例三：荧光素酶报告检测
采用了双荧光素酶检测法进一步验证KLF4是否是miR-10b的直接靶基因。共转染pGL3-Control、pRL-TK(WT、Mut)、pCD513B-1(NegativeControl、miR10b)于293T细胞，检测双荧光素酶活性从而判断miR10b对不同pRL-TK载体Renillaluciferase表达的影响。结果显示(图11)，miR-10b共转染3’-UTR(wt)与miR-10b共转染3’-UTR(mut)相比，荧光的表达量显著降低(P<0.05)。以上结果表明，在胃癌中，KLF4是miR-10b的直接靶基因，且miR-10b在核酸和蛋白水平同时调节KLF4的表达。
实施例四：miR-10b和KLF4在胃癌临床组织中表达相关性的研究
a)miR-10b在胃癌组织中的表达
收集至2011年-2014年入住我院的能采集到胃癌标本的胃癌患者癌组织和癌旁正常组织，共67对，离体30min内液氮速冻后，-80℃冰箱保存备用。此后使用Trizol抽提组织中总RNA，采用茎环逆转录(RT)引物设计miR-10b引物(表1)，SYBR Green I荧光定量PCR法检测miR-10b在胃癌组织中的表达，并分析其表达水平与临床病理特征的相关性。研究结果显示，将癌旁正常组织用来消除个体差异，以为界，大于1定义为miR-10b表达水平上调，小于1定义为miR-10b表达水平下调，结果发现，36例(53.73％，36/67)组织中miR-10b的表达水平上调(图12)，而将67例患者按分化程度分类为普通腺癌组和印戎细胞癌组(包括印戎细胞癌和粘液腺癌)发现，印戎细胞癌组中有15例(15/20，75.00％)miR-10b的表达水平上调，而普通腺癌组中20例数(20/47，42.55％)miR-10b的表达水平上调，两者比较有显著地统计学差异，提示，恶性程度越高，miR-10b表达水平越高。此外，对miR-10b的表达与胃癌的临床病理特征相关性分析发现，miR-10b的表达与肿瘤大小，浸润深度，发生位置以及分化程度密切相关(表2)。
Table1Reverse transcription and stem-loop primers for Real-Time PCR
F:forward primer,R:reverse primer
Table2 Relative miR-10b expression in GC patients and clinicopathologicalfeatures
b)靶基因KLF4在胃癌组织中的表达；
采用免疫组织化学方法检测胃癌组织中KLF4的表达，结果显示KLF4染色主要位于细胞质。KLF4蛋白在癌旁组织及正常胃组织标本中均可见KLF4蛋白强阳性表达(图13A),而在部分胃癌组织中强表达(图13B)，在大部分胃癌组织或癌巢组织中弱表达表达(图13C)。
进一步分析KLF4在胃癌中的表达与胃癌临床病理特征的关系发现：KLF4在胃癌中的异常表达与胃癌的分化程度，肿瘤分期及淋巴结转移相关。KLF4在中高分化胃癌中的阳性率为81.2％,在低分化胃癌中阳性率为14.3％，二者间的差异有统计学意义(P>0.05)。从I至IV各期胃癌组织的KLF4表达阳性率依次降低,各期KLF4阳性表达率间的差异均有统计学意义(P<0.05)，而有淋巴结转移组中KLF4阳性率83.3％，无淋巴结转移组中KLF4的阳性率为27.8％,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),见表3。
表3.KLF4在胃癌组织中的表达与临床病理特点间的关系
c)胃癌组织中miR-10b、KLF4表达水平的相关性分析
采用spearman分析发现，miR-10b和KLF4mRNA在胃癌组织中的表达水平呈负相关(表4，r＝-0.288，p＝0.018)。同时，采用免疫组织化学检测30例胃癌组织标本发现，KLF4蛋白在胃癌组织中缺失表达共17例，缺失表达率为56.67％，而67例胃癌组织中36例miR-10b表达上调，上调率为53.73％，两者结果近似一致。因为我们认为，在胃癌细胞中，KLF4是miR-10b的靶基因，且miR-10b在mRNA和蛋白水平同时调节(抑制)KLF4的表达。
Table4Correlation analysis ofmiR-10b expression andKLF4mRNAexpression
本发明说明书未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种miR-10b 基因作为KLF4靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中 KLF4表达水平药物或试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1中所述用途，其中调节癌症细胞中 KLF4表达水平为  MiRNA-10b抑制KLF4的表达。
3.根据权利要求1中所述用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
4.根据权利要求1中所述用途，其中所述miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因KLF4的表达。
5.一种KLF4作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物或试剂盒中的用途。
6.根据权利要求5中所述用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
7.一种验证胃癌细胞中KLF4是miR-10b靶基因的研究方法，具体为：
a)    生物信息学方法对miR-10b的靶基因进行预测;
b)    不同胃癌细胞中miR-10b、KLF4 mRNA表达水平的相关性检测；
c)    荧光素酶报告验证KLF4是miR-10b的靶基因；
d)    建立稳定表达miR-10b的细胞株，荧光定量PCR技术和western blot技术阐明miR-10b作用于靶基因KLF4的核酸水平或蛋白水平；
e)    胃癌组织中验证miR-10b和KLF4的表达相关性。
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