CN112608959A - 一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，属于发酵工程技术领域，采用大肠杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖，在发酵培养阶段，对IPTG诱导进行控制，选择在不同阶段分批次添加IPTG，同时在第二次IPTG诱导时将葡萄糖酸钙和碘化钾与IPTG一同加入，发酵周期短、产酸效率高、菌体密度高；底物转化率高；而且工艺简单，环境污染低，降低了乙酰氨基葡萄糖的生产成本，有利于工业化生产的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖是甲壳素的单体，甲壳素在自然界中的存量非常大，仅次于纤维素。N-乙酰氨基葡萄糖在医药上具有重要的生理功能，具有消炎、抗肿瘤及抗氧化作用，是治疗骨关节炎、风湿性关节炎的有效药物，在食品、化工及化妆品行业中均有重要的应用。
现有的N-乙酰氨基葡萄糖的制备方法，包括有甲醇钠法以及甲壳素直接酶解法等。甲醇钠法的流程为：氨基葡萄糖原料中加入甲醇钠进行置换反应，除去氨基葡萄糖中的氯离子，再加入醋酐对其进行乙酰化，经过超滤去除其中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，接而分级沉淀、过滤过后，再进行重溶结晶以及固液分离，真空干燥过后所得物质即为成品。直接酶解法是指N~乙酰氨基葡萄糖的生产可以用几丁酶直接酶解甲壳素而产生，由于甲壳素化学性质的特殊性使其酶解过程较长，且水解不完全，水解率在75%以下，效率较低，实际大规模工业化生产成本较高，效益不佳。
运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。但是采用该方法，发酵水平尤其对于乙酰氨基葡萄糖的发酵产量，并不是很理想，如何进一步优化发酵工艺，以使得发酵单位有效提高，是本领域研究人员着力探究的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法。所述方法是在发酵培养阶段，对IPTG诱导进行控制，选择在不同阶段分批次添加IPTG，同时在第二次IPTG诱导时将葡萄糖酸钙和碘化钾与IPTG一同加入，有效提高了发酵产量，
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，包括以下步骤：
步骤一、大肠杆菌原始菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱30~36℃培养12h，得到活化菌种；
步骤二、种子培养：将步骤一所得活化菌种接种到装有种子培养基的种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8 h，得种子液；
步骤三、将步骤二所得种子液接种到装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵培养基的体积为x L；接种量：5-15%，培养条件：初始发酵温度30-36℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.0~7.2之间；当菌体OD为10~15时，添加x mL浓度为0.1 mol/L 的IPTG诱导，继续培养到菌种OD值生长到50~80时，再一次性添加x mL浓度为0.1 mol/L的IPTG、10x mL浓度为5g/L的葡萄糖酸钙溶液和x mL浓度为0.5g/L的碘化钾溶液，继续培养10~20h结束。
作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述种子培养基中所含的组分及其含量分别为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410~20g/L，MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L，KH2PO4 10~20g/L，柠檬酸0.5~3.0g/L，(NH4)2SO4 5~10.0g/L和微量元素5~10.0mL/L。
作为对上述方案的进一步优化，步骤三所述发酵培养基中所含的组分及其含量分别为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO43.0~10.0g/L, MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L， 柠檬酸1.0~7.0.0g/L，(NH4)2SO4 5~10.0g/L和微量元素5~10.0mL/L。
作为对上述方案的进一步优化，步骤三所述接种量为7%。
有益效果：
本发明采用大肠杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖，菌株发酵为好氧发酵，菌体生长较快，在发酵培养阶段，对IPTG诱导进行控制，选择在不同阶段分批次添加IPTG，同时在第二次IPTG诱导时将葡萄糖酸钙和碘化钾与IPTG一同加入，有效提高了发酵产量，过程简单，易于控制，适合进行工业生产。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，具体步骤如下：
接种原始菌株（大肠埃希氏菌CGMCC NO.13924）到斜面，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱30~36℃培养12h左右。接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8 h；当OD值长到1.0~2.0左右时，接种到5L发酵瓶中，接种量：7%左右，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp，菌体OD为10~15左右时，一次性添加5ml 0.1 mol/L的IPTG诱导，继续培养到菌种OD值生长到50~80左右时，再一次性添加5ml 0.1 mol/L的IPTG诱导和50ml 5g/L的葡萄糖酸钙和5ml 0.5g/L的碘化钾，继续培养10~20h，发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为70.25g/L。
采用上述方案设置对照，所述对照与上述方案不同之处在于：在发酵培养至菌体OD为10~15左右时，一次性添加10ml同浓度的IPTG诱导，然后继续培养至发酵结束。发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为49.69g/L。
与对照相比，实施例1中乙酰氨基葡萄糖的产量提高了41.37%。
实例2
从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌（大肠埃希氏菌CGMCC NO.13924）接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8h；当OD值长到1.0~2.0左右时，将摇瓶种子以10%的接种量接入装有6L发酵培养基的10L全自动发酵罐中进行二级种子培养。培养温度30~36℃，罐压0.01~0.05MPa，空气流量1~8L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~50%，pH值控制在7.0~7.2之间，培养时间为5~8h。将二级种子以10%接种量分别接入装有18L发酵培养基的50L全自动发酵罐中进行发酵。发酵温度30~36℃，罐压0.01~0.15MPa，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.2~7.2之间，菌体OD为10~15左右时，一次性添加18ml 0.1 mol/L的IPTG诱导，继续培养到菌种OD值生长到50~80左右时，再一次性添加18ml 0.1 mol/L的IPTG诱导和180ml 5g/L的葡萄糖酸钙和18ml 0.5g/L的碘化钾，继续培养10~20h，发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为220.76g/L。
采用上述方案设置对照，所述对照与上述方案不同之处在于：在发酵培养至菌体OD为10~15左右时，一次性添加36ml同浓度的IPTG诱导，然后继续培养至发酵结束。发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为170.74g/L。
与对照相比，实施例2中乙酰氨基葡萄糖的产量提高了29.30%。
实施例3
从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌（大肠埃希氏菌CGMCC NO.13924）接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8h；当OD值长到1.0~2.0左右时，将摇瓶种子接入装有0.6m3发酵培养基的2m3发酵罐中进行二级种子培养。培养温度30~36℃，罐压0.01~0.05MPa，空气流量0.1~0.5m3/min和搅拌速度100~300r/min使溶氧维持在10~50%，pH值控制在7.0~7.2之间，培养时间为5~8h。将二级种子以10%接种量接入装有4m3发酵培养基的10m3发酵罐中进行发酵。发酵温度30~36℃，罐压0.01~0.15MPa，空气流量5-50L/min和搅拌速度200-800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在7.0~7.2之间，菌体OD为10~15左右时，一次性添加4L 0.1 mol/L的IPTG诱导，继续培养到菌种OD值生长到50~80左右时，再一次性添加4L 0.1 mol/L的IPTG诱导和40L 5g/L的葡萄糖酸钙和4L 0.5g/L的碘化钾，继续培养10~20h，发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为198.76g/L。
采用上述方案设置对照，所述对照与上述方案不同之处在于：在发酵培养至菌体OD为10~15左右时，一次性添加8 L同浓度的IPTG诱导，然后继续培养至发酵结束。发酵结束后检测乙酰氨基葡萄糖含量为150.74g/L。
与对照相比，实施例3中乙酰氨基葡萄糖的产量提高了31.86%。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、大肠杆菌原始菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱30~36℃培养12h，得到活化菌种；
步骤二、种子培养：将步骤一所得活化菌种接种到装有种子培养基的种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8 h，得种子液；
步骤三、将步骤二所得种子液接种到装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵培养基的体积为x L；接种量：5-15%，培养条件：初始发酵温度30-36℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.0~7.2之间；当菌体OD为10~15时，添加x mL浓度为0.1 mol/L 的IPTG诱导，继续培养到菌种OD值生长到50~80时，再一次性添加x mL浓度为0.1 mol/L的IPTG、10x mL浓度为5g/L的葡萄糖酸钙溶液和x mL浓度为0.5g/L的碘化钾溶液，继续培养10~20h结束。
2.根据权利要求1所述的一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，其特征在于：步骤二所述种子培养基中所含的组分及其含量分别为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410~20g/L，MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L，KH2PO4 10~20g/L，柠檬酸0.5~3.0g/L，(NH4)2SO4 5~10.0g/L和微量元素5~10.0mL/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，其特征在于：步骤三所述发酵培养基中所含的组分及其含量分别为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO43.0~10.0g/L,MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L， 柠檬酸1.0~7.0.0g/L，(NH4)2SO4 5~10.0g/L和微量元素5~10.0mL/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高乙酰氨基葡萄糖发酵单位的方法，其特征在于：步骤三所述接种量为7%。
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