CN110438184A - 一种提高发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法 - Google Patents

一种提高发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高发酵液中N‑乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，首先挑取斜面上保存的菌种在LB液体培养基中进行培养，得到一级种子液；再将一级种子液接种至二级种子瓶中进行培养，而后将二级种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中进行培养，添加IPTG诱导，全程流加葡萄糖；而后将发酵液体积的三分之一至二分之一放出，并补充无菌的基础培养基至发酵初始体积，继续发酵培养，进行半连续发酵，补加三次后结束发酵。本发明采用了半连续发酵方法，在发酵快结束时放出一部分发酵液并补加新的基础培养基，增加了放罐批次，提高了产量和转化率，降低了生产成本；增大了葡萄糖的利用率。

Description

一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法
技术领域
本发明涉及N-乙酰氨基葡萄糖发酵工程领域，具体的是一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能。在医学临床上，作为治疗骨关节疾病、治疗风湿性关节炎的药物广受欢迎，而且还可以作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂中。在氨基葡萄糖盐酸盐的制备中是重要原料。
现有的N-乙酰氨基葡萄糖制备方法主要包括微生物发酵法、甲醇钠法以及甲壳素直接酸解或酶解法等方法，大规模生产中比较有优势的是微生物发酵法，通过代谢工程手段构建重组大肠杆菌来生产N-乙酰氨基葡萄糖是大规模生产的有效途径。但在发酵中存在发酵周期长，转化率低等缺点。目前尚未有以半连续发酵提高N-乙酰氨基葡萄糖产量和转化率的具体方法见报道。
发明内容
本发明目的是为解决上述问题，采用半连续发酵来缩短发酵周期，提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖的含量和转化率，在正常发酵周期结束时，将三分之一至二分之一发酵液放出，并补充一定量的基础培养基，继续发酵，形成半连续发酵，循环三次后放罐结束发酵。
本发明提供的技术方案如下所述：
步骤一，挑取斜面上保存的菌种在LB液体培养基中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速200-240rpm/min，时间6-10h，当OD值为1.5-3时，得到一级种子液；
步骤二，将步骤一得到的一级种子液接种至二级种子瓶中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速200-240rpm/min，时间10-16h，当OD至为1.5-3时，得到二级种子液；
步骤三，将步骤二得到的二级种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速300-700rpm/min，pH为6.8-7.2，DO(溶氧)值为20-60％，通风比为1:0.5-1:1.5，罐压为0.02-0.04MPa；当OD为20-40时，添加IPTG诱导，全程流加葡萄糖，使残糖维持在0-1g/L；培养45-55h得到含量为100-120g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液；
步骤四，将步骤三得到的发酵液体积的三分之一至二分之一放出，并补充无菌的基础培养基至发酵初始体积，继续发酵培养8-12h，当含量升高至100-120g/L时放出发酵液体积的三分之一至二分之一，进行半连续发酵，补加三次后结束发酵。
作为优选，步骤一中LB培养基为蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.0；
作为优选，步骤一中OD值检测的波长为600nm。
作为优选，步骤二中一级种子至二级种子接种量为2-5％。
作为优选，步骤二中二级种子培养基为葡萄糖10-20g/L，磷酸二氢钾15-25g/L，磷酸氢二钾5-8g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L，pH为6.7-7.0。
作为优选，步骤三中发酵培养基为葡萄糖3-5g/L，磷酸氢二钾15-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L，pH为6.7-7.0。
作为优选，步骤二和步骤三中微量元素储备液为硫酸亚铁2-3g/L，硫酸锰0.2-0.5g/L，硫酸锌0.2-0.5g/L，硫酸铜0.2-0.5g/L和氯化钴0.2-0.5g/L。
作为优选，步骤三中IPTG的添加量为8-30mg/L。
作为优选，步骤三中流加葡萄糖的浓度为65-75％。
作为优选，步骤三中接种量为7-15％。
作为优选，步骤四中补充的基础培养基为磷酸氢二钾15-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L。
作为优选，所述菌种可以适用于任何产N-乙酰氨基葡萄糖的菌种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等菌株。
更优选的，所述菌种为大肠杆菌基因工程菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用了半连续发酵，在发酵快结束时放出一部分发酵液并补加新的基础培养基，增加了放罐批次，提高了产量，提高了转化率，降低了生产成本；
(2)本发明提供的发酵方法在需要流加补充底物的发酵行业第一次提出半连续发酵，同时控制底物含量要求苛刻；所述发酵方法补充的量少于放出的量，以流加补充葡萄糖的形式补充，增大了葡萄糖的利用率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
作为典型的实施例，本实施例中使用的大肠杆菌基因工程菌，可见公开专利“高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用”(公开号：CN104059872B)，具体制备方法为：所述工程菌通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因构建而成。
本发明提供的提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法并不限于所述大肠杆菌基因工程菌，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等任何产N-乙酰氨基葡萄糖的菌种均可应用本方法提高N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率。
实施例1：
挑取斜面上保存的大肠杆菌基因工程菌(来源于CN104059872B)在LB液体培养基中进行培养，温度35℃、转速200rpm/min，时间8h，当OD至为1.8时，得到一级种子液。
接种一级种子液至二级种子瓶中进行培养，接种量为3％，温度35℃、转速200rpm/min，时间12h，当OD至为1.5时，得到二级种子液。二级种子培养基为葡萄糖15g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸1.5g/L，微量元素储备液8ml/L，pH为6.8；微量元素储备液成分为硫酸亚铁2g/L，硫酸锰0.3g/L，硫酸锌0.3g/L，硫酸铜0.3g/L和氯化钴0.3g/L。
接种二级种子液至装有15L无菌发酵培养基的30L发酵罐中进行培养，接种量为10％，温度35℃、转速300-700rpm/min，PH为6.9，DO至为20-60％，通风比为1:0.5-1:1.5，罐压为0.03MPa，当溶氧低于20％时可通过提高转速、增加通风来提高溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用，当溶氧高于60％时，可通过降低转速、降低通风量来降低溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用。当OD为20时，添加IPTG诱导，IPTG添加量为15mg/L，全程流加65％的葡萄糖，使残糖维持在1g/L以下。培养50h得到21L含量为120.6g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。发酵培养基为葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸1.5g/L，微量元素储备液8ml/L，pH为6.8。
放出11L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为119.4g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。补充的基础培养基成分为：磷酸氢二钾15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸1.5g/L，微量元素储备液8ml/L。
放出6L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为121.3g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。放出6L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养11h，得到17L含量为138.7g/L的发酵液，放罐，结束发酵。
本次实验总周期为93h，共计得到N-乙酰氨基葡萄糖折纯5.13kg，共计用葡萄糖8.96kg葡萄糖，转化率为57.25％。
实施例中N-乙酰氨基葡萄糖的检测方法参照美国USP38的方法进行检测，采用高效液相色谱仪，检测器用紫外检测器，检测器波长195nm，10μl定量环，氨基柱(4.6mm*15cm，3μm)，柱温35℃，流速1.5ml/min；流动相A：乙腈，流动相B为称取3.5g磷酸氢二钾，加入0.25ml氨水，用水定容至1L，混匀，用磷酸调节PH至7.5，流动相A：流动相B＝75:25。
实施例2：
挑取斜面上保存的大肠杆菌基因工程菌(来源于CN104059872B)在LB液体培养基中进行培养，温度38℃、转速220rpm/min，时间6h，当OD至为2.6时，得到一级种子液。
接种一级种子液至二级种子瓶中进行培养，接种量为2.5％，温度38℃、转速220rpm/min，时间10h，当OD至为2.4时，得到二级种子液。二级种子培养基为葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾25g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸2.5g/L，微量元素储备液8ml/L，pH为7.0；微量元素储备液的成分为硫酸亚铁3g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸锌0.5g/L，硫酸铜0.5g/L和氯化钴0.5g/L。
接种二级种子液至装有15L无菌发酵培养基的30L发酵罐中进行培养，接种量为8％，温度38℃、转速300-700rpm/min，pH为7.0，DO至为20-60％，通风比为1:0.5-1:1.5，罐压为0.03MPa，当溶氧低于20％时可通过提高转速、增加通风来提高溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用，当溶氧高于60％时，可通过降低转速、降低通风量来降低溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用。当OD为30时，添加IPTG诱导，IPTG添加量为20mg/L，全程流加68％的葡萄糖，使残糖维持在1g/L以下。培养49h得到21L含量为123.6g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。发酵培养基为葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾20g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸2.5g/L，微量元素储备液8ml/L，pH为7.0。
放出11L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为120.9g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。补充的基础培养基成分为：磷酸氢二钾20g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸2.5g/L，微量元素储备液8ml/L。
放出6L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为123.2g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。放出6L发酵液，并补充5.5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养13h，得到17L含量为131.5g/L的发酵液，放罐，结束发酵。
本次实验总周期为90h，共计得到N-乙酰氨基葡萄糖折纯5.06kg，共计用葡萄糖9.02kg葡萄糖，转化率为56.10％。
实施例3：
挑取斜面上保存的大肠杆菌基因工程菌(来源于CN104059872B)在LB液体培养基中进行培养，温度30℃、转速240rpm/min，时间9h，当OD至为1.5时，得到一级种子液。
接种一级种子液至二级种子瓶中进行培养，接种量为4％，温度30℃、转速240rpm/min，时间14h，当OD至为1.5时，得到二级种子液。二级种子培养基为葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾20g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵8g/L，柠檬酸1g/L，微量元素储备液5ml/L，pH为6.7。微量元素储备液成分为硫酸亚铁2.5g/L，硫酸锰0.4g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸铜0.4g/L和氯化钴0.4g/L。
接种二级种子液至装有15L无菌发酵培养基的30L发酵罐中进行培养，接种量为15％，温度30℃、转速300-700rpm/min，pH为7.0，DO至为20-60％，通风比为1:0.5-1:1.5，罐压为0.04MPa，当溶氧低于20％时可通过提高转速、增加通风来提高溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用，当溶氧高于60％时，可通过降低转速、降低通风量来降低溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用。当OD为20时，添加IPTG诱导，IPTG添加量为10mg/L，全程流加70％的葡萄糖，使残糖维持在1g/L以下。培养51h得到21L含量为125.1g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。发酵培养基为葡萄糖3g/L，磷酸氢二钾17g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵8g/L，柠檬酸1g/L，微量元素储备液5ml/L，pH为6.7。
放出11L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为121.1g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。补充的基础培养基成分为：磷酸氢二钾17g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵8g/L，柠檬酸1g/L，微量元素储备液5ml/L。
放出6L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养6h，得到16L含量为119.5g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液。放出6L发酵液，并补充5L无菌的基础培养基至15L，继续发酵培养11h，得到17.5L含量为136.6g/L的发酵液，放罐，结束发酵。
本次实验总周期为97h，共计得到N-乙酰氨基葡萄糖折纯5.21kg，共计用葡萄糖9.13kg葡萄糖，转化率为57.06％。
对照例：
挑取斜面上保存的大肠杆菌基因工程菌(来源于CN104059872B)在LB液体培养基中进行培养，温度35℃、转速200rpm/min，时间8h，当OD至为1.8时，得到一级种子液。
接种一级种子液至二级种子瓶中进行培养，接种量为3％，温度35℃、转速200rpm/min，时间12h，当OD至为1.5时，得到二级种子液。二级种子培养基为葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾20g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵8g/L，柠檬酸1g/L，微量元素储备液5ml/L，pH为6.7。微量元素储备液成分为硫酸亚铁2.5g/L，硫酸锰0.4g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸铜0.4g/L和氯化钴0.4g/L。
接种二级种子液至装有15L无菌发酵培养基的30L发酵罐中进行培养，接种量为10％，温度35℃、转速300-700rpm/min，PH为6.9，DO至为20-60％，通风比为1:0.5-1:1.5，罐压为0.03MPa，当溶氧低于20％时可通过提高转速、增加通风来提高溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用，当溶氧高于60％时，可通过降低转速、降低通风量来降低溶氧至要求范围内，调节时二种方法交替使用。当OD为20时，添加IPTG诱导，全程流加65％的葡萄糖，使残糖维持在1g/L以下。培养55h得到21L含量为135.1g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液，放罐，结束发酵。发酵培养基为葡萄糖3g/L，磷酸氢二钾17g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵8g/L，柠檬酸1g/L，微量元素储备液5ml/L，pH为6.7。
本次实验总周期为75h，共计得到N-乙酰氨基葡萄糖折纯2.84kg，共计用葡萄糖6.1kg葡萄糖，转化率为46.56％。
可见与对照例相比，本发明提供的发酵工艺在产生相同重量的N-乙酰氨基葡萄糖产品时，使用的时间更短，发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量更高。采用本发明的发酵工艺提高了发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，挑取斜面上保存的菌种在LB液体培养基中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速200-240rpm/min，时间6-10h，当OD值为1.5-3时，得到一级种子液；
步骤二，将步骤一得到的一级种子液接种至二级种子瓶中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速200-240rpm/min，时间10-16h，当OD至为1.5-3时，得到二级种子液；
步骤三，将步骤二得到的二级种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：温度30-38℃、转速300-700rpm/min，pH为6.8-7.2，DO值为20-60％，通风比为1:(0.5-1.5)，罐压为0.02-0.04MPa；当OD为20-40时，添加IPTG诱导，全程流加葡萄糖，使残糖维持在0-1g/L；培养45-55h得到含量为100-120g/L的N-乙酰氨基葡萄糖发酵液；
步骤四，将步骤三得到的发酵液体积的三分之一至二分之一放出，并补充无菌的基础培养基至发酵初始体积，继续发酵培养8-12h，当N-乙酰氨基葡萄糖含量升高至100-120g/L时放出发酵液体积的三分之一至二分之一，进行半连续发酵，总共补加三次后结束发酵。
2.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤一中所述LB培养基为蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.0；作为优选，步骤一中OD值检测的波长为600nm。
3.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤二中接种量为2-5％；步骤三中接种量为7-15％。
4.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤二中二级种子培养基为葡萄糖10-20g/L，磷酸二氢钾15-25g/L，磷酸氢二钾5-8g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L，pH为6.7-7.0；步骤三中发酵培养基为葡萄糖3-5g/L，磷酸氢二钾15-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L，pH为6.7-7.0。
5.根据权利要求4所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中微量元素储备液为硫酸亚铁2-3g/L，硫酸锰0.2-0.5g/L，硫酸锌0.2-0.5g/L，硫酸铜0.2-0.5g/L和氯化钴0.2-0.5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤三中IPTG的添加量为8-30mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤三中流加葡萄糖的浓度为65-75％。
8.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，步骤四中补充的基础培养基为磷酸氢二钾15-20g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，硫酸铵5-10g/L，柠檬酸0.5-2.5g/L，微量元素储备液5-8ml/L。
9.根据权利要求1所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，所述菌种包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌这些产N-乙酰氨基葡萄糖的菌种。
10.根据权利要求9所述的一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法，其特征在于，所述菌种为大肠杆菌基因工程菌。
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