JP2011516029A - 高光合成生物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年11月10日に出願された米国特許仮出願60/987,046号;2008年2月28日に出願された米国特許仮出願61/032,169号;および2008年8月22日に出願された米国特許仮出願61/090,933号からの優先権を主張する。それぞれの開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は合成生物学の分野に関し、さらに具体的には、二酸化炭素および光をバイオマスおよび関心対象の炭素ベース産物に効率的に変換するように設計された、産業化された光独立栄養生物に関する。
光合成とは、生物学的実体がエネルギーを得るために太陽光およびCO2を利用して糖を産生するプロセスである。既存の光独立栄養生物(すなわち、植物、藻類、および光合成細菌)は工業バイオプロセスにあまり適していない。特に、ほとんどの生物の倍加時間(10〜72時間)は、大腸菌(Escherichia coli)などの産業化された従属栄養生物(20分)と比較して長い。さらに、光独立栄養生物は、多くの場合、pH、温度、および耐塩性を含む一般的な環境ストレスにおいて中程度の変化を受けやすい。このような感受性があるために、光独立栄養体を産業に使用するのは効率が悪い。さらに、ますます毒性が強くなってきている環境要因(例えば、重金属、窒素、および硫黄をベースとする工業副産物を含む毒性汚染物質)のために、光独立栄養体の特定の工業用途への適用はさらに限定されることがある。
本発明は、例えば、光捕獲および炭素固定の効率を遺伝的に改善することによって、ならびにフォトバイオリアクター内で増やすための増殖特性を最適化することによって、光合成生物を安定して利用する経路を操作するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、結果として生じた、二酸化炭素および光を関心対象の炭素ベース産物を効率的に変換する操作された「高光合成」細胞および生物を提供する。
添付の配列表に列挙したアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822において定義されたアミノ酸残基の標準的な文字略語を用いて示した。添付のアミノ酸配列表。
用語および方法の以下の説明は、本発明の開示をより詳しく説明するために、かつ本開示の実施において当業者を案内するために提供される。本明細書で使用する「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味し、単数形「1つの(a)」もしくは「1つの(an)」または「その(the)」は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り複数の指示物を含む。例えば、「細胞を含む(comprising a cell)」についての言及は、1つまたは複数のこのような細胞を含み、「チオエステラーゼを含む(comprising a thioesterase)」についての言及は、1つのまたは複数のチオエステラーゼペプチドおよび当業者に公知のその均等物についての言及を含む。「または(or)」という用語は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り、述べられた複数の代替要素の中の1つの要素、または2つもしくはそれ以上の要素の組み合わせを指す。
生物
本発明は、光独立栄養生物を高光合成生物に変換することを可能にする。光独立栄養生物には、真核生物の植物および藻類、ならびに原核生物のラン藻類、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、および紅色非硫黄細菌が含まれる。
gerheimia)、ラギニオン属(Lagynion)、シラタマモ属(Lamprothamnium)、レマネア属(Lemanea)、レポシンクリス属(Lepocinclis)、レプトシラ属(Leptosira)、ラボコッカス属(Lobococcus)、ラボシスティス属(Lobocystis)、ロボモナス属(Lobomonas)、ルチコラ属(Luticola)、リングビヤ属(Lyngbya)、マレオクロリス属(Malleochloris)、マロモナス属(Mallomonas)、マントニエラ属(Mantoniella)、マルソニエラ属(Marssoniella)、マルチアナ属(Martyana)、マスチゴコレウス属(Mastigocoleus)、ガストグロイア属(Gastogloia)、メロシラ属(Melosira)、メリスモペディア属(Merismopedia)、メソスティグマ属(Mesostigma)、メソタエニウム属(Mesotaenium)、ミクラクチニウム属(Micractinium)、ミクラステリアス属(Micrasterias)、ミクロカエテ属(Microchaete)、ミクロコレウス属(Microcoleus)、ミクロシスティス属(Microcystis)、ミクログレナ属(Microglena)、ミクロモナス属(Micromonas)、ミクロスポラ属(Microspora)、ミクロタムニオン属(Microthamnion)、ミスココッカス属(Mischococcus)、モノクリシス属(Monochrysis)、モノダス属(Monodus)、モノマスティクス属(Monomastix)、モノラフィジウム属(Monoraphidium)、 ヒトエグサ属(Monostroma)、ヒザオリ属(Mougeotia)、モウゲオチオプシス属(Mougeotiopsis)、ミオクロリス属(Myochloris)、マイロメシア属(Myromecia)、ミクソサルシナ属(Myxosarcina)、ナエゲリエラ属(Naegeliella)、ナンノクロリス属(Nannochloris)、ナウトコッカス属(Nautococcus)、フナガタケイソウ属(Navicula)、ネグレクテラ属(Neglectella)、ネイジウム属(Neidium)、ネフロクラミス属(Nephroclamys)、ネフロシチウム属(Nephrocytium)、ネフロジエラ属(Nephrodiella)、ネフロセルミス属(Nephroselmis)、ネトリウム属(Netrium)、フラスコモ属(Nitella)、ホシツリモ属(Nitellopsis)、ササノハケイソウ属(Nitzschia)、ノドゥラリア属(Nodularia)、ノストック属(Nostoc)、オクロモナス属(Ochromonas)、サヤミドロ属(Oedogonium)、オリゴカエトホラ属(Oligochaetophora)、オニコネマ属(Onychonema)、オオカルジウム属(Oocardium)、オオシスティス属(Oocystis)、オペホラ属(Opephora)、オフィオシチウム属(Ophiocytium)、オルトセイラ属(Orthoseira)、オシラトリア属(Oscillatoria)、オキシネイス属(Oxyneis)、パチクラデラ属(Pachycladella)、パルメラ属(Palmella)、パルモジクチオン属(Palmodictyon)、パンドリナ属(Pnadorina)、パンヌス属(Pannus)、パラリア属(Paralia)、パシェリナ属(Pascherina)、パウルシュルジア属(Paulschulzia)、クンショウモ属(Pediastrum)、ペディネラ属(Pedinella)、ペディノモナス属(Pedinomonas)、ペディノペラ属(Pedinopera)、ペラゴジクチオン属(Pelagodictyon)、ペニウム属(Penium)、ペラネマ属(Peranema)、ペリジニオプシス属(Peridiniopsis)、ペリジニウム属(Peridinium)、ペロニア属(Peronia)、ペトロネイス属(Petroneis)、ファコタス属(Phacotus)、ウチワヒゲムシ属(Phacus)、ファエアスター属(Phaeaster)、フェオデルマチウム属(Phaeodermatium)、フェオフィタ属(Phaeophyta)、フェオスファエラ属(Phaeosphaera)、フェオタムニオン属(Phaeothamnion)、フォルミジウム属(Phormidium)、フィコペルティス属(Phycopeltis)、フィラリオクロリス属(Phyllariochloris)、フィロカルジウム属(Phyllocardium)、フィロミタス属(Phyllomitas)、ハネケイソウ属(Pinnularia)、ピトホラ属(Pitophora)、プラコネイス属(Placoneis)、プランクトネマ属(Planctonema)、プランクトスファエリア属(Planktosphaeria)、プラノチジウム属(Planothidium)、プレクトネマ属(Plectonema)、ヒゲマワリ属(Pleodorina)、プレウラストラム属(Pleurastrum)、プレウロカプサ属(Pleurocapsa)、プレウロクラジア属(Pleurocladia)、プレウロジスカス属(Pleurodiscus)、プレウロシグマ属(Pleurosigma)、プレウロシラ属(Pleurosira)、プレウロタエニウム属(Pleurotaenium)、ポシロモナス属(Pocillomonas)、ポドヘドラ属(Podohedra)、ポリブレファリデス属(Polyblepharides)、ポリカエトホラ属(Polychaetophora)、ポリエドリエラ属(Polyedriella)、ポリエドリオプシス属(Polyedriopsis)、ポリゴニオクロリス属(Polygoniochloris)、ポリエピドモナス属(Polyepidomonas)、ポリタエニア属(Polytaenia)、ポリトマ属(Polytoma)、ポリトメラ属(Polytomella)、ポルフィリディウム属(Porphyridium)、ポステリオクロモナス属(Posteriochromonas)、プラシノクロリス属(Prasinochloris)、プラシノクラダス属(Prasinocladus)、プラシノフィタ属(Prasinophyta)、カワノリ属(Prasiola)、プロクロルフィタ属(Prochlorphyta)、プロクロロトリックス属(Prochlorothrix)、プロトデルマ属(Protoderma)、プロトシフォン属(Protosiphon)、プロバソリエラ属(Provasoliella)、プリムネシウム属(Prymnesium)、プサモジクチオン属(Psammodictyon)、プサモチジウム属(Psammothidium)、シュードアナベナ属(Pseudanabaena)、シュードエノクロニウム属(Pseudenoclonium)、シュードカルテリア属(Psuedocarteria)、シュードカテ属(Pseudochate)、シュードカラシウム属(Pseudocharacium)、シュードコッコミキサ属(Pseudococcomyxa)、シュードジクチオスファエリウム属(Pseudodictyosphaerium)、シュードケフィリオン属(Pseudokephyrion)、シュードンコビルサ属(Pseudoncobyrsa)、シュードクアドリグラ属(Pseudoquadrigula)、シュードスファエロシスティス属(Pseudosphaerocystis)、シュードスタウラストラム属(Pseudostaurastrum)、シュードスタウロシラ属(Pseudostaurosira)、シュードテトラストラム属(Pseudotetrastrum)、プテロモナス属(Pteromonas)、パンクタストルアタ属(Punctastruata)、ピラミクラミス属(Pyramichlamys)、 ピラミモナス属(Pyramimonas)、ピロフィタ属(Pyrrophyta)、クアドリクロリス属(Quadrichloris)、クアドリコッカス属(Quadricoccus)、クアドリグラ属(Quadrigula)、ラジオコッカス属(Radiococcus)、ラジオフィラム属(Radiofilum)、ラフィジオプシス属(Raphidiopsis)、ラフィドセリス属(Raphidocelis)、ラフィドネマ属(Raphidonema)、ラフィドフィタ属(Raphidophyta)、ペイメリア属(Peimeria)、ラブドデルマ属(Rhabdoderma)、ラブドモナス属(Rhabdomonas)、ネダシグサ属(Rhizoclonium)、ロドモナス属(Rhodomonas)、ロドフィタ属(Rhodophyta)、ロイコスフェニア属(Rhoicosphenia)、ロパロジア属(Rhopalodia)、リブラリア属(Rivularia)、ロゼンビンギエラ属(Rosenvingiella)、ロシチジウム属(Rossithidium)、ロヤ属(Roya)、セネデスムス属(Scenedesmus)、シェルフェリア属(Scherffelia)、シゾクラミデラ属(Schizochlamydella)、シゾクラミス属(Schizochlamys)、シゾメリス属(Schizomeris)、シゾトリックス属(Schizothrix)、スクロエデリア属(Schroederia)、スコリオネイス属(Scolioneis)、スコチエラ属(Scotiella)、スコチエロプシス属(Scotiellopsis)、スコウルフィエルジア属(Scourfieldia)、スキトネマ属(Scytonema)、セレナストラム属(Selenastrum)、セレノクロリス属(Selenochloris)、セラホラ属(Sellaphora)、セミオルビス属(Semiorbis)、シデロセリス属(Siderocelis)、ジデロシストプシス属(Diderocystopsis)、ジモンセニア属(Dimonsenia)、シホノネマ属(Siphononema)、シロクラジウム属(Sirocladium)、シロゴニウム属(Sirogonium)、スケレトネマ属(Skeletonema)、ソラストラム属(Sorastrum)、スペルマトゾプシス属(Spermatozopsis)、スファエレロシスティス属(Sphaerellocystis)、スファエレロプシス属(Sphaerellopsis)、スファエロジニウム属(Sphaerodinium)、ヨコワミドロ属(Sphaeroplea)、スファエロゾスマ属(Sphaerozosma)、スピニフェロモナス属(Spiniferomonas)、スパイロジャイラ属(Spirogyra)、スピロタエニア属(Spirotaenia)、スピルリナ属(Spirulina)、スポンジロモラム属(Spondylomorum)、スポンジロシウム属(Spondylosium)、スポロテトラス属(Sporotetras)、スプメラ属(Spumella)、スタウラストラム属(Staurastrum)、スタエロデスマス属(Stauerodesmus)、スタウロネイス属(Stauroneis)、スタウロシラ属(Staurosira)、スタウロシレラ属(Staurosirella)、ステノプテロビア属(Stenopterobia)、ステファノコスティス属(Stephanocostis)、ステファノディスカス属(Stephanodiscus)、ステファノポロス属(Stephanoporos)、ステファノスファエラ属(Stephanosphaera)、スチココッカス属(Stichococcus)、スチコグロエア属(Stichogloea)、スチゲオクロニム属(Stigeoclonium)、スチゴネマ属(Stigonema)、スチピトコッカス属(Stipitococcus)、ストケシエラ属(Stokesiella)、ストロムボモナス属(Strombomonas)、スチロクリサリス属(Stylochrysalis)、スチロジニウム属(Stylodinium)、スチロイキシス属(Styloyxis)、スチロスファエリジウム属(Stylosphaeridium)、スリレラ属(Surirella)、シキジオン属(Sykidion)、シムプロカ属(Symploca)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネドラ属(Synedra)、シノクロモナス属(Synochromonas)、シヌラ属(Synura)、タベラリア属(Tabellaria)、タブラリア属(Tabularia)、テイリンギア属(Teilingia)、テムノガメタム属(Temnogametum)、テトメモラス属(Tetmemorus)、テトラクロレラ属(Tetrachlorella)、テトラシクラス属(Tetracyclus)、テトラデスマス属(Tetradesmus)、テトラエドリエラ属(Tetraedriella)、テトラエドロン属(Tetraedron)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、ヨツメモ属(Tetraspora)、テトラストラム属(Tetrastrum)、タラシオシラ属(Thalassiosira)、タムニオカエテ属(Thamniochaete)、トラコクロリス属(Thorakochloris)、トレア属(Thorea)、トリペラ属(Tolypella)、トリポスリクス属(Tolypothrix)、トラケロモナス属(Trachelomonas)、トラキジスカス属(Trachydiscus)、トレボウキシア属(Trebouxia)、トレンテホリア属(Trentepholia)、トレウバリア属(Treubaria)、トリボネマ属(Tribonema)、アイアカシオ属(Trichodesmium)、トリコジスカス属(Trichodiscus)、トロキスシア属(Trochiscia)、トリブリオネラ属(Tryblionella)、ヒビミドロ属(Ulothrix)、ウログレナ属(Uroglena)、ウロネマ属(Uronema)、ウロソレニア属(Urosolenia)、シリオミドロ属(Urospora)、ウバ属(Uva)、バキュオラリア属(Vacuolaria)、フシナシミドロ属(Vaucheria)、ボルボックス属(Volvox)、ボルブリナ属(Volvulina)、ウェステラ属(Westella)、ウォロスジンスキア属(Woloszynskia)、キサンチジウム属(Xanthidium)、キサントフィタ属(Xanthophyta)、キセノコッカス属(Xenococcus)、ジグネマ属(Zygnema)、ジグネモプシス属(Zygnemopsis)、およびジゴニウム属(Zygonium)が含まれるが、これに限定されない。
液体培地中で、またはアガロース含有プレート上で光合成生物を培養する方法は、当業者に周知である(例えば、ATCCおよびInstitute Pasteurに関連したウェブサイトを参照されたい)。例えば、シネココッカス属の種PCC7002細胞(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteriaから入手可能)は、16μg/Lビオチン、20mM MgSO4、8mM KCl、および300mM NaClを添加した、BG-11培地(17.65mM NaNO3、0.18mM K2HPO4、0.3mM MgSO4、0.25mM CaCl2、0.03mM クエン酸、0.03mM クエン酸鉄アンモニウム、0.003mM EDTA、0.19mM Na2CO3、2.86mg/L H3BO3、1.81mg/L MnCl2、0.222mg/L ZnSO4、0.390mg/L Na2MoO4、0.079mg/L CuSO4、および0.049mg/L Co(NO3) 2、pH7.4)において培養される(例えば、Institute Pasteurに関連したウェブサイト、およびPrice GD, Woodger FJ, Badger MR, Howitt SM, Tucker L. 「Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria. Proc Natl. Acad. Sci USA (2004). 101(52):18228-33を参照されたい)。典型的には、培養物は28℃に維持され、120μmol photon/m2/sの光強度下で、5%CO2を用いて連続して通気される。
遺伝子工学に関連するプラスミドは、典型的には、少なくとも2つの機能エレメント1)宿主生物内でのDNA配列の増幅を可能にする複製起点、および2)選択マーカー(例えば、アンピシリン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどに対する耐性を付与する抗生物質耐性マーカー)を含む。プラスミドは、主な目的が望ましい異種DNAインサートの増幅である場合、「クローニングベクター」と呼ばれることが多い。プラスミドはまた、異種DNAインサートの転写および翻訳を誘導するシス作用調節配列(例えば、プロモーター、転写ターミネーター、リボソーム結合部位)を含んでもよい。このようなプラスミドは「発現ベクター」と呼ばれることが多い。プラスミドが、複数種での増幅を可能にする機能エレメントを含有する場合、このようなプラスミドは「シャトルベクター」と呼ばれる。シャトルベクターは当業者に周知である。例えば、pSE4は、大腸菌およびシネココッカス属での増幅を可能にするシャトルベクターである[Maeda S, Kawaguchi Y, Ohy T, and Omata T. J. Bacteriol. (1998). 180:4080-4088]。関心対象の光独立栄養生物への形質転換による導入の前に、大腸菌において遺伝子および調節配列の容易な操作を可能にするシャトルベクターは、本発明において特に有用である。
原核生物の標準的な形質転換法は当業者に周知である[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y.;およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業, (1997 補遺まで、およびこれを含む)]。
に記載されている。
注目すべきことに、ある特定の状況では、SD配列の非存在下で高レベルの翻訳が観察されることがある[Mutsuda M and Sugiura M. 「Translation initiation of cyanobacterial rbcS mRNAs requires the 38-kDa ribosomal protein S1 but not the Shine-Dalgarno sequence.」 J Biol Chem (2006). 281(50):38314-38321; Xu J, Mironova R, Ivanov IG, Abouhaidar MG. J Basic Microbiol (1999). 「A polylinker-derived sequence, PL, highly increased translation efficiency in Escherichia coli.」39(1):51-60]。発現レベルを調整するために、関心対象の遺伝子内で、または関心対象の遺伝子外で、mRNA二次構造が操作される。
翻訳レベルを上げるまたは下げるために、コドン使用頻度も操作される。
最初に、前記のエピソームプラスミドを用いて、以下の生合成経路およびモジュールが試験および最適化される。非限定的な最適化には、プロモーターの交換および調整、リボソーム結合部位の操作、遺伝子の順番の変更(例えば、遺伝子ABC対BAC、CBA、CAB、BCA)、分子シャペロンの同時発現、活性を上げるもしくは下げるような遺伝子配列のランダム変異誘発もしくは標的化変異誘発、フォールディング、またはアロステリック調節、別の種に由来する遺伝子配列の発現、コドン操作、細胞内標的化配列、例えば、シグナル配列の付加もしくは除去などが含まれる。
ある特定の場合では、宿主生物に天然にある(すなわち、「内因性」の)染色体DNA配列が変えられる。特定の遺伝子産物の発現を増加および減少させるために、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどを含む非コード領域が操作される。別の態様では、目的のタンパク質の安定性、フォールディング、活性、または局在化に影響を及ぼすように、内因性遺伝子のコード配列が変えられる。または、特定の遺伝子を、完全に欠失または「ノックアウト」することができる。このような操作のための技法および方法は当業者に公知である。
選択圧は、高光合成生物を試験および最適化するための評価可能な手段を提供する。高温度下でも生き残る能力は、改善した耐熱性モジュールが首尾よく働いているという証拠となる。煙道ガス(または煙道ガス組成物に近い人工気体製剤)を通気した培地中で増殖する能力によって、改善した煙道ガス耐性モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。野生型対応物より速く複製する能力によって、改善したCO2固定モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。培地添加物としてビタミンB12を欠く培地中で生き残り、複製する能力によって、ビタミンB12モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。
高光合成生物からの産物の産生および単離は、特定の発酵法を使用することによって強化することができる。産生を最大にしながら、費用を少なくする必須の要素は、このような産物に変換される炭素源のパーセントを高めることである。炭素原子は、正常な細胞生活環の間に、脂質、糖類、タンパク質、および核酸の産生を含む細胞機能に進む。産物に関連しない活性に必要な炭素の量を減らすことによって、産生物の産生の効率を高めることができる。これは、最初に、微生物を望ましい密度まで増殖させることによって実現する。好ましい密度は、対数増殖期のピークに達した密度であろう。このような時点で、細胞増殖を止めるように複製チェックポイント遺伝子を利用することができる。具体的には、クオラムセンシング機構(Camilli, A. and Bassler, B.L Science 311:1113; Venturi, V. FEMS Microbio Rev 30: 274;およびReading, N.C. and Sperandio, V. FEMS Microbiol Lett 254:1において概説される)を使用して、遺伝子、例えば、p53、p21、または他のチェックポイント遺伝子を活性化することができる。大腸菌の細胞複製および細胞増殖を止めるために活性化することができる遺伝子には、umuDC遺伝子が含まれる。この遺伝子が過剰発現されると、対数期から進行が止まり定常増殖になる(Murli, S., Opperman, T., Smith, B.T., and Walker, G.C. 2000 Journal of Bacteriology 182: 1127.)。UmuCは、ほとんどのUV変異誘発および化学変異誘発の機構基礎である非コード損傷にわたって損傷乗り越え合成を行うことができるDNAポリメラーゼである。umuDC遺伝子産物は、損傷乗り越え合成プロセスに必要であり、DNA損傷チェックポイントとしても役立つ。UmuDC遺伝子産物には、UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’2C、UmuD’2およびUmuD2が含まれる。同時に、これらの産物合成遺伝子が活性化され、従って、産物が作られると同時に、使用される重要な複製経路および維持経路の必要が最小限になる。
本発明の改変生物によって産生された産物のレベルおよび同一性を分析するために、ガスクロマトグラフィー-質量分析、および液体クロマトグラフィー-質量分析、HPLC、キャピラリー電気泳動、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析などの任意の標準的な分析方法を使用することができる。
最適化プロセスの一部として、本発明はまた、炭素およびエネルギーを消費し得るが、有用な産物(例えば、炭化水素、ワックスエステル、界面活性剤、および他の炭化水素産物)を産生しない望ましくない副反応がもしあれば、これを排除する工程を提供する。これらの工程は、望ましい産物の収率を改善するのに役立つ可能性がある点で有益であり得る。
を参照されたい。
本発明における高光合成生物は、生物学的糖、炭化水素産物、固形、および薬を含むが、これに限定されない産物カテゴリーを生じるように操作することができる。
pJB5ベースプラスミドの構築
シネココッカス属の種PCC7002への組換えのために、pJB5ベースプラスミドを空の発現ベクターとして設計した。2つの相同性領域である上流相同性領域(UHR)および下流相同性領域(DHR)を、関心対象のクローニングされた遺伝子に隣接するように設計した。これらの500bp相同性領域は、それぞれ、天然プラスミドpAQ1(GenBankアクセッションNC_005025)上のUHRおよびDHRの位置3301-3800および3801-4300に対応する。組み込まれた構築物にスペクチノマイシン耐性およびストレプトマイシン耐性を付与するために、aadAプロモーター、遺伝子配列、およびターミネーターを設計した。発現用に、aph2カナマイシン耐性カセットプロモーターおよびリボソーム結合部位(RBS)を用いて、pJB5を設計した。このプロモーターおよびRBSの下流に、本発明者らは、NdeIおよびEcoRIの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにXhoI部位、BamHI部位、SpeI部位、およびPacI部位を設計および挿入した。EcoRI部位の後に、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)(adhII)ターミネーターからの、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の天然ターミネーターを含めた。便利なXbaI制限部位がUHRおよびDHRに隣接するので、組換えしようとするDNAを、ベクターの残りから切断することができる。pJB5、pJB6、およびpJB7は、DNA2.0(Menlo Park, CA)が構築した。
pJB5ベースプラスミドを補うために、pJB161ベースプラスミドを設計したが、2つの遺伝子を同時にシネココッカス属の種PCC7002に組み込むために異なる組込み部位および耐性マーカーがある。pJB5に由来するUHRおよびDHRを、シネココッカス属の種PCC7002の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接する領域と置換した。新たなldh-UHRおよびldh-DHRをPCR増幅した。これらは、それぞれ、lac-UHRおよびlac-DHRの、天然プラスミドpAQ7(GenBankアクセッションNC_0104774)上の位置185990-77および184333-184913に対応する。PCRに使用したプライマーは、以下の通り:
:lac-UHR用フォワードプライマー-
、lac-UHR用下流プライマー-
;lac-DHR用上流プライマー-
、lac-DHR用下流プライマー-
であった。lac-UHR用上流プライマーによってSbfI制限エンドヌクレアーゼ部位が付加され、lac-UHR用下流プライマーによってNotI制限部位が付加され、lac-DHR用上流プライマーによってAscI制限部位が付加され、lac-DHR用下流プライマーによってFseI制限部位が付加された。高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて、相同性領域を、シネココッカス属の種PCC7002ゲノムDNAから増幅した。増幅されたldh-DHR領域およびpJB5プラスミドを、FseIおよびAscI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。結果とした生じたDNA断片を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400(EpiCentre(登録商標))細胞を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。結果とした生じたプラスミドを、ldh-UHR領域を組み込むために、もう1回クローニングに供した。増幅されたldh-UHR領域および新たに構築されたプラスミドを、SbfIおよびNotI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。結果とした生じたプラスミド、pJB165を、PCRおよび制限消化によって確認した。
以下の手順を用いて、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)およびアルコールデヒドロゲナーゼ(adhII)遺伝子をpJB5プラスミドにクローニングした。ザイモモナス・モビリス(GenBank:DD161475、M15394)からのpdc-adhII遺伝子を、NdeI部位がpdcコード領域の開始に取って代わるように設計した。pdc遺伝子の後に、本発明者らは、2つの制限エンドヌクレアーゼ部位(XhoIおよびBamHI)を設計した。次に、adhII配列全体を制限部位の後に設計し、最後に、挿入されたEcoRI部位の下流に天然adhIIターミネーターも含めた。この構築物はDNA2.0(Menlo Park, CA)が構築し、pJB5およびインサート上でのNdeIおよびEcoRI(New England Biolabs; Ipswitch、MA)による制限消化によって挿入し、その後に、Quick Ligation Kit(New England Biolabs;Ipswitch, MA)を用いて連結した。連結された構築物により、NEB5αF’Iqコンピテント大腸菌(高効率)(New England Biolabs: Ipswitch, MA)を形質転換した。
簡単に述べると、シネココッカス属の種PCC7002を、Frigaard NU et al. (2004)「Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation」 Methods Mol Biol 274:325-340に記載のA+培地を含む、30℃、1%CO2でインキュベートされた振盪フラスコ中で、OD7301.0まで48時間、コロニーから増殖させた。培養物500μLを、各構築物についてQiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit(Valencia, CA)から調製した1〜5μgのDNA 30μLを含む試験管に添加した。細胞を、約1バブル/2秒で1%CO2を通気しながら4時間インキュベートした。細胞200μLを、1.5%Bactoアガーを含むA+培地プレート上にプレートし、低照度で30℃で2日間増殖させた。最終濃度が10μg/mLとなるように、スペクチノマイシンを下層においた。耐性コロニーは7〜10日間生存した。コロニーをPCRによってスクリーニングした。結果とした生じた株をJCC136と名付けた。
pJB263ベースプラスミドをpJB5と同様に構築したが、これは、シネコシスティス属の種PCC6803のglgA遺伝子(アクセッション番号:NP_441947)の組込みおよび置換のために構築した。シネコシスティス属の種PCC6803のglgA遺伝子の750bp上流および下流に、glgA-UHRおよびglgA-DHRを設計した。これらは、それぞれ、染色体上の2266647〜22667396および2264463〜2265212の(-)鎖(アクセッション番号:NC_000911)に対応する。glgA-UHRおよびglgA-DHRは、SbfIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位ならびにPacIおよびAscI制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接し、後で、これらの間で消化しやすくなるように配列スペーサーを付けて設計した。この構築物はDNA2.0(Menlo Park, CA)が構築した。このカセットとpJB5-PdcAdhIIを、NotIおよびAscI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換した。結果とした生じたプラスミドpJB263を、PCRによって、および形質転換コロニーの抗生物質スペクチノマイシン耐性によって確認した。
本明細書において提供される実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。これらの実施例は、当業者が本発明の様々な局面を理解および実施する助けとなるように提供され、従って、限定するものであると解釈すべきでない。本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更および拡張は当業者に明らかであり、従って、このような変更および拡張は本発明の範囲内にある。
光合成生物は、光を効率的に捕獲する精巧な方法を進化させてきた。この方法は、しばしば、光合成生物の自然生息地を制限している。真核生物の光独立栄養生物は、光エネルギーを捕獲し、光合成反応中心に送る集光性複合体(LHC)として知られる、クロロフィルおよびカロテノイド結合タンパク質のスーパーファミリーをコードする[Green BR and Durnford DG. 「The chlorophyll-carotenoid proteins of oxygenic photosynthesis.」 Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1996).47:685-714]。クロロフィル分子は、具体的には、いわゆる「アンテナ」構造で並べられている。反応中心1個あたりのクロロフィル分子の数は、光化学系II(PSII)では反応中心1個あたり350超のクロロフィルaおよびクロロフィルb分子、ならびに光化学系I(PSI)では300のクロロフィルa分子を含めて、大幅に異なる場合がある。アンテナは、全く新しいタンパク質ベースの反応中心および付随する電子輸送系を作る必要なく光吸収スペクトルを高める手段を提供する。大きなアンテナは、自然において生物に生存上の利益をもたらす。しかしながら、高い光強度の条件下では、大きなアンテナは過剰な光子を吸収し、蛍光または熱として無駄に放散しなければならない。一重項状態の励起クロロフィル分子を安全に放散し損なうと、極めて有害な活性酸素種である一重項酸素が形成することがある[Muller P, Li X, Niyogi KK. 「Non-photochemical quenching. A response to excess light energy.」Plant Physiology (2001). 125:1558-66]。
またはLHCタンパク質ファミリー全体[Mussgnug JH, Thomas-Hall S, Rupprecht J, Foo A, Klassen V, McDowall A, Schenk PM, Kruse O, and Hankamer B. 「Engineering photosynthetic light capture: impacts on improved solar energy to biomass conversion.」 (2007). 5(6):802-14]を下方制御することによって、微細藻類の通常は動的なアンテナサイズを遺伝的に永久に縮めることができることが証明された。より小さなアンテナを有する株は、特に、高光束下では、細胞遮光(cell shading)の低下および生産性の向上を示す。
例示的なデルタロドプシン配列は、Ihara K et al. J Mol Biol (1999)「Evolution of the archael rhodopsins: evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation.」285:163-174に記載の、ハロテリゲナ(Haloterrigena)の種のArg-4のAB009620 遺伝子座である。
本明細書で使用するSAR86プロテオロドプシン遺伝子(Beja, et al. (Science (2000) vol. 289: 1902-1906; GenBank: AF279106) は、Jessica WaltersおよびJan Liphardt(University of California, Berkeley)によって以前に構築および提供されたプラスミドから入手した。Walters-Liphardt宿主プラスミドは、βラクタマーゼカセットがSAR86プロテオロドプシン遺伝子を有するpBR322プラスミド誘導体である。Walters-Liphardtプラスミドから、フォワードプライマー
およびリバースプライマー
を含むPCRプライマーを用いて、プロテオロドプシン遺伝子を増幅した。PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix (New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて行った。フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびMfeI制限認識部位が付加される。
独立栄養炭素固定を可能にする4つの公知の経路:3-ヒドロキシプロプリオン酸(hydroxyproprionate)(3-HPA)回路(クロロフレクサス・アウランチアカス(Chloroflexus aurantiacus)およびクレナルカエオタ・シムビオサム(Crenarchaeota symbiosum)によって用いられる)、還元的TCA回路(クロロビウム・テピダムによって用いられる)、還元的アセチルコエンザイムA経路(ウッド-ユングダール経路とも知られる;化学合成独立栄養体(chemolithoautotroph)、例えば、クロストリジウム・サーモアセチカム(Clostridium thermoaceticum)、メタノバクテリウム・サーマウトトロフィカム(Methanobacterium thermautotrophicum)、およびダスルフォバクテリウム・アウトロフィカム(Dusulfobacterium autotrophicum)によって用いられる)、ならびに還元的ペントースリン酸回路(カルビン回路とも知られる、植物、藻類、および全てのラン藻類によって用いられる)がある。定義により、全ての光独立栄養生物は、無機CO2を、糖などの複雑な還元有機炭素分子に固定する能力を有する。
機能的な3-ヒドロキシプロピオン酸回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、クロロフレクサス・アウランチアカスによって用いられる [Herter S, Farfsing J, Gad’On N, Rieder C, Eisenreich W, Bacher A, and Fuchs G. J Bacteriol (2001). 「Autotrophic CO2 fixation by Chloroflexus aurantiacus: study of glyoxylate formation and assimilation via the 3-hydroxypropionate cycle.」 183(14):4305-16]。
機能的な還元的TCA回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然ではクロロビウム・テピダムによって用いられる。
機能的なウッド-ユングダール経路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)(以前は、クロストリジウム・サーモアセチカムとして知られる)、メタノバクテリウム・サーモアウトロフィカム(Methanobacterium thermoautrophicum)、およびデスルフォバクテリウム・オートロフィカム(Desulfobacterium autotrophicum)によって用いられる。
機能的な還元的ペントースリン酸(カルビン)回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、全ての植物、藻類、およびラン藻類によって用いられる。
ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換には、以下の通り2つの酵素活性が必要とされる。
フルクトース1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換には、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(EC3.1.3.11)が必要とされる。フルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、フルクトース-1,6-二リン酸および水からフルクトース-6-リン酸およびPiを生成する。例示的なフルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、大腸菌遺伝子座JW4191、fbp、(EC#4.1.2.13)によってコードされる。
fbpIフォワードプライマー
およびリバースfbpIプライマー
;fbpIIフォワードプライマー
およびリバースプライマー
;fbaAフォワードプライマー
およびリバースプライマー
を用いて、サーモシネココッカス・エロンガテスBP-1株ゲノムDNAから直接増幅された。PCR増幅は、PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen, Carlsbad, CA)および標準的なPCR増幅条件を用いて行った。fbpIおよびfbpIIフォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、fbaAフォワードプライマーによりBsmAI制限認識部位が付加され、全てのリバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。
グルコース-6-リン酸からグルコースへの変換には、グルコース-6-ホスファターゼ(EC3.1.3.68)が必要とされる。グルコース-6-ホスファターゼは、グルコース-6-リン酸および水から、グルコースおよびPiを生成する。例示的なグルコース-6-ホスファターゼは、サッカロマイセス・セレビシエYHR044C遺伝子座、dog1によってコードされる。別の例示的なグルコース-6-ホスファターゼ活性は、サッカロマイセス・セレビシエYHR043C遺伝子座、dog2によってコードされる。
前記のCO2固定経路には、主に、NADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型)およびNADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型)の形で還元力を発生させることが必要な場合がある。
NADHレベルが最適以下のままである場合、細胞内NADH濃度を上げるために、以下の遺伝子の過剰発現を含む複数の方法が用いられる。
Nuo複合体Iをコードするロドバクター属Nuoオペロンは、逆の電子流によってさらなるNADHを生成するように再構成することができる。
大腸菌K12 udhA遺伝子(アクセッション番号:NP_418397)は、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(E.C.#1.6.1.1)をコードする。この遺伝子を、フォワードプライマー
およびリバースプライマー
を用いて、大腸菌K12株ゲノムDNAから直接増幅した。PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix (New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて行った。フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。
NADPHは、還元的(特に、脂肪酸)生合成における電子ドナーとして役立つ。光独立栄養に十分なNADPHレベルを維持するために、3つの類似した方法が単独でまたは組み合わせて用いられる。方法1および方法2は、WO2001/007626、細胞NADPHを増やすことによってL-アミノ酸を産生する方法(Methods for producing L-amino acids by increasing cellular NADPH)に記載されている。方法3は、米国特許出願公開第2005/0196866号、大腸菌における細胞内NADPHの利用可能性の増大(Increasing intracellular NADPH availability in E. coli)に記載されている。
大腸菌K12 zwf遺伝子(アクセッション番号:AAC74922)は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.49)をコードする。この遺伝子を、フォワードプライマー
およびリバースプライマー
を用いて、大腸菌K12株ゲノムDNAから直接増幅した。PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix (New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて行った。フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。
A.ペントースリン酸経路を介したフラックスの増加
NAD依存性酵素の代わりに、またはNAD依存性酵素に加えて、NADP+依存性酵素を発現することができる。
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(EC1.6.1.1)の発現は、NADHおよびNADP+からNADPHおよびNAD+を生成する。例示的な酵素は、sthA(udhAとも知られる)、遺伝子座JW551によってコードされる大腸菌可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。別の例示的な酵素は、pntA、遺伝子座JW1595によってコードされる、NAD(P)トランスヒドロゲナーゼサブユニットα、およびpntB、遺伝子座JW1594によってコードされる、NADPトランスヒドロゲナーゼサブユニットβからなる多サブユニットによってコードされる、膜結合型大腸菌ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。
ある特定の態様では、フォトバイオリアクターが高い動作温度で維持される。高い動作温度に耐え、良く育つように光独立栄養生物を操作すると、冷却費が少なくなり、炭素ベース産物の産生のキネティクスが速くなる。光独立栄養生物の耐熱性を高める4つの重要な手法には、アクセサリータンパク質による光合成装置の安定化、細胞内の他の細胞内タンパク質を安定化するシャペロンの発現、細胞膜の脂質プロファイルの変化、およびベタインなどの浸透圧保護剤の発現が含まれる。
ある特定の態様において、生物生産性を高めるために、CO2レベルの上昇が用いられる。しかしながら、フォトバイオリアクター内のCO2レベルが上昇すると、付随して培地の酸性度が上がり、これは細胞にとって有毒な場合がある。高い酸性度条件に対して耐性となるように細胞を操作すると、生産性が上がり、外部pH制御に関連した費用が少なくなる。本発明において、酸耐性を付与する1つまたは複数の機構が細胞に入るように操作される。
煙道ガスは、典型的には、N2 (80%)、CO2 (10〜15%)、O2 (2〜3%)、ならびに微量のCO(70〜110ppm)、NOx(最も典型的にはNO2)(50〜70ppm)、SO2 (180〜250ppm)からなる。煙道ガスの成分のうち、NOxおよびSO2のみが、光独立栄養生物の成長に悪影響を及ぼすと考えられている[Negoro M, Shioji N, Miyamoto K, Miura Y. 「Growth of microalgae in high CO2 gas and effects of SOx and NOx.」 Appl Biochem Biotechnol (1991). Spring (28-29): 877-86.]。
多くの地理学的場所において、利用可能な水供給は高塩分の影響を受けている。結果として、ある特定の態様では、汽水(8〜500mM NaCl)または海水(約530mM)の中で光独立栄養生物を繁殖させることが有利である。関心対象の光独立栄養細胞がこれらの条件下で良く育つことができない場合に、耐塩性を付与する核酸を過剰発現することが必要である。
アファノテセ・ハロフィチカに由来するNa/H+アンチポーター(アクセッション番号:BAB69459)との相同性によって同定された、シネココッカス属の種PCC7002に由来する推定Na/H+アンチポーターを、以下のプライマー:NaHフォワードプライマー-
、NaHリバースプライマー-
を用いて、PCR増幅した。フォワードプライマーによりNdeI制限エンドヌクレアーゼ認識部位が付加され、リバースプライマーによりMfeI制限部位が付加される。
CO2および光に加えて、光独立栄養生物は、典型的には、無機栄養源およびビタミンを必要とする。必要とされる栄養分は、一般的には、このような生物をベンチスケールで増やしている間に増殖培地に添加される。しかしながら、このような栄養分には、工業スケールのバイオプロセスの状況では法外な費用がかかる。
発現プラスミドpJB5は、シネココッカス属の種PCC 7002の天然pAQ1プラスミド上の配列と相同な2つの500bp DNA領域を含有する。2つの相同性領域の間には、プロモーターおよびリボソーム結合部位、DNA配列挿入部位、ならびにスペクチノマイシン耐性を付与する耐性カセットaadA1がある。大腸菌に由来するmetE遺伝子(NP_418273)およびサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来するmetE遺伝子(NP_681881)がそれぞれpJB6上およびpJB7上にコードされる。これらのプラスミドは全て、NdeI(New England Biolabs)およびEcoRI(New England Biolabs)を用いて消化され、pJB6およびpJB7に由来する約1kb断片、ならびにpJB5に由来する大きな断片を、標準的な技法(Qiagen)を用いてゲル単離および精製した。pJB6およびpJB7に由来する断片を、標準的な技法を用いてpJB5に連結および形質転換して、pJB5-6およびpJB5-7を形成した。
アカリオコリス・マリナ(Acaryochloris marina)は、主なChl構成要素としてクロロフィル(Chl)dを有することが知られている唯一の生物である。Chl dは700nm〜750nmの近赤外光を吸収し、酸素発生光合成を行う。アカリオコリス・マリナはまた、主な構成要素として多くの生物に見出されるChl aも含有する。Chl aは、ホルミル基の代わりにビニル基を有するという点のみChl dと異なる。次いで、本発明者らは、図4に示した機構の1つまたは複数によって、Chl dはChl aから得られる(すなわち、Chl d前駆体は類似するChl a前駆体から得られると考えた)。
Claims (55)
- 光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または該操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された光合成細胞。
- 複数の操作された光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸をさらに含む、請求項1記載の操作された光合成細胞。
- 複数の操作された核酸が複数の異種核酸をコードする、請求項2記載の操作された光合成細胞。
- 操作された光捕獲核酸が、プロテオロドプシン、バクテリオロドプシン、デルタロドプシン、オプシン、キサントロロドプシン、レチナール生合成経路タンパク質、およびATP合成酵素タンパク質を含む群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- 操作された光捕獲核酸が、イソペンテニル二リン酸δイソメラーゼ;15,15’-βカロチンジオキシゲナーゼ;リコペンシクラーゼ;フィトエン合成酵素;フィトエンデヒドロゲナーゼ;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素;およびβカロチンケトラーゼタンパク質からなる群より1つまたは複数のタンパク質を含む1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項4記載の操作された光合成細胞。
- ATP合成酵素タンパク質が、膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットaタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットcタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットbタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、αサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、εサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、βサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、γサブユニットタンパク質;および膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、δサブユニットタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項4記載の操作された光合成細胞。
- 操作された核酸が存在することで、ApcEタンパク質、CpcG1タンパク質、CpcA(フィコシアニンαサブユニット)タンパク質、CpcB(フィコシアニンβサブユニット)タンパク質、CpcC(フィコビリソームロッドリンカーペプチド)タンパク質、CpcD(フィコシアニンリンカータンパク質9K)タンパク質、CpcE(フィコビリソーム成熟タンパク質)タンパク質、CpcG(フィコビリソームロッドコアリンカーポリペプチド)タンパク質、CpcF(フィコシアニンαサブユニットフィコシアノビリンリアーゼ)タンパク質、pufA(集光性B875α鎖)タンパク質、およびpufB(集光性B875β鎖)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項4〜6のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- 操作された炭素固定経路核酸が、3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質、カルビン回路タンパク質、炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質、糖新生経路タンパク質、グリオキシル酸シャント経路タンパク質、ピルビン酸合成経路タンパク質、還元的TCA回路タンパク質、およびウッド-ユングダール経路タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- 3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質が、アセチル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットα)タンパク質;アセチル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;ビオチン-カルボキシル担体タンパク質(accB)、ビオチン-カルボキシラーゼタンパク質;マロニルCoA還元酵素タンパク質;3-ヒドロキシプロピオニル-CoA合成酵素タンパク質;プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットα)タンパク質;プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;メチルマロニル-CoAエピメラーゼタンパク質;メチルマロニル-CoAムターゼタンパク質;スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼ(サブユニットα)タンパク質;スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;フマル酸還元酵素-frdA-フラビンタンパク質サブユニットタンパク質;フマル酸還元酵素鉄-硫黄サブユニット-frdbタンパク質;g15サブユニット[フマル酸還元酵素サブユニットc]タンパク質;g13サブユニット[フマル酸還元酵素サブユニットD]タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスI好気性(fumA)タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスI嫌気性(fumB)タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスII(fumC)タンパク質;およびL-マリル-CoAリアーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- カルビン回路タンパク質が、フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ-クラスI(Fda)タンパク質;フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ-クラスII(FbaA)タンパク質;グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、cbbGタンパク質;ホスホリブロキナーゼ(PrkA)タンパク質;CP12タンパク質;トランスケトラーゼ(TktA)タンパク質;フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(Fbp)タンパク質;ペントース-5-リン酸-3-エピメラーゼ(Rpe)タンパク質;セドヘプツロース-1,7-二リン酸アルドラーゼ(RpaA)タンパク質;セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ(SBPアーゼ)タンパク質;リボース-5-リン酸イソメラーゼ(RpiA)タンパク質;ホスホグリセリン酸キナーゼタンパク質;トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCo)-小サブユニット-cbbSタンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCo)-大サブユニットcbbLタンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(RbcS)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(RbcL)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(CbbS)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(CbbL)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(CbbM)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RbcL)タンパク質;およびルビスコアクチバーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- 炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質が、パントテン酸キナーゼ(panK)タンパク質;ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、αサブユニット(pdhA)タンパク質;およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ、αサブユニット(pdhB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- 糖新生経路タンパク質が、ピルビン酸カルボキシラーゼタンパク質、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼタンパク質、グルコース-6-ホスファターゼ-dog1タンパク質、およびグルコース-6-ホスファターゼ-dog2タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- グリオキシル酸シャント経路タンパク質が、リンゴ酸合成酵素-aceBタンパク質、リンゴ酸合成酵素-glcBタンパク質、イソクエン酸リアーゼ-aceAタンパク質、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- ピルビン酸合成経路タンパク質が、ピルビン酸合成酵素活性を有するピルビン酸フェレドキシン:酸化還元酵素タンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- 還元的TCA回路タンパク質が、ATP-クエン酸リアーゼ、サブユニット1タンパク質;ATP-クエン酸リアーゼ、サブユニット2タンパク質;シトリル-CoA合成酵素(大サブユニット)タンパク質;シトリル-CoA合成酵素(小サブユニット)タンパク質;シトリル-CoAリガーゼタンパク質;リンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(好気性アイソザイム、fumA)タンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(嫌気性アイソザイム、fumB)タンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(fumC)タンパク質;コハク酸デヒドロゲナーゼ(フラビンタンパク質サブユニット-SdhA)タンパク質;SdhB鉄-硫黄サブユニットタンパク質;SdhC膜アンカーサブユニットタンパク質;SdhD膜アンカーサブユニットタンパク質;スクシニル-CoA合成酵素αサブユニット(sucD)タンパク質;スクシニル-CoA合成酵素αサブユニットタンパク質;スクシニル-CoA合成酵素β-サブユニット(sucC)タンパク質;スクシニル-CoA合成酵素βサブユニットタンパク質;α-ケトグルタル酸サブユニットα-korAタンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;α-ケトグルタル酸サブユニットβ-korBタンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NADP依存性(Idh)タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Icd)タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NAD依存性サブユニット1タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NAD依存性サブユニット2タンパク質;アコニット酸ヒドラターゼ1(acnA)タンパク質;アコニット酸ヒドラターゼ2(acnB)タンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットA porAタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットB porBタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットC porCタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットD porDタンパク質;ホスホエノールピルビン酸合成酵素-ppsAタンパク質;ホスホエノールピルビン酸合成酵素-ppsAタンパク質;およびPEPカルボキシラーゼ、ppCタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- ウッド-ユングダール経路タンパク質が、NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ-サブユニットA Mt-fdhAタンパク質;NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ-サブユニットB Mt-fdhBタンパク質;ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼタンパク質;ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素タンパク質;ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼタンパク質;メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼタンパク質;メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ;メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MetF)タンパク質;5-メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ(AcsE)タンパク質;一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoA合成酵素-サブユニットβタンパク質;アセチル-CoAデカルボニラーゼ/合成酵素複合体サブユニットβ(AcsB)タンパク質;および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoA合成酵素-サブユニットαタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- 操作された核酸が存在することで、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼタンパク質、生合成グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質、および乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項8記載の操作された光合成細胞。
- 操作されたNADH経路核酸が、NAD+依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh1タンパク質;NAD+依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh2タンパク質;リンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質;およびNADH:ユビキノン酸化還元酵素(nuo)オペロンタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- NADH:ユビキノン酸化還元酵素(nuo)オペロンタンパク質が、NuoAタンパク質、NuoBタンパク質、NuoCタンパク質、NuoDタンパク質、NuoEタンパク質、NuoFタンパク質、NuoGタンパク質、NuoHタンパク質、NuoIタンパク質、NuoJタンパク質、NuoKタンパク質、NuoLタンパク質、NuoMタンパク質、およびNuoNタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項18記載の操作された光合成細胞。
- 操作されたNADPH経路核酸が、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ;zwfタンパク質;6-ホスホグルコノラクトナーゼ-pglタンパク質;6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、gndタンパク質;NADP依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼタンパク質;NADP依存性リンゴ酸酵素;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;および膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- 操作された核酸が存在することで、ホスホグルコースイソメラーゼタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項20記載の操作された光合成細胞。
- 操作された耐熱性核酸が、ベタイン生合成タンパク質;光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質;ならびにタンパク質フォールディングタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- ベタイン生合成タンパク質が、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ(ApGSMT)タンパク質およびジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼ(ApDMT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
- 光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質が、光化学系IIマンガン安定化ポリペプチド(PsbO)タンパク質;PSII複合体12kDa外因性タンパク質(PsbU)タンパク質;およびチトクロムc550(PsbV)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
- タンパク質フォールディングタンパク質が、熱ショックタンパク質分子シャペロン(HspA)タンパク質、シャペロニン1(GroEL-1)タンパク質、シャペロニン2(GroEL-2)タンパク質、コシャペロニン(GroES)タンパク質、およびエンドペプチダーゼ(ClpB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
- 操作された耐熱性核酸が、δ-12-不飽和化酵素(desA)タンパク質、δ-15不飽和化酵素(desB)タンパク質、ステアロイル-CoA 9-不飽和化酵素(desC)タンパク質、δ-6-不飽和化酵素(desD)タンパク質、熱誘導性転写リプレッサータンパク質(hrcA)、およびヒスチジンキナーゼ34タンパク質(hik34)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現を下方制御またはノックアウトする、請求項22記載の操作された光合成細胞。
- 操作されたpH耐性核酸が、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(GadA)タンパク質;グルタミン酸デカルボキシラーゼβ(GadB)タンパク質;グルタミン酸:γ-アミノ酪酸アンチポーター(GadC)タンパク質;生分解性アルギニンデカルボキシラーゼ(AdiA)タンパク質;アルギニン:アグマチンアンチポーター(AdiC)タンパク質;シャペロンタンパク質dnaK2(DnaK)タンパク質;DNA指向性RNAポリメラーゼ、σサブユニット(sll0306)タンパク質;Zn依存性プロテアーゼ(sll0528)タンパク質;金属依存性ホスホエステラーゼ(sll0549)タンパク質;酸ストレス関連膜タンパク質(sll0939)タンパク質;熱ショック分子シャペロン(sll1514)タンパク質;マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ(sll1558)タンパク質;RNAポリメラーゼσ因子(sll2012)タンパク質;カルボキシル末端プロセシングプロテアーゼ(slr0008)タンパク質;分子シャペロン(slr0093)タンパク質;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(slr0611)タンパク質;CheY様レシーバー(slr1214)タンパク質;シグナル伝達ヒスチジンキナーゼ(slr1285)タンパク質;スーパーオキシドジスムターゼ(slr1516)タンパク質;ヒドロゲナーゼ発現/形成タンパク質(slr1675)タンパク質;エステラーゼ(slr1916)タンパク質;ヒドロゲナーゼ成分タンパク質(ssl3044)タンパク質;塩素イオンチャネルタンパク質;および酸ストレス耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- 塩素イオンチャネルタンパク質が、塩素イオンチャネルタンパク質(EriC)および塩素イオンチャネルタンパク質(MriT)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項27記載の操作された光合成細胞。
- 酸ストレス耐性タンパク質が、酸ストレス耐性タンパク質(sll0846)、酸ストレス耐性タンパク質(sll1086)、酸ストレス耐性タンパク質(sll1483)、酸ストレス耐性タンパク質(slr0270)、酸ストレス耐性タンパク質(slr0967)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1413)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1544)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1573)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1674)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1676)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1687)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1915)、酸ストレス耐性タンパク質(ssl3769)、酸ストレス耐性タンパク質(ssr2016)、および酸ストレス耐性タンパク質(ssr2595)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項27記載の操作された光合成細胞。
- 操作された煙道ガス耐性核酸が、NOx耐性タンパク質、SOx耐性タンパク質、水銀耐性タンパク質、金属耐性タンパク質、および粒子エアロゾル耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- NOx耐性タンパク質が、マルチ銅オキシダーゼ1型(NirK)タンパク質;マルチ銅オキシダーゼ1型(ncgA)タンパク質;チトクロムc、クラスI(ncgB)タンパク質;およびチトクロムc、クラスIC(ncgC)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項30記載の操作された光合成細胞。
- SOx耐性タンパク質が、システイン合成酵素A(cysK)タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ(sodA)タンパク質、およびカタラーゼ(katG)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項30記載の操作された光合成細胞。
- 操作された耐塩性核酸が、Na+/H+アンチポータータンパク質(apnhaP)、カタラーゼタンパク質(katG)、塩およびカドミウムストレス関連タンパク質(CW80Cd404)、breast basic conserved(bbc1)タンパク質、ならびにベタイン生合成タンパク質を含む群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- ベタイン生合成タンパク質が、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ(ApGSMT)タンパク質およびジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼ(ApDMT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項33記載の操作された光合成細胞。
- 操作された近赤外光吸収核酸がクロロフィルd生合成核酸からなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- クロロフィルd生合成核酸が、オキシゲナーゼタンパク質、光化学系タンパク質、エポキシド還元酵素タンパク質、およびSAM利用オキシゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項35記載の操作された光合成細胞。
- オキシゲナーゼタンパク質が、フェオホルビドAオキシゲナーゼタンパク質、酸化還元酵素、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼファミリータンパク質、リスケ2Fe-2Sドメインタンパク質、リスケ鉄-硫黄(cytb6f)融合タンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、フィタノイル-CoAジオキシゲナーゼ(PhyH)タンパク質、第1のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼタンパク質、リポキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、第1のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、キヌレニン3-モノオキシゲナーゼタンパク質、フィタノイル-CoAジオキシゲナーゼ(PhyH)スーパーファミリータンパク質、ジオキシゲナーゼサブファミリータンパク質、第2のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第2のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、ルシフェラーゼ様モノオキシゲナーゼタンパク質、第1の短いリスケ鉄硫黄タンパク質、抗生物質生合成モノオキシゲナーゼドメインタンパク質、サリチル酸1-モノオキシゲナーゼタンパク質、第3のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、キヌレニン3-モノオキシゲナーゼタンパク質、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼタンパク質、リスケ2Fe-2Sドメインタンパク質、ISSタンパク質、第1の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、フェオホルビドAオキシゲナーゼタンパク質、第4のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第5のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第3のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、モノオキシゲナーゼ、フラビン結合ファミリータンパク質、芳香環切断ジオキシゲナーゼ様タンパク質、第6のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、モノオキシゲナーゼ、FAD結合タンパク質、第1のリポキシゲナーゼタンパク質、第2の短いリスケ鉄硫黄タンパク質、第2の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、第7のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第1の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第2のリポキシゲナーゼタンパク質、第3の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、リスケ[2Fe-2S]ドメインタンパク質と融合した膜タンパク質、第2の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、チトクロムb6f複合体リスケ鉄-硫黄サブユニットPetCタンパク質、第4の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質、第8のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第9のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第5の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、第2のリスケ、2Fe-2Sタンパク質、第10のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、亜硝酸還元酵素のフェレドキシンサブユニット、および環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼ、保存されたリスケ(2Fe-2S)領域タンパク質を含有、クロロフィリドオキシゲナーゼ類似体タンパク質、モノオキシゲナーゼ、FAD結合タンパク質、システインジオキシゲナーゼI型ファミリータンパク質、グリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.27および2.5.1.18タンパク質、フェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼおよび関連する環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼ、大末端サブユニットタンパク質、第1のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質、第11のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、ジオキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼ(開環)タンパク質、第3の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第4の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第2のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質、グリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、EC2.5.1.18、ならびに第3のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
- エポキシド還元酵素タンパク質が、チオレドキシン還元酵素、ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質、第1のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第2のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第1のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第2のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第3のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第4のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第3のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第5のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第6のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第4のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第7のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、カルボキシエステラーゼNPタンパク質、第5のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、α/βヒドロラーゼタンパク質、リゾホスホリパーゼタンパク質、第6のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリー、および仮説エポキシド還元酵素タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
- SAM利用オキシゲナーゼタンパク質が、S-アデノシル-メチルトランスフェラーゼMraWタンパク質、ラジカルSAMドメイン/B12結合ドメインタンパク質、プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼタンパク質、第1のラジカルSAMドメインタンパク質、第2のラジカルSAMドメインタンパク質、第3のラジカルSAMドメインタンパク質、マグネシウムプロトポルフィリンO-メチルトランスフェラーゼタンパク質、ラジカルSAM酵素、Cfrファミリータンパク質、第4のラジカルSAMドメインタンパク質、第5のラジカルSAMドメインタンパク質、およびSAM依存性メチルトランスフェラーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
- 光化学系タンパク質が、光化学系IサブユニットPsaAタンパク質、光化学系IサブユニットPsaBタンパク質、光化学系IIサブユニットPsbAタンパク質、光化学系IIサブユニットPsbDタンパク質、光化学系IIコアアンテナサブユニットPsbBタンパク質、および光化学系IIコアアンテナサブユニットPsbCタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
- 操作された栄養分非依存性核酸が、アンモニア同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化-亜硝酸耐性タンパク質、窒素固定タンパク質、尿素同化タンパク質、ビタミンB12生合成タンパク質、およびビタミンB12生合成-Co2+輸送からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
- アンモニア同化タンパク質が、高親和性アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt1)タンパク質、アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt2)タンパク質、およびアンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt3)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- 硝酸/亜硝酸同化タンパク質が、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系基質結合タンパク質(nrtA)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系パーミアーゼタンパク質(nrtB)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(nrtC)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(nrtD)、亜硝酸/硝酸パーミアーゼタンパク質(nrtP)、亜硝酸還元酵素タンパク質(nirA)、および硝酸還元酵素タンパク質(narB)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- 硝酸/亜硝酸同化-亜硝酸耐性タンパク質が、マルチ銅オキシダーゼ1型(NirK)タンパク質;マルチ銅オキシダーゼ1型(ncgA)タンパク質;チトクロムc、クラスI(ncgB)タンパク質;およびチトクロムc、クラスIC(ncgC)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- 窒素固定タンパク質が、FeMo補因子生合成タンパク質(nifB)、[4Fe-4S]フェレドキシン(fdxN)タンパク質、L-システイン脱硫酵素(nifS)タンパク質、Feクラスターアクセサリータンパク質(nifU)、ニトロゲナーゼ-Feサブユニット(nifH)タンパク質、ニトロゲナーゼ-αサブユニット(nifD)タンパク質、ニトロゲナーゼ-βサブユニット(nifK)タンパク質、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifE)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifN)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifX)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifW)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(hesA)、FeSクラスター補因子アセンブリアクセサリータンパク質(hesB)、窒素固定特異的フェレドキシン(FdxH)タンパク質、ピルビン酸:フラボドキシン酸化還元酵素(nifJ)タンパク質、ホモクエン酸合成酵素(nifV)タンパク質、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifZ)、およびFeMo補因子アクセサリータンパク質(nifT)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- 尿素同化タンパク質が、尿素アミドヒドロラーゼ、γサブユニット(ureA)タンパク質;尿素アミドヒドロラーゼ、βサブユニット(ureB)タンパク質;尿素アミドヒドロラーゼ、αサブユニット(ureC)タンパク質;ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureD);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureE);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureF);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureG);ABC型、高親和性尿素パーミアーゼペリプラズムドメイン(urtA)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(urtB)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(urtC)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(urtD)タンパク質;およびABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(urtE)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- ビタミンB12生合成タンパク質が、ウロポルフィリン-III C-メチルトランスフェラーゼコバルトキラターゼ(cysG)タンパク質;シロヒドロクロリンコバルトキラターゼ(cbiK)タンパク質;プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼ(cbiL)タンパク質;プレコリン-3Bメチラーゼ(cbiH)タンパク質;二機能CbiG/プレコリンメチルトランスフェラーゼ(cbiG)タンパク質;プレコリン-4 C11-メチルトランスフェラーゼ(cbiF)タンパク質;コバラミン生合成タンパク質(cbiD);NADPH依存性プレコリン-6A還元酵素(cbiJ)タンパク質;プレコリン-6B C5,15-メチルトランスフェラーゼ(cbiE)タンパク質;プレコリン-6B C12デカルボキシラーゼ(cbiT)タンパク質;プレコリン-8X-メチルムターゼ(cbiC)タンパク質;コビリニン酸A,C-ジアミド合成酵素(cbiA)タンパク質;コビリニン酸(I)a,c-ジアミドアデノシルトランスフェラーゼ(btuR)タンパク質;コビリニン酸合成酵素(cbiP)タンパク質;コビリン酸デカルボキシラーゼ(cobD)タンパク質;アデノシルコビナミドリン酸合成酵素(cbiB)タンパク質;αリバゾール-5'-Pホスファターゼ(cobC)タンパク質;コバラミン(5'リン酸)合成酵素(cobS)タンパク質;コビナミドリン酸グアニリルトランスフェラーゼ(cobU)タンパク質;およびニコチン酸-ヌクレオチドジメチルベンズイミダゾール-Pホスホリボシルトランスフェラーゼ(cobT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- ビタミンB12生合成-Co2+輸送タンパク質が、ABC型Co2+輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質;ABC型コバルト輸送系、ペリプラズム成分タンパク質;およびABC型コバルト輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- ビタミンB12非依存性タンパク質が、5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(metE)タンパク質;リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、αサブユニット(nrdA)タンパク質;およびリボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、βサブユニット(nrdB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
- metEタンパク質が、大腸菌(Escherichia coli)K12(アクセッション番号NP_418273.1)またはサーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(アクセッション番号NP_681881)に由来する、請求項49記載の操作された光合成細胞。
- 耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または該操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された炭素固定細胞。
- 耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、近赤外光吸収核酸、および栄養分非依存性核酸からなる群より選択される複数の操作された核酸を含む、請求項51記載の操作された光合成細胞。
- 関心対象の炭素ベース産物を産生する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を発現するように、細胞を操作する工程であって、少なくとも1つの操作された核酸の発現が、(i)該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質の発現、(ii)該操作された核酸の存在の結果としての内因性タンパク質の過剰発現、または(iii)該操作された核酸の存在の結果としての内因性タンパク質の過小発現を含む、工程;ならびに
(b)CO2および光の存在下で該細胞を培養して、関心対象の炭素ベース産物を産生する工程。 - 関心対象の炭素ベース産物を取り出す工程をさらに含む、請求項53記載の方法。
- 関心対象の炭素ベース産物が、タンパク質、コエンザイムA、アセチルコエンザイムA、アルデヒド、カルボン酸、エーテル、エステル、カロテノイド、ケトン、アルカン、アルケン、アルキン、ジエン、イソプレン、カルボン酸、界面活性剤、ワックスエステル、ポリマー化学物質[ポリフタレートカーボネート(PPC)、ポリエステルカーボネート(PEC)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸(PHB)、ポリラクチド(PLA)、およびポリカプロラクトン(PCL)]、モノマー化学物質[プロピレングリコール、エチレングリコール、および1,3-プロパンジオール、エチレン、酢酸、酪酸、3-ヒドロキシプロパン酸(3-HPA)、アクリル酸、マロン酸、脂肪酸、アセチル-CoA結合炭化水素、アセチル-CoA結合炭水化物、およびポリケチド中間体、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、およびオクタデカノール、バイオディーゼル、バイオ原油、「再生可能な石油」、ならびに薬物からなる群より選択される1つまたは複数の産物を含む、請求項53記載の方法。
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