WO2022044979A1 - 外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞 - Google Patents

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opsin
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cell
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Inventor
清敬 原
陽子 原
吉博 戸谷
史生 松田
涼 田中
さや香 戸谷
海瑚人 佐野
純 石井
謙爾 柘植
英伸 平山
貴秀 木苗
泉穂 武田
寛史 菊川
香奈江 酒井
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静岡県公立大学法人
国立大学法人大阪大学
国立大学法人神戸大学
株式会社３９６バイオ
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to exogenous opsin and cells expressing the rhodopsin.
  • the present invention also relates to a method for culturing the cells.
  • Patent Document 1 discloses a yeast expressing deltarhodopsin (dR) derived from Haloterigena turkmenica in the inner mitochondrial membrane.
  • dR deltarhodopsin
  • Patent Document 1 shows that the obtained yeast exhibits a proton transporting ability in a light-dependent manner, promotes energy production of yeast, and improves the production ability of glutathione, trehalose, and succinic acid.
  • Patent Document 2 discloses Escherichia coli expressing deltarhodopsin (dR) and proteorhodopsin (pR) derived from marine picoplankton.
  • Patent Document 2 shows that the obtained Escherichia coli exhibits a proton transporting ability in a light-dependent manner, promotes energy production of Escherichia coli, and improves the production ability of isoprenol.
  • Patent Document 3 provides energy to photoautotrophs such as cyanobacteria introduced with exogenous opsin, and has the effect of improving doubling time, CO2 fixation rate, and / or carbon-based product formation. Is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 shows that the expression of opsin in the mitochondria of mammalian cells such as CHO cells can supply energy to the cells. For example, it has been shown that this can suppress cell death caused by inhibition of respiratory chain complex I by rotenone. Energy supply to cells is expected to apply to light-driven bioproduction.
  • the present invention provides cells expressing exogenous opsin and the rhodopsin.
  • the present invention also provides a method for culturing the cells.
  • the present inventors analyzed the obtained genomic information of various microorganisms by metagenomic analysis and identified a new opsin gene. By expressing the identified novel opsin gene in other cells, it was found that those showing proton transport capacity are included.
  • the opsin gene which can impart proton transport capacity to cells, activates cell proliferation under light irradiation conditions, promotes ATP production, enhances substance production, and results in low pH resistance and high temperature resistance.
  • the present invention is based on these findings. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • the amino acid corresponding to the 88th position of the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y, I, A or F;
  • the amino acid corresponding to the 90th position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y;
  • the amino acid corresponding to the 91st position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is V, I or A;
  • the amino acid corresponding to the 94th position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is L or V;
  • the amino acid corresponding to the 95th position of the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is V, I, F or L;
  • [1A] The opsin according to the above [1], wherein the amino acid having the number corresponding to the 109th to 112th amino acids in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is not RAIA, AAIA, AAAT, RAVG, KVAG or AAVT. .. [2]
  • Opsin, (1) A group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 38.
  • the opsin according to claim 1 which has an amino acid sequence selected from, or (2) an amino acid sequence having 80% or more identity with the above amino acid sequence ⁇ but not deltarodopsin and proteolodopsin ⁇ .
  • the opsin according to the above [1] which has the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 41 to 43.
  • [6] The gene encoding opsin according to any one of [1] to [4] above, or the gene encoding functional opsin capable of hybridizing to the gene under stringent conditions.
  • [7] Contains a gene encoding an exogenous opsin operably linked to a control sequence. The gene encoding exogenous opsin is the gene described in [6] above. If the cell is a prokaryotic cell, opsin is at least expressed on the cell membrane and If the cell is a eukaryotic cell, opsin is expressed at least in the inner mitochondrial membrane, the cell.
  • the gene encoding exogenous opsin is the gene according to [6] above.
  • a method comprising culturing the cells under light irradiation conditions.
  • FIG. 1 shows a phylogenetic tree of various opsins identified by metagenomic analysis and the proton transport capacity (proton pump activity) per cell in cells expressing each of the opsins.
  • FIG. 2 is a graph comparing the rhodopsin transport capacity per cell of delta rhodopsin (dR), OP13, OP17, and OP27 and the average of the transport capacity of various rhodopsins shown in FIG.
  • FIG. 3A is alignment data of the amino acid sequences of deltarhodopsin (dR), OP13, OP17, and OP27.
  • Helix A to Helix G represent the amino acids corresponding to the seven helices of opsin.
  • the underline shows the amino acids present in the binding pocket with retinal.
  • 3B to 3D are alignment data of the amino acid sequence of the displayed opsin.
  • the numbers displayed below the alignment data correspond to the amino acid numbers in the OP13 sequence.
  • the alignment data of the amino acid sequence of the protein is displayed in the order of FIG. 3B, then FIG. 3C, and then FIG. 3D from the N-terminal side to the C-terminal side. Same as above.
  • FIG. 4A shows the retinal synthesis pathway.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • idi stands for IPP ⁇ -isomerase
  • DMAPP dimethylaryl diphosphate
  • ispA stands for FPP synthase
  • GPP stands for geranylgeranyl diphosphate
  • FPP stands for farnesyl diphosphate
  • crtE stands for geranylgeranylpyrophosphate synthase
  • GGPP stands for geranylgeranylpyrophosphate
  • crtB stands for phytoene synthase
  • phytoene stands for phytoene
  • crtI stands for phytoene.
  • Lycopene represents lycopene
  • crtY represents lycopene cyclase
  • ⁇ -carotene represents ⁇ -carotene
  • BCM (D) O represents 15,15'- ⁇ -carotene dioxygenase (representing dehydrogenase).
  • Blh and all-trans-retinal represents all-trans-retinal.
  • FIG. 4B shows the colors of the strains in the presence or absence of retinal in the strain having the retinal synthetic system (ATR (+) strain) and the strain not having the synthetic system (ATR ( ⁇ ) strain). If the strain is colored, the strain has retinal.
  • FIG. 4C shows that the proton concentration gradient inside and outside the cell membrane is enhanced under bright conditions.
  • FIG. 4D shows the proton transport capacity per cell of a strain having a retinal synthesis system (ATR (+) strain).
  • FIG. 5 shows the relationship between the glycerol concentration and the cell concentration (OD 600 ) in the retinal synthesis system and the cells introduced with opsin (upper left), the amount of glutathione produced at the time marked with * (middle left and right), and extracellular. The pH of the solution (lower left) and intracellular ATP concentration lower right) are shown. No additional retinal was added in this experiment. The experiment was performed under light conditions (bright) and dark conditions (dark).
  • FIG. 5 shows the relationship between the glycerol concentration and the cell concentration (OD 600 ) in the retinal synthesis system and the cells introduced with opsin (upper left), the amount of glutathione produced at the time marked with * (middle left and right), and extracellular. The pH of the solution (lower left) and intracellular ATP concentration lower right) are shown. No additional retinal was added in this experiment. The
  • FIG. 6 shows cell concentration (OD 600 ) (upper left), glucose consumption (upper right), glutathione production per cell (lower left), and glutathione production (lower right) in eukaryotic cells into which opsin has been introduced. Irradiation was performed under irradiation conditions of 50 ⁇ E. E is a unit representing mol photons m -2 s -1 . The square symbol is the result of the opsin-introduced strain (Con), and the circle symbol is the result of the opsin-introduced strain (OP13). The white symbol is the result of pH 5.0 and the black symbol is the result of pH 3.5.
  • FIG. 7 shows the cell concentration (OD 600 ) (upper left), glucose concentration (upper right), glutathione production amount per cell (lower left), and glutathione production amount (lower right) in eukaryotic cells into which opsin was introduced. Irradiation was performed under irradiation conditions of 0.05 ⁇ E.
  • the square symbol is the result of the opsin-introduced strain (Con), and the circle symbol is the result of the opsin-introduced strain (OP13).
  • the white symbol is the result of pH 5.0 and the black symbol is the result of pH 3.5.
  • FIG. 8 shows the temperature tolerance and low pH tolerance of opsin-introduced eukaryotic cells.
  • FIG. 9 shows the low pH resistance of eukaryotic cells (+) introduced with opsin and eukaryotic cells (-) not introduced with opsin.
  • the low pH tolerance is as shown in proliferation ability (upper left), glucose consumption (upper right), intracellular ATP concentration (lower left), glutathione production (middle lower), and glutathione production per cell (lower right). rice field.
  • the solid black line represents pH 6.0 (+)
  • the dashed black line represents pH 3.5 (+)
  • the solid gray line represents pH 3.5 (-).
  • the gray dashed line represents pH 6.5 (-).
  • FIG. 10 shows the high temperature tolerance of opsin-introduced eukaryotic cells. The temperature tolerance was as shown in proliferation ability (upper left), glucose consumption (upper right), intracellular ATP concentration (lower left), and glutathione production per cell (lower right).
  • FIG. 11 shows the total fatty acid production and cell concentration of OP13-introduced Aspergillus oryzae under light irradiation conditions. As a negative control, the same type of aspergillus into which an empty vector was introduced was used.
  • rhodopsin is a complex of a protein called opsin and retinal.
  • Types of rhodopsin include, for example, delta rhodopsin (dR), bacterial rhodopsin (bR) and bR-type rhodopsin (eg, archiardopsin, cruxrhodopsin), sensory rhodopsin I, sensory rhodopsin II, proteolodopsin (pR) and pR type.
  • rhodopsin examples thereof include rhodopsin, channel rhodopsin I, channel rhodopsin II, halorhodopsin, xanthrodopsin, sodium pump type rhodopsin, heliorhodopsin and the like.
  • deltarhodopsin, bacteriorhodopsin, and proteorhodopsin are localized in the cell membrane of prokaryotes and have the function of pumping protons from the inside of the prokaryote to the outside under bright conditions (light irradiation). In prokaryotes, proton concentration gradients inside and outside the cell membrane can be utilized for ATP production.
  • the inner mitochondrial membrane has an oxidative phosphorylation pathway that transports protons from the membrane to the outside to form a proton concentration gradient.
  • This proton concentration gradient is utilized for ATP production. Therefore, for eukaryotes, by expressing opsin in the inner mitochondrial membrane, a proton concentration gradient can be formed photodependently and ATP production can be promoted.
  • opsin is a membrane protein having a 7-transmembrane structure. Photoreceptive ability is acquired by binding to retinal, which is a vitamin A derivative. Examples of opsin include, for example, the opsin shown in Table 1. However, not all of these are capable of transporting protons in heterologous organisms. The opsin is not particularly limited, but Gloeobacter violaceus, Roseiflexus sp. , Octadecabter antennacticus, Photobacterium sp.
  • SKA34, Exiguobacterium sibiricum, Uncultured marine bacterium 66A03, Rhodobacterales bacterium, Uncultured bacterium MedeBAC35C06, Uncultured marine bacterium HF1019P19, and at least one species of opsin and the like is selected from the group consisting of Psychroflexus torquis. These opsins have significant proton transport capacity. Opsin also includes functional variants of opsin that can form a light-dependent proton concentration gradient.
  • the "gene encoding opsin” is a gene encoding opsin operably linked to a control sequence (for example, a promoter).
  • the regulatory sequence can induce transcription of opsin in the host (the cell into which the gene has been introduced).
  • the gene encoding opsin may be codon-optimized for the host. Since codon usage differs depending on the host, it is preferable to perform codon optimization, especially when introducing different types of opsin.
  • the gene encoding opsin can be integrated on a vector (eg, a plasmid) that has or does not have an origin of replication suitable for replication in the host.
  • the vector may have an auxotrophy marker and / or a drug selection marker, and if it has an auxotrophy marker and / or a drug selection marker, the host into which the vector has been introduced with the nutrition and / or drug. Can be selected.
  • the control sequence may be a constitutive promoter or an inducible promoter.
  • Opsin is expressed in cells and is called rhodopsin when it binds to retinal in the membrane. Expressing rhodopsin means having a form of opsin bound to retinal within the membrane.
  • organisms are roughly classified into prokaryotes and eukaryotes. Organisms are also broadly divided into unicellular and multicellular organisms. Usually, prokaryotes are unicellular, and eukaryotes include those that are unicellular and those that are multicellular. Prokaryotes include, for example, bacteria, archaea (archaea), cyanobacteria (cyanobacteria) and actinomycetes. Specifically, Escherichia coli (eg, Escherichia coli), Bacillus subtilis (eg, Bacillus subtilis), Lactobacillus (eg, Lactobacillus), Acetate (eg, Acetbacillus).
  • Escherichia coli eg, Escherichia coli
  • Bacillus subtilis eg, Bacillus subtilis
  • Lactobacillus eg, Lactobacillus
  • Acetate eg, Acetbacillus
  • Acetobacteraceae, Corynebacterium, Pseudomonas bacteria, methane-producing bacteria eg, Metanobacterium, Streptomyces, Streptomyces
  • Examples include the genus Streptomyces, the genus Agrobacteria, and the like.
  • eukaryotes include animals, plants, and fungi (fungi).
  • fungi examples include fission yeast or budding yeast, for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces curlsbergensis, Saccharomyces saccharomyces saccharomyces saccharomyces saccharomyces saccharomyces Saccharomyces, Saccharomyces pombe and other Saccharomyces genus, Candida utilis, Candida tropicalis and other Candida tropicalis, Xan -Xanthophyllomyces (Xanthophyllomyces) genus Xanthophyllomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast, Yeast Yeasts such as the genus Rhodotorula) can be mentioned.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces curlsbergens
  • yeasts of the genus Saccharomyces, Saccharomyces, Candida, Xanthophilomyces or Pikia are preferable, and Saccharomyces cerevisiae of the genus Saccharomyces and Saccharomyces pon of the genus Saccharomyces.
  • S. pombe and C. utilis of the genus Candida are more preferable, and most preferably S. cerevisiae. It is cerevisiae.
  • Filamentous fungi eg, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium, Brakeslea trispora (Blakeslea trispora), for example, Brakeslea trispora (Pelicella trispora) , Spodoptera flugiperda-derived cells, Trichoplusia ni-derived cells, silkworms, nematodes, plant cells, algae (large algae, microalgae), plants (eg, white algae, tobacco), mammals Examples include cultured cells (for example, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), human cells). The cells may be algae (large algae, microalgae).
  • the cells may be algae (large algae, microalgae).
  • the cell or organism may be a photosynthetic cell or organism (photosynthetic cell or photosynthetic organism) or a non-photosynthetic cell or organism (non-photosynthetic cell or non-photosynthetic organism). This is because the introduction of opsin promotes the formation of a proton concentration gradient and promotes energy production in any case.
  • An organism or cell into which a gene encoding opsin is introduced may be referred to herein as a "host.”
  • foreign means derived from an organism other than the host.
  • the control sequence can be exogenous.
  • the gene to be expressed can also be exogenous. Therefore, a gene operably linked to a control sequence can be exogenous in both the control sequence and the gene.
  • “Intrinsic” means that it is possessed by the host itself.
  • the "retinal synthesis system” is a multi-step pathway for synthesizing all-trans retinal (ATR) from isopentenyl diphosphate (IPP).
  • ATR is synthesized from IPP by the following [1] to [7].
  • IPP is converted to dimethylallyl diphosphate (DMAPP) by IPP ⁇ -isomerase.
  • DMAPP is converted to farnesyl diphosphate (FPP) by FPP synthase (ispA).
  • FPP is converted to geranylgeranylpyrrophosphate (GGPP) by geranylgeranylpyrrophosphate synthase (crtE).
  • GGPP is converted to phytoene by phytoene synthase (crtB).
  • Phytoene is converted to lycopene by phytoene dehydrogenase (crtI).
  • Lycopene is converted to ⁇ -carotene by lycopene cyclase (crtY).
  • ⁇ -carotene is cleaved by 15,15'- ⁇ -carotene dioxygenase (blh) and converted into two all-trans retinal (ATR).
  • IPP can be produced by the mevalonate or non-mevalonate pathway.
  • a series of enzymes of the retinal synthesis system means a set of enzymes of the above [1] to [7].
  • Some cells may have an endogenous enzyme.
  • E. coli and yeast have IPP ⁇ -isomerase and ispA. Therefore, when crtE, crtB, crtI, and crtY are added to E. coli, the E. coli and yeast will synthesize ⁇ -carotene. Further addition of blh to E. coli and yeast will cause the E. coli and yeast to synthesize all-trans retinal.
  • having a series of enzymes of the retinal synthesis system includes having all the series of enzymes of the retinal synthesis system by combining the exogenous enzyme and the endogenous enzyme.
  • all of the series of enzymes in the retinal synthesis system may be supplied extrinsically.
  • Those skilled in the art can appropriately determine which enzyme the cell has by analyzing the presence or absence of a gene or by analyzing a gene product.
  • the host is IPP ⁇ -isomerase, FPP synthase (ispA), geranylgeranylpyrophosphate synthase (crtE), phytoene synthase (crtB), phytoene dehydrogenase (crtI), lycopene cyclase (crtY), and 15.
  • blh 15'- ⁇ -carotene dioxygenase expresses all enzymes selected from the group.
  • the host is IPP ⁇ -isomerase, FPP synthase (ispA), geranylgeranylpyrophosphate synthase (crtE), phytoene synthase (crtB), phytoene dehydrogenase (crtI), lycopene cyclase (crtY), and 15. , 15'- ⁇ -carotene dioxygenase (blh) selected from the group consisting of some or all of the exogenous genes encoding ⁇ provided that the host does not have an endogenous enzyme or gene. May ⁇ .
  • the inventors have recently obtained a newly discovered opsin gene having a strong proton transport ability (see Table 1). These opsin genes may not be codon-optimized if their expression is confirmed in the host, but may be codon-optimized for the host.
  • the proton excretion rate indicates the ability to transport protons from the inside of the cell to the outside of the cell.
  • the proton discharge rate ( ⁇ mol / gDCW / min) is 0.1 or more, 0.2 or more, 0.270 or more, 0.3 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more.
  • ⁇ or higher, 0.8 or higher, 0.806 or higher, 0.9 or higher, or 1.0 or higher has a proton transport capability and can be preferably used in the present invention.
  • OP13, OP17, and OP27 in Table 1 show excellent proton transport capacity and may be particularly preferably used.
  • opsin is (1) A group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 38. It has an amino acid sequence selected from, or (2) 80% or more (or 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more) with the above amino acid sequence. , 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) can be opsin having an amino acid sequence having the sameness.
  • Opsin (1) A group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 38. It has an amino acid sequence selected from, or (2) 80% or more (or 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more) with the above amino acid sequence. , 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) of the same amino acid sequence, opsin, or a gene encoding the opsin is provided. Opsin and the gene encoding it can be isolated.
  • the gene encoding opsin may be a gene encoding functional opsin that can hybridize with the above-mentioned opsin-encoding gene under stringent conditions.
  • the stringent condition includes a normal stringent condition and a condition having a higher stringency.
  • hybridization is carried out in a hybridization solution having a salt concentration of 6 ⁇ SSC or equivalent under a temperature condition of 50 to 60 ° C. for about 16 hours, and the salt is 6 ⁇ SSC or equivalent. This can be carried out by performing preliminary cleaning with a solution having a concentration of 1 ⁇ SSC or a solution having a salt concentration equivalent to that of 1 ⁇ SSC, if necessary.
  • the above-mentioned washing can be carried out by performing the washing in a solution having a salt concentration of 0.1 ⁇ SSC or the same.
  • SSC is a pH 7 aqueous solution containing 15 mM sodium citrate and 150 mM sodium chloride.
  • N ⁇ SSC (where n is a positive real number) means an aqueous solution having a pH of 7 containing sodium citrate and sodium chloride contained in the SSC at n-fold concentrations, respectively.
  • the SSC can be DNase-free and / or RNase-free and may be autoclaved.
  • the genes encoding opsin shown in Table 1 are provided. According to the present invention, the genes encoding opsin shown in Table 1 may be codon-optimized for increased expression in the host.
  • the gene encoding opsin may be integrated on the vector, and a vector containing the gene encoding opsin is provided.
  • the vector can be a gene expression vector.
  • the gene expression vector contains a gene encoding opsin operably linked to the control sequence in the expression cassette.
  • the control sequence is, for example, a promoter sequence and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the host expressing opsin.
  • the gene expression vector may further have an auxotrophic marker and / or a drug selection marker, and the host carrying the vector can be selected or maintained in the absence of the nutrient and / or in the presence of the drug.
  • the isolated opsin shown in Table 1 is also provided.
  • the present invention also provides cells or organisms containing opsin shown in Table 1.
  • opsin can bind to retinal to form rhodopsin.
  • a cell or organism containing rhodopsin as a complex of opsin and retinal shown in Table 1.
  • opsin can be exogenous opsin. That is, opsin can be transcribed and translated from a gene encoding an exogenous opsin operably linked to a control sequence.
  • the opsin-containing cells or organisms shown in Table 1 may have genes encoding exogenous opsin operably linked to a control sequence.
  • opsin may have R / K, L, X, and I, respectively, the amino acids corresponding to positions 121 to 124 of the amino acid sequence (OP13) set forth in SEQ ID NO: 9. This sequence belongs to Helix D as shown in FIG. These amino acids are amino acids located in the retinal binding pocket that determine the binding of opsin to retinal and are common to the highly active OP13, OP17 and OP27 and can enhance the activity of opsin.
  • the amino acid aligned at the same position as a certain amino acid is the amino acid corresponding to the certain amino acid. Alignment can be done with default parameters using commercially available software such as Clustal W.
  • opsin may have a common sequence between or before and after the retinal binding pockets.
  • opsin is selected from the following condition group A: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, or all may be met:
  • the amino acid having the 88th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is F, I, Y, or A;
  • the amino acid having the 89th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is R;
  • the amino acid having the 90th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y;
  • the amino acid corresponding to the 91st position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is I, V, or A;
  • the amino acids corresponding to positions 92 and 93 in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 are
  • opsin has 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, selected from the following condition group B as a property common to opsin with high proton transport activity. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, or all may be met:
  • the amino acid having the 88th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is F, I, Y, or A;
  • the amino acid having the 89th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is R;
  • the amino acid having the 90th corresponding number in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y;
  • the amino acid corresponding to the 91st position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is I, V, or A;
  • the amino acids corresponding to positions 92 and 93 in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 are D and W, respectively;
  • opsin may satisfy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or all selected from the following condition group C ⁇ provided.
  • the amino acid of the number corresponding to the 109th to 112th of the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is not RAIA, AAIA, AAAT, RAVG, KVAG or AAVT ⁇ :
  • the amino acid corresponding to the 88th position of the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y, I, A or F;
  • the amino acid corresponding to the 90th position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is Y;
  • the amino acid corresponding to the 91st position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is V, I or A;
  • the amino acid corresponding to the 94th position in the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9 is L or V;
  • Opsin is not dR and pR.
  • the opsin is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: An amino acid sequence selected from the group consisting of 38 and 80% or more (or 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% It may have an amino acid sequence having 98% or more, or 99% or more) identity.
  • the opsin is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO:
  • the amino acids having the same amino acid sequence of 98% or more, or 99% or more) and corresponding to the 121st to 124th positions of the amino acid sequence (OP13) shown in SEQ ID NO: 9, respectively, are R / It can be K, L, X, and I.
  • the opsin is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO:
  • the opsin is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO:
  • the opsin is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO:
  • opsin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.
  • opsin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
  • opsin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
  • the isolated opsin shown in Table 1 may also be linked to a mitochondrial localization signal. Therefore, according to the present invention, the isolated opsin shown in Table 1 linked to the mitochondrial localization signal and the gene encoding the opsin are provided.
  • Opsin linked to the mitochondrial localization signal translocates to mitochondria when expressed in eukaryotic cells or eukaryotes. In this way, eukaryotic cells or eukaryotes having rhodopsin expressed in mitochondria can be obtained. Rhodopsin expressed in mitochondria can form a proton concentration gradient inside and outside the inner mitochondrial membrane and promote ATP synthesis.
  • opsin linked to mitochondrial localization signals is suitable for expression in eukaryotic cells or eukaryotes.
  • the mitochondrial localization signal those well known to those skilled in the art can be used, for example, ALA synthase Hem1, S2 peptide, or oligoarginine (for example, octaarginine), peroxiredoxin PRX1, pyruvate dehydrogenase ⁇ subunit.
  • Heat shock protein HSP60 ⁇ subunit of ATP synthase, ⁇ subunit of ATP synthase, subunit 2 and subunit 4 of cytochrome c oxidase, subunit 6, Succinate dehydrogenasecytochrome b small subunit, citrate synthesize 1.
  • CIT1 Actolactatesynchrotactic subunit (ILV2), Keto l-acid redtoisomerase, Mitfilin, cytochrome c degrading enzyme (Sue), and the like can be used.
  • Opsin can also be localized to mitochondria by translating opsin in mitochondria without having a mitochondrial localization signal.
  • the tryptophan codon is changed to TAA, such opsin can only be translated in mitochondria.
  • TGA is a stop codon in cytoplasmic translation and encodes tryptophan in mitochondrial translation.
  • TAA can be used as the stop codon in mitochondria.
  • the gene encoding opsin may include TGA as a codon encoding tryptophan.
  • the host can be a prokaryote or a eukaryote.
  • the host can also be a unicellular or multicellular organism.
  • the host can be a microorganism.
  • the host can be a photosynthetic cell or a photosynthetic organism.
  • the host can be a non-photosynthetic cell or a non-photosynthetic organism.
  • the host can also be an organism selected from the group consisting of bacteria, archaea (archaea), cyanobacteria (cyanobacteria) and actinomycetes.
  • the host is Escherichia coli (eg, Escherichia coli), Bacillus subtilis (eg, Bacillus subtilis), Lactobacillus (eg, Lactobacillus), Acetate (eg, acet).
  • Bacillus bacteracea Corynebacterium, Pseudomonas bacteria, methane-producing bacteria (eg, Methanobacterium, Streptomyces, Streptomyces) It can be an organism selected from the group consisting of the genus Streptomyces and the genus Agrobacteria.
  • the host can be an organism selected from the group consisting of animals, plants, and fungi (fungi).
  • the host can be yeast in some embodiments.
  • the host can, in some embodiments, be fission yeast or budding yeast.
  • the host is Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces curlsbergensis, Saccharomyces saccharomyces saccharomyces fragilis, Saccharomyces saccharomyces fragilis, etc. (Shizosaccharomyces pombe), Saccharomyces genus, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida genus, Xanthophilomyces dendroth, etc. Saccharomyces (Xanthophyllomyces), Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Hansenula, Estenula from Rodothorula, and End from Rhodotorulas.
  • the host is a filamentous fungus (eg, Aspergillus, eg, Aspergillus oryzae), Trichoderma, Humicola, Acremonium, fraes Trispora) and Penicillium species), insect cells (eg, cells derived from Spodoptera frugiperda, cells derived from Trichoplusia ni), nematodes, silkworms, plant cells, algae (large algae) It can be selected from the group consisting of microalgae), plants (white indigo, tobacco), and cultured mammalian cells (eg, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), human cells). The host may also be algae (large algae, microalgae).
  • a filamentous fungus eg, Aspergillus, eg, Aspergillus oryzae
  • Trichoderma Humicola, Acremonium, fraes Trispora
  • Penicillium species eg, insect cells eg, cells derived from Spo
  • Opsin introduced into these hosts can be exogenous.
  • the host and opsin can be heterologous. Animals can be non-human. If the host is a prokaryote, opsin can be expressed on the cell membrane. If the host is a eukaryote, opsin can be expressed on the inner mitochondrial membrane. As a method of expression, a technique well known to those skilled in the art can be used.
  • the host can have all of the series of enzymes in the retinal synthesis system, in addition to the gene encoding exogenous opsin. Thereby, if the host can self-synthesize retinal, the amount of retinal added to the medium can be reduced. If the amount of retinal synthesized by the host is sufficient, it is not necessary to add retinal to the medium. If the host does not have a portion of a set of enzymes in the retinal synthesis system, an exogenous gene encoding the enzyme that the host does not have can be introduced into the host. The exogenous gene encoding the enzyme that the host does not have can be operably linked to the control sequence and is introduced into the expression cassette in the vector. Whether or not the host has the enzyme can be appropriately determined by those skilled in the art by biochemical analysis (eg, Western blotting), genetic analysis (eg, sequencing, or PCR).
  • biochemical analysis eg, Western blotting
  • genetic analysis eg, sequencing, or PCR
  • a host expressing rhodopsin can be cultured under culture conditions suitable for the host. Culture conditions could be appropriately determined by those skilled in the art. Hosts expressing rhodopsin can be cultured under light irradiation conditions. By culturing under light irradiation, ATP synthesis is promoted in the host expressing rhodopsin, and energy is supplied by light irradiation.
  • the light irradiation is not particularly limited as long as the irradiation is such that rhodopsin receives light, and for example, 0.01 ⁇ mol photons m -2 s -1 or more, 0.02 ⁇ mol photons m -2 s -1 or more, 0.03 ⁇ mol.
  • the strength can be photons m -2 s -1 or higher, 0.04 ⁇ mol photons m -2 s -1 or higher, or 0.05 ⁇ mol photons m -2 s -1 or higher.
  • Light irradiation is also 0.1 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less, 0.2 ⁇ photons mol m -2 s -1 or less, 0.3 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less, 0.4 ⁇ mol photons m -2 s- 1 or less, 0.5 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less, 0.6 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less, 0.7 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less, 0.8 ⁇ mol photons m -2 s -1 or less , 0.9 ⁇ photons molm -2 s -1 or less, 1.0 ⁇ mol photons m -2 s
  • the light to be irradiated may be any of a light bulb (for example, an incandescent light bulb, a halogen light bulb, etc.), a fluorescent lamp, a high-pressure discharge lamp, a low-pressure discharge lamp, an LED, EL, chemiluminescence, biological light emission, and sunlight, for example, 300 to 800 nm. , 450-650 nm, for example light containing a wavelength of 550 nm can be used.
  • the light irradiation may be performed continuously or intermittently.
  • the host When energy is provided to the host by light irradiation, the host can reduce the consumption of carbon sources used for energy production. When energy is provided to the host by light irradiation, the host will be able to use more of the raw material, such as a carbon source, in pathways involved in substance production (eg, the pentose phosphate pathway, etc.). Therefore, light irradiation puts the host in a state suitable for substance production. Therefore, by supplying a raw material such as a carbon source to the host, substance production can be preferably performed. Microorganisms expressing rhodopsin can exhibit low pH resistance and / or high temperature resistance under light irradiation conditions.
  • Low pH tolerance is defined as low pH environment (eg, less than pH 5.0) in which the host's ability (one or more ability selected from the group consisting of proliferation ability, ATP synthesis ability, and substance production ability) is reduced.
  • the host's ability one or more ability selected from the group consisting of proliferation ability, ATP synthesis ability, and substance production ability
  • Low pH tolerance means, for example, in the case of yeast, growth under pH conditions of less than pH 5.0, pH 4.5 or less, pH 4.0 or less, for example, pH 3.2 to 3.7 (for example, pH 3.5).
  • a host expressing rhodopsin and having low pH tolerance can be preferably cultured even under low pH conditions. Under low pH conditions, one or more abilities selected from the group consisting of growth of other contaminating microorganisms, ATP synthase ability, and substance production ability are suppressed, and the host may be selectively cultured.
  • High temperature tolerance means light irradiation in a high temperature environment where the host's ability (one or more ability selected from the group consisting of proliferation ability, ATP synthesis ability, and substance production ability) is reduced as compared with the case of no irradiation. Under conditions and / or compared to when rhodopsin is not expressed, it means that under expression conditions, one or more abilities selected from the group consisting of proliferative ability, ATP synthesizing ability, and substance producing ability are increased. do.
  • high temperature tolerance means growth ability and ATP synthesis ability under conditions of 32 ° C. or higher, 33 ° C. or higher, 34 ° C. or higher, for example, 34 ° C. to 36 ° C.
  • one or more abilities selected from the group consisting of substance-producing ability are greater than the corresponding abilities under non-irradiation and / or rhodopsin non-expression conditions. Under high temperature conditions, the growth of other contaminating microorganisms may be suppressed and the host may be selectively cultured.
  • Microorganisms expressing rhodopsin can be resistant to low pH and high temperature under light irradiation conditions.
  • a host that expresses rhodopsin and is resistant to low pH and high temperature can be preferably cultured under low pH and high temperature conditions.
  • the ability of one or more selected from the group consisting of growth of other contaminating microorganisms, ATP synthase ability, and substance production ability is suppressed, and it may be possible to selectively culture the host. ..
  • Material production can be preferably carried out by culturing cells or organisms expressing rhodopsin under the above conditions.
  • a cell or organism expressing rhodopsin can be cultured under conditions suitable for the production of a particular substance in order to increase the production of that substance. Culture conditions can meet either or both low pH and high temperature conditions. Further modifications to cells or organisms expressing rhodopsin are permissible in order to increase the production of certain substances. Such modifications include, for example, modifications that mutate and / or introduce an enzyme for the production pathway of the substance; disruption of the enzyme for degradation of the substance, reduction of expression, deletion or reduction of activity; and / or competition. Enzyme disruption, reduced expression, and / or loss or reduction of activity with respect to the pathway involved.
  • Examples of substances produced by substance production include organic acids, peptides, amino acids, proteins, nucleosides, vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, isoprenoids and lipids. More specifically, the following can be mentioned.
  • Examples of the organic acid include acetic acid, lactic acid, succinic acid, ⁇ -keto acid (2-oxo acid) and the like.
  • Examples of the peptide include glutathione, alanylglutamine, ⁇ -glutamylvalylglycine and the like, and examples of the polypeptide include polylysine and polyglutamic acid.
  • Amino acids include L-alanine, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-aspartin, L-aspartic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-leucine, L-valine, L-isoleucine. , L-proline, L-histidine, L-arginine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-serine, L-cysteine, L-3-hydroxyproline, L-4-hydroxyproline, 5-aminolevulin You can give acid and so on.
  • luciferase As proteins, luciferase, inosine kinase, Glutathate 5-kinase (EC 2.7.2.11), Glutamate-5-semialdehydedgerogenase (EC 1.2.1.41), Pyrroline-5-carboxylatec .1.2), ⁇ -glutamylcysteine synthase (EC 6.3.2.2), glutathione synthase (EC 6.3.2.3), human granulocyte colony stimulator, xylose reductase, P450, etc. I can give it.
  • the nucleoside include inosine, guanosine, inosinic acid, guanylic acid, adenylic acid and the like.
  • vitamins examples include riboflavin, thiamine, and ascorbic acid.
  • sugar examples include xylose and mannose
  • sugar alcohol examples include xylitol and mannitol
  • examples of the alcohol include ethanol.
  • isoprenoids include mevalonic acid (MVA: Mevalonate), isoprenol, astaxanthin, isoprene, isopentenol, limonene, pinene, farnesene, bisabolen and the like.
  • examples of the lipid include propionic acid, hydroxypropionic acid, EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid).
  • acetic acid is particularly suitable for organic acids, glutathione for peptides, mevalonic acid and isoprenol for isoprenoids, and hydroxypropionic acid for lipids.
  • examples of the substances produced include ATP, glutathione, and isoprenoids.
  • Example 1 Preparation of exogenous rhodopsin-expressing cells 43 types of opsin sequences were obtained by metagenomic analysis using the obtained microbial genome sequences. Escherichia coli was used as the host cell. To express opsin in E. coli, NdeI / KpnI restriction enzyme sequences were introduced and codons were optimized for E. coli (see Table 1). A codon-optimized opsin was introduced into the pCDF-Duet1 vector to transform E. coli MG1655 (DE3) strain to obtain E. coli expressing one of 43 rhodopsins.
  • Rhodopsin-expressing Escherichia coli was inoculated from a glycerol stock or a single colony into 4 mL of LB medium and grown at 37 ° C. overnight at 150 rpm to be used as a preculture solution.
  • the cells were stirred and cultured at 37 ° C. and 150 rpm. After 4 hours, 20 ⁇ M IPTG and 10 ⁇ M all-trans retinal (hereinafter, simply referred to as “retinal”) were added, and the mixture was continuously stirred and cultured at 37 ° C. and 150 rpm.
  • the culture solution was collected and centrifuged at 5,000 g at 25 ° C. for 10 minutes to recover rhodopsin-expressing Escherichia coli.
  • the rhodopsin-expressing Escherichia coli suspension was irradiated with light using a 300 W halogen projector lamp (JCD100V-300W). The irradiated light intensity was measured using a photoanalyzer LA-105 (NK system, Osaka, Japan).
  • the time course of pH changes in rhodopsin-expressing E. coli suspensions was recorded using a pH meter (F-72, Horiba, Japan) connected to a PC.
  • the proton pump activity of rhodopsin-expressing E. coli was determined from the initial gradient of pH change.
  • the amount of proton transport per cell was determined by dividing the proton pump activity by the weight of dried cells. No proton transport ability was observed in the system not supplied with retinal. The results were as shown in Table 1, FIG. 1 and FIG.
  • the amino acid sequences of rhodopsin showing particularly high activity were aligned. The results were as shown in FIGS. 3A-3D. As shown in FIGS. 3A-3D, they showed high similarity in amino acid sequence in the retinal pocket (underlined), where rhodopsin binds to retinal. Important amino acid sequences in these amino acid sequences were extracted as condition groups A to C. The condition groups A to C are as described above.
  • rhodopsin-expressing microorganisms enhance their ability to produce energy in a light-dependent manner.
  • the blh gene (66A03) derived from the marine bacterium of the metagenomic sequence described in 2011, 10:59 was codon-optimized for Escherichia coli and PCR-amplified using In-Fusion cloning (Takara Bio, Japan).
  • the amplified blh gene was subcloned into pD874_CrtP-EBIY to obtain the retinal self-synthesis plasmid pD874_CrtP-EBIY-blh.
  • Rhodopsin-expressing Escherichia coli was transformed with this pD874_CrtP-EBIY-blh to obtain retinal self-synthesized rhodopsin-expressing Escherichia coli.
  • ATR (+) indicates a microorganism incorporating an exogenous retinal synthesis system
  • ATR (-) indicates a microorganism incorporating an exogenous retinal synthesis system.
  • Retinal self-synthesized rhodopsin-expressing Escherichia coli was inoculated from a glycerol stock or a single colony into 4 mL of LB medium and grown at 37 ° C. overnight at 150 rpm to be used as a preculture solution.
  • the preculture was inoculated into 20 mL of autoclaved M9 medium containing 4 g / L glucose or 2 g / L glycerol so that the initial OD 600 was 0.1 and cultured at 200 rpm at 37 ° C.
  • the cells were irradiated with 100 ⁇ mol photons m -2 s -1 white LED lights, and under dark conditions, they were cultured in the dark with aluminum foil.
  • the appropriate antibiotics for maintaining the plasmid were added to the culture medium at appropriate concentrations.
  • the obtained Escherichia coli having an exogenous retinal synthesis system (ATR (+) strain) is colored with or without the addition of retinal, and the Escherichia coli having no exogenous retinal synthesis system is obtained.
  • ATR ( ⁇ ) strain was colored only when retinal was added.
  • the obtained retinal self-synthesized rhodopsin-expressing Escherichia coli carried out proton transport in response to light (Fig. 4C). From this, it was clarified that the introduction of an exogenous retinal synthesis system eliminates the need for external addition of retinal in the expression of photodependent proton transport ability by rhodopsin-expressing microorganisms.
  • a dR-introduced strain (MG1655 (DE3) / pCDFDuet1-dR, pD874-CrtP-EBIY-blh) was used, but the same applies when another rhodopsin-introduced strain is used. Is clear.
  • the effect of adding retinal and the effect of introducing an exogenous retinal synthesis system without adding retinal were compared.
  • the results were as shown in FIG. 4D.
  • the ATR (+) strain showed a proton transport capacity comparable to that of the externally added retinal-added ATR (-) strain.
  • Examples 1 and 2 cells capable of light-dependent energy production were prepared. In such cells, carbon source consumption for energy production is believed to be reduced, and therefore more carbon sources can be used for material production.
  • Example 3 Material production by rhodopsin-expressing cells
  • substance production by rhodopsin-expressing cells was attempted.
  • Retinal self-synthesized rhodopsin (OP13) -expressing Escherichia coli was inoculated from a glycerol stock or a single colony into 4 mL of LB medium and grown at 37 ° C. overnight at 200 rpm to be used as a preculture solution.
  • the light was irradiated with a 50 ⁇ mol m -2 s -1 white LED light, and the dark condition was shielded from light with aluminum foil for culturing.
  • Centrifugation was performed at 7,000 xg for 2 minutes, and cells were separated from the culture medium collected by sampling.
  • the cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), destroyed with a cell disruptor (Shake Master NEO, Bio Medical Sciences) at 1500 rpm for 10 minutes, and 16,000 x g, 4 ° C for 10 minutes. Cell debris was removed by centrifugation.
  • the glutathione (GSH) concentration in the cell extract was measured using the 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) -glutathione reductase cycling assay described in Hara et al, 2009. The amount of glutathione produced per cell was determined by dividing the glutathione concentration by the cell concentration.
  • the intracellular ATP concentration was measured using the luciferin / luciferase assay method described in Hara 2006; Hara 2009 as follows.
  • a 150 ⁇ l assay mixture was prepared containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.3 ⁇ g / ml luciferase, 0.5 mM D-luciferin, 2 mM DTT, 10 mM regsvr 4 , and 0.2 M EDTA. , To 50 ⁇ l of cells.
  • Luminescence was measured using the Gene light GL-210S series (Microtech Nithion).
  • the carbon source in the culture medium of retinal self-synthesized rhodopsin-expressing Escherichia coli was measured as follows.
  • the concentration of glycerol and glucose, which are carbon sources in the culture solution, is such that the culture solution is collected at an appropriate time for culturing, centrifugation is performed to remove the precipitate, and commercially available F-Kitglycerol (JK international, Japan) is used.
  • F-Kitglycerol JK international, Japan
  • Glucose C-IItestKit Wisco Pure Chemical Industries, Ltd.
  • OD 600 showed a good increase in both light and dark conditions.
  • the glycerol content showed a similar rate of decrease in both light and dark conditions, but tended to be consumed faster in dark conditions.
  • rhodopsin-expressing cells had a higher rate of increase in OD value than non-expressing cells.
  • Glutathione production was statistically significantly higher under light conditions than under dark conditions, as shown in FIG.
  • the pH of the culture medium (extracellular pH; the higher the proton excretion capacity, the lower the pH) was statistically significantly lower under light conditions than under dark conditions. There was no difference in intracellular ATP concentration between light and dark conditions. It is considered that the consumption of rhodopsin-expressing cells increased with the amount of ATP produced, resulting in accelerated turnover.
  • rhodopsin-expressing cells produced energy in a light-dependent manner, excreted protons outside the cells, formed a pH concentration gradient on the cell membrane, and increased glutathione production. It is thought that the light energy was converted to glutathione production.
  • Escherichia coli was transformed with a pMevB plasmid containing the mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, and mevalonic acid pyrophosphate decarboxylase gene from Saccharomyces cerevisiae (Martin et al. 2003).
  • a DNA fragment of nudF containing NcoI and BamHI restriction sites was amplified from the Bacillus subtilis genome. The amplified DNA was digested with NcoI and BamHI and inserted into the multicloning site of pCOLADuet-mvaES.
  • dR-expressing Escherichia coli, OP13-expressing Escherichia coli and OP27-expressing Escherichia coli were transformed to obtain dR-expressing isoprenol-producing Escherichia coli, OP13-expressing isoprenol-producing Escherichia coli, and OP27-expressing isoprenol-producing Escherichia coli, respectively. ..
  • Rhodopsin-expressing isoprenol-producing Escherichia coli was inoculated from a glycerol stock or a single colony into 4 mL of LB medium and grown at 37 ° C. overnight at 150 rpm to be used as a preculture solution.
  • the rhodopsin-expressing isoprenol-producing Escherichia coli was collected by centrifugation at 7,000 ⁇ g at 25 ° C. for 4 minutes and washed with glucose-free M9 medium.
  • Rhodopsin-expressing isoprenol-producing Escherichia coli was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C for 5 minutes after the main culture.
  • the concentration of isoprenol was measured using a gas chromatograph (Agilent Technologies, USA) equipped with a Stabilwax column (Restek, USA) and a flame ionization detector.
  • the isoprenol concentration was less than 0.5 mM in the cells cultured under dark conditions, whereas the isoprenol concentration increased to about 0.6 mM in the cells cultured under light conditions.
  • rhodopsin was expressed in a prokaryote (representatively Escherichia coli) as a cell.
  • rhodopsin was expressed in eukaryotes (typically yeast).
  • Rhodopsin was introduced into yeast in conjunction with a signal under mitochondrial localization. Specifically, S. As a mitochondrial localization signal of cerevisiae, Roseiflexus sp., In which a nucleic acid (DNA) encoding the ALA synthase HemI is bound to the N-terminal. The nucleic acid encoding the derived rhodopsin (OP13) was codon-optimized and synthesized in Saccharomyces cerevisiae. This synthetic OP13 gene was introduced into the pGK426 vector to prepare pK426-HemI-OP13. Using pK426-HemI-OP13 by the lithium acetate method, S.I. S.
  • S. A strain in which the pGK426 vector was introduced into the cerevisiae BY4741 strain was used. It was stored as a glycerol stock at ⁇ 80 ° C. until just before use.
  • the obtained S. S. cerevisiae BY4741 transformants and controls are referred to as "OP13 expressing yeast” and "control yeast", respectively.
  • Rhodopsin-expressing yeast was cultured as follows. Synthetic rhodopsin-expressing yeast and control yeast were cultured statically on a synthetic dextrose (SD) (added Leu, His, Met) medium plate at 30 ° C. for 3 days, and 3 colonies that appeared were picked up and YPD medium 5 Precultured overnight at 30 ° C. at 175 rpm in mL. Precultured OP13-expressing yeast and control yeast were inoculated into 20 mL of SD medium containing amino acids and 10 ⁇ M all-trans retinal so that the initial OD 600 was 0.15. For this culture medium, SD medium having a pH adjusted to 3.5 or 5 with citric acid-phosphate buffer (McIlvaine 1921) was used.
  • Rhodopsin-expressing yeast and control yeast were recovered after culturing for an appropriate time.
  • the glucose concentration in the culture medium, the amount of glutathione produced per cell, and the ATP content were measured in the same manner as in Escherichia coli. The experiment was repeated 3 times for each experimental condition.
  • the above experiment was performed under the same conditions except that the light intensity was 0.05 ⁇ E.
  • the results were as shown in FIG.
  • the amount of glutathione produced is as shown in the table below.
  • rhodopsin-introduced yeast achieved higher OD 600 (cell concentration) when the pH was lowered compared to non-introduced yeast (gray bar).
  • OD 600 cell concentration
  • non-introduced yeast See upper left panel.
  • FIG. 8 when the culture temperature was raised, the growth ability of all yeasts decreased, but in the yeasts into which rhodopsin was introduced (white bars), the yeasts to which rhodopsin was not introduced (gray bars) were compared. No improvement in proliferative capacity was observed (see upper right panel).
  • the yeast in which rhodopsin was introduced was not introduced (gray) under both low pH conditions (see the middle panel on the left) and high temperature (see the middle panel on the right). It was expensive compared to the bar).
  • the amount of glutathione produced per cell is similar, and the yeast introduced with rhodopsin (white bar) was not introduced (gray) under both low pH conditions (see the lower left panel) and high temperature (see the lower right panel). It was expensive compared to the bar).
  • the above was further tested by changing the pH condition.
  • the pH was set to 3.5 and 6.0, and the relationship with the presence or absence of rhodopsin introduction was investigated.
  • rhodopsin-introduced yeast (+) achieved a higher OD 600 (cell concentration) than the non-introduced yeast (-) (cell concentration). See upper left panel).
  • Glucose in the medium was the fastest consumed in the rhodopsin-introduced yeast (+) when the pH was low (pH 3.5), the pH was low and the rhodopsin-introduced yeast (-), and the pH. The order was high.
  • the yield against sugar was calculated from the data in FIG.
  • the yield with respect to sugar was defined as the amount of glutathione produced per 1 g of glucose (mg).
  • the results were as shown in Table 5 below.
  • rhodopsin This ability of rhodopsin is considered to be related to the rate of proton excretion by rhodopsin (that is, ATP production ability) in both eukaryotic cells and prokaryotic cells. Therefore, by extrinsically expressing rhodopsin having the proton excretion activity shown in Table 1, at least one of the above functions can be imparted to cells, and opsin is considered to be more useful as the proton transporting ability is higher. ..
  • OP13 was expressed in Aspergillus oryzae , which is often used in the fermentation industry.
  • the obtained OP13 expression strain and the negative control strain expressing only the vector were cultured under light irradiation conditions using a medium generally used for culturing Jiuqu.
  • Aspergillus oryzae NS4 ⁇ ligD was used as the aspergillus oryzae (see Mizutani et al., Fungal Genet. Biol., 45: 878-889, 2008).
  • ⁇ ligD relates to disruption of ligase involved in illegitimate recombination to avoid insertion of non-specific transgenes into the genome.
  • a pUND vector was used as the expression vector of OP13.
  • Czapek Dox liquid medium 20 g glucose, 6 g NaNO 3 , 1.52 g KH 2 PO 4 , 0.52 g KCl, 1 mL 2M ⁇ 4.7H 2 O (final concentration 2 mM), 1 mL trace amount per 1 L. It is a medium containing elements. Trace elements are 8.5g ZnSO 4.7H 2 O, 1g FeSO 4.7H 2 O, 0.4g CuSO 4.5H 2 O, 0.1g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 O, per 1L.

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Abstract

本発明は、外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞を提供する。本発明はまた、当該細胞を培養する方法を提供する。

Description

外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞
　本発明は、外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞に関する。本発明はまた、当該細胞を培養する方法に関する。
　微生物や細胞、生物を利用した物質生産は、化学物質の生産プロセスにおいて注目を集める１分野である。特許文献１では、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシン（ｄＲ）をミトコンドリア内膜に発現した酵母が開示されている。
　特許文献１では、得られた酵母は光依存的にプロトン輸送能を示し、酵母のエネルギー産生を促進し、グルタチオン、トレハロース、およびコハク酸の産生能が向上することが示されている。特許文献２では、デルタロドプシン（ｄＲ）およびマリン・ピコプランクトン由来のプロテオロドプシン（ｐＲ）を発現した大腸菌が開示されている。
　特許文献２では、得られた大腸菌は光依存的にプロトン輸送能を示し、大腸菌のエネルギー産生を促進し、イソプレノールの産生能が向上することが示されている。特許文献３では、外来性のオプシンを導入された藍藻類などの光独立栄養生物に対してエネルギーを供給し、倍加時間、CO2固定速度、および/または炭素ベース産物形成の改善の効果をもたらすことが開示されている。非特許文献１では、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞のミトコンドリアにおけるオプシンの発現が、細胞にエネルギーを供給できることが示されている。例えば、これによりロテノンによる呼吸鎖複合体Ｉの阻害によりもたらされる細胞死を抑制し得ることが示されている。細胞へのエネルギー供給は、光駆動性の生物生産に適用されると期待されている。
ＷＯ２０１５／１７０６０９Ａ ＷＯ２０２０／０５０１１３Ａ ＷＯ２００９／０６２１９０Ａ
Ｈａｒａ　ｅｔ　ｌａ．，　Ｓｃｉ．　Ｒｅｐ．，　３：１６３５，　２０１３
　本発明は、外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞を提供する。本発明はまた、当該細胞を培養する方法を提供する。
　本発明者らは、入手した各種微生物のゲノム情報をメタゲノム解析により分析し、新たなオプシン遺伝子を同定した。同定された新たなオプシン遺伝子を他の細胞に発現させることにより、プロトン輸送能力を示すものが含まれることを見出した。細胞にプロトン輸送能力を付与することができるオプシン遺伝子は、光照射条件下において細胞の増殖を活発化させ、ＡＴＰ産生を促進し、物質生産を増強し、低ｐＨ耐性や高温耐性をもたらした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］原核生物のオプシンであって、オプシンは、以下の条件群Ｃから選択される１以上またはすべてを満たし得るオプシン｛但し、デルタロドプシンおよびプロテオロドプシンではない｝：
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の８８番目に対応する番号のアミノ酸がＹ、Ｉ、ＡまたはＦである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９０番目に対応する番号のアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９１番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、ＩまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９４番目に対応する番号のアミノ酸がＬまたはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９５番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、Ｉ、ＦまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９７番目に対応する番号のアミノ酸がＶまたはＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９８番目に対応する番号のアミノ酸がＰである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９９番目に対応する番号のアミノ酸がＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１００番目に対応する番号のアミノ酸がＬ、ＱまたはＭである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３４番目に対応する番号のアミノ酸がＹまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３５番目に対応する番号のアミノ酸がＡ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＩまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３６番目に対応する番号のアミノ酸がＧまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１９４番目から１９５番目に対応する番号のアミノ酸がＡＩ、ＡＶ、ＧＶ、ＦＬまたはＣＦである。
［１Ａ］配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１０９番目から１１２番目に対応する番号のアミノ酸が、ＲＡＩＡ、ＡＡＩＡ、ＡＡＡＴ、ＲＡＶＧ、ＫＶＡＧまたはＡＡＶＴではない、上記［１］に記載のオプシン。
［２］オプシンであって、
（１）配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または
（２）上記アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のオプシン｛但し、デルタロドプシンおよびプロテオロドプシンではない｝。
［３］上記［１］に記載のオプシンであって、配列番号４１～４３のいずれかのアミノ酸配列を有する、オプシン。
［４］Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ　ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＫＡ３４、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　６６Ａ０３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＭｅｄｅＢＡＣ３５Ｃ０６、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＨＦ１０１９Ｐ１９、およびＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓからなる群から選択される少なくとも１つの種に由来する、上記［１］または［２］に記載のオプシン。
［５］Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＫＡ３４、およびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群から選択される少なくとも１つの種に由来する、上記［４］に記載の細胞。
［６］上記［１］～［４］のいずれかに記載のオプシンをコードする遺伝子、または当該遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる機能的なオプシンをコードする遺伝子。
［７］制御配列に作動可能に連結した外来性のオプシンをコードする遺伝子を含み、
　外来性のオプシンをコードする遺伝子は、上記［６］に記載の遺伝子で
であり、
　細胞が原核生物の細胞である場合、オプシンは少なくとも細胞膜に発現しており、
　細胞が真核生物の細胞である場合、オプシンは少なくともミトコンドリア内膜に発現している、細胞。
［８］細胞が、放線菌、ラン藻、細菌、および古細菌からなる群から選択される原核生物の細胞である、上記［７］に記載の細胞。
［９］細胞が、動物、植物、藻類および菌類からなる群から選択される真核生物の細胞である、上記［７］に記載の細胞。
［１０］レチナール合成系をコードする一連の遺伝子をさらに有する、上記［７］～［９］のいずれかに記載の細胞。
［１１］細胞の培養方法であって、
　制御配列に作動可能に連結した外来性のオプシンをコードする遺伝子を含む細胞を提供することと、ここで、外来性のオプシンをコードする遺伝子は、上記［６］に記載の遺伝子であり、
　光照射条件下で当該細胞を培養することを含む、方法。
［１２］前記培養が、ｐＨ５より低いｐＨ条件、および３０度を超える温度条件からなる群から選択される何れかまたは両方を満たす条件下で行われる、上記［１１］に記載の培養方法。
図１は、メタゲノム解析により同定された各種オプシンの系統樹と当該オプシンそれぞれを発現させた細胞における細胞あたりのプロトン輸送能力（プロトンポンプ活性）を示す。 図２は、デルタロドプシン（ｄＲ）、ＯＰ１３、ＯＰ１７、およびＯＰ２７の細胞あたりのロドプシン輸送能および図１に示した各種ロドプシンの当該輸送能力の平均を比較したグラフである。 図３Ａは、デルタロドプシン（ｄＲ）、ＯＰ１３、ＯＰ１７、およびＯＰ２７のアミノ酸配列のアラインメントデータである。ヘリックスＡからヘリックスＧは、オプシンが有する７つのヘリックスに対応するアミノ酸を示す。下線は、レチナールとの結合ポケットに存在するアミノ酸を示す。 図３Ｂ～３Ｄは、表示されたオプシンのアミノ酸配列のアラインメントデータである。アラインメントデータの下に表示される数字は、ＯＰ１３の配列におけるアミノ酸番号に相当する。タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントデータが、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて、図３Ｂ、次いで図３Ｃ、さらに図３Ｄの順番で表示されている。 同上。 同上。 図４Ａは、レチナール合成経路を示す。ＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸を表し、ｉｄｉは、ＩＰＰδ－イソメラーゼを表し、ＤＭＡＰＰは、ジメチルアリール二リン酸を表し、ｉｓｐＡは、ＦＰＰ合成酵素を表し、ＧＰＰは、ゲラニル二リン酸を表し、ＦＰＰは、ファルネシル二リン酸を表し、ｃｒｔＥは、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素を表し、ＧＧＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸を表し、ｃｒｔＢは、フィトエン合成酵素を表し、ｐｈｙｔｏｅｎｅは、フィトエンを表し、ｃｒｔＩは、フィトエン脱水素酵素を表し、ｌｙｃｏｐｅｎｅは、リコペンを表し、ｃｒｔＹは、リコペンシクラーゼを表し、β－ｃａｒｏｔｅｎｅは、β－カロテンを表し、ＢＣＭ（Ｄ）Ｏは、１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）を表し、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎａｌは、オールトランスレチナールを表す。 図４Ｂは、レチナール合成系を有する株（ＡＴＲ（＋）株）と合成系を有しない株（ＡＴＲ（－）株）における、レチナールの存在下または非存在下での株の色を示す。株が着色している場合、株はレチナールを有する。 図４Ｃは、細胞膜内外のプロトン濃度勾配が明条件下で増強することを示す。 図４Ｄは、レチナール合成系を有する株（ＡＴＲ（＋）株）の細胞あたりのプロトン輸送能力を示す。 図５は、レチナール合成系およびオプシンを導入した細胞における、グリセロール濃度と細胞濃度（ＯＤ６００）との関係（左上）、＊印の時間におけるグルタチオンの産生量（中段の左と右）、細胞外溶液のｐＨ（下段の左）、および細胞内ＡＴＰ濃度下段の右）を示す。本実験では追加のレチナール添加はなされていない。実験は、明条件（明）および暗条件（暗）とで行った。 図６は、オプシンを導入した真核細胞における、細胞濃度（ＯＤ６００）（左上）、グルコース消費（右上）、細胞あたりのグルタチオン産生量（左下）、グルタチオン産生量（右下）を示す。照射は、５０μＥの照射条件下で行われた。Ｅは、ｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１を表す単位である。四角のシンボルはオプシン非導入株（Ｃｏｎ）の結果であり、丸のシンボルはオプシン導入株（ＯＰ１３）の結果である。白のシンボルはｐＨ５．０の結果であり、黒のシンボルはｐＨ３．５の結果である。 図７は、オプシンを導入した真核細胞における、細胞濃度（ＯＤ６００）（左上）、グルコース濃度（右上）、細胞あたりのグルタチオン産生量（左下）、グルタチオン産生量（右下）を示す。照射は、０．０５μＥの照射条件下で行われた。四角のシンボルはオプシン非導入株（Ｃｏｎ）の結果であり、丸のシンボルはオプシン導入株（ＯＰ１３）の結果である。白のシンボルはｐＨ５．０の結果であり、黒のシンボルはｐＨ３．５の結果である。 図８は、オプシンを導入した真核細胞の温度耐性および低ｐＨ耐性を示す。上記耐性は、増殖能（ｐＨに関して左上および温度に関して右上）、細胞内ＡＴＰ濃度（ｐＨに関して左中段および温度に関して右中段）、および細胞あたりのグルタチオン産生量（ｐＨに関して左下および温度に関して右下）に示される通りであった。グレーのバーは、オプシン非導入株の結果であり、白抜きのバーは、オプシン導入株の結果である。 図９は、オプシンを導入した真核細胞（＋）と導入していない真核細胞（－）の低ｐＨ耐性を示す。上記低ｐＨ耐性は、増殖能（左上）、グルコース消費（右上）、細胞内ＡＴＰ濃度（左下）、グルタチオン産生量（中下）、および細胞あたりグルタチオン産生量（右下）に示される通りであった。増殖能（左上）およびグルコース消費量（右上）において、黒実線はｐＨ６．０（＋）を表し、黒破線はｐＨ３．５（＋）を表し、グレー実線はｐＨ３．５（－）を表し、グレー破線はｐＨ６．５（－）を表す。 図１０は、オプシンを導入した真核細胞の高温耐性を示す。上記温度耐性は、増殖能（左上）、グルコース消費（右上）、細胞内ＡＴＰ濃度（左下）、および細胞あたりグルタチオン産生量（右下）に示される通りであった。 図１１は、ＯＰ１３を導入した麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅの光照射条件下における総脂肪酸生産量と細胞濃度を示す。陰性対照として、空ベクターを導入した同種の麹菌が用いられた。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「ロドプシン」とは、オプシン（Ｏｐｓｉｎ）というタンパク質とレチナール（Ｒｅｔｉｎａｌ）の複合体である。ロドプシンの種類としては、例えばデルタロドプシン（ｄＲ）、バクテリオロドプシン（ｂＲ）およびｂＲ型ロドプシン（例えば、アーキアロドプシン、クルックスロドプシン）、センサリーロドプシンＩ、センサリーロドプシンＩＩ、プロテオロドプシン（ｐＲ）およびｐＲ型ロドプシン、チャンネルロドプシンＩ、チャンネルロドプシンＩＩ、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシン、ヘリオロドプシンなどが挙げられる。例えば、デルタロドプシン、バクテリオロドプシン、およびプロテオロドプシンは、原核生物の細胞膜に局在し、明条件（光照射）によりプロトンを原核生物の内部から外部へ汲み出す機能を有する。原核生物においては、細胞膜内外のプロトン濃度勾配は、ＡＴＰ産生に利用され得る。真核生物においては、ミトコンドリア内膜は酸化的リン酸化経路を有し、膜内から膜外にプロトンを輸送してプロトン濃度勾配を形成する。このプロトン濃度勾配は、ＡＴＰ産生に利用される。したがって、真核生物に対しては、ミトコンドリア内膜にオプシンを発現させることによって、プロトン濃度勾配を光依存的に形成させ、ＡＴＰ産生を促進することができる。
　本明細書では、「オプシン」は、７回膜貫通構造を有する膜タンパク質である。ビタミンＡ誘導体であるレチナールが結合することにより光受容能を獲得する。オプシンの例としては、例えば、表１に記載のオプシンが挙げられる。しかし、これらがすべて異種生物においてプロトン輸送能を奏するわけではない。オプシンとしては、特に限定されないが、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ　ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＫＡ３４、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　６６Ａ０３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＭｅｄｅＢＡＣ３５Ｃ０６、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＨＦ１０１９Ｐ１９、およびＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓからなる群から選択される少なくとも１つの種のオプシンが挙げられる。これらのオプシンは、有意なプロトン輸送能を有する。光依存的にプロトンの濃度勾配を形成させることができるオプシンの機能的変種もオプシンに含まれる。
　本明細書では、「オプシンをコードする遺伝子」とは、制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結したオプシンをコードする遺伝子である。制御配列は、宿主（遺伝子を導入した細胞）においてオプシンの転写を誘導することができる。オプシンをコードする遺伝子は、宿主に対してコドン最適化がなされていてもよい。宿主によってコドン使用が異なるために特に異種のオプシンを導入する場合には、コドン最適化を行うことが好ましい。オプシンをコードする遺伝子は、宿主における複製に適した複製起点を有する、または有しないベクター（例えば、プラスミド）上に組み込まれ得る。ベクターは、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有していてもよく、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有する場合には、当該栄養および／または薬剤でベクターが導入された宿主を選択することができる。制御配列は、構成的プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。オプシンは細胞において発現し、膜内でレチナールと結合するとロドプシンと呼ばれる。ロドプシンを発現しているとは、膜内でレチナールと結合した形態のオプシンを有することを意味する。
　本明細書では、生物は、原核生物と真核生物に大別される。また、生物は、単細胞生物と多細胞生物にも大別される。通常は、原核生物は単細胞であり、真核生物には、単細胞生物であるものと多細胞生物であるものとが存在する。原核生物としては、例えば、細菌、古細菌（アーキア）、ラン藻（シアノバクテリア）および放線菌が挙げられる。具体的には、大腸菌（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））、枯草菌（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、乳酸菌（例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、酢酸菌（例えば、アセトバクテラセエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ））、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂａｃｔｅｒｉａ）、メタン生成菌（例えば、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。真核生物としては、動物、植物、菌類（真菌類）が挙げられる。真菌類としては、例えば、分裂酵母または出芽酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）などのサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのキャンディダ属、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）などのキサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、エンドマイセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属などの酵母が挙げられる。中でも、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンディダ属、キサントフィロマイセス属またはピキア属の酵母が好ましく、サッカロミセス属のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属のシゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓ．　ｐｏｍｂｅ）、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリス（Ｃ．　ｕｔｉｌｉｓ）がより好ましく、最も好ましくはＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ），ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ），アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ），フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），ブラケスリア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ　ｔｒｉｓｐｏｒａ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来細胞）、カイコ、線虫、植物細胞、藻類（大型藻類、微細藻類）、植物（例えば、シロイヌナズナ、タバコ）、哺乳類培養細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト細胞）が挙げられる。細胞は、藻類（大型藻類、微細藻類）であってもよい。細胞または生物は、光合成する細胞または生物（光合成細胞または光合成生物）であってもよいし、光合成しない細胞または生物（非光合成細胞または非光合成生物）であってもよい。オプシンの導入によって、どのような場合でもプロトン濃度勾配形成が促進され、エネルギー産生が促進されるからである。オプシンをコードする遺伝子が導入される生物または細胞を、本明細書では「宿主」と呼ぶことがある。
　本明細書では、「外来性」は、宿主以外の生物に由来することを意味する。典型的には、制御配列は、外来性であり得る。また、発現させる遺伝子も外来性であり得る。したがって、制御配列に作動可能に連結された遺伝子は、制御配列および当該遺伝子の両方が外来性であり得る。「内因性」は、宿主自体が有するものであることを意味する。
　本明細書では、「レチナール合成系」とは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からオールトランスレチナール（ＡＴＲ）を合成する多段階経路である。レチナール合成系では、下記［１］～［７］により、ＩＰＰからＡＴＲが合成される。
［１］ＩＰＰは、ＩＰＰδ－イソメラーゼにより、ジメチルアリール二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換される。
［２］ＤＭＡＰＰは、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）により、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に変換される。
［３］ＦＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）により、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換される。
［４］ＧＧＰＰは、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）により、フィトエンに変換される。
［５］フィトエンは、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）により、リコペンに変換される。
［６］リコペンは、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）により、β－カロテンに変換される。
［７］β－カロテンは、１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）により開裂し、２つのオールトランスレチナール（ＡＴＲ）に変換される。
　ＩＰＰは、メバロン酸経路または非メバロン酸経路により産生され得る。
　本明細書では、「レチナール合成系の一連の酵素」とは、上記［１］～［７］の酵素一式をいう。細胞によっては、内在性の酵素を有している場合がある。例えば、大腸菌および酵母は、ＩＰＰδ－イソメラーゼとｉｓｐＡを有している。したがって、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹを大腸菌に追加すると当該大腸菌および酵母はβ－カロテンを合成するようになる。大腸菌および酵母にｂｌｈをさらに追加することによって、当該大腸菌および酵母は、オールトランスレチナールを合成するようになる。このようにレチナール合成系の一連の酵素を有するとは、外来性の酵素と内在性の酵素とを合わせてレチナール合成系の一連の酵素をすべて有することを含む。もちろん、レチナール合成系の一連の酵素のすべてを外来性に供給してもよい。細胞が、いずれの酵素を有するかは、遺伝子の有無を解析することによって、あるいは遺伝子産物を解析することによって当業者であれば適宜決定することができる。ある態様では、宿主は、ＩＰＰδ－イソメラーゼ、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）、および１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）からなる群から選択されるすべての酵素を発現している。ある態様では、宿主は、ＩＰＰδ－イソメラーゼ、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）、および１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）からなる群から選択される一部、またはすべてをコードする外来性の遺伝子を有する｛但し、宿主が内因性に有する酵素または遺伝子は有しなくてもよい｝。
　発明者らは、今般、新しく発見されたオプシン遺伝子から強いプロトン輸送能を有するものを取得した（表１参照）。これらのオプシン遺伝子は、宿主において発現が確認される場合にはコドン最適化されていなくてもよいが、宿主に対してコドン最適化されていてもよい。表１において、プロトン排出速度は、細胞内からの細胞外へのプロトン輸送能力を示す。表１において、プロトン排出速度（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）が、０．１以上、０．２以上、０．２７０以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．８０６以上、０．９以上、または１．０以上を示したオプシン遺伝子は、プロトン輸送能力を有しており、本発明において好ましく用いられ得る。プロトン輸送能力は、高いほど好ましく、例えば、０．２７０（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）またはそれを越えるプロトン排出速度を有するオプシン遺伝子が、好ましく用いられ得る。特に、表１におけるＯＰ１３、ＯＰ１７、およびＯＰ２７は、優れたプロトン輸送能力を示し、とりわけ好ましく用いられ得る。
　ある態様では、オプシンは、
（１）配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または
（２）上記アミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有する、オプシン
であり得る。
　したがって、本発明では、
　オプシンであって、
（１）配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または
（２）上記アミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有する、オプシン、または、上記オプシンをコードする遺伝子が提供される。オプシンおよびこれをコードする遺伝子は、単離されたものであり得る。
　オプシンをコードする遺伝子は、上記オプシンをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる機能的なオプシンをコードする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のストリンジェントな条件とより高いストリンジェンシーを有する条件が挙げられる。通常のストリンジェントな条件では、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。「ＳＳＣ」は、１５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７の水溶液である。「ｎ×ＳＳＣ」（ここで、ｎは正の実数である）は、当該ＳＳＣに含まれるクエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムをそれぞれｎ倍の濃度で含むｐＨ７の水溶液を意味する。ＳＳＣは、ＤＮａｓｅフリーおよび／またはＲＮａｓｅフリーであり得、かつ、オートクレーブ滅菌されていてもよい。
　本発明によれば、表１に示されるオプシンをコードする遺伝子が提供される。本発明によれば、表１に示されるオプシンをコードする遺伝子は、宿主における発現が高まるようにコドン最適化されていてもよい。オプシンをコードする遺伝子は、ベクター上に組込まれていてもよく、オプシンをコードする遺伝子を含むベクターが提供される。ベクターは、遺伝子発現ベクターであり得る。遺伝子発現ベクターは、発現カセット中に、制御配列に作動可能に連結されたオプシンをコードする遺伝子を含む。制御配列は、例えば、プロモーター配列であり、オプシンを発現させる宿主に応じて当業者であれば適宜選択することができる。遺伝子発現ベクターは、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーをさらに有していてもよく、ベクターを有する宿主を当該栄養非存在下および／または薬剤存在下で選択または維持することができる。
　本発明によればまた、表１に示される単離されたオプシンが提供される。本発明によればまた、表１に示されるオプシンを含む細胞または生物が提供される。オプシンを含む細胞中では、オプシンがレチナールと結合し、ロドプシンを形成し得る。したがって、本発明によれば、表１に示されるオプシンとレチナールとの複合体としてのロドプシンを含む細胞または生物が提供される。本発明のある態様では、オプシンは、外来性のオプシンであり得る。すなわち、オプシンは、制御配列に作動可能に連結された外来性のオプシンをコードする遺伝子から転写および翻訳されたものであり得る。したがって、表１に示されるオプシンを含む細胞または生物は、制御配列に作動可能に連結された外来性のオプシンをコードする遺伝子を有するものであってよい。
　ある態様では、オプシンは、配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１２１番目から１２４番目に相当するアミノ酸がそれぞれ、Ｒ／Ｋ、Ｌ、Ｘ、およびＩであり得る。この配列は、図３に示されるようにヘリックスＤに属する。これらのアミノ酸は、オプシンのレチナールへの結合を決定付けるレチナール結合ポケットに位置するアミノ酸であり、高活性を示すＯＰ１３、ＯＰ１７およびＯＰ２７に共通し、オプシンの活性を高め得る。
　様々なオプシンをアラインメントしたときに、あるアミノ酸と同じ位置にアラインメントされるアミノ酸は、当該あるアミノ酸に対応するアミノ酸である。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗなどの市販のソフトウェアを用いてデフォルトのパラメータで行うことができる。
　ある態様では、オプシンは、レチナール結合ポケット間あるいは前後に共通配列を有し得る。例えば、ある態様では、オプシンは、以下の条件群Ａから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、またはすべてを満たし得る：
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において８８番目に対応する番号のアミノ酸がＦ、Ｉ、Ｙ、またはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において８９番目に対応する番号のアミノ酸がＲである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９０番目に対応する番号のアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９１番目に対応する番号のアミノ酸がＩ、Ｖ、またはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９２番目および９３番目に対応する番号のアミノ酸がそれぞれＤおよびＷである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９４番目に対応する番号のアミノ酸がＬまたはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９５番目に対応する番号のアミノ酸がＩ、Ｌ、Ｖ、またはＦであり、好ましくは、Ｉ、Ｌ、またはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９６番目に対応する番号のアミノ酸がＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９７番目に対応する番号のアミノ酸がＶまたはＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９８番目に対応する番号のアミノ酸がＰである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９９番目に対応する番号のアミノ酸がＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１００番目に対応する番号のアミノ酸がＬ、ＭまたはＱである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１０３番目に対応するアミノ酸がＥまたはＤである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３３番目に対応するアミノ酸がＧである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３４番目に対応する番号のアミノ酸がＹまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３５番目に対応する番号のアミノ酸がＡ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＩまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３６番目に対応する番号のアミノ酸がＧまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３７番目に対応するアミノ酸がＥである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１４９番目に対応するアミノ酸がＧ、Ｌ、Ｖ、またはＷである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１５７番目に対応するアミノ酸がＦ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、またはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９３番目に対応するアミノ酸がＷである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９４番目に対応するアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｃ、またはＦである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９５番目に対応するアミノ酸がＩ、Ｖ、Ｆ、またはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９６番目に対応するアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９７番目に対応するアミノ酸がＰである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において２００番目に対応するアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において２２４番目に対応するアミノ酸がＤである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において２２８番目に対応するアミノ酸がＫである。
　例えば、ある態様では、オプシンは、プロトン輸送活性の高いオプシンに共通する特性として、以下の条件群Ｂから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、またはすべてを満たし得る：
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において８８番目に対応する番号のアミノ酸がＦ、Ｉ、Ｙ、またはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において８９番目に対応する番号のアミノ酸がＲである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９０番目に対応する番号のアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９１番目に対応する番号のアミノ酸がＩ、Ｖ、またはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９２番目および９３番目に対応する番号のアミノ酸がそれぞれＤおよびＷである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９４番目に対応する番号のアミノ酸がＬまたはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９５番目に対応する番号のアミノ酸がＩ、Ｌ、Ｖ、またはＦであり、好ましくは、Ｉ、Ｌ、またはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９６番目に対応する番号のアミノ酸がＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９７番目に対応する番号のアミノ酸がＶまたはＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９８番目に対応する番号のアミノ酸がＰである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において９９番目に対応する番号のアミノ酸がＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１００番目に対応する番号のアミノ酸がＬ、ＭまたはＱである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１０３番目に対応するアミノ酸がＥまたはＤである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３３番目に対応するアミノ酸がＧである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３４番目に対応する番号のアミノ酸がＹまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３５番目に対応する番号のアミノ酸がＡ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＩまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３６番目に対応する番号のアミノ酸がＧまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１３７番目に対応するアミノ酸がＥである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９３番目に対応するアミノ酸がＷである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９４番目に対応するアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｃ、またはＦである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９５番目に対応するアミノ酸がＩ、Ｖ、Ｆ、またはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９６番目に対応するアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）において１９７番目に対応するアミノ酸がＰである。
　例えば、ある態様では、オプシンは、以下の条件群Ｃから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはすべてを満たし得る｛但し、上記において、配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１０９番目から１１２番目に対応する番号のアミノ酸が、ＲＡＩＡ、ＡＡＩＡ、ＡＡＡＴ、ＲＡＶＧ、ＫＶＡＧまたはＡＡＶＴではない｝：
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の８８番目に対応する番号のアミノ酸がＹ、Ｉ、ＡまたはＦである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９０番目に対応する番号のアミノ酸がＹである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９１番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、ＩまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９４番目に対応する番号のアミノ酸がＬまたはＶである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９５番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、Ｉ、ＦまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９７番目に対応する番号のアミノ酸がＶまたはＴである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９８番目に対応する番号のアミノ酸がＰである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９９番目に対応する番号のアミノ酸がＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１００番目に対応する番号のアミノ酸がＬ、ＱまたはＭである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３４番目に対応する番号のアミノ酸がＹまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３５番目に対応する番号のアミノ酸がＡ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＩまたはＬである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３６番目に対応する番号のアミノ酸がＧまたはＡである；
　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１９４番目から１９５番目に対応する番号のアミノ酸がＡＩ、ＡＶ、ＧＶ、ＦＬまたはＣＦである。上記条件群Ｃは、表１において平均値以上のプロトン輸送活性を有するオプシンが有し、平均未満のプロトン輸送活性を有するオプシンが有しないアミノ酸の条件群である。
　オプシンは、ｄＲおよびｐＲではない。
　ある態様では、オプシンは、配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１２１番目から１２４番目に相当するアミノ酸がそれぞれ、Ｒ／Ｋ、Ｌ、Ｘ、およびＩであり得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、条件群Ａからなる群から選択される１以上またはすべてを満たし得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、条件群Ｂからなる群から選択される１以上またはすべてを満たし得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上（または８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、条件群Ｃからなる群から選択される１以上またはすべてを満たし得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号４１のアミノ酸配列を有し得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号４２のアミノ酸配列を有し得る。
　ある態様では、オプシンは、配列番号４３のアミノ酸配列を有し得る。
　本発明によればまた、表１に示される単離されたオプシンは、ミトコンドリア局在化シグナルと連結されていてもよい。したがって、本発明によれば、ミトコンドリア局在化シグナルと連結した表１に示される単離されたオプシン、および当該オプシンをコードする遺伝子が提供される。ミトコンドリア局在化シグナルと連結されたオプシンは、真核細胞または真核生物において発現させると、ミトコンドリアに移行する。このようにして、ミトコンドリアで発現するロドプシンを有する真核細胞または真核生物を得ることができる。ミトコンドリアで発現したロドプシンは、ミトコンドリア内膜の内外でプロトン濃度勾配を形成し、ＡＴＰ合成を促進し得る。したがって、ミトコンドリア局在化シグナルと連結されたオプシンは、真核細胞または真核生物において発現させることに適している。ミトコンドリア局在化シグナルとしては、当業者に周知のものを用いることができ、例えば、ＡＬＡ合成酵素であるＨｅｍ１、Ｓ２ペプチド、またはオリゴアルギニン（例えば、オクタアルギニン）、ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　ＰＲＸ１、ピルベートデヒドロゲナーゼβサブユニット、ヒートショックタンパクＨＳＰ６０、ＡＴＰ合成酵素のγサブユニット、ＡＴＰ合成酵素のαサブユニット、シトクロムｃ酸化酵素のサブユニット２およびサブユニット４、サブユニット６、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ　ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｕｎｉｔ、ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　１　（ＣＩＴ１）、Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ　（ＩＬＶ２）、Ｋｅｔｏ　ｌ－ａｃｉｄ　ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｍｉｔｆｉｌｉｎ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ分解酵素（Ｓｕｅ）、などを用いることができる。ミトコンドリア局在化シグナルを有しなくても、ミトコンドリアでオプシンを翻訳させることによっても、オプシンをミトコンドリアに局在させ得る。例えば、トリプトファンのコドンを、ＴＡＡに変更するとこのようなオプシンはミトコンドリアでのみ翻訳され得る。ＴＧＡは、細胞質での翻訳においては終止コドンであり、ミトコンドリアでの翻訳においてはトリプトファンをコードする。ミトコンドリアでの終止コドンとしては、ＴＡＡを用いることができる。したがって、ある態様では、オプシンをコードする遺伝子は、トリプトファンをコードするコドンとしてＴＧＡを含み得る。
　宿主は、原核生物または真核生物であり得る。宿主はまた、単細胞生物または多細胞生物であり得る。宿主は、微生物であり得る。宿主は、光合成細胞または光合成生物であり得る。宿主は、非光合成細胞または非光合成生物であり得る。宿主はまた、細菌、古細菌（アーキア）、ラン藻（シアノバクテリア）および放線菌からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、大腸菌（例えば、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））、枯草菌（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、乳酸菌（例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、酢酸菌（例えば、アセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ））、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂａｃｔｅｒｉａ）、メタン生成菌（例えば、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、動物、植物、および菌類（真菌類）からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、酵母であり得る。宿主はある態様では、分裂酵母または出芽酵母であり得る。宿主はある態様では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）などのサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのキャンディダ属、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）などのキサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、およびエンドマイセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属からなる群から選択される酵母であり得る。宿主はある態様では、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），例えば，麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ），トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ），ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ），アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ），フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），ブラケスリア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ　ｔｒｉｓｐｏｒａ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来細胞）、線虫、カイコ、植物細胞、藻類（大型藻類、微細藻類）、植物（シロイヌナズナ、タバコ）、および哺乳類培養細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト細胞）からなる群から選択され得る。宿主はまた、藻類（大型藻類、微細藻類）であってもよい。これらの宿主に導入されるオプシンは外来性であり得る。宿主とオプシンは異種でありうる。動物は、非ヒトであり得る。宿主が原核生物の場合には、オプシンは細胞膜上に発現させ得る。宿主が真核生物の場合には、オプシンはミトコンドリア内膜上に発現させ得る。発現させる方法は、当業者に周知の技術を用い得る。
　宿主は、外来性のオプシンをコードする遺伝子に加えて、レチナール合成系の一連の酵素すべてを有していることができる。これによって、宿主がレチナールを自己合成できる場合、培地へのレチナールの添加量を低減することができる。宿主によるレチナールの合成量が十分である場合、培地にレチナールを添加しなくてもよい。宿主が、レチナール合成系の一連の酵素の一部を有しない場合、宿主が有しない当該酵素をコードする外来性の遺伝子を宿主に導入することができる。宿主が有しない当該酵素をコードする外来性の遺伝子は、制御配列に作動可能に連結されたものであり得、ベクター中の発現カセット内に導入される。宿主が、酵素を有するか否かは、生化学的な分析（例えば、ウェスタンブロット）、遺伝学的な分析（例えば、シークエンシング、またはＰＣＲ）により当業者であれば適宜決定することができる。
　ロドプシンを発現した宿主は、当該宿主に適した培養条件下で培養することができる。培養条件は、当業者であれば適宜決定することができるであろう。ロドプシンを発現した宿主は、光照射条件下で培養することができる。光照射下で培養することによって、ロドプシンを発現した宿主では、ＡＴＰ合成が促進され、光照射によりエネルギーが供給されることとなる。光照射は、ロドプシンが光を受容する程度の照射であれば特に限定されないが、例えば、０．０１μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以上、０．０２μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以上、０．０３μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以上、０．０４μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以上、または０．０５μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以上の強度とすることができる。光照射はまた、０．１μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．２μ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍｏｌｍ－２ｓ－１以下、０．３μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．４μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．５μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．６μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．７μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．８μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、０．９μ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍｏｌｍ－２ｓ－１以下、１．０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．１μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．２μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．３μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．４μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．５μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．６μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．７μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．８μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１．９μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、２μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、３μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、４μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、５μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、６μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、７μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、８μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、９μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１５μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、２０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、２０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、３０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、４０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、６０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、７０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、８０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、９０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１１０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１２０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１３０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１４０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１６０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１７０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１８０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１９０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、２００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、３００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、４００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、５００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、６００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、７００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、８００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、９００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１０００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、１５００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下、または２０００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１以下であり得る。照射する光は、電球（例えば、白熱電球、ハロゲン電球等）、蛍光灯、高圧放電ランプ、低圧放電ランプ、ＬＥＤ、ＥＬ、化学発光、生物発光および太陽光のいずれでもよく、例えば、３００～８００ｎｍ、４５０～６５０ｎｍ、例えば、５５０ｎｍの波長を含む光を用いることができる。光照射は、連続的に行われてもよく、間欠的に行われてもよい。
　光照射により宿主にエネルギーが提供されると、宿主は、エネルギー産生のために用いる炭素源の消費量を低減しうる。光照射により宿主にエネルギーが提供されると、宿主は、物質産生に関わる経路（例えば、ペントースリン酸経路等）で炭素源等の原料のより多くを用いることができるようになる。したがって、光照射により宿主は、物質産生に適した状態となる。そのため、宿主に炭素源等の原料を供給することによって、物質生産を好ましく行うことができる。
　ロドプシンを発現した微生物は、光照射条件下で低ｐＨ耐性、および／または高温耐性を示し得る。
　低ｐＨ耐性とは、宿主の能力（増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力）が低下するｐＨの低い環境下（例えば、ｐＨ５．０未満）において、非照射時と比較して、光照射条件下で、および／またはロドプシンの非発現時と比較して、発現条件下で、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、高まることを意味する。低ｐＨ耐性とは、例えば、酵母の場合、ｐＨ５．０未満、ｐＨ４．５以下、ｐＨ４．０以下、例えば、ｐＨ３．２～３．７（例えば、ｐＨ３．５）のｐＨ条件下において、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、非照射条件下および／またはロドプシン非発現条件下での対応する能力よりも高まることを意味する。ロドプシンを発現し、低ｐＨ耐性を備えた宿主は、低ｐＨ条件下においても好ましく培養し得る。低ｐＨ条件下では、他の混入微生物の増殖、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
　高温耐性とは、宿主の能力（増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力）が低下する高温環境下において、非照射時と比較して、光照射条件下で、および／またはロドプシンの非発現時と比較して、発現条件下で、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、高まることを意味する。高温耐性とは、例えば、酵母の場合、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、例えば、３４℃～３６℃（例えば、３５℃）またはそれ以上の条件下において、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、非照射条件下および／またはロドプシン非発現条件下での対応する能力よりも高まることを意味する。高温条件下では、他の混入微生物の増殖が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
　ロドプシンを発現した微生物は、光照射条件下で、低ｐＨ耐性および高温耐性を備え得る。この場合、ロドプシンを発現し、低ｐＨ耐性および高温耐性を備えた宿主は、低ｐＨおよび高温条件下において好ましく培養し得る。低ｐＨおよび高温条件下では、他の混入微生物の増殖、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
　物質生産は、上記条件下において、ロドプシンを発現する細胞または生物を培養することによって好ましく行われ得る。ロドプシンを発現する細胞または生物は、特定の物質の産生量を増大させるために、当該物質の産生に適した条件下で培養され得る。培養条件は、低ｐＨ条件下および高温条件下のいずれかまたは両方を満たし得る。特定の物質の産生量を増大させるためには、ロドプシンを発現する細胞または生物に対してさらなる改変を加えることが許容される。そのような改変としては、例えば、当該物質の産生経路に関する酵素を変異および／または導入する改変；当該物質の分解に関する酵素の破壊、発現量の低減、活性の欠失や低減；および／または競合する経路に関する酵素の破壊、発現量の低減、および／または活性の欠失や低減が挙げられる。
　物質生産により、産生される物質としては、例えば有機酸、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオシド、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、イソプレノイド類及び脂質などをあげることができる。より具体的には以下があげられる。有機酸としては、酢酸、乳酸、コハク酸、αーケト酸（２－オキソ酸）などをあげることができる。ペプチドとしてはグルタチオン、アラニルグルタミン、γグルタミルバリルグリシンなどをあげることができ、ポリペプチドとしては、ポリリジン、ポリグルタミン酸をあげることができる。アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－３－ヒドロキシプロリン、Ｌ－４－ヒドロキシプロリン、５－アミノレブリン酸などをあげることができる。タンパク質としては、ルシフェラーゼ、イノシンキナーゼ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　５－ｋｉｎａｓｅ　（ＥＣ　２．７．２．１１）、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ－５－ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＥＣ　１．２．１．４１）、Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ　（ＥＣ　１．５．１．２）、γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＥＣ　６．３．２．２）、グルタチオン合成酵素（ＥＣ　６．３．２．３）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、Ｐ４５０などをあげることができる。ヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸、アデニル酸などをあげることができる。ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができる。糖としては、キシロース、マンノースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトール、マンニトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができる。イソプレノイド類としては、メバロン酸（ＭＶＡ：Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）、イソプレノール、アスタキサンチン、イソプレン、イソペンテノール、リモネン、ピネン、ファルネセン、ビサボレンなどをあげることができる。脂質としては、プロピオン酸、ヒドロキシプロピオン酸、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）やＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。本発明における有用物質では、有機酸では酢酸、ペプチドではグルタチオン、イソプレノイド類ではメバロン酸、イソプレノール、脂質ではヒドロキシプロピオン酸が特に好適である。産生される物質としては、例えば、ＡＴＰ、グルタチオン、イソプレノイドが挙げられる。
実施例１：外来性ロドプシン発現細胞の作製
　入手した微生物のゲノム配列を用いたメタゲノム解析によりオプシン配列を４３種類取得した。宿主細胞としては大腸菌を用いた。大腸菌にオプシンを発現させるため、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ制限酵素配列を導入し、コドンを大腸菌に最適化した（表１参照）。ｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１ベクターにコドンを最適化したオプシンを導入し、大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を形質転換し、４３種類のロドプシンの１つを発現する大腸菌を得た。
　ロドプシン発現大腸菌をグリセロールストックまたはシングルコロニーから４　ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩１５０　ｒｐｍで振とうして増殖させ、これを前培養液とした。得られた前培養液を、１０　ｇ／Ｌグルコースを含むＭ９培地５０　ｍｌに初期ＯＤ６００　＝０．０５となるように接種し、振とう培養器（ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック、日本）内にて３７℃、１５０　ｒｐｍにて撹拌培養した。４時間後、２０μＭ　ＩＰＴＧおよび１０μＭオールトランスレチナール（以下、単に「レチナール」という）を加え３７℃、１５０　ｒｐｍにて引き続き撹拌培養した。
　本培養２４時間後、培養液を回収し、５，０００　ｇ、２５℃で１０分間遠心分離してロドプシン発現大腸菌を回収した。回収したロドプシン発現大腸菌を１００　ｍＭ　ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、ＯＤ ６００　＝　２となるように１００　ｍＭ　ＮａＣｌ溶液に懸濁した。ロドプシン発現大腸菌懸濁液に対し、３００　Ｗハロゲンプロジェクターランプ（ＪＣＤ１００Ｖ－３００Ｗ）を使用して、光を照射した。照射した光強度は、フォトアナライザーＬＡ－１０５（ＮＫシステム、大阪、日本）を用いて測定した。　ロドプシン発現大腸菌懸濁液のｐＨ変化の時間経過を、ＰＣに接続したｐＨメーター（Ｆ－７２、堀場、日本）を使用して記録した。ロドプシン発現大腸菌のプロトンポンプ活性は、ｐＨ変化の初期勾配から決定した。細胞あたりのプロトン輸送量はプロトンポンプ活性を乾燥菌体重量で除して求めた。なお、レチナールの供給をしない系では、プロトン輸送能は認められなかった。
　結果は、表１、図１および図２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　表１に示されるように、多くのロドプシンは、活性を示さないか、とても低い活性を示し、その平均値は、０．２７０　（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）であった。これに対して、表１、図１、および図２に示されるようにｄＲでは、０．８０６　（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）であり、ＯＰ１３では、１．８６５　（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）、ＯＰ１７では、１．０２２　（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）、ＯＰ２７では、１．４４７　（μｍｏｌ／ｇＤＣＷ／分）であった。ＯＰ１３、ＯＰ１７、およびＯＰ２７は、細胞に導入することで光依存的にプロトン排出する機能を有するロドプシンであり、従来知られたｄＲよりも高いプロトン排出速度を有するものであった。
　これらの特に高い活性を示したロドプシンのアミノ酸配列をアラインメントした。結果は図３Ａ～３Ｄに示される通りであった。図３Ａ～３Ｄに示されるように、ロドプシンがレチナールと結合する部位であるレチナールポケット（下線）においてアミノ酸配列における高い類似性を示した。これらのアミノ酸配列における重要なアミノ酸配列を条件群Ａ～Ｃとして抽出した。条件群Ａ～Ｃについては上記の通りである。
　上記に加えて、平均値を越えた活性を有するロドプシンとしては、表１に示されるように、ｄＲ、ＧＲ、ＯＰ１５、ＯＰ２０、ＯＰ２５、ＯＰ２６、ＯＰ３５、ＯＰ３８、およびＯＰ４２が確認され、高活性の有用なロドプシンであることが明らかとなった。そのうち、ｄＲ、ＧＲ、ＯＰ１５、ＯＰ３８は、平均値の２倍を超える活性を示した。これらのロドプシンは微生物に光依存的なプロトン輸送能を付与するものである。
　原核生物においては、細胞膜内外のプロトン濃度勾配は、ＦоＦ１ＡＴＰ合成酵素を駆動させ、細胞内におけるＡＴＰ合成の原動力となる。したがって、ロドプシン発現微生物は、光依存的にエネルギーを産生することができる能力を高めていることが理解される。
実施例２：細胞への外来性レチナール合成系の導入
　オプシンに組み込まれたオールトランスレチナールは光を受けると１３－シスーレチナールに異性化する。この過程において、ロドプシンは、プロトンを細胞内から細胞外へ放出し、細胞外ｐＨを低下させる。実施例１では、レチナールを培養液中に供給していたが、本実施例では、レチナール合成系を組込むことにより外部からのレチナールの供給がない場合でも光依存的なプロトン輸送能を発揮する微生物の作製を試みた。
　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２００７，　７３：　１３５５－６１に記載のｃｒｔプロモーター／オペロン（図４ＡのｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＹがｃｒｔプロモーター下に作動可能に連結している）を、ｐＤ８７４ベクター（ＡＴＵＭ）のＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてクローニングし、β－カロテン合成用プラスミドｐＤ８７４＿ＣｒｔＰ－ＥＢＩＹを構築した。Ｍｉｃｒｏｂ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔ．　２０１１，　１０：　５９に記載のメタゲノム配列の海洋細菌に由来するｂｌｈ遺伝子（６６Ａ０３）を大腸菌用にコドン最適化し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ、日本）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したｂｌｈ遺伝子をｐＤ８７４＿ＣｒｔＰ－ＥＢＩＹにサブクローニングし、レチナール自己合成用プラスミドｐＤ８７４＿ＣｒｔＰ－ＥＢＩＹ－ｂｌｈを得た。このｐＤ８７４＿ＣｒｔＰ－ＥＢＩＹ－ｂｌｈを用いてロドプシン発現大腸菌を形質転換し、レチナール自己合成ロドプシン発現大腸菌を得た。以下、ＡＴＲ（＋）は、外来性のレチナール合成系を組込んだ微生物を示し、ＡＴＲ（－）は、外来性のレチナール合成系を組込んでいない微生物を示す。
　レチナール自己合成ロドプシン発現大腸菌をグリセロールストックまたはシングルコロニーから４　ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩１５０　ｒｐｍで振とうして増殖させ、これを前培養液とした。前培養液を初期のＯＤ６００が０．１になるように４　ｇ／Ｌグルコースまたは２　ｇ／Ｌグリセロールを含むオートクレーブされたＭ９培地２０　ｍＬに接種し、２００　ｒｐｍ、３７℃にて培養した。明条件は　１００μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２　ｓ－１の白色ＬＥＤライトにて光照射し、暗条件はアルミ箔にて遮光して培養した。プラスミドを細胞内に保持するために、培養液にプラスミドを維持するための適切な抗生物質を適切な濃度添加した。
　図４Ｂに示されるように、得られた外来性のレチナール合成系を有する大腸菌（ＡＴＲ（＋）株）は、レチナールの添加の有無にかかわらず着色し、外来性のレチナール合成系を有しない大腸菌（ＡＴＲ（－）株）は、レチナール添加時のみ着色した。また、得られたレチナール自己合成ロドプシン発現大腸菌は、光に応答してプロトン輸送を行った（図４Ｃ）。これにより、外来性のレチナール合成系の導入が、ロドプシン発現微生物による光依存性プロトン輸送能の発現においてレチナールの外部からの添加を不要とすることが明らかとなった。本実施例では、大腸菌は、ｄＲ導入株（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＣＤＦＤｕｅｔ１－ｄＲ，　ｐＤ８７４－ＣｒｔＰ－ＥＢＩＹ－ｂｌｈ）を用いたが、他のロドプシンを導入した株を用いた場合も同様であることは明らかである。
　レチナールを添加した効果と、レチナールを添加せずに外来性のレチナール合成系を導入した効果とを比較した。結果は、図４Ｄに示される通りであった。図４Ｄに示されるように、ＡＴＲ（＋）株では、外部からレチナールを添加したＡＴＲ（－）株に匹敵するプロトン輸送能を示した。
　実施例１および２では、光依存的にエネルギー産生が可能な細胞を作製した。このような細胞では、エネルギー産生のための炭素源消費量が減少すると考えられ、したがって、より多くの炭素源を物質産生に用いることができる。
実施例３：ロドプシン発現細胞による物質生産
　本実施例では、ロドプシン発現細胞による物質生産を試みた。
　レチナール自己合成ロドプシン（ＯＰ１３）発現大腸菌をグリセロールストックまたはシングルコロニーから４　ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩２００　ｒｐｍで振とうして増殖させ、これを前培養液とした。前培養液を初期のＯＤ６００が０．１になるように０．２％グリセロールを含むオートクレーブされたＭ９培地２０　ｍＬに接種し、２００　ｒｐｍ、３７℃にて培養した（ｎ＝３）。明条件は　５０μｍｏｌ　ｍ－２　ｓ－１の白色ＬＥＤライトにて光照射し、暗条件はアルミ箔にて遮光して培養した。プラスミドを細胞内に保持するために、培養液に適切な抗生物質を適切な濃度添加した。培養物のサンプリングは、培養１８時間後、２３時間後、４２時間後および６９時間後に行い、得られたサンプルのｐＨとＯＤ６００を測定した。
　７，０００　ｘ　ｇで２分間遠心分離して、サンプリングにより回収した培養液から細胞を分離した。細胞を５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ　８．０）に懸濁し、細胞破壊装置（Ｓｈａｋｅ　Ｍａｓｔｅｒ　ＮＥＯ、Ｂｉｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５００　ｒｐｍで１０分間破壊し、１６，０００　ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心分離して細胞破片を除去した。細胞抽出液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度を、Ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、２００９に記載の５、５’－ジチオビス（２－ニトロベンゾン酸）－グルタチオンレダクターゼサイクリングアッセイ法を用いて測定した。細胞あたりグルタチオン産生量はグルタチオン濃度を細胞濃度で除して求めた。
　細胞内ＡＴＰ濃度は、Ｈａｒａ　２００６；Ｈａｒａ　２００９に記載のルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ法を次のように変更して用い測定した。５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．３μｇ／　ｍｌルシフェラーゼ、０．５　ｍＭ　Ｄ－ルシフェリン、２　ｍＭ　ＤＴＴ、１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４、および０．２　Ｍ　ＥＤＴＡを含む１５０μｌのアッセイ混合物を作製し、５０μｌの細胞に加えた。発光はＧｅｎｅ　ｌｉｇｈｔ　ＧＬ－２１０Ｓシリーズ（マイクロテックニチオン）を用いて測定した。
レチナール自己合成ロドプシン発現大腸菌の培養液中の炭素源の測定は以下の通りに行った。培養液中の炭素源であるグリセロールとグルコースの濃度は、培養の適切な時間で、培養液を回収し、遠心分離を行い沈殿を除去し、市販のＦ－Ｋｉｔグリセロール（Ｊ．Ｋ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｊａｐａｎ）およびＧｌｕｃｏｓｅＣ－ＩＩｔｅｓｔＫｉｔ（和光純薬）を用いて測定した。
　結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、ＯＤ６００は、明条件および暗条件で共に良好な増加を示した。図５に示されるように、グリセロール含量は、明条件および暗条件共に同様な減少速度を示したが暗条件において消費が早い傾向が示された。また、図５に示されるように、グリセロールが枯渇した４２時間後の後において、ロドプシン発現細胞は、非発現細胞よりもＯＤ値の上昇速度が高かった。グルタチオン産生量は、図５に示されるように、明条件下において暗条件よりも統計学的に有意に増加した。培養液のｐＨ（細胞外のｐＨ；プロトン排出能が高いほどｐＨが低下する）は、明条件下において暗条件下よりも統計学的に有意に低下した。細胞内ＡＴＰ濃度は、明条件および暗条件での差は認められなかった。ロドプシン発現細胞ではＡＴＰ産生量と共に消費量が増加し、ターンオーバーが速まった結果であると考えられる。
　このことから、ロドプシン発現細胞は、光依存的にエネルギーを産生し、プロトンを細胞外に排出して細胞膜にｐＨ濃度勾配を形成すると共に、グルタチオン産生量を増大させた。光エネルギーをグルタチオン産生に転換させたと考えられる。
　さらにイソプレノールの産生を試みた。サッカロミセス・セレビシエからのメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むｐＭｅｖＢプラスミドを用いて大腸菌を形質転換した（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　２００３）。ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含むｎｕｄＦのＤＮＡ断片を枯草菌ゲノムから増幅した。増幅ＤＮＡはＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化され、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－ｍｖａＥＳのマルチクローニングサイトに挿入された。　得られたｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－ｍｖａＥＳ－ｎｕｄＦとｐＭｅｖＢを用いてｄＲ発現大腸菌、ＯＰ１３発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌を形質転換し、ｄＲ発現イソプレノール生産大腸菌、ＯＰ１３発現イソプレノール生産大腸菌、ＯＰ２７発現イソプレノール生産大腸菌をそれぞれ得た。
　ロドプシン発現イソプレノール生産大腸菌をグリセロールストックまたはシングルコロニーから４　ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩１５０ｒｐｍで振とうして増殖させ、これを前培養液とした。ロドプシン発現イソプレノール生産大腸菌の前培養液をオートクレーブ滅菌したＬＢ培地１００ｍＬに初期ＯＤ６００＝０．０５となるように接種し、振とう培養器（ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック、日本）内にて１６５ｒｐｍ、３７℃にて培養した。１８時間後、７，０００×ｇ、２５℃で４分間遠心分離してロドプシン発現イソプレノール生産大腸菌を回収し、グルコースを含まないＭ９培地で洗浄した。洗浄したロドプシン発現イソプレノール生産大腸菌を、８ｇ／Ｌグルコースを含むＭ９培地２０ｍＬに、初期ＯＤ６００＝５となるように接種し、振とう培養器内にて１６５ｒｐｍ、３７℃にて培養した。明条件は、培養１時間後に５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１の白色ＬＥＤライトを照射し、暗条件はアルミ箔にて遮光して培養した。明条件、暗条件の両方で、培養３時間後に終濃度が５μＭになるようにオールトランスレチナールを培養液に添加した。
　ロドプシン発現イソプレノール生産大腸菌を本培養後１５，０００　ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離した。イソプレノールの濃度は、Ｓｔａｂｉｌｗａｘカラム（Ｒｅｓｔｅｋ、米国）を備えたガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）とｆｌａｍｅ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ検出器を使用して測定した。
　その結果、暗条件下で培養した細胞では、イソプレノール濃度が０．５ｍＭ弱であったのに対して、明条件下で培養した細胞では、イソプレノール濃度は０．６ｍＭ程度に増加した。
実施例４：ロドプシン発現真核細胞の作製
　上記実施例では、細胞として原核生物（その代表として大腸菌）にロドプシンを発現させた。本実施例では、真核生物（その代表として酵母）にロドプシンを発現させた。
　ロドプシンは、ミトコンドリア局在下シグナルと連結して酵母に導入した。具体的には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのミトコンドリア局在化シグナルとして、ＡＬＡ合成酵素ＨｅｍＩをコードする核酸（ＤＮＡ）をＮ末端に結合したＲｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．由来のロドプシン（ＯＰ１３）をコードする核酸を出芽酵母にコドン最適化して合成した。この合成ＯＰ１３遺伝子をｐＧＫ４２６ベクターに導入し、ｐＫ４２６－ＨｅｍＩ－ＯＰ１３を作製した。酢酸リチウム法によりｐＫ４２６－ＨｅｍＩ－ＯＰ１３を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ２０１３８８）株を形質転換した。コントロールとしては、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＢＹ４７４１株にｐＧＫ４２６ベクターを導入した株を用いた。使用直前まで－８０℃でグリセロールストックとして保存した。得られたＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＢＹ４７４１形質転換体およびコントロールを各々「ＯＰ１３発現酵母」、「コントロール酵母」という。
　ロドプシン発現酵母の培養は以下のように行った。ロドプシン発現酵母およびコントロール酵母をグリセロールストックから合成デキストロース（ＳＤ）（Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔを添加）培地プレートに３０℃で３日間静置培養し、出現したコロニーを、３つピックアップしてＹＰＤ培地５　ｍＬで１７５　ｒｐｍで３０℃で一晩、前培養した。前培養したＯＰ１３発現酵母およびコントロール酵母をアミノ酸および１０　μＭオールトランスレチナールを含むＳＤ培地２０　ｍＬに初期ＯＤ６００が０．１５となるように植菌した。本培養液は、クエン酸－リン酸バッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ　１９２１）でｐＨを３．５または５に調整したＳＤ培地を用いた。培地には、１０μＭのオールトランスレチナールを添加した。以下真核細胞の実験はすべて同様である。ＬＣ－ＬＥＤ　４５０Ｗ（ＴＡＩＴＥＣ、日本）によって±５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１光照射を用いて、振とう培養器で１７５　ｒｐｍ、３０℃にて培養した。
　ロドプシン発現酵母およびコントロール酵母を適切な時間培養後に回収した。培養液中のグルコース濃度および細胞あたりグルタチオン産生量およびＡＴＰ含有量の測定は大腸菌と同様に行った。各実験条件に対して実験を３回繰り返した。
　結果は図６に示される通りであった。図６に示されるように、光強度５０μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ　ｍ－２ｓ－１（Ｅ）の照射条件下で、細胞の増殖速度は、ｐＨの相違およびＯＰ１３の挿入の有無による影響は認められなかった。培地中のグルコース残量を経時的に測定するとともに、図６に示されるように、グルタチオンの産生量は、ＯＰ１３導入株においてコントロール（Ｃｏｎ）よりも高かった。グルタチオン濃度は、培養開始２４時間でピークを示し、その後、減少しているが、ＳＤ培地中では、酵母がグルタチオンを代謝することによると考えられる。
　上記結果を表にまとめると以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記表２および３に示されるように、ロドプシン（ＯＰ１３）を発現させるとグルタチオンの産生量が向上し、対糖収率も向上することが明らかとなった。グルタチオン産生量と対糖収率の向上の効果は、ｐＨ３．５の条件下においても奏された。雑菌の混入や増殖を防ぐには、ｐＨを低下させることは一つの有効な手法となり得るが、その際に用いられるｐＨ３．５の条件下においても、ロドプシンの発現は、物質生産の向上や対糖収率の向上の効果を奏することが示された。
　上記の実験を、光強度を０．０５μＥとした以外は、同一の条件で行った。結果は、図７に示される通りであった。グルタチオン産生量については、以下表の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４に示されるように、光強度を１／１００に低下させた場合であっても、ロドプシン導入による物質産生の増加効果が確認された。
　さらに、ロドプシン発現酵母の温度耐性および低ｐＨ耐性をさらに調べた。ロドプシンとしてはｄＲを用いる以外は、上記と同様に実験を行った。
　図８に示されるように、ロドプシンを導入した酵母（白いバー）は、ｐＨが低下した場合に、導入しなかった酵母（グレーのバー）と比較して高いＯＤ６００（細胞濃度）を達成した（左上パネル参照）。また、図８に示されるように、培養温度を上昇させると、いずれの酵母も増殖能が低下したが、ロドプシンを導入した酵母（白いバー）において、導入しなかった酵母（グレーのバー）に対する増殖能の向上は認められなかった（右上パネル参照）。一方で、細胞内ＡＴＰ濃度に関しては、低ｐＨ条件（左中パネル参照）においても、高温（右中パネル参照）においても、ロドプシンを導入した酵母（白いバー）は、導入しなかった酵母（グレーのバー）と比較して高かった。細胞あたりグルタチオン産生量も同様であり、低ｐＨ条件（左下パネル参照）においても、高温（右下パネル参照）においても、ロドプシンを導入した酵母（白いバー）は、導入しなかった酵母（グレーのバー）と比較して高かった。
　このように、真核細胞においても、ロドプシンの導入と光照射は、細胞のｐＨ耐性を増加させ、低ｐＨ条件下におけるエネルギー産生と物質産生を増加させることが明らかとなった。また、真核細胞においても、ロドプシンの導入と光照射は、高温条件下においても、エネルギー産生と物質産生を増加させることが明らかとなった。
　上記をｐＨ条件を変えてさらに追加試験した。ｐＨは、３．５と６．０とし、ロドプシンの導入の有無との関係を調べた。図９に示されるように、ｐＨが低い場合（ｐＨ３．５）に、ロドプシンを導入した酵母（＋）において、導入しなかった酵母（－）よりも高いＯＤ６００（細胞濃度）を達成した（左上パネル参照）。培地中のグルコースは、ｐＨが低い場合（ｐＨ３．５）に、ロドプシンを導入した酵母（＋）において、最も消費が早く、ｐＨが低くロドプシンを導入しなかった酵母（－）、そして、ｐＨの高い条件の順となった。ＡＴＰおよびグルタチオン（ＧＳＨ）の合成に関しては、低ｐＨ条件下でも、ロドプシンを導入した酵母において顕著に増加した（下の３つのパネル）。その効果は、培養時間が長くなると特に顕著であった（４８時間および７２時間参照）。
　さらに温度条件を変えてさらに追加試験した。ｐＨは６とし、温度条件を図示された条件とする以外は上記条件で、培養開始２４時間後にロドプシンの導入有無と温度変化との関係を調べた。図１０に示されるように、その結果、ロドプシン導入群では、高い温度において特にグルコースの消費量が減少し、細胞内ＡＴＰ濃度の増大およびグルタチオン産生量の増大を認めた。
　図１０におけるデータから対糖収率を算出した。対糖収率は、グルコース１ｇあたりのグルタチオン産生量（ｍｇ）とした。結果は、下記表５に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５に示されるように、ロドプシン導入株（Ｒｈｏｄ　（＋））では、導入していない株（Ｒｈｏｄ　（－））と比較して、グルタチオンの対糖収率が顕著に向上した。このことから、ロドプシンの導入は、細胞の低ｐＨ耐性を高め、高温耐性を高め、物質生産能を高め、糖消費量を低減し、対糖収率を高める効果を奏することが示された。
　このロドプシンの能力は、真核細胞においても原核細胞においても、ロドプシンによるプロトン排出速度（すなわち、ＡＴＰ産生能）と関連していると考えられる。したがって、表１に示されるプロトン排出活性を有するロドプシンを外来的に発現させることによって、細胞に上記機能の少なくとも１つを与えることができ、オプシンはプロトン輸送能が高いほど有用であると考えられる。
　さらに、発酵産業でよく用いられる麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅにＯＰ１３を発現させた。得られたＯＰ１３発現株とベクターのみを発現させた陰性対照株を、麹菌の培養に一般的に用いられる培地を用いて光照射条件下にて培養した。
　具体的には麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＮＳ４　ΔｌｉｇＤを用いた（Ｍｉｚｕｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｕｎｇａｌ　Ｇｅｎｅｔ．　Ｂｉｏｌ．，　４５：８７８－８８９，　２００８参照）。ΔｌｉｇＤは、ゲノムへの非特異的導入遺伝子の挿入を回避するための非相同組換えに関与するリガーゼの破壊に関する。ＯＰ１３の発現ベクターとしては、ｐＵＮＤベクターを用いた。陰性対照群では、ｐＵＮＤの空ベクターを用いた。麹菌を培養するための培地は、Ｃｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ液体培地とした。Ｃｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ液体培地は、１Ｌあたりに、２０ｇグルコース、６ｇ　ＮａＮＯ３、１．５２ｇ　ＫＨ２ＰＯ４、０．５２ｇ　ＫＣｌ、１　ｍＬの２Ｍ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　（終濃度２　ｍＭ）、１　ｍＬ　微量元素を含む培地である。微量元素は、１Ｌあたりに、８．５ｇ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇ　Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ　（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを含む溶液として提供された。
　麹菌へのベクターの形質転換は以下の通り行われた。
１Ａ）菌体を白金耳でかき取り、５００　ｍＬ容バッフル付三角フラスコ内の５００　ｍＬの滅菌Ｄｐｙ（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％イーストエクストラクト、０．５％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）液体培地に植菌し懸濁後、１８－２４時間、３０℃、１２０－１５０　ｒｐｍで振盪培養した。
２Ａ）培養後の菌体をミラクロスを用いてろ過し、滅菌水で洗浄後、滅菌済Ｌ字管内のＴＦ溶液１に懸濁し、３時間、３０℃、５０　ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪しプロトプラストを形成させた。
３Ａ）非特許文献２（五味勝也『麹菌の形質転換方法と宿主・ベクター系』農芸化学会誌１９９７年７１巻１０号１０１３－１０１７ページ）に記載のプロトプラスト－ＰＥＧ法を用いて形質転換株の胞子を得た。培養は以下の通り行われた。
５０ｍＬ容　三角フラスコ（羽無し）に上記のＣｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ液体培地を５ｍＬ入れて反復振とう（１２０ｒｐｍ）、４０℃の条件下で７日間（１６８時間）培養した。具体的には、
１Ｂ）５ｍＬの液体培地に各形質転換株の胞子を７．５μＬ（ＯＤ６００＝２５の濃度に調製）添加した。
２Ｂ）全て暗条件にて７２時間培養した。その間、２４時間と４８時間の時点でオールトランスレチナールを含むエタノール溶液（７ｍＭ）を７．５μＬずつ添加した。
３Ｂ）その後、５０μＥ光照射条件にて４０℃で培養した。
４Ｂ）１６８時間後、菌体を回収し、細胞量を測定すると共に、脂肪酸抽出し、総脂肪酸生産量を測定した。
　結果は図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、ＯＰ１３発現株では、ベクターコントロール株と比較して、総脂肪酸生産量（ｍｇ／Ｌ）が約１．６５倍に増加した。脂肪酸合成が増強される場合、脂肪酸合成のためにアセチルＣｏＡが消費されるためにＴＣＡ回路に対するアセチルＣｏＡの供給が低下し、細胞増殖に悪影響を与える可能性が考えられた。しかしながら、図１１に示されるように、細胞濃度は、ＯＰ１３導入株では減少せず、むしろ増加する傾向を示した。このことから、オプシンの強制発現は、物質生産中の細胞の増殖能を改善、回復、または増加させることができ、結果として、総バイオマス量と産生物質量の向上に寄与するものと考えられた。

Claims (12)

  1. 　原核生物のオプシンであって、オプシンは、以下の条件群Ｃから選択される１以上またはすべてを満たし得るオプシンのタンパク質｛但し、デルタロドプシンおよびプロテオロドプシンではない｝：
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の８８番目に対応する番号のアミノ酸がＹ、Ｉ、ＡまたはＦである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９０番目に対応する番号のアミノ酸がＹである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９１番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、ＩまたはＡである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９４番目に対応する番号のアミノ酸がＬまたはＶである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９５番目に対応する番号のアミノ酸がＶ、Ｉ、ＦまたはＬである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９７番目に対応する番号のアミノ酸がＶまたはＴである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９８番目に対応する番号のアミノ酸がＰである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の９９番目に対応する番号のアミノ酸がＬである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１００番目に対応する番号のアミノ酸がＬ、ＱまたはＭである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３４番目に対応する番号のアミノ酸がＹまたはＡである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３５番目に対応する番号のアミノ酸がＡ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＩまたはＬである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１３６番目に対応する番号のアミノ酸がＧまたはＡである；
    　配列番号９に記載のアミノ酸配列（ＯＰ１３）の１９４番目から１９５番目に対応する番号のアミノ酸がＡＩ、ＡＶ、ＧＶ、ＦＬまたはＣＦである。
  2. 　オプシンであって、
    （１）配列番号２、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３４、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または
    （２）上記アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のオプシン｛但し、ｄＲおよびｐＲではない｝。
  3. 　請求項１に記載のオプシンであって、配列番号４１～４３のいずれかのアミノ酸配列を有する、オプシン。
  4. 　Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ　ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＫＡ３４、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　６６Ａ０３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＭｅｄｅＢＡＣ３５Ｃ０６、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＨＦ１０１９Ｐ１９、およびＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ　ｔｏｒｑｕｉｓからなる群から選択される少なくとも１つの種に由来する、請求項１または２に記載のオプシン。
  5. 　Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ　ｓｐ．、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　ＳＫＡ３４、およびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群から選択される少なくとも１つの種に由来する、請求項４に記載のオプシン。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のオプシンをコードする遺伝子、または当該遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる機能的なオプシンをコードする遺伝子。
  7. 　制御配列に作動可能に連結した外来性のオプシンをコードする遺伝子を含み、
    　外来性のオプシンをコードする遺伝子は、請求項６に記載の遺伝子でであり、
    　細胞が原核生物の細胞である場合、オプシンは少なくとも細胞膜に発現しており、
    　細胞が真核生物の細胞である場合、オプシンは少なくともミトコンドリア内膜に発現している、
    細胞。
  8. 　細胞が、放線菌、糸状菌、微細藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される原核生物の細胞である、請求項７に記載の細胞。
  9. 　細胞が、動物、植物、および真菌からなる群から選択される真核生物の細胞である、請求項７に記載の細胞。
  10. 　レチナール合成系をコードする一連の遺伝子をさらに有する、請求項７～９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 　細胞の培養方法であって、
    　制御配列に作動可能に連結した外来性のオプシンをコードする遺伝子を含む細胞を提供することと、ここで、外来性のオプシンをコードする遺伝子は、請求項６に記載の遺伝子であり、
    　光照射条件下で当該細胞を培養することを含む、方法。
  12. 　前記培養が、ｐＨ５より低いｐＨ条件、および３０度を超える温度条件からなる群から選択される何れかまたは両方を満たす条件下で行われる、請求項１１に記載の培養方法。

     
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