JP6985282B2 - ７型コラーゲンの精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、７型コラーゲンを捕捉及び精製するための方法、並びに、ヒトへの投与に使用可能な精製７型コラーゲンなどの精製７型コラーゲンを含んでなる組成物に関する。

７型コラーゲン（「Ｃ７」）は、皮膚を強化及び安定化する機能を果たす構造タンパク質であり、かつ、皮膚の最上層である表皮を下層にある真皮に繋ぎ留めるのを助ける係留線維の主成分である。Ｃ７モノマーは、１個のＮＣ‐１結合ドメイン及び１個のＮＣ‐２結合ドメインを含有しているおよそ９００ｋＤａのホモ三量体として集合する。ホモ三量体はαらせんコイルを介して結び付いている。ホモ三量体から、これらのＣ７タンパク質前駆物質は整列し、１．８ｍＤａへの分子量増大を伴って逆平行の二量体となる。逆平行の二量体が横方向に集合すると、係留線維（長さ約８００ｎｍ）の形成をもたらす。

表皮水疱症（ＥＢ）は、皮膚を極めて脆弱とし、かつ容易に水疱を生じさせる一連の遺伝子疾患である。水疱及び皮膚びらんは、擦れること又は掻くことのような、軽微な外傷又は摩擦に反応して形成する。栄養障害性表皮水疱症（ＤＥＢ）は表皮水疱症の主要な形態のうちの１つである。この疾患の徴候及び症候は罹患者の間で広く多様である。軽度の症例では、水疱形成は主として手、足、膝、及び肘に現れる可能性がある。この疾患の重篤な症例には、失明、容姿の変貌、及びその他の深刻な医学的問題をもたらす可能性のある、広範囲の水疱形成を伴う。栄養障害性表皮水疱症は、３つの主要な型すなわち：劣性栄養障害性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、非アロポー・シーメンス型（非ＨＳ ＲＤＥＢ）、及び常染色体優性型（ＤＤＥＢ）に分類することが可能である。これらの型は重篤度において異なるが、その特徴は著しく重複しており、かついずれもタンパク質である７型コラーゲンをコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。

Ｃ７ホモ三量体はさらに、ペプシンを使用した羊膜の可溶化によって精製することが可能である［２］。可溶化されたコラーゲンは分別塩析によって部分的に分画されるが、この場合Ｃ７は５型コラーゲン（「Ｃ５」）とともに共沈する。Ｃ５からのＣ７の分離は、ＣＭセルロースクロマトグラフィ、その後のＤＥＡセルロースクロマトグラフィによる夾雑プロテオグリカンの除去によって遂行可能である。この生成物は、日常的な実験室での使用には十分な純度である。さらなる精製が必要な場合、純粋な天然構造物を分離用速度沈降法によって得ることが可能である。純粋な変性α鎖は、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィの後に得ることが可能である。

ｒＣ７は、硫酸アンモニウムを用いた沈澱生成とその後の陰イオン交換クロマトグラフィによって実験室規模で精製されている［２］。しかしながら、この精製方法の収率及び純度は、治療目的のｒＣ７の工業規模での精製には十分ではない。ｒＣ７の工業規模での精製方法を開発しようとする過去の試みは、僅かに約１％の全収率しか有していなかった。

概要
本開示は、精製ｒＣ７を調製する方法を提供する。これらの精製方法は、従来の方法を超えてｒＣ７の収率を著しく高め、かつヒトへの投与に使用しうる高純度の工業規模のｒＣ７組成物を調製するために使用可能である。

１つの態様では、本開示は、細胞培養上清からｒＣ７を収集及び濃縮して未精製バルク液体（任意選択で凍結される）にするための捕捉プロセス（「上流の処理」）に関する。別の態様では、本開示は、未精製バルク液体中のｒＣ７を精製するためのプロセス（「下流の処理」）に関する。さらに、ヒトへの投与に適した精製７型コラーゲンを得るために上流及び下流の処理のステップを組み合わせることも可能である。ある実施形態では、捕捉方法及び精製方法は工業規模の方法である。

上流の処理は、清澄化ステップ（例えばデプスフィルタ）及び濃縮／バッファー交換のステップを包含している。上流の処理について、１つの実施形態は、細胞培養から生産された組換えヒト７型コラーゲンを捕捉する方法であって：
ａ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、ステップ；
ｂ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップ；
ｃ）ステップｂ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、ステップ；
ｄ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップ（ｂ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、ステップ；
ｅ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップ；
ｆ）組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップ；並びに
ｇ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップ
を含んでなる方法に関する。

ある実施形態では、方法は、ステップａ）の前に：
ａ）組換えヒト７型コラーゲンを生産する宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）培養された宿主細胞から上清を採取するステップ
をさらに含んでなる。

ある実施形態では、未精製バルク液体は、清澄化された上清中の組換え７型コラーゲンのうち４０〜８０％を含有する。１つの実施形態では、未精製バルク液体は、清澄化された上清中の組換え７型コラーゲンのうち平均で約６０％を含有する。

ある実施形態では、細胞培養は、少なくとも２００リットル、好適には少なくとも１５００リットルの量を用いてバイオリアクタ中で宿主細胞を培養することを含んでなる。ある実施形態では、バイオリアクタは灌流バイオリアクタ又は流加培養式バイオリアクタである。

ある実施形態では、未精製バルク液体は５０グラムを上回る組換えヒト７型コラーゲンを含有する。
ある実施形態では、可溶化剤は、尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸（glutamic）、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含んでなる。１つの実施形態では、可溶化剤はアルギニンを含んでなる。

下流の処理については、１つの実施形態は、組換えヒト７型コラーゲンを精製する方法であって：
ａ）組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料を、混合モードのフロースルー式樹脂に供するステップであって、混合モードのフロースルー式樹脂はリガンド活性化コア及び不活性シェルを含んでなり、不活性シェルは組換えヒト７型コラーゲンがリガンド活性化コアに入るのを防止し、かつ十分に小さい不純物は不活性シェルを通り抜けてリガンド活性化コアに結合する、ステップ；
ｂ）混合モードのフロースルー式樹脂を通り抜け、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含有する、第１の流出液を収集するステップ；
ｃ）ステップｂ）からの第１の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンが陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に結合することを可能にする条件下で陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に供するステップ；
ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂から組換えヒト７型コラーゲンを溶出させるステップ；
ｅ）ステップｄ）からの溶出した組換えヒト７型コラーゲンを、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂に供し、疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂を通り抜ける第２の流出液を収集するステップ；
ｆ）ステップｅ）の第２の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンを濃縮するために限外濾過ステップに供するステップ；
ｇ）ステップｆ）からの濃縮された組換えヒト７型コラーゲンを、バッファーを用いて透析濾過するステップ；並びに
ｈ）精製された組換えヒト７型コラーゲンを回収するステップ
を含んでなり、
１以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを含んでなる方法に関する。

ある実施形態では、限外濾過ステップは接線流フィルタを含んでなり、接線流フィルタは親水性膜を含んでなる。
ある実施形態では、方法は、ステップｆ）に先立ち、ステップｅ）からの第２の流出液に可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方を添加するステップをさらに含んでなる。

ある実施形態では、１以上のウイルス低減ステップは、ステップａ）に先立ち組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料に放射線照射する（例えばＵＶ照射）ステップ、ステップｂ）からの第１の流出液に界面活性剤を添加するステップ、及びステップｅ）からの第２の流出液を多孔質フィルタに供するステップ、を含んでなる。１つの実施形態では、多孔質フィルタは３５ｎｍの平均径を有する複数の細孔を含んでなる。

ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ処理ステップは、ステップｄ）からの溶出された組換えヒト７型コラーゲンを、エンドヌクレアーゼで処理することを含んでなる。
ある実施形態では、バッファーは、少なくとも１つの塩、可溶化剤、及び糖質を含んでなる。

ある実施形態では、少なくとも１つの塩は、塩化ナトリウム、クエン酸塩、及びリン酸ナトリウムのうち１以上であり、可溶化剤はアルギニンであり、糖質はスクロースである。

ある実施形態では、ステップｈ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、ステップａ）からの試料中の組換えヒト７型コラーゲンの量の平均１５〜３０％を含有する。
ある実施形態では、ステップａ）における試料は少なくとも２５グラムの組換えヒト７型コラーゲンを含有する。

ある実施形態では、少なくとも４．０グラムの精製された組換えヒト７型コラーゲンがステップｈ）において回収される。
ある実施形態では、ステップｈ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞タンパク質を組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり２０００ｎｇ以下、好適には１０００ｎｇ／ｍｇ以下、及びより好適には６００ｎｇ／ｍｇ以下しか含有しない。

ある実施形態では、ステップｈ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞ＤＮＡを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり４２ｐｇ以下、好適には２５ｐｇ／ｍｇ以下、及びより好適には１５ｐｇ／ｍｇ以下しか含有しない。

ある実施形態では、ステップｈ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、エンドトキシンを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり１．０ＥＵ／ｍｇ以下、好適には０．７０ＥＵ／ｍｇ以下、及びより好適には０．５０ＥＵ／ｍｇ以下しか含有しない。

ある実施形態では、方法は、ステップａ）の前に：
ａ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、ステップ；
ｂ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップ；
ｃ）ステップｂ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、ステップ；
ｄ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップ（ｂ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、ステップ；
ｅ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップ；
ｆ）組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップ；並びに
ｇ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップ
をさらに含んでなる。

ある実施形態では、可溶化剤は、尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸（glutamic）、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含んでなる。１つの実施形態では、可溶化剤はアルギニンを含んでなる。

別の態様は、本明細書中に記載された方法によって得られた精製ｒＣ７組成物に関する。精製ｒＣ７組成物は、ヒトでの使用に適していることが好ましい。ある実施形態では、ｒＣ７組成物は：
＊１ｍｇのｒＣ７あたり２０００ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質、好適には１０００ｎｇ／ｍｇ以下、及びより好適には６００ｎｇ／ｍｇ以下；
＊１ｍｇのｒＣ７あたり４２ｐｇ以下の宿主細胞ＤＮＡ、好適には２５ｐｇ／ｍｇ以下、及びより好適には１５ｐｇ／ｍｇ以下；
並びに／又は
＊１ｍｇのｒＣ７あたり１．０ＥＵ／ｍｇ以下のエンドトキシン、好適には０．７０ＥＵ／ｍｇ以下、及びより好適には０．５０ＥＵ／ｍｇ以下
しか含有しない。

前述の全般的な概要及び以降の詳細な説明はいずれも例示にすぎず、本開示を限定するものではない。
本明細書に組み込まれかつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、ある特定の実施形態を例証しており、かつ文書での記述と共に、本明細書中に開示された組成物及び方法のある一定の法則について説明する役割を果たす。

ｒＣ７を採取し、清澄化し、かつ濃縮（ＵＦ／ＤＦ）して未精製バルク液体とするための一般的な上流プロセスの１つの実施形態を示しているフローチャート。 ｒＣ７を採取し、清澄化し、かつ濃縮（ＵＦ／ＤＦ）して未精製バルク液体とするための具体的な上流プロセスの１つの実施形態を示しているフローチャート。 ｒＣ７を、混合モードのフロースルー式樹脂に供し、その後陽イオン交換クロマトグラフィ、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂、及び最終のＵＦ／ＤＦステップに供することによりｒＣ７を精製するための、一般的な下流プロセスの実施形態を示しているフローチャート。 清澄化及びＵＦ／ＤＦステップ（上流プロセス）の後の、第１回及び第２回の生産実行の採取物（各実行回につき２０日分の１日採取物の合計）から得られた未精製バルク（ＵＰＢ）中のｒＣ７回収率（％）を示す図。試験的実行からの平均のｒＣ７の歩留まり（並びに最大値及び最小値）も提示されている。 清澄化及びＵＦ／ＤＦステップ（上流プロセス）の後の、第１回及び第２回の生産実行の採取物（２０日分の１日採取物の合計）から得られた未精製バルク（ＵＰＢ）中のｒＣ７／宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を示す図。試験的実行からの平均のｒＣ７／ＨＣＰ比（並びに最大値及び最小値）も提示されている。 ｒＣ７精製方法（下流プロセス）の１つの実施形態を示す図。

詳細な説明
１．定義
本発明のより容易な理解のために、ある特定の用語については最初に以下に定義する。以降の用語及びその他の用語のさらなる定義は本明細中の各所に明記されている。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（a ）」、「１つの（an）」及び「その（the ）」は、文脈がそうでないことを明らかに示していないかぎり、複数の参照物を含む。よって、例えば、「方法（a method）」への言及は、１以上の方法、並びに／又は、本明細書中に記載されている種類及び本開示その他を読めば当業者には明白になるであろう種類のうち少なくともいずれか一方の種類のステップを含む。

［およそ（Approximately ）］：本明細書中で使用されるように、１以上の対象とする値に適用されるような用語「およそ」又は「約」は、明示された基準値に類似した値を指している。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、そうでないことが明示されるか若しくは文脈からそうでないことが明白でないかぎり、明示された基準値のいずれかの方向（より大きい方向若しくは小さい方向）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、若しくは１％未満の範囲内に入る一連の値を指す（そのような数が考えられる値の１００％を超える場合を除く）。

［工業規模（Commercial Scale）］：本明細書中で使用されるように、用語「工業規模」は、大規模な生産方法を、商業目的に十分なｒＣ７生産のレベルを得るために拡大するのは難しい場合の多いベンチスケールの方法から、区別するために使用される。工業規模の捕捉及び精製方法はグラム量のｒＣ７をもたらす。

［賦形剤（Excipient ）］：本明細書中で使用されるように、用語「賦形剤」は、例えば所望の粘稠度若しくは安定化効果を提供するか又は粘稠度若しくは安定化効果に寄与するために、医薬組成物中に含まれうる、治療剤ではないものを指す。適切な製薬用の賦形剤には、例えば、バッファー（例えば、リン酸ナトリウムのようなリン酸バッファー、トリスバッファー）、生理食塩水、塩類（例えば塩化ナトリウム）、乳酸加リンゲル液、電解質、界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００）のような界面活性剤）、安定剤、保存剤、例えば抗微生物剤又は酸化防止剤、デンプン、糖質（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、リンゲルデキストロース、及びデキストロース）ゼラチン、麦芽、米穀、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール並びにその他同種のものが挙げられる。

［宿主細胞（Host cell ）］：本明細書中で使用されるように、「宿主細胞」という言葉は、ヒト７型コラーゲンをコードしているＤＮＡのような外来性ＤＮＡ（組換え又はその他のＤＮＡ）をその中に導入済みである細胞を指す。宿主細胞は、標準的な組換え技法によってヒト７型コラーゲンのような対象のポリペプチドを生産するために使用されうる。当業者は、本開示を読めば、そのような用語が特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指しているということを理解するであろう。突然変異又は環境の影響のいずれかによりある種の改変が次の世代に生じるかもしれないので、そのような子孫は実のところ親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書中で使用されるような用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、外来性ＤＮＡ（例えば組換え核酸配列）を発現するのに適した任意の原核細胞及び真核細胞が含まれる。典型的な細胞には、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は例えばハイブリドーマ若しくはクアドローマのような細胞融合体が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞であり、かつ次の細胞すなわち：ＣＨＯ（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ‐１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ‐ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ‐７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ‐６０、（例えばＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ‐１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ‐０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ミエローマ細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株、から選択される。

［薬学的に許容可能なビヒクル（Pharmaceutically acceptable vehicles）］：本開示において有用な薬学的に許容可能な担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｅ．Ｗ．マーティン（Martin）による「レミングトンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences ）」、第１５版、米国ペンシルベニア州イーストンのマック・パブリッシング社（Ma ck Publishing Co. ）、１９７５年は、１以上の治療用組成物、例えば１以上のインフルエンザワクチン、及びさらなる薬剤の、薬学的送達に適した組成物及び調合物について述べている。一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与方式に応じて変化することになろう。例えば、非経口用の調合物は通常、ビヒクルとして水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどのような薬学的かつ生理学的に許容可能な流体を含む注射可能な流体を含んでなる。固形組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、又はカプセルの形態）については、従来の非毒性固形担体として例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中立な担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒な補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを、含有することが可能である。

［組換え体（Recombinant ）］：本明細書中で使用されるように、用語「組換え体」とは、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、作出又は単離されるポリペプチド（例えば本明細書中に記載されるような７型コラーゲンポリペプチド）又は同ポリペプチドをコードする核酸であって、例えば宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組換えコンビナトリアルポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド、又は互いにスプライシング選択された配列要素を用いる任意の他の手段によって調製、発現、作出若しくは単離されたポリペプチド、を指すように意図されている。標準的な技法が、組換え核酸、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）に使用されうる。酵素反応及び精製技法は、製造業者の説明書に従って、又は当分野で一般に行われるように若しくは本明細書中に記載されるようにして、実施可能である。先述の技法及び手順は、当分野で良く知られた従来の方法に従って一般に実施可能である。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（第４版、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、２０１２年）（参照により本願に組込まれる）を参照されたい。

［界面活性剤（Surfactant）］：本明細書中で使用されるように、用語「界面活性剤」は、２つの液体の間、又は液体と固体との間の表面張力を低下させる化合物を指す。界面活性剤の例には、限定するものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（一般にＴｗｅｅｎ（登録商標）と呼ばれる）、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、ブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸ（商標）など）；様々な反復数のエトキシ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）基を備えたオクトキシノール、特にオクトキシノール‐９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００）；エチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ‐６３０／ＮＰ‐４０）；レシチンのようなリン脂質；ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリル、オレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）界面活性剤）、特に、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ＳＰＡＮ（登録商標）として知られるソルビタンエーテル、特にソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウラート、が挙げられる。

２．概観
動物モデルを過ぎて臨床試験へとｒＣ７の開発を進めるために、ヒトで使用するためのｒＣ７を生産することができる規模拡大可能なプロセスが開発された。大規模細胞培養からｒＣ７を精製するためのプロセスを開発しようとするとき、本発明者らが見出したのは、ｒＣ７が、「粘着性」と、特にＰＢＳバッファー中で調合された時に高いタンパク質濃度では沈殿する傾向とを示して、ｒＣ７の溶解度が限定的なものとなり工業規模の精製方法の際にかなりの量のタンパク質の喪失が生じる、ということである。ＰＢＳバッファー中のｒＣ７の溶解度は約０．４ｍｇ／ｍＬに限られ、０．４ｍｇ／ｍＬを上回るとかなりの沈殿及び粘稠度の問題を伴う。ＰＢＳバッファー中のｒＣ７の溶解度（solubility rC7）を約０．８ｍｇ／ｍＬまで高めることは可能であったが、規模拡大や、又は限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）のような従来の精製プロセスとの両立が不可能な、まさに特有の実験室条件下でのみのことであった。

本発明者らはｒＣ７精製プロセスを開発して、従来の方法を用いて可能であるよりも有意に高い収率を達成した。精製されたｒＣ７は精製純度が高く、かつ効力を保持していた。精製プロセスは２部に分けられる、すなわち：大規模細胞培養から採取されたｒＣ７を捕捉する上流プロセス、及びその後の捕捉ｒＣ７を精製する下流プロセスである。捕捉プロセスは、清澄化ステップ及び濃縮ステップ（典型的には限外濾過／透析濾過すなわち「ＵＦ／ＤＦ」ステップ）を含み、この場合採取されたｒＣ７を含有する細胞培養上清は、限外濾過膜に通される。ｒＣ７の工業規模の精製方法を開発するための本発明者らの過去の試みにおいて実行されたように保持液中のｒＣ７を収集するのではなく、最初の保持液は不純物を除去するために廃棄した。いかなる理論によっても縛られることは意図していないが、これらの条件下ではｒＣ７は保持液の中ではなく限外濾過膜に隣接する層の中に集積するようである。最初の保持液を廃棄した後、この層を、ｒＣ７を回収するために可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供する。いかなる理論によっても縛られることは意図していないが、可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方は層中のｒＣ７を可溶化するのに役立つようである。このようにして、ｒＣ７は層から放出されて第２の保持液の中に収集され、第２の保持液は組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るための透析濾過ステップに供される。この最初のＵＦ／ＤＦステップの収率は、ｒＣ７が限外濾過膜の最初の保持液中に収集されて著しく低い収率をもたらす以前の内部の捕捉方法を使用する場合の約２４％と比較して、平均約６０％（例えば図４を参照）となった。

ｒＣ７は、上流の処理からの未精製バルク液体を混合モードのフロースルー式樹脂に、続いて結合溶出モードの陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に、続いてフロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂に、及び最終のＵＦ／ＤＦステップに供することにより、さらに精製可能である。ある実施形態では、該精製方法はさらに、１以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを包含する。この精製プロセスから回収されたｒＣ７は精製純度が高く、かつフィブロネクチン結合活性を保持している。下流プロセスの全収率は平均２０％であり、ｒＣ７の工業規模での精製のための以前の内部の下流プロセスによって得られた約２％と比較して著しい改善であった。加えて、この精製スキームは、ヒトにおける試験又は使用について、残存する宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質に関して十分な純度（すなわち、治療用量当たり１００ｐｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、及びより好適には用量当たり１０ｐｇ未満）のｒＣ７を産出する。本明細書中に開示された方法は、主として工業規模でｒＣ７を捕捉及び精製するために設計されている。

１つの態様では、本開示は、ｒＣ７を捕捉するための方法であって、
ａ）ｒＣ７を含有している採取された細胞培養上清を（例えば、デプスフィルタを使用して）清澄化するステップ；
ｂ）清澄化されたｒＣ７組成物を（例えば、限外濾過膜を使用して）濃縮するステップ
ｃ）濃縮ｒＣ７組成物を透析濾過するステップ；及び
ｇ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップ
を含んでなる方法を提供する。

ある実施形態では、該方法は、ステップａ）の前に：
ａ）ｒＣ７を生産する宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）培養された宿主細胞から上清を採取するステップ
をさらに含んでなる。

別の態様では、本開示は、ｒＣ７を精製する方法であって、：
ａ）ｒＣ７を含有している試料を：
＊混合モードクロマトグラフィ、フロースルー式樹脂；
＊陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂；
＊フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂；
に供するステップ；
ｂ）ＨＩＣ樹脂からの溶出液中のｒＣ７を（例えば、限外濾過膜を使用して）濃縮するステップ；
ｃ）濃縮ｒＣ７組成物を透析濾過するステップ；及び
ｄ）精製されたｒＣ７を回収するステップ
を含んでなる方法を提供する。

精製方法は、任意選択で１以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを含む。
これらの捕捉及び精製方法の様々な特徴及び実施形態は、以下に一層詳細に説明される。

３．細胞培養
ｒＣ７は、当業者に周知の標準的な細胞培養手順を使用して工業規模で生産可能である。典型的には、ｒＣ７をコードする核酸を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を適切な細胞培養条件下で増殖させる。７型コラーゲンは好適にはヒトの７型コラーゲンである。ヒト７型コラーゲンをコードする核酸配列は当分野において既知である。ｒＣ７は細胞培養上清中に分泌される。ｒＣ７の工業規模生産については、培養細胞を典型的には大型バイオリアクタ中で増殖させる。ある実施形態では、バイオリアクタは灌流バイオリアクタである。他の実施形態では、バイオリアクタは流加培養式バイオリアクタである。ある実施形態では、細胞培養は、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、又は少なくとも２０，０００リットルの細胞培養体積を用いてバイオリアクタ中で宿主細胞を培養することを含んでなる。ある実施形態では、バイオリアクタは灌流バイオリアクタであり、灌流バイオリアクタ中の細胞培養の量は少なくとも２００リットル、より好適には少なくとも１５００リットルである。

典型的には、ｒＣ７は連続継代性細胞株において発現される。より典型的には、連続継代性細胞株は哺乳動物の細胞株である。適切な連続継代性細胞株には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫（例えばＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓（例えばＨＥＫ‐２９３）、Ｃ１２７、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、及びメイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）が挙げられる。例えば、米国特許第６，６３２，６３７号明細書（ここにその全体が参照により援用される）を参照されたい。他の適切な宿主細胞は当業者に既知である。１つの実施形態では、ｒＣ７はＣＨＯ細胞において発現される。別の実施形態では、ｒＣ７はＨＥＫ‐２９３細胞において発現される。

４．上流プロセス
１つの態様では、本発明は、細胞培養上清からｒＣ７を収集及び濃縮して未精製バルク液体とし、該液体は任意選択で凍結される、捕捉プロセスに関する。この態様は、ｒＣ７が採取、清澄化、及び濃縮される、上流の処理とも呼ばれる。一般的な上流プロセスの一実施形態を示すフローチャートを、図１に示す。図２は、ｒＣ７を捕捉するために使用される具体的な上流プロセスの一実施形態を示す。

ａ．採取
バイオリアクタからの上清を収集し、適切な保管温度、典型的には２〜８℃に維持する。典型的には、清澄化プロセスを開始する前に上清が未処理の状態におかれるのは１日未満である。細胞を灌流バイオリアクタ中で増殖させる場合、上清は、５〜３０、１０〜２５、又は１５〜２０日間、好適には２０日間にわたって一日単位のバッチとして採取する。

ｂ．清澄化
採取した上清を、例えば生菌及び細胞残屑を除去するために、かつＵＦ／ＤＦステップに先立ちバイオバーデン及び他の微粒子を低減するために、清澄化することができる。当業者に既知の任意の清澄化プロセス、例えば濾過、精密濾過、遠心分離、クロマトグラフィ及びその他同種のものなどを使用可能である。

典型的には、採取された上清から細胞残屑及び生菌を取り除くために濾過を使用する。当分野で知られているように、濾過プロセスの選択は、一部には、保持されるべきタンパク質の大きさに対する夾雑物の粒度分布の関数になるであろう。望ましい濾過を選択することにより、不要な残存粒子を除去することと同時に高いｒＣ７収率を維持することとの間のバランスが最適化されるであろう。適切なフィルタには、セルロースフィルタ、再生セルロースファイバー、無機濾過助剤と組み合わせたセルロースファイバー、無機濾過助剤及び有機樹脂と組み合わせたセルロースファイバー、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施形態では、採取された上清の清澄化はデプス濾過の手法を使用して実施する。当分野で理解されているように、デプス濾過とは、相当な量の大型粒子（例えば生菌又は細胞残屑）を含有する溶液を清澄化するための多孔性フィルタ媒質の使用を、そのような条件下では急速に詰まる可能性のある膜濾過と比較して指している。デプス濾過ステップは、１以上、２以上又は３以上のデプスフィルタに流体を通過させることを伴いうる。ある実施形態では、上流の処理は２つの清澄化ステップを含み、第１の清澄化ステップは概して大きな孔径（例えば６５μｍ）を備えたデプスフィルタを使用し、第２の清澄化ステップは概して小さな孔径（例えば０．４５及び／又は０．２μｍ）を備えた滅菌グレードの濾過膜を使用する。

多様な孔径の様々なデプス濾過媒質は、ミリポア（Millipore ）、ポール（Pall）、ゼネラル・エレクトリック（General Electric）、及びザルトリウス（Sartorious）のような様々な製造業者から市販されている。例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ／Ｄ０ＨＣ及びＭｉｌｌｉｓｔａｋ／ＤＥ５０（ＥＭＤミリポア、ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）並びにＳａｒｔｏｐｕｒｅ（登録商標）ＧＦプラス（０．６５μｍデプスフィルタ）が使用されてもよい。多様な孔径の様々な濾過膜は、ミリポア、ポール、ゼネラル・エレクトリック、及びザルトリウス（Sartorious）のような様々な製造業者から市販されている。例えば、Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２／０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）ＰＥＳプラチナ０．４５／０．２μｍフィルタ（ザルトリウス・ステディム（Sartorious Stedim ）、ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）が使用されてもよい。

ｃ．濃縮及びバッファー交換
上流プロセスのある実施形態では、ｒＣ７組成物を、当業者に既知の多くのプロセス、例えば透析、クロマトグラフィ、限外濾過及び同種のもののうちのいずれか１つによって濃縮する。

１つの実施形態では、ｒＣ７組成物を限外濾過によって濃縮した後に透析濾過ステップに供する（「ＵＦ／ＤＦ」）。ＵＦ／ＤＦは限外濾過及び透析濾過が組み合わされた操作である。このステップは、膜の孔隙率又は分画分子量（ＭＷＣＯ）よりも分子の大きさが小さい不純物及び構成成分を除去し、ｒＣ７を濃縮し、かつｒＣ７組成物の水性組成又はバッファー組成を交換／改変する。当分野ではよく知られているが、清澄性に関して、用語「限外濾過」は、特定の細孔径の１以上の半透過性フィルタ（又は膜若しくは媒質）に組成物を通過させることにより、ｒＣ７から不純物を分離するプロセスを指し、この場合、より大きな分子はフィルタ上に保持される一方、水及び分子量の低い分子はフィルタを通り抜ける。これらの分子量の低い分子は、媒質の構成成分、ペプチド断片、及びその他の夾雑物（不純物）のうち少なくともいずれか、例えばリポ多糖類、低分子量の宿主細胞タンパク質などであることが考えられる。膜の孔径は標的分子の大きさに基づいて選択される。一般に、ＭＷＣＯより大きな粒子は膜によって保持されることになる一方、ＭＷＣＯより小さな粒子は通過することになる。このプロセスはさらにｒＣ７組成物を濃縮する。

用語「透過流」は、濾過に関する場合、濾過中にフィルタの細孔を通り抜ける組成物の画分を指す。用語「保持液流」は、濾過に関する場合、フィルタ上に残る、すなわち濾過中にフィルタの細孔を通り抜けない組成物の画分を指す。

本発明者らの以前の内部大規模捕捉プロセスでは、ｒＣ７を保持液流中に収集する一方、不純物は透過流中にあり該透過流を廃棄する。対照的に、現在の方法では、上流プロセスの限外濾過ステップにおいて、最初の保持液流を透過流と併せて廃棄する。いかなる理論によっても縛られることは意図していないが、これらの条件下では、ｒＣ７は限外濾過膜に隣接する層に集積し、最初の保持液流又は透過流いずれの中にも収集されないようである。最初の保持液を廃棄した後、ｒＣ７を回収するために層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供した。いかなる理論によっても縛られることは意図していないが、可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方は、層中のｒＣ７を可溶化する助けとなるようである。このようにして、ｒＣ７を層から放出させて第２の保持液中に収集し、該保持液を、ｒＣ７を含んでなる未精製バルク液体を得るための透析濾過ステップに供する。

適切な種類のＵＦ／ＤＦの膜及び装置は当業者には既知であり、様々な要因、例えば濾過されるタンパク質の分子量、濾過される組成物の構成成分の量及び大きさ、濾過される組成物の体積、並びに濾過される組成物の細胞の密度及び生存度、に基づいて選択することが可能である。いくつかの実施形態では、膜型限外濾過器、プレート型限外濾過器、カートリッジ型限外濾過器、バッグ型限外濾過器、又は真空限外濾過器のようなフィルタを使用することが可能である。ある実施形態では、限外濾過膜又はフィルタのＭＷＣＯは、２５０〜５０ｋＤａ、好適には約２００ｋＤａ又は１００ｋＤａである。ある実施形態では、限外濾過膜又はフィルタは、酢酸セルロース、再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、又はポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）を含んでなる。上流プロセスのＵＦ／ＤＦステップの１つの実施形態では、限外濾過膜はセルロース又は再生セルロースを含んでなる。

ある実施形態では、限外濾過ステップは、採取された上清中に存在するｒＣ７の濃度の１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍、１２０倍、１５０倍、又は２００倍より高いｒＣ７の濃度を有するｒＣ７組成物を生じる。

使用可能な市販の限外濾過膜又は限外濾過フィルタは、様々な供給業者、例えばミリポア・コーポレイション（Millipore Corporation ）（米国マサチューセッツ州ビレリカ）、ポール・コーポレイション（Pall Corporation）（米国ニューヨーク州イーストヒルズ）、ＧＥヘルスケア・サイエンシズ（GE Healthcare Sciences）（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、及びザルトリウス・コーポレイション（Sartorius Corporation ）（ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）によって製造されている。例えば、ザルトリウスのＥＣＯ再生セルロース（１００ｋＤａ）を使用することができる。

典型的には、限外濾過／透析濾過は接線流濾過（ＴＦＦ）モードで行なう。ＴＦＦ（十字流濾過（ＣＦＦ）とも呼ばれる）は当業者に良く知られており、多種多様の状況におけるその実装のための装置及びプロトコールは、様々な製造業者、例えば、限定するものではないがポール・コーポレイション（米国ニューヨーク州ポートワシントン）及びスペクトラム・ラボ（米国カリフォルニア州ランチョドミンゲス）から市販されている。概して、ＴＦＦには膜の表面を横切る保持液の再循環を伴う。この緩やかな十字流供給は膜の汚損を最小限にし、高い濾過速度を維持し、かつ高い生産物回収率をもたらす。１つの実施形態では、ＴＦＦは平板状システムで実装可能である。別の実施形態では、ＴＦＦは、本明細書中に例示されるように、中空繊維状システムで実装されてもよい。

透析濾過は、ｒＣ７組成物をその最終用途用に、例えば保管、凍結乾燥、非経口用調合物などのために調製する役割を果たす。バッファー系は、典型的には、ｒＣ７を含んでなる未精製バルク液体を生産するために、緩衝剤及びその濃度のうち少なくともいずれか一方を、追加する／取り除く／置き換えることにより、交換かつ／又は改変される。追加の添加剤を、例えばｐＨ、張度、溶解度、及び安定性のうち少なくともいずれかを調整するために導入することが可能である。安定性とは、液体状態のｒＣ７組成物を安定させること、又は凍結乾燥若しくは再構成の際にｒＣ７を保護することを指すことが可能である。ある実施形態では、未精製バルク液体は、組換え７型コラーゲン、トリスバッファー、可溶化剤（例えばアルギニン）、塩化ナトリウム及び界面活性剤（例えばｔｒｉｔｏｎＸ‐１００）を含んでなる。未精製バルク（ＵＰＢ）液体は、その後の使用のために保管又は凍結することが可能である。

ある実施形態では、ＵＰＢ液体は、細胞培養から採取された上清中のｒＣ７の４０〜８０％を含有する。ある実施形態では、清澄化及び捕捉ステップについての平均のｒＣ７回収率は約４０〜４５％である、すなわち、プールされたＵＰＢは、細胞培養から採取された上清中のｒＣ７の約４０〜４５％を含有する。ある実施形態では、ＵＰＢ液体は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００グラムを上回るｒＣ７を含有する。

ｄ．濾過滅菌
濾過滅菌ステップが本方法に含まれてもよく、該ステップはバイオバーデンの除去に役立つ。例えば、ＵＦ／ＤＦステップに続いて、ＵＰＢを、例えば修飾ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＥＭＤミリポア）のような０．２２ミクロンのフィルタを使用して、濾過滅菌することが可能である。修飾ＰＶＤＦに加えて、滅菌フィルタは、当分野において良く知られかつ当業者に入手可能な様々な他の材料で構築されていてもよい。これらには、限定するものではないが、ポリプロピレン、セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリエーテルスルフォン、又は任意の他の材料であって、生産物との結合性が低いことと矛盾しないものが挙げられる。濾過滅菌されたｒＣ７組成物は、凍結して保管するか、又はその後の使用の準備が完了するまで２〜８℃に保持することが可能である。

５．下流プロセス
任意の捕捉プロセスによって収集されたｒＣ７を含むいかなるｒＣ７試料も、該ｒＣ７試料を混合モードのフロースルー式樹脂、続いて陽イオン交換クロマトグラフィ、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂、並びに最後の濃縮及び任意選択のバッファー交換（例えばＵＦ／ＤＦ）のステップに供することにより、さらに精製することが可能である。図３。該精製方法はさらに、１以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを包含することが好ましい。この精製プロセスから回収されたｒＣ７は純度が高く、かつフィブロネクチン結合活性を保持している。精製ｒＣ７は、ヒトでの使用に適していることが好ましい。

ａ．混合モードクロマトグラフィ
混合モードのフロースルー式樹脂は、２つの一般的な精製技法すなわち：サイズ排除及び結合分離を兼ね備える。混合モードのフロースルー式樹脂は、リガンド活性化コア及び不活性シェルを含んでなる。不活性シェルはサイズ排除の構成要素として機能し、かつｒＣ７のようなより大きな分子がリガンド活性化コアに入るのを防止する。不活性シェルは、所望の分画分子量を設定するために様々な細孔径を有する。ある実施形態では、不活性シェルの分画分子量は、２００〜１５００ｋＤａ、より好適には５００〜９００ｋＤａ、最適には約７００ｋＤａである。

ｒＣ７のようなより大きな分子はカラムのフロースルー画分に収集される一方、より小さな不純物は不活性シェルを通過し、リガンド活性化コアに入り、内在化されたリガンドに結合する。コアは、結合相互作用を決定するリガンドで官能化されている。「リガンド」は、クロマトグラフィのマトリックスに取り付けられ、かつ該マトリックスの結合特性を決定する、官能基である。「リガンド」の例には、限定するものではないが、イオン交換基（陰イオン又は陽イオン交換基）、疎水性相互作用基、親和性基、又はこれらの組み合わせ（マルチモーダル）が挙げられる。マルチモーダルリガンドは、広範囲のｐＨ及び塩濃度にわたってほとんどの不純物との強力な結合を促進する。結合した不純物は、ＮａＯＨのような標準的な試薬及びほとんどの場合は溶剤を用いる定置洗浄手法によって、コアのリガンドから除去される。

使用可能な市販の混合モード、フロースルー式の樹脂は、様々な供給業者、例えばＧＥヘルスケア・サイエンシズ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、バイオ‐ラッド（Bio-Rad ）（米国カリフォルニア州ヘラクレス）、及びサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）（米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって製造されている。例えば、ＧＥヘルスケア・サイエンシズのＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ７００カラムを使用することができる。

ｂ．陽イオン交換クロマトグラフィ
陽イオン交換クロマトグラフィの原理は当分野で良く知られているが、簡潔に述べると、この方法は、単離されるべき粒子と使用される樹脂との間の静電的相互作用に依存している。陽イオン交換カラムは固定化された負の電荷を有する構成部分を含有している。ｒＣ７は生理的ｐＨ範囲では正の電荷を有するので、カラムは、陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂へのｒＣ７の結合を伴う結合溶出モードで操作される。

正の電荷を有する分子の結合を最適化するために、移動相は概して低〜中位のイオン強度の（すなわち、低〜中位の塩濃度の）溶液である。固体担体への分子の吸着は、試料分子中及び担体上の官能性リガンド中の、反対の電荷を有するイオン性基の間のイオン相互作用によって推進される。相互作用の強さは、分子上及び官能基上の電荷の数及び位置によって決まる。塩濃度を（一般に直線的塩濃度勾配又は段階的定組成溶離を使用することにより）増加させることにより、最も弱いイオン相互作用を備えた分子がカラムから最初に溶出し始める。より強いイオン相互作用を有する分子はより高い塩濃度を必要とし、勾配中でより遅く溶出する。

陽イオン交換マトリックスは概して、共有結合した、負の電荷を有する構成部分を含んでなる。弱い、又は強い陽イオン交換樹脂を使用することができる。一般に、強い陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、スルホン酸若しくはスルホナート基又はホスホリル基を含んでなる有機基を担持して含んでなる。弱い陽イオン交換樹脂は一般に、ｐＨに応じて、カルボン酸又はカルボキシラート基を含んでなる有機基を担持して含んでなる。ある実施形態では、マルチモーダルの陽イオン交換樹脂を使用することが可能であり、該樹脂はイオン相互作用だけでなく追加の結合機構、例えば水素結合相互作用及び疎水性相互作用のうち１以上を組み入れている。適切な陽イオン交換樹脂の例には、限定するものではないが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスファート（Ｐ）及びスルホナート（Ｓ）、ＰＲＯＰＡＣ ＷＣＸ‐１０（商標）（ダイオネクス（D ionex））、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｍｅｇａｃａｐ（登録商標）ＩＩ ＳＰ ５５０Ｃ、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）５０ ＨＳ及びＳＰ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦマトリックスが挙げられる。ある実施形態では、陽イオン樹脂はスルホプロピル基を含んでなる。

陽イオン交換クロマトグラフィのステップは、ｒＣ７に関しては結合溶出モードで使用されるべきである。結合溶出モードでは、ｒＣ７は陽イオン交換マトリックスに吸着される一方、１以上の不純物はマトリックスを通過し、よってｒＣ７が不純物から分離される。いくつかの実施形態では、陽イオン交換マトリックスは、吸着したｒＣ７が陰イオン交換マトリックスから取り出される前に、さらなる不純物を除去するためにバッファーで１回以上洗浄される。結合モードの陽イオン交換クロマトグラフィを使用して組成物から１以上の不純物を除去した後、吸着したｒＣ７を陽イオン交換マトリックスから取り出す（溶出させる）ことが可能である。

ｃ．疎水性相互作用クロマトグラフィ
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）は、分子をその疎水性に基づいて分離する。ＨＩＣは、分子を、これらの分子とＨＩＣ樹脂の疎水性表面（例えば、疎水性のリガンドで修飾されたポリマーマトリックス）との間の可逆的相互作用を使用して、該分子の表面の疎水性の差に従って分離する。典型的には、疎水性分子とＨＩＣマトリックスのリガンドとの間の相互作用は、ランニングバッファー中のコスモトロピック塩の存在によって影響を受ける。高い塩濃度は相互作用を増強する一方、塩濃度を低下させると相互作用が弱まる。バッファーのイオン強度を低下させるにつれて、分子とマトリックスとの間の相互作用は覆され、疎水性の度合いの最も低い分子が最初に溶出される。最も疎水性の高い分子は、相互作用を覆すためにより大きな塩濃度の低減を必要として、最後に溶出する。

ほとんどのタンパク質、及び度合いは非常に小さいが親水性の分子（例えばＤＮＡ及び炭水化物）は、その表面上に疎水性のエリア又はパッチを有している。これらのパッチの溶媒和作用はエネルギー的に不都合であり、水性移動相の中で疎水性キャビティの形成をもたらす。（コスモトロピック塩の添加による）疎水性効果の促進は、タンパク質上の疎水性エリアの、固定相上の疎水性エリア（例えばマトリックスの疎水性リガンドを含有するエリア）への吸着を推進する。これは、個々の疎水性キャビティの数及び体積を低減するという点で熱力学的に好都合である。従来型のＨＩＣでは、コスモトロピック塩の濃度を低下させることによる疎水的相互作用の低減が固体担体からの脱離をもたらす。従来型のＨＩＣは、タンパク質が高い塩濃度で固定相に結合し低い塩濃度で溶出するという点で他のクロマトグラフ分離方法とは異なっている。

ＨＩＣは「フロースルーモード」で使用することも可能である。フロースルーモードのＨＩＣは凝集物及びその他の不純物を除去するために使用可能である。これらの不純物はｒＣ７に非常に類似した化学的性質を有するが、概してｒＣ７よりも疎水性が高い。適正な条件下では、不純物はＨＩＣ樹脂に結合してｒＣ７が通過するのは可能となる。ＨＩＣのフロースルーモードでは、疎水性クロマトグラフィ／ＨＩＣ樹脂は、典型的にはｐＨが５．０〜約７．０、５．５〜約６．５、又は約６．０である水性の移動相バッファーと組み合わされる。

最も広く用いられているＨＩＣマトリックスは、親水性の炭水化物：架橋アガロース及び合成コポリマー材料である。異なるマトリックスの間の選択性は、リガンドが同じであっても同一にはならない。ＨＩＣマトリックスの例には、限定するものではないが、アガロース、セファロース及びメタクリル酸ポリマーが挙げられる。

ＨＩＣマトリックスは、疎水性リガンド基で修飾される（例えば、該リガンド基が共有結合する）ことが可能であり、該リガンド基に分子の疎水性エリアが吸着する。分子の吸着挙動は固定化されたリガンドの種類によって決まる。概して、直鎖アルキルリガンドは疎水特性を示す一方、アリールリガンドは芳香族相互作用及び疎水性相互作用の両方が可能な混合モードの挙動を示す。リガンドの種類の選択は、場合によっては経験的に決定されてもよい。本明細書中で使用されうる疎水性リガンドの例には、限定するものではないが、エーテル基、ポリプロピレングリコール基、フェニル基、ブチル基、ヘキシル基及びオクチル基が挙げられる。これらの官能基を備えたＨＩＣ樹脂の例には、限定するものではないが、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ブチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ、オクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃａｐｔｏフェニル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌヘキシル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌエーテル、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧが挙げられる。ある実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、ポリプロピレングリコールのようなポリエーテルリガンドで修飾されたメタクリル酸（methacryclic）ポリマーを含んでなる。

ｄ．濃縮及びバッファー交換
下流プロセスのある実施形態では、ｒＣ７組成物は、当業者に既知の多くのプロセスのうち任意のもの、例えば透析、クロマトグラフィ、限外濾過及び同種のものによって濃縮される。

１つの実施形態では、ｒＣ７組成物は透析濾過ステップに供される前に限外濾過により濃縮される（「ＵＦ／ＤＦ」）。上記に議論されるように、ＵＦ／ＤＦステップは、膜の孔隙率よりも分子の大きさが小さい不純物及び構成成分のうち少なくともいずれかを除去し、ｒＣ７を濃縮し、かつｒＣ７組成物の水溶液組成又はバッファー組成を交換／改変する。ある実施形態では、ＵＦ／ＤＦステップは、第１の限外濾過、透析濾過及び表面積が縮小された膜を使用する第２の限外濾過を含んでなる。

ある実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィのステップからの流出液は、ＵＦ／ＤＦステップに先立ち、可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか、例えばアルギニンで処理される。これらの実施形態では、透過流は廃棄される一方、ｒＣ７は最初の保持液中に濃縮され、該保持液はその後の透析濾過ステップに供される。

他の実施形態では、可溶化剤及び／又は洗剤がＵＦ／ＤＦステップの前にｒＣ７組成物に添加されない場合、最初の保持液流は、上流プロセスにおけるように透過流と共に廃棄可能である。最初の保持液を廃棄した後、層を、可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか、例えばアルギニンに供して、第２の保持液中にｒＣ７を回収することが可能であり、第２の保持液は精製ｒＣ７を得るために透析濾過ステップに供される。

適切な種類のＵＦ／ＤＦの膜及び装置は当業者には既知であり、様々な要因、例えば濾過されるタンパク質の分子量、濾過される組成物の構成成分の量及び大きさ、濾過される組成物の体積、並びに濾過される組成物の細胞の密度及び生存度、に基づいて選択することが可能である。いくつかの実施形態では、膜型限外濾過器、プレート型限外濾過器、カートリッジ型限外濾過器、バッグ型限外濾過器、又は真空限外濾過器のようなフィルタを使用することが可能である。ある実施形態では、限外濾過膜又はフィルタのＭＷＣＯは、２５０〜５０ｋＤａ、好適には約２００ｋＤａ又は１００ｋＤａである。ある実施形態では、限外濾過膜又はフィルタは、酢酸セルロース、再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、又はポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）を含んでなる。１つの実施形態では、限外濾過膜は親水性である。下流プロセスのＵＦ／ＤＦステップの１つの実施形態では、親水性の限外濾過膜はＰＥＳを含んでなる。

ある実施形態では、限外濾過ステップは、ＵＦ／ＤＦステップの前のｒＣ７組成物中に存在するｒＣ７の濃度の１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍、１２０倍、１５０倍、又は２００倍より高いｒＣ７濃度を有するｒＣ７組成物を生じる。ある実施形態では、下流プロセスのＵＦ／ＤＦステップの後に得られる精製ｒＣ７は、混合モードクロマトグラフィのステップに供された試料中のｒＣ７の量の、平均で１５〜３０％、又は１７〜２１％、又は約２０％を含有する。ある実施形態では、混合モードクロマトグラフィのステップに供された試料は、少なくとも１５、２０、２５、３０又は５０グラムのｒＣ７、より好適には少なくとも２０〜３０グラム、又は少なくとも２５グラムを含有する。ある実施形態では、少なくとも２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、又は５．０グラムのｒＣ７、より好適には少なくとも３．０〜５．０グラム、又は少なくとも４．０グラムのｒＣ７が、下流プロセスのＵＦ／ＤＦステップから回収される。精製ｒＣ７はフィブロネクチン結合活性を保持している。

使用可能な市販の限外濾過用の膜又はフィルタは、様々な供給業者、例えばＥＭＤミリポア（ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）、ポール・コーポレイション（米国ニューヨーク州イーストヒルズ）、ＧＥヘルスケア・サイエンシズ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）及びザルトリウス・コーポレイション（ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）によって製造されている。例えば、Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２ １００ｋＤａ（ＥＭＤミリポア、ドイツ連邦共和国ダルムシュタット）が使用されてもよい。

透析濾過は、ｒＣ７組成物をその最終用途、例えば保管、凍結乾燥、非経口用調合物などのために調製する役割を果たす。バッファー系は、典型的には、精製ｒＣ７組成物、及び好適にはヒトでの使用に適しているｒＣ７組成物を生産するために、緩衝剤及びその濃度のうち少なくともいずれか一方を、追加する／取り除く／置き換えることにより、交換かつ／又は改変される。

透析濾過は、組成物を最終剤型にする必要も、すべての賦形剤を提供する必要もない。追加の賦形剤又は組成の完全な変更は、ＵＦ／ＤＦの後に実行可能である。しかしながら、ＵＦ／ＤＦステップは概して、ｒＣ７組成物をほぼ最終の形態とする。追加の添加剤を、例えばｐＨ、張度、溶解度、及び安定性のうち少なくともいずれかを調整するために、導入することが可能である。安定性とは、液体状態のｒＣ７組成物を安定させること、又は凍結乾燥若しくは再構成の際にｒＣ７を保護することを指すことが可能である。精製されたｒＣ７は、後の使用のために保管するか又は凍結させることが可能である。別例として、後の使用のために精製ｒＣ７を凍結乾燥して保管することも可能である。

ｅ．濾過滅菌
濾過滅菌ステップが本方法に含まれてもよく、該ステップはバイオバーデンの除去に役立つ。例えば、ＵＦ／ＤＦステップに続いて、精製ｒＣ７組成物を、例えば修飾ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（例えば、ＥＭＤミリポア）のような０．２２ミクロンのフィルタを使用して濾過滅菌することが可能である。修飾ＰＶＤＦに加えて、滅菌フィルタは、当分野において良く知られかつ当業者に入手可能な様々な他の材料で構築されていてもよい。これらには、限定するものではないが、ポリプロピレン、セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリエーテルスルフォン、又は任意の他の材料であって、生産物との結合が低いことと矛盾しないものが挙げられる。ある実施形態では、界面活性剤（例えばポリソルベート）が、濾過滅菌の前又は後、好適には前に、ｒＣ７組成物に添加されることが好ましい。ある実施形態では、界面活性剤（例えばポリソルベート）は、２〜０．０１％（ｖ／ｖ）、１．０〜０．０５％（ｖ／ｖ）、又は約０．０５％（ｖ／ｖ）の終濃度となるように添加される。濾過滅菌されたｒＣ７組成物を凍結及び保管するか、又は望ましい場合には、その後の調合のために２〜８℃に保持することが可能である。

ｆ．ウイルスの低減
ある実施形態では、下流プロセスは１以上のウイルス低減ステップを含む。ウイルスは、不活性化されるか又は組成物から物理的に除去される（又は両方である）場合に、「低減」される。いくつかの実施形態では、ウイルス低減ステップは混合モードのフロースルーステップの前に行なわれる。いくつかの実施形態では、ウイルス低減ステップは混合モードのフロースルーステップの後に行なわれる。いくつかの実施形態では、ウイルス低減ステップは混合モードのフロースルーステップの前及び後の両方において行なわれる。いくつかの実施形態では、ウイルス低減ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィのステップの後及びＵＦ／ＤＦステップの前に行なわれる。いくつかの実施形態では、第１のウイルス低減ステップは混合モードのフロースルーステップの前に行なわれ、第２のウイルス低減ステップは混合モードのフロースルーステップの後及び疎水性相互作用クロマトグラフィステップの前に行なわれ、かつ第３のウイルス低減ステップは疎水性相互作用クロマトグラフィステップの後及びＵＦ／ＤＦステップの前に行なわれる。

ウイルスの不活性化に関しては、ウイルスは最終製品中に残る場合はあっても、非感染性の形態である。ウイルスの不活性化ステップは、ｐＨ不活性化ステップ及び化学的不活性化ステップのうち少なくともいずれか一方を含んでなることができる。化学的不活性化ステップは、界面活性剤（例えば洗剤）を用いた処理、放射線照射、及びウイルスを不活性化するのに十分な高温への短時間の曝露のうち少なくともいずれかを含むことができる。これらのウイルス不活性化の方法は当業者には既知であり、また当業者は適正な処理条件を選択することができる。ある実施形態では、下流の処理は、放射線照射ステップを、好適には混合モードのフロースルーステップの前に、備えている。ある実施形態では、下流の処理は、界面活性剤（例えば洗剤）をｒＣ７組成物に、好適には混合モードのフロースルーステップからのｒＣ７を含有する流出液に、添加するステップを含む。ある実施形態では、下流の処理は、混合モードのフロースルーステップの前の放射線照射ステップと、混合モードのフロースルーステップからの流出液に界面活性剤（例えば洗剤）を添加するステップとを含む。

ウイルス低減ステップが組成物からのウイルスの物理的な除去を含んでなる場合、典型的には濾過が含まれる。具体的には、ナノ濾過は、ｒＣ７からウイルスを分離するために、例えば７５ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、又は１５ｎｍ以下の孔径を有するマトリックスに組成物を通過させることを含んでなる。ある実施形態では、下流の処理は、疎水性相互作用クロマトグラフィステップの後及びＵＦ／ＤＦステップの前に、好適には３５ｎｍの平均孔径を有する多孔質フィルタを使用する、ウイルス除去ステップを含む。様々なナノフィルタが市販されており、かつ当分野において既知である。

ある実施形態では、下流の処理は、混合モードのフロースルーステップの前に組成物を放射線照射することを含んでなる第１のウイルス低減ステップ、混合モードのフロースルーステップからの流出液に界面活性剤（例えば洗剤）を添加することを含んでなる第２のウイルス低減ステップ、及び疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂からのフロースルー（流出液）をフィルタ、好適には３５ｎｍの平均孔径を有する多孔質フィルタに供することを含んでなる第３のウイルス低減ステップを含む。

ｇ．エンドヌクレアーゼ
ある実施形態では、下流の処理には、エンドヌクレアーゼを用いてｒＣ７を含有する組成物を処理するステップが含まれる。エンドヌクレアーゼは、好適にはＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分解するエンドヌクレアーゼである。１つの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（ＥＭＤミリポア）と称して販売されている、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens ）由来の遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼ（イーブス（Eaves ）、Ｇ．Ｎ．ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bact.）、１９６３年、第８５巻、ｐ．２７３−２７８；ネスレ（Nestle）、Ｍ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、１９６９年、第２４４巻、ｐ．５２１９−５２２５）である。該酵素は、ｐＮＵＣ１生産プラスミドを含有している、Ｋ１２株の突然変異体である大腸菌Ｗ３１１０株（米国特許第５，１７３，４１８号明細書、この文献は参照によりその全体がここで本願に援用される）から生産されて精製される。構造上、該タンパク質は、２つの重要なジスルフィド結合を備えた、同一の２４５アミノ酸で約３０ｋＤａのサブユニットの二量体である。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、全ての形態のＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖、二本鎖、直線状及び環状）を分解し、かつ広範囲の作用条件にわたり有効であって、核酸を分解して長さ２〜５塩基の５’‐モノホスファートを終端としたオリゴヌクレオチドとする。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は現行の適正製造規範（ｃＧＭＰ）の下で生産され、よって、医薬用タンパク質の精製のための工業規模でのプロセスにおいて使用可能である。

ｃＧＭＰ条件下で生産される他のエンドヌクレアーゼ、例えば、限定するものではないがＤｅｎｅｒａｓｅ（商標）（ザルトリウス・ステディム・バイオテック（Sartorius Stedim Biotech）、ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）、Ｃｙａｎａｓｅ（商標）（リボソリューション（RiboSolution）、米国テキサス州シダークリーク）及びＰｉｅｒｃｅ（商標）ユニバーサルヌクレアーゼ（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）も同様に、本願に開示された精製方法において使用することが可能である。

ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ処理ステップは疎水性相互作用クロマトグラフィステップの前に行われる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ処理ステップは陽イオン交換クロマトグラフィステップの後に行われる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ処理ステップは、陽イオン交換クロマトグラフィステップの後及び疎水性相互作用クロマトグラフィステップの前に行われる。

６．医薬品組成物
本開示によって精製されたｒＣ７は、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法によって調合可能である。本開示の組成物は、当分野で既知の技法を使用して、哺乳動物の対象者、好適にはヒトへの投与のために調合可能である。特に送達システムは、筋肉内、皮内、粘膜、皮下、静脈内、注射可能なデポ剤型デバイス、又は局所への投与用に調合することができる。送達システムが溶液又は懸濁液として調合される場合、該送達システムは、許容可能な担体中に、好適には水性担体中に含まれる。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は従来の良く知られた滅菌技法によって滅菌されてもよいし、濾過滅菌されてもよい。結果として生じる水溶液は、そのまま使用するために包装されても、凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与に先立ち滅菌溶液と組み合わされる。

組成物は、生理学的状態に近づくために必要とされるような薬学的に許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などであって、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどを含有することができる。組成物はさらに、その他の薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系の物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレンブロックポリマー、及びポリエチレングリコールを含有することもできる。

ある実施形態では、本明細書中に記載された精製方法によって得られる医薬組成物は、ｒＣ７、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、糖質（例えばスクロース）、及び界面活性剤（例えばポリソルベート）を含んでなる。

ある実施形態では、本明細書中に記載された精製方法によって得られる医薬組成物は、１ｍｇのｒＣ７あたり２０００ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質、好適には１０００ｎｇ／ｍｇ以下、及びより好適には６００ｎｇ／ｍｇ以下しか含有しない。

ある実施形態では、本明細書中に記載された精製方法によって得られる医薬組成物は、１ｍｇのｒＣ７あたり４２ｐｇ以下の宿主細胞ＤＮＡ、好適には２５ｐｇ／ｍｇ以下、及びより好適には１５ｐｇ／ｍｇ以下しか含有しない。

ある実施形態では、本明細書中に記載された精製方法によって得られる医薬組成物は、１ｍｇのｒＣ７あたり１．０ＥＵ／ｍｇ以下のエンドトキシン、好適には０．７０ＥＵ／ｍｇ以下、及びより好適には０．５０ＥＵ／ｍｇ以下しか含有しない。

医薬組成物はさらに、ウイルスに関して高い純度を有する。本明細書中に記載されたプロセスは際立ったウイルス対数減少値（ＬＲＶ）をもたらす。例えば、該プロセスは、異種指向性マウス白血病ウイルス及びブタパルボウイルスについてそれぞれＬＲＶ＞１８及びＬＲＶ＞４をもたらす。

本開示は、以下の実施例を参照することで、より十分に理解されるであろう。
実施例
実施例１：上流の処理
第１回の実行及び第２回の実行は、未精製バルク（ＵＰＢ）を生産するために、２０の清澄化された採取物に、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）による１０回の捕捉を伴って、成功裡に完了した。ＵＦ／ＤＦは接線流濾過（ＴＦＦ）によって実施した。第１回の実行からの１０２．９グラムのｒＣ７を含有する２２４１ＬのＵＰＢ、及び第２回の実行からの９２．１ｇのｒＣ７を含有する１０５２ＬのＵＰＢの合計が、下流の処理のために生産され、清澄化については７０％及び捕捉プロセスについては６０％の平均収率が示された。

２０００Ｌの生産バイオリアクタに種培養物を接種した。接種後、ｒＣ７生産バイオリアクタ培養物を、灌流を伴わずにバッチ培養で増殖させた（作業体積は１５００Ｌ）。バッチ培養の終了時、灌流培養を開始し、続いて生産段階（連続２０日間）、及び毎日の採取物収集を行った。清澄化の作業は、各実行についての個々の採取物プールごとに毎日実施した。

ＵＦ／ＤＦ捕捉に先立ち、細胞、細胞残屑を除去し、かつバイオバーデン、加えて他の微粒子を低減するために、採取物を清澄化した。バイオリアクタからの未処理のバルクを、覆い付きトートバッグの中に入った３０００Ｌ容バッグに収集した。採取物収集が完了し次第、この清澄化されていない採取物を２〜８℃に維持した。各採取物を一日単位のバッチとして一連の清澄化操作を使用して清澄化したが、この一連の清澄化操作には、ミリポアのＤ０ＨＣポッド・デプスフィルタ、ミリポアのＤＥ５０ポッド・デプスフィルタ、ザルトリウスのＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＧＦプラス０．６５μｍデプスフィルタ、ザルトリウスのＳａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ 公称１．２／０．２μｍ濾過膜、及びザルトリウスのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ＰＥＳプラチナ０．４５／０．２μｍ滅菌グレードフィルタが含まれた。

清澄化した採取物をその後、限外濾過（ＵＦ）、続いて透析濾過（ＤＦ）によって濃縮し、かつ下流の精製用の未精製バルク液体を生成するためにさらに濃縮した。ＵＦ／ＤＦステップは再生セルロースから成るＵＦ膜（ザルトリウス・ステディム）を使用して行なった。該ＵＦ膜は、ＥＣＯスクリーンチャネル構造を備えたＴＦＦ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）カセットに包含されたものである（１００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ ＥＣＯ）。ＵＦ／ＤＦステップは、低分子の構成成分を除去し、清澄化された採取物の中に存在する宿主細胞タンパク質のレベルを低減し、清澄化された採取物の体積を縮小し、かつ所望のＵＰＢのｐＨ及び導電率を達成する。それぞれのＵＦ／ＤＦによる捕捉作業では、２つの連続する清澄化済み採取物のプールを混合した。よって、２０個の清澄化済み採取物を用いて、合計１０回の捕捉作業を実施した。膜によって保持される材料は保持液と呼ばれる。このシステムでは、ｒＣ７が保持液中に集まるのではなく膜に隣接した層に集積するということが思いがけず発見された。従って、最初の保持液はシステムから排出した。層中のｒＣ７は、ｒＣ７を含んでなる第２の保持液を得るために、０．０２Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｌ‐アルギニン、０．０１％ Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ‐１００、ｐＨ８．０を添加し、かつシステム全体にわたって再循環させることにより、再可溶化した。

第２の保持液中のｒＣ７を、同じ溶液（０．０２Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｌ‐アルギニン、０．０１％ Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ‐１００、ｐＨ８．０）を使用して透析濾過し、ｒＣ７は１００ｋＤａ膜に保持された。次いで透析濾過生成物を、未精製バルク（ＵＰＢ）の目標体積７５Ｌまで濃縮した。濃縮及び透析濾過された採取物を、混合ステーションへ移すことによりシステムから回収した。次に、システムから残留物を回収するために再び同じバッファー液を用いてシステムのすすぎを実施し（目標添加量３５Ｌ）、次いで、より強く濃縮された生成物を最終目標のおよそ１０５Ｌまで希釈するために使用した。希釈された生成物を混合して０．４５／０．２μｍフィルタに通して濾過し、２０Ｌのバイオプロセスバッグの中に７〜１１Ｌの体積まで注入した。注入されたバッグを−２０±５℃の冷凍庫内で保管し（５日間未満）、続いて下流の処理まで−５０±５℃で長期保管した。

２回の実行の間に、１９５グラムのｒＣ７を含有する合計３２９２．３ＬのＵＰＢを捕捉し、清澄化ステップについては約７０％及び捕捉（ＵＦ／ＤＦ）ステップについては約６０％の平均回収率が示された。比較すると、ｒＣ７が最初の保持液中に収集された本発明者らの以前の内部の上流の処理における捕捉（ＵＦ／ＤＦ）ステップについてのｒＣ７回収率は、わずか約２４％であった。よって、現行の捕捉ステップは、ｒＣ７の工業規模生産の際のｒＣ７回収率に大きな改善をもたらして、収量及び費用節約の著しい増大という結果を引き起こす。清澄化及びＵＦ／ＤＦ捕捉（上流プロセス）についての合計ｒＣ７生産量は、表１及び図４に要約されている。

最後に、ＵＰＢの品質の尺度として、ｒＣ７の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に対する比率を純度の単純な尺度として評価した。図５は、２回の実行についてのｒＣ７：ＨＣＰ比をまとめたものであり、初期及び後期の両方の採取物についてはより高いｒＣ７：ＨＣＰ値を示している。

実施例２ 下流の処理
ｒＣ７精製プロセスの一般化した概略図を図６に示す。実施例１からの未精製バルク（ＵＰＢ）を融解し、ＣＡＰＴＯ（商標）Ｃｏｒｅ７００（ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンシズ（GE Healthcare Life Sciences ））指定の装荷量を目標としてプールした。意図した目標のＣＡＰＴＯ Ｃｏｒｅ７００（ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンシズ）装荷量は、樹脂１Ｌあたり１．０ｇのｒＣ７である（ＵＰＢの濾過及び短波長紫外線の操作について１００％の力価収率を仮定）。装荷の詳細は以下の表２に詳述されている。

プールしたＵＰＢは、下流の処理に備えて微粒子の除去及びバイオバーデンの低減を行うために、０．４５及び０．２μｍのフィルタに通して濾過した。濾過したＵＰＢを、ＵＶＩＶＡＴＥＣ（登録商標）（ザルトリウス）システムを使用して短波長紫外線照射に供した。ウイルスが不活性化されたＵＰＢをプールして０．２μｍフィルタに通して濾過した。

精製プロセスについての第１の下流のカラムステップは、フロースルーモードの、例えばＣＡＰＴＯ Ｃｏｒｅ７００（ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンシズ）カラムのような、混合モードの樹脂である。不純物は樹脂に結合する一方、ｒＣ７は通り抜ける。カラムの平衡化及び洗浄に使用される溶液は、０．０２Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｌ‐アルギニン及び０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘを含んでなるものであった。

ＣＡＰＴＯ Ｃｏｒｅ７００（ＧＥヘルスケア・サイエンシズ）からの通過画分を、エンベロープウイルス粒子を対象としてウイルス不活性化（ＶＩ）プールを生じるために、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を用いて周囲温度で３〜２４時間処理した。

第２のクロマトグラフィステップは陽イオン交換クロマトグラフィステップである。スルホプロピル（ＳＰ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・サイエンシズ）樹脂をこのステップで使用した。ＶＩプールを、６Ｍ尿素の添加により最終目標濃度２Ｍへと希釈した。次に該プールを、１Ｍ酢酸を使用してｐＨ４．８にさらに調整し、ＳＰ樹脂に装荷する前に０．４５及び０．２μｍのフィルタを用いて濾過した。ＳＰカラムを平衡化し、０．０６６Ｍ Ｌ‐アルギニン、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、及び０．０２Ｍアセタートを含んでなる溶液で洗浄した。ＳＰカラムを、陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂へのｒＣ７の結合を伴う結合溶出モードで操作した。装荷、洗浄、及び溶出はすべて一定の流量で実施した。ｒＣ７を、０．０６６Ｍ Ｌ‐アルギニン、０．２２Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、及び０．０２Ｍアセタートを含んでなる溶液を用いてカラムから溶出させた。溶出プールの分画は実施しなかった。

ＳＰクロマトグラフィステップに続いて、ＳＰ溶出プールを、１Ｍトリスベースを使用してｐＨ８．０に調整した。次に該プールをさらに、１Ｍ ＭｇＣｌ_２を用いて終濃度２ｍＭに調整した。この中間物を次に０．４５／０．２μｍフィルタで処理し、３０℃に加熱した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（ＥＭＤミリポア）エンドヌクレアーゼを添加してＤＮＡ消化反応を開始させ、反応混合物を１６〜２０時間保持した。

第３のクロマトグラフィステップは疎水性相互作用カラムである。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ ６００Ｍ（トーソー・バイオサイエンシズ（Tosoh Biosciences ））樹脂をフロースルーモードで使用した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）で処理したプールを１８℃に冷却し、次に１Ｍ ＭＥＳ、酸を使用してｐＨ６．０に調整した。次いで５Ｍ ＮａＣｌを終濃度１．５Ｍまで添加し、０．４５／０．２μｍフィルタに通して濾過してからＰＰＧカラムに装荷した。不純物は樹脂に結合する一方、ｒＣ７は０．０２Ｍ ＭＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中でｐＨ６．０においてカラムを通過する。通過画分の収集は装荷の開始後０．４ＣＶで始め、１．５ＣＶの洗浄の後に終了した。

収集したＦＴ／Ｗプールを、０．７５Ｍ Ｌ‐アルギニン、ＨＣｌを用いて終濃度０．１Ｍに調整し、かつ０．４５／０．２μｍフィルタに通して濾過した後、名目上３５ｎＭより大きなウイルス様粒子をプロセス流から除去するためにＰｌａｎｏｖａ（商標）‐Ｎ３５ナノフィルタ（旭化成メディカル（Asahi Kaei Medical）、日本国）を通過させた。

最終的な調合及び濃縮のステップはＵＦ／ＤＦステップである。ウイルス濾過済みプールを、４ｍ^２のＴＦＦシステムに装荷し、０．２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、かつＢｉｏｍａｘ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ １００ｋＤａ ＵＦ／ＤＦ膜（ＥＭＤミリポア）を使用して、６〜８倍の透析容積の０．０７Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍシトラート、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ Ｌ‐アルギニン、及び０．０５Ｍスクロースを用いて透析濾過した。透析濾過を完了し次第、材料を排液及びシステムのすすぎによって回収し、続いてプールした。プールした生成物を、次に２．５ｍ^２のＴＦＦシステムを使用して１．４ｍｇ／ｍＬまでさらに濃縮した。

ポリソルベート８０を２０％保存溶液から添加して終濃度０．０５％とした。結果として得たｒＣ７プールを０．５／０．２μｍフィルタに通して濾過した後、１Ｌボトル中に３００ｍＬの目標充填体積まで分注し、−６５〜−８５℃で保管した。

ＤＳ‐１及びＤＳ‐２の実行からそれぞれ５．４及び４．７グラムのｒＣ７が得られ、以下の表３にまとめたようにＵＰＢ中のｒＣ７の量と比較してそれぞれ２１％及び１７％のｒＣ７回収率に達していた。比較すると、本発明者らの以前の内部の下流精製プロセスにおけるｒＣ７回収率はわずかに約２％であった。よって、現在のｒＣ７下流精製プロセスの回収率は、本発明者らの以前の内部プロセスより約１０倍高く、収量及び費用節約の著しい前進をもたらしている。

結果として生じる、この精製プロセスによって回収されたｒＣ７はさらに、以下に表４にまとめるようなフィブロネクチンへの結合及び純度の要件を含む、全ての品質規格を満たした。

請求項の要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」などのような順序を示す用語の使用は、それ自体で１つの請求項の要素が別の要素を上回る何らかの優先度、優先順位、若しくは順序を、又は方法の行為が実施される一時的な順序を意味するものではなく、単に、請求項の要素を識別するために、ある名前を有している１つの請求項の要素を同一の名前（順序を示す用語の使用を別とする）を有している別の要素から識別するためのラベルとして使用されている。

別段の指示がないかぎり、明細書及び特許請求の範囲において使用される数字はすべて、そのように明示されているか否かにかかわらず用語「約」によっていかなる場合にも修飾されているものとして理解されるべきである。さらに理解されるべきなのは、明細書及び特許請求の範囲において使用される明確な数値は、任意の指定された端点の内側にある全ての範囲及び部分的範囲がするように、本開示の追加の実施形態を形成する、ということである。加えて、ステップが開示される場合、明記されないかぎり該ステップはその順序で実施される必要はないことに注意されたい。

他の実施形態は、本明細書の考察及び本開示の実践から当業者には明白となろう。
参照文献
１．ハラルソン（Haralson）Ｍ．Ａ．及びハッセル（Hassell ）Ｊ．Ｒ．編「細胞外マトリックス 実践的アプローチ（Extracellular Matrix A Practical Approach ）」、オックスフォード大学出版局、１９９５年の中の、バージソン（Burgeson）Ｒ．Ｅ．著「第４Ｃ章．ＶＩＩ型コラーゲン（Chapter 4C. Type VII Collagen ）」。

２．チェン（Chen）Ｍ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２００２年、第２７７巻、ｐ．２１１８−２１２４。

Claims (21)

1. 細胞培養からの組換えヒト７型コラーゲン生成物を捕捉する方法において、
   ａ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、上清をデプスフィルタに供するステップと、
   ｂ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップと、
   ｃ）ステップｂ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、溶液を限外濾過ステップに供するステップと、
   ｄ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップｂ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、第１の保持液を廃棄するステップと、
   ｅ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップと、
   ｆ）組換え７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップと、
   ｇ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップと
   を備え、
   前記可溶化剤は尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含有する、方法。
2. ステップａ）の前に：
   Ｉ）組換えヒト７型コラーゲンを生産する宿主細胞を培養するステップ；及び
   ＩＩ）培養された宿主細胞から上清を採取するステップ
   をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 未精製バルク液体は、ステップｂ）から収集された上清中の組換えヒト７型コラーゲンのうち４０〜８０％を含有する、請求項１に記載の方法。
4. 細胞培養は、少なくとも２００リットルの量を用いてバイオリアクタ中で宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項３に記載の方法。
5. バイオリアクタは灌流バイオリアクタ又は流加培養式バイオリアクタである、請求項４に記載の方法。
6. 未精製バルク液体は５０グラムを上回る組換えヒト７型コラーゲンを含有する、請求項５に記載の方法。
7. 可溶化剤は、アルギニンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を行って組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料を得るステップを備えた、前記組換えヒト７型コラーゲンを精製する方法において、
   ａ）前記試料を、混合モードのフロースルー式樹脂に供するステップであって、混合モードのフロースルー式樹脂はリガンド活性化コア及び不活性シェルを含んでなり、不活性シェルは組換えヒト７型コラーゲンがリガンド活性化コアに入るのを防止し、かつ十分に小さい不純物は不活性シェルを通り抜けてリガンド活性化コアに結合する、試料を混合モードのフロースルー式樹脂に供するステップと、
   ｂ）混合モードのフロースルー式樹脂を通り抜け、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含有する、第１の流出液を収集するステップと、
   ｃ）ステップｂ）からの第１の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンが陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に結合することを可能にする条件下で陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に供するステップと、
   ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂から組換えヒト７型コラーゲンを溶出させるステップと、
   ｅ）ステップｄ）からの溶出した組換えヒト７型コラーゲンを、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂に供し、疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂を通り抜ける第２の流出液を収集するステップと、
   ｆ）ステップｇ）に先立ち、ステップｅ）からの第２の流出液に可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方を添加するステップと、
   ｇ）ステップｆ）の第２の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンを濃縮するために限外濾過ステップに供するステップと、
   ｈ）ステップｇ）からの濃縮された組換えヒト７型コラーゲンを、少なくとも１つの塩と、可溶化剤と、糖と含有するバッファーを用いて透析濾過するステップと、
   ｉ）精製された組換えヒト７型コラーゲンを回収するステップと
   を含んでなり、
   １以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを含んでなる方法。
9. 限外濾過ステップは接線流フィルタを含んでなり、接線流フィルタは親水性膜を含んでなる、請求項８に記載の方法。
10. １以上のウイルス低減ステップは、ステップａ）に先立ち組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料に放射線照射するステップ、ステップｂ）からの第１の流出液に界面活性剤を添加するステップ、及びステップｅ）からの第２の流出液を多孔質フィルタに供するステップ、を含んでなる、請求項８に記載の方法。
11. エンドヌクレアーゼ処理ステップは、ステップｄ）からの溶出された組換えヒト７型コラーゲンを、エンドヌクレアーゼで処理することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
12. バッファーは、少なくとも１つの塩、可溶化剤、及び糖質を含んでなり、前記可溶化剤は尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含有する、請求項８に記載の方法。
13. 少なくとも１つの塩は、塩化ナトリウム、クエン酸塩、及びリン酸ナトリウムのうち１以上であり、可溶化剤はアルギニンであり、糖質はスクロースである、請求項１２に記載の方法。
14. ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、ステップａ）からの試料中の組換えヒト７型コラーゲンの量の平均１５〜３０％を含有する、請求項１３に記載の方法。
15. ステップａ）における試料は少なくとも２５グラムの組換えヒト７型コラーゲンを含有する、請求項１４に記載の方法。
16. 少なくとも４．０グラムの精製された組換えヒト７型コラーゲンがステップｉ）において回収される、請求項１５に記載の方法。
17. ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞タンパク質を組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり６００ｎｇ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１６に記載の方法。
18. ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞ＤＮＡを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり１５ｐｇ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１７に記載の方法。
19. ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、エンドトキシンを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり０．５０ＥＵ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１８に記載の方法。
20. ステップａ）の前に：
    Ｉ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、上清をデプスフィルタに供するステップと、
    ＩＩ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップと、
    ＩＩＩ）ステップＩＩ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、ステップＩＩ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップと、
    ＩＶ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップＩＩ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、第１の保持液を廃棄するステップと、
    Ｖ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップと、
    ＶＩ）組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップと、
    ＶＩＩ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップと
    をさらに備え、
    前記可溶化剤は、尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記可溶化剤はアルギニンを含んでなる、請求項２０に記載の方法。

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