JP2016010406A - 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも、下記(1)及び(2)の要件を具備することを特徴とするヒト誘導肝幹細胞:
(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子である特定の遺伝子群を発現し;
(2)肝細胞で特徴的に発現している特定の遺伝子グループまたは肝細胞で特徴的に産生している特定のタンパク質グループを発現している。
【選択図】なし
Description
また、膨大な数の個人の差に対応するために、それらの差を網羅する複数のドナー由来の初代培養肝細胞を代表細胞として、各種試験に繰り返し使用することが可能であることが望ましい。しかしながら、初代培養肝細胞を培養皿で培養しても、ほとんど増殖培養できないため、同じ肝細胞を継代培養して、繰り返し、様々な試験に使用することは事実上不可能であるという問題もある。
このような諸事情から、肝細胞の性質を有し、長期にわたって継代培養可能である細胞が望まれているが、そのような細胞が膨大な数の個人の差を網羅する複数のドナーから見出されたという報告は未だなされていない。
つまり、未分化性維持に重要な因子と考えられているNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子、並びに、分化細胞の多数の性質(多数の分化遺伝子の発現)が共に発現する細胞は作製不可能であると考えられていた。
本発明の第2の目的は、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を作製する方法を提供することにある。
(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子を発現している。
(3)3日以上増殖培養又は継代培養可能である。
前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要な前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の使用比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく(請求項12)、特に、4:2:1であることが好ましい(請求項13)。
本発明の誘導肝幹細胞は、少なくとも、下記(1)〜(3)の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞である。
(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子である前記表1の遺伝子群の中から選択された少なくとも15種の遺伝子を発現している。
(2)肝細胞としての性質を有する。
(3)3日以上増殖培養又は継代培養可能である。
各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は前記表2の通りである。各遺伝子情報については、NCBIのホームページ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)から入手できる。
前記遺伝子は、一般に肝細胞で数多く発現している遺伝子であり、逆に胚性幹細胞も含めた肝細胞以外の細胞では、これらの遺伝子の多くは、実質的に発現していないことが知られている。
本発明の誘導肝幹細胞は、多様な肝細胞の性質を示すので、各種医薬品・化合物の代謝、作用機構の解析、肝臓の形成と機能を制御する分子の探索及び解析等に非常に有用である。従って、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験、抗ウイルス活性試験(特にB型・C型肝炎)、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬等の医薬品のスクリーニング試験、創薬標的のスクリーニング(肝繊維化、肝硬変、脂肪肝炎、メタボリックシンドローム、造血など)、肝細胞産生タンパク質の生産、動物モデル作製、再生医療等に用いることができる。
また本発明の製造方法においては、哺乳動物の細胞から本発明の誘導肝幹細胞への誘導時に、これらの遺伝子の遺伝子産物が特定の比率で細胞内に存在することが必要である。これにより、哺乳動物の細胞に内在される前記(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子が発現し、最終的に、本発明の誘導肝幹細胞が誘導される。
本発明の製造方法においては、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子に係る遺伝子産物の細胞内存在比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、順次、4:2:1となるように調節することが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。
また、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子と、これらの遺伝子の代わりに用いられる遺伝子を組み合わせて使用することは、本発明の好ましい実施態様である。
これらの成分は、前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地中に添加することが好ましい。
また、由来細胞が線維芽細胞でない場合、例えば、胃又は結腸がん患者由来の細胞のような上皮系細胞を用いる場合には、遺伝子導入後にフィーダー細胞との共培養を行うことが好ましい。
本発明の誘導肝幹細胞は、肝細胞としての性質を有するため、様々な肝細胞に特徴的なタンパク質を産生することができる。そこで、特定の肝細胞に特異的なタンパク質を生産する本発明の誘導肝幹細胞を培養し、肝細胞に特徴的なタンパク質を生産する方法などを例示することができる。
本発明の治療方法においては、哺乳動物の細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、哺乳動物の肝臓に移植する治療方法である。例えば、イヌの細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、イヌの肝臓に移植することができる。
POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクタープラスミドを、Fugene HD(ロシュ社製;Cat no.4709691)を用いて、パントロピックレトロウイルスベクター調製用パッケージング細胞であるPlat-GP細胞に導入し、レトロウイルスベクター液を調製した。遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは順に4:2:1の比率で使用した。4:2:1の比率は、パッケージング細胞に遺伝子を導入する時でもよく、また、別々にPOU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を作製して、4:2:1の比率で混合してもよい。詳細は、以下の通りである。
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、addgeneのベクターを用いた(後記表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs(addgene製) 2μg、KLF4-pMXs(addgene製) 1μg、SOX2-pMXs(addgene製) 0.5μg、Venus-pCS2(Nagai T et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol 2002; 20: 87-90.?) 0.5μg、VSV-G-pCMV(Cell Biolab製) 2μg、FuGENE HD(ロッシュ製) 18μlとした。
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs(Cell Biolab製) 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。
出生直後の組織であるヒト新生児皮膚組織由来の細胞(商品名:新生児正常ヒト皮膚繊維芽細胞;初代培養;Lot no. 7F3956)から、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。
凍結保存されたヒト新生児皮膚組織由来の細胞(初代培養;ロンザ社製;CC-2511;Lot no.7F3956)1本を、37℃の恒温槽中で解凍し、1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)及びFBSを10%含むD-MEM(高グルコース)(インビトロジェン社製;Cat no.11965-092)培地に懸濁し、10mlの細胞懸濁液を得た。
MEF
マイトマイシンC処理初代マウス胚性繊維芽細胞〔DSファーマバイオメディカル社製〕Cat no. R-PMEF-CF
馴化ES培地
ノックアウトD-MEM(インビトロジェン社製;Cat no. 10829-018)500ml
20%ノックアウト血清リプレースメント(インビトロジェン社製;Cat no. 10828-028)
50μg/ml ゲンタマイシン(インビトロジェン社製;Cat no. 15750-060)
1XMEM非必須アミノ酸液(インビトロジェン社製;Cat no.11140-050)
10 ng/ml bFGF(ぺプロテック社製;Cat no.100-18B)
0.1mM 2-メルカプトエタノール(シグマアルドリッチ社製;Cat no. M7154)
ノックアウトD-MEM(インビトロジェン社製;Cat no. 10829-018)500ml
20%ノックアウト血清リプレースメント(インビトロジェン社製; Cat no. 10828-028)
50μg/mlゲンタマイシン(インビトロジェン社製; Cat no. 15750-060)
1XMEM非必須アミノ酸液(インビトロジェン社製; Cat no.11140-050)
10ng/ml bFGF(ぺプロテック社製; Cat no.100-18B)
103U/ml 組み換え ヒトLIF(和光純薬社製; Cat no.129-05601)
0.1mM 2-メルカプトエタノール(シグマアルドリッチ社製; Cat no. M7154)
0.5μM ALK5阻害剤(A-83-01)(シグマアルドリッチ社製; Cat no.A5480)
0.5μM PD0325901(アクソンメディケム社製; Cat no.1408)
3μM CHIR99021(アクソンメディケム社製; Cat no.1386)
下記に新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代(p)とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日(day)を示した。
NFB1-3
day52: 24well(p1)→6well(p2)
day55: 6well(p2)→10cm(p3)
day61: passage (p4)
day62: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理 (p5)
ヒト胃がん(進行がん)患者のがん組織から細胞を単離した。得られた細胞に、3遺伝子(POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1)レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた胃がん(進行がん:男性、67歳、日本人)新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)(インビトロジェン社製;Cat no.14175-095)で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。更に、ハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ(和光純薬社製;Cat no.034-10533)/1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。
その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入から15日後から、フィーダーフリー用ヒトES/iPS細胞用培地 mTeSR 1 (ステムセルテクノロジー社製、Cat no.05850)で毎日培地交換を行った。
下記に胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導肝幹細胞の継代(p)とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日(day)を示した。
GC1-2
day37: 24well(p1)→6well(p2)
day43: 6well(p2)→10cm (p3)
day56: passage (p4)
day57: passage and stock (p5)
day60: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理
胃がん患者非がん組織由来の細胞に、3遺伝子(POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1)レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子を導入することによって、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた胃がん(進行がん:男性、67歳、日本人)患者の非がん新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)(インビトロジェン社製;Cat no.14175-095)で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)で上清が透明になるまで洗浄した後、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ(和光純薬社製;Cat no.034-10533)/1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)を加え、振盪器を用いて37℃で60分間攪拌した。
下記に胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代(p)とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日(day)を示した。
NGC1-2
day52: 24well(p1)→6well(p2)
day58: 6well(p2)→10cm(p3)
day65: passage, stock and Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理(p4)
ヒト結腸がん(S字結腸がん)患者のがん新鮮組織由来の細胞に3遺伝子(POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1)レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた結腸がん(S状結腸がん:男性、55歳、日本人)の一部をハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)(インビトロジェン社製;Cat no.14175-095)で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液(フェノールレッドを含まない)で上清が透明になるまで洗浄した。次いで、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ(和光純薬社製;Cat no.034-10533)/1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。
下記に結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代(p)とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日(day)を示した
CC1-4
day40: 6well(p2)→6well(p2)
day45: 6well(p2)→10cm(p3)
day51: passage and stock (p4)
day54: passage and stock (p5)
day59: passage and stock (p5)
day63: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理(p5)
成人皮膚組織由来の細胞(商品名:成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞;初代培養;ロンザ社製;Lot no.76582)からヒト誘導肝幹細胞を作製した。
凍結保存された成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞(初代培養;ロンザ社製;Lot no.76582)1本を、37℃の恒温槽中で解凍し、1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)及びFBSを10%含むD-MEM(高グルコース)(インビトロジェン社製;Cat no.11965-092)培地に懸濁させ、10mlの細胞懸濁液を得た。次いで、1000rpm、4℃で5分間遠心分離し上清を除去した後、FGM-2 BulletKit 20mlに懸濁させた。20μg/cm2の濃度のマトリゲル(ベクトンディクソン社製)で、底面を30分以上コーティングしたディッシュ100mm(ヌンク社製;Cat no. 172958)上に、該細胞懸濁液を10mlずつ加えて細胞を播種した。
下記に成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代(p)とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日(day)を示した。
AFB1-1
day50: 24well(p1)→6well(p2)
day54: 6well(p2)→10cm(p3)
day59: passage (p4)
day63: passage (p5)
day67: passage and stock and Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理 (p5)
細胞から培地を除きPBS(-)で洗浄した後、細胞剥離液を加えた。37℃で5分間静置したのち、細胞剥離液を除き、1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)及びFBS(インビトロジェン社製;Cat no.26140-079)を10%含むD-MEM(高グルコース)(インビトロジェン社製;Cat no.11965-092)培地を20ml加えて、1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤(インビトロジェン社製;Cat no.15240-062)及びmTeSR、10μM Y-27632を加え、MEF 1.0×106cells/dishが播種してあるゼラチンコート100mmに細胞懸濁液を播種した。
(1)0.25%トリプシン-1mM EDTA溶液(インビトロジェン社製;Cat no. 25200-056)
(2)10mg/mlコラゲネース (インビトロジェン社製;Cat no. 17104-019)10ml、
100mM 塩化カルシウム溶液1ml、
PBS 59ml、
2.5%トリプシン溶液(インビトロジェン社製;Cat no. 15090-046)10ml、
ノックアウト血清リプレースメント(インビトロジェン社製;Cat no.10828-028)20ml
ヒト誘導肝幹細胞(AFB1-1、NGC1-2)を、半年以上の長期に渡って継代培養を行った。培地は、mTeSR1(ステムセルテクノロジー・ベリタス社製)、bFGF添加霊長類ES/iPS細胞用培地(リプロセル社)、又はbFGF添加ReproStem(リプロセル社)などを用いた。MEF使用時にはコラーゲン又はゼラチンコートの培養皿を用いた。MEF非使用時にはマトリゲルコートした培養皿を用いた。その結果、0.05〜0.5μM A-83-01(TGF-βシグナル阻害剤、TGF-β type I receptor ALK5 kinase , type I activin/nodal receptor ALK4 and ALK7阻害剤)の添加は、ヒト誘導肝幹細胞の自己複製に有用であり、増殖速度、形態とも非常に良好であった。
アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ(4X44K)により、ゲノムワイドな遺伝子発現(mRNAのトランスクリプトーム)を解析した。
<試料>
実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞(NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4)のtotal RNAとゲノムDNAを、実施例2〜6において、事前にBuffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)で処理した溶液から、AllPrep DNA/RNA Mini Kit (50)(キアゲン社製;Cat no.80204)を用いて抽出した。
試料として、ヒト誘導肝幹細胞(NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4)のtotal RNA を使用した。
(1)クオリティーチェック
RNA用LabChip(アジレント社製の登録商標)キットを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer (アジレント社製)でtotal RNA の品質のチェックを行ったところ、全てのRNAサンプルのクオリティーは良好であった。また、NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies)で、RNA濃度及びRNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいてもcRNA合成に必要なtotal RNA量があることが確認され、純度も高いことが確認された。
各サンプルのtotal RNA (500ng)から、Quick Amp Labeling kit(アジレント社製)を用いて、アジレント社のプロトコールに従って、2本鎖cRNAを合成した。作製したcDNAから、in vitro transcriptionによりcRNAを合成した。この際、Cyanine色素で標識されたCTP(Cyanine 3-CTP)を取り込ませ、蛍光標識を行った。
Gene Expression Hybridization Kit(アジレント社製)を使用して、ハイブリダイゼーション標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、アジレント製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ(4X44K)上で17時間ハイブリダイズし、洗浄後、アジレントマイクロアレイスキャナで、DNAマイクロアレイのイメージを読み取り、Feature Extraction Software (v.9.5.3.1)を用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。
発現の有無は、全体の遺伝子発現の分布(各プローブの蛍光値の分布)の中央値を0として評価した。0を超えた発現値を示したプローブを、遺伝子発現を検出したプローブとし、遺伝子発現を有りとして、発現プローブの数として表した。
下記表6に、本発明のヒト誘導肝幹細胞において発現している、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子を示す。肝細胞で特徴的に発現しているアジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ(4X44K)の発現プローブ156(144遺伝子)の内、ヒト誘導肝幹細胞が発現していた発現プローブ数と各々の表にプローブ名(Probe name)、遺伝子シンボル(GeneSymbol)、ジェンバンクアセッションナンバー(Genebank Accession No)を記載した。
胃がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:GC1-2
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は138であった。
成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞:AFB1-1
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は133であった。
胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:NGC1-2
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、131であった。
新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞:NFB1-3
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、96であった。
結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:CC1-4
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、92であった。
ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している、アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ(4X44K)の発現プローブ数31(23の遺伝子;表12)の内、31のプローブ数が、実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞でヒト胚性幹細胞とほぼ同程度(1/4〜4倍以内)に発現していた。ヒト胚性幹細胞とその遺伝子のプローブ名(Probe name)、遺伝子シンボル(GeneSymbol)、ジェンバンクアセッションナンバー(Genebank Accession No)を記載した。
マイクロアレイの結果をさらに解析すると、本発明の誘導肝幹細胞は中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞に特徴的な性質を有していた。詳しくは、中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞で特徴的に発現する遺伝子であるSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子の全てを発現していた。実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞(NFB1-3、GC1-2、NGC1-2、AFB1-1、CC1-4)の内、肝細胞に特徴的な遺伝子が比較的少なく、低発現のヒト誘導肝幹細胞(NFB1-3、CC1-4)は、SOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子が他のヒト誘導肝幹細胞(GC1-2、NGC1-2、AFB1-1)より高発現していた。
実施例4で誘導した胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞(NGC1-2)と、実施例6で誘導した成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞(AFB1-1)を、Lab-Tek(登録商標) Chamber Slide(登録商標)System (Nunc社製、Cat no. 177429)に播種した。翌日培地を除き、PBS(-)で2回洗浄した後、10%ホルマリン溶液を加えて、室温で15分静置した。次いで、10%ホルマリン溶液を除き、PBS(-)で3回洗浄した後、0.1% Triton-X100 (ICN Biomedical社製)を加え、室温で15分静置した。次いで、0.1% Triton-X100溶液を除きPBS(-)で3回洗浄した後、ブロッキング溶液(TBS系;pH7.2)(ナカライテスク社製;Cat no.05151-35)を加えて室温で一時間静置した。50倍希釈した一次抗体を、4℃一晩あるいは室温で一時間反応させた。その後、PBS(-)で2回洗浄した後、500倍希釈した二次抗体を室温で30分間反応させた。使用した一次抗体及び二次抗体は、下記の通りである。
ヤギ抗ヒトNANOG抗体(R&Dシステム社製;Lot no.KKJ03)、マウス抗ヒトSSEA-4抗体(ミリポア社製;Lot no.LV1488380)、マウス抗ヒトCD9抗体(R&Dシステム社製;Lot no.JOK04)、ウサギ抗ヒトα-1-Fetoprotein抗体(ダコ社製;Lot no.A 0008)、マウス抗ヒトAlbumin抗体(シグマアルドリッチ社製;Lot no.A6684)
ロバ抗ヤギIgG抗体Alexa Fluor594標識(インビトロジェン社製;Cat no.A11058)、ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor488標識(インビトロジェン社製;Cat no.A11001)、ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor594標識(インビトロジェン社製;Cat no.A11005)、ロバ抗ウサギIgG抗体Alexa Fluor488標識(インビトロジェン社製;Cat no.A21206)
アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ(4X44K)を用いて、C型肝炎ウイルス(HCV)の複製に重要な遺伝子であるCD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子を解析した。解析ソフトは、GeneSpring GX 10.0を使用し、ノーマライゼーションは、50th percentileで行った。実験手法は実施例8と同様である。
3種類のヒト胚性幹細胞、hES_H9(GSM194390)、hES_BG03(GSM194391)及びhES_ES01(GSM194392)と、誘導多能性幹細胞、iPS cells 201B7(GSM241846)のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。
また、本発明においては、さらに、胚性幹細胞に特徴的に発現するNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子などは、様々な生体中の細胞を生体外で自己複製させる「自己複製遺伝子」として機能する。
本発明の誘導肝幹細胞は、肝臓の形成と機能を制御する分子の探索及び解析、例えば、肝繊維化、肝硬変、脂肪肝炎、メタボリックシンドローム、造血などにおける創薬、並びに各種医薬品・化合物の代謝、作用機構の解析、ワクチン作製、バイオリアクターへの応用などに非常に有用である。
Claims (6)
- 少なくとも、下記(1)及び(2)の要件を具備することを特徴とするヒト誘導肝幹細胞:
(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択され、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、NANOG遺伝子、ZFP42遺伝子、及びSALL4遺伝子を含む、少なくとも15種の遺伝子を発現するか又はNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、及びGABRB3遺伝子を含む、少なくとも15種の遺伝子を発現し;
(a)SERPINA1遺伝子、ALB遺伝子、FGA遺伝子、及びAGT遺伝子;
(b)TF遺伝子、AHSG遺伝子、及びFABP1遺伝子;
(c)ASGR2遺伝子、C3遺伝子、C5遺伝子、F2遺伝子、SERPINA3遺伝子、SERPINA5遺伝子、SLC13A5遺伝子、及びVTN遺伝子;
(d)アルファ-フェトプロテイン(AFP)遺伝子、トランスサイレチン(TTR)遺伝子、アルブミン(ALB)遺伝子、及びアルファ1-アンチトリプシン(AAT)遺伝子;
(e)AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子、及びRBP4遺伝子;及び
(f)CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子、及びCLDN1遺伝子、
又は肝細胞で特徴的に産生している、タンパク質グループ(g)を発現している:
(g)アルファ-フェトプロテイン(AFP)タンパク質及びアルブミン(ALB)タンパク質。 - 前記ヒト誘導肝幹細胞で発現している前記(1)に記載の胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、ヒト胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/4から4倍である、請求項1に記載されたヒト誘導肝幹細胞。
- 更に、被検物質により、下記表2の遺伝子群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害される、請求項1又は2に記載されたヒト誘導肝幹細胞。
- 請求項1〜3の何れかに記載されたヒト誘導肝幹細胞を、TGF-betaシグナル阻害剤、Rho associatied kinase(Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ)の阻害剤、MEK(mitogen activated protein kinase)/ERK(extracellular signal regulated kinases 1 and 2)経路阻害剤、及び/又はGSK(Glycogen Synthase Kinase)3阻害剤を添加した培地中で培養する工程を含む、ヒト誘導肝幹細胞の培養方法。
- 請求項4に記載されたヒト誘導肝幹細胞の培養方法であって、TGF-betaシグナル阻害剤がA-83-01、Rho associatied kinase(Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ)の阻害剤がY-27632、MEK(mitogen activated protein kinase)/ERK(extracellular signal regulated kinases 1 and 2)経路阻害剤がPD0325901、及びGSK(Glycogen Synthase Kinase)3阻害剤がCHIR99021であるヒト誘導肝幹細胞の培養方法。
- 請求項1〜3の何れかに記載されたヒト誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする非ヒト動物モデル作製方法。
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