KR101657318B1 - 다분화성/다능성 세포 및 방법 - Google Patents

다분화성/다능성 세포 및 방법 Download PDF

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데츠야 이시카와
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Abstract

본원에서는 다분화성 줄기 세포, 예를 들면, 인간 및 다른 포유동물의 다능성 줄기 세포 및 관련 방법을 기술한다.

Description

다분화성/다능성 세포 및 방법{MULTIPOTENT/PLURIPOTENT CELLS AND METHODS}
상호 참조
본 출원은 2007년 6월 15일 출원된 일본 특허 출원 JPO 2007 - 159382, 2007년 11월 20일 출원된 PCT/EP2007/010019 및 2008년 3월 28일 출원된 미국 출원 61/040,646(상기 문헌 3개 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 이익을 주장한다.
발명의 배경
재생 의료 분야는 손상된 세포, 조직, 또는 기관의 수복, 대체, 또는 재생을 돕도록 디자인된 요법을 포함한다. 재생 의료의 한 분야로는, 다양한 세포 유형의 근원이 될 수 있는 잠재능을 갖고 있는 배아 줄기 세포(ES: stem cell)에 의존하는 세포 요법을 포함한다. ES에 기반한 세포 요법은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 척수 손상, 심장 마비, 신부전증, 골다공증, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 화상 및 상처를 비롯한 각종 건강상의 병태를 치료할 수 있다는 장래성을 보인다. 그러나, 수혜자와는 면역학적으로 부적합성인 기증자로부터 유래된 ES 세포의 면역 거부의 가능성을 비롯한, 여러 인자들의 방해로 인해 상기와 같은 요법은 진보되지 못했다.
발명의 요약
본 개시는 몇몇 경우에는 다능성이고, 몇몇 경우에는 다분화인간 성체 줄기 세포를 포함한다. 본 개시는 추가로 상기 인간 줄기 세포를 재생시키는 방법, 상기 인간 줄기 세포를 사용하는 방법 및 관련 조성물을 포함한다.
따라서, 본원의 하나의 측면에서는 다능성이고, 체세포성이며, 비배아성이고, 장기간 자가 재생능을 갖는 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인간 줄기 세포는 Oct3/4 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 외인성 유전자, Sox2 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 외인성 유전자 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 외인성 유전자를 비롯한 외인성 유전자를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 외인성 유전자를 포함하는 인간 줄기 세포는, 제1의 외인성 유전자가 Oct3/4 폴리펩티드를 코딩하고, 제2의 외인성 유전자가 Sox2 폴리펩티드를 코딩하고, 제3의 외인성 유전자가 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 3종 및 단지 3종의 외인성 유전자만을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 외인성 유전자는 필수적으로 바로 앞에서 언급한 제1, 제2 및 제3의 외인성 유전자로 구성된다. 또다른 실시태양에서, 외인성 유전자는 Oct3/4 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 외인성 유전자, Sox2 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 외인성 유전자, Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 외인성 유전자 및 마우스의 유래의 양이온성 아미노산 수송체(mCAT: mouse-derived cationic amino acid transporter)(예로서, mCAT1)의 아미노산 서열을 코딩하는 제4의 외인성 유전자를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 외인성 유전자를 포함하는 인간 줄기 세포는, 제1의 외인성 유전자가 Oct3/4 폴리펩티드를 코딩하고, 제2의 외인성 유전자가 Sox2 폴리펩티드를 코딩하고, 제3의 외인성 유전자가 Klf4 폴리펩티드를 코딩하고, 제4의 외인성 유전자가 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 4종 및 단지 4종의 외인성 유전자만을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 외인성 유전자는 필수적으로 바로 앞에서 언급한 제1, 제2, 제3 및 제4의 외인성 유전자로 구성된다. 몇몇 실시태양에서, 외인성 유전자는 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 외인성 유전자를 포함하는 인간 줄기 세포는 외인성 c-Myc 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 외인성 유전자는 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 외인성 유전자가 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 경우, 외인성 유전자는 마우스의 유래의 양이온성 아미노산 수송체(mCAT)의 아미노산 서열을 코딩하는 제5의 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 외인성 유전자는 TERT 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 외인성 유전자는 HPV16 E6 폴리펩티드 또는 HPV16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 외인성 유전자는 TERT 폴리펩티드, SV40 대형 T 항원 폴리펩티드, HPV16 E6 폴리펩티드, 또는 Bmi1 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 추가의 다른 실시태양에서, 외인성 유전자를 포함하는 인간 줄기 세포는 암을 유도할 수 있는 외인성 유전자를 포함하지 않는다. 추가의 다른 실시태양에서, 인간 줄기 세포는 하기: Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드 중 3가지 이상을 코딩하는 외인성 유전자를 포함한다.
본원의 또다른 측면에서는 체세포성이고, 비배아성이며, 알칼리성 포스파타제 양성이고, 유전자 TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog) 중 2가지 이상을 발현하는 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 줄기 세포는 다능성이다.
본원의 관련된 측면에서는 인간 배아 줄기 세포와 비교할 때 1 내지 1000개의 유전자(예로서, 1 내지 700개의 유전자, 1 내지 500개의 유전자, 1 내지 300개의 유전자, 1 내지 200개의 유전자, 1 내지 100개의 유전자, 1 내지 50개의 유전자, 3 내지 20개의 유전자, 5 내지 20개의 유전자, 5 내지 50개의 유전자, 10 내지 50개의 유전자, 20 내지 50개의 유전자, 30 내지 100개의 유전자, 또는 50 내지 100개의 유전자)가 더 높은 수준으로 유전자 발현을 하는 것인 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 인간 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 양성이며, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, Tert, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되는 2개 이상의(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 유전자를 발현한다.
본원의 또다른 측면에서는 인간 배아 줄기 세포와 비교할 때 본원에서 제공되는 표 13, 15, 또는 16에 열거된 유전자들 중 2개 이상(예로서, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상)의 유전자가 더 높은 수준으로 유전자 발현을 하는 것인 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 인간 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 양성이며, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, Tert, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되는 2개 이상의(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 유전자를 발현한다.
본원의 추가의 측면에서는 본원에서 제공되는 인간 배아 줄기 세포와 비교할 때 표 14에 열거된 유전자들 중 2개 이상(예로서, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상)의 유전자가 더 낮은 수준으로 유전자 발현을 하는 것인 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 인간 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 양성이며, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, Tert, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되는 2개 이상의(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 유전자를 발현한다.
본원의 또다른 측면에서는 인간 배아 줄기 세포와 비교할 때 1 내지 1000개의 유전자(예로서, 1 내지 300개의 유전자, 또는 1 내지 50개의 유전자)가 더 낮은 수준으로 유전자 발현을 하는 것인 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 인간 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 양성이며, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, Tert, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되는 2개 이상의(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 유전자를 발현한다.
본원의 추가의 측면에서는 1 내지 100개의 유전자의 발현 수준이 인간 배아 줄기 세포보다는 인간 섬유아세포에서의 발현 수준에 더 가까운 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 인간 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 양성이며, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, Tert, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되는 2개 이상의(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 유전자를 발현한다.
본원의 추가의 또다른 측면에서는 배양된, 인간 피험체로부터 유래된 출생 후 비배아성 세포 군집에서 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시켜 자가 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 이러한 방법에 생성된 자가 줄기 세포는 테라토마를 형성할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 그렇게 생성된 자가 줄기 세포는 다능성이다.
본원의 추가의 또다른 측면에서는 인간의 출생 후 세포에서 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시켜, 핵 대 세포질의 비가 높은 세포 콜로니로서 주위에 있는 세포보다 크기가 더 작은 하나 이상의 세포 콜로니를 얻는 단계 및 상기 하나 이상의 콜로니 중 적어도 하나를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 인간 줄기 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 바로 앞에서 언급한 방법에 의해 생성된 인간 줄기 세포는 다능성 인간 줄기 세포이다. 몇몇 실시태양에서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드의 강제 발현은 하나 이상의 발현 벡터, 예로서, 레트로바이러스 발현 벡터, 렌티바이러스 발현 벡터, 아데노 관련 바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, 재조합 레트로바이러스, 또는 핵산 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드 발현 벡터를 인간의 출생 후 세포 내로 도입함으로써 달성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 언급한 방법은 인간의 출생 후 세포에서의 c-Myc 폴리펩티드의 강제 발현을 포함하지 않는다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 인간의 출생 후 세포에서의 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자의 강제 발현을 포함하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 추가로 인간의 출생 후 세포에서의 c-Myc 폴리펩티드의 강제 발현을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명이 c-Myc 폴리펩티드의 강제 발현을 포함하는 경우, 본 방법은 외인성 유전자가 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 유도 인자를 코딩하는 4종 및 단지 4종의 외인성 유전자만을 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 4개의 외인성 유전자가 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 유도 인자를 코딩하는 4개의 외인성 유전자를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 필수적으로 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드 세트를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 외인성 유전자가 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 유도 인자를 코딩하는 3종 및 단지 3종의 외인성 유전자만을 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 필수적으로 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드 세트를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 인간 줄기 세포를 생성하는 상기 언급한 방법은 또한 인간의 출생 후 세포를 히스톤 데아세틸라제 저해제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 언급한 방법은 인간의 출생 후 세포 내로 (i) Oct3/4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제1의 정제된 폴리펩티드; (ii) Sox2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제2의 정제된 폴리펩티드; 및 (iii) Klf4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제3의 정제된 폴리펩티드를 도입시킴으로써 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 제1, 제2 및 제3의 정제된 폴리펩티드 중 적어도 하나는 추가로 단백질 도입 도메인을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 인간 줄기 세포는 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는다: 다능성; 다분화성; 테라토마 형성능; 정상적인 이배체 핵형; 적어도 약 30회 내지 적어도 약 100회 계대될 수 있는 있는 자손; 인간 배아 줄기 세포보다 더 짧은 텔로미어; (예로서, 5% 산소 내지 약 21% 산소 초과의) 대기 산소 조건하에서 미분화된 표현형을 갖는 것으로 증식할 수 있는 능력; 콜로니 증식; 생물학적 시료로부터 조제된 후 4회 이상 계대된 인간 체세포 또는 출생 후 세포로부터의 유도; 인간 태아 체세포로부터의 유도; 인간 성체 체세포로부터의 유도; 인간 성체 피부 섬유아세포, 성체 말초 혈액 단핵 세포, 인간 성체 골수 유래의 단핵 세포, 인간 신생아 피부 섬유아세포, 인간 배꼽 정맥 내피 세포, 인간 배꼽 동맥 평활근 세포, 인간 출생 후 골격근 세포, 인간 출생 후 지방 세포, 인간 출생 후 말초 혈액 단핵 세포, 또는 인간 제대혈 단핵 세포 중 임의의 것을 포함하는 세포 군집으로부터의 유도; 군집이 냉동 보관된 후 조제 전에 해동시킨 세포 조성물로부터 제조된 것인, 상기 세포 군집으로부터의 유도.
본원에서 제공하는 다수의 측면은 상기 기술된 인간 줄기 세포 중 임의의 것에 관한 것이다. 그러한 측면으로는 정제된 인간 줄기 세포 군집; 인간 줄기 세포로부터 분화된 세포(예로서, 정제된 분화 세포 군집)을 포함한다. 그러한 분화된 줄기 세포로는 췌장 베타 세포, 신경 줄기 세포, 피질 뉴런, 도파민성 뉴런, 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포 전구 세포, 간 세포 또는 간 세포 줄기 세포, 또는 심근 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 관련된 측면은 인간 줄기 세포를 동결보존 배지 중에 현탁시키고, 생성된 현탁액을 냉동시켜 인간 줄기 세포를 보관하는 방법; 인간 줄기 세포를 분화시켜 (상기 분화된 세포 중 임의의 것을 비롯한) 분화된 세포를 생성하는 방법; 분화된 세포(예로서, 다른 세포 유형은 실질적으로 포함하지 않는 분화된 세포)를 인간 피험체로 도입하는 방법으로서, 여기서, 분화된 세포는 피험체와 동일한 게놈을 공유하거나, 피험체와 면역적합성인 것인 방법을 포함한다. 추가의 관련된 측면으로는 인간 줄기 세포 및 동결보존 배지를 포함하는 조성물; 인간 줄기 세포 및(예로서, 약 4 ng/ml 내지 약 100 ng/ml 농도의) 정제된 성장 인자를 포함하는 배지를 포함하는 조성물을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 성장 인자는 bFGF, FGF-2, PDGF, EGF, IGF, 인슐린, TGFb-1, 액티빈 A, noggin(Noggin), BDNF, NGF, NT-1, NT-2, 또는 NT-3, IGF, IGFI, IGFII, 또는 FGF 패밀리의 성장 인자의 구성원 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
추가의 또다른 측면에서 본원에서는 하기 성분들:
i. 단백질 도입 도메인 및 Oct3/4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
ii. 캐리어 시약 및 정제된 Oct3/4 폴리펩티드;
iii. 단백질 도입 도메인 및 Sox2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
iv. 캐리어 시약 및 정제된 Sox2 폴리펩티드;
v. 단백질 도입 도메인 및 Klf4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
vi. 캐리어 시약 및 정제된 Klf4 폴리펩티드;
vii. 단백질 도입 도메인 및 c-Myc 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
viii. 캐리어 시약 및 정제된 c-Myc; 또는
(i) 내지 (viii)의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 언급한 조성물은 성분 (i) 내지 (viii) 중 적어도 2개, 3개, 또는 4개를 함유한다. 추가의 측면에서, 본원에서는 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인간의 출생 후 세포에서 강제 발현시켜 인간 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 사용된 인간의 출생 후 세포는 생물학적 시료로부터 조제된 후 4회 이상 계대하였다. 몇몇 실시태양에서, 인간의 출생 후 세포는 냉동 보관 후 해동시킨, 인간의 출생 후 세포를 포함하는 조성물로부터 제조하였다. 하나의 실시태양에서, 인간의 출생 후 세포는 성인으로부터 유래된 것이다. 본 발명에서 사용되는 인간의 출생 후 세포는 인간 성체 골수 유래의 단핵 세포, 인간 신생아 피부 섬유아세포, 배꼽 정맥 내피 세포, 배꼽 동맥 평활근 세포, 출생 후 골격근 세포, 출생 후 지방 세포, 출생 후 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 단핵 세포, 또는 태반 세포를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에서 사용되는 인간의 출생 후 세포는 생물학적 시료로부터 조제된 후 4회 이상 계대된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 출생 후 인간 세포는 강제 발현 이전에 약 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠의 밀도로 배양된다. 몇몇 실시태양에서, 인간의 출생 후 세포는 5% 이하(예로서, 2% 이하)의 혈청 농도의 존재하에 배양된다. 몇몇 실시태양에서, 인간의 출생 후 세포는 강제 발현 이전에 bFGF, FGF-2, PDGF, EGF, IGF, 인슐린, TGFb-1, 액티빈 A, 노긴(noggin), BDNF, NGF, NT-1, NT-2, NT-3, 또는 FGF-성장 인자 패밀리 구성원 중 하나 이상의 존재하에 배양된다.
몇몇 실시태양에서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드의 강제 발현은 인간의 출생 후 세포 내로, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 도입시킴으로써 수행된다. 그러한 벡터로는 예로서, 재조합 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 아데노바이러스; 레트로바이러스 발현 벡터, 렌티바이러스 발현 벡터, 핵산 발현 벡터, 또는 플라스미드 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시태양에서, 강제 발현을 위해 재조합 레트로바이러스가 사용되는 경우, 본 방법은 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 레트로바이러스 벡터를 도입하기 이전에 마우스 유래의 양이온성 아미노산 수송체(mCAT) 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터를 배양된 인간 세포 군집 내로 도입하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 방법은 c-Myc 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 방법은 c-Myc 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 TERT 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 방법은 또한 출생 후 인간 세포를 히스톤 데아세틸라제 저해제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계는 인간의 출생 후 세포 내로 하나 이상의 발현 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 인간 줄기 세포를 생성하는 상기 방법은 또한 강제 발현 이후에 하나 이상의 콜로니 주위에 있는 세포보다 크기가 더 작은 하나 이상의 세포 콜로니를 단리하는 단계 및 알칼리성 포스파타제, 나노그(Nanog), TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, CYP26A1, TERT 및 zfp4를 발현하는 하나 이상의 콜로니 중 적어도 하나를 동정하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 방법은 인간의 출생 후 세포 배양물 내로 (i) Oct3/4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제1의 정제된 폴리펩티드; (ii) Sox2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제2의 정제된 폴리펩티드; 및 (iii) Klf4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 제3의 정제된 폴리펩티드를 도입시킴으로써 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 바로 앞에서 언급한 폴리펩티드 중 적어도 하나는 추가로 단백질 도입 도메인을 포함한다.
다른 실시태양에서, 인간의 출생 후 세포에서 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계는 인간의 출생 후 세포를
i. 단백질 도입 도메인 및 Oct3/4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
ii. 캐리어 시약 및 정제된 Oct3/4 폴리펩티드;
iii. 단백질 도입 도메인 및 Sox2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
iv. 캐리어 시약 및 정제된 Sox2 폴리펩티드;
v. 단백질 도입 도메인 및 Klf4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드;
vi. 캐리어 시약 및 정제된 Klf4 폴리펩티드;
vii. 단백질 도입 도메인 및 c-Myc 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드; 또는
(i) 내지 (vii)의 임의의 조합 중 하나 이상과 접촉시킴으로써 수행된다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 방법에 의해 생성된 인간 줄기 세포는 테라토마를 형성할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 이러한 방법에 의해 생성된 인간 줄기 세포는 다능성인 바, 외배엽, 중배엽 및 내배엽을 생성할 수 있다.
또다른 측면에서, 본원에서는
(i) 제1 및 제2의 배양된 인간 체세포를 제공하는 단계;
(ii) 제1의 배양된 인간 체세포를 테스트 시약과 접촉시키는 단계;
(iii) 제2의 배양된 인간 체세포를 음성 대조군 시약과 접촉시키는 단계;
(iv) 접촉시킨 제1 및 제2의 배양된 세포에서 배아 줄기 세포 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)에서 측정된 발현 수준을 비교하여, 접촉시킨 제1의 배양된 세포에서의 배아 줄기 세포 마커 유전자 발현 수준이 접촉시킨 제2의 배양된 세포에서 측정된 것보다 더 높을 경우에는 상기 테스트 시약이 다능성 또는 다분화성을 자극하는 것임을 표시하고, 접촉시킨 제1의 배양된 세포에서의 배아 줄기 세포 마커 유전자 발현 수준이 접촉시킨 제2의 배양된 세포에서 측정된 것과 동일하거나 그보다 낮을 경우, 상기 테스트 시약이 다능성 또는 다분화성을 자극하지 못하는 것임을 표시하며, 여기서, 배아 줄기 세포 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 Tert 또는 Cyp26a1의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 단계를 포함하는, 인간 체세포(예로서, 출생 후 인간 체세포)에서 다능성 또는 다분화성을 자극하는 시약을 동정하는 방법을 제공한다.
단계 (iv)에서 측정된 발현 수준을 비교하여, 접촉시킨 제1의 배양된 세포에서의 배아 줄기 세포 마커 유전자 발현 수준이 접촉시킨 제2의 배양된 세포에서 측정된 것보다 더 높을 경우, 상기 테스트 시약이 다능성 또는 다분화성을 자극하는 것임을 표시하고, 접촉시킨 제1의 배양된 세포에서의 배아 줄기 세포 마커 유전자 발현 수준이 접촉시킨 제2의 배양된 세포에서 측정된 것과 동일하거나 그보다 낮을 경우, 상기 테스트 시약이 다분화성 또는 다능성을 자극하지 못하는 것임을 표시하며, 여기서, 배아 줄기 세포 마커 유전자는 Tert 또는 Cyp26a1을 포함하는 것이다.
추가의 측면에서, 본원에서는
(i) 피험체와 면역적합성인 기증자를 확인하는 단계;
(ii) 유도된 다능성 줄기 세포주를 기증자의 출생 후 세포로부터 생성하는 단계; 및
(iii) 유도된 다능성 줄기 세포주로부터 분화된 하나 이상의 세포를 피험체에 이식하는 단계를 포함하는, 세포 이식을 필요로 하는 피험체에서 세포 이식을 실시하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, HLA 유전자형이 수혜자의 HLA 유전자형과 합치된다면, 기증자는 면역적합성인 것으로 확인된다. 하나의 실시태양에서, 면역적합성인 기증자는 면역적합성인 기증자로부터 유래된 혈액 시료의 유전자형 분석을 통해서 확인된다. 몇몇 실시태양에서, 유도된 다능성 줄기 세포주는 혈액 단핵 세포로부터 유도된다.
본원에 기술된 인간 줄기 세포, 조성물 및 방법의 몇몇 실시태양에서, Oct3/4 폴리펩티드는 서열 번호 7과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, Sox2 폴리펩티드는 서열 번호 9와 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, Klf4 폴리펩티드는 서열 번호 11과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, c-Myc 폴리펩티드는 서열 번호 13과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, Oct3/4 폴리펩티드는 서열 번호 6과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, Sox2 폴리펩티드는 서열 번호 8과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, Klf4 폴리펩티드는 서열 번호 10과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하거나, c-Myc 폴리펩티드는 서열 번호 12과 적어도 70% 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, Oct3/4 폴리펩티드는 인간 Oct3/4 또는 마우스 Oct3/4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하고; Sox2 폴리펩티드는 인간 Sox2 또는 마우스 Sox2의 아미노산 서열을 포함하고; Kif4 폴리펩티드는 인간 Klf4 또는 마우스 Klf4의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, Oct3/4 폴리펩티드는 Oct3/4 이외의 Oct 패밀리 구성원이고, Sox2 폴리펩티드는 Sox2 이외의 Sox 패밀리 구성원이고, Klf4 폴리펩티드는 Klf4 이외의 Klf 패밀리 구성원이고, c-Myc 폴리펩티드는 c-Myc 이외의 c-Myc 패밀리 구성원이다. 몇몇 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 유도가능한 활성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 c-Myc-에스트로겐 수용체(c-Myc-ER: c-Myc-estrogen receptor) 융합 폴리펩티드이다.
참고 문헌 인용
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 인용된 것처럼 본원에서 동일한 정도로 인용된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부하는 청구의 범위에서 언급된다. 본 발명의 원리가 사용되는 예시적인 실시태양을 기술한 하기의 상세한 설명을 참고로 하여 본 발명의 특징과 잇점을 보다 잘 이해할 수 있을 것이며, 첨부 도면은 다음과 같다:
도 1은 유도 과정과 세포 용도의 접근법에 관한 개요이다.
도 2는 4개의 유전자 도입 후 인간 성인 골수 유래 세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 저혈청 조건하에서 인간 성인 골수로부터 유래된 단핵 세포로부터 수립된 세포로 도입하였다. 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고, 정량적 PCR에 의해 인간 Nanog 및 인간 Tert 유전자의 발현을 입증하였다. 4개의 유전자가 도입되어 있지 않은 섬유아세포 및 중간엽 줄기 세포를 본 실험에서는 대조군으로서 사용하였다. 유전자 발현량은, 발현량을 인간 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT: human hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 유전자의 발현량에 의해 표준화하여, 신생아 피부 섬유아세포로부터 유도된 알칼리성 포스파타제(ALP: Alkaline Phosphatase) 양성 콜로니에 있어서의 HPRT 유전자 발현량을 1로 한 상대치로서 제공한다. Nanog 및 Tert의 발현은, 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)가 도입되고, ALP 양성 콜로니에서 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 3은 4개의 유전자 도입 후 신생아 섬유아세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 신생아 피부로부터 유래된 1차 배양 섬유아세포로 도입하고; 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고; 정량적 PCR에 의해 인간 Nanog 및 인간 Tert 유전자의 발현량을 측정하였다. 4개의 유전자가 도입되어 있지 않은 모체 섬유아세포 및 중간엽 줄기 세포를 본 실험에서는 대조군으로서 사용하였다. 유전자 발현은 도 2에 개요된 동일 방법을 사용함으로써 표준화하였다. Nanog 및 Tert의 발현은, 4개의 유전자가 도입되고, ALP 양성 콜로니에서 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 4는 3개의 유전자 도입 및 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 처리 이후 마우스 성체 골수 유래 세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. 3개의 유전자(Oct3/4, Sox2 및 Klf4)를 저혈청 조건하에서 수립된 마우스 골수 유래 세포에 도입하였다. 또한, 세포를 HDAC 저해제인 MS-275(0.1 또는 1.0 μM)로 처리하였다. 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고, 정량적 PCR에 의해 Nanog 발현량을 측정하였다. 3개의 유전자가 도입되고, 히스톤 데아세틸라제 저해제로 처리된 세포로부터 ALP 양성의 세포군(콜로니)이 형성되었고, 이들 콜로니에서의 Nanog 발현이 ALP 음성 콜로니에서보다 현저히 높은 것으로 확인되었다. 본 도면에서, W1, W2, W3, W4, W5 및 W6은 실시예 12에서 사용된 6웰 플레이트의 각 웰 번호를 나타낸다.
도 5는 인간 iPS 클론 1-8의 특징을 규명한 것이다. 그의 모체 섬유아세포(로트 5F0438)의 형태는 패널 a에 제시되어 있고; 뮤린 배아 섬유아세포(MEF: murine embryonic fibroblast) 영양 세포 상에서 배양된 인간 iPS 클론 1-8 세포의 형태는 패널 b에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 인간 iPS 클론 1-8 세포의 형태는 패널 c에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 클론 2-4 세포는 패널 d에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 클론 3-2 세포는 패널 e에 제시되어 있다. 클론 1-8의 성장 곡선은 패널 f 및 g에 제시되어 있다. 화살표는 검사일을 나타낸다. 사각형으로 표시한 것은 세포 증식율을 예측하기 위해 세포 갯수를 계수한 기간을 나타낸다. 패널 h는 101일째 iPS 클론 1-8 유래 세포의 정상 핵형을 나타낸, 다색 핵도 영상이다.
도 6은 인간 iPS 클론 1-8에서 전사 인자, 세포 표면 항원 및 ALP 활성의 특징을 규명한 것이다. 인간 iPS 세포(클론 1-8)는 Nanog(패널 a), SSEA-3(패널 b), SSEA-4(패널 c), TRA-1-60(패널 d), TRA-1-81(패널 e), CD9(패널 f), CD24(패널 g), Thy-1(CD90으로도 명명된)(패널 h)에 대해 염색되었다. 녹색 형광 염색은 인간 iPS 클론 1-8이 이들 표면 항원들 모두를 발현한다는 것을 시사한다. ALP 염색은 iPS 클론 1-8이 ALP 양성이라는 것을 시사한다. 화살표는 녹색 형광 염색 부위를 나타낸다.
도 7은 인간 iPS 클론 1-8 세포의 유전자 발현에 관한 RT-PCR을 나타낸다. 패널 a는 클론 1-8 및 그의 모체 섬유아세포(NeoFB)에서의 hES 마커 유전자 발현에 관한 RT-PCR을 도시한다. CYP26A1(35회 반복)을 제외한 유전자들은 30회 반복으로 검출되었다. 패널 b는 클론 1-8에서 4개의 트랜스유전자의 침묵화를 도시한다. 유전자 형질도입 후 17일째 수득한 조 섬유아세포를 대조군으로서 사용하였다. "외인성" 프라이머 세트는 외인성 유전자의 발현을 선택적으로 검출하고; "전체" 프라이머 세트는 내인성 및 외인성 유전자 발현, 둘 모두를 검출하였다.
도 8은 인간 iPS 클론 1-8 세포의 전체 유전자 발현에 관한 산점도 분석을 나타낸다. 산점도는 mTeSR1에서 배양된 인간 iPS 클론 1-8 세포와 MEF를 포함하는 H14 hES 세포(공개 데이타베이스 GEO로부터의 GSM151741) 사이의 전체 유전자 발현에 관한 비교(패널 a), 또는 클론 1-8과 그의 모체 섬유아세포 사이의 전체 유전자 발현에 관한 비교(패널 b)를 나타낸다. 산점도 둘 모두에서 ES 세포 특이 유전자의 기호는 선으로 표시하였다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다. 화살표는 색상을 띤 대표적인 부분을 나타낸다.
도 9는 상이한 세포주의 전체 유전자 발현과 전체 유전자 발현 분석에 기초한 유전자 수형도를 나타낸다. 국제 줄기 세포 법안(International Stem Cell Initiative)(표 21 참조)에 의해 확인된 유전자 세트에 기초하여 세포를 유전자 수형도로 군집화하였다. 시료는 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR"; MEF 조절된 배지에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8CM"; 냉동 해동 처리 후에 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR(f&t)"; MEF에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8MEF"; mTeSR에서 배양된 클론 2-4의 경우, "2-4 mTeSr"; MEF 배지에서 배양된 클론 2-4의 경우, "2-4MEF"; mTeSR에서 배양된 클론 3-2의 경우, "3-2mTeSR"; 모체 섬유아세포의 경우, "5F0438" 또는 "5F0416"; MEF에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES1," "hES2," "hES3"(각각 GSM 194307, GSM 194308, GSM 194309); 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES4," 또는 "hES5"(각각 GSM 194313, GSM 194314); MEF 상에서 배양된 H14 세포주의 경우, "hES6," 또는 "hES7"(GSM151739, GSM151741); 각각 GSM96262의 경우, "섬유아세포 1"; GSM96263의 경우, "섬유아세포 2" 및 GSM96264의 경우, "섬유아세포 3"으로 명시한다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다.
도 10은 상이한 세포주의 전체 유전자 발현과 전체 유전자 발현 분석에 기초한 유전자 수형도를 나타낸다. 섬유아세포(3개의 GEO 데이타)와 비교하였을 때 0.99 내지 1 사이의 비율로 인간 ES 세포(7개의 GEO 데이타)에서의 Nanog 유전자 발현과 상관관계에 있는 유전자 세트에 기초하여 세포를 유전자 수형도로 군집화하였다. 시료는 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR"; MEF 조절된 배지에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8CM," 모체 섬유아세포의 경우, "5F0438," MEF에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES1," "hES2," "hES3"(각각 GSM 194307, GSM 194308, GSM 194309); 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES4," 또는 "hES5"(각각 GSM 194313, GSM 194314); MEF 상에서 배양된 H14 세포주의 경우, "hES6," "hES7"(GSM151739, GSM151741); 각각 GSM96262의 경우, "섬유아세포 1"; GSM96263의 경우, "섬유아세포 2" 및 GSM96264의 경우, "섬유아세포 3"으로 명시한다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다.
도 11은 인간 iPS 1-8에서 프로모터의 메틸화 분석을 나타낸다. Oct3/4 프로모터(원위 인핸서(Oct3/4-Z1) 및 근접 프로모터 부위(Oct3/4-Z2) 포함) 및 Nanog 프로모터의 일부분(근접 프로모터 부위(Nanog-Z1, -Z2) 포함)을 CpG의 메틸화에 대하여 분석하였다(패널 a). 패널 b는 CpG의 메틸화 비율(이는 원을 통해 그 백분율로 표시되어 있다)을 도시한다.
도 12는 94일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래된 세포의 테라토마 형성능을 나타낸다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 56일째에 분석하였다. 패널 a는 포름알데히드 고정된 테라토마 조직의 HE 및 알시안 블루 염색을 도시한다. 테라토마는 3배엽층의 대표적인 조직을 포함하였다; ne: 신경 상피, ca: 연골, et: 내배엽 관. 이식편으로부터 비롯된 조직은 HuNu 염색에 의해 숙주 조직으로부터 식별되었다(패널 b-d). 네스틴 발현 신경 상피는 패널 b에 도시되어 있고; 콜라겐 II 발현 연골세포는 패널 c에 도시되어 있고; 알파 태아단백질 발현은 내배엽 관은 패널 d에 도시되어 있다. 화살표는 대표되는 염색 부분을 나타낸다.
도 13은 다양한 조건하에서 배양된 세포의 테라토마 형성능을 나타낸다. 테라토마 1(패널 T-1)은 94일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래되었다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 56일째에 분석하였다. 테라토마 2(패널 T-2)는 102일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래되었다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 48일째에 분석하였다. 테라토마-1(패널 T-1)에서는 도 12에서 관찰되는 3배엽층 이외에 평활근 세포(α-SMA 양성) 및 분비 상피(MUC-1 양성)도 관찰되었다. 화살표는 대표되는 염색 부분을 나타낸다.
도 14는 다양한 조건하에서 배양된 세포의 테라토마 형성능을 나타낸다. 테라토마 3(패널 T-3)은 114일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래되었다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 42일째에 분석하였다. 도 12 및 13과 유사한 3배엽층이 관찰되었다. T-F1 및 F1 도면은 134일(계대 19회) 동안 배양된, 냉동 해동시킨 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래된 테라토마를 나타낸다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 46일(패널 T-F1) 및 48일(패널 T-F2)째에 분석하였다. 3배엽층으로 구성된 조직이 관찰되었다. 멜라닌세포 또한 T-F2 실험에서 관찰되었다. 심지어 냉동 및 해동 후에도 다능성은 유지되었다. 화살표는 대표되는 염색 부분을 나타낸다.
도 15는 인간 iPS 클론 1-8에서 검출된 트랜스유전자에 관한 써던 블롯 유전 및 PCR 분석을 나타낸다. 써던 블롯 분석에 의해 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 트랜스유전자가 검출되었다. 인간 iPS 클론 1-8은 Oct3/4 트랜스유전자 및 Sox2 트랜스유전자, 둘 모두 대략 10개 정도의 카피와 Klf4 트랜스유전자의 단일 카피를 갖는 것으로 예측되었다. c-Myc 트랜스유전자에 대해서는 게놈 PCR 분석을 실시하였다. 프라이머 세트는 완전한 두번째 인트론을 포함하도록 디자인되었다. 검은색 화살표는 관심의 대상이 되는 트랜스유전자의 위치를 나타낸다. 흰색 화살표는 내인성 c-Myc의 위치를 나타낸다.
도 16은 4개의 유전자(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)에 의해 유도된 ALP 양성 콜로니에서의 hES 마커 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 4개의 유전자를 형질도입 후 17일째 콜로니를 알칼리성 포스파타제에 대하여 염색하였다. ALP(+) 콜로니 모두 절개하고, hES 마커 유전자 발현에 대해 평가하였다. 패널 a는 Nanog, TDGF1, Dnmt3b, Zfp42, FoxD3, TERT, CYP26A1 및 GDF3을 발현하는 콜로니의 갯수를 보여준다. 패널 b는 옥타 양성 콜로니의 형태를 보여준다. 패널 c-d는 개별 실험에 의해 분류된 hES 세포 마커 유전자의 갯수를 보여준다.
도 17-도 23은 ES 세포 관련 8개의 유전자(Nanog, TDGF1, Dnmt3b, Zfp42, FoxD3, TERT, CYP26A1 및 GDF3)의 유전자 발현 프로파일과 ALP 활성에 의해 분류된 4개의 유전자(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc) 유도성 콜로니의 형태를 보여준다. 원으로 표시된 부분은 채취된 콜로니를 나타낸다.
도 24는 인간 Oct3/4의 예측된 돌연변이 내성 지도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 25는 인간 Sox2의 예측된 돌연변이 내성 지도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 26은 인간 Klf4의 예측된 돌연변이 내성 지도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 인간 c-Myc의 예측된 돌연변이 내성 지도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 28은 마우스 배아 섬유아세포로부터 ALP 양성 콜로니를 유도하기 위해 트랜스유전자를 사용하는 것을 나타낸다. (Sox2, c-Myc 및 Klf4) 및 (Oct4, Sox2 및 c-Myc)의 유전자 조합을 통해 12일째 ALP 콜로니를 유도할 수 있다.
도 29는 마우스 성체 신경 줄기 세포로부터 ALP 양성 콜로니를 유도하기 위해 트랜스유전자를 사용하는 것을 나타낸다. MEF 세포와 비교한 바, 성인 신경 줄기 세포는 ALP 콜로니 유도를 위해 외인성 Sox2의 발현을 필요로 하지 않는다.
도 30은 마우스 골수 유래 세포로부터 ALP 양성 콜로니를 유도하기 위해 3개 또는 4개의 트랜스유전자를 사용하는 것을 나타낸다. ALP 콜로니는 c-Myc 또는 Klf4 없이도 유도될 수 있다.
도 31은 마우스 골수 유래 세포로부터 ALP 양성 콜로니를 유도하기 위해 2개 또는 4개의 트랜스유전자를 사용하는 것을 나타낸다. Sox2와 cMyc의 조합이 ALP 양성 콜로니를 유도할 수 있다.
발명의 상세한 설명
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Figure 112010002911839-pct00002
I. 개요
본 개시는 유도된 다분화성 및 다능성 줄기 세포 및 관련 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 다능성 줄기 세포는 3배엽층(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 모두로 이루어진 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 반면; 대조적으로 다분화성 줄기 세포는 반드시 3가지 모두가 아닌, 특정 배엽(들)으로 이루어진 하나 이상의 세포 유형의 근원이 될 수 있다.
세포가 다분화성 또는 다능성이 되도록 유도하는 방법은 ES 세포의 자가 재생 및/또는 다능성을 유지 또는 조절하는 역할을 하는 폴리펩티드, 특히, 단백질의 강제 발현에 기초한다. 그러한 단백질의 예로는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 전사 인자가 있는데, 이들 모두는 ES 세포에서 고도로 발현된다. 강제 발현은 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하고, 재조합 바이러스를 사용하여 세포를 형질도입시키고, 관심의 대상이 되는 외인성 정제된 폴리펩티드를 세포 내로 도입하고, 세포를, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드(예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc)를 코딩하는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 비천연적으로 발생된 시약, 또는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자(예로서, 내인성 유전자 Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc)의 발현을 유도하는 임의의 다른 생물학적, 화학적, 또는 물리적 수단과 접촉시킬 수 있다. 세포를 유도하는 몇몇 기본 단계는 도 1에 제시되어 있다. 이러한 단계는, 기증자, 예로서, 인간 기증자, 또는 제3자로부터 세포를 채취하는 단계(100); 예를 들면, 폴리펩티드, 예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 강제 발현시킴으로써 세포를 유도하는 단계(110); 다분화성 또는 다능성 줄기 세포를 확인하는 단계(120); 콜로니를 단리하는 단계(130); 및 임의로 세포를 보관하는 단계(140)를 포함할 수 있다. 세포를 배양하거나, 확장시키는 단계를 비롯한, 세포를 유지시키는 단계가 상기의 모든 단계들 사이에 산재되어 있다. 추가로, 본 과정에서 많은 단계들 이후에는 세포를 보관하는 단계가 존재할 수 있다. 이후, 세포는 예를 들면, 치료제 또는 다른 용도로 여러 상황에서 사용될 수 있다(150).
배아 줄기(ES) 세포는 자가 재생이면서 다능성을 띤다. 유도된 세포 또한 자가 재생이면서 다능성을 띨 수 있다. 그러나, ES 세포와는 달리, 유도된 세포는 광범위한 세포 및 비배아성 조직을 비롯한 조직으로부터 유래될 수 있다.
유도된 세포(예로서, 유도된 다분화성 또는 다능성 줄기 세포)는 여러 가지 용도를 갖고 있다. 유도된 세포가 분화된 세포, 예로서, 뉴런, 간 세포, 또는 심근 세포를 생성할 수 있도록 하는 조건하에 놓을 수 있다. 또한 특정 계통의 다른 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 다른 유형의 줄기 세포, 예로서, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 또는 심장 줄기 세포가 될 수 있는 근원이 될 수 있다. 유도된 세포 및 유도된 세포로부터 분화된 세포 또한 의료 요법, 예로서, 세포 대체 요법에도 유용하다. 유도된 세포는 비배아성 세포로부터 유도될 수 있기 때문에 세포 요법은 피험체 자신의 조직으로부터 유래된 세포를 피험체에게 제공하여 면역 거부의 가능성을 줄이는 것을 포함할 수 있다.
본 개시는 유도된 다분화성 및 다능성 줄기 세포, 그의 제조 및 그의 보관을 기술한다. 본 개시는 추가로 유도된 다분화성 및 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포, 그의 제조 및 그의 보관을 기술한다. 또한, 세포 요법을 위한, 유도된 세포, 또는 그로부터 분화된 세포의 용도를 기술한다. 분석 방법 및 세포 저장 방법 또한 제공한다.
II. 세포 조제
A. 유도될 수 있는 세포에 관한 설명
다분화성 또는 다능성 세포는 매우 광범위한 포유동물 세포로부터 유도될 수 있다. 적합한 포유동물 세포 군집의 예로는 섬유아세포, 골수 유래의 단핵 세포, 골격근 세포, 지방 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 대식세포, 간 세포, 각질세포, 경구 각질세포, 모낭 진피 세포, 위 상피 세포, 폐 상피 세포, 윤활 세포, 신장 세포, 피부 상피 세포 또는 골모세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 포함한다.
세포는 또한 여러 상이한 유형의 조직, 예로서, 골수, 피부(예로서, 진피, 표피), 근육, 지방 조직, 말초 혈액, 포피, 골격근, 또는 평활근으로부터 기원될 수 있다. 세포는 또한 제대 조직(예로서, 제대, 제대혈, 제대혈 혈관), 양막, 태반, 또는 다른 각종 신생아 조직(예로서, 골수액, 근육, 지방 조직, 말초 혈액, 피부, 골격근 등)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신생아 조직으로부터 유래될 수 있다.
세포는 제왕절개 출생을 비롯한 출생시부터 사망까지의 기간에 포함되어 있는 피험체로부터 채취된 신생아 또는 출생 후 조직으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 조직은 >10분, >1시간, >1일, >1개월, >2개월, >6개월, >1세, >2세, >5세, >10세, >15세, >18세, >25세, >35세, >45세, >55세, >65세, >80세, <80세, <70세, <60세, <50세, <40세, <30세, <20세 또는 <10세의 피험체로부터 유래될 수 있다. 피험체는 신생아 유아일 수 있다. 몇몇 경우에서, 피험체는 소아 또는 성인이다. 몇몇 일례에서, 조직은 연령이 2, 5, 10 또는 20시간된 인간으로부터 유래된 것이다. 다른 일례에서, 조직은 연령이 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 12개월된 인간으로부터 유래된 것이다. 몇몇 일례에서, 조직은 연령이 1세, 2세, 3세, 4세, 5세, 18세, 20세, 21세, 23세, 24세, 25세, 28세, 29세, 31세, 33세, 34세, 35세, 37세, 38세, 40세, 41세, 42세, 43세, 44세, 47세, 51세, 55세, 61세, 63세, 65세, 70세, 77세, 또는 85세인 인간으로부터 유래된 것이다.
세포는 비배아성 조직으로부터, 예로서, 배아 단계 이후의 발달 단계에 있는 비배아성 조직으로부터 유래될 수 있다. 다른 경우에서, 세포는 배아로부터 유래될 수 있다. 몇몇 경우에서, 세포는 태아 단계 이후의 발달 단계에 있는 조직으로부터 유래될 수 있다. 다른 경우에서, 세포는 태아로부터 유래될 수 있다.
세포는 인간 피험체로부터 유래되는 것이 바람직하지만, 인간 이외의 피험체, 예로서, 인간 이외의 포유동물로부터도 유래될 수 있다. 인간 이외의 포유동물의 예로는 인간 이외의 영장류(예로서, 유인원, 원숭이, 고릴라), 설치류(예로서, 마우스, 래트), 소, 돼지, 양, 말, 개, 고양이, 토끼를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포는 각종 질환 상태를 앓고 있는 피험체로부터 채취될 수 있다. 세포는 유해한 건강 병태는 없는 피험체로부터 채취될 수 있다. 다른 경우에서, 피험체는 예로서, 만성 건강 병태, 예로서, 심혈관 질환, 안과 질환(예로서, 황반 변성), 청각 질환(예로서, 난청), 당뇨병, 인지 장애, 정신분열병, 우울증, 양극성 장애, 치매, 신경변성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 골다공증, 간 질환, 신장 질환, 자가 면역 질환, 관절염, 또는 증식성 장애(예로서, 암)과 같은 질환 또는 질병을 앓고 있거나, 앓게 될 위험이 높다. 다른 경우에서, 피험체는 급성 건강 병태, 예로서, 뇌졸중, 척수 손상, 화상, 또는 상처를 앓고 있거나, 앓게 될 위험이 높다. 특정 경우에서, 피험체는 피험체 스스로가 추후에 사용하기 위한(예로서, 자가 요법) 또는 치료 또는 요법을 필요로 할 수 있는 또다른 피험체의 사용을 위한(예로서, 동종 이형 요법) 세포를 제공한다. 몇몇 경우에서, 기증자 및 수혜자는 면역조직적합성을 띠거나, HLA 합치된다.
유도시키고자 하는 세포는 단일 세포로부터 또는 세포 군집으로부터 수득할 수 있다. 상기 군집은 동종성이거나 이질성일 수 있다. 세포는 인간 세포 시료, 예로서, 생검 또는 혈액 시료에서 발견되는 세포 군집일 수 있다. 종종, 세포는 체세포이다. 세포는 세포주일 수 있다. 몇몇 경우에서, 세포는 다른 세포에 융합된 세포로부터 유래된 것이다. 몇몇 경우에서, 세포는 다른 세포에 융합된 세포로부터 유래된 것이 아니다. 몇몇 경우에서, 세포는 다른 세포에 인공적으로 융합된 세포로부터 유래된 것이 아니다. 몇몇 경우에서, 세포는 체세포 핵 전달(SCNT: somatic cell nuclear transfer)로서 알려져 있는 방법을 받은 세포, 또는 SCNT를 받은 세포의 자손인 세포가 아니다.
세포 군집은 분화된 세포 및 미분화된 세포, 둘 모두를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 군집은 주로 분화된 세포를 포함한다. 다른 경우에서, 군집은 주로 미분화된 세포, 예로서, 미분화된 줄기 세포를 포함한다. 군집내 포함된 미분화된 세포는 다능성 또는 다분화성을 띠도록 유도될 수 있다. 몇몇 경우에서, 세포 군집내 포함된 분화된 세포는 다능성 또는 다분화성을 띠도록 유도된다.
세포 군집은 미분화된 줄기 세포 또는 고유의 줄기 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 미분화된 줄기 세포는 하기: 나노그(Nanog), Oct3/4, Sox2 및 Tert 중 적어도 4개의 유전자, 적어도 3개의 유전자, 적어도 2개의 유전자, 적어도 1개의 유전자의 DNA 메틸화 또는 히스톤 변형에 기인한, 또는 어느 유전자에서도 DNA 메틸화 또는 히스톤 변형이 일어나지 않는 것에 기인한 이질염색질 형성에 의한 후성적인 불활성화 변형이 일어나지 않은 줄기 세포이다. 상기 유전자, 예로서, Tert, Nanog, Oct3/4 또는 Sox2의 활성화 또는 발현은 인간 다능성 줄기 세포가 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 유도되었을 때 일어날 수 있다.
B. 세포 채취
예로서, 문헌 [Schantz and Ng (2004), A Manual for Primary Human Cell Culture, World Scientific Publishing Co., Pte, Ltd]에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 체세포를 수득하는 방법은 잘 수립되어 있다. 몇몇 경우에서, 본 방법은 예로서, 생검(예로서, 피부 시료), 채혈, 또는 폐포 또는 다른 폐 세척에 의해 세포 시료를 수득하는 것을 포함한다. 조직으로부터 제조된 세포로부터의 초기 플레이팅 밀도는 특정 조직으로부터 유래된 세포의 예측되는 생육성 또는 부착성과 같은 변수에 기초하여 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 각종 유형의 인간 체세포를 수득하는 방법은 하기의 예시적인 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
1. 골수
기증자에 전신 마취를 하고, 엎드린 자세로 있게 한다. 장골 후방 경계로부터 채취 바늘로 직접 피부를 찔러 장골의 표면을 통해서 골수에 바늘을 넣어, 주사기로 골수의 액을 흡인한다. 골수의 골형성 구역으로부터 골수 세포를 단리하여 체세포성 줄기 세포를 강화시킨다. 이어서, 밀도 구배 원심분리에 의해서 흡인물로부터 단핵 세포 분획을 제조한다. 이어서, 본원에 기술된 유도 방법에 사용하기 이전에 채취한 조 단핵 세포 분획을 배양한다.
2. 출생 후 피부
예를 들면, 무릎 또는 둔부 뒤쪽으로부터 진피를 포함하는 피부 조직을 수거한다. 이어서, 피부 내측을 밑으로 하여, 피부 조직을 0.6% 트립신/둘베코 변형 이글스 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/1% 항생제/항진균제를 함유하는 F-12 중에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.
피부 조직을 뒤집은 후에 핀셋으로 피부 내측을 가볍게 문지른다. 가위를 사용하여 피부 조직을 1 ㎟ 절편으로 세단한 후, 1200 rpm으로 10분간 실온에서 원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 25 ml의 0.1% 트립신/DMEM/F-12/1% 항생제, 항진균제를 조직 침전물에 첨가한다. 37℃에서 40분 동안 교반기를 사용하여 200-300 rpm으로 혼합물을 교반시킨다. 조직 침전물이 충분히 소화된 것을 확인한 후, 3 ml의 소태아 혈청(FBS: fetal bovine serum)(JRH 제조)을 첨가하고, 거즈(PIP가 제조한 I형), 100 ㎛ 나일론 필터(FALCON 제조) 및 40 ㎛ 나일론 필터(FALCON 제조)의 순으로 순차적으로 여과시킨다. 생성된 여액을 1200 rpm으로 10분간 실온에서 원심분리하여 상청액을 제거한 후, DMEM/F-12/1% 항생제, 항진균제를 첨가하여 침전물을 세척하고, 1200 rpm으로 10분간 실온에서 원심분리한다. 이와 같이 하여 수득된 세포 분획은 유도하기 이전에 배양한다.
두피 조직으로부터 진피 유두를 단리하여 진피 줄기 세포를 강화시킬 수 있다. 인간 두피 조직(0.5-2 cm 이하)을 세정하고, 손질하여 과량의 지방 조직을 제거하고, 작은 조각으로 절단한다. 이들 조직 조각을 4℃에서 24시간 동안 DMEM 중 12.5 mg/ml 디스파제 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)에서 효소적으로 소화시킨다. 효소 처리한 후, 표피를 진피로부터 벗겨내고; 모낭을 진피로부터 뽑아낸다. 모낭을 인산염으로 완충처리된 염수(PBS: phosphate- buffered saline)로 세척하고; 표피 및 진피를 제거한다. 이러한 절차에는 현미경을 이용할 수 있다. DMEM 및 10% FCS를 함유하는 배지 중 플라스틱 조직 배양 접시 상에서 외식된 유두를 1주간 배양하여 단일의 진피 유두 유래 세포를 생성한다. 단일의 진피 유두 세포가 생성되었을 때, 이들 세포를 제거하고, FGM-2 싱글쿼츠(SingleQuots)(Lonza)로 보충된 FBM에서 배양하거나, 혈청없이 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF-2 및 B27의 존재하에서 배양한다.
표피 줄기 세포 또한 인간 두피 조직(0.5 - 2 ㎠ 이하)으로부터 강화시킬 수 있다. 인간 두피 조직을 세정하고, 손질하여 과량의 지방 조직을 제거하고, 작은 조각으로 절단한다. 이들 조직 조각을 4℃에서 24시간 동안 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM) 중 12.5 mg/ml 디스파제(캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)에서 효소적으로 소화시킨다. 효소 처리한 후, 표피를 진피로부터 벗겨내고; 모낭을 진피로부터 뽑아낸다. 효소 처리한 후, 표피를 진피로부터 벗겨내고; 모낭을 진피로부터 뽑아낸다. 모근과 온전한 외모근초(ORS: outer root sheath)를 현미경 아래서절개한다. 세척한 후, 상기 모낭을 플라스틱 접시로 옮긴다. 이어서, 미세 바늘을 사용하여 돌출부 부위를 상부 모낭으로부터 절개한다. 돌출부를 새 접시로 옮기고, DMEM/F12 및 10% FBS를 함유하는 배지 중에서 배양한다. 세포 확인 후, 배양 배지를 에피라이프™ 익스텐디드-라이프스팬 무혈청 배지(EpiLife™ Extended-Lifespan Serum-FreeMedium)(Sigma)로 교체한다.
3. 출생 후 골격근
상완이두근 근육의 외측두 또는 다리의 봉공근 근육과 같은 근육을 포함하는 결합 조직의 표피를 절단하고, 근육 조직을 적출한 후, 봉합한다. 수득한 전 근육을 가위 또는 메스를 사용하여 잘게 다지고, 0.06%의 IA형 콜라게나제 및 10% FBS를 함유하는 DMEM(고글루코스) 중에 현탁시키고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다.
원심분리에 의해 세포를 잘게 다진 근육으로부터 채취하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM(고글루코스) 중에 현탁시킨다. 현탁액을 공극 크기가 40 ㎛인 마이크로필터 및 공극 크기가 20 ㎛인 마이크로필터를 통해 통과시킨 후, 수득한 세포 분획을, 미분화된 줄기 세포를 포함하는 조 정제된 세포로서 배양하고, 본원에 기술된 바와 같이 인간 다능성 줄기 세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
4. 출생 후 지방 조직
본 발명의 방법에 유용한 지방 조직 유래 세포는 당업자에게 알려져 있는 각종 방법에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 미국 특허 번호 제6,153,432호(그의 전문이 본원에서 인용된다)에 기재되어 있다. 바람직한 지방 조직원은 대망 지방 조직이다. 인간에서 지방 세포는 전형적으로 지방 흡인에 의해 단리된다.
지방 세포 유래 세포를 단리하는 하나의 방법에 있어서, 지방 조직을 25 내지 50℃, 예로서, 33 내지 40℃, 또는 37℃에서 10분 내지 3시간, 예로서, 30분 내지 1시간 또는 45분 동안 0.01% 내지 0.5%, 예로서, 0.04% 내지 0.2%, 0.1% 콜라게나제; 0.01% 내지 0.5%, 예로서, 0.04%, 또는 0.2% 트립신; 및/또는 0.5 ng/ml 내지 10 ng/ml 디스파제, 또는 유효량의 하이알루로니다제 또는 DN아제(DNA 소화 효소) 및 약 0.01 내지 약 2.0 mM, 예로서, 약 0.1 내지 약 1.0 mM, 또는 0.53 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 처리한다.
세포를 20 마이크론 내지 800 마이크론, 더욱 바람직하게 40 마이크론 내지 400 마이크론 및 가장 바람직하게 70 마이크론의 나일론 또는 치즈 클로스 메쉬 필터에 통과시킨다. 이어서, 배양 배지 중의 세포를 직접, 또는 피콜(Ficoll) 또는 퍼콜(Percoll) 또는 다른 입자 구배를 사용하여 분별 원심분리한다. 세포는 100 내지 3000xg, 더욱 바람직하게 200 내지 1500xg, 가장 바람직하게 500xg으로 1분 내지 1시간, 더욱 바람직하게 2 내지 15 분 및 가장 바람직하게 5분 동안 4 내지 5O℃, 바람직하게 20 내지 40℃ 및 더욱 바람직하게 약 25℃에서 원심분리시킨다.
상기와 같이 수득한 지방 조직 유래 세포 분획을 본원에 기술된 방법에 따라 미분화된 줄기 세포를 포함하는 조 정제된 세포로서 배양하고, 인간 다능성 또는 다분화성 줄기 세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
5. 혈액
약 50 ml 내지 약 500 ml의 정맥혈 또는 제대혈을 채취하고, 예로서, 문헌 [Kanof et al., (1993), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulie, E. M. Shevack, and W. Strober, eds.), ch. 7.1.1.-7.1.5, John Wiley & Son, New York]에 기재되어 있는 바와 같이, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 방법에 의해 단핵 세포 분획을 수득한다.
단핵 세포 분획을 단리한 후, 대략 1 x 107 내지 1 x 108개의 인간 말초 혈액 단핵 세포를 10% 소태아 혈청, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 유니트/ml 페니실린을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 현탁시키고, 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 회수한다. 회수한 세포를 RPMI 1640 배지 중에 재현탁시키고, 약 1 x 107개의 세포/접시의 밀도로 100 mm 플라스틱 페트리 접시 중에 플레이팅하고, 8% CO2하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시킨다. 10분 후에, 현탁액 중에 남아있는 세포를 제거하고, 부착성 세포를 피펫팅에 의해 수거한다. 이어서, 본원에 기술된 유도기 이전에 생성된 부착 단핵 세포 분획을 배양한다. 몇몇 경우에서, 상기와 같이 수득한 말초 혈액 유래의 또는 제대혈 유래의 부착성 세포 분획을 본원에 기술된 방법에 따라 미분화된 줄기 세포를 포함하는 조 정제된 세포로서 배양하고, 인간 다능성 또는 다분화성 줄기 세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
말초 혈액 중의 대식세포는 10% 열로 불활성화된 소태아 혈청 (FBS; 캔사스주 레넥사 소재의 JRH Biosciences), 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 저글루코스 DMEM 중에서 단핵 세포 분획을 배양하여 강화시킬 수 있다. 대식세포를 확장시키기 위해 말초 혈액 단핵 세포를 4℃에서 밤새도록 10 ㎍/ml FN(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma)로 처리된 플라스틱 플레이트 상에서 2 x 106/ml의 밀도로 확장시킨다. 이어서, 세포를 습윤 대기하에 37℃ 및 5% CO2에서 추가의 어떤 성장 인자를 포함하지 않고 배양한다. 부유 세포를 포함하는 배지를 매 3일마다 교체한다. 관찰이 가능한 섬유아세포의 특성을 갖고 있는 대식세포를 유도 실험을 위해 이용할 수 있다.
몇몇 경우에서, 말초 혈액, 제대혈, 또는 골수로부터 유래된 세포 분획을 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/885,112호에 기재되어 있는 바와 같이 확장시키고 및 본원에 기술된 유도 방법에 사용한다.
III. 유도
A. 개요
유도 과정 중에 특정 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계는 일정 기간 동안 배양된 세포에서 수행되며, 이 기간 이후 유도된 세포를 다분화성 및 다능성 줄기 세포를 특징으로 하는 여러 특성(예로서, 형태상의 특징, 유전자 발현)에 대하여 스크리닝한다. 이어서, 이러한 스크리닝 기준을 충족시키는 유도된 세포를 서브클로닝시키고 확장시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도시키고자 하는 세포를 유도 절차 이전에 일정 기간 동안 배양할 수 있다. 별법으로, 유도시키고자 하는 세포를 사전 배양 기간 없이 유도 과정에서 직접 이용할 수 있다. 몇몇 경우에서, 상이한 세포 배양 배지가 유도 과정 이전, 그 도중에 및 그 이후에 다른 시점에서 사용된다. 예를 들면, 한가지 유형의 배양 배지는 조직 채취 이후 및/또는 유도 과정 이전에 직접 사용될 수 있는 반면, 두번째 유형의 배지는 유도 과정 중에 및/또는 그 이후에 사용된다. 때때로, 세번째 유형의 배양 배지는 유도 과정 중에 및/또는 그 이후에 사용된다.
B. 세포 배양
채취 후에 조직 또는 세포 시료를, 채취된 특정 세포 또는 조직에 적합한 임의의 배지에서 배양할 수 있다. 조직 또는 세포가 배양될 수 있는 몇몇 대표적인 배지로는 다분화성 성인 전구 세포(MAPC: multipotent adult progenitor cell) 배지; FBM(Lonza 제조); 배아 줄기 세포(ES) ES 배지; 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(Sigma); 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM); MEF 조절된 ES(MC-ES); 및 mTeSR™(예로서, 캐나다 밴쿠버 소재의 StemCell Technologies로부터 입수가능한 것)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예로서, 문헌 [Ludwig et a., (2006), Nat Biotechnol., 24(2): 185-187] 참조). 다른 경우에서, 인간 ES 세포 성장을 위한 대체 배양 조건은 예로서, 문헌 [Skottman et al, (2006), Reproduction, 132(5):691-698]에 기재되어 있는 바와 같이 사용된다.
MAPC(2% FBS) 배지는 60% 둘베코 변형 이글스 배지-저글루코스, 40% MCDB 201, 인슐린 트란스페린 세레륨 보충물, (0.01 mg/ml 인슐린; 0.0055 mg/ml 트란스페린; 0.005 ㎍/ml 아셀렌산나트륨), 1 X 리놀렌산 알부민(1 mg/mL 알부민; 2몰 리놀렌산/1몰 알부민), 1 nM 덱사메타손, 2% 소태아 혈청, 1 nM 덱사메타손, 10-4 M 아스코르브산 및 10 ㎍/ml 겐타마이신을 포함할 수 있다.
FBM(2% FBS) 배지는 MCDB202 변형 배지, 2% 소태아 혈청, 5 ㎍/ml 인슐린, 50 mg/ml 겐타마이신 및 50 ng/ml 암포테리신-B를 포함할 수 있다.
ES 배지는 40% 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM) 40% F12 배지, 2 mM L-글루타민, 1 X 비필수 아미노산(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma, Inc.), 20% 녹아웃된 혈청 대체제(넉아웃 혈청 Replacement)™ (캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen, Inc.) 및 10 ㎍/ml 겐타마이신을 포함할 수 있다.
MC-ES 배지는 하기와 같이 제조될 수 있다. ES 배지를 미토마이신 C로 처리된 뮤린 배아 섬유아세포(MEF: murine embryonic fibroblast) 상에서 20 내지 24시간 동안 조절하고, 수거하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 약 0.1 mM의 β-머캅토에탄올, 약 10 ng/ml의 bFGF 또는 FGF-2 및 임의로 약 10 ng/ml의 액티빈 A로 보충한다. 몇몇 경우에서, 미토마이신 C로 처리된 MEF 대신 조사 MEF를 사용한다. 다른 경우에서, MEF 대신 STO(ATCC) 또는 인간 섬유아세포 세포를 사용한다.
세포를 특정 혈정으로 보충된 배지에서 배양할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 혈청은 소태아 혈청(FBS)이다. 혈청은 또한 송아지 태아 혈청(FCS: fetal calf serum)일 수 있다. 몇몇 경우에서, 혈청은 인간 혈청(예로서, 인간 AB 혈청)일 수 있다. 혈청 혼합물, 예로서, FBS와 인간 AB, FBS와 FCS, FCS와 인간 AB 혼합물 또한 사용될 수 있다.
조직 채취 및 세포 조제 이후에, 적합한 배양 조건을 사용함으로써 제조된 세포 중에 존재할 수 있는 조직 줄기 세포 또는 전구 세포의 확장을 촉진시키는 것이 유용할 수 있다. 몇몇 경우에서, 저혈청 배양물 또는 무혈청 배지(본원에 기술된 것)는 조직 줄기 세포 또는 전구 세포의 확장을 촉진시킬 수 있다. 적합한 배양 배지는 MAPC, FBM, 또는 MSCGM을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
초대 배양은 보통 세포를 기증자, 예로서, 인간로부터 단리한 직후에 한다. 세포는 또한 초대 배양 이후에 계대배양될 수 있다. "2차" 계대배양물은 1회 계대배양된 초대 배양물을 기술하고, "3차" 계대배양물은 2회 계대배양된 초대 배양물을 기술하고, "4차" 계대배양물은 3회 계대배양된 초대 배양물 등을 기술한다. 몇몇 경우에서, 1차 세포를 2차 계대배양, 3차 계대배양, 또는 4차 계대배양한다. 몇몇 경우에서, 1차 세포를 4회 미만으로 계대배양한다. 본원에 기술된 배양 기법은 일반적으로 초대 배양부터 4차 계대배양까지의 기간 동안 배양하는 것을 포함할 수 있으나, 다른 배양 기간 또한 사용될 수 있다. 바람직하게, 세포를 초대 배양부터 2차 계대배양까지 배양한다. 몇몇 경우에서, 세포를 약 1 내지 약 12일, 예로서, 2일, 3일, 4.5일, 5일, 6.5일, 7일, 8일, 9일, 10일, 또는 본원에 기술된 유도 방법을 수행하기 전 약 1일 내지 약 12일간의 임의의 다른 기간 동안 배양할 수 있다. 다른 경우에서, 세포를 12일 초과의 기간 동안, 예로서, 예로서, 약 12일부터 약 20일; 약 12일부터 약 30일; 또는 약 12일부터 약 40일 동안 배양할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 유도시키고자 하는 세포를 유도 이전에 4회 이하에 걸쳐(예로서, 3, 2, 1, 또는 0회) 계대한다.
몇몇 경우에서, 유도 이전에 세포를 예로서, 약 1 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 1 x 104개의 세포/㎠의 저밀도로 배양한다. 다른 경우에서, 유도 이전에(예로서, 유도하기 직전에), 세포를 약 1 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 3 x 104개의 세포/㎠; 또는 약 1 x 104개의 세포/㎠ 내지 약 3 x 104개의 세포/㎠의 밀도로 배양한다.
대개는, 상기 기술된 바와 같이, 유도 인자를 세포로 도입하기 이전 및/또는 그 중에 세포 및/또는 조직을 1차 배지에서 배양하고; 유도 인자를 세포로 도입하는 중에 및/또는 그 이후에 세포를 2차 또는 3차 배지에서 배양한다. 2차 또는 3차 배지는 MEF 조절된(MC)-ES, mTeSR1™ 배지, 또는 예로서, 문헌 [Skottman et al, (2006), Reproduction, 132(5):691-698]에 기재되어 있는 것과 같은 다른 ES 세포 배지일 수 있다.
여러 가지 일례로, 세포를, 세포 중에서 유전자 또는 폴리펩티드의 강제 발현을 개시하기 이전에(예로서, 레트로바이러스 감염 기간 직후에) MAPC, FBM 또는 MSCGM 배지에서 배양하고; 강제 발현을 개시한 후, 세포를 MC-ES 배지, mTeSR1™ 배지, 또는 본원에 기술된 바와 같은 다른 ES 세포 배지에서 배양한다.
세포 배양은 유도 인자의 도입 이전에, 그 중에, 또는 그 이후에 저혈청 배양 조건하에서 수행할 수 있다. "저혈청 배양 조건"은 0%(v/v)(즉, 무혈청) 내지 약 5%(v/v), 예로서, 0% 내지 2%, 0% 내지 2.5%, 0% 내지 3%, 0% 내지 4%, 0% 내지 5%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 5%, 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 또는 5% 범위의 농도로 혈청을 함유하는 세포 배양 배지를 사용하는 것을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 저혈청 농도는 약 0%(v/v) 내지 약 2%(v/v)이다. 몇몇 경우에서, 혈청 농도는 약 2%이다. 다른 실시태양에서, 세포를 "고혈청 조건," 즉, 5%(v/v) 초과의 혈청 내지 약 20%(v/v) 혈청, 예로서, 6%, 7%, 8%, 10%, 12%, 15%, 또는 20%하에서 배양한다. 유도 인자 도입 이전에, 그 중에 및/또는 그 이후에 고혈청 조건하에서 배양할 수 있다. 저농도의 혈청을 함유하는 배지는 미분화된 줄기 세포를 강화시키는데 특히 유용할 수 있다. 예를 들면, MSC는 대개, 조직, 예로서, 골수, 지방, 근육, 또는 피부 등을 고농도 혈청(5% 이상)을 함유하는 배양 배지에서 배양하였을 때 플라스틱 배양 접시에 부착되는 비조혈 세포(예로서, 간질 세포)를 단리함으로써 수득한다. 그러나, 이러한 배양 조건하에서 특히 세포가 특정 배양 조건(예로서, 적은 계대수, 저밀도 배양 또는 저산소)하에 계대된 경우에 극소수의 미분화된 세포는 유지될 수 있다.
저혈청 조건 또는 고혈청 조건이 세포를 배양하는데 사용될 때, 하나 이상의 성장 인자, 예로서, 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor)-2; 염기성 FGF(bFGF: basic FGF); 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor); 인슐린 유사 성장 인자(IGF: insulin-like growth factor); IGF II; 또는 인슐린이 배양 배지 중에 포함될 수 있다. 세포 배양 배지를 보충하는데 사용될 수 있는 다른 성장 인자로는 하나 이상의: 형질전환 성장 인자 β-1(TGF β-1: Transforming Growth Factor β-1), 액티빈 A, 노긴, 뇌 유래의 신경 친화성 인자(BDNF: Brain-derived Neurotrophic Factor), 신경 성장 인자(NGF: Nerve Growth Factor), 뉴로트로핀(NT)-1, NT-2, 또는 NT-3 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 경우에서, MC-ES 배지 또는 다른 세포 배양 배지 중에서 bFGF 또는 FGF-2 대신 상기 인자들 중 하나 이상을 사용한다.
본원에 기술된 배양 배지(예로서, MAPC, FBM, MC-ES, MSCGM, IMDM, mTeSR1™) 중 성장 인자(들)(예로서, FGF-2, bFGF, PDGF, EGF, IGF, 인슐린, IGF II, TGF β-1, 액티빈 A, 노긴, BDNF, NGF, NT-1, NT-2, NT-3)의 농도는 약 4 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 예로서, 약 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml,5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 10 ng/ml, 12 ng/ml, 14 ng/ml, 15 ng/ml, 17 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 또는 50 ng/ml일 수 있다. 성장 인자의 농도는 또한 약 4 ng/ml 내지 약 10 ng/ml; 약 4 ng/ml 내지 약 20 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 30 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 40 ng/ml; 또는 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml일 수 있다. 다른 경우에서, 고농도의, 예로서, 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 또는 약 50 ng/ml 내지 약 75 ng/ml의 성장 인자를 이용할 수 있다.
성장 인자는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, FGF-2를 단독으로 배지에 첨가할 수 있고; 다른 일례로는 PDGF 및 EGF, 둘 모두를 배양 배지에 첨가한다. 대개, 특정 세포 유형에 적절한 성장 인자를 이용할 수 있다. 예를 들면, 진피 세포는 약 20 ng/ml EGF 및/또는 약 40 ng/ml FGF-2 존재하에서 배양할 수 있는 반면, 표피 세포는 약 50 ng/ml EGF 및/또는 5 ug/ml 인슐린 존재하에서 배양할 수 있다.
아포프토시스를 감소시키기 위해 rho, 또는 rho 관련 단백질 키나제(ROCK) 저해제 존재하에서 유도된 세포를 유지시킬 수 있다. ROCK 저해제는 특히 세포를 예를 들면, 효소 처리와 같이 엄격하게 처리하였을 때 유용할 수 있다. 예를 들면, Y-27632(Calbiochem; 수용성) 또는 패수딜(Fasudil)(HA1 077: Calbiochem), Rho 관련 키나제(Rho 관련 꼬인 코일 함유 단백질 키나제)의 저해제를 첨가하는 것을 사용함으로써 본 발명의 인간 다능성 및 다분화성 줄기 세포를 배양할 수 있다. 몇몇 경우에서, Y-27632 또는 패수딜의 농도는 약 2.5 μM 내지 약 20 μM, 예로서, 약 2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 또는 20 μM이다.
37℃, 5% CO2 인큐베이터(예로서, 대기 산소 수준하에서)에서 유지 배양 배지 중 유도된 세포를 배양할 수 있고, 배지를 매일 교체하는 것이 바람직할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 인간 출생 후 조직에 존재하는 본 발명의 미분화된 줄기 세포로부터 유도된 인간 다능성 줄기 세포를 배양 및 성장시키기 위해서는 MEF로 덮힌 플라스틱 배양 접시 또는 마트리겔로 코팅된 플라스틱 배양 접시 상에서, 본원에 기출된 첨가제를 함유하는 배양 배지 중에서 세포를 매 5 내지 7일마다 계대배양하는 것이 바람직하다. 유도된 세포용의 유지 배양 배지의 예로는 임의의 모든 완전 ES 세포 배지(예로서, MC-ES)를 포함한다. 유지 배양 배지는 b-FGF 또는 FGF2로 보충될 수 있다. 몇몇 경우에서, 유지 배양 배지는 다른 인자, 예로서, IGF-II, 액티빈 A 또는 본원에 기술된 다른 성장 인자로 보충된다(예로서, 문헌 [Bendall et al, (2007), Nature, 30:448(7157): 1015-21] 참조). 몇몇 실시태양에서, 형태상의 특징에 기초하여 후보 다분화성 또는 다능성 줄기 세포 콜로니를 확인하고 선별하기 이전에 유도된 세포를 약 14일 내지 약 40일, 예로서, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38일, 또는 다른 기간, 약 14일 내지 약 40일 동안 배양하고, 관찰한다.
다분화성 또는 다능성 줄기 세포 콜로니를 동정하는 형태상의 특징으로는 주위에 있는 세포와 비교하여 더 둥글고, 핵 대 세포질의 비가 높은 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 후보 유도된 세포의 크기는 약 5 ㎛ 내지 약 10 ㎛; 약 5 ㎛ 내지 약 15 ㎛; 약 5 ㎛ 내지 약 30 ㎛; 약 10 ㎛ 내지 약 30 ㎛; 또는 약 20 ㎛ 내지 약 30 ㎛일 수 있다. 높은 핵 대 세포질의 비는 약 1.5:1 내지 약 10:1, 예로서, 약 1.5:1; 약 2:1; 약 3:1; 약 4:1; 약 5:1; 약 7:1; 약 8:1; 약 9.5:1 또는 10:1일 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포 클론은 마우스 ES 세포에 비하여 평평한 형상을 나타낸다. 예를 들면, 말초 혈액 세포로부터, 또는 영양 세포를 함유하지 않는(feeder-free) 배지 중에서 배양된 세포로부터 유래된, 후보 유도된 세포는 주위에 있는 세포와 비교하여 평평한 형성을 나타낼 수 있다. 유도된 세포주를 확인하기 위한 또다른 형태상의 특징은 모체 세포 사이의(예로서, 섬유아세포 사이의) 공간 내에 존재하는 작은 단일층 콜로니 형성이다.
유도된 세포는 조직 배양 등급의 플라스틱에 직접 플레이팅되고 배양될 수 있다. 별법으로, 세포는 코팅된 기판, 예로서, 피브로넥틴, 젤라틴, 마트리겔™(BD Bioscience), 콜라겐, 또는 라미닌으로 코팅된 기판 상에서 플레이팅되고 배양된다. 몇몇 경우에서, 비처리 페트리디쉬도 사용될 수 있다. 적합한 세포 배양 용기로는 예로서, 35 mm, 60 mm, 100 mm 및 150 mm 세포 배양 접시, 6웰 세포 배양 플레이트, 다른 크기가 동일한 세포 배양 용기를 포함한다. 몇몇 경우에서, 세포는 영양 세포와 함께 배양된다. 예를 들면, 세포는 MEF(예로서, 조사 또는 미토마이신 처리된 MEF) 층 또는 카페트 상에서 배양될 수 있다.
전형적으로, 유도된 세포를 저밀도로 플레이팅(또는 배양)할 수 있는데, 이는 세포를 약 1:8 내지 약 1:3, 예로서, 약 1:8; 약 1:6; 약 1:5; 약 1:4; 또는 약 1:3로 분리함으로써 달성될 수 있다. 세포를 약 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅시킬 수 있다. 몇몇 일례로, 세포를 약 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅시킬 수 있다. 몇몇 일례로, 세포를 약 1.5 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠; 약 2 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠; 약 3 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠; 약 4 x 103개의 세포/㎠ 내지 약 104개의 세포/㎠; 또는 약 103개의 세포/㎠ 내지 약 9 x 103개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 세포를 104개의 세포/㎠ 초과, 예로서, 약 1.25 x 104개의 세포/㎠ 내지 약 3 x 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅시킬 수 있다.
C. 유도 인자
세포가 다분화성 또는 다능성이 되도록 유도하는 것은 여러 가지 방식으로 달성될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 세포에서 다능성 또는 다분화성을 유도하는 방법은 한 세트의 유도 인자를 강제 발현시키는 단계를 포함한다. 강제 발현은 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계, 관심의 대상이 되는, 외인성의 정제된 폴리펩티드를 세포 내로 도입하는 단계, 또는 세포를, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 비천연적으로 발생된 시약과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 경우에서, IF 세트는 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드, 또는 c-Myc 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 경우에서, 상기 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 예를 들면, IF 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 제외한, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 세포 형질전환의 위험 또는 암 유도의 위험을 증가시킬 수 있는 폴리펩티드는 포함하지 않는다. 세포 형질전환을 유도할 수 있는 c-Myc의 능력의 예로서, 문헌 [Adhikary et al., (2005), Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6(8):635-645]에 기재되어 있으며, 이를 참조한다.
몇몇 경우에서, 본 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 포함한다. 특정 경우에서, c-Myc 폴리펩티드는 구성적으로 활성인 c-Myc 변이체이다. 몇몇 일례로, 본 세트는 유도가능한 활성을 보일 수 있는 c-Myc 폴리펩티드, 예로서, c-Myc-ER 폴리펩티드를 포함한다(예로서, 문헌 [Littlewood, et al., (1995), Nuclei Acid Res., 23(10): 1686-90] 참조).
다른 경우에서, IF 세트는 TERT 폴리펩티드, SV40 대형 T 항원 폴리펩티드, HPV16 E6 폴리펩티드, HPV16 E7 폴리펩티드, 또는 Bmi1 폴리펩티드를 제외한, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 TERT 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 SV40 대형 T 항원을 포함하지 않는다. 다른 경우에서, IF 세트는 HPV16 E6 폴리펩티드 또는 HPV16 E7 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
몇몇 경우에서, IF 세트는 3개의 IF를 포함하는데, 여기서, 3개의 IF 중 2개는 Oct3/4 폴리펩티드 및 Sox2 폴리펩티드이다. 다른 경우에서, IF 세트는 2개의 IF, 예로서, c-Myc 폴리펩티드 및 Sox2 폴리펩티드 또는 Oct3/4 및 Klf4 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드로 제한된다. 다른 경우에서, IF 세트는 4개의 IF: Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드로 이루어진 한 세트로 제한될 수 있다.
IF 세트는 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드 이외의 IF를 포함할 수 있다. 그러한 추가의 IF로는 나노그(Nanog), TERT, LIN28, CYP26A1, GDF3, FoxD3, Zfp42, Dnmt3b, Ecat1 및 Tcl1 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 경우에서, 추가의 IF 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 몇몇 경우에서, 추가의 IF 세트는 세포 형질전환의 위험 또는 암 유도의 위험을 증가시킬 수 있는 폴리펩티드는 포함하지 않는다.
IF의 강제 발현은 적어도 약 7일 내지 적어도 약 40일, 예로서, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 25일, 30일, 33일, 또는 37일 간의 기간 동안 유지될 수 있다.
인간 세포 군집의 세포에서 다능성을 유도할 수 있는 유도 효율은 초기에 배양된 모체 세포 전체 갯수의 적어도 약 0.001% 내지 적어도 약 0.1%, 예로서, 0.002%, 0.0034%, 0.004%, 0.005%, 0.0065%, 0.007%, 0.008%, 0.01%, 0.04%, 0.06%, 0.08%, 또는 0.09%이다. 때때로, 기증자의 연령, 조직의 기원, 배양 조건에 따라 더 높은 효율을 얻을 수 있다.
D. HDAC 저해제
세포를 유도하는 것은 히스톤 데아세틸라제(HDAC: histone deacetylase) 저해제 처리와, IF 세트를 강제 발현시키는 단계를 조합함으로써 이루어질 수 있다. 유도시키고자 하는 세포는 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포일 수 있다. 다른 경우에서, 유도시키고자 하는 세포는 분화된 세포이거나, 분화된 세포와 미분화된 세포의 혼합물이다.
HDAC는 특정 IF 세트, 예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 세트의 강제 발현과 조합될 수 있다. 예를 들면, HDAC 저해제 처리를 Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 강제 발현 또는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 강제 발현과 조합하였을 때 인간 체세포는 다능성을 띠도록 유도된다. 몇몇 경우에서, 3개의 유전자(예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 또는 3개의 유전자(예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4)와 c-Myc 유전자 또는 HDAC 저해제를 함께, Tert, Nanog, Oct3/4 및 Sox2의 각 유전자가 후성적으로 불활성화되지 않은 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포 내로 도입하여 인간 다능성 줄기 세포를 유도할 수 있다. 추가의 다른 경우에서는 미분화된 줄기 세포를 초대 배양 또는 2차 계대배양에 의해, 또는 저밀도 계대배양에 의해 및 저농도의 혈청을 포함하는 배양 배지에서 계대배양하여 증폭시킨 후에 3개의 유전자(예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 또는 3개의 유전자(예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4)와 c-Myc 유전자 또는 히스톤 데아세틸라제 저해제를 함께, 미분화된 줄기 세포 내로 도입하여 인간 다능성 줄기 세포를 유도한다.
세포를 약 2시간 내지 약 5일, 예로서, 3시간, 6시간, 12시간, 14시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 또는 4일 동안 하나 이상의 HDAC로 처리할 수 있다. HDAC 저해제로 처리하는 것은 세포에서 IF의 강제 발현을 시작하기 이전에 개시할 수 있다. 몇몇 경우에서, HDAC 저해제 처리는 세포에서 IF의 강제 발현 중에 또는 그 이후에 시작한다. 다른 경우에서, HDAC 저해제 처리는 강제 발현 이전에 시작하여 강제 발현 중에 유지시킨다.
적합한 HDAC 저해제 농도는 사용되는 특정 HDAC 저해제에 따라 약 0.001 nM 내지 약 10 mM 범위이지만, 처리되는 세포의 세포 생존을 현저히 감소시키지 않도록 선택된다. HDAC 농도는 0.01 nM 내지 1000 nM 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, HDAC 농도는 약 0.01 nM 내지 약 1000 nM, 예로서, 약 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 0.75 nM, 1.0 nM, 1.5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 1000 nM의 기타 농도 범위이다. 세포는 1 내지 5일 또는 1 내지 3일 동안 노출된다. 예를 들면, 세포는 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 동안 노출된다.
각종의 여러 HDAC 저해제가 유도 실험을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, HDAC 저해제 MS-275가 사용된다. 적합한 HDAC 저해제의 예로는 하기 중 어느 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
A. 트리코스타틴 A 및 그의 유사체, 예를 들면: 트리코스타틴 A(TSA); 및 트리코스타틴 C(문헌 [Koghe et al, (1998), Biochem. Pharmacol, 56: 1359-1364]).
B. 펩티드, 예를 들면: 옥삼플라틴 [(2E)-5-[3-[(페닐설포닐)아미노페닐]-펜트-2-엔-4-이노하이드록삼산(문헌 [Kim et ai, (1999), Oncogene, 18:2461-2470]); 트라폭신 A(사이클로사이클로-(L-페닐알라닐-L-페닐알라닐-D-피페콜리닐-L-2-아미노-8-옥소-9,10-에폭시-데카노일)(문헌 [Kijima et al., (1993), J. Biol. Chem., 268:22429-22435]); FR901228, 뎁시펩티드(문헌 [Nakajima et al, (1998). Ex. Cell Res., 241 : 126-133]); FR225497, 사이클릭 테트라펩티드(H. Mori et al, (2000), PCT 국제 특허 공개 번호 WO 00/08048); 아피시딘, 사이클릭 테트라펩티드 [사이클로-(N-O-메틸-L-트립토파닐-L-이소류시닐-D-피페콜리닐-L-2-아미노-8-옥소데카노일)](문헌 [Darkin-Rattray et al, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:13143-13147]); 아피시딘 Ia, 아피시딘 Ib, 아피시딘 Ic, 아피시딘 IIa 및 아피시딘 IIb(P. Dulski et al, PCT 국제 특허 공개 번호 WO 97/11366); HC-독소, 사이클릭 테트라펩티드(문헌 [Bosch et al, (1995), Plant Cell, 7: 1941-1950]); WF27082, 사이클릭 테트라펩티드(PCT 국제 특허 공개 번호 WO 98/48825); 및 클라마이도신(문헌 [Bosch et al., 상기 문헌 동일).
C. 하이드록삼산에 기초한 하이브리드 극성 화합물(HPC: Hybrid polar compound), 예를 들면: 살리실 하이드록삼산(SBHA)(문헌 [Andrews et al, (2000), International J. Parasitology, 30:761-8]); 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (SAHA)(문헌 [ARichon et al, (1998), Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95: 3003-7]); 아젤라인 비스하이드록삼산 (ABHA)(문헌 [Andrews et al., 상기 문헌 동일]); 아젤라인-1-하이드록사메이트-9-아닐리드(AAHA)(문헌 [Qiu et al, (2000), Mol Biol. Cell, 11 :2069-83]); M-카르복시 신남산 비스하이드록사미드(CBHA)(문헌 [Ricon et al., 상기 문헌 동일]); 6-(3-클로로페닐우레이도) 카프로익 하이드록삼산(3-Cl-UCHA)(문헌 [Richon et al., 상기 문헌 동일]); MW2796(문헌 [Andrews et al., 상기 문헌 동일]); 및 MW2996(문헌 [Andrews et al, 상기 문헌 동일]).
D. 단쇄 지방산(SCFA: short chain fatty acid) 화합물, 예를 들면: 부티르산나트륨(문헌 [Cousens et al, (1979), J. Biol. Chem., 254: 1716-23]); 이소발레레이트(문헌 [McBain et al., (1997), Biochem. Pharm., 53: 1357-68]); 발프로인산; 발레레이트(문헌 [McBain et al., 상기 문헌 동일]); 4-페닐 부티르산(4-PBA)(문헌 [Lea and Tulsyan, (1995), Anticancer Research, 15:879-3]); 페닐 부티르산(PB)(문헌 [Wang et al, (1999), Cancer Research 59: 2766-99]); 프로피오네이트(문헌 [McBain et al., 상기 문헌 동일]); 부틸아미드(문헌 [Lea and Tulsyan, 상기 문헌 동일]); 이소부틸아미드(문헌 [Lea and Tulsyan, 상기 문헌 동일); 페닐 아세테이트(문헌 [Lea and Tulsyan, 상기 문헌 동일]); 3-브로모프로피오네이트(문헌 [Lea and Tulsyan, 상기 문헌 동일]); 트리부티린(문헌 [Guan et al., (2000), Cancer Research, 60:749-55]); 아르기닌 부티레이트; 이소부틸 아미드; 및 발프로에이트.
E. 벤즈아미드 유도체, 예를 들면: MS-275 [N-(2-아미노페닐)-4-[N-(피리딘-3-일-메톡시카르보닐)아미노메틸]벤즈아미드](문헌 [Saito et al., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:4592-7]); 및 MS-275의 3'-아미노 유도체(문헌 [Saito et al., 상기 문헌 동일]); 및 CI-994.
히스톤 데아세틸라제 저해제 처리는 예를 들면, 하기와 같이 수행될 수 있다. HDAC 저해제의 농도는 특정 저해제에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게 0.001 nM 내지 약 10 mM 및 더욱 바람직하게 약 0.01 nM 내지 약 1000 nM이다. 히스톤 데아세틸라제 저해제의 유효한 투여량은 세포, 구체적으로 미분화된 줄기 세포의 생존율을 현저히 감소시키지 않는 히스톤 데아세틸라제 저해제의 양으로서 정의된다. 세포는 1 내지 5일 또는 1 내지 3일 동안 노출된다. 노출 기간은 1일 미만일 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포는 약 1 내지 5일 동안 배양되고, 유효량의 히스톤 데아세틸라제 저해제에 노출된다. 그러나, 히스톤 데아세틸라제 저해제는 배양 시작시에 첨가될 수 있다. 상기 시간 프레임 내에서 3개의 유전자(Oct3/4, Sox2 및 Klf4)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 같은, 유전자 수반 비히클을 공지 방법에 의해 배양된 세포 내로 도입한다.
E. IF 발현 벡터
IF를 강제 발현시키는 단계는 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 포유동물발현 벡터를 세포 군집으로 도입하는 것을 포함할 수 있다. IF는 외인성 유전자로서 세포 내로 도입될 수 있다. 몇몇 경우에서, 외인성 유전자는 숙주 세포와 그의 자손의 게놈 내로 통합된다. 다른 경우에서, 외인성 유전자는 숙주 세포와 그의 자손의 에피좀 상태로 지속된다. 외인성 유전자는 외부 공급원으로부터 세포로 도입되는 유전자이다. 본원에서 사용되는 유전자는 보통 관심의 대상이 되는 폴리펩티드, 예로서, IF를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산이다. 유전자는 바람직하게 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 몇몇 경우에서, 천연 버전의 유전자는 이미 세포내 존재하고 있을 수 있지만, 추가의 "외인성 유전자"가 세포에 첨가됨으로써 폴리펩티드 발현을 유도할 수 있다.
하나 이상의 포유동물 발현 벡터는 총 세포 군집의 20% 초과로, 예로서, 25%, 30%, 35%, 40%, 44%, 50%, 57%, 62%, 70%, 74%, 75%, 80%, 90%, 또는 상기 세포의 20% 초과의 다른 비율로 도입될 수 있다. 단일 포유동물 발현 벡터는 바로 앞에서 언급한 IF 중 2가지 이상을 포함할 수 있다. 다른 경우에서, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터가 사용된다. 몇몇 실시태양에서, 발현시키고자 하는 IF 각각은 별개의 포유동물 발현 벡터 상에서 발현된다.
몇몇 경우에서, IF는 미국 특허 번호 제6,773,920호, 제6,521,455호, 제6,251,398호 및 제 6,017,735호에 기재되어 있는 것과 같이, 수송체 단백질 아미노산 서열, 예로서, VP22 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 프레임 내에 유전자적으로 융합된다. 특히, VP22 폴리펩티드는 전장의 HSV1 VP22 서열(1-301)(그의 서열은 WO 97/05265 도 4에 개시되어 있다) 중 아미노산 60-301 및 159-301에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 헤르페스 바이러스로부터의 VP22 단백질 서열에 기초한 상동성 단백질 및 단편은 미국 특허 번호 제6,017,735호에 기재되어 있다. 그러한 VP22 서열이 VP22 융합 폴리펩티드 발현 벡터로 형질감염된 세포로부터 형질감염이나 형질도입되지 않은 이웃 세포로의 VP22 융합 폴리펩티드의 세포내 수송을 부여한다. 예로서, 문헌 [Lemken et ah, (2007), Mo. l Then, 15(2):310- 319]을 참조한다. 따라서, IF-VP22 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 사용하는 것이 본원에 기술된 유도 방법에서의 형질감염된 포유동물 발현 벡터의 기능적 효율을 현저히 증가시킬 수 있다.
적합한 포유동물 발현 벡터의 예로는 재조합 바이러스, 핵산 벡터, 예로서, 플라스미드, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 인간 인공 염색체, cDNA, cRNA 및 PCR 생산 발현 카세트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IF의 발현을 유도하는 적합한 프로모터의 예로는 레트로바이러스 LTR 요소; 구성적 프로모터, 예로서,CMV, HSV1-TK, SV40, IF-1α, β-액틴; PGK 및 유도가능 프로모터, 예로서, Tet-오퍼레이터 요소를 포함하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 경우에서, 포유동물 발현 벡터들 중 하나 이상이 IF 이외에, 형질감염되거나, 감염된 세포의 확인 또는 선별을 촉진하는 마커 유전자를 코딩한다. 마커 유전자의 예로는 형광 단백질, 예로서, EGFP, DS-Red, YFP 및 CFP를 코딩하는 유전자; 선별 시약에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자, 예로서, neoR 유전자 및 블라스티시딘 내성 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
1. 재조합 바이러스
IF를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 수반하는 재조합 바이러스를 하나 이상의 세포로 도입함으로써 IF를 강제 발현시킬 수 있다. 쉽게 언급할 수 있도록 하기 위해 때때로 바이러스는 본원에서는 바이러스가 코딩하는 IF로 지칭될 것이다. 예를 들면, Oct3/4 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스는 "Oct3/4 바이러스"로서 기술될 수 있다. 특정 경우에서, 바이러스는 1 초과의 IF 카피를 코딩할 수 있거나, 한번에 1 초과의 IF, 예로서, 2개의 IF를 코딩할 수 있다.
다양한 IF 세트의 강제 발현을 위해 재조합 바이러스 조합 또는 세트를 세포로 도입할 수 있다. 몇몇 경우에서, 재조합 바이러스에 의해 발현된 IF 세트는 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드, 또는 c-Myc 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 경우에서, 상기 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 예를 들면, IF 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 제외한, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 포함할 수 있다. IF 세트는 세포 형질전환의 위험 또는 암 유도의 위험을 증가시킬 수 있는 폴리펩티드는 포함하지 않는다. 세포 형질전환을 유도할 수 있는 c-Myc의 능력의 예로서, 문헌 [Adhikary et al., (2005), Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6(8):635-645]에 기재되어 있으며, 이를 참조한다.
몇몇 경우에서, 발현시키고자 하는 세트는 c-Myc 폴리펩티드이다. 특정 경우에서, c-Myc 폴리펩티드는 구성적으로 활성인 c-Myc 변이체이다. 몇몇 일례로, 본 세트는 유도가능한 활성을 보일 수 있는 c-Myc 폴리펩티드, 예로서, c-Myc-ER 폴리펩티드를 포함한다(예로서, 문헌 [Littlewood, et al., (1995), Nuclei Acid Res., 23(10): 1686-90] 참조).
다른 경우에서, 발현시키고자 하는 IF 세트는 TERT 폴리펩티드, SV40 대형 T 항원 폴리펩티드, HPV16 E6 폴리펩티드, HPV16 E7 폴리펩티드, 또는 Bmi1 폴리펩티드를 제외한, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 TERT 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 SV40 대형 T 항원을 포함하지 않는다. 다른 경우에서, IF 세트는 HPV16 E6 폴리펩티드 또는 HPV16 E7 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
몇몇 경우에서, IF 세트는 3개의 IF를 포함하는데, 여기서, 3개의 IF 중 2개는 Oct3/4 폴리펩티드 및 Sox2 폴리펩티드이다. 다른 경우에서, IF 세트는 2개의 IF를 포함하는데, 여기서, 2개의 폴리펩티드는 c-Myc 폴리펩티드 및 Sox2 폴리펩티드이다. 몇몇 경우에서, IF 세트는 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드로 제한된다. 다른 경우에서, IF 세트는 4개의 IF: Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드, Klf4 폴리펩티드 및 c-Myc 폴리펩티드로 이루어진 한 세트로 제한될 수 있다.
IF 세트는 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드 이외의 IF를 포함할 수 있다. 그러한 추가의 IF로는 Nanog, TERT, LIN28, CYP26A1, GDF3, FoxD3, Zfp42, Dnmt3b, Ecat1 및 Tcl1 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 경우에서, 추가의 IF 세트는 c-Myc 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 몇몇 경우에서, 추가의 IF 세트는 세포 형질전환의 위험 또는 암 유도의 위험을 증가시킬 수 있는 폴리펩티드는 포함하지 않는다.
개개의 바이러스는 시간에 맞춰 순차적으로 또는 동시에 세포에 첨가될 수 있다. 몇몇 경우에서, 적어도 하나의 바이러스, 예로서, Oct3/4 바이러스, Sox2 바이러스, Kif4 바이러스, 또는 c-Myc 바이러스는 하나 이상의 다른 바이러스가 첨가되는 시점과는 다른 시점에 세포에 첨가된다. 몇몇 일례로, Oct3/4 바이러스, Sox2 바이러스 및 K1F4 바이러스는 동시에, 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 세포에 첨가되고, c-Myc 바이러스는 다른 바이러스가 첨가되는 시점과는 다른 시점에 첨가된다.
적어도 2개의 재조합 바이러스가 동시에 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 세포에 첨가될 수 있다. 몇몇 일례로, Oct3/4 바이러스 및 Sox2 바이러스는 동시에, 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 첨가되고, Klf4 바이러스 또는 c-Myc 바이러스는 다른 시점에 첨가된다. 몇몇 일례로, Oct3/4 바이러스 및 Sox2 바이러스; Oct3/4 바이러스 및 Klf4 바이러스; Oct3/4 바이러스 및 c-Myc 바이러스; Sox2 바이러스 및 Klf4 바이러스; Sox2 바이러스 및 c-Myc 바이러스; 또는 Klf4 및 c-Myc 바이러스가 동시에, 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 첨가된다.
몇몇 경우에서, 적어도 3개의 바이러스, 예로서, Oct3/4 바이러스, Sox2 바이러스 및 Klf4 바이러스가 동시에, 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 첨가된다. 다른 일례로, 적어도 4개의 바이러스, 예로서, Oct3/4 바이러스, Sox2 바이러스, Klf4 바이러스 및 c-Myc 바이러스가 동시에, 또는 매우 가까운 시간 간격을 두고 세포에 첨가된다.
때때로, 바이러스 감염 효율은 동일 바이러스로 반복적으로 처리함으로써 개선될 수 있다. 몇몇 경우에서, 하나 이상의 Oct3/4 바이러스, Sox2 바이러스, Klf4 바이러스, 또는 c-Myc 바이러스는 적어도 2회, 적어도 3회, 또는 적어도 4회에 걸쳐 별도의 시점에 세포에 첨가된다.
재조합 바이러스의 예로는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함); 아데노바이러스; 및 아데노 관련 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 종종, 재조합 레트로바이러스는 뮤린 몰로니 백혈병 바이러스(MMLV: murine moloney leukemia virus)이지만, 다른 재조합 레트로바이러스, 예로서, 조류 백혈구증 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV: Murine Leukemia Virus), 밍크 세포 포커스 유도 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 세망내피증 바이러스, 긴팔원숭이 유인원 백혈구 바이러스(Gibbon Abe Leukemia Virus), 메이슨 화이자 원숭이 바이러스(Mason Pfizer Monkey Virus), 또는 라우스 육종 바이러스 또한 사용될 수 있다(예로서, 미국 특허 번호 제6,333,195호 참조).
다른 경우에서, 재조합 바이러스는 렌티바이러스(예로서, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1); 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV: Simian Immunodeficiency Virus); 또는 고양이 면역결핍 바이러스(FIY: Feline Immunodeficiency Virus))이다(예로서, 문헌 ([Johnston et al., (1999), Journal of Virology, 73(6):4991-5000](FIV); [Negre D et al., (2002), Current Topics in Microbiology and Immunology, 261 :53-74](SFV); [Naldini et al., (1996), Science, 272:263-267](HIV))을 참조).
재조합 바이러스는 표적 세포로의 유입을 도와주는 바이러스 폴리펩티드(예로서, 레트로바이러스 env)를 포함할 수 있다. 그러한 바이러스 폴리펩티드는 당업계에 잘 수립되어 있다(예로서, 미국 특허 번호 제5,449,614호 참조). 바이러스 폴리펩티드는 원 숙주 종 외부에 있는 세포를 비롯한, 다수의 종으로부터 유래된 세포로의 유입을 도와주는 양생 바이러스 폴리펩티드, 예로서, 양생 env일 수 있다(예로서, 상기 문헌 참조). 바이러스 폴리펩티드는 원 숙주 종 외부에 있는 세포로의 유입을 도와주는 친이종 바이러스 폴리펩티드일 수 있다(예로서, 상기 문헌 참조). 몇몇 실시태양에서, 바이러스 폴리펩티드는 원 숙주 종 외부에 있는 세포로의 유입을 도와주는 동종숙주역 바이러스 폴리펩티드, 예로서, 동종숙주역 env일 수 있다(예로서, 상기 문헌 참조).
레트로바이러스를 세포로의 유입을 도와줄 수 있는 바이러스 폴리펩티드의 예로는 MMLV 양생 env, MMLV 동종숙주역 env, MMLV 친이종 env, 수포성 구내염 바이러스-g 단백질(VSV-g: vesicular stomatitis virus-g 단백질), HIV-1 env, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV: Gibbon Ape Leukemia Virus) env, RD114, FeLV-C, FeLV-B, MLV 10A1 env 유전자 및 키메라를 비롯한 그의 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 문헌 ([Yee et al., (1994), Methods Cell Biol., Pt A:99-112](VSV-G); 미국 특허 번호 제5,449,614호)를 참조한다. 몇몇 경우에서, 발현을 촉진시키거나, 수용체에의 결합을 증진시키기 위해 바이러스 폴리펩티드를 유전적으로 변형시킨다.
일반적으로, 바이러스 DNA 또는 RNA 작제물을 생산자 세포 내로 도입함으로써 재조합 바이러스를 생산한다. 몇몇 경우에서, 생산자 세포는 외인성 유전자를 발현하지 않는다. 다른 경우에서, 생산자 세포는 예로서, 하나 이상의 gag, pol, 또는 env 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 레트로바이러스 gag, pol, 또는 env 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 같은 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 "패키징 세포"이다. 레트로바이러스 패키징 세포는 바이러스 폴리펩티드, 예로서, 표적 세포로의 유입을 도와주는 VSV-g를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 패키징 세포는 하나 이상의 렌티바이러스 단백질을 코딩하는 유전자, 예로서, gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev, 또는 nef를 포함한다. 몇몇 경우에서, 패키징 세포는 아데노바이러스 단백질, 예로서, E1A 또는 E1B 또다른 다른 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 예를 들면, 패키징 세포가 공급하는 단백질은 레트로바이러스 유래의 단백질, 예로서, gag, pol, and env; 렌티바이러스 유래의 단백질, 예로서, gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev 및 nef; 및 아데노바이러스 유래의 단백질, 예로서, E1A 및 E1B일 수 있다. 다수의 일례로, 패키징 세포는 바이러스 벡터가 유래되는 바이러스와는 상이한 바이러스로부터 유래된 단백질을 공급한다.
패키징 세포주는 임의의 용이하게 형질감염될 수 있는 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 패키징 세포주는 293T 세포, NIH3T3, COS 또는 HeLa 세포주에 기초한 것일 수 있다. 패키징 세포는 종종 바이러스를 패키징하는데 필요한 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자가 부족한 바이러스 벡터 플라스미드를 패키징하는데 사용된다. 상기 바이러스 벡터 플라스미드에 의해 코딩된 단백질을 제외한 단백질 또는 폴리펩티드를 공급할 수 있는 임의의 세포를 패키징 세포로서 이용할 수 있다. 패키징 세포주의 예로는 플레티넘-E(Plat-E); 플레티넘-A(Plat-A); BOSC 23(ATCC CR1 11554); 및 Bing(ATCC CR1 11270)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예로서, 문헌 [Morita et al., (2000), Gene Therapy, 7: 1063-1066]; [Onishi et al, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329]; 미국 특허 번호 제6,995,009호 참조). 예로서, 암포-팩(Ampho-Pak) 293 세포주, 에코-팩(Eco-Pak) 2-293 세포주, 레트로팩(레트로Pack) PT67 세포주 및 레트로-X 유니버살 패키징 시스템(레트로-X Universal Packaging System)(이 모두 Clontech로부터 이용가능하다)과 같은 시판용 패키징 세포주 또한 유용하다.
레트로바이러스 작제물은 광범위한 레트로바이러스, 예로서, MMLV, HIV-1, SrV, FIV, 또는 본원에 기술된 다른 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 작제물은 특정 바이러스의 1회 초과의 복제 주기를 위해 필요한 모든 바이러스 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 몇몇 경우에서, 바이러스 유입 효율은 다른 인자 또는 다른 바이러스 폴리펩티드를 첨가함으로써 개선된다. 다른 경우에서, 레트로바이러스 작제물에 의해 코딩된 바이러스 폴리펩티드는 1회 초과의 복제 주기를 지원하지 못한다(예로서, 미국 특허 번호 제6,872,528호). 그러한 환경하에서는 다른 인자 또는 다른 바이러스 폴리펩티드를 첨가하는 것이 바이러스 유입을 가속화시키는데 도움을 줄 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 재조합 레트로바이러스는 VSV-g 폴리펩티드는 포함하지만, HTV-1 env 폴리펩티드는 포함하지 않는 HTV-1 바이러스이다.
레트로바이러스 작제물은 프로모터, 다중 클로닝 부위 및/또는 내성 유전자를 포함할 수 있다. 프로모터의 예로는 CMV, SV40, IF 1α, β-액틴; 레트로바이러스 LTR 프로모터 및 유도가능 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 레트로바이러스 작제물은 또한 패키징 신호(예로서, MFG 벡터로부터 유래된 패키징 신호; psi 패키징 신호)를 포함할 수 있다. 당업계에 알려져 있는 몇몇 레트로바이러스 작제물의 예로는 pMX, pBabeX 또는 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 문헌 [Onishi et ai, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329]를 참조한다. 몇몇 경우에서, 레트로바이러스 작제물은 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터(SIN: self-inactivating lentiviral vector) 벡터이다(예로서, 문헌 [Miyoshi et al, (1998), J. Virol, 72(10):8150-8157] 참조). 몇몇 경우에서, 레트로바이러스 작제물은 LL-CG, LS-CG, CL-CG, CS-CG, CLG 또는 MFG이다. 문헌 ([Miyoshi et al, (1998), J. Virol, 72(10): 8150-8157]; [Onishi et al, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329]; [Riviere et al., (1995), PNAS, 92:6733-6737]). 바이러스 벡터 플라스미드(또는 작제물)은 pMX, pMX-IB, pMX-puro, pMX-neo를 포함한다(pMX-IB는 pMX-puro의 퓨로마이신 내성 유전자 대신에 블라스티시딘 내성 유전자를 수반하는 벡터이다)(문헌 [Kimatura et al., (2003), Experimental Hematology, 31:1007-1014]; [MFG Riviere et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:6733-6737]); pBabePuro(문헌 [Morgenstern et al., (1990), Nucleic acids Research, 18:3587-3596]); 레트로바이러스 시스템으로서 LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG(문헌 [Miyoshi et al., (1998), Journal of Virology, 72:8150-8157]) 등 및 아데노바이러스 시스템으로서 pAdex1(문헌 [Kanegae et al., (1995), Nucleic acids Research, 23:3816-3821])을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 레트로바이러스 작제물은 블라스티시딘(예로서, pMX-IB), 퓨로마이신(예로서, pMX-puro, pBabePuro); 또는 네오마이신(예로서, pMX-neo)을 포함한다. 예로서, 문헌 [Morgenstern et al., (1990), Nucleic acids Research, 18:3587-3596]을 참조한다.
레트로바이러스 작제물은 하나 이상의 IF를 코딩할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 폴리펩티드, 또는 그의 변이체를 코딩하는 pMX 벡터를 생성하거나 수득한다. 예를 들면, Oct3/4를 pMX-puro 내로 삽입하여 pMX-Oct3/4를 생성하고; Sox2를 pMX-neo 내로 삽입하여 pMX-Sox2를 생성하고; Klf4를 pMX-IB 내로 삽입하여 pMX-Klf4를 생성하고; c-Myc를 pMX-IB 내로 삽입하여 pMX-c-Myc를 생성한다.
패키징 세포로부터 재조합 바이러스를 생산하는 방법 및 그의 용도는 잘 수립되어 있으며, 예로서, 미국 특허 번호 제5,834,256호; 제6,910,434호; 제5,591,624호; 제5,817,491호; 제7070994호; 및 제6,995,009호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 여러 방법은 바이러스 작제물을 패키징 세포주 내로 도입하는 것으로 시작된다. 바이러스 작제물은 인산칼슘법(예로서, 미심사된 일반 특허 공개 번호 제2-227075호(Kokai)), 리포펙션 방법(문헌 [Feigner et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:7413-7417]), 전기천공 방법, 미세주입, 휴젠(fugene) 형질감염 등 및 본원에 기술된 임의의 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다.
일례로, pMX-Oct3/4, pMX-Sox2, pMX-Klf4 또는 pMX-c-Myc를 휴젠 HD(Roche) 형질감염에 의해 플레이트(PlatE) 세포 내로 도입한다. 세포 배양 배지를 FGM-2 싱글 쿼츠(Lonza)로 보충된 FBM(Lonza)을 포함하는 신선한 배지로 교체할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 바이러스 작제물을 도입한 후 약 12 내지 약 60시간이 경과하였을 때, 예로서, 바이러스 작제물을 생산자 세포 내로 도입한 후 약 12 내지 약 18시간; 약 18 내지 약 24시간; 약 24 내지 약 30시간; 약 30 내지 약 36시간; 약 36 내지 약 42시간; 약 42 내지 약 48시간; 약 48 내지 약 54시간; 또는 약 54 내지 약 60시간이 경과하였을 때 배지를 교체한다. 바이러스 작제물을 생산자 세포 내로 도입한 후 약 24 내지 약 48시간이 경과하였을 때 배지를 교체할 수 있다. 신선한 배지를 첨가한 후 약 4 내지 약 24시간, 예로서, 약 4시간이 경과하였을 때 상청액을 회수할 수 있다. 몇몇 경우에서, 신선한 배지를 첨가한 후 매 4시간마다 상청액을 회수할 수 있다. 회수된 상청액을 0.45 uM 필터(Millipore)에 통과시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 회수된 상청액은 하나 이상의: pMX-Oct3/4, pMX-Sox2, pMX-Klf4 또는 pMX-c-Myc로부터 유래된 레트로바이러스를 포함한다.
아데노바이러스 형질도입을 사용하여 IF 세트를 강제 발현시킬 수 있다. 아데노바이러스 생성 방법 및 그의 용도 또한 잘 수립되어 있으며, 예로서, 문헌 ([Strau, The Adenoviru, Plenum Press (NY 1984), 451 496]; [Rosenfeld, et al., (1991), Science, 252:431-434]; 미국 특허 번호 제6,203,975호, 제5,707,618호 및 제5,637,456호])에 기재되어 있다. 다른 경우에서, 아데노바이러스 관련 바이러스 형질도입을 사용하여 IF 세트를 강제 발현시킨다. 아데노 관련 바이러스 생성 방법 및 그의 용도 또한 예로서, 미국 특허 번호 제6,660,514호 및 제6,146,874호에 기재되어 있는 바와 같이, 잘 수립되어 있다.
예시적인 실시태양에서, 아데노바이러스 작제물을 수득하거나, 생성할 수 있는데, 여기서, 아데노바이러스 작제물, 예로서, 아데노-X는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc를 코딩하는 DNA를 포함한다. 아데노바이러스 작제물은 예로서, 리포펙트아민 2000(리포펙트아민 2000)(Invitrogen) 또는 휴젠 HD(Roche)와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 HEK 293 세포 내로 도입될 수 있다. 몇몇 경우에서, 본 방법은 추가로 (1) 형질감염 이후 약 10 내지 약 20일, 예로서, 약 11, 13, 14, 15, 18, 또는 20일이 경과하였을 때 일어나는 세포변성 효과(CPE: cytopathic effect)를 보일 때 세포를 채취하는 단계; (2) 세포에 약 2 내지 약 5회, 예로서, 약 3회에 걸쳐 냉동 해동 주기를 반복 실시하는 단계; (3) 생성된 바이러스 함유 액체를 채취하는 단계; (4) 아데노바이러스 정제 키트(Clontech)를 사용하여 바이러스를 정제하는 단계; 및 (5) -80℃에서 바이러스를 보관하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에서, 아데노바이러스 스톡의 역가, 또는 플라크 형성 단위(PFU: plaque forming unit)는 본원에 기술된 바와 같이, 아데노-X 고속 역가 키트(아데노-X rapid titer kit)(Clontech)를 사용하여 측정한다.
세포는 상이한 숙주로부터 유래된 상이한 세포 유형 또는 세포들을 천연적으로 표적하는 재조합 레트로바이러스로 감염될 수 있다. 효율을 촉진시키기 위해서는 먼저 외인성 수용체를 인간 세포로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 뮤린 몰로니 백혈병 바이러스(MMLV)의 유입을 돕기 위해서 외인성 마우스 수용체를 인간 세포, 예로서, 출생 후 진피 섬유아세포에 첨가할 수 있다. 특히 외인성 수용체가 바이러스 폴리펩티드, 예로서, MMLV env, 또는 HTV env를 인식한다면 상기 수용체는 바이러스 유입을 촉진시킴으로써 감염 효율을 개선시킬 수 있다. 외인성 수용체의 예로는 당업계에 공지된 특정 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 인식되는 임의의 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 인간 표적 세포의 MMLV 감염을 촉진시키기 위해서 뮤린 수용체인 mCAT1(진뱅크 등록 번호 NM_007513 단백질)을 사용한다.
외인성 수용체는 본원에 기술된 방법에 의해 도입될 수 있다. 외인성 수용체를 도입하는 방법은 인산칼슘 형질감염, 리포펙트아민 형질감염, 휴젠 형질감염, 미세주입, 또는 전기천공을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 실시태양에서, 바이러스, 예로서, 재조합 아데노바이러스 또는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함)를 사용하여 외인성 수용체를 표적 세포로 도입한다. 추가의 예시적인 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스를 사용하여 mCAT1을 인간 세포로 도입하고, 재조합 레트로바이러스, 예로서, MMLV를 사용하여 IF 유전자, 예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc를 세포로 도입한다.
몇몇 경우에서, mCAT1 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 아데노바이러스 용액, 예로서, pADEX-mCAT1 작제물을 사용함으로써 생성된 아데노바이러스 용액을 생성하거나 수득한다. 아데노바이러스 용액은 행크(Hanks) 평형 염 용액을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, (1) 약 1 m.o.i. 내지 약 50 m.o.i., 예로서, 약 1 m.o.i., 약 5 m.o.i., 약 7.5; m.o.i., 약 10 m.o.i., 약 15 m.o.i., 약 20 m.o.i., 약 30 m.o.i., 약 40 m.o.i., 또는 약 50 m.o.i.의 감염다중도(m.o.i.: multiplicity of infection)(바이러스 대 세포의 비)로 세포, 예로서, 인간, 비배아성 섬유아세포와 p-ADEX-mCAT1 아데노바이러스 용액을 접촉시키고; (2) 세포를 아데노바이러스 용액과 함께 실온에서 약 15분 내지 약 2시간, 예로서, 약 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1시간, 약 1.25시간, 약 1.5시간, 약 1.75시간, 또는 약 2시간 동안 인큐베이션시키고; (3) 배양 배지 중에서 체세포 군집을 약 24시간 내지 약 60시간, 예로서, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간, 또는 약 60시간 동안 배양함으로써 세포를 감염시킨다.
매우 다양한 방법을 사용하여 세포를 감염시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, (1) 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 모두의: pMX-Oct3/4 레트로바이러스, pMX-Sox2 레트로바이러스, pMX-Klf4, 또는 pMX-c-Myc를 조합하여 레트로바이러스 용액을 수득하는 단계; (2) 레트로바이러스 용액을 약 2 ug/ml 내지 약 15 ug/ml의 폴리브렌, 예로서, 약 2 ug/ml, 약 3 ug/ml, 약 5 ug/ml, 약 7 ug/ml, 약 10 ug/ml, 약 12 ug/ml, 또는 약 15 ug/ml의 폴리브렌으로 보충하는 단계; (3) 약 0.5 m.o.i. 내지 약 10 m.o.i., 예로서, 약 0.5 m.o.i., 약 1 m.o.i., 약 2 m.o.i., 약 5 m.o.i., 약 7.5 m.o.i., 또는 약 10 m.o.i.의 m.o.i.(바이러스 대 세포의 비)로 체세포와 레트로바이러스 용액을 접촉시키는 단계; (4) 단계 (3)의 접촉 단계를 37℃에서 약 2시간 내지 약 24시간, 예로서, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 1 1시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 약 24시간 동안 지속시키는 단계; (5) 단계 (4)의 접촉 단계 이후에 본원에 기술된 바와 같이, 즉시 배지를 MC-ES 배지로 교체하는 단계; 및 (6) MC-ES 배지를 매일 내지 2일마다 신선한 배지로 교체하는 단계에 의해 세포 감염이 이루어진다. 몇몇 경우에서, 본원에 기술된 단계 (1)부터 (6)에 따라, 그리고, 세포를 레트로바이러스 용액과 접촉시키기 이전에 일정 시간 동안, 에로서, 약 48시간 동안 세포를 사전 인큐베이션시키는 추가의 단계에 의해 체세포 감염이 이루어진다. 체세포가 바이러스 형질도입, 형질감염, 또는 다른 방법에 의해 도입된 외인성 수용체를 발현할 때에는 상기 사전 인큐베이션이 필요할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하여 외인성 수용체, 예로서, mCAT1을 체세포로 도입하는 경우; 상기 세포는 적어도 약 30시간 내지 적어도 약 60시간, 예로서, 약 30, 약 35, 약 40, 약 48, 약 52, 약 55, 또는 약 60시간의 일정 시간 동안 배양될 필요가 있을 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 바업에 의해 세포를 감염시킬 수 있다. 예로서, Palsson, B., et al., (1995), WO95/10619; [Morling, F.J. et al., (1995), Gene Therapy, 2:504-508]; [Gopp et al., (2006), Methods Enzymol, 420:64-81]을 참조한다. 예를 들면, 바이러스를 세포에 첨가한 후 단시간내 일정 기간 동안 세포를 원심분리시키는 것을 포함하는, 회전식 감염 또는 "회전식 접종(spinoculation)" 방법에 의해 감염시킬 수 있다. 몇몇 경우에서는 바이러스를 감염 이전에, 예를 들면, 초원심분리에 의해서 농축시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 레트로바이러스가 표적 세포 내로 유입되는 것을 돕거나 이를 개선시키기 위한 목적으로 다른 기술이 사용될 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스를 리포좀 또는 면역리포좀과 접촉시켜 특정 세포 유형으로의 유입을 돕거나, 이를 지시할 수 있다. 예로서, 문헌 [Tan et al., (2007), Mol. Med. 13(3-4):216-226]을 참조한다.
본원에 기술된 세포 감염 방법을 사용하여 외인성 수용체, 예로서, mCAT1 또는 본원에 기술된 외인성 수용체를 발현하는 세포를 감염시킬 수 있다. 외인성 수용체가 도입되는 방법에 따라, 감염 이전의 세포 사전 인큐베이션 기간을 달리할 필요가 있을 수 있다. 몇몇 경우에서, 외인성 수용체를 발현하지 않는 세포가 사용된다. 효율적인 세포 내로의 유입을 위해서 몇몇 재조합 레트로바이러스, 예로서, VSV-G 위형(pseudotype) 재조합 레트로바이러스는 외인성 수용체의 도움을 필요로 하지 않을 수 있다. 몇몇 일례로, VSV-G 위형 재조합 레트로바이러스는 본원에 기술된 방법에 따라 세포로 도입되는데, 단, 세포의 사전 배양 시간 조절은 달라질 수 있다.
2. 핵산 벡터
핵산 벡터 형질감염(예로서, 일시적 형질감염) 방법을 사용하여 IF를 인간 세포 내로 도입할 수 있다. 형질감염 등급의 핵산 발현 벡터를 제조하는 방법 및 형질감염 방법이 잘 수립되어 있다. 예로서, 문헌 [Sambrook and Russell (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd ed, (CSHL Press); and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son, N. Y. (2005), 9.1-9.14]를 참조한다. 고효율 형질감염 효율 방법으로는 예로서, 문헌 [Trompeter (2003), J Immunol. Method, 274(1-2):245-256] 및 국제 특허 출원 공보 WO2002086134, WO200200871 및 WO2002086129에 기재되어 있는 "뉴클레오펙션", 플러스(PLUS)™(캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen), 드림펙트(Dreamfect)™(프랑스 마르세유 소재의 OZ Biosciences), 진쥬스(GeneJuice)™(위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen), 폴리에틸렌이민(예로서, 문헌 [Lungwitz et al., (2005), Eur. JPharm. Biopharm., 60(2):247-266] 참조) 및 진잼머(유전자Jammer)™ (캘리포니아주 라호야 소재의 Stratagene)와 조합된 지질 기반 형질감염 시약, 예로서, 휴젠®6 및 휴젠® HD(Roche), DOTAP 및 리포펙트아민™ LTX 및 예로서, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/195,066호에 기재되어 있는 나노입자 형질감염 시약를 사용하여 이루어진 형질감염을 포함한다.
3. 단백질 도입
도입 방법은 IF 중 적어도 하나를 직접 세포 내로 도입하는 단백질 도입을 이용할 수 있다. 몇몇 경우에서, 단백질 도입 방법은 캐리어 시약과, 상기 언급한 IF들 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 정제된 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 적합한 캐리어 시약의 예 및 그의 사용 방법은 상업적으로 이용가능한 시약, 예로서, 미국 특허 번호 제6,841,535호에 기재되어 있는 샤리오(Chariot)™(캘리포니아주 칼스배드 소재의 Active 모티프, Inc.); 바이오포트(BioPort)®(캘리포니아주 샌디에고 소재의 Gene Therapy System, Inc.), 게놈원(GenomeONE)(일본 도쿄 소재의 Cosmo Bio Co., Ltd.) 및 프로테오쥬스(ProteoJuice)™(위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen), 또는 예로서, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/138,593호에 기재되어 있는 나노입자 단백질 도입 시약을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단백질 도입 방법은 단백질 도입 도메인(PTD: protein transduction domain) 서열에 융합된 상기 언급한 IF들 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 정제된 폴리펩티드(IF-PTD 융합 폴리펩티드)와 세포를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. PTD 도메인은 IF 서열의 아미노 말단에 융합될 수 있거나; PTD 도메인은 IF 서열의 카르복시 말단에 융합될 수 있다. 몇몇 경우에서, IF-PTD 융합 폴리펩티드는 변성된 폴리펩티드로서 세포에 첨가되는데, 상기 변성된 폴리펩티드는 그 자신이 세포로 수송되는 것을 촉진시킬 수 있으며, 이후 상기 세포에서 복원된다. PTD 융합 단백질 생성 및 그의 사용 방법은 당업계에 수립되어 있으며, 예로서, 미국 특허 번호 제5,674,980호, 제5,652,122호 및 제6,881,825호에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Becker-Hapak et ai, (2003), Curr Protocols in Cell Biol, John Wiley & Son, Inc]를 참조한다. 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열로는 하기: YGRKKRRQRRR(서열 번호 1); RKKRRQRR(서열 번호 2); YARAAARQARA(서열 번호 3); THRLPRRRRRR(서열 번호 4); 및 GGRRARRRRRR(서열 번호 5) 중 임의의 것을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 경우에서, 개개의 정제된 IF 폴리펩티드를 상이한 시점에 순차적으로 세포내 첨가한다. 다른 실시태양에서, 정제된 c-Myc 폴리펩티드를 제외한 적어도 3개의 정제된 IF 폴리펩티드, 예로서, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드의 세트를 세포에 첨가한다. 몇몇 실시태양에서, 4개의 정제된 IF 폴리펩티드, 예로서, 정제된 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 폴리펩티드의 세트를 세포에 첨가한다. 몇몇 실시태양에서, 정제된 IF 폴리펩티드를 하나의 조성물(즉, IF 폴리펩티드 혼합물을 함유하는 조성물)로서 세포에 첨가한다. 몇몇 실시태양에서, 세포를 정제된 IF 폴리펩티드의 존재하에 약 30 분 내지 약 24시간, 예로서, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 또는 약 30 분 내지 약 24시간의 임의의 다른 기간 동안 인큐베이션시킨다. 몇몇 실시태양에서, 세포의 단백질 도입은 약 매일 내지 약 매 4일마다, 예로서, 1.5일마다, 매 2일마다, 매 3일마다의 빈도로, 또는 약 매일 내지 약 매 4일마다 임의의 다른 빈도로 동일하거나 상이한 IF 폴리펩티드를 사용함으로써 반복한다.
몇몇 경우에서, 본원에 기술된 방법은 본원에 기술된 IF 세트를 강제 발현시키기 위해 임의로 조합된 단백질 도입 및 발현 벡터 형질도입/형질감염을 사용한다. 몇몇 실시태양에서, 레트로바이러스 발현 벡터를 사용하여 세포에서 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 강제 발현시키고, 정제된 c-Myc 정제된 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 단백질 도입에 의해 세포 내로 도입시킨다. 정제된 IF 폴리펩티드 이외에 HDAC 저해제 처리를 이용할 수 있다. 몇몇 경우에서, 정제된 c-Myc 폴리펩티드를 제외한 적어도 3개의 정제된 IF 폴리펩티드, 예로서, Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드의 세트를 세포에 첨가하고, 또한 상기 세포를 HDAC 저해제 처리한다.
F. 유도 인자 서열
본원에 기술된 유도 방법에서 사용되는 IF의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자는 본원에 기술되어 있다. 몇몇 실시태양에서, IF 아미노산 서열은 천연적으로 발생된 아미노산 서열, 예로서, 인간 또는 마우스 Oct3/4, 인간 또는 마우스 Sox2, 인간 또는 마우스 Klf4, 또는 인간 또는 마우스 c-Myc 폴리펩티드의 아미노산 서열이다. 다른 실시태양에서, IF 아미노산 서열은 본원에 기술된 바와 같이 IF의 비천연적으로 발생된, 아미노산 서열 변이체인데, 그럼에도 불구하고, 상기 변이체는 기능적으로 또는 구조적으로 IF 아미노산 서열과 상동성을 띤다.
2가지 이상의 폴리펩티드의 구조적 및 기능적 상동성을 평가하는 것은 일반적으로 서로에 대한 그들의 아미노산 서열의 동일성(%)을 측정하는 것을 포함한다. 2개 이상 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 종래 방법으로 측정된다. 예를 들면, 문헌 ([Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402]; 및 [Henikoff and Henikoff (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1992)])을 참조한다. 간략하면, 갭 개방 패널티=10, 갭 연장 패널티=1 및 [Henikoff and Henikoff (상기 동일 문헌)]의 "BLOSUM62" 점수화 행렬을 사용하여 정렬 점수가 최대화되도록 2개의 아미노산 서열을 정렬한다. 이어서, 동일성(%)을 하기와 같이 계산한다: ([동일한 매치의 총 갯수]/[더 긴 서열의 길이 + 2개의 서열을 정렬시키기 위해 더 긴 서열 내로 도입된 갭의 갯수])(100).
당업자는 2개의 아미노산 서열을 정렬하는데 이용할 수 있는 알고리즘 다수가 수립되어 있음을 알고 있을 것이다. 피어슨(Pearson) 및 리프먼(Lipman)의 "FASTA" 유사성 검색 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열과 또다른 펩티드의 아미노산 서열이 공유하는 동일성 수준을 조사하는데 적합한 단백질 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘은 문헌 [Pearson and Lipman (1988), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444] 및 문헌 [Pearson (1990), Meth. Enzymol., 183:63]에 기재되어 있다. 간략하면, FASTA는 우선 의문의 서열(예를 들어, 서열 번호 6-13 중 어느 것) 및 가장 높은 밀도의 동일성(만일 ktup 변수가 1이라면) 또는 동일성의 쌍(만일 ktup=2)을 갖는 테스트 서열이 공유하는 영역을 확인함으로써 서열 유사성을 특징짓는데, 이때 보존적 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실은 고려하지 않는다. 이어서 가장 높은 밀도의 동일성을 갖는 10개의 영역은 아미노산 치환 행렬을 사용하여 쌍을 이룬 아미노산 모두의 유사성을 비교함으로써 다시 점수화되고, 상기 영역의 말단은 가장 높은 점수에 도움이 되는 그들의 잔기만을 포함하도록 "정돈"된다. "컷오프" 값(서열의 길이 및 ktup 값을 기초로 한 미리 결정된 공식에 의해 계산됨)보다 더 큰 점수를 갖는 몇몇 영역이 존재한다면, 그 후 정돈된 개시 영역을, 상기 영역이 결합되어 갭과 함께 거의 정확한 정렬을 형성할 수 있는지 여부를 결정하도록 조사한다. 최종적으로, 2개의 아미노산 서열의 가장 높은 점수화 영역은 니들만-운쉬-셀러(Needleman-Wunsch-Sellers) 알고리즘(문헌 ([Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48:444-453]; [Sellers (1974), SIAMJ. Appl. Math., 26:787]))을 변형하여 정렬하는데, 이는 아미노산 삽입 및 결실을 허용한다. FASTA 분석에 대한 예시적인 파라미터는 ktup=1, 갭 개방 패널티=10, 갭 연장 패널티=1 및 치환 행렬=BLOSUM62이다. 이들 파라미터는 [Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63(1990)]에서 설명되는 바와 같이, 점수화 행렬 파일("SMATRIX")을 변형시킴으로써 FASTA 프로그램으로 도입될 수 있다.
낮은, 중간 정도의, 또는 고도한 엄격도 조건하에서 서열 번호 6-13 중 어느 것의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로부터의 적어도 100개의 뉴클레오티드로 이루어진 프로브에 특이적으로 하이브리드화하는, 본원에 기술되어 있는 것과 같은, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예로서, 외인성 유전자) 또한 본원에서 기술한다. 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건은 예로서, 2XSSC 및 0.1% SDS 중 42℃에서 약 40% 내지 약 70% GC 함량의 100개의 뉴클레오티드로 이루어진 프로브와 하이브리드화하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격도의 하이브리드화 조건은 예로서, 0.5X SSC 및 0.1% SDS 50℃에서의 것을 포함한다. 고도한 엄격도의 하이브리드화 조건은 예로서, 0.2X SSC 및 0.1% SDS 중 65℃에서 상기 언급한 프로브와 하이브리드화하는 것을 포함한다. 이러한 조건하에서는 하이브리드화 온도가 승온됨에 따라 더 높은 상동성을 갖는 핵산을 수득할 수 있다. Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 본원에 기술되어 있는 바와 같은 이들 IF의 강제 발현에 유용하다.
IF의 특정 아미노산 서열 변이체가 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한지 여부를 결정하는데 다수의 고려 사항이 당업자에게 유용하다. 이러한 고려 사항으로는 (1) IF에 관한 공지의 구조 기능 관계, 예로서, 모듈 도메인, 예로서, DNA 결합 도메인 또는 전사활성 도메인(이는 다수의 경우에 있어서 기능적으로 별개의 것이고, 독립적인 기능을 할 수 있는 것으로 보여진다)의 존재; (2) 본원에 기술된 서열 정렬 알고리즘에 의해 밝혀진 바와 같이, IF의 천연적으로 발생된 상동체(예로서, 패럴로그 및 올소로그) 중의 아미노산 서열 보존 존재를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 다수의 생물정보학 알고리즘이 당업계에 알려져 있는데, 이를 통해 기능적 효과, 즉, 그의 기능에 미치는 단백질의 아미노산 서열 중 특정 아미노산 치환의 "내성"을 성공적으로 예측할 수 있다. 그러한 알고리즘으로는 예로서, pMUT, SIFT, PolyPhen 및 SNPs3D를 포함한다. 그에 관한 개요를 위해서는 예로서, 문헌 [Ng and Henikoff (2006), Ann Rev Genomics Hum Genet., 7:61-80]을 참조한다. 예를 들면, pMUT는 서열 상동성에 기초하여 주어진 위치에서의 특정 아미노산 치환이 단백질의 기능에 영향을 미치는지 여부를 고도로 정확하게(전반적으로 약 84%로) 예측한다. 문헌 ([Ferrer-Costa et al, (2005), Bioinformatic, 21(14):3176-3178]; [Ferrer-Costa et al, (2004), Protein, 57(4):811-819]; 및 [Ferrer-Costa et al., (2002), J Mol Biol, 315:771-786])을 참조한다. PMUT 알고리즘 서버는 월드 와이드 웹상의 //mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/에서 공개적으로 이용가능하다. 따라서, 임의의 IF 폴리펩티드 아미노산 서열의 경우, 주어진 아미노산 치환이 IF 폴리펩티드 기능에 미치는 중성성 또는 유해성을 예측할 수 있는 "아미노산 치환 행렬"을 작성할 수 있다.
비천연적으로 발생된 서열 변이체는 당수의 공지 방법에 의해 생성될 수 있다. 그러한 방법으로는 미국 특허 번호 제6,521,453호에 기재되어 있는 "유전자 셔플링"; 문헌 [Kopsidas et al, (2007), BMC Biotechnology, 7: 18-29]에 기재되어 있는 "RNA 돌연변이 유발법"; 및 "오류 빈발 PCR 방법"을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 오류 빈발 PCR 방법은 (a) 뉴클레오티드 농도를 불균형화시키고/거나, 화학적 화합물, 예로서, 염화망간을 첨가함으로써 폴리머라제의 신뢰도를 감소시키는 방법(예로서, 문헌 [Lin-Goerke et al., (1997), Biotechnique, 23:409-412] 참조), (b) 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 방법(예로서, 미국 특허 번호 제6,153,745호 참조), (c) '돌연변이유발성' 폴리머라제를 사용하는 방법(예로서, 문헌 [Cline, J. and Hogrefe,H.H. (2000), Strategies (Stratagene Newsletter), 13: 157-161] 참조) 및 (d) 조합 방법(예로서, 문헌 [Xu et al., (1999), Biotechnique, 27: 1102-1108] 참조)으로 분류될 수 있다. 다른 PCR-기반한 돌연변이 유발 방법은 예로서, 문헌 ([Osuna et al., (2004), Nucleic Acids Re, 32(17):e136] 및 [Wong et al., (2004), Nucleic Acids Res.,10;32(3):e26)])에 기재되어 있는 방법 및 당업계에 공지되어 있는 방법을 포함한다.
IF의 아미노산 서열 변이체의 기능 유지, 손실, 또는 획득에 관해서 확인하는 것은 평가하고자 하는 단백질 기능에 따라 다양한 유형의 분석법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, IF가 전사 활성인자, 예로서, Oct3/4인 경우, 그 기능은 세포 기반의 프로모터-리포터 분석법을 사용하여 쉽게 평가할 수 있는데, 여기서, 리포터 작제물은 평가하고자 하는 활성인자 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 동족의 표적 요소를 포함한다. 프로모터-리포터 작제물을 생성하고, 상기 작제물을 세포 내로 도입하고, 다양한 리포터 폴리펩티드 활성을 분석하는 방법은 예로서, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son, N. Y. (2005), 3.16-3.17 and 9.1-9.14](각각)에서 상세히 살펴볼 수 있다. 프로모터 활성은 리포터 폴리펩티드(예로서, 효소 활성 또는 형광성), 리포터 폴리펩티드 발현(예로서, ELISA 분석법에 의해), 또는 리포터 mRNA 발현(예로서, 형광 하이브리드화 하이브리드화 기법에 의해) 특성을 측정함으로써 정량할 수 있다. 적합한 리포터 폴리펩티드로는 예로서, 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 형광 단백질(예로서, 강화된 녹색 형광 단백질), β-갈락토시다제, β 락타마제, ALP 및 호스래디쉬 퍼옥시다제를 포함한다.
예를 들면, 루시퍼라제 활성은 적절한 발광원성 기질, 예로서, 반딧불이 루시퍼라제에 대한 반딧불이 루시페린 또는 레닐라 루시퍼라제에 대한 코엘렌테라진을 제공함으로써 검출될 수 있다. 적절한 기질의 존재하에서 루시퍼라제 활성은 다수의 표준 기법, 예로서, 발광분석법에 의해 정량화시킬 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제5,744,320호를 참조한다. 형광 폴리펩티드(예로서, EGFP)는 당업계에 공지된 다수의 검출 방법(예로서, 형광분석법 또는 형광 현미경검사법)에 의해 살아있는 세포에서 검출되고 정량화될 수 있다. 고효율 스크리닝 방법을 비롯한, 형광 폴리펩티드를 사용하여 살아있는 세포에서 실시되는 리포터 분석 스크린에 관한 상세한 설명은 예로서, 미국 특허 번호 제6,875,578호에서 살펴볼 수 있다.
전사 활성인자, 즉, 단량체로서, 다량체로서, 또는 다른 폴리펩티드와의 헤테로머 복합체로 전사 활성 인자가 결합하는 특이적인 표적 요소를 포함하는 프로모터를 전사활성화시키는 폴리펩티드인 다수의 IF가 본원에 기술되어 있다. 천연적으로 발생된 전사 활성 인자, 예로서, Klf4는 최소한, 하기와 같은 2개의 도메인: 유전자가 표적되어지도록 지시하는 DNA 결합 도메인 및 전사 기구와의 상호작용을 통해 전사 반응의 성질 및 정도를 지배하는 활성화 도메인으로 구성된 모듈 단백질이다. 2개의 도메인은 전형적으로 독립적인 양식으로 작동함으로써 하나의 전사 활성 인자의 DNA 결합 도메인, 예로서, DNA 결합 도메인 Sox2는 또다른 전사 활성 인자의 전산활성 도메인, 예로서, 헤르페스 VP16에 부착됨으로써 완전한 기능성을 보이는 "키메라" 전사 활성 인자, 예로서, 예로서, 문헌 [Kamachi et al, (1999), Mol Cell Biol., 19(1): 107-120]에 기재되어 있는 키메라 Sox2 전사 활성 인자를 생성할 수 있게 된다.
본원에서 제공하는 가이던스에 비추어 보면, 본원에 기술된 방법에서 작동가능한 매우 광범위한 IF 서열 변이체(예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 서열 변이체)는 과도한 노력 없이도 당업계의 숙련인에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
Oct3/4 폴리펩티드
본원에서 언급되는 바와 같이, "Oct3/4 폴리펩티드"는 인간 Oct3/4, 마우스 Oct3/4, 또는
(i) 인간 nanog 유전자 옥타머 요소:
5'-TTTTGCAT-3'에 결합하는 DNA 결합 도메인(DBD: DNA binding domain)을 포함하고;
(ii) 하나 이상의 nanog 옥타머 요소를 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예로서, 문헌 [Kuroda et al, (2005), Mol and Cell Biol., 25(6):2475-2485]을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, Oct3/4는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 호모사피엔스(Homo sapiens) POU 부류 5 호메오박스 1(POU5F1; 진뱅크 등록 번호. NP_002692)로도 알려져 있는, 인간 Oct3/4의 아미노산 서열에 상응하는 서열 번호 6과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 6과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Oct3/4는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 6과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아민 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 서열 번호 6을 포함하는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, Oct3/4는 상기 언급한 기능적 특성을 가지며, 총 30개 이하의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 6, 예로서, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25개, 또는 0 내지 30개 사이의 임의의 다른 갯수의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 6(인간 Oct3/4) :
Figure 112010002911839-pct00003
몇몇 실시태양에서, Oct3/4는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 고도로 보존되는 POU DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 Oct3/4의 아미노산 138-290에 상응하는 서열 번호 7과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 7과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Oct3/4는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 7과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 7을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 7(인간 Oct3/4의 POU/DNA 결합 도메인)
Figure 112010002911839-pct00004
본원에 기술된 바와 같이, Oct3/4 폴리펩티드는 인간 Oct3/4의 천연적으로 발생되거나, 비천연적으로 발생된 상동체를 포함할 수 있다. 인간 Oct3/4의 천연적으로 발생된 상동체의 예로는 진뱅크 등록 번호: NP_002692; NP_001 108427; NP_001093427; NP_001009178; 및 NP_038661하에 열거된 것, 또는 상기 언급한 구조 및 기능적 기준을 충족시키는 임의의 다른 Oct 패밀리 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
인간 Oct3/4의 비천연적으로 발생된 상동체의 예로는 예로서, 문헌 ([Niwa et al., (2002), Mol Cell Biol, 22(5): 1526-1536]; 및 [Lunde et al, (2004), Curr. Biol, 14(1):48-55])에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
250개의 서열을 포함하는 PSI-BLAST 다중 정렬에 기반한, 인간 Oct3/4 아미노산 서열(서열 번호 6)의 pMUT 분석을 통해 표 17에 제시한 아미노산 치환 행렬(ASM: amino acid substitution matrix)을 수득한다. 인간 Oct3/4 아미노산 서열 중 각 야생형 아미노산 위치에 대해서 표 17은 (20개의 가능한 아미노산 중) 어떤 아미노산 치환이 단백질의 기능에 대해 유해한지(굵은 밑줄체로 표시) 또는 중성적인지(평문으로 표시)를 예측한 것을 나타낸다. (상기 기술된) 동족의 nanog 유전자 옥타머 요소에 결합할 수 있고, 하나 이상의 nanog 표적 요소를 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 Oct3/4 폴리펩티드의 능력에 관한 기능적 분석은 예로서, 문헌 ([Kuroda et al., (상기 문헌 동일)]; 및 [Londe et al., (2006), Nat. genet., 39(4):431-440])에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
Sox2 폴리펩티드
본원에서 언급되는 바와 같이, "Sox2 폴리펩티드"는 인간 Sox2, 마우스 Sox2, 또는
(i) 인간 nanog 유전자 Sox 요소:
5'-TACAATG-3':에 결합하는 DNA 결합 도메인(DBD)을 포함하고;
(ii) 하나 이상의 nanog 유전자 프로모터 Sox 요소를 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예로서, 문헌 [Kuroda et al., (2005), Mol and Cell Biol, 25(6):2475-2485]을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, Sox2 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 인간 Sox2, 즉, 성 결정 부위 Y 박스 2 단백질(진뱅크 등록 번호. NP_003097)의 아미노산 서열에 상응하는 서열 번호 8과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 8과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Sox2 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 8과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입) 서열 번호 8을 포함하는 폴리펩티드이다.
다른 실시태양에서, Sox2 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 가지며, 총 30개 이하의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 8, 예로서, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25개, 또는 0 내지 30개 사이의 임의의 다른 갯수의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 8 (인간 Sox2):
Figure 112010002911839-pct00005
몇몇 실시태양에서, Sox2 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 고도로 보존되는, 고유동성 군-Sox-TCF(HMG-Sox-TCF: High Mobility Group-Sox-TCF) 모티프 DNA 결합 도메인(DBD)을 포함하는 인간 Sox2의 아미노산 40-115인 서열 번호 9와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 9와 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Sox2 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 9와 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 9를 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 9(HMG-Sox2-TCF DBD)
Figure 112010002911839-pct00006
본원에 기술된 바와 같이, Sox2 폴리펩티드는 인간 Sox2의 천연적으로 발생되거나, 비천연적으로 발생된 상동체를 포함할 수 있다. 인간 Sox2의 천연적으로 발생된 상동체의 예로는 진뱅크 등록 번호: NP_001098933; NP_035573, ACA58281; BAA09168; NP_001032751; 및 NP_648694하에 열거된 것, 또는 상기 언급한 구조 및 기능적 기준을 충족시키는 임의의 다른 Sox 패밀리 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
인간 Sox2의 비천연적으로 발생된 상동체의 예로는 예로서, 문헌 [Kamachi et al, (1999), Mol Cell Biol., 19(1): 107-120]에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
250개의 서열을 포함하는 PSI-BLAST 다중 정렬에 기반한, 인간 Sox2 아미노산 서열(서열 번호 8)의 pMUT 분석을 통해 ASM(표 18)을 수득하였는데, 이는 단백질의 기능에 대해 유해하거나 중성적인 것으로 예측되는 아미노산 치환을 제시한다. nanog 유전자 Sox 요소에 결합할 수 있고, 하나 이상의 nanog Sox 요소를 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 Sox2 폴리펩티드의 능력에 관한 기능적 분석은 예로서, 문헌 [Kuroda et al., (상기 문헌 동일)]에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
Klf4 폴리펩티드
본원에서 언급되는 바와 같이, "Klf4 폴리펩티드"는 인간 Klf4, 마우스 Klf4, 또는
(i) Klf 표적 요소, 예로서, 5'-GAGGTCC-S' 또는 5'-GGGGTGT-3'에 결합하는 아연 핑거 DNA 결합 도메인(DBD)을 포함하고;
(ii) 상기 언급한 표적 요소 중 하나 이상을 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예로서, 문헌 [Nakatake et al., (2006), Mol Cell Biol., 24(20):7772-7782]을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, Klf4 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 인간 Klf4, 즉, 크루펠 유사 인자 4(Kruppel-Like Factor 4)(진뱅크 등록 번호. NP_004226)의 아미노산 서열에 상응하는 서열 번호 10과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 10과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Klf4 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 10과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 10을 포함하는 폴리펩티드이다.
다른 실시태양에서, Klf 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 가지며, 총 30개 이하의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 10, 예로서, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25개, 또는 0 내지 30개 사이의 임의의 다른 갯수의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 10(인간 Klf4):
Figure 112010002911839-pct00007
몇몇 실시태양에서, Klf4 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 고도로 보존되는 아연 핑거 모티프 DNA 결합 도메인(ZF-DBD)을 포함하는 인간 Klf4의 아미노산 382-469에 상응하는 서열 번호 11과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 11과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, Klf4 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 11과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 11을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 11(인간 Klf4-ZF-DBD)
Figure 112010002911839-pct00008
본원에 기술된 바와 같이, Klf4 폴리펩티드는 인간 Klf4의 천연적으로 발생되거나, 비천연적으로 발생된 상동체를 포함할 수 있다. 인간 Klf4의 천연적으로 발생된 상동체의 예로는 진뱅크 등록 번호: NP_001017280, NP_057354(Klf2); AAP36222(Klf5); NP_034767; 및 NP_446165하에 열거된 것, 또는 상기 언급한 구조 및 기능적 기준을 충족시키는 임의의 다른 Klf 패밀리 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인간 Klf4의 비천연적으로 발생된 상동체의 예로는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11과 적어도 70%, 예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 70% 내지 100% 사이의 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시태양에서, Klf4 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖는 비천연적으로 발생된 폴리펩티드이다.
136개의 서열을 포함하는 PSI-BLAST 다중 정렬에 기반한, 인간 Klf4 아미노산 서열(서열 번호 10)의 (상기 기술된) pMUT 분석을 통해 ASM(표 19)을 수득하였는데, 이는 단백질의 기능에 대해 유해하거나 중성적인 것으로 예측되는 아미노산 치환을 제시한다. 상기 언급한 표적 요소 중 어느 것에 결합할 수 있고, 표적 요소 중 하나 이상을 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 Klf4 폴리펩티드의 능력에 관한 기능적 분석은 예로서, 문헌 [Nakatake el al., (상기 문헌 동일)]에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
c-Myc 폴리펩티드
본원에서 언급되는 바와 같이, "c-Myc 폴리펩티드"는 인간 c-Myc, 마우스 c-Myc, 또는
(i) 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 류신 지퍼 도메인을 포함하고, 서열: 5'-CACGTG-3'; 또는 5'-C/GACCACGTGGTG/C-3'을 포함하는 표적 요소에 결합하고;
(ii) 상기 언급한 표적 요소 중 하나 이상을 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예로서, 문헌 [Cowling et al., (2006), Seminars in Cane. Biol., 16:242-252]을 참조한다.
몇몇 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 인간 c-Myc, 즉, 골수구종증 바이러스 온코진 상동체(진뱅크 등록 번호 NP_002458)의 아미노산 서열에 상응하는 서열 번호 12와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 12와 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 12와 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 12를 포함하는 폴리펩티드이다.
다른 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 가지며, 총 30개 이하의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 12, 예로서, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25개, 또는 0 내지 30개 사이의 임의의 다른 갯수의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 12(인간 c-Myc) :
Figure 112010002911839-pct00009
몇몇 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 고도로 보존되는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH: basic helix-loop-helix) 류신 지퍼(LZ: leucine zipper) DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 c-Myc의 아미노산 370-454인 서열 번호 13과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열, 예로서, 서열 번호 13과 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 적어도 70% 내지 100% 사이의 임의의 다른 동일성(%)으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, c-Myc 폴리펩티드는 상기 언급한 기능적 특성을 갖고, 서열 번호 13과 적어도 70% 내지 100% 미만으로 동일한(예로서, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% 동일한) 아미노산 서열, 예로서, 적어도 하나의 아미노 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입(예로서, 1 내지 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 갖는 서열 번호 13을 포함하는 폴리펩티드이다.
서열 번호 13(인간 c-Myc bHLH-LZ 도메인)
Figure 112010002911839-pct00010
본원에 기술된 바와 같이, c-Myc 폴리펩티드는 인간 c-Myc의 천연적으로 발생되거나, 비천연적으로 발생된 상동체를 포함할 수 있다. 인간 c-Myc의 천연적으로 발생된 상동체의 예로는 진뱅크 등록 번호: NP_001005154, NP_036735, NP_034979, P0C0N9 및 NP_001026123하에 열거된 것, 또는 상기 언급한 구조 및 기능적 기준을 충족시키는 임의의 다른 c-Myc 패밀리 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인간 c-Myc의 비천연적으로 발생된 상동체의 예로는 예로서, 문헌 [Chang et al., (2000), Mol Cell Biol., 20:4309-4319]에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
250개의 서열을 포함하는 PSI-BLAST 다중 정렬에 기반한, 인간 c-Myc 아미노산 서열(서열 번호 12)의 (상기 기술된) pMUT 분석을 통해 ASM(표 20)을 수득하였는데, 이는 단백질의 기능에 대해 유해하거나 중성적인 것으로 예측되는 아미노산 치환을 제시한다. 상기 언급한 표적 요소 중 어느 것에 결합할 수 있고, 표적 요소 중 하나 이상을 포함하는 프로모터를 전사활성화시킬 수 있는 c-Myc 폴리펩티드의 능력에 관한 기능적 분석은 예로서, 문헌 [Gu et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2935-2939]에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
몇몇 경우에서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 폴리펩티드 DNA 결합 도메인 중 임의의 것은 헤르페스 VP 16 전사활성 도메인에 융합됨으로써 본원에 기술된 유도 방법에서 유도 인자로서 사용될 수 있는 키메라 융합 단백질을 생성하게 된다. 하나의 실시태양에서, 헤르페스 VP 16 전사활성 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112010002911839-pct00011
몇몇 실시태양에서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc 폴리펩티드 중 임의의 것, 또는 그 조합은 본원에 기술된 유도 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드 형질도입 조성물로서 제공한다. 상기 조성물은 하기 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 아미노 또는 카르복시 말단에 단백질 도입 도메인을 포함하는 정제된 3/4Oct3/4 폴리펩티드;
(ii) 캐리어 시약 및 정제된 3/4Oct3/4 폴리펩티드;
(iii) 단백질 도입 도메인을 포함하는 정제된 Sox2 폴리펩티드 및 Sox2 폴리펩티드의 아미노산 서열;
(iv) 캐리어 시약 및 정제된 Sox2 폴리펩티드;
(v) 단백질 도입 도메인을 포함하는 정제된 Klf4 폴리펩티드;
(vi) 캐리어 시약 및 정제된 Klf4 폴리펩티드;
(vii) 단백질 도입 도메인을 포함하는 정제된 c-Myc 폴리펩티드;
(viii) 캐리어 시약 및 정제된 c-Myc-폴리펩티드
(ix) (i) 내지 (vi)의 임의의 조합(여기서, 조성물에는 c-Myc 폴리펩티드의 아미노산을 포함하는 정제된 폴리펩티드가 실질적으로 존재하지 않는다).
몇몇 실시태양에서, 단백질 도입 도메인은 IF 서열의 아미노 말단에 융합되어 있다. 다른 실시태양에서, PTD 도메인은 IF 서열의 카르복시 말단에 융합되어 있다. 몇몇 실시태양에서, IF-PTD 융합 폴리펩티드는 변성된 폴리펩티드로서 세포에 첨가되는데, 상기 변성된 폴리펩티드는 그 자신이 세포로 수송되는 것을 촉진시킬 수 있으며, 이후 상기 세포에서 복원된다. PTD 융합 단백질 생성 및 그의 사용 방법은 당업계에 수립되어 있으며, 예로서, 미국 특허 번호 제5,674,980호, 제5,652,122호 및 제6,881,825호에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Becker-Hapak et ai, (2003), Curr Protocols in Cell Biol, John Wiley & Son, Inc]를 참조한다. 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열로는 하기: YGRKKRRQRRR(서열 번호 1); RKKRRQRR(서열 번호 2); YARAAARQARA(서열 번호 3); THRLPRRRRRR(서열 번호 4); 및 GGRRARRRRRR(서열 번호 5) 중 임의의 것을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
적합한 캐리어 시약의 예 및 그의 사용 방법은 미국 특허 번호 제6,841,535호에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
G. 유도된 세포 콜로니 서브클로닝
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 세포 콜로니를 서브클로닝함으로써 순수한 인간 줄기 세포 군집을 수득할 수 있는데, 상기 세포 군집은 정제 이전의 전체 세포 군집에서 발견되는 것보다, 전체 세포 군집에 비하여 더 높은 비율로 생성된 인간 줄기 세포를 함유한다. 몇몇 경우에서, 본원에 기술된 바와 같이, 유도된 세포를 배양하고, 형태상의 특징에 기초하여 "유도된 세포"를 포함하는 클론을 확인하고 선별하기 이전에 약 14일 내지 약 40일, 예로서, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 23일, 24일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일 동안, 또는 약 14일 내지 약 40일 사이의 다른 기간 동안 관찰한다. 유도된 세포를 유지 배양 배지 중 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양할 수 있으며, 배지를 약 매일 내지 2일마다, 바람직하게, 매일 교체한다. 유지 배양 배지의 예로는 임의의 모든 완전 ES 배지(예로서, MC-ES)를 포함한다. 유지 배양 배지는 b-FGF 또는 FGF2로 보충될 수 있다. 몇몇 경우에서, 유지 배양 배지는 다른 인자, 예로서, IGF-EI 또는 액티빈 A로 보충된다.
세포 배양물을 생리학적 완충액, 예로서, 행크 평형 염 용액으로 세척한 후, 바닥에 실리콘 그리스로 코팅된 클로닝 링으로 관심의 대상이 되는 형태상의 특징을 나타내는 콜로니를 포위한다. 이어서, 약 100 ㎕(또는 50 ㎕ 내지 150 ㎕)의 "영장류 ES 세포용 분리 배지"(일본 도쿄 소재의 ReproCELL 제조)를 클로닝 링에 첨가하고, 약 20분 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 세포 현탁액을 형성한다. 분리된 콜로니를 함유하는 링 중의 세포 현탁액을 약 2 ml의 MC-ES 배지(또는 본원에 기술된 다른 배지)에 첨가하고, MEF 코팅된 24웰 플레이트의 하나의 웰에, 또는 표면적이 동일한 다른 세포 배양 용기에 플레이팅한다. 5% CO2(대기 O2) 세포 배양 인큐베이터에서 약 14시간 동안 37℃하에 콜로니 유래 세포를 배양한 후, 배지를 교체한다. 이어서, 약 8일 후 2차 계대배양을 수행할 때까지 약 매 2일마다 배지를 교체한다.
몇몇 실시태양에서, 초대 계대배양물에서, 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 이어서, 영장류 ES 세포용 분리 배지(일본 도쿄 소재의 ReproCell)를 세포에 첨가하고, 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후에 MC-ES 배지(2 ml)를 생성된 세포 현탁액에 첨가하여 분리 배지의 활성을 정지시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겨 200 x g로 4℃에서 5분 동안 원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 MC-ES 배지에 재현탁시키고, 재현탁된 세포를 MEF 코팅된 24웰 플레이트 중 4개의 웰에 플레이팅하고, 2차 계대배양물을 제조할 때까지 약 7일 동안 배양한다.
상기 기술된 방법에 의해 제조된 2차 계대배양물에서, 세포를 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔™로 코팅된 60 mm 세포 배양 접시에 플레이팅한다. 약 8일 경과 후(대략적으로는 IF의 강제 발현을 개시한 후 5주째에) 3차 계대배양물을 제조하고, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 계대배양물에서 세포를 2개의 마트리겔™로 코팅된 60 mm 세포 배양 접시(이중 하나는 이후 유전자 발현 분석을 위해 사용되는 것이며, 나머지 하나는 하기 기술되는 바와 같이 계속하여 계대하는데 사용된다)에 플레이팅한다. 본원에 기술된 바와 같이, 계대배양물 중 하나를 유전자 발현 분석을 위해 사용하고, 나머지 하나는 유도된 세포 클론으로부터 유래된 세포주를 유지시키는 것이 필요한 바, 계대한다.
H. 유도된 세포의 계대 및 유지
서브클로닝한 후, 유도된 세포를 약 매 5 내지 7일마다 계대배양할 수 있다. 몇몇 경우에서, 세포를 행크 평형 염 용액로 세척하고, 디스파제 또는 영장류 ES 세포용 분리 배지를 첨가하고, 5 내지 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 대략적으로 절반 이상의 콜로니가 분리되었을 때, MC-ES 배지를 첨가하여 분리 배지의 효소 활성을 정지시키고, 생성된 세포/콜로니 현탁액을 원심분리 튜브로 옮긴다. 현탁액 중의 콜로니가 상기 튜브 바닥에 침전시키고, 주의하여 상청액을 제거한 후, MC-ES 배지를 첨가하여 콜로니를 재현탁시킨다. 콜로니의 크기를 검사한 후, 크기가 극도로 큰 임의의 콜로니가 있다면 천천히 상하로 피펫팅하여 좀더 작은 크기로 분할시킨다. 적당한 크기가 된 콜로니를 계대배양 이전의 기저 면적의 약 3 내지 6배되는 기저 면적을 갖는, 마트리겔로 코팅된 플라스틱 배양 접시에 플레이팅한다. 예를 들면, 세포를 약 1:6 내지 약 1:3, 예로서, 약 1:6, 1:5, 1:4, 또는 1:3으로 분할할 수 있다.
본 발명의 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 유도된 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는데 유용한 배양 배지의 예로는 ES 배지 및 인간 ES 세포를 배양하는데 적합한 배양 배지, 에로서, MEF 조절된 ES 배지(MC-ES) 또는 본원에 기술된 다른 배지, 예로서, mTeSR1™를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 일례로, 세포는 본원에 기술된 바와 같이, ROCK 저해제의 존재하에 유지된다.
IV. 유도된 세포 분석
초기에 형태상의 특징에 기초하여 확인된 것으로부터의 세포 콜로니 계대배양물을, ALP 활성의 발현, ES 세포 마커 유전자의 발현, 단백질 마커의 발현, 모체세포와 비교하여 Oct3/4 및 Nanog 프로모터의 저메틸화, 장기간 자가 재생능, 정상적인 이배체 핵형 및 외배엽, 중배엽 및 내배엽 조직을 포함하는 테라토마를 형성할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다능성 줄기 세포와 관련된 다수의 특성들 중 하나에 대하여 분석할 수 있다.
세포(예로서, 고정 세포 또는 살아있는 세포)에서 ALP 활성을 검출하기 위한 다수의 분석법 및 시약이 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 실시태양에서, 분석하고자 하는 콜로니를 5분, 예로서, 2 내지 5분 동안 실온에서 10% 포르말린 중성 완충 용액으로 고정시키고, PBS로 세척한다. 이어서, ALP의 발색성 기질인 1 단계 BCEP (5-브로모-4-클로로-3'-인돌리포스페이트 p-톨루이딘 염) 및 NBT(니트로-블루 염화테트라졸륨)(일리노이주 록퍼드 소재의 피어스(Pierce) 제조)를 첨가하고, 20 내지 30분 동안 실온에서 반응시킨다. ALP 활성을 갖는 세포는 청색 내지 보라색으로 염색된다.
이어서, ALP 활성에 대하여 테스트된 추정 iPS 세포 콜로니를, Nanog, TDGF1, Dnmt3b, Zfp42, FoxD3, GDF3, CYP26A1, TERT, Oct3/4, Sox2, Sal14 및 HPRT를 포함하나, 이에 한정되지 않는 일련의 인간 배아 줄기 세포 마커(ESCM: embryonic stem cell marker) 발현에 대하여 분석할 수 있다. 예로서, 문헌 [Assou et al, (2007), Stem Cells, 25:961-973]을 참조한다. 다수의 유전자 발현 분석 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예로서, 문헌 [Lorkowski et al., (2003), Analysing gene Expression, A Handbook of Methods: Possibilities and Pitfalls, Wiley-VCH]를 참조한다. 적합한 핵산 기반 유전자 발현 분석법의 예로는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), 마이크로어레이 하이브리드화, 도트 블롯팅, RNA 블롯팅, RN아제 보호 및 SAGE를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 추정 iPS 세포 콜로니에서 ESCM 유전자의 mRNA 발현 수준의 수준은 qRT-PCR에 의해 측정된다. 추정 iPS 세포 콜로니를 수거하고, "포름알데히드- 또는 파라포름알데히드 고정되고, 파라핀에 포매된(FFPE: formaldehyde- or paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded) 조직" (텍사스수 오스틴 소재의 Ambion)용의 리커버올 전체 핵산 단리용 키트"를 사용하여 전체 RNA를 추출한다. 몇몇 일례로, RNA 추출에 사용되는 콜로니는 고정된 콜로니, 예로서, ALP 활성에 대하여 테스트된 바 있는 콜로니이다. 콜로니는 RNA 추출에 직접, 즉, 사전에 고정시키지 않고 이용할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 택맨® 프리앰프 마스터믹스(TaqMan® PreAmp mastermix)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystem 제조)을 사용하여 표적 유전자를 증폭시킨다. 실시간 정량적 PCR은 상기 언급한 ESCM 유전자의 mRNA 검출을 위한 하기 PCR 프라이머 세트를 사용함으로써 ABI 프리즘(Prism) 7900HT를 사용하여 실시한다: Nanog, Hs02387400_g1, Dnmt3b, Hs00171876_m1, FoxD3, Hs00255287_s1, Zfp42, Hs01938187_s1, TDGF1, Hs02339499_g1, TERT, Hs00162669_m1, GDF3, Hs00220998_m1, CYP26A1, Hs00175627_m1, GAPDH, Hs99999905_m1.
추정 iPS 세포 콜로니는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD9, CD24, Thy-1 및 Nanog를 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질 마커의 발현을 위한 면역 세포 화학 방법으로 분석할 수 있다. 광범위한 면역 세포 화학 분석법, 예로서, 형광성 면역 세포 화학 분석법이 공지되어 있으며, 이는 예로서, 문헌 [Harlow et al., (1988), Antibodies: A Laboratory Manual 353-355, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있고, 또한, [The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (2004), Molecular Probe, Inc., Eu유전자, OR]을 참조한다.
예시적인 실시태양에서, 추정 iPS 세포 콜로니에서 상기 언급한 단백질 중 하나 이상의 발현을 하기와 같이 분석한다. 배양된 세포를 10분 동안 10% 포름알데히드로 고정시키고, 약 1시간 동안 실온에서 0.1% 젤라틴/PBS로 차단시킨다. 세포를 SSEA-3(MC-631; Chemicon), SSEA-4(MC813-70; Chemicon), TRA-1-60 (ab16288; abeam), TRA-1-81(ab16289; abeam), CD9(M-L13; R&D systems), CD24 (ALB9; abeam), Thy1(5E10; BD Bioscience), 또는 Nanog(MAB 1997; R&D Systems)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. Nanog 염색을 위해서는 차단에 앞서 0.1% 트리톤 X-100/PBS를 사용하여 세포를 투과시킨다. 세포 콜로니를 PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, AlexaFluor 488에 접합된 2차 항체(Molecular Probes) 및 훽스트(Hoechst) 33258(Nacalai)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 추가로 세척한 후에 형광성은 형광 현미경, 예로서, 악시오버트(Axiovert) 200M 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 검출한다.
A. 메틸화 분석
몇몇 실시태양에서, 유도된 세포의 특징은 그의 모체 세포의 것에 비해 Oct3/4 및 Nanog의 게놈 프로모터의 메틸화가 감소되었다는 점이다. 분석하고자 하는 적합한 Oct3/4 프로모터 부위로는 보존 부위 1(CR1: conserved region 1)을 포함하는 Oct3/4 근접 프로모터 및 CR4를 포함하는 Oct3/4 프로모터 및 Oct3/4 프로모터 원위 인핸서를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 분석하고자 하는 적합한 Nanog 프로모터 부위로는 Oct3/4 및 Sox2 결합 부위를 포함하는 Nanog 근접 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 문헌 ([Rodda et al, (2005), J Biol. Chem., 280:24731-24737] 및 [Yang et al., (2005), J Cell Biochem., 96:821-830])를 참조한다. 게놈 DNA의 정량적 분석 방법 다수가 예로서, 문헌 [Brena et al., (2006), J Mol. Med., 84(5):365-377]에 기재되어 있는 바와 같이 공지되어 있다. 예시적인 실시태양에서, 추정 유도된 세포 및 비교에 사용되는 세포로부터 단리되는 게놈 DNA를 단리하고, 비설파이트로 처리한다. 이어서, 비설파이트로 처리된 게놈 DNA를 T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭시킨다. 이후, T7 폴리머라제를 사용하여 RNA 전사체를 생성하고, 이를 RN아제 A로 처리하여 메틸화 특이 절단 산물을 생성한다. 절단 산물의 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 개개 CpG 부위의 메틸화를 평가한다. 상기 방법에 관한 상세한 설명은 예로서, 문헌 [Ehich et al, (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 15785-15790]에서 제공한다.
B. 자가 재생 분석
줄기 세포의 특징들 중 하나는 노화되지 않고 연속하여 증식할 수 있는 그의 능력이다. 따라서, 유도된 세포는 시험관내에서 연속하여 계대할 수 있는 그의 능력에 관하여 평가된다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 시험관내에서 적어도 약 30 내지 적어도 약 100회, 예로서, 약 33, 35, 40, 45, 51, 56, 60, 68, 75, 80, 90, 93, 100회, 또는 적어도 약 30 내지 적어도 약 100회 계대 사이의 임의의 다른 계대수로 계대될 수 있는 그의 능력에 관하여 평가된다.
또다른 평가로, 유도된 세포는 모체 세포에서의 IF 강제 발현 개시로부터 약 30일 내지 약 500일간의 기간 동안, 예로서, 모체 세포에서의 IF 강제 발현 개시로부터 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 100일, 150일, 180일, 200일, 250일, 300일, 400일, 450일, 또는 약 30일 내지 약 500일 사이의 임의의 다른 기간 동안 증식할 수 있는 그의 능력에 관하여 평가된다. 몇몇 실시태양에서, 유도된 세포의 장기간 자가 재생능은, 세포를 예로서, 본원에 기술된 mTeSR1 배지와 같이 한정 배지(예로서, mTeSR1 배지) 중 영양 세포의 부재하에서 계대하였을 때, 측정한다. 다른 실시태양에서, 세포를 본원에 기술된 MC-ES 배지 중에 계대한다.
C. 핵형 분석
가능성이 있는 또다른 분석법으로서는 유도된 세포를 시험관내에서 적어도 1년 동안 계대한 후, 2배성 및 정상의 안정적인 핵형, 예로서, 안정적인 핵형에 대해 유도된 세포를 평가하는 것이 있다. 다수의 핵형 분석 방법이 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 핵형 분석 방법은 예로서, 문헌 [Bayani et al., (2004), Curr. Protoc, Cell Biol., Chapter 22:Unit 22.5]에 기재되어 있는 다색 FISH이다. 다른 실시태양에서, 핵형 분석법은 예로서, 문헌 [Vermeesch et al., (2007), Eur. J. Hum. genet., 15(11): 1105-1114]에 기재되어 있는 분자 핵형 분석법을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 유도된 세포를 약 2 내지 약 3시간 동안 0.02 ㎍/ml 콜세미드로 전처리하고, 약 20분 동안 약 0.06 내지 약 0.075 M KCl과 함께 인큐베이션시키고, 카노이(Carnoy) 고정액으로 고정시킨다. 이후, 다색 FISH 분석을 위해 세포를 예로서, 캄비오 리미티드(Cambio, Ltd)(영국 캠브리지 소재)로부터 입수한 스타*피쉬(Star*FISHⓒ) 인간 다색 FISH(M-FISH) 키트에 있는 것과 같은 다색 FISH 프로브와 하이브리드화시킨다.
D. 테라토마 분석
다능성 줄기 세포는 면역손상된 동물 내로 주사되었을 때에 외배엽, 중배엽 및 내배엽 조직을 포함하는 테라토마를 형성할 수 있는 능력을 갖고 있는 것으로 여겨진다. 유도된 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS: induced pluripotent stem cell) 또는 ES 세포 유사 다능성 줄기 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능 및 3배엽층층으로 분화될 수 있는 다능성을 갖는 세포를 지칭할 수 있는데, 상기 다능성 줄기 세포는 예로서, 마우스와 같은 테스트 동물 내로 이식되었을 경우에 테라토마를 형성할 수 있다.
유도된 세포는 면역손상된 동물 모델에서 테라토마 형성 분석법으로 다능성에 대하여 평가될 수 있다. 면역손상된 동물은 면역저해제, 예로서, 사이클로스포린 또는 FK-506을 투여받은 설치류일 수 있다. 예를 들면, 면역손상된 동물 모델은 SCID 마우스일 수 있다. 약 0.5 x 106 내지 약 2.0 x 106, 예로서, 0.6 x 106, 0.8 x 106, 1.O x 106, 1.2 x 106, 1.5 x 106, 1.7 x 106개의 유도된 세포/마우스, 또는 약 0.5 x 106 내지 약 2.0 x 106개 사이의 임의 갯수의 유도된 세포/마우스를 7 내지 8주령된 면역손상된 동물의 정소 수질에 주사할 수 있다. 약 6 내지 약 8주 경과시, PBS에 이어 10% 완충처리된 포르말린을 동물에 관류시킨 후에 테라토마를 잘라낸다. 이어서, 잘라낸 테라토마를 면역조직학적으로 분석한다. 인간 테라토마 조직을 숙주(예로서, 설치류) 조직으로부터 식별하는 한가지 방법으로는 인간 특이 핵 마커인 HuNu로 면역염색시키는 것을 포함한다. 면역조직학적 분석법은 외배엽(예로서, 신경외배엽), 중배엽 및 내배엽 조직의 존재를 측정하는 것을 포함한다. 외배엽 조직에 대한 단백질 마커로는 네스틴, GFAP 및 인테그린 β1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 중배엽 조직에 대한 단백질 마커로는 콜라겐 II, 브라카이우리(Brachyury) 및 오스테오칼신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 내배엽 조직에 대한 단백질 마커로는 α-태아 단백질(α-FP) 및 HNF3베타를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
E. 유전자 발현
몇몇 실시태양에서, 추정 iPS 세포 콜로니에서 유전자 발현 분석을 실시한다. 그러한 유전자 발현 분석은 추정 iPS 세포 콜로니로부터 얻은 유전자 발현 프로파일을, (i) 모체 세포, 즉, 추정 iPS 세포 콜로니를 유도시킨 것인 하나 이상의 세포; (ii) 인간 ES 세포주; 또는 (iii) 수립된 iPS 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 세포 유형으로부터 얻은 유전자 발현 프로파일과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 ES 세포주에 대한 유전자 발현 데이타는 월드 와이드 웹 상의 NCBI "유전자 발현 옴니버스(유전자 Expression Omnibus)" 데이타베이스와 같은 공개원을 통해 이용할 수 있다. 예로서, 문헌 [Barrett et al, (2007), Nuc. Acids Research, D760-D765]을 참조한다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 추정 iPS 콜로니로부터 얻은 유전자 발현 프로파일을, ES 세포주부터 얻은 유전자 발현 프로파일과 비교하는 것은 추정 iPS 세포 콜로니로부터 실험을 통해 얻은 데이타를 공개 데이타베이스를 통해 이용할 수 있는 유전자 발현 데이타와 비교하는 것을 의미한다. 그의 유전자 발현 데이타는 공개적으로 이용가능한 것인 인간 ES 세포주의 예로는 hE14(GEO 데이타 세트 등록 번호 GSM151739 및 GSM151741), Sheff4(GEO 등록 번호 GSM 194307, GSM 194308 및 GSM 193409), h_ES 01(GEO 등록 번호 GSM 194390), h_ES H9(GEO 등록 번호 GSM194392) 및 h_ES BG03(GEO 등록 번호 GSM194391)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 하나 이상의 iPS 세포주로부터 단리된 전체 RNA를 핵산 마이크로어레이 하이브리드화 분석법에 의해 분석함으로써 유전자 발현을 달성할 수 있다. 전체 유전자 발현 분석을 위해 적합한 마이크로어레이 플랫폼의 예로는 인간 게놈 U133 플러스 2.0 마이크로어레이(Human Genome Ul 33 plus 2.0 microarray)(Affymetrix) 및 완전 인간 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole Human Genome Oligo Micoarray)(Agilent)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유전자 발현 프로파일의 비교를 위한 다수의 분석 방법이 공지되어 있으며, 예로서, 문헌 ([Suarez-Farinas et al, (2007), Methods Mol. Biol., 377:139-152], [Hardin et al, (2007), BMC Bioinformatics, 8:220-232], [Troyanskaya et al, (2002), Bioinformatic, 18(11): 1454-1461] 및 [Knudsen (2002), A Biologist's Guide to Analysis of DNA Microarray Data, John Wiley & Sons])에 기재되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 세포로부터 얻은 유전자 발현 데이타를 인간 ES 세포주, 모체 세포 및 다분화성 줄기 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 세포 유형으로부터 수득한 유전자 발현 데이타와 비교한다. 적합한 통계학적 분석 행렬 및 방법으로는 피어슨 상관관계(Pearson Correlation), 유클리디안 거리(Euclidean Distance), 계층적 군집화(Hierarchical Clustering)(예로서, 문헌 [Eisen et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(25): 14863-14868] 참조) 및 자기 조직화 지도(Self Organizing Maps)(예로서, 문헌 [Tamayo et al, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(6):2907-2912]) 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
V. 유도된 세포에 관한 설명
유도된 세포는 장기간 자가 재생능, 정상적인 이배체 핵형, 형태상의 특징 및 외배엽, 중배엽 및 내배엽 조직을 포함하는 테라토마를 형성할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다능성 또는 다분화성 줄기 세포와 관련된 특정의 특성들을 공유할 수 있다.
유도된 세포는 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성에 대해 양성일 수 있다. 유도된 세포는 ALP를 발현할 수 있고, 하기 ES 세포 마커 유전자: TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, zfp42, Sox2, Oct3/4 및 Nanog 중 2 내지 10개(예로서, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)를 발현할 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 Tert 또는 Cyp26a1을 발현한다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 Tert 및 Cyp26a1, 둘 모두를 발현한다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 ALP 활성에 대해 양성이고, 하기 ES 세포 마커 유전자들 모두를 발현한다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 ALP 활성에 대해 양성이고, Nanog를 발현한다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 ALP 활성에 대해 양성이고, TERT, CYP26A1, 또는 GDF3 중 하나 이상을 발현한다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 ALP 활성에 대해 양성이고, Nanog, TDGF 및 Dnmt3b 중 하나 이상을 발현한다.
유도된 세포는 하기 마커 단백질: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD9, CD24, 또는 Thy-1 중 2가지 이상을 발현할 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 상기 마커 단백질 모두를 발현한다. 예시적인 실시태양에서, 인간 다능성 줄기 세포는 세포 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD9, CD24 및 CD90 및 ES 세포 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, TDGF1, Dnmt3b, GABRB3, GDF3, Zfp42, ALP, CD9 및 Thy-1을 발현한다.
유도된 세포는 하나 이상의 배아 줄기 세포, 예로서, 인간 배아 줄기 세포에서의 하나 이상의 유전자(예로서, 내인성 유전자)의 발현 수준과 비교하여, 예를 들면, 더 높거나 낮은 발현 수준과 같은 발현 수준 상의 차이를 나타낼 수 있다. 바람직하게, 유전자 발현 상의 차이는 하나 이상의 통계적 검정(예로서, 스튜던트의 T 검정(Student's t-test) 또는 다른 모수적 검정 또는 비모수적 검정)에 의해 통계학적으로 유의적이다. 예를 들면, 발현 상의 차이는 0.05 이하, 0.01 이하, 또는 0.001 이하의 p 값을 가질 수 있다.
유도된 세포 및 배아 줄기 세포에서 상이한 발현 수준을 보이는 유전자의 갯수는 예로서, 1 내지 1000개의 유전자, 1 내지 700개의 유전자, 1 내지 500개의 유전자, 1 내지 300개의 유전자, 1 내지 200개의 유전자, 1 내지 100개의 유전자, 1 내지 50개의 유전자, 3 내지 20개의 유전자, 5 내지 20개의 유전자, 5 내지 50개의 유전자, 10 내지 50개의 유전자, 20 내지 50개의 유전자, 30 내지 100개의 유전자, 또는 50 내지 100개의 유전자, 1개 이상의 유전자, 2개 이상의 유전자, 3개 이상의 유전자, 5개 이상의 유전자, 10개 이상의 유전자, 15개 이상의 유전자, 20개 이상의 유전자, 50개 이상의 유전자, 70개 이상의 유전자, 또는 100개 이상의 유전자, 500개 이상의 유전자, 1000개 이상의 유전자, 9개의 유전자, 12개의 유전자, 42개의 유전자, 70개의 유전자, 또는 100개의 유전자일 수 있다. 유전자 발현 수준 상의 차이는 적어도 2배, 예로서, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 10배, 2 내지 50배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 10배, 또는 2 내지 5배일 수 있다.
몇몇 경우에서, 유도된 세포 및 배아 줄기 세포에서 상이한 발현 수준을 보이는 유전자는 인간 배아 줄기 세포에서보다 유도된 세포에서 더 높은 수준의 발현을 나타낸다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포에서 더 높은 발현 수준으로 발현하는 유전자는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상의, 표 13, 15, 또는 16에 열거된 유전자이다. 몇몇 경우에서, 배아 줄기 세포와 비교하여 유도된 세포에서와 상이한 발현 수준을 보이는 유전자는 유도된 세포와 비교하여 인간 배아 줄기 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 몇몇 경우에서, 인간 배아 줄기 세포에서 더 높은 수준으로 발현된 유전자는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상의, 표 14에 열거된 유전자이다.
특정 경우에서, 유전자 또는 유전자 세트는 배아 줄기 세포와 비교하였을 때 및 모체 세포, 예로서, 섬유아세포와 비교할 경우 유도된 세포에서 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 예를 들면, 배아 줄기 세포및 모체 세포, 둘 모두에서보다 유도된 세포에서 더 높은 발현 수준을 나타내는 유전자는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상의, 표 15에 열거된 유전자이다.
유전자 또는 유전자 세트는 배아 줄기 세포에서의 그의 발현 수준보다는 모체 세포(예로서, 섬유아세포)세포에서의 발현 수준에 더 가까운 수준으로 유도된 세포에서 발현될 수 있다. 유전자 또는 유전자 세트는 예를 들면, 모체 세포, 예로서, 섬유아세포를 제외한 배아 줄기 세포에서 비교하였을 때 유도된 세포에서 더 높은 발현 수준을 나타낼 수 있다. 배아 세포에서보다 유도된 세포에서 더 높은 발현 수준을 나타태는 유전자는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 200개 이상의, 표 16에 열거된 유전자이다.
유도된 세포 내의 텔로미어의 길이는 배아 줄기 세포 내의 염색체 말단에서의 텔로미어의 길이보다 짧을 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포에서 텔로미어는 배아 줄기 세포주 내의 텔로미어보다 적어도 0.1 kB, 적어도 0.25 kB, 적어도 0.5 kB, 적어도 1 kB, 적어도 2 kB, 적어도 3 kB, 적어도 4 kB, 또는 적어도 5 kB 더 짧다. 특정 일례로, 유도된 세포는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 또는 적어도 15개의 배아 줄기 세포주보다 짧은 텔로미어를 갖는다.
유도된 세포는 IF를 코딩하는 외인성 유전자(또는 트랜스유전자)를 포함할 수 있다. 유도된 세포는 본원에 기술된 임의의 IF 세트를 코딩하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 유도된 세포는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 4개의 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 유도 인자를 코딩하는 다른 외인성 유전자를 제외한, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 4개의 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 유도된 세포는 c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자를 제외한, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는, 필수적으로 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 3개의 유전자로 구성된 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우에서, 인간 다능성 줄기 세포는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 코딩하는 외인성 유전자의 적어도 단일의 카피를 수반한다. 몇몇 경우에서, 외인성 유전자를 포함하는 유도된 세포 중 임의의 세포는 또한 동종숙주역 레트로바이러스에 대한 수용체인 마우스 유래의 양이온 수송체 1(MCAT-1)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 유전자를 포함한다.
외인성 유전자의 도입 이후 어떤 시점에 외인성 유전자들 중 하나 이상을 침묵화시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, Oct3/4 외인성 유전자가 침묵화되거나; Klf4 외인성 유전자가 침묵화되거나; Sox2 외인성 유전자가 침묵화되거나; c-Myc 트랜스유전자가 침묵화된다. 몇몇 경우에서, 4개의 외인성 유전자(예로서, Oct3/4; Sox2; Klf4; 및 c-Myc) 모두가 침묵화된다. 몇몇 경우에서, 3개의 외인성 유전자(예로서, Oct3/4; Sox2; 및 Klf4) 모두가 침묵화된다.
유도된 세포는 본원에 기술된 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포주: 1-8; 2-4; 또는 3-2의 확인된 특징들 모두를 공유할 수 있다. 세포주 iPS 1-8은 부다페스트 조약 규칙에 따라 국제 특허 생물 기탁소(IPOD: International Patent Organism Depositary)에 기탁되어 있다. 기탁 인증 번호는 FERM BP-10956이다. IPOD의 주소는 다음과 같다:
일본 (우편번호 305-8566)
이바라키켄 츠쿠바시
히가시 1-1-1
AIST 츠쿠바 센트럴 6
국제 특허 생물 기탁소(IPOD)
몇몇 경우에서, 인간 다능성 또는 다분화성 줄기 세포는 Tert, Nanog, Oct3/4 및 Sox2 유전자가 후성적으로 불활성화되지 않은 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 유도된다. 몇몇 경우에서, 세포는 조직에 존재하는 분화된 세포로부터, 또는 조직에 존재하는 분화된 세포 및 미분화된 세포의 조합으로부터 유도된다.
유도된 세포 중 Nanog 및 Oct3/4의 프로모터 부위는 모체 섬유아세포와 비교하여 저메틸화되어 있거나, 탈메틸화되어 있을 수 있다. 유도된 세포는 인간 ES 세포-배양 조건하에서 배양되었을 때 장기간 자가 재생능을 갖는 줄기 세포일 수 있다.
줄기 세포의 특징들 중 하나는 노화되지 않고 연속하여 증식할 수 있는 그의 능력이다. 따라서, 유도된 세포는 시험관내에서 연속하여 계대될 수 있다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포는 시험관내에서 적어도 약 30 내지 적어도 약 100회, 예로서, 약 33, 35, 40, 45, 51, 56, 60, 68, 75, 80, 90, 93, 100회, 또는 적어도 약 30 내지 적어도 약 100회 계대 사이의 임의의 계대수로 계대될 수 있다. 유도된 세포는 모체 세포에서의 IF 강제 발현 개시로부터 약 30일 내지 약 500일간의 기간 동안, 예로서, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 100일, 150일, 180일, 200일, 250일, 300일, 400일, 450일, 또는 약 30일 내지 약 500일 사이의 임의의 다른 기간 동안 증식할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 유도된 세포는 500일 초과의 기간 동안 증식한다.
전형적으로, 유도된 세포는 대기 산소 조건(예로서, 약 21% 산소)하에서 미분화된 표현형으로 증식할 수 있다. 다른 경우에서, 유도된 세포는 5% 초과의 산소 내지 약 21% 산소 범위의 산소 조건하에서 미분화된 세포로서 증식한다. 일반적으로, 유도된 세포는 콜로니로 증식한다.
유도된 세포는 시험관내 인간 ES 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화할 수 있는 능력과 같은 시험관내 다능성 수행능을 가질 수 있고; 그러한 세포는 추가로 원시 생식 세포(예로서, 정자, 난모세포)로 분화할 수 있는 잠재능을 가질 수 있다.
몇몇 경우에서, 유도된 인간 다능성 줄기 세포 및 모체 세포(예로서, 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포)는 동일하거나, 거의 동일한 SNP 유전자형을 갖는다. 몇몇 경우에서, 유도된 세포 및 모체 세포는 동일한 HLA 유형(예로서, HLA-A, B, Cw, DR, DQ, DP 및 Bw)을 갖는다.
본원에서 제공하는 조성물은 유도된 세포 이외의, 또는 유도된 세포로부터 분화된 세포 이외의 다른 성분들을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 조성물은 상기 세포 및 동결보존제, 예로서, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/902,571호; 제11/142,651호; 문헌 [Ha et al., (2005), Hum. Reprod., 20(7): 1779-1785]에 기재되어 있는 동결보존 배지를 포함한다.
조성물은 상기 세포 및 배양 배지, 예로서, 인간 ES 배양 배지를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 배양 배지는 하나 이상의 성장 인자, 예를 들면: FGF-2, bFGF, PDGF, EGF, IGF, 또는 그의 유도체로 구성된 배지이다. 몇몇 일례로, 조성물은 인간 유도된 다능성 또는 다분화성 줄기 세포 및 FGF-2 또는 bFGF 또는 그의 유도체를 포함하는 배지를 포함한다. 다른 일례로, 조성물은 인간 유도된 다능성 또는 다분화성 줄기 세포 및 인간 ES 배양 배지 및 FGF-2 또는 bFGF, 또는 그의 유도체를 포함하는 배지를 포함한다. 추가의 또다른 일례로, 조성물은 인간 유도된 다능성 또는 다분화성 줄기 세포 및 본원에 기술된 MC-ES 배지를 포함한다.
몇몇 경우에서, 배양 배지 중 bFGF 또는 FGF2의 농도는 2 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 예로서, 약 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml,5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 10 ng/ml, 12 ng/ml, 14 ng/ml, 15 ng/ml, 17 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml이다. bFGF 또는 FGF2의 농도는 또한 약 4 ng/ml 내지 약 10 ng/ml; 약 4 ng/ml 내지 약 20 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 30 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 40 ng/ml; 또는 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml일 수 있다. 다른 경우에서, 예로서, 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 50 ng/ml 내지 약 75 ng/ml와 같이 보다 고농도의 bFGF 또는 FGF2가 사용될 수 있다. 유사하게, 배양 배지는 본원에 기술된 바와 같이, 농도가 약 2 ng/ml 내지 약 100 ng/ml인, bFGF 또는 FGF2 이외의 성장 인자를 함유할 수 있다.
VI. 세포 분화
유도된 세포는 다양한 계통의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 분화된 세포의 예로는 외배엽(예로서, 뉴런 및 섬유아세포), 중배엽(예로서, 심근 세포), 또는 내배엽(예로서, 췌장 세포) 계통으로부터 유래된 분화된 임의의 세포를 포함한다. 분화된 세포는 췌장 베타 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런(예로서, 도파민성 뉴런), 희소돌기아교세포, 희소돌기아교세포 전구 세포, 간 세포, 간 줄기 세포, 성상세포, 근육세포, 조혈 세포, 또는 심근 세포 중 하나 이상일 수 있다.
유도된 세포로부터 유래된 분화된 세포는 최종적으로 분화된 세포일 수 있거나, 특정 계통의 세포의 근원이 될 수 있다. 예를 들면, 유도된 세포는 각종 다분화성 세포 유형, 예로서, 신경 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 또는 간 줄기 세포로 분화될 수 있다. 이어서, 줄기 세포는 추가로 새로운 세포 유형으로 분화될 수 있는데, 예를 들면, 신경 줄기 세포는 뉴런으로 분화될 수 있고; 심장 줄기 세포는 심근 세포로 분화될 수 있고; 간 줄기 세포는 간 세포로 분화될 수 있다.
유도된 세포를 더욱더 분화된 세포 유형으로 분화시키는 방법은 다수 존재한다. 유도된 세포를 분화시키는 방법은 줄기 세포, 특히, ES 세포, MSC, MAPC, MIAMI, 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 분화시키는데 사용되는 방법과 유사할 수 있다. 몇몇 경우에서, 생체외에서 분화가 일어날 수 있고; 몇몇 경우에서는, 생체내에서 분화가 일어날 수 있다.
ES 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 임의의 공지 방법을 사용하여 유도된 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성할 수 있다(예로서, 문헌 [Reubinoff et al., (2001), Nat, Biotechnol., 19(12): 1134-40] 참조). 예를 들면, 신경 줄기 세포는 유도된 세포를 노긴, 또는 다른 골 형태형성 단백질 길항제의 존재하에서 부유 응집물로서 배양함으로써 생성될 수 있다(예로서, 문헌 [Itsykson et al., (2005) Mol, Cell Neurosci., 30(1):24-36] 참조). 또다른 일례로, 신경 줄기 세포는 유도된 세포를 현탁액 중에서 배양하여 성장 인자, 예로서, FGF-2의 존재하에 응집물을 형성함으로써 생성될 수 있다(문헌 [Zhang et al., (2001), Nat.Biotech., (19): 1129-1133]). 몇몇 경우에서, 응집물을, FGF-2를 함유하는 무혈청 배지 중에서 배양한다. 또다른 일례로, 유도된 세포를, FGF-2를 함유하는 무혈청 배지의 존재하에서 마우스 기질 세포주, 예로서, PA6과 함께 공배양한다. 추가의 또다른 일례로, 유도된 세포를 직접 FGF-2를 함유하는 무혈청 배지로 옮겨 직접 분화를 유도한다.
유도된 세포로부터 유래된 신경 줄기는 뉴런, 희소돌기아교세포, 또는 성상세포로 분화될 수 있다. 종종, 신경 줄기 세포를 생성하는데 사용되는 조건은 또한 뉴런, 희소돌기아교세포, 또는 성상세포를 생성하는데도 사용될 수 있다.
도파민성 뉴런은 파킨슨병 및 다른 신경변성 질환에서 중추적인 역할을 하는 바, 이에 특히 관심의 대상이 된다. 도파민성 뉴런으로의 분화를 촉진시키기 위해서 유도된 세포를 무혈청 조건하에서 PA6 마우스 기질 세포주와 함께 공배양할 수 있다(예로서, 문헌 [Kawasaki et al., (2000) Neuron, 28(1):31-40] 참조). 다른 방법 또한 기재되어 있다(예로서, 문헌 [Pomp et al., (2005), Stem Cells 23(7):923-30]; 미국 특허 번호 제6,395,546호, 예로서, 문헌 [Lee et al., (2000), Nature Biotechnol, 18:675-679] 참조).
희소돌기아교세포 또한 유도된 세포로부터 생성될 수 있다. 유도된 세포의 희소돌기아교세포로의 분화는 ES 세포 또는 신경 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 공지 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 희소돌기아교세포는 유도된 세포 또는 신경 줄기 세포를 기질 세포와 함께 공배양함으로써 생성될 수 있다(예로서, 문헌 [Hermann et al. (2004), J Cell Sci. 117(Pt 19):4411-22] 참조). 또다른 일례로, 희소돌기아교세포는, 인터루킨(IL)-6 수용체, 또는 유도체가 IL-6 사이토카인, 또는 그의 유도체에 연결되어 있는 것인 융합 단백질의 존재하에서 유도된 세포 또는 신경 줄기 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 희소돌기아교세포는 또한 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 유도된 세포로부터 생성될 수 있다(예로서, 문헌 [Kang et al, (2007) Stem Cells 25, 419-424] 참조).
성상세포 또한 유도된 세포로부터 생산될 수 있다. 성상세포는 유도된 세포 또는 신경 줄기 세포를, bFGF 및 EGF를 포함하는 신경원성 배지의 존재하에서 배양함으로써 생성할 수 있다(예로서, 문헌 [Brustle et al, (1999), Science, 285:754-756] 참조).
유도된 세포를 당업계에 공지되는 방법에 의해 췌장 베타 세포로 분화시킬 수 있다(예로서, 문헌 ([Lumelsky et al., (2001) Science, 292:1389-1394]; [Assady et al., (2001), Diabetes, 50:1691-1697]; [D'Amour et al., (2006), Nat. Biotechnol, 24: 1392-1401]; [D'Amour et al., (2005), Nat. Biotechnol 23: 1534-1541])). 본 방법은 유도된 세포를 액티빈 A로 보충된 무혈청 배지 중에서 배양한 후, 올-트랜스 레티노산으로 보충된 무혈청 배지의 존재하에 배양한 후, bFGF 및 니코틴아미드로 보충된 무혈청 배지의 존재하에 배양하는 것을 포함할 수 있다(예로서, 문헌 [Jiang et al., (2001), Cell Res., 4:333-444]). 다른 일례로, 본 방법은 유도된 세포를 무혈청 배지, 액티빈 A 및 Wnt 단백질의 존재하에 약 0.5 내지 약 6일, 예로서, 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6일 동안 배양한 후; 약 0.1% 내지 약 2%, 예로서, 0.2%의 FBS 및 액티빈 A의 존재하에 약 1 내지 약 4일, 예로서, 약 1, 2, 3, 또는 4일 동안 배양한 후; 2% FBS, FGF-10 및 KAAD-사이클로파민(케토-N-아미노에틸아미노카프로일 디하이드로 신나모일사이클로파민) 및 레티노산의 존재하에 약 1 내지 약 5일, 예로서, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 동안 배양한 후; 1% B27, 감마 세크레타제 저해제 및 익스텐딘-4와 함께 약 1 내지 약 4일, 예로서, 1, 2, 3, 또는 4일 동안 배양한 후; 최종적으로 1% B27, 익스텐딘-4, IGF-1 및 HGF의 존재하에 약 1 내지 약 4일, 예로서, 1, 2, 3, 또는 4일 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다.
간 세포 또는 간 줄기 세포는 유도된 세포로부터 분화될 수 있다. 예를 들면, 유도된 세포를 부티르산나트륨의 존재하에서 배양함으로써 간 세포를 생성할 수 있다(예로서, [Rambhatla et al., (2003), Cell Transplant, 12:1-11] 참조). 또다른 일례로, 간 세포는 유도된 세포를 액티빈 A 존재하의 무혈청 배지 중에서 배양한 후, 세포를 섬유아세포 성장 인자-4 및 골 형태형성 단백질-2 중에서 배양함으로써 생성할 수 있다(예로서, 문헌 [Cai et al, (2007), Hepatology, 45(5): 1229-39]). 예시적인 실시태양에서, 유도된 세포는 유도된 세포를 액티빈 A의 존재하에 약 2 내지 약 6일, 예로서, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6일 동안 배양하고, 유도된 세포를 간 세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor)의 존재하에 약 5일 내지 약 10일, 예로서, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10일 동안 배양함으로써 간 세포 또는 간 줄기 세포로 분화된다.
유도된 세포는 또한 심근 세포로 분화될 수 있다. 골 형태형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 신호 전달을 저해함으로써 심근 세포(또는 심근 세포)를 생성할 수 있다(예로서, 문헌 [Yuasa et al, (2005), Nat. Biotechnol, 23(5):607-11] 참조). 따라서, 예시적인 실시태양에서, 유도된 세포는 노긴 존재하에 약 2 내지 약 6일, 예로서, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 또는 약 6일 동안 배양된 후, 배아체 형성 이후에 배아체는 약 1주 내지 약 4주, 예로서, 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4주 동안 배양된다.
다른 일례로, 심근 세포는 유도된 세포를 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)의 존재하에 배양함으로써, 또는 ES 세포로부터 심근 세포를 생성하는 것으로 알려져 있는 당업계의 공지 방법을 사용함으로써 생성할 수 있다(예로서, 문헌 ([Bader et al, (2000), Circ. Res., 86:787-794], [Kehat et al, (2001), J Clin. Invest., 108:407-414]; [Mummery et al, (2003), Circulation, 107:2733-2740])).
유도된 세포로부터 다른 세포 유형을 생성하는 방법의 예로는 (1) 유도된 세포를 레티노산, 백혈병 억제 인자(LIF), 갑상샘 호르몬(T3) 및 인슐린의 존재하에 배양하여 지방세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Dani et al, (1997), J. Cell Sci, 110:1279-1285]); (2) 유도된 세포를 BMP-2 또는 BMP-4의 존재하에 배양하여 연골세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Kramer et al, (2000), Mech, Dev., 92:193-205]); (3) 유도된 세포를 평활근 생성 조건하에서 배양하는 것(예로서, 문헌 [Yamashita et al, (2000), Nature, 408:92-96]); (4) 유도된 세포를 베타-1 인테그린의 존재하에 배양하여 각질세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Bagutti et al, (1996), Dev. Biol, 179: 184-196]); (5) 유도된 세포를 인터루킨-3(IL-3) 및 대식세포 콜로니 자극 인자의 존재하에 배양하여 대식세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Lieschke and Dunn (1995), Exp. Hemat., 23:328-334]); (6) 유도된 세포를 IL-3 및 줄기 세포 인자의 존재하에 배양하여 비만 세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Tsai et al, (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:9186-9190]); (7) 유도된 세포를 덱사메타손 및 기질 세포층, 스틸 인자의 존재하에 배양하여 멜라닌세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Yamane et al, (1999), Dev. Dyn., 216:450-458]); (8) 유도된 세포를 덱사메타손, 레티노산, 아스코르브산, 베타-글리세로포스페이트의 존재하에 태아 마우스 골모세포와 함께 공배양하여 골모세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Buttery et al, (2001), Tissue Eng., 7:89-99]); (9) 유도된 세포를 골형성 인자의 존재하에 배양하여 골모세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Sottile et al, (2003), Cloning Stem Cells, 5:149-155]); (10) 유도된 세포 중 인슐린 유사 성장 인자-2를 과다발현시키고, 세포를 디메틸 설폭시드의 존재하에 배양하여 골격근 세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Prelle et al, (2000), Biochem. Biophys. Res. Commun., 277:631-638]); (11) 백혈구 세포를 생성하는 조건에 유도된 세포를 가하는 것; 또는 (12) 유도된 세포를 BMP4 및 SCF, FLT3, IL-3, IL-6 및 GCSF 중 하나 이상의 존재하에 배양하여 조혈 전구 세포를 생성하는 것(예로서, 문헌 [Chadwick et al, (2003), Blood, 102:906-915])을 포함한다.
몇몇 경우에서, 분화된 세포의 하위군집을 정제 또는 분리시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 원하는 세포 유형에 특이적인 하나 이상의 모노클로날 항체를 세포 군집과 인큐베이션시키고, 상기의 결합한 세포를 단리한다. 다른 경우에서, 세포의 원하는 하위군집은 세포 유형에 특이적인 프로모터의 제어하에 있는 리포터 유전자를 발현한다.
특정 실시태양에서, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제-EGFP 융합 단백질은 세포 유형에 특이적인 방식으로 발현된다. 정제 방법은 세포 유형에 독립적인 방식으로 작제물(예로서, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제-EGFP)을 발현하는 세포가 강화된 세포 군집을 수득하기 위해 세포를 분류하여 녹색 형광 세포를 선별하고, 필요에 따라 상기 분류를 반복하는 것을 포함한다. 세포의 원하는 하위군집을 선별하는 것은 또한 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제/간시클로비르(HS Vtk/GCV) 자살 유전자 시스템을 사용한 증식 세포의 음성적 선별에 의해, 또는 이시스트론 리포터를 발현하는 세포의 양성적 선별에 의해 이루어질 수 있다(예로서, 문헌 [Anderson et al. (2007) Mol Ther. (11):2027-2036]).
VII. 세포 요법
유도된 세포, 또는 유도된 세포로부터 분화된 세포는 질환(예로서, 유전자 결함)을 치료하는 요법으로서 사용될 수 있다. 상기 요법은 질환의 원인을 치료하는 것을 대상으로 할 수 있거나; 별법으로, 상기 요법은 질환 또는 병태가 미친 결과를 치료하는 것일 수 있다. 유도된 세포를 피험체의 손상 부위로 전달하거나, 그에 근접하게 놓을 수 있거나; 세포가 손상 부위로 이주하거나, 귀소할 수 있도록 하는 방식으로 세포를 피험체에 도입할 수 있다. 유리하게는, 전달된 세포가 상해를 입은 세포 또는 손상된 세포를 대체함으로써 피험체의 전반적인 상태를 개선시킬 수 있다. 몇몇 일례로, 전달된 세포가 조직 재생 또는 수복을 자극시킬 수 있다.
전달된 세포는 유도된 세포로부터 분화된 세포일 수 있다. 전달된 세포는 또한 유도된 세포로부터 분화된 다분화성 줄기 세포일 수 있다. 몇몇 경우에서, 전달된 세포는 분화되지 않은 유도된 세포일 수 있다.
피험체에게 치료를 실시하는 횟수는 달라질 수 있다. 유도된 세포 및/또는 분화된 세포를 피험체 내로 도입하는 것은 1회성 이벤트일 수 있지만; 특정 상황하에서는 그러한 치료가 제한된 기간 동안 개선을 이끌어 낼 수 있고, 반복적으로 진행되는 일련의 치료를 필요로 할 수 있다. 다른 상황하에서는 결과가 관찰되기 이전에 세포를 다회에 걸쳐 투여하는 것이 필요할 수 있다. 정확한 프로토콜은 질환 또는 병태, 질환의 단계 및 치료하고자 하는 개개의 피험체의 파라미터에 따라 달라진다.
세포는 하기 경로: 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 경피, 기관지내, 복강내, 또는 척수액 내로의 경로들 중 어느 것을 통해 피험체에게 도입될 수 있다.
유도된 세포는 세포로 분화될 수 있고, 광범위한 질환 또는 질병을 앓는 피험체에게로 전달될 수 있다. 신경계 질환 또는 질병을 앓는 피험체가 특히 줄기 세포 요법으로부터 이익을 받을 수 있다. 몇몇 접근법에서, 유도된 세포는 신경 줄기 세포 또는 신경 세포로 분화될 수 있고, 손상된 부위로 이식됨으로써 신경계 병태, 예로서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 뇌경색, 척수 손상, 또는 다른 중추 신경계 질병을 치료할 수 있다(예로서, 문헌 ([Morizane et al., (2008), Cell Tissue Res., 331(1):323-326]; [Coutts and Keirstead (2008), Exp. Neurol, 209(2):368- 377]; [Goswami and Rao (2007), Drug, 10(10):713-719]) 참조).
파킨슨병 치료의 경우, 유도된 세포는 도파민 작용성 뉴런으로 분화될 수 있고, 파킨슨병을 앓는 피험체의 선조체로 이식될 수 있다. 다발성 경화증 치료의 경우, 신경 줄기 세포는 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포의 전구 세포로 분화될 수 있고, 이는 이후 MS를 앓는 피험체로 전달된다.
임의의 신경계 질환 또는 질병 치료의 경우, 성공적인 접근법은 신경 줄기 세포를 피험체에게 도입하는 것일 수 있다. 예를 들면, 알츠하이머병, 뇌경색 또는 척수 손상을 치료하기 위해서 유도된 세포는 신경 줄기 세포로 분화된 후, 손상된 부위로 이식될 수 있다. 유도된 세포는 또한 뇌 및 척수 손상의 수복을 위해 병변으로의 그의 유주를 표적할 수 있는 단서에 대해 반응하도록 공학처리될 수 있다(예로서, 문헌 [Chen et al., (2007), Stem Cell Rev., 3(4):280-288]).
신경계 질병 이외의 질환은 또한 유도된 세포, 예로서, 유도된 다분화성 또는 다능성 줄기 세포로부터 분황된 세포를 사용하는 줄기 세포 요법에 의해 치료될 수 있다. 퇴행성 심장 질환, 예로서, 허혈성 심장근육병증, 전도 질환 및 선천결함은 줄기 세포 요법으로부터 이익을 받을 수 있다(예로서, 문헌 [Janssens et al., (2006), Lancet, 367: 1 13-121] 참조).
췌장섬 세포(또는 랑게르한스섬의 1차 세포)는 당뇨병(예로서, 1형 당뇨병)을 앓는 피험체에 이식될 수 있다(예로서, 문헌 [Burns et al., (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2:255-266] 참조). 몇몇 실시태양에서, 유도된 세포로부터 유래된 췌장 베타 세포는 당뇨병(예로서, 1형 당뇨병)을 앓는 피험체에 이식될 수 있다.
다른 일례로, 유도된 세포로부터 유래된 간 세포 또는 간 줄기 세포는 간 질환, 예로서, 간염, 간경화, 또는 간부전을 앓는 피험체에 이식된다.
유도된 세포로부터 유래된 조혈 세포 또는 조혈 줄기 세포(HSC)는 혈액암, 또는 다른 혈액 또는 면역 질병을 앓는 피험체에 이식될 수 있다. 잠재적으로 조혈 세포 또는 HSC에 의해 치료되는 혈액암의 예로는 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수모구 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia), 호지킨병, 다발골수종 및 비호지킨 림프종을 포함한다. 종종, 상기와 같은 질환을 앓는 피험체는 빠르게 분화하는 혈액 세포를 사멸시키기 위해서 조사되고/거나 화학요법적 치료를 받아야 한다. 유도된 세포로부터 유래된 HSC를 이들 피험체로 도입하는 것이 제거된 세포 저장소를 재증식시키는데 도움이 될 수 있다.
몇몇 경우에서, 유도된 세포로부터 유래된 조혈 세포 또는 HSC는 또한 암을 직접 공격하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 동종 이형 HSC를 이식하는 것이 신장암 치료에 있어 유망한 것으로 나타났다(예로서, 문헌 [Childs et al., (2000), N. Engl. J. Med., 343:750-758. 몇몇 실시태양에서, 동종 이형, 또는 심지어는 자가의, 유도된 세포로부터 유래된 HSC는 신장암 또는 다른 암을 치료하기 위해 피험체로 도입될 수 있다.
유도된 세포로부터 유래된 조혈 세포 또는 HSC는 또한 혈액 세포 이외의 세포 또는 조직, 예로서, 근육, 혈액 혈관, 또는 골을 생성하거나, 수복시키기 위해 피험체로 도입될 수 있다. 그러한 치료는 다수의 질병을 치료하는데 유용할 수 있다.
몇몇 경우에서, 유도된 세포는 면역손상된 동물, 예로서, SCID 마우스로 전달되어 분화될 수 있다. 이식된 세포는 분화된 세포 유형 및 종양 세포의 혼합물을 형성할 수 있다. 관심의 대상이 되는 특정의 분화된 세포 유형을 선택하고, 계통 특이 마커의 사용에 의해서, 예로서, 형광 활성 세포 분류법(FACS: fluorescent activated cell sorting) 또는 다른 분류 방법, 예로서, 자기 활성 세포 분류법(MACS: magnetic activated cell sorting)에 의해 종양 세포로부터 정제할 수 있다. 이어서, 분화되 세포를 피험체(예로서, 자가 피험체, HLA 합치 피험체)로 이식됨으로써 질환 또는 병태를 치료할 수 있다. 질환 또는 병태는 조혈성 질병, 내분비 결핍, 퇴행성 신경계 질병, 탈모, 또는 본원에 기술된 다른 질환 또는 병태일 수 있다.
VIII. 분석 방법
본원에는 또한 1차 체세포(예로서, 피부 세포, 단핵 혈액 세포, 또는 골수 세포) 또는 세포주(예로서, HEK293 세포, Hela 세포, 다분화성 줄기 세포주, 또는 성인 줄기 세포주)에서 다능성을 유도하는 제제를 단독으로, 또는 예로서, 본원에 기술된 유도 인자와 같은 다른 제제와 조합하여 확인할 수 있는 분석 방법이 기술되어 있다. 본 방법은 또한 다능성을 유도하는 유도 인자의 능력(예로서, 다능성을 유도하는 효율)을 증가시키는 제제를 확인하는 방법을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 분석 방법에서 사용되는 세포는 Tert, Nanog, Oct3/4 또는 Sox2가 후성적으로 불활성화되지 않은 것이다.
몇몇 실시태양에서, 다능성 또는 다분화성을 유도할 수 있는 테스트 시약의 능력은 알칼리성 포스파타제(ALP), ES 마커 유전자, 또는 단백질 마커 중 하나 이상의 발현을 유도할 수 있는 테스트 시약의 능력을 측정함으로써 1차 스크린 종점으로 평가한다. 몇몇 경우에서, 테스트 시약의 유도 능력을 음성 대조군 시약(예로서, 목적 유전자 또는 단백질 마커를 유도할 수 있는 능력이 제한되어 있거나, 존재하지 않는 시약)의 능력과 비교함으로써 상기와 같은 측정은 이루어진다. 대부분의 경우에는, 시료를 채취하고, 상기 시료를 사전 배양 단계없이 분석에 직접 이용할 수 있지만, 테스트 시약 또는 대조군 시약과 인큐베이션시키기 이전에 또는 그 중에 세포를, 배양되는 특정 세포 유형에 적합화된 세포 배양 배지, 예로서, 본원에 기술된 세포 배양용 세포 배양 배지들 중 어느 배지 중에서 배양한다. 몇몇 경우에서, 테스트 시약 인큐베이션 기간 이후에 본원에 기술된 바와 같이 세포를 MC-ES 배지 중에서 배양한다.
스크리닝 분석에 적합한 ES 마커 유전자의 예로는 Tert, Cyp26a1, Nanog, Oct3/4, 또는 Sox2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 표준 방법, 예로서, 본원에서 언급한 방법들 중 임의의 방법, 예로서, qPCR에 의해 mRNA 수준 또는 단백질 수준을 검출하거나, 정량함으로써 마커의 발현을 측정할 수 있다. 다른 실시태양에서, 세포를 테스트 시약과 접촉시키기 이전에 분석하고자 하는 세포로 ES 마커 유전자 프로모터로부터의 하나 이상의 요소를 포함하는 리포터 작제물을 도입한다. 프로모터-리포터 작제물을 생성하는 방법, 상기 작제물을 세포 내로 도입하는 방법 및 다양한 리포터 폴리펩티드 활성을 분석하는 방법은 예로서, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son, N.Y. (2005), 3.16-3.17 and 9.1-9.14(각각)]에서 상세히 살펴볼 수 있다. 통상의 방법에 의해 특정 세포 유형을 형질감염시키는 것이 어려울 경우에는 예로서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 형질도입을 사용하여 바이러스 프로모터-리포터 작제물을 도입할 수 있다. 프로모터 활성은 리포터 폴리펩티드의 특성(예로서, 효소 활성 또는 형광성), 리포터 폴리펩티드 발현(예로서, ELISA 분석법에 의해), 또는 리포터 mRNA 발현(예로서, 형광 하이브리드화 기법에 의해)을 측정함으로써 정량할 수 있다. 적합한 리포터 폴리펩티드로는 예로서, 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 형광 단백질(예로서, 강화된 녹색 형광 단백질), β-갈락토시다제, β 락타마제, ALP 및 호스래디쉬 퍼옥시다제를 포함한다. Nanog, Sox2, Oct3/4, TERT, 또는 Cyp26a1 프로모터 활성화 유도 검출용의 예시적인 프로모터-리포터 작제물은 문헌 ([Kuroda et al, (2005), Mol. Cell Biol, 25(6):2475-2485](Nanog에 관한 문헌); [Zhan et al., (2005), Cell Biochem. Biophys., 43(3):379-405](Oct3/4 및 Sox2에 관한 문헌); 및 [Tzukerman et al, (2000), Mol. Biol. Cell, 11(12):4381-4391](hTert에 관한 문헌) 및 [Loudig et al, (2005), Biochem. J., 392(Pt 1):241-248])에 기재되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 분석된 세포에서 ALP 활성의 존재 여부가 테스트 시약의 유도 활성에 관한 예비 테스트로서 사용된다. 상기 분석 중 임의의 것에서 양성인 결과, 예로서, 대조군 시약보다 테스트 시약에서 현저히 더 높은 수준의 활성을 보이는 양성 결과는 테스트 시약이 유도 활성을 갖는다는 것을 시사하는 예비 조사 결과로서 간주된다. 상기 후보 유도 시약은 1차 스크린에서 테스트 시약과 접촉되어진 세포를, ES 마커 유전자, 단백질 마커, 장기간 자가 재생능, Oct3/4, Sox2 및 Nanog 프로모터의 저메틸화, 테라토마를 형성할 수 있는 능력 및 생체외에서 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽 계통의 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력을 측정하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다능성 또는 다분화성 측정을 위한 본원에 기술된 분석법들 중 어느 것으로 테스트함으로써 추가로 스크리닝될 수 있다.
분석 조건은 달라질 수 있으며, 이는 사용되는 분석 프로토콜의 성질 및 사용되는 세포 및 시약의 성질에 따라 달라질 수 있다. 상기 분석에 있어서 종점 분석 이전의 세포 배양 기간은 적어도 약 3일 내지 적어도 약 40일, 예로서, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 20, 21, 25, 26, 27, 30, 32, 34, 36, 38일, 또는 적어도 약 3일 내지 적어도 약 40일 사이의 임의의 기간으로 다양할 수 있다. 추가로, 대부분의 경우, 테스트 시약 인큐베이션 기간은 적어도 약 30분 내지 약 40일, 예로서, 1시간, 2시간, 12시간, 18시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 25일, 30일, 34일, 적어도 약 30분 내지 적어도 약 40일 사이의 임의의 다른 기간인 범위이다.
몇몇 실시태양에서, 테스테하고자 하는 시약은 약 19개의 염기쌍으로 이루어진 표적 유전자 서열을 포함하고, RNA 간섭의 표적 유전자 발현을 저해할 수 있는 더블 스트랜드 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 siRNA이다. 예로서, 문헌 [Scherr et al, (2007), Cell Cycle, 6(4):444-449]를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 분석하고자 하는 siRNA로는 예로서, 문헌 ([Miyagishi et al, (2003), Oligonucleotides, 13(5):325-333]; 및 [Huesken et al, (2005), Nat. Biotechnol, 8:995-1001])에 기재되어 있는 완전한 게놈 siRNA 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 완전한 게놈 siRNA 라이브러리, 예로서, 상업적으로 이용가능한 어레이된 siRNA 라이브러리로는 퀴아젠(Qiagen)(캘리포니아주 발렌시아 소재)으로부터 입수한 "인간 완전 게놈 siRNA 세트 V4.0(Human Whole Genome siRNA Set V4.0)"; 디하마콘(Dharmacon)(콜로라도주 라피엣 소재)으로부터 입수한 "인간 si게놈 siRNA 라이브러리 - 게놈(Human siGENOME siRNA Library - Genome)"; 및 암비온(Ambion)(텍사스수 오스틴 소재)으로부터 입수한 사일러서® 인간 게놈 siRNA 라이브러리(Silencer® Human Genome siRNA Library)를 포함한다. siRNA 도입 방법 및 시약은 시판용 시약, 예로서, 리포펙트아민™ RNAi맥스(RNAiMAX)(캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen), 트랜스메신저 형질감염 시약(TransMessenger Transfection Reagent)(캘리포니아주 발렌시아 소재 Qiagen), 또는 디하마 펙트(Dharma FECT)®(콜로라도주 라피엣 소재의 Dharmacon)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 문헌 [Krausz (2007), Mol. Biosyst, 3(4):232-240]을 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 예로서, 문헌 [Root et al, (2006), Nat. Method, 3(9):715-719]에 기재되어 있는 것과 같은 바이러스 RNAi 라이브러리를 사용한다.
임의로, 스크리닝되는 유도 테스트 시약은 소분자이다. 테스트 분자는 최상의 개개 소분자일 수 있거나, 몇몇 경우에서, 스크리닝되는 소분자 테스트 시약은 조합 라이브러리, 즉, 다수의 화학적 "구성 블록"을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 수집물로부터 기인한다. 예를 들면, 선형 조합 화학물질 라이브러리, 예로서, 폴리펩티드 라이브러리는 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 중의 아미노산의 갯수)를 위해 모든 가능한 방식으로 아미노산으로 불리는 화학적 구성 블록 세트를 조합함으로써 형성된다. 화학적 구성 블록의 상기와 같은 조합적 혼합을 통해 수백 만개의 화학적 화합물을 합성할 수 있다. 실제로, 이론적으로는 100여개의 상호교환가능한 화학적 구성 블록을 체계적이게 조합적으로 혼합함으로써 1억 여개의 사량체 화합물 또는 100억여개의 오량체 화합물을 합성할 수 있다. 예로서, 문헌 [Gallop et al, (1994), J. Med. Chem., 37(9), 1233-1251]을 참조한다. 조합 화학물질 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업계에 잘 알려져 있다. 조합 화학물질 라이브러리로는 예로서, 문헌 [Hobbs et al, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6909-6913]에 기재되어 있는 것과 같은, 디버조머(diversomer), 예로서, 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티; 문헌 [Chen et al., (1994), J. Amer. Chem. Soc, 116:2661-2662]에 기재되어 있는 것과 같은, 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성체; 문헌 [Cho, et al, (1993), Science, 261: 1303- 1305]에 기재되어 있는 것과 같은, 올리고카르바메이트; 문헌 [Campbell et al., (1994), J. Org. Chem., 59: 658-660]에 기재되어 있는 것과 같은, 펩티딜 포스포네이트; 및 예로서, 티아졸리디논 및 메타티아자논(미국 특허 번호 제5,549,974호), 피롤리딘(미국 특허 번호 제5,525,735호 및 제5,519,134호), 벤조디아제핀(미국 특허 번호 제5,288,514호)을 포함하는 유기 소분자 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다수의 조합 라이브러리는 예로서, 콤제넥스(ComGenex)(뉴저지주 프린스턴 소재); 아시넥스(Asinex)(러시아 모스코바 소재); 트리포스, 인코포레이티드(Tripos, Inc.)(미주리주 세인트루이스 소재), 켐스타, 리미티드(ChemStar, Ltd.)(러시아 모스코바 소재); 3D 파마슈티칼스 (3D Pharmaceuticals)(펜실배니아주 엑스톤 소재); 및 마르텍 바이오사이언시즈(Martek Biosciences)(매릴랜드주 콜럼비아 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다.
몇몇 경우에서, 유도 활성에 대해 스크리닝되는 테스트 시약은 본원에 기술된 하나 이상의 유도 인자(예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc), 예로서, 본원에 기술된 1, 2, 3, 또는 4개의 유도 인자와 조합하여 함께 사용될 수 있다. 몇몇 경우에서, 테스트 시약을 하나의 유도 인자, 예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 c-Myc와 함께 조합하여 스크리닝한다. 다른 경우에서, 테스트 시약을 2개의 유도 인자, 예로서, Oct3/4 및 Sox2; Oct3/4 및 Klf4; Oct3/4 및 c-Myc; Sox2 및 Klf4; Sox2 및 c-Myc; 또는 Klf4- 및 c-Myc와 함께 조합하여 스크리닝한다. 몇몇 실시태양에서, 테스트 시약을 3개의 유도 인자, 예로서, Oct3/4, Sox2 및 Klf4; Oct3/4, Klf4 및 c-Myc; Oct3/4, Sox2 및 c-Myc; 또는 Sox2, Klf4 및 c-Myc와 함께 조합하여 스크리닝한다. 테스트 시약을 또한 유도 인자 세트, 예로서, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 조합에 의한 다능성 유도의 효율을 증가시킬 수 있는 그의 능력에 관해 분석할 수 있다.
IX. 세포 보관
수거된 조직, 세포, 유도된 세포, 유도된 다능성 세포, 유도된 다분화성 세포, 수거한 조직으로부터 분화된 세포, 또는 본원에 기술된 다른 세포를 보관할 수 있다. 따라서, 공정 중 임의의 시점으로부터 얻은 세포 또는 물질은 추후에 공정을 완성하거나, 용도 변경을 위해 보관할 수 있다.
보관 방법은 본원에 기술된 방법, 예로서, 동결보존 배지를 사용하는 방법을 비롯한 임의의 방법일 수 있다. 몇몇 예시적인 동결보존 배지로는 "영장류 ES 세포용 동결보존 배지"(일본 도쿄 소재의 ReproCELL) 또는 mFreSR™(캘리포니아주 밴쿠버 소재의 StemCell Technologies)을 포함한다. 세포를 바람직하게 액체 질소 중에서 신속하게 냉동시키고, 액체 질소 보관 용기에 보관한다. 다른 적합한 동결보존 배지 및 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 세포의 동결보존/해동 방법은 예로서, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/902,571호 및 제11/142,651호에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Ha et al, (2005), Hum. Reprod., 20(7): 1779-1785]도 참조한다.
X. 실시예
하기의 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것으로서 해석되어야 하며, 어느 방식으로든 본 개시내용의 나머지를 제한하고자 하는 것은 아니다. 추가의 노력없이도 당업자는 본 설명에 기초하여 본 발명을 최대 한도로 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본원에 인용된 모든 공개 문헌은 그의 전문이 참고로 인용된다. URL 또는 다른 식별자 또는 주소를 참고할 경우, 상기 식별자는 변경될 있고, 인터넷에 관한 특정 정보는 변천할 수 있지만, 등가의 정보도 인터넷 검색을 통해 살펴볼 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그에 관한 참고가 상기 정보의 사용성 및 공중 보급을 입증한다.
실시예 1. 레트로바이러스 벡터 제조
휴젠 HD(Roche 제조)를 사용하여 표 1에서와 같이 작제된 4개의 유전자에 대한 레트로바이러스 벡터 플라스미드(Oct3/4-pMx, Sox2-pMx, Klf4-pMx 및 c-Myc-pMx)를 패키징 세포주 Plat-E(문헌 [Experimental Hematology, 2003, 31(11): 1007-1014]) 내로 도입하였다. 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 도입한 후 약 24 내지 48시간이 경과한 후에, 상기 배지는, 유전자가 도입되는 세포에 적합한 배지로 교체하였다. 레트로바이러스 벡터가 도입된 Plat-E 세포를 4시간 넘게 배양한 후, 상청액을 회수하고, 직경이 45 ㎛인 필터(Millipore 제조)를 통해 통과시켰다. 상기 방법에 의해 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액을 제조하였다.
휴젠 HD(Roche 제조)를 사용하여 3개의 유전자에 대한 레트로바이러스 벡터 플라스미드(Oct3/4-pMx, Sox2-pMx 및 Klf4-pMx)를 패키징 세포인 Plat-E 세포 내로 도입하였다. 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 도입한 후 약 24 내지 48시간이 경과한 후에, 상기 배지는, 유전자가 도입되는 세포에 적합한 배지로 교체하였다. 레트로바이러스 벡터가 도입된 Plat-E 세포를 4시간 넘게 배양한 후, 상청액을 회수하고, 직경이 45 ㎛인 필터(Millipore 제조)를 통해 통과시켰다. 상기 방법에 의해 3개의 유전자(Oct3/4, Sox2 및 Klf4)의 레트로바이러스 벡터 용액을 제조하였다.
실시예 2. 아데노바이러스 벡터 제조
양생 레트로바이러스를 사용하는 것에는 실험자가 감염될 위험이 현저히 존재한다. 이러한 위험은 레트로바이러스가 온코진 단백질(예로서, c-myc)을 코딩할 경우에 특별히 우려되는 점이다. 따라서, 본 발명자들은 마우스 수용체인 마우스 유래의 양이온성 아미노산 수송체 1(MCAT1)을 선택적으로 인식하는 동종숙주역 레트로바이러스 벡터를 사용하였다. 본 발명자들은 mCAT1을 코딩하는 유전자를 수반하는 아데노바이러스 벡터로 인간 세포를 감염시킴으로써 동종숙주역 레트로바이러스가 mCAT1 수용체를 발현하는 인간 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있도록 하였다.
먼저, 마우스 유래의 양이온성 아미노산 수송체(MCAT1) 유전자의 코딩 부위의 서열을 갖는 cDNA를 수반하는 아데노바이러스 벡터를 작제하였다. 구체적으로, 아데노-X 발현 시스템 1 키트(TakaraBio Clontech 제조)를 사용하였다. 아데노-X 발현 시스템 1 키트에서는 다카라 바이오(TakaraBio)사의 키트에 첨부되어 있는 실험 방법에 기초하여 mCAT1 유전자를 pShuttle로 불리는 벡터의 다중 클로닝 부위로 서브클로닝하였다.
이어서, pShuttle의 발현 카세트의 양끝에 있는 절단 부위인, PI-Sce I 부위와 I-Ceu I 부위에서 발현 카세트를 절단하고, 상기 키트의 아데노-X 바이러스 DNA 중 PI-Sce I 부위와 I-Ceu I 부위 사이에 원하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입한 후, 제한 효소 Swa I로 처리하여, 통합이 불성립된 아데노바이러스 DNA는 제거했다. 상기 플라스미드를 E. 콜라이 DH5 균주로 형질전환한 후, 아데노바이러스 DNA로 원하는 유전자가 정확하게 도입되었는지 여부를 제한 효소 처리 또는 PCR 등에 의해 확인하였다. 플라스미드를 대량으로 제조하여, Pac I 제한 효소로 절단했다. 상기를 통해 수득한 재조합 아데노바이러스 DNA를 사용하여 유전자를 HEK293 세포(MicroBix)에 도입하고, 리포펙트아민 2000(Invitrogen 제조)을 사용하여 6웰에 플레이팅하고, 2주 경과 후 세포가 세포변성 효과(CPE)를 보일 때 배지마다 세포를 채취하였다.
이어서, 세포 현탁액을 3회에 걸쳐 냉동 및 해동시킨 후, 세포를 파괴하여, 세포 중에 존재하는 바이러스 입자를 액중에 방출시켰다. 이와 같이 하여 제조된 바이러스 현탁액을 HEK293 세포(5 x 106개의 세포)에 해당하는 하나의 100 mm 플라스틱 배양 접시에 첨가하여 세포를 감염시키고, 바이러스를 증폭시켰다. 추가로, HEK293 세포에 해당하는 4개의 150 mm 플레이트를 사용하여 바이러스를 대량으로 제조한 후, 아데노바이러스 정제 키트(Clontech 제조)를 사용하여 바이러스를 정제하고, -80℃에서 냉동 보관하였다.
mCAT1 아데노바이러스 벡터의 역가(플라크 형성 단위, PFU)에 관하여는 아데노-X 고속 역가 키트를 사용하여 측정하였다. 24웰 플레이트에 웰당 HEK293 세포를 5 x 104개의 세포/500 ㎕의 농도로 플레이팅했다. 일련의 희석된(10-2 내지 10-7) 바이러스 벡터 50 ㎕를 500 ㎕의 배지와 혼합한 후, 세포를 감염시키는데 사용하였다. 5% CO2 및 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 배지를 흡인하고, 세포를 5분 동안 건조시키고, 500 ㎕의 냉 100% 메탄올을 사용하여 세포를 -20℃에 10분 동안 정치하여 고정시켰다. 메탄올을 흡인 제거한 후, 500 ㎕의, 1% 소 혈청 알부민 함유 포스페이트 완충액으로 3회에 걸쳐 웰을 세척하였다. 마우스 항-헥손(hexone) 항체를 1% 소 혈청 알부민 함유 포스페이트 완충액으로 1000배 희석하여, 각각의 250 ㎕를 웰에 첨가하였다.
37℃에서 1시간 동안 정치시킨 후, 항체액을 제거하고, 500 ㎕의, 1% 소 혈청 알부민 함유 포스페이트 완충액으로 3회에 걸쳐 웰을 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제로 표지된 래트 항마우스 면역글로불린 항체를 1% 소 혈청 알부민 함유 포스페이트 완충액으로 500배 희석시키고, 250 ㎕를 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 정치시킨 후, 항체액을 제거하고, 500 ㎕의, 1% 소 혈청 알부민 함유 포스페이트 완충액으로 3회에 걸쳐 웰을 세척하였다. 250 ㎕ of the DAB (디아미노벤지딘) 용액(10배 DAB 농축액을 안정한 퍼옥시다제 완충액으로 희석)을 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 정치시켰다. DAB를 흡인 제거한 후, 500 ㎕의 포스페이트 완충액을 첨가하였다. 20배의 대물렌즈를 사용하여 6개의 관측 시야 중 갈색을 띠는 양성 세포를 계수하였다.
표준적 20배 대물 렌즈의 반경: 0.5 mm
1개의 관측 시야 면적: 7.853 x 10-3 ㎠
웰의 면적: 2 ㎠
웰 관측 시야: 2 ㎠/7.853 x 103 ㎠=254.7
관측 시야(32/6)x254.7/(0.55 x 10-5)= 2.5 X 108 ifu(감염 단위)/ml
실시예 3. 알칼리성 포스파타제 염색
다능성 줄기 세포의 특징인 알칼리성 포스파타제 활성을 확인하기 위한 염색은 하기와 같이 실시하였다. 배지를 제거한 후, 10% 포르말린 중성 완충 용액을 웰에 첨가하고, 세포를 실온에서 5분 동안 고정시켰다. 포스페이트 완충액 등으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제의 발색 기질인 1 단계 NBT/BCIP 용액(Pierce 제조)을 첨가하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 반응시켰다. 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는 세포는 모두 청보라색으로 염색되었다.
실시예 4. 정량적 PCR에 의한 콜로니 유전자 발현 측정
ALP 양성 콜로니를 포함하는 각 콜로니의 표적 유전자의 발현을 하기 방식으로 정량적 PCR을 사용하여 측정했다. 다능성 또는 다분화성 줄기 세포의 유도에 의해 출현한 콜로니를 수거하고, FFPE용의 리커버올(Recoverall) 전체 핵산 단리 키트(Ambion 제조)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 택맨 프리앰프 마스터믹스(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystem 제조)을 사용하여 표적 유전자를 증폭시켰다.
정량적 PCR의 프라이머에는 택맨 유전자 발현 어세이(Taqman gene exprESsion assay)(Applied biosystems사 제조)를 사용하였다. 이하에 각 프라이머의 표적 유전자명과 제품 번호를 제시한다. 인간 Hprt: Hs99999909_m1, 인간 Nanog: Hs02387400_g1, 인간 Tert: Hs00162669_m1, 마우스 Hprt: Mm01545399_m1, 마우스 Nanog: Ma02019550_s1.
정량적 PCR에서의 양성 대조군으로서 하기와 같은 방식으로 수립된 중간엽 줄기 세포로부터 추출된 cDNA를 사용하였다.
인간 골수 유래의 단핵 세포(hBMMNC(Lonza 제조), 로트 060175 A: 여성, 21세, 흑인)로 구성된 하나의 바이알(2.5x107개의 세포)을 37℃ 수조에서 해동시키고, 10 ml의 MSCGM 배지(중간엽 세포용 성장 배지)(Lonza 제조)에 현탁시켰다. 냉동 용액 중 DMSO를 제거하기 위해서, 4℃, 300 g에서 7분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 그렇게 수득한 세포 덩어리를 10 ml의 MSCGM 배지에 재현탁시키고, 105개의 세포/㎠의 밀도로 100 mm 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 배양하였다. 7일 후에 배지를 교체하였다. 이 때, 오래된 배지 중의 현탁된 세포를 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 새로운 배지와 함께 세포에 복귀시켰다. 13일째 부착성 세포가 융합되었을 때 상청액을 제거하고, 포스페이트 완충액으로 비부착성 세포를 씻어 버리고, 0.05% 트립신 EDTA 용액으로 부착성 세포를 분리하여 채취하고, 3000개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하였다. 3차 계대배양물의 세포로부터 RNA를 채취하고, cDNA를 합성하였다.
실시예 5. 출생 후 인간 성인 골수 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도
출생 후 인간 성인 골수 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포를 포함하는 인간 성인 골수 유래 세포(상품명: 인간 골수 유래의 단핵 세포)로부터 저혈청(2%) 및 고혈청(10%) 배양 조건하에서 세포를 수립하고, 다능성 줄기 세포 유도 실험에 사용하였다. 따라서, 냉동 인간 골수 유래의 단핵 세포(hBMMNC(Lonza 제조), 로트 060809B: 여성, 20세, 백인/및 hBMMNC(Lonza 제조), 로트 060470B: 여성, 20세, 흑인) 각각의 하나의 바이알(2.5 x 107개의 세포)을 37℃ 수조에서 해동시키고, 저혈청 배양에 사용되는 10 ml의 MAPC 배지에 현탁시켰다. 냉동 용액 중 DMSO를 제거하기 위해서, 4℃, 300 g에서 7분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다.
그렇게 수득한 세포 덩어리를 재현탁시키고, 10 ng/ml 피브로넥틴으로 코팅된 100 mm 플레이트에 105개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하였다. 성장 인자[10 ng/ml PDGF-BB(Peprotech 제조), 10 ng/ml EGF(Peprotech 제조), 10 ng/ml IGF-II(Peprotech 제조)]를 첨가하였다. 3일 후에는 성장 인자만을 첨가하였다. 7일 후에는 부착성 세포를 제외한 현탁된 세포와 배지를 채취하고, 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 새로운 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 원래의 10 cm 접시에 복귀시키고, 상기에 성장 인자를 첨가하였다. 10일째 부착성 세포가 융합되었을 때 상청액을 제거하고, 포스페이트 완충액으로 비부착성 세포를 씻어 버리고, 0.05% 트립신 EDTA 용액으로 부착성 세포를 분리하여 채취하고, 셀 뱅커(cell banker)(Juji Field 제조)를 사용하여 초대 배양물을 냉동 보관하였다.
동일한 로트의 인간 골수 유래의 단핵 세포를 사용하여, 10% FBS를 함유하는 MSCGM 배지(Lonza 제조)를 사용함으로써 고혈청 조건하에서 세포를 수립하였다. 10 ml의 MSCGM 배지가 첨가된 100 mm 플레이트에 105개의 세포/㎠의 밀도로 인간 골수 유래의 단핵 세포를 플레이팅하고, 37℃에서 배양하였다. 7일 후에는 부착성 세포를 제외한 현탁된 세포와 배지를 채취하고, 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 세포를 새로운 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 원래의 10 cm 접시에 복귀시키고, 계속하여 배양하였다. 13일째 부착성 세포가 융합되었을 때 상청액을 제거하고, 포스페이트 완충액으로 비부착성 세포를 씻어 버리고, 0.05% 트립신 EDTA 용액으로 부착성 세포를 분리하여 채취하고, 셀 뱅커(Juji Field 제조)를 사용하여 초대 배양물을 냉동 보관하였다.
고혈청 및 저혈청 조건하에서 수립된 인간 골수 유래의 초대 배양 세포의 각각의 하나의 바이알을 37℃ 인큐베이터에서 해동시켰다. 수립시키는데 사용된 2 ml의 배지를 각각의 세포에 첨가하고, 저혈청 배양에 사용되는 10 ml의 MAPC 배지에 현탁시켰다. 냉동 용액 중 DMSO를 제거하기 위해서, 4℃, 300 g에서 7분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 그의 웰이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔(BD Bioscience 제조)로 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 배양 접시 상에 세포를 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하고, 14시간 동안 배양하였다(2차 계대배양 세포). 14시간 후, 배지를 제거하고, 웰당 500 ㎕의 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 10에 등가인 양으로 실시예 2에서 제조된 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다.
수립시키는데 사용된 2 ml의 각각의 배지를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 각 웰의 배지를, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4,Sox2, Klf4, c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액(최종 농도 4 ㎍/ml으로 폴리브렌이 첨가된 용액) 2 ml로 대체하고, 37℃에서 14시간 배양하였다. 바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하였다. 4개의 유전자를 도입한 후 경과 14일째 관찰하였을 때, 유도된 다능성 줄기 세포의 특징을 보이는 로트 060809B의 저혈청 조건군 중에서 하나의 전형적인 콜로니가 관찰되었다. 상기 콜로니는 주위의 세포보다도 현저히 더 작은 세포로 구성되어 있었다. 다능성 줄기 세포 유사 콜로니 이외에도 저혈청 군 및 고혈청 군, 둘 모두에서 다수의 콜로니가 관찰되었지만, 알칼리성 포스파타제에 의해서는 염색되지 않았다.
다능성 줄기 세포 유사 콜로니를 단리하기 위해 웰을 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 바닥이 실리콘 그리스로 도포된 클로닝 링(Iwaki 제조)에 의해서 콜로니를 포위하였다. 약 100 ㎕의 영장류 ES 세포용 분리 배지(ReproCELL 제조)를 상기 링에 첨가하고, 10 내지 20분 동안 37℃에서 배양하였다. 분리된 콜로니를 함유하는 링 중의 세포 현탁액을 2 ml의 MEF 조절된 ES 배지에 첨가하고, MEF로 코팅된 24웰 플레이트의 1개의 웰에 플레이팅하였다. 37℃에서 8 내지 14시간 동안 배양한 후, 배지를 교체하고, 이후 계속하여 매 2일마다 배지를 교체하고, 8일 후에 2차 계대배양을 수행하였다.
배지를 제거하고, 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 영장류 ES 세포용 분리 배지(ReproCELL 제조)를 첨가하고, 10분 동안 37℃에서 배양하고, 2 ml의 배지를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겨 200 g로 4℃에서 5분 동안 원심분리시켜 상청액을 제거하였다. 세포를 MEF 조절된 ES 배지에 재현탁시키고, MIF 코팅된 24웰 플레이트 중 4개의 웰에 플레이팅하였다. 계속하여 매 2일마다 배지를 교체하고, 2차 계대배양 후 7일이 경과하였을 때 세포를 알칼리성 포스파타제 염색을 하였는데, 클로닝된 콜로니 유래 세포는 청보라색으로 염색되었다.
추가로, 정량적 PCR에 의해 알칼리성 포스파타제 활성 양성의 다능성 줄기 세포의 콜로니가 Nanog 및 Tert를 발현하였음이 확인되었다. 실시예 4에서 수립된 중간엽 줄기 세포와 비교하였을 때, Nanog의 발현량은 약 30배 더 높았다. Tert의 발현은 중간엽 줄기 세포가 아닌, 상기 다능성 줄기 세포에서만 유일하게 주목되었다. 도 2는 4개의 유전자 도입 후 인간 성인 골수 유래 세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 저혈청 조건하에서 인간 성인 골수로부터 유래된 단핵 세포로부터 수립된 세포로 도입하였다. 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고, 정량적 PCR에 의해 인간 Nanog 및 인간 Tert 유전자의 발현을 입증하였다. 4개의 유전자가 도입되어 있지 않은 섬유아세포 및 중간엽 줄기 세포를 본 실험에서는 대조군으로서 사용하였다. 유전자 발현량은, 발현량을 인간 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자의 발현량에 의해 표준화하여, 신생아 피부 섬유아세포로부터 유도된 알칼리성 포스파타제(ALP) 양성 콜로니에 있어서의 HPRT 유전자 발현량을 1로 한 상대치로서 제공한다. Nanog 및 Tert의 발현은, 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)가 도입되고, ALP 양성 콜로니에서 현저히 높은 것으로 확인되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 4개의 유전자가 도입되었음에도 불구하고 콜로니를 형성하지 않는 세포에서는 Nanog 및 Tert가 발현되지 않았다.
상기로부터 인간 성인 골수 유래 세포를 사용한 경우, 다능성 줄기 세포를 저혈청 배양군으로부터는 수득하였지만, 고혈청 배양군(로트 060809B 및 로트 060470B)(표 2)로부터는 전혀 수득하지 못했다. 또한, 저혈청 조건하에서 배양하는 것이 미분화된 세포를 유지시키는데는 적합하였다.
실시예 6. 인간 신생아 피부에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 인간 다능성 줄기 세포의 유도
출생 직후의 인간 조직인 인간 신생아 조직으로부터 유래된 세포(상품명: 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포, 초대 배양)를 사용하여, 인간 신생아의 피부에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도를 시도하였다.
냉동시킨 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(초대 배양, Lonza 제조, 로트 5F0438)의 하나의 바이알을 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, 2% 소태아 혈청, 5 ㎍/ml 인슐린, 50 ㎍/ml 겐타마이신, 50 ng/ml 암포테리신-B를 함유하는 배지(FBM 배지, Lonza 제조)인 MCDB202 변형 배지에 현탁시켜 12 ml의 세포 현탁액을 수득하였다. 2 ml의 각 세포 현탁액을, 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔(BD Biosciences)로 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 배양 접시 상에 플레이팅하였다(2차 계대배양 세포).
14시간 후, 웰당 500 ㎕의 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 5에 등가인 양으로 실시예 2에서 제조된 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다. 각 웰에 2 ml의 FBM 배지를 각각 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 각 웰의 배지를, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액(최종 농도 4 ㎍/ml으로 폴리브렌이 첨가된 용액) 2 ml로 대체하고, 37℃에서 4시간 배양하였다.
바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하고, 4개의 유전자를 도입한 후 14일째 6웰 플레이트의 1개의 웰을 알칼리성 포스파타제로 염색하였다. 그 결과, 6개의 다능성 줄기 세포 유사 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니를 수득하였다. 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니는 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포보다도 현저히 더 작은 세포로 구성되어 있었다.
이어서, 정량적 PCR에 의해 알칼리성 포스파타제 활성 양성의 다능성 줄기 세포의 콜로니가 Nanog 및 Tert를 발현하였음이 확인되었다. 도 3은 4개의 유전자 도입 후의 신생아 섬유아세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 신생아 피부로부터 유래된 초대 배양 섬유아세포로 도입하고; 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고; 정량적 PCR에 의해 인간 Nanog 및 인간 Tert 유전자의 발현량을 측정하였다. 4개의 유전자가 도입되어 있지 않은 모체 섬유아세포 및 중간엽 줄기 세포를 본 실험에서는 대조군으로서 사용하였다. 유전자 발현은 도 2에 개요된 동일 방법을 사용함으로써 표준화하였다. Nanog 및 Tert의 발현은, 4개의 유전자가 도입되고, ALP 양성 콜로니에서 현저히 높은 것으로 확인되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 5의 고혈청(10%) 배양 조건하에서 수립된 중간엽 줄기 세포와 비교하였을 때, 4개의 유전자가 도입되기 이전의 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포는 Nanog를 발현하지 않은 반면, 4개의 유전자가 도입된 이후의 세포의 경우, 콜로니를 형성하지 않는 세포에서 9배 및 알칼리성 포스파타제 활성 양성 콜로니에서 Nanog 발현은 18배인 것이 관찰되었다(도 3). 한편, Tert 발현은 오직 알칼리성 포스파타제 활성 양성 콜로니에서만 주목되었다. 이로부터, 다능성 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제 활성이 양성이고, Nanog 양성 및 Tert 양성인 특징에 의해 정의될 수 있다. 또한, 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포는 다능성 줄기 세포의 유도 효율이 상대적으로 높고, 4개의 유전자 도입에 의해 Nanog를 발현할 수 있는 세포인 것으로 확인되었다.
다능성 줄기 세포의 콜로니를 하기와 같은 방식으로 단리하였다. 유전자 도입 후 17일째, 남은 웰로부터 특징적인 형상을 갖는 6개의 콜로니를 선택하였다. 웰을 행크 평형 염 용액으로 세척한 후, 바닥이 실리콘 그리스로 도포된 클로닝 링(Iwaki 제조)에 의해서 콜로니를 포위하였다. 100 ㎕의 영장류 ES 세포용 분리 배지(ReproCELL 제조)를 상기 링에 첨가하고, 20분 동안 37℃에서 배양하였다. 분리된 콜로니를 함유하는 링 중의 세포 현탁액을 2 ml의 MEF 조절된 ES 배지에 첨가하고, MEF로 코팅된 24웰 플레이트의 1개의 웰에 플레이팅하였다. 37℃에서 14시간 동안 배양한 후, 배지를 교체하고, 이후 계속하여 매 2일마다 배지를 교체하고, 8일 후에 2차 계대배양을 수행하였다. 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 영장류 ES 세포용 분리 배지(ReproCELL 제조)를 첨가하고, 10분 동안 37℃에서 배양하고, 2 ml의 배지를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겨 200 g로 4℃에서 5분 동안 원심분리시켜 상청액을 제거하였다. 세포를 MEF 조절된 ES 배지에 재현탁시키고, MIF 코팅된 24웰 플레이트 중 4개의 웰에 플레이팅하였다. 2차 계대배양 후 7일이 경과하였을 때, 하기 기술하는 계대배양 방법으로 세포를 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔로 코팅되어 있는 60 mm 플라스틱 배양 접시 상에 플레이팅하였다. 추가로 8일 후(4개의 유전자 도입 후 37일째), 3차 계대배양을 수행하고, 2개의 마트리겔로 코팅된 60 mm 플라스틱 배양 접시에 플레이팅하였는데, 이중 일부는 알칼리성 포스파타제 염색 및 RNA 추출에 사용되었다. 본 결과는 클로닝된 콜로니로부터 유래된 세포가 알칼리성 포스파타제 활성 양성이고, Nanog 및 Tert를 높은 비율로 발현함으로써 상기가 다능성 줄기 세포임을 지지하는 것임을 확인시켜 주었다.
유지 및 성장을 위해 유도된 다능성 줄기 세포를 매 5 내지 7일마다 계대배양하였다. 계대배양한 플라스틱 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 디스파제 또는 영장류 ES 세포용 분리 배지를 첨가하고, 37℃에서 5 내지 10분 동안 배양하였다. 절반 이상의 콜로니가 분리되었을 때, ES 배지를 첨가하여 반응을 정지시키고, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겼다. 콜로니가 상기 튜브 바닥에 침전되었을 때, 상청액을 제거하고, ES 배지를 첨가하여 콜로니를 재현탁시켰다. 콜로니의 크기를 검사한 후, 크기가 극도로 큰 임의의 콜로니가 있다면 천천히 피펫팅하여 적절한 크기로 분할시켰다. 적당한 크기가 된 콜로니를 계대배양 이전의 기저 면적의 약 3 내지 6배 정도되는 기저 면적을 갖는, 마트리겔로 코팅된 플라스틱 배양 접시에 플레이팅하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 로트 5F0438 이외의 로트(로트 5F0474) 중의 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포는 우수한 다능성 줄기 세포 유도를 나타내었다. 실시예 5와의 비교로부터, 어린 개체로부터 유래된 세포, 또는 배양 기간이 짧은 세포가 다능성 줄기 세포의 유도에 적합하다고 생각되었다.
상기 결과로부터, 미분화된 세포를 포함하는 인간 출생 후 조직인 인간 신생아 조직으로부터 유래된 세포를 사용하여 2% 혈청을 함유하는 배양 배지 중에서 2차 계대배양시켰을 때, 다능성 줄기 세포를 유도할 수 있었다.
실시예 7. 인간 성인 피부에 존재하는 미분화된 줄기 세포부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도
인간 성인 피부에 존재하는 미분화된 줄기 세포를 포함하는 인간 성인 조직 유래 세포(상품명: 성인 정상 인간 피부 섬유아세포, 초대 배양)를 사용하여 본 발명의 다능성 줄기 세포의 유도를 실시하였다.
냉동시킨 성인 정상 인간 피부 섬유아세포(초대 배양, Lonza 제조, 로트 6F3535: 28세, 여성, 백인, 로트 6F4026: 39세, 여성, 백인) 각각의 하나의 바이알을 각각 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, FBM 배지에 현탁시켜 12 ml의 세포 현탁액을 수득하였다. 2 ml의 각 세포 현탁액을, 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔로 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 배양 접시 상에 플레이팅하였다(2차 계대배양 세포).
14시간 후, 배지를 제거하고, 웰당 500 ㎕의 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 5에 등가인 양으로 실시예 2에서 제조된 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다. 각 웰에 2 ml의 FBM 배지를 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 각 웰의 배지를, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액 2 ml로 대체하고, 37℃에서 4시간 배양하였다. 바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하고, 4개의 유전자를 도입한 후 13일째 알칼리성 포스파타제로 염색하였다. 그 결과, 로트 6F3535로부터 웰당 2개의 다능성 줄기 세포 유사 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니를 수득한 반면, 로트 6F4242로부터는 어떤 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니도 수득하지 못했다(표 2).
실시예 6과의 비교로부터, 피부 섬유아세포 중 신생아 유래 세포는 다능성 줄기 세포의 유도 효율이 더 높았다. 또한, 성인 정상 인간 피부 섬유아세포 중 더 어린 기증자로부터 유래된 세포는 형질전환 효율이 더 높았다. 상기로부터 다능성 줄기 세포의 유도 효율은 연령 의존 방식으로 감소한다는 것이 입증되었다.
실시예 8. 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포를 사용한 3차 계대배양물의 조사
냉동 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(초대 배양, Lonza 제조, 로트 5F0439) 하나의 바이알을 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, FBM 배지에 현탁시키고, 2개의 100 mm 플라스틱 배양 접시 상에 플레이팅하였다(2차 계대배양). 70 내지 90% 융합될 때까지 6일 동안 배양한 후, 0.025% 트립신-EDTA 용액(Lonza 제조)을 사용하여 세포를 분리하고, 4℃에서 200 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 채취한 2차 계대배양 세포는 셀 뱅커를 사용하여 냉동 보관하였다.
냉동시킨 2차 계대배양 세포를 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, 12 ml의 FBM 배지에 현탁시키고, 4℃에서 200 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 현탁시키고, 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔로 코팅되어 있는 100 mm 플라스틱 배양 접시 상에 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하였다(3차 계대배양). 14시간 후, 배지를 제거하고, 2 ml의 the 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 5에 등가인 양으로 실시예 2에서 제조된 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다. 각 웰에 10 ml의 FBM 배지를 첨가하고, 37℃에서 배양하였다.
mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 배지를 제거하고, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4,Sox2, Klf4, c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액(최종 농도 4 ㎍/ml으로 폴리브렌이 첨가된 용액) 10 ml로 대체하고, 37℃에서 4시간 배양하였다. 바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하고, 4개의 유전자를 도입한 후 14일째, 알칼리성 포스파타제로 염색하였다. 그 결과, 5개의 다능성 줄기 세포 유사 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니를 수득하였다. 바닥 면적에 기초하여 환산한 바, 이는 6웰 플레이트의 웰당 0.83개의 콜로니를 수득하였음을 시사한다(표 2).
실시예 6과의 비교로부터, 배양 기간이 장기화됨에 따라 다능성 줄기 세포의 유도 효율이 감소된다는 것이 입증되었다.
실시예 9. 제대에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도(1)
출생 직후의 인간 조직인 인간 제대로부터 유래된 세포(상품명: 정상 인간 배꼽 정맥 내피 세포, 초대 배양)를 사용하여, 제대에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 본 발명의 인간 다능성 줄기 세포의 유도를 시도하였다.
냉동시킨 냉동 정상 인간 배꼽 정맥 내피 세포(초대 배양, Lonza 제조)의 하나의 바이알을 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, 론자(Lonza) 제조의 내피 세포 배지 키트-2(2% 혈청)(이하 EBM-2로 지칭됨)에 현탁시켜 12 ml의 세포 현탁액을 수득하였다. 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔로 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 배양 접시 상에 약 105/2 ml/웰의 각각의 세포 현탁액을 플레이팅하였다(2차 계대배양). 6시간 후, 배지를 제거하고, 웰당 500 ㎕의 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 5에 등가인 양으로 실시예 2에서 제조된 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다.
2.5 ml의 각각의 EBM-2 배지를 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 각 웰의 배지를, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액(최종 농도 4 ㎍/ml으로 폴리브렌이 첨가된 용액) 2 ml로 대체하고, 37℃에서 4시간 배양하였다. 바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하였다. 4개의 유전자를 도입한 후 12일째 콜로니가 확인되었다.
4개의 유전자를 도입한 후 13일째 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 유도된 콜로니가 염색되었다.
상기 결과로부터 미분화된 세포를 포함하는, 출생 직후의 인간 조직인 인간 제대로부터 유래된 세포를, 2% 혈청을 함유하는 배양 배지에서 2차 계대배양시켰을 때에는 다능성 줄기 세포를 유도할 수 있었다.
실시예 10. 제대에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도(2)
하기 기술하는 바와 같이, 출생 직후의 인간 조직인 인간 제대로부터 유래된 세포(상품명: 정상 인간 배꼽 동맥 평활근 세포, 3차 계대배양)을 사용하여, 제대에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 본 발명의 인간 다능성 줄기 세포의 유도를 시도하였다.
냉동시킨 정상 인간 배꼽 동맥 평활근 세포(3차 배양, Lonza 제조)의 하나의 바이알을 37℃ 인큐베이터에서 해동시키고, 론자 제조의 평활근 세포 배지 키트-2(5% 혈청)(이하 SmGM-2로 지칭됨)에 현탁시켜 12 ml의 세포 현탁액을 수득하였다. 바닥이 20 ㎍/㎠의 농도로 마트리겔(Becton Dickinson 제조)로 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 배양 접시(Becton Dickinson 제조) 상에 약 105/2 ml/웰의 각각의 세포 현탁액을 플레이팅하였다(4차 계대배양). 1일이 경과한 후, 배지를 제거하고, 웰당 500 ㎕의 행크 평형 염 용액 중 m.o.i. 1.25 내지 5에 등가인 양으로 mCAT1 아데노바이러스 벡터를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 감염시켰다. 2.5 ml의 각각의 SmGM-2 배지를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다.
mCAT-1 아데노바이러스 벡터를 도입한 후 48시간이 경과하였을 때, 각 웰의 배지를, 실시예 1에서 제조된 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)의 레트로바이러스 벡터 용액(최종 농도 5 ㎍/ml으로 폴리브렌이 첨가된 용액) 2 ml로 대체하고, 37℃에서 4시간 배양하였다. 바이러스 상청액을 제거하고, MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2일마다 MEF 조절된 ES 배지로 배지를 교체하였다. 4개의 유전자를 도입한 후 13일째 콜로니가 확인되었다. 그러나, 유도된 콜로니가 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 염색되지는 않았다.
상기 결과로부터 출생 직후의 인간 조직인 인간 제대로부터 유래된 세포가 제대에 존재하는 미분화된 세포를 포함하지만, 세포를 5% 혈청을 함유하는 배양 배지에서 4차 계대배양시켰을 때에는 다능성 줄기 세포를 유도하는 것인 더욱 난해한 것으로 밝혀졌다.
실시예 11. 마우스 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터 마우스 다능성 줄기 세포의 유도
마우스 출생 후 조직인 마우스 골수 유래 세포를 사용하여, 마우스 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 본 발명의 다능성 줄기 세포의 유도를 시도하였다.
임의의 어떤 조직도 들어가지 않도록 최대한 주의를 기울여 4 내지 6주령된 마우스(c57BL/6N 계통, 4주령, 암컷)로부터 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 채취한 뼈를 70% 에탄올에 단시간 침지시켜 뼈 바깥쪽에 부착된 세포를 사멸시킴으로써 골수 이외의 세포로 오염되지 않도록 하였다. 에탄올 처리후, 뼈를 즉시이스코브 변형 둘베코 배지(SIGMA)로 옮겨 골수 내부의 세포의 영향을 막았다. 각각의 뼈 바깥쪽을 김와이프(Kimwipe)로 닦어 결합조직을 제거하였다. IMDM을 포함하는 모르타르로 처리가 끝난 뼈를 전부 옮겨, 막자로 두드려 분쇄하였다. IMDM으로 수회에 걸쳐 세척한 후, 뼈를 가위로 세단하였다. 추가로 IMDM으로 수회에 걸쳐 세척한 후, 뼈 절편을 원심분리 튜브로 옮겼다.
IMDM을 제거한 후에, 마우스 5마리의 뼈 절편당, 0.2% 콜라게나제 I를 함유하는 10 ml의 IMDM을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 진탕시킨 후, 피펫맨(Pipetman)을 사용하여 현탁액을 수회에 걸쳐 교반한 후, 상청액을 별도의 튜브에 옮겨 동량의 냉 10% FBS 함유 IMDM을 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 효소 처리 후, 뼈편(부재)을, 냉 10% FBS 함유 IMDM을 포함하는 모르타르로 옮기고, 재차 막자로 두드려 분쇄한 후, 수회에 걸쳐 교반한 후, 상청액을 채취하였다. 그렇게 채취한 세포 현탁액을, 순차적으로 직경이 70 ㎛ 및 40 ㎛인 나일론 메쉬를 통해 통과시켜 여과하였다. 세포 현탁액을 4℃ 600 g에서 7분 동안 원심분리하여, 마우스 골수 심부로부터 유래된 세포를 채취하였다.
마우스 골수 심부로부터 유래된 세포를 MAPC 배지에 현탁시키고, 105개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하였다. 세포의 플레이팅을 위해서는 10 ng/ml 피브로넥틴(Becton Dickinson)을 함유하는 포스페이트 완충액으로 미리 코팅된 접시를 사용하였다. 사용시 성장 인자[10 ng/ml PDGF-BB(Peprotech 제조), 10 ng/ml EGF(Peprotech 제조), 1000 유니트/ml LIF(Chemicon 제조)]를 배지에 첨가하였다. 플레이팅으로부터 3일 이 경과하였을 때, 배지 교체는 하지 않고 성장 인자만을 첨가하였다. 6일 후, 포스페이트 완충액으로 비부착성 세포를 씻어 버리고, 0.05% 트립신-EDTA 용액(Invitrogen 제조)으로 부착성 세포를 분리시켜 채취하고 셀 뱅커(Juji Field 제조)를 사용하여 초대 배양물로서 세포를 냉동 보관하였다.
냉동 보관한 초대 배양 세포를 37℃ 수조에서 해동시키고, 2% FBS를 함유하는 배지인 MAPC 배지 10 ml에 현탁시켰다. 냉동 용액 중의 DMSO를 제거하기 위해서 4℃, 300 g에서 7분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 수득한 세포 덩어리를 재현탁시키고, 바닥이 0.1% 젤라틴/포스페이트 완충액으로 젤라틴 코팅된 12웰 플라스틱 플레이트 상에 2.5 x 103개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하고, 2 ml의 각각의 MAPC 배지를 첨가하였다(2차 계대배양).
8 내지 14시간 후, 배지를 제거하고, 이에 실시예 1에서와 같이 제조된 4개의 유전자 레트로바이러스 벡터 용액 각 2 ml씩을 첨가하고, 37℃에서 4 내지 14시간 동안 ㅐ양하였다. 이어서, 바이러스 용액을 제거하고, 마우스 ES 배지[최종 농도 0.3% FBS(Invitrogen 제조), 1000 유니트/ml LIF(Chemicon 제조) 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올이 첨가된 ES 배지]로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하고, 4개의 유전자를 도입한 후 5 내지 7일이 경과하였을 때, 상기 다능성 줄기 세포는, 마우스 ES 세포 유사 소형 세포를 포함하는 콜로니를 형성하였다. 유도된 다능성 줄기 세포의 콜로니는 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 청보라색으로 염색되었다.
12웰 플레이트의 나머지의 웰로부터 마우스 다능성 줄기 세포를 계대배양하고, 젤라틴으로 코팅된 100 mm 플레이트에 계대배양을 계속하였다. 7차 계대배양 세포로부터 RN이지 미니 키트(RNeasy mini kit)(QIAGEN 제조)를 사용하여 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. cDNA를 사용하여 정량적 PCR을 수행함으로써 Nanog의 발현을 확인하였다.
7차 계대배양의 마우스 다능성 줄기 세포를, 동계통의 C57BL/6N 마우스 3마리의 등 피하에 마우스 1마리당 3 x 105개의 세포로 이식하고, 38일 후, 형성된 테라토마를 적출하였다. 테라토마는 마우스 3마리 모두에서 형성되었다. 적출된 테라트마로부터 절편을 제작하고, 3배엽층으로의 분화능을 면역염색 및 조직염색(HE 염색, 알시안 블루 염색)으로 분석하였다. 그 결과, 외배엽계로서 MAP2 양성의 세포(신경계), GFAP 양성의 세포(신경계), 중배엽계로서는 골격근 세포(근육세포), 연골 조직, 내배엽계로서는 장관 조직이 관찰되었다.
마우스 다능성 줄기 세포를 유지 및 성장시키기 위해서 매 3 내지 4일마다 계대배양하였다. 계대배양을 수행한 플라스틱 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 포스페이트 완충액으로 세척하고, 0.05% 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 세포가 분리되었을 때, ES 배지를 첨가하여 반응을 정지시키고, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겼다. 200 g에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고, 마우스 ES 배지 중에 침전물을 현탁시킨 후, 세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 104개의 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하였다. 동일한 계대배양 방법으로 저혈청에서 배양된 마우스 골수 유래 세포로부터 유도된 다능성 줄기 세포를 장시간 동안 배양하였다.
상기 기술한 바와 같이, 다능성 줄기 세포는 저혈청 조건하에서 수립된 출생 후 마우스 골수 유래 세포로부터 유도되었다.
실시예 12. 3개의 유전자 도입과 히스톤 데아세틸라제 저해제 처리에 의한 마우스 다능성 줄기 세포의 유도
마우스 출생 후 조직인 마우스 골수로부터 유래된 세포를 사용하여 3개의 유전자 도입과 히스톤 데아세틸라제 저해제 처리에 의한 다능성 줄기 세포의 유도를 수행하였다.
실시예 11과 유사한 방식으로 제조된 후 냉동 보관된, 미분화된 줄기 세포를 포함하는 마우스 골수로부터 유래된 초대 배양 세포를 바닥이 0.1% 젤라틴/포스페이트 완충액으로 젤라틴 코팅되어 있는 24웰 플라스틱 플레이트(Becton Dickinson 제조) 상에 5 x 103개의 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하고, MAPC 배지를 각 2 ml씩 첨가하였다.
8시간 후, 배지를 제거하고, 실시예 1에서와 같이 제조된 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터 용액을 각 2 ml씩 첨가하고, 추가로, 히스톤 데아세틸라제 저해제인 MS-275를 최종 농도 1 또는 0.1 μM을 첨가한 후, 37℃에서 14시간 동안 배양하였다. 이어서, 바이러스 용액을 제거한 후, 히스톤 데아세틸라제 저해제인 MS-275를 최종 농도 1 또는 0.1 μM로 함유하는 MAPC 배지를 각 2 ml씩 첨가하였다. 3일 후, 마우스 ES 배지[사용시에 최종 농도 0.3% FBS(Invitrogen 제조), 1000 유니트/ml LIF(Chemicon 제조) 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올을 ES 배지에 첨가하였다]로 대체하였다.
계속하여 매 2 내지 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하였다. 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터를 도입한 후 12일이 경과하였을 때, 세포를 24웰 플라스틱 플레이트의 각 웰로부터 6웰 플라스틱 플레이트의 각 웰로 계대배양하였다. 또한, 그 중 일부는24웰 플라스틱 플레이트에서 배양하였다. 상기 3개의 유전자 도입 및 MS-275 처리 후 15일이 경과하였을 때, 다능성 줄기 세포는 마우스 ES 세포 유사 소형 세포로 이루어진 콜로니를 형성하였다. 상기 다능성 줄기 세포의 콜로니는 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 청보라색으로 염색되었다.
이어서, 정량적 PCR에 의해 Nanog 유전자의 발현량을 측정하고, 이어서, 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는 다능성 줄기 세포의 콜로니의 마우스 Nanog 발현을 확인하였다(도 4). 도 4는 3개의 유전자 도입 및 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 처리 이후 마우스 성체 골수 유래 세포에서의 Nanog 및 Tert 유전자의 상대적인 발현을 나타낸다. 3개의 유전자(Oct3/4, Sox2 및 Klf4)를 저혈청 조건하에서 수립된 마우스 골수 유래 세포에 도입하였다. 또한, 세포를 HDAC 저해제인 MS-275(0.1 또는 1.0 μM)로 처리하였다. 수득한 콜로니로부터 RNA를 추출하고, 정량적 PCR에 의해 Nanog 발현량을 측정하였다. 3개의 유전자가 도입되고, 히스톤 데아세틸라제 저해제로 처리된 세포로부터 ALP 양성의 세포군(콜로니)이 형성되었고, 이들 콜로니에서의 Nanog 발현이 ALP 음성 콜로니에서보다 현저히 높은 것으로 확인되었다. 본 도면에서, W1, W2, W3, W4, W5 및 W6은 실시예 12에서 사용된 6웰 플레이트의 각 웰 번호를 나타낸다.
상기 3개의 유전자 도입 및 MS-275 처리 후 18일이 경과하였을 때, 다능성 줄기 세포를 6웰 플레이트의 각 웰로부터 젤라틴으로 코팅된 100 mm 플레이트로 계대배양하였다. 계속하여 유사한 방식으로 계대배양하였다.
상기 3개의 유전자 도입 및 MS-275 처리 후 29일이 경과하였을 때, 마우스 다능성 줄기 세포를, 동계통의 C57BL/6N 마우스의 등 피하에 마우스 1마리당 2 x 107개의 세포로 이식하고, 34일 후, 형성된 테라토마를 적출하였다. 적출된 테라트마로부터 절편을 제작하고, 3배엽층으로의 분화능을 면역염색 및 조직염색(HE 염색, 알시안 블루 염색)으로 분석하였다. 그 결과, 외배엽계로서 GFAP 양성의 세포(신경계) 및 케라틴 생산 세포(피부 세포), 중배엽계로서는 평활근 액틴 양성의 세포(평활근 세포), 뼈 조직 및 연골 조직 및 내배엽계로서는 장관 조직(MUC-1 양성의 내배엽 상피)이 관찰되었다.
실시예 13. 3개의 유전자 도입에 의한 마우스 다능성 줄기 세포의 유도
이어서, 마우스 출생 후 조직인 마우스 골수로부터 유래된 세포를 사용하여 3개의 유전자 도입에 의한 마우스 다능성 줄기 세포의 유도를 수행하였다.
실시예 11에서 제조된 후 냉동 보관된, 미분화된 줄기 세포를 포함하는 마우스 골수로부터 유래된 초대 배양 세포를 바닥이 0.1% 젤라틴/포스페이트 완충액으로 젤라틴 코팅되어 있는 24웰 플라스틱 플레이트(Becton Dickinson 제조) 상에 1 x 104개의 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하고, MAPC 배지를 각 2 ml씩 첨가하였다.
2일 후, 배지를 제거하고, 실시예 1에서와 같이 제조된 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터 용액을 각 2 ml씩 첨가하고, 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 바이러스 용액을 제거하고, MAPC 배지를 각 2 ml씩 첨가하였다. 3일 후, 배지를 마우스 ES 배지[사용시에 최종 농도 0.3% FBS(Invitrogen 제조), 1000 유니트/ml LIF(Chemicon 제조) 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올을 ES 배지에 첨가하였다]로 대체하였다. 이어서, 계속하여 매 2 내지 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하였다. 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터를 도입한 후 11일이 경과하였을 때, 세포를 24웰 플라스틱 플레이트의 각 웰로부터 6웰 플라스틱 플레이트의 각 웰로 계대배양하였다.
이어서, 계속하여 매 2 내지 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하였다. 상기 3개의 유전자 도입 후 19일이 경과하였을 때, 다능성 줄기 세포는 마우스 ES 세포 유사 소형 세포로 이루어진 콜로니를 형성하였다. 알칼리성 포스파타제 활성을 확인하기 위해, 배지를 제거하고, 10% 포르말린 중성 완충 용액을 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 고정시켰다. 포스페이트 완충액 등으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제의 발색 기질을 포함하는 1 단계 NBT/BCIP 용액(Pierce 제조)을 첨가하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 반응시켰다. 상기 다능성 줄기 세포의 콜로니는 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 청보라색으로 염색되었다.
이어서, 정량적 PCR에 의해 Nanog 유전자의 발현량을 확인하고, 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는 다능성 줄기 세포의 콜로니의 마우스 Nanog 발현을 확인하였다.
마우스 출생 후 조직인 마우스 골수로부터 유래된 세포를 사용하여 3개의 유전자 도입에 의한 다능성 줄기 세포의 유도를 수행하였다.
실시예 11에서 제조된 후 냉동 보관된, 미분화된 줄기 세포를 포함하는 마우스 골수로부터 유래된 초대 배양 세포를 바닥이 0.1% 젤라틴/포스페이트 완충액으로 젤라틴 코팅되어 있는 6웰 플라스틱 플레이트(Becton Dickinson 제조) 상에 1 x 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하고, MAPC 배지를 각 2 ml씩 첨가하였다.
2일 후, 배지를 제거하고, 실시예 1에서와 같이 제조된 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터 용액을 2 ml씩 첨가하고, 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 바이러스 용액을 제거하고, MAPC 배지를 2 ml씩 첨가하였다. 3일 후, 배지를 마우스 ES 배지[사용시에 최종 농도 0.3% FBS(Invitrogen 제조), 1000 유니트/ml LIF(Chemicon 제조) 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올을 ES 배지에 첨가하였다]로 대체하였다. 계속하여 매 2 내지 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하였다. 3개의 유전자(인간 Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 레트로바이러스 벡터를 도입한 후 9일이 경과하였을 때, 세포를 6웰 플라스틱 플레이트의 각 웰로부터 10 cm 플라스틱 접시의 각 웰로 계대배양하였다.
계속하여 매 2 내지 3일마다 마우스 ES 배지로 배지를 교체하였다. 상기 3개의 유전자 도입 후 7일이 경과하였을 때, 다능성 줄기 세포는 마우스 ES 세포 유사 소형 세포로 이루어진 콜로니를 형성하였다. 알칼리성 포스파타제 활성을 확인하기 위해, 배지를 제거하고, 10% 포르말린 중성 완충 용액을 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 고정시켰다. 포스페이트 완충액 등으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제의 발색 기질을 포함하는 1 단계 NBT/BCIP 용액(Pierce 제조)을 첨가하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 반응시켰다. 상기 다능성 줄기 세포의 콜로니는 알칼리성 포스파타제 활성에 의해 청보라색으로 염색되었다.
이어서, 정량적 PCR에 의해 Nanog 유전자의 발현량을 확인하고, 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는 다능성 줄기 세포의 콜로니의 마우스 Nanog 발현을 확인하였다.
상기 3개의 유전자 도입 후 49일이 경과하였을 때, 마우스 다능성 줄기 세포를, 동계통의 C57BL/6N 마우스의 등 피하에 마우스 1마리당 2 x 107개의 세포로 이식하고, 13 내지 17일 후, 형성된 테라토마를 적출하였다. 적출된 테라트마로부터 절편을 제작하고, 3배엽층으로의 분화능을 면역염색 및 조직염색(HE 염색, 알시안 블루 염색)으로 분석하였다. 그 결과, 외배엽계로서 GFAP 양성의 세포(신경계) 및 케라틴 생산 세포, 중배엽계로서는 평활근 액틴 양성의 세포(평활근 세포), 뼈 조직 및 연골 조직 및 내배엽계로서는 장관 조직(MUC-1 양성의 내배엽 상피)이 관찰되었다.
유사하게, 상기 3개의 유전자 도입한 후, FACS Aria를 통해 GFP 및 SSEA-1에 양성인 것에 기초하여 단일 분류된 마우스 다능성 줄기 세포를, 동계통의 C57BL/6N 마우스의 등 피하에 마우스 1마리당 2 x 107개의 세포로 이식하고, 13 내지 14일 후, 형성된 테라토마를 적출하였다. 적출된 테라트마로부터 절편을 제작하고, 3배엽층으로의 분화능을 면역염색 및 조직염색(HE 염색, 알시안 블루 염색)으로 분석하였다. 그 결과, 외배엽계로서 GFAP, 네스틴 또는 뉴로필라멘트(Neurofilament) 및 중배엽계로서는 연골 조직 및 내배엽계로서는 장관 조직(MUC-1 양성의 내배엽 상피)이 관찰되었다.
상기 결과로부터, 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포에서 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 각 3개의 유전자를 강제 발현시킴으로써 다능성 줄기 세포를 수득하였다. 다능성 줄기 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내었고, ES 세포 마커 발현, Nanog 발현 및 알칼리성 포스파타제 활성 및 조직 유도체의 3배엽층(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 모두로부터의 분화능이 존재하였다.
실시예 14. 인간 유도된 다능성 줄기 세포의 장기간의 확장 및 특징 규명
실시예 6에서 인간 신생아 피부 섬유아세포(로트 번호 5F0438)로부터 생성된 인간 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포주(iPS-1-8로 명명됨)을 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이, 클로닝 실린더 및 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 추가로 서브클로닝하였다. 인간 iPS-1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7,1-8 및 1-9로 명명되는 9개의 서브클론을 수득하였다. 인간 iPS-1-8 클론으로 명명되는 9개의 서브클론 중 하나를, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 10 ng/ml bFGF로 보충된 인간 ES 배지 중 MEF 영양 세포 상에서 또는 마트리겔(BD Biosciences)로 코팅된 배양 접시 상의 mTeSR1 한정 배지(Stem cell Techologies) 중 MEF 영양 세포 상에서 성공적으로 확장시켰다. 인간 iPS-1-8 클론 배양물을 위해 매일 배지를 교체하고, 보통 5 내지 20 μM의 Y-27632(Calbiochem)로 처리하여 계대 절차에 의해 유발되는 세포 아포프토시스를 막았다. 계속적으로 배양하기 위해 계대하는 경우, 인간 유도된 다능성 줄기 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 37℃에서 3분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 인큐베이션시키고, 배양 배지에 첨가하여 트립신 활성을 정지시켰다. 인간 유도된 다능성 줄기 세포를 300 x g에서 실온 또는 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 침전된 인간 유도된 다능성 줄기 세포를 배양 배지에 재현탁시켰다. 다능성 줄기 세포는 보통 1:4 내지 1:6의 분할비를 사용하여 새로운 배양 접시로 분할하였다. 인간 iPS-1-8 클론은 ES 세포용 세포 냉동 용액(Reprocell)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 냉동시켰다.
미토마이신-C로 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 상에서 배양되었을 때 인간 iPS-1-8 클론은, 작은 라운드형의 조밀 세포로 구성된, 가장자리가 분명한 전형적인 인간 ES 세포 콜로니와는 형태상으로 식별할 수 없었다(도 5). 도 5는 인간 iPS 클론 1-8의 특징을 규명한 것이다. 그의 모체 섬유아세포(로트 5F0438)의 형태는 패널 a에 제시되어 있고; 뮤린 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포 상에서 배양된 인간 iPS 클론 1-8 세포의 형태는 패널 b에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 인간 iPS 클론 1-8 세포의 형태는 패널 c에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 클론 2-4 세포는 패널 d에 제시되어 있고; mTeSR1 배지 중의 클론 3-2 세포는 패널 e에 제시되어 있다. 클론 1-8의 성장 곡선은 패널 f 및 g에 제시되어 있다. 화살표는 검사일을 나타낸다. 사각형으로 표시한 것은 세포 증식율을 예측하기 위해 세포 갯수를 계수한 기간을 나타낸다. 패널 h는 101일째 iPS 클론 1-8 유래 세포의 정상 핵형을 나타낸, 다색 핵도 영상이다.
인간 iPS-1-8 클론은 mTeSR1 배지 중에서 활발하게 증식하였다. mTeSR1 배지 중에서 배양된 인간 iPS-1-8 클론 유래의 세포를 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로 명명하였다. 인간 iPS-1-8 클론은 30회 넘게 계대될 수 있고, 4배 감염 이후 반년 넘게 배양될 수 있었다(도 5f, g). 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포는 액체 질소 중에 보관될 수 있고, 5 내지 20 μM의 Y-27632의 존재하에 mTeSR 배지 중에서 재배양될 수 있다. 4배 감염 이후 123일째 내지 148일째인, 계대 19 내지 26 사이에서 분석하였을 때, 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포 군집의 배가 시간은 대략적으로 48.5시간이었다.
김자 염색 및 다색 FISH 분석을 사용하여 장기간 배양된 인간 iPS-1-8 클론(1-8mTeSR)의 핵형 분석을 실시하였다. 인간 iPS 세포를 2시간 동안 0.02 ㎍/ml 콜세미드로 전처리한 후, 20분 동안 0.075 M KCl과 함께 인큐베이션시키고, 카노이 고정액으로 고정시켰다. 다색 FISH 분석을 위해 세포를 다색 FISH 프로브(Cambio)와 하이브리드화시키고, DMRA2 형광 현미경(Leica)으로 분석하였다. 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포는 mTeSR(68%)에서 장기간 배양된 후, 대부분 어떤 염색체 전위 또는 결실도 없이 정상 핵형(46XY)을 유지하였다(도 5h, 표 3).
알칼리성 포스파타제 염색을 위해 세포를 10% 포르말린 중성 완충 용액(Wako)을 사용하여 5분 동안 실온에서 고정시키고, PBS로 세척하고, 알칼리성 포스파타제 기질인, 1단계 NBT/BCEP(Pierce)와 함께 20-30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 알칼리성 포스파타제 활성을 갖는 세포는 청보라색으로 염색되었다. 면역 세포 화학물질의 경우, 배양된 세포를 10분 동안 10% 포름알데히드로 고정시키고, 1시간 동안 실온에서 0.1% 젤라틴/PBS로 차단하였다. 세포를 SSEA-3(MC-631; Chemicon), SSEA-4(MC813-70; Chemicon), TRA-1-60(ab16288; abeam), TRA-1-81(ab16289; abeam), CD9(M-L13; R&D systems), CD24(ALB9; abeam), Thy1(5E10; BD Bioscience), 또는 Nanog(MAB 1997; R&D Systems)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. Nanog 염색을 위해서는 차단에 앞서 0.1% 트리톤 X-100/PBS를 사용하여 세포를 투과시켰다. 세포를 PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, AlexaFluor 488에 접합된 2차 항체(Molecular Probes) 및 훽스트 33258과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 추가로 세척한 후에 형광성은 악시오버트 200M 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 검출하였다
인간 iPS-1-8 mTeSR 세포는 알칼리성 포스파타제(이하, "ALP"로 지칭됨) 활성 및 당질 항원 SSEA-3 및 SSEA-4, 황산케라틴 항원 TRA-1-60 및 TRA-1-81 및 단백질 항원 CD9, CD24, Thy-1(CD90) 염색에 대해 양성이었다(도 6). 도 6은 인간 iPS 클론 1-8에서 전사 인자, 세포 표면 항원 및 ALP 활성의 특징을 규명한 것이다. 인간 iPS 세포(클론 1-8)는 Nanog(패널 a), SSEA-3(패널 b), SSEA-4(패널 c), TRA-1-60(패널 d), TRA-1-81(패널 e), CD9(패널 f), CD24(패널 g), Thy-1(CD90으로도 명명된)(패널 h)에 대해 염색되었다. 녹색 형광 염색은 인간 iPS 클론 1-8이 이들 표면 항원들 모두를 발현한다는 것을 시사한다. ALP 염색은 iPS 클론 1-8이 ALP 양성이라는 것을 시사한다. 화살표는 녹색 형광 염색 부위를 나타낸다.
인간 iPS-1-8 클론, 그의 모체 섬유아세포 및 유전자 형질도입 이후 17일째 수득한 조 섬유아세포로부터 RN이지(Qiagen)을 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. 슈퍼스크립트 III(Superscript III)(Invitrogen)에 의해 cDNA를 합성하였다. Extaq(Takara)를 사용하여 PCR에 의해 유전자 발현을 검출하였다. 프라이머의 서열은 표 4에 기술되어 있다. "외인성" 프라이머 세트는 선택적으로 외인성 발현을 검출하고, "전체" 프라이머 세트는 내인성 발현을 검출하였다.
인간 iPS-1-8 클론은 인간 ES 마커 유전자 Nanog, TERT, Sal14, Zfp42, GDF3, Dnmt3b, TDGF1, GABRB3 및 CYP26A1을 발현한 반면, 모체 섬유아세포는 상기 마커 유전자 중 어느 것도 발현하지 못했다(도 7a). 조 섬유아세포와는 달리, 인간 iPS-1-8 클론은 4개의 유전자, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 강제 발현을 하향 조절하였다(도 7b). 도 7은 인간 iPS 클론 1-8 세포의 유전자 발현에 관한 RT-PCR을 나타낸다. 패널 a는 클론 1-8 및 그의 모체 섬유아세포(NeoFB)에서의 hES 마커 유전자 발현에 관한 RT-PCR을 도시한다. CYP26A1(35회 반복)을 제외한 유전자들은 30회 반복으로 검출되었다. 패널 b는 클론 1-8에서 4개의 트랜스유전자의 침묵화를 도시한다. 유전자 형질도입 후 17일째 수득한 조 섬유아세포를 대조군으로서 사용하였다. "외인성" 프라이머 세트는 외인성 유전자의 발현을 선택적으로 검출하고; "전체" 프라이머 세트는 내인성 및 외인성 유전자 발현, 둘 모두를 검출하였다.
마트리겔 상의 mTeSR1(1-8 mTeSR) 및 마트리겔 상의 MEF 조절된 배지(1-8CM), 둘 모두에서 배양된 인간 iPS 세포 및 그의 모체 섬유아세포(5F0438)의 전체 유전자 발현에 관하여 분석하였다. 마이크로어레이 연구는 애피메트릭스(Affymetrix) 인간 게놈 U133 플러스 2.0 마이크로어레이(캘리포니아주 산타클라라 소재의 Affymetrix)를 사용하여 수행하였다. 유전자칩(GeneChip)® 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이는 단일 어레이 상에 전사된 인간 게놈을 포괄적으로 포함하며, 특징이 잘 규명되어 있는 38,500개의 인간 유전자를 비롯한, 47,000개가 넘은 전사체 및 변이체의 발현 수준을 분석한다. 간략하면, RNA이지(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 애피메트릭스 기법 프로토콜에 따라 1 ㎍의 전체 RNA로부터 비오틴으로 표지된 cRNA를 역전사시켰다. 15 ㎍의 cRNA를 단편화시키고, 45℃에서 16시간 동안 애피메트릭스 U133 플러스 2 유전자칩 어레이에 하이브리드화시키고, 세척하고, 애피메트릭스 플루이딕스(Affimetrix Fluidics)(Affimetrix)를 사용하여 염색하였다. 분석을 애피메트릭스 GCS3000 스캐너로 스캐닝하고, 수득한 영상은 GCOS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 본 실험 및 GEO로부터 얻은 데이타를 진스프링(GeneSpring) 7.3.1. 소프트웨어로 조사하였다.
산점도 분석을 위해 마트리겔 상의 마트리겔에서 배양된 인간 유도된 다능성 줄기 세포 클론 1-8(1-8mTeSR) 및 그의 모체 섬유아세포(5F0438)를, 비교 목적으로 대표적으로 사용하는 인간 ES 세포인 클론 1-8과 H14 hES 세포주(GEO로부터의 데이타)(GSM151741), 둘 모두에 대한 해당 플래그 판정값(P<0.04) 또는 한계 플래그 판정값(0.04≤P<0.06)을 갖는 21,080개의 유전자 세트에 기초하여 분석하였다. 도 8은 인간 iPS 클론 1-8 세포의 전체 유전자 발현에 관한 산점도 분석을 나타낸다. 산점도는 mTeSR1에서 배양된 인간 iPS 클론 1-8 세포와 MEF를 포함하는 H14 hES 세포(공개 데이타베이스 GEO로부터의 GSM151741) 사이의 전체 유전자 발현에 관한 비교(패널 a), 또는 클론 1-8과 그의 모체 섬유아세포 사이의 전체 유전자 발현에 관한 비교(패널 b)를 나타낸다. 산점도 둘 모두에서 ES 세포 특이 유전자의 기호는 선으로 표시하였다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다. 화살표는 색상을 띤 대표적인 부분을 나타낸다.
군집 분석을 위해 mTeSR1에서 배양된 클론 1-8(1-8mTeSR), MEF 조절된 배지에서 배양된 클론 1-8(1-8CM) 및 그의 모체 섬유아세포(5F0438)에 대한 DNA 마이크로어레이 데이타를 MEF 상에서 배양된 Sheff4 세포주(hES1 :GSM194307, hES2: GSM194308, hES3: GSM194309), 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 세포주(hES4: GSM194313, hES5: GSM194314), MEF 상에서 배양된 H14 세포주(hES6: GSM151739, hES7: GSM151741) 및 3개의 섬유아세포(섬유아세포 1의 경우, GSM96262, 섬유아세포 2의 경우, GSM96263 및 섬유아세포 3의 경우, GSM96264)에 대한 DNA 마이크로어레이 데이타와 비교하였다.
인간 iPS 세포주(1-8, 2-4 및 3-2) 및 그의 모체 섬유아세포의 전체 유전자 발현 프로파일을 마이크로어레이 기술을 사용하여 분석하였다. 국제 줄기 세포 법안(International Stem Cell Initiative)(표 21 참조)에 의해 정의된 유전자 세트를 사용한 계층적 군집 분석을 통해, 인간 iPS 세포주(1-8, 2-4 및 3-2)는 인간 ES 세포주와 함께 군집화되지만, 그의 모체 피부 유래의 세포와는 나뉘어진다는 것이 밝혀졌다(도 9). 도 9는 상이한 세포주의 전체 유전자 발현과 전체 유전자 발현 분석에 기초한 유전자 수형도를 나타낸다. 국제 줄기 세포 법안(표 21 참조)에 의해 확인된 유전자 세트에 기초하여 세포를 유전자 수형도로 군집화하였다. 시료는 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR"; MEF 조절된 배지에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8CM"; 냉동 해동 처리 후에 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR(f&t)"; MEF에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8MEF"; mTeSR에서 배양된 클론 2-4의 경우, "2-4 mTeSr"; MEF 배지에서 배양된 클론 2-4의 경우, "2-4MEF"; mTeSR에서 배양된 클론 3-2의 경우, "3-2mTeSR"; 모체 섬유아세포의 경우, "5F0438" 또는 "5F0416"; MEF에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES1," "hES2," "hES3"(각각 GSM 194307, GSM 194308, GSM 194309); 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES4," 또는 "hES5"(각각 GSM 194313, GSM 194314); MEF 상에서 배양된 H14 세포주의 경우, "hES6," 또는 "hES7"(GSM151739, GSM151741); 각각 GSM96262의 경우, "섬유아세포 1"; GSM96263의 경우, "섬유아세포 2" 및 GSM96264의 경우, "섬유아세포 3"으로 명시한다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다.
인간 ES 세포주 sheff4와 H14 사이의 피어슨 상관관계 계수는 0.675였고, 인간 iPS 세포주 1-8과 인간 ES 세포주 H14 사이의 피어슨 상관관계 계수는 0.835였다(도 9). iPS 세포주 1-8, 2-4 및 3-2와 hES 세포주의 전체 유전자 발현 프로파일 사이에서도 유사한 피어슨 상관관계 계수가 관찰되었다. 본 분석은 인간 iPS 세포주 1-8이 인간 ES 세포주 H14와 유사한 유전자 발현 패턴을 갖고 있음을 시사한다.
인간 iPS 세포주(클론 1-8)와 인간 ES 세포주 H14 사이의 산점도 분석은 인간 ES 세포 마커 유전자인 Nanog, Oct3/4, TDGF1, Dnmt3b, GABRB3, GDF3, Zfp42, ALP, CD9 및 Thy-1이 인간 iPS 세포주와 인간 ES 세포주 H14 사이에 높은 상관관계가 있음을 나타내었다(도 8a). 대조적으로, 클론 1-8은 모체 신생아 섬유아세포와는 상이하였다(도 8b). 이는 Nanog 관련 유전자를 사용한 군집 분석에 의해 확인하였다. 인간 iPS 세포주 1-8과 인간 ES 세포주 H14 사이의 피어슨 상관관계 계수는 0.908이고, 인간 iPS 세포주 1-8과 그의 모체 섬유아세포 사이의 피어슨 상관관계 계수는 0.100이었다(도 10). 도 10은 상이한 세포주의 전체 유전자 발현과 전체 유전자 발현 분석에 기초한 유전자 수형도를 나타낸다. 섬유아세포(3개의 GEO 데이타)와 비교하였을 때 0.99 내지 1 사이의 비율로 인간 ES 세포(7개의 GEO 데이타)에서의 Nanog 유전자 발현과 상관관계에 있는 유전자 세트에 기초하여 세포를 유전자 수형도로 군집화하였다. 시료는 mTeSR에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8mTeSR," MEF 조절된 배지에서 배양된 클론 1-8의 경우, "1-8CM," 모체 섬유아세포의 경우, "5F0438," MEF에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES1," "hES2," "hES3"(각각 GSM 194307, GSM 194308, GSM 194309); 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 세포주의 경우, "hES4," 또는 "hES5"(각각 GSM 194313, GSM 194314); MEF 상에서 배양된 H14 세포주의 경우, "hES6," "hES7"(GSM151739, GSM151741); 각각 GSM96262의 경우, "섬유아세포 1"; GSM96263의 경우, "섬유아세포 2" 및 GSM96264의 경우, "섬유아세포 3"으로 명시한다. 발현 강도는 적색(상단)부터 녹색(하단)까지의 비색 순서로 나타내었다. 1-8, 2-4 및 3-2 세포주 및 그의 모체 섬유아세포에 대한 전체 유전자 발현 데이타는 등록 번호 GSE9709하에 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이타베이스에 기탁되었다. 이러한 분석을 통해 인간 iPS 세포주는 유전자 발현에 있어 인간 ES 세포주와 매우 유사하다는 것이 밝혀졌다.
클론 1-8 및 2-4 중 Nanog 및 Oct3/4의 프로모터 부위를 개개의 CpG 부위의 메틸화에 관하여 분석하였다. 10 ng의 비설파이트로 처리된 게놈 DNA를 T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭시키고, 전사체를 RN아제 A로 처리하였다. 메틸화된 CpG 서열로부터 기원하는 단편은 A 염기 대신 G를 함유하였는 바, 상기 단편은 상응하는 비메틸화된 CpG로부터 생성된 단편보다 16 Da 더 높은 분자량을 가졌다. 이러한 질량 차이는 MALDI-TOF 질량 분석기(Bruker Daltonics의 Autoflex)를 사용하여 검출하였다. 질량 분석기에 의해 작성된 이러한 스펙트럼은 에피타이퍼(EpiTYPER)(Sequenom)를 사용하여 분석하였다. 비메틸화된 단편 및 메틸화된 단편으로부터의 신호 피크하 면적을 사용하여 개개의 CpG 부위의 메틸화율(%)을 계산하였다. 비메틸화된 단편 및 메틸화된 단편으로부터의 신호 피크하 면적을 사용하여 개개의 CpG 부위의 메틸화율(%)을 계산하였다. 표 9는 메틸화 분석에 사용된 엠프리콘에 상응하는 게놈이 위치와 크기에 관해 작성된 목록이다. 표 10은 메틸화 분석에 사용된 프라이머 세트에 관해 작성된 목록이다.
보존 부위 1(CR1)을 포함하는 Oct3/4 근접 프로모터, CR4를 포함하는 Oct3/4 프로모터 원위 인핸서 및 Oct3/4 및 Sox2 결합 부위를 포함하는 Nanog 근접 프로모터를 조사하였다(도 11a). 도 11b에 나타낸 바와 같이, 이들 부위 중의 시토신-포스페이트-구아노신(CpG) 디뉴클레오티드는 모체 섬유아세포와 비교하여 클론 1-8 및 2-4 유래 세포에서 탈메틸화되었다.
해밀턴(7 내지 8주령된 SCID) 주사기를 사용하여 7 내지 8주령된 SCID 마우스(CB 17, Oriental Yeast)의 좌측 고환의 수질 내로 인간 iPS-1-8mTeSR 세포 현탁액(0.5 내지 2 x 106개의 세포/마우스)을 주사하였다. 6 내지 8주 후, PBS에 이어 10% 완충처리된 포르말린으로 관류시키는 중에 테라토마를 적출하고, 조직학적으로 분석하였다. SCID 마우스를 고환으로 이식한 후 4 내지 8주가 경과하였을 때 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포에 의해 테라토마가 형성되었다.
테라토마를 봉입제에 포매시키고, 저온 유지 장치 상에서 10 ㎛ 절편으로 만들었다. 일련의 절편을 헤마톡실린 에오신(HE: hematoxylin-eosin)으로 염색하여 일반적인 형태를 시각화하였다. 연골 검출을 위해 알시안 블루 염색을 사용하거나 HE와 조합하였다.
면역염색을 위해 절편을 이뮤노블록(Immunoblock)(Dainippon-Sumitomo)으로 30분 동안 처리하여 비특이 결합을 차단시켰다. 슬라이드를 하기 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다: 항네스틴 폴리클로날 항체(PRB-570C, COVANCE, 1:300), 항 II형 콜라겐 폴리클로날 항체(LB-1297, LSL, 1:200), 항 평활근 액틴 폴리클로날 항체(RB-9010-R7, LAB VISION, 1:1), 항 α 태아단백질 폴리클로날 항체(A0008, DAKO, 1:500), 항 MUC-1 폴리클로날 항체(RB-9222-P0, LAB VISION, 1:100) 및 항 인간 핵 모노클로날 항체(HuNu)(MAB 1281, CHEMICON, 1:300). II형 콜라겐의 경우, 1차 항체로 처리하기 이전에 절편을 하이알루로니다제(25 mg/mL)와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 적절한 2차 항체(Alexa fluor 594 및 688, Molecular Probe, 1:600)를 사용하여 항원의 위치 측정 결과를 시각화하였다. DAPI로 핵을 염색하였다. 면역염색된 테라토마 절편을 형광성 현미경(Zeiss의 Axio Imager Zl)으로 분석하였다.
인간 iPS-1-8 mTeSR 세포의 테라토마는 3배엽층인, 신경외배엽, 중배엽 및 내배엽의 대표적인 조직을 포함하였다. 도 12는 94일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포로부터 유래된 테라토마를 나타낸다(T1). 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCID 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 56일째에 분석하였다. 테라토마 조직의 HE 및 알시안 블루 염색을 통해 테라토마가 신경 상피(네스틴 양성), 연골(콜라겐 II 양성), 내배엽 관(알파 태아단백질)을 포함한다는 것이 밝혀졌다. 인간 iPS-1-8mTeSR 세포 유래의 조직은 HuNu 염색에 의해 숙주 조직으로부터 식별되었다. T1 테라토마에서 평활근 세포(알파-SMA 양성) 및 분비 상피(MUC-1 양성) 또한 관찰되었다(도 13). 102일 및 114일 동안 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 SCED 마우스 고환에 주사하고, 주사후 각각 48일 및 42일(T3)째 분석하였다(T2, 도 13, T3, 도 14). 3배엽층인, 신경외배엽, 중배엽 및 내배엽의 대표적인 조직이 관찰되었다. 인간 iPS가 동결보존될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포를 급속 냉동시키고, 액체 질소 중에 보관하고, 재배양하였다. 이들 세포를 SCED 마우스 고환에 주사하고, 주사 후 46일(T-F1) 및 48일(T-F2)째 분석하였다. 3배엽층인, 신경외배엽, 중배엽 및 내배엽의 대표적인 조직이 관찰되었다. 멜라닌세포 또한 T-F2 테라토마에서 관찰되었다(도 14). 따라서, 다능성은 냉동 및 해동을 통해 유지되었다.
써던 블롯 분석 및 게놈 PCR 분석, 둘 모두는 인간 iPS-1-8 클론이 4개의 트랜스유전자를 수반하였다는 것을 시사하였다. 써던 블롯 분석에서는 상응하는 pMX 벡터 플라스미드로부터 제한 효소 분해(POU5F1의 경우 XhoI, Sox2의 경우 NotI, KIF4의 경우 PstI)에 의해 cDNA 단편을 제조하였다. 이러한 단편은 아가로스 겔 전기영동 및 QIA퀵(QIAquick) 겔 추출 키트(QIAGEN)로 [32P] 표지된 프로브로서 정제되었다. 인간 iPS 클론 1-8 및 그의 모체 섬유아세포로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 5 ㎍의 각각의 게놈 DNA를 KpnI(POU5F1, Sox2 및 Klf4)로 분해하였다. 단편을 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리하고, HybondXL 막(GE Healthcare) 상에서 블롯팅하고, [32P] 표지된 프로브와 하이브리드화시켰다. 인간 iPS 클론 1-8은 Oct3/4 트랜스유전자및 Sox2 트랜스유전자의 대략 10개 정도의 카피와 Klf4 트랜스유전자의 단일 카피를 수반하는 것으로 나타났다(도 15). 게놈 PCR 분석에서, 표 4에서 c-Myc-전체로 표시된 프라이머 세트는, 엠프리콘이 c-Myc의 완전한 두번째 인트론을 포함하도록 디자인하였다. 따라서, 트랜스유전자의 엠프리콘 크기(338 bp)는 내인성 엠프리콘 크기(1814 bp)보다 더 작았다. 벡터 플라스미드 및 감염 후 17일간 배양시킨 배양물로부터 수득한, 배양된 조 섬유아세포 게놈인 모체 섬유아세포 게놈을 대조군 주형으로서 사용하였다. 게놈 PCR을 통해 클론 1-8 세포가 c-Myc 트랜스유전자를 수반한다는 것을 확인하였다(도 15).
유전자칩 인간 맵핑 500K 어레이 세트(GeneChip Human Mapping 500K Array Set)(Affymetrix)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 SNP 유전자형 분석을 실시하였다. 마트리겔 상의 mTeSR1에서 배양된 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포, 그의 모체 섬유아세포(5F0438) 및 다른 기증자로부터 유래된 섬유아세포(5F0416)를 상기 분석을 위해 분석하였다. 어레이 세트는 StyI 및 NspI 칩을 포함한다. 2 분취량의, 250 ng DNA 각각을 각각 NspI 및 StyI로 분해하였다. 각 효소 시료를 상응하는 SNP 어레이에 하이브리드화시켰다(각각, NspI 및 StyI 상의 262,000 및 238,000). 다이나믹 모델 알고리즘(Dynamic Model algorithml)138로 P=O.33의 93% 판정율 임계치를 각 분석에 사용하였다.
인간 iPS-1-8 mTeSR 세포가 섬유아세포(5F0438)로부터 생성되었는지 여부를 확인하기 위해 본 발명자들은 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포와 사용된 섬유아세포 사이의 SNP 유전자형 분석 결과를 비교하였다(표 5). 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포의 SNP는판정된 SNP 467,946 중 464,069(99.17%)에서 모체 세포의 SNP와는 일치하였지만, 그중 186,010(39.50%)에서 비관련 세포와는 상이하였다. 따라서, 인간 iPS-1-8 클론(1-8mTeSR) 및 모체 세포는 서로에 대해 거의 동일 SNP 유전자형을 가졌고, 이는 상기 세포 둘 모두 단일의 기증가로부터 기원된 것임을 나타내는데, 이는 세포 둘 모두가 단일의 기증자로부터 기원하는 것임을 강력히 제안한다.
PCR 증폭된 DNA를 서열 특이 올리고뉴클레오티드 프로브(SSOP)(Luminex)와 하이브리드화시키는 것을 사용함으로써 HLA DNA형 분석을 실시하였다. 다능성 줄기 세포 유도 과정과 관련된 DNA 돌연변이 비율을 조사하기 위하여, 인간 iPS 클론 1-8(n=2), 그의 모체 피부 유래의 세포(n=2) 및 또다른 기증자로부터 유래된 피부 세포(n=1)에 대한 게놈 와이드 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이 분석을 실시하였다. 인간 iPS 클론 1-8 및 모체 세포 간에는 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다(표 5). 이러한 관찰 결과와 일관되게, 인간 iPS 세포주 1-8, 2-4 및 3-2의 HLA 유전자형은 그들 각각의 모체 세포의 것과 동일하였다. 제조사의 설명서에 따라 분석을 실시하여 HLA-A, HLA-B, HLA-Cw, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 및 Bw 유전자좌를 결정하였다. 인간 iPS 세포는 세포 이식 요법에서 유망한 물질이며, 인간 iPS 세포는 피험체의 세포로부터 직접 생성될 수 있으며, 동일한 HLA형이어야 하는 바, 면역 거부를 극복할 것으로 보인다. 본 발명자들은 인간 iPS-1-8 클론(1-8 mTeSR), 모체 세포 (5F0438) 및 비관련 섬유아세포(5F0416)의 HLA형 분석을 수행하였다. 예측대로, iPS-1-8 클론의 HLA형은 5F0438과는 완전히 동일하였지만, 5F0416과는 동일하지 않았다(표 6).
상기 결과로부터, 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 각 4개의 유전자를 강제 발현시킴으로써 인간 다능성 줄기 세포를 수득하였다. 인간 다능성 줄기 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내었고, 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로의 분화능을 나타내었다. 인간 다능성 줄기 세포에서 세포 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD9, CD24, and CD90, and ES 세포 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, TDGF1, Dnmt3b, GABRB3, GDF3, Zfp42, ALP, CD9 및 Thy-1이 발현되었다. 모체 섬유아세포와 비교하여 인간 다능성 줄기 세포에서의 Nanog 및 Oct3/4의 프로모터 부위는 탈메틸화되었다. 인간 다능성 줄기 세포는 적어도 단일의 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 트랜스유전자 카피를 수반한다. 유도된 인간 다능성 줄기 세포 및 모체 세포(인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포)는 서로 거의 동일한 SNP 유전자형을 가졌고, 유도된 인간 다능성 줄기 세포의 HLA형은 모체 세포(인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포)의 것과 완전히 동일하였다.
실시예 15. 4개의 유전자가 도입된 신생아 섬유아세포의 초대 배양물의 유전자 발현 프로파일
4개의 유전자 형질도입 이전에 2가지 로트의 신생아 섬유아세포(5F0416 및 5F0474)를 6웰 플레이트 중 직경이 35 mm인 웰에 103개의 세포/㎠ 또는 104개의 세포/㎠로 파종하고, FGM-2 싱글쿼츠(Lonza 제조)로 보충된 FBM에서 배양하였다. 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이 세포를 2 x 105 ifu/웰로 mCAT1-아데노바이러스 벡터로 감염시키고, 4개의 유전자를 수반하는 레트로바이러스 벡터로 감염시켰다. 본 연구를 위해 8개의 웰을 제조하였다(로트가 다른 2개 및 밀도가 다른 2개를 2벌로 제조).
감염 후 17일이 경과하였을 때, 실시예 3에서와 같이, 세포를 고정시키고, 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대하여 염색하였다. 4개의 독립 실험에서 총 163개의 ALP 양성(+) 콜로니가 관찰되었다. 163개의 ALP(+) 콜로니와 18개의 ALP 음성(ALP(-)) 콜로니 모두를 절개하고, 리커버올 전체 핵산 단리 키트(Ambion 제조)를 사용하여 이들 콜로니로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA를 제조한 후, 택맨 프리앰프(Applied Biosystems 제조)를 사용하여 관심의 대상이 되는 유전자를 증폭시켰다. PCR 프라이머 세트(Applied Biosystems 제조, Nanog, Hs02387400_g1, Dnmt3b, Hs00171876_m1, FoxD3, Hs00255287_s1, Zfp42, Hs01938187_s1, TDGF1, Hs02339499_g1, TERT, HsOOl 62669_m1, GDF3, Hs00220998_m1, CYP26A1, HsOOl 75627_m1, GAPDH, Hs99999905_m1)를 사용하여 ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems 제조)로 실시간 정량적 PCR을 실시함으로써 콜로니에서의 인간 ES 세포 마커의 유전자 발현을 측정하였다. 인간 ES 세포에서 발현하는 것으로 기록된 8개의 유전자(Nanog, TDGF1, Dnmt3b Zfp42 FoxD3, GDF3, CYP26A1 및 Tert 유전자)를 다능성 줄기 세포 마커 유전자로서 선별하였다. 각 프라이머 쌍에 대하여 표준 곡선을 작성하였다. 모든 발현 값은 GAPDH에 대해 표준화하였다.
마우스 ES 세포 및 마우스 iPS 세포는 다층/응집된 콜로니를 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 먼저 인간 섬유아세포에서 4개의 유전자의 이소 발현에 의해 유도된 마우스 ES 세포 유사한 응집된 콜로니를 분석하였다(예로서, 도 23에서 콜로니 #1-2-F 및 #1-2-B). 그러나, 이들 콜로니는 모두 ALP(-)이다. 이어서, 본 발명자들은 콜로니에서의 Nanog 유전자 발현을 분석하였다. 163개의 ALP 양성 콜로니 중 161개에서, 그리고 18개의 ALP 음성 콜로니 중 16개에서 Nanog 유전자 발현이 관찰되었다. 한편, 163개의 ALP 양성 콜로니 중 26개 및 24개의 콜로니에서 TERT 및 CYP26A1 유전자 발현이 각각 관찰되었다(도 16a). 인간 ES 세포에서 다능성 상태와 밀접한 관계가 있으며, 그의 분화시에 강하게 하향조절되는 것으로 잘 알려져 있는 유전자, 예로서, Nanog, TDGF 및 Dnmt3b는 4개의 유전자 형질도입에 의해 유도되는 경향이 더 컸다.
8개의 인간 마커 유전자의 유전자 발현 패턴에 기초하여 ALP 양성 콜로니를 40개의 군으로 분류할 수 있다(표 7). 8개의 마커 유전자 발현의 총 갯수로 콜로니를 분류하였을 때, 콜로니 갯수의 분포는 정규 분포를 따르는데, 이는 콜로니 유도에 확률 과정이 존재한다는 것을 제안하는 것이다(도 16c, d). 추가로, 인간 섬유아세포에서의 인간 ES 세포 마커 유전자 발현 효율은 기증자 차이에 따라 영향을 받았다.
감염 후 17일째 형성된 콜로니의 정량적 유전자 발현 분석을 통해 트랜스유전자 c-Myc 및 Oct4가 분석된 콜로니 모두에서 고발현된 것으로 나타났다(표 11). 추가로, 8개의 인간 ES 세포 마커 유전자 중 하나 이상은 발현되지 않은 세포를 비롯하여, ALP 양성 콜로니 대부분에서 내인성 Nanog 발현은 매우 높았다(표 11). 이러한 결과는 인간 피부 섬유아세포로부터의 다능성 줄기 세포 유도 과정은 마우스 iPS 세포 생성에 대하여 기술된 것보다 더 느리다는 것을 시사한다. 163개의 ALP 양성 콜로니 중 오직 4개만이 Nanog, TDGF1, Dnmt3b, Zfp42, FoxD3, GDF3, Cyp26a1 및 Tert에 대해 양성이었다(옥타 양성 콜로니). 이들 옥타 양성 콜로니 중 세포는 1) 핵 대 세포질의 비가 높고, 크기가 작으며, 2) 섬유아세포 사이에는 공간이 존재하지 않는 작은 단층 콜로니를 형성한다는 공통된 특징을 보였다(도 16c). 이러한 특징은 인간 ES 세포의 특징와 일치한다. 그러나, 이러한 3개의 특징은 하나 이상의 ES 세포 마커가 발현되지 않는 몇몇의 ALP(+) 콜로니에서도 또한 관찰되었다. 추가로, 이러한 3개의 특징을 갖는 거대 콜로니에서는 ALP 발현이 없었다(도 23 콜로니 #7-1-1). 섬유아세포성 특징을 갖는 ALP (+) 콜로니(도 17-23 및 표 7, 11에서 콜로니 #5-1-7, #3-1-214, #3-2-233, #3-1-212, #3-1-215, #5-1-4)에서는 보통 하나 이상의 ES 세포 마커 유전자 발현이 없었다.
이러한 결과는, 유도된 다능성 줄기 세포가 섬유아세포성 콜로니, 확산된 콜로니 또는 다층 콜로니로부터가 아닌, 핵 대 세포질의 비가 높으며 소형 세포를 포함하는 소형 단층 콜로니로부터 단리될 수 있다는 것을 시사한다. 표 8은 인간 신생아 섬유아세포를 사용하연 모든 실험 및 ALP 양성 콜로니 갯수에 관한 결과를 요약한다.
실시예 16. 인간 신생아 피부 섬유아세포로부터 인간 iPS -2-4 클론의 생성
mCAT1에 대한 아데노바이러스 벡터 플라스미드를 293 세포로 형질감염시켰다. 3회에 걸쳐 반복된 냉동 해동 주기에 의해 3개의 세포로부터 mCAT1 아데노바이러스를 단리하고, 아데노바이러스 정제 키트(Clontech)를 사용하여 정제하고, -80℃에서 보관하였다. 벡터 스톡의 역가는 아데노-X 고속 역가 키트(Clontech)에 의해 측정하였다.
인간 Oct3/4, Sox-2, c-Myc 및 Klf4의 이소 발현을 위해 복제 불능 MMLV 유래의 레트로바이러스 벡터 pMx를 사용하였다. 벡터를 Plat-E 패키징 시스템에 형질감염시킨 후(문헌 [Morita et al., (2000), Gene Therapy, 7: 1063-1066]), FGM-2 싱글쿼츠(Lonza)로 보충된 FBM(Lonza)에서 배양하여 재조합 레트로바이러스를 생성하였다. 형질감염 후 24 내지 48시간 사이에 적어도 4시간 간격으로 수회에 걸쳐 Plat-E 배양물로부터의 상청액을 수집하고, 0.45 ㎛ 필터를 통과시켰다.
MEF 조절된 배지(MEF-CM) 제조를 위해 인간 ES 배지(20% 넉아웃 혈청 대체물(KSF: Knockout Serum Replacement, Invitrogen)로 보충된 DMEM/F12(Gibco), 2 mM L-글루타민(Sigma), 1 x 비필수 아미노산(Sigma), 10 ㎍/ml 겐타마이신), 10 ng/ml bFGF를 20-24시간 동안 미토마이신-C 처리된 MEF(Reprocell) 상에서 조절하고, 수거하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시키고, 사용 전 0.1 mM 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 10 ng/ml bFGF로 보충하였다.
출생 직후의 인간 조직인 인간 신생아 조직으로부터 유래된 세포(상품명: 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포, 초대 배양)를 사용하여, 인간 신생아의 피부에 존재하는 미분화된 줄기 세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도를 시도하였다.
싱글쿼츠로 보충된 FGM에서 인간 신생아 진피 섬유아세포(Lonza; 로트 5F0416)를 배양하였다. 4개의 유전자를 도입하기 3일 전에, 6웰 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종하였다. 18시간 후, 세포를 500 ㎕ 행크 평형 염 용액 중의 mCAT1 아데노바이러스 벡터 용액과 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2 ml의 배지에 첨가하고, 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 37℃에서 4시간 내지 밤새도록 2 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액(5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 실시예 1에서 제조된 각 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)에 대한 동량의 레트로바이러스 벡터 현탁액의 혼합물) 중에서 세포를 인큐베이션시켰다. 바이러스 상청액을 MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 배지를 매일 교체하였다.
유전자 도입 후 33일째, 집게를 사용하여 웰로부터 특징적인 형상을 갖는 콜로니를 채취하였다. 채취한 콜로니를 24웰 플레이트 중 마트리겔로 코팅된 웰로 옮기고, 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 유지시켰다. 14시간 후, 배지를 교체하였다. 계속하여 매일 배지를 교체하였다. 감염 후 54일째 2차 계대배양을 수행하였다. 67일째, 인간 iPS-2-4 클론을 서브클로닝하고, 인간 iPS-2-4 서브클론으로 명시하였다.
계대하기 위해 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척한 후, 37℃에서 3분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 처리하였다. 새로운 배지를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 세포 현탁액을 4℃, 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 세포를 재현탁시키고, 플레이팅하였다.
인간 iPS-2-4 서브클론을, 마트리겔(BD Biosciences)로 코팅된 배양 접시 상의 mTeSR1 한정 배지(Stem cell Techologies) 중에서 성공적으로 확장시켰다. 본 발명자들은 서브클론 iPS-2-4로부터 유래하고, mTeSR1 배지에서 배양된 세포를 인간 iPS-2-4mTeSR 세포로 명명하였다. 인간 iPS-2-4mTeSR 세포 배양을 위해 매일 배지를 교체하고, 보통 Y-27632(Calbiochem)로 처리하여 계대 이후의 세포 아포프토시스를 막았다. 계대하기 위해, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 37℃에서 3분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 인큐베이션시키고, 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 300 x g에서 실온 또는 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 배양 배지에 재현탁시켰다. 인간 iPS-2-4 mTeSR 세포는, 핵 대 세포질의 비가 높고, 작은 라운드형 세포로 구성된, 가장자리가 분명한 콜로니로 성장한, 전형적인 인간 ES 세포 및 인간 iPS- 1-8 mTeSR 세포와는 형태상으로 식별할 수 없었다.
4개의 유전자 감염 후 15일이 경과하였을 때, 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이, 세포 중 일부를 고정시키고, 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대하여 염색하였다. 세포로 구성된 콜로니는 ALP에 대하여 양성이었고, 리커버올 전체 핵산 단리 키트(Ambion 제조)를 사용하여 콜로니로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA를 제조한 후, 택맨 프리앰프(Applied Biosystems 제조)를 사용하여 관심의 대상이 되는 유전자를 증폭시켰다. PCR 프라이머 세트(Applied Biosystems 제조, Nanog, Hs02387400_g1, Dnmt3b, Hs00171876_m1, FoxD3, Hs00255287_s1, Zfp42, Hs01938187_s1, TDGF1, Hs02339499_g1, TERT, Hs00162669_m1, GDF3, Hs00220998_m1, CYP26A1, Hs00175627_m1, GAPDH, Hs99999905_m1)를 사용하여 ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems 제조)로 실시간 정량적 PCR을 실시함으로써 콜로니에서의 인간 ES 세포 마커의 유전자 발현을 측정하였다. 클론-2-4는 ES 세포 마커 유전자의 발현을 나타내었다(표 12). iPS 1-8 세포주에서 관찰된 바와 같이, 써던 블롯 분석 및 게놈 PCR 분석, 둘 모두를 통해 2-4 세포주가 통합된 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 트랜스유전자를 포함한 것으로 나타났다. 유사하게, 2-4 iPS 세포주는 세포 표면 마커 CD24, CD90, TRA 1-60, TRA-1-81, SSEA3 및 SSEA4를 발현하였고; 정상 핵형을 갖고; 그의 모체 세포와 동일한 HLA 유전자형, 1-8 세포주와 유사한 전체 유전자 발현을 갖고; 1-8 세포주에서 관찰된 것과 같은 Oct3/4 및 Nanog 프로모터 저메틸화를 가졌다.
상기 결과로부터, 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 각 4개의 유전자를 강제 발현시킴으로써 인간 다능성 줄기 세포를 수득하였다. 인간 다능성 줄기 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내었고, ES 세포 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, TDGF1, Dnmt3b, GABRB3, GDF3, Zfp42, ALP, CD9 및 Thy-1을 발현하였다.
실시예 17. 인간 신생아 피부 섬유아세포로부터 인간 iPS -3-2 클론 생성
실시예 16에 따라, FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 인간 신생아 진피 섬유아세포(Lonza; 로트 5F0438)를 배양하였다. 4개의 유전자를 도입하기 3일 전에, 6웰 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종하였다. 18시간 후, 세포를 500 ㎕ 행크 평형 염 용액 중의 mCAT1 아데노바이러스 벡터 용액과 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2 ml의 배지에 첨가하고, 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 37℃에서 4시간 내지 밤새도록 2 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액(5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 실시예 1에서 제조된 각 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)에 대한 동량의 레트로바이러스 벡터 현탁액의 혼합물) 중에서 세포를 인큐베이션시켰다. 바이러스 상청액을 MEF 조절된 ES 배지로 대체하였다. 이어서, 배지를 매일 교체하였다.
유전자 도입 후 21일째, 집게를 사용하여 접시들 중 하나로부터 특징적인 형상을 갖는 콜로니를 직접 채취하였다. 채취한 콜로니를 24웰 플레이트 중 마트리겔로 코팅된 웰로 옮기고, 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 유지시켰다.
14시간 후, 배지를 교체하였다. 계속하여 매일 배지를 교체하였다. 감염 후 40일째 2차 서브클로닝을 수행하고, 세포를 마트리겔로 코팅된 배양 접시 상의 mTeSR1 한정 배지(Stem cell Techologies) 중에서 성공적으로 확장시켰다. 매일 배지를 교체하고, 보통 Y-27632(Calbiochem)로 처리하여 계대 이후의 세포 아포프토시스를 막았다. 계대를 하기 위해, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 37℃에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 인큐베이션시키고, 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 300 x g에서 실온에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 배양 배지에 재현탁시켰다.
세포는, 핵 대 세포질의 비가 높고, 작은 라운드형 세포로 구성된, 가장자리가 매우 분명한 콜로니로 성장한, 전형적인 인간 ES 세포, 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포 및 인간 iPS-2-4 mTeSR 세포와는 형태상으로 식별할 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 클론을 인간 iPS-3-2 클론으로 명명하였다. 인간 iPS-3-2 클론은 mTeSR1 배지에서 활발하게 증식하였다. 본 발명자들은 mTeSR1 배지에서 배양된 인간 iPS-3-2 클론으로부터 유래된 이들 세포를 인간 iPS-3-2 mTeSR 세포로 명명하였다.
4개의 유전자 감염 후 48일이 경과하였을 때, 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이, 세포를 고정시키고, 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대하여 염색하였다. 리커버올 전체 핵산 단리 키트(Ambion 제조)를 사용하여 콜로니로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA를 제조한 후, 택맨 프리앰프(Applied Biosystems 제조)를 사용하여 관심의 대상이 되는 유전자를 증폭시켰다. PCR 프라이머 세트(Applied Biosystems 제조, Nanog, Hs02387400_g1, Dnmt3b, Hs00171876_m1, FoxD3, Hs00255287_s1, Zfp42, HsO1938187_s1, TDGF1, Hs02339499_g1, TERT, HsOOl 62669_m1, GDF3, Hs00220998_m1, CYP26A1, HsOOl 75627_m1, GAPDH, Hs99999905_m1)를 사용하여 ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems 제조)로 실시간 정량적 PCR을 실시함으로써 콜로니에서의 인간 ES 세포 마커의 유전자 발현을 측정하였다. 클론-2-4는 ES 세포 마커 유전자의 발현을 나타내었다(표 12). 게놈 PCR 분석을 통해 3-2 세포주가 통합된 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 트랜스유전자를 포함한 것으로 나타났다. 유사하게, 3-2 iPS 세포주는 그의 모체 세포와 동일한 HLA 유전자형 및 1-8 세포주와 유사한 전체 유전자 발현을 가졌다.
상기 결과로부터, 인간 출생 후 조직에 존재하는 미분화된 줄기 세포에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 각 4개의 유전자를 강제 발현시킴으로써 인간 다능성 줄기 세포를 수득하였다. 인간 다능성 줄기 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내었고, ES 세포 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, TDGF1, Dnmt3b, GABRB3, GDF3, Zfp42, ALP, CD9 및 Thy-1을 발현하였다.
실시예 18. 레트로바이러스 형질도입과 HDAC 저해제 처리에 의한 Oct3/4. Sox2 및 Klf4의 강제 발현에 유발된 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 인간 출생 후 진피 섬유아세포를 배양한다. 레트로바이러스 형질도입 및 히스톤 데아세틸라제 저해제 처리 3일 전에, 6웰 세포 배양 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종한다. 18시간 후, 가끔씩 진탕시켜 주면서 (실시예 2에 기술된) mCAT1 아데노바이러스 벡터를 포함하는 500 ㎕ 행크 평형 염 용액 중 30분 동안 실온에서 세포를 MOI 5로 인큐베이션시킨다. 이어서, 2 ml의 FBM 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 48시간 동안 배양한다. 이어서, 37℃에서 4시간 내지 밤새도록 2 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액(5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 각 바이러스에 대하여 대략 m.o.i. 10으로 제조되어진, 실시예 1 및 5에 기술되어 있는 것과 같은 Oct3/4, Sox2 및 Klf4를 코딩하는 동량의 레트로바이러스 벡터 혼합물) 중에서 세포를 인큐베이션시킨다. 이어서, 바이러스 상청액을, 최종 농도 1 μM의 히스톤 데아세틸라제 저해제 MS-275로 보충된 MC-ES 배지로 대체한다. 그 다음날, 배지를 MC-ES 배지로 대체하고, 이후 매일 대체한다.
바이러스 형질도입과 MS-275 처리 후 17-33일 사이에 집게를 사용하여 웰로부터 특징적인 형상(예로서, 작은, 둥근형 및 핵 대 세포질의 높은 비)을 갖는 콜로니를 채취한다. 이어서, 채취한 콜로니를 24웰 플레이트 중 마트리겔로 코팅된 웰로 옮기고, 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 유지시킨다. 14시간 후, 배지를 교체한다. 이어서, 계속하여 매일 배지를 교체한다. 바이러스 형질도입과 MS-275 처리 후 38-54일 사이에, 2차 계대배양을 수행한다. 계대하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척한 후, 37℃에서 3-5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 처리한다. 새로운 배지를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 세포 현탁액을 4℃, 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거한다. 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 세포를 재현탁시키고, 6웰 배양 접시 중 마트리겔로 코팅된 웰에 플레이팅한다.
생성된 인간 iPS 클론을 마트리겔(BD Biosciences)로 코팅된 배양 접시 상의 mTeSR1 한정 배지에서 확장시킨다. 인간 iPS 세포 배양을 위해 매일 배지를 교체한다. 인간 iPS 세포주를 계대하기 위해, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 37℃에서 3-5분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 인큐베이션시키고, 배양 배지에 첨가한다. 이어서, 생성된 세포 현탁액을 300 x g에서 실온 또는 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다. 세포를 배양 배지에 재현탁시키고, 상기 기술된 바와 같이 플레이팅시킨다. 계대한 후, 세포 아포프토시스를 막기 위해 배지를 Y-27632(Calbiochem)로 보충한다. 생성된 인간 iPS 세포는, 핵 대 세포질의 비가 높고, 작은 라운드형 세포로 구성된, 가장자리가 분명한 콜로니로 성장한, 전형적인 인간 ES 세포 및 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포와는 형태상으로 식별할 수 없다. 실시예 14-15에 기술된 바와 같은 모든 분석을 통해, 생성된 인간 iPS 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내고, 여러가지 특징에 있어서 전형적인 인간 ES 세포와 매우 유사하다.
실시예 19. 레트로바이러스 형질도입에 의한 Oct3/4. Sox2 및 Klf4의 강제 발현에 유발된 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 인간 출생 후 진피 섬유아세포를 배양한다. 레트로바이러스 형질도입 3일 전에, 6웰 세포 배양 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종한다. 18시간 후, 가끔씩 진탕시켜 주면서 (실시예 2에 기술된) mCAT1 아데노바이러스 벡터를 포함하는 500 ㎕ 행크 평형 염 용액 중 30분 동안 실온에서 세포를 MOI 5로 인큐베이션시킨다. 이어서, 2 ml의 FBM 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 48시간 동안 배양한다. 이어서, 37℃에서 4시간 내지 밤새도록 2 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액(5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 각 바이러스에 대하여 대략 m.o.i. 10으로 제조되어진, 실시예 1 및 5에 기술되어 있는 것과 같은 Oct3/4, Sox2 및 Klf4를 코딩하는 동량의 레트로바이러스 벡터 혼합물) 중에서 세포를 인큐베이션시킨다. 이어서, 바이러스 상청액을 MC-ES 배지로 대체한다. 그 다음날, 배지를 MC-ES 배지로 대체하고, 이후 매일 대체한다.
바이러스 형질도입 후 17-33일 사이에 집게를 사용하여 웰로부터 특징적인 형상(예로서, 작은, 둥근형 및 핵 대 세포질의 높은 비)을 갖는 콜로니를 채취한다. 이어서, 채취한 콜로니를 24웰 플레이트 중 마트리겔로 코팅된 웰로 옮기고, 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 유지시킨다. 14시간 후, 배지를 교체한다. 이어서, 매일 배지를 교체한다. 바이러스 형질도입 후 38-54일 사이에, 2차 계대배양을 수행한다. 계대하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척한 후, 37℃에서 3-5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 처리한다. 새로운 배지를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 세포 현탁액을 4℃, 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거한다. 10 μM Y-27632로 보충된 mTeSR1 한정 배지에 세포를 재현탁시키고, 6웰 배양 접시 중 마트리겔로 코팅된 웰에 플레이팅한다.
생성된 인간 iPS 클론을 마트리겔(BD Biosciences)로 코팅된 배양 접시 상의 mTeSR1 한정 배지에서 확장시킨다. 인간 iPS 세포 배양을 위해 매일 배지를 교체한다. 인간 iPS 세포주를 계대하기 위해, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, 37℃에서 3-5분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)에서 인큐베이션시키고, 배양 배지에 첨가한다. 이어서, 생성된 세포 현탁액을 300 x g에서 실온 또는 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다. 세포를 배양 배지에 재현탁시키고, 상기 기술된 바와 같이 플레이팅시킨다. 계대한 후, 세포 아포프토시스를 막기 위해 배지를 Y-27632(Calbiochem)로 보충한다. 생성된 인간 iPS 세포는, 핵 대 세포질의 비가 높고, 작은 라운드형 세포로 구성된, 가장자리가 분명한 콜로니로 성장한, 전형적인 인간 ES 세포 및 인간 iPS-1-8 mTeSR 세포와는 형태상으로 식별할 수 없다. 실시예 14-15에 기술된 바와 같은 모든 분석을 통해, 생성된 인간 iPS 세포는 시험관내 장기간 자가 재생능을 나타내고, 여러가지 특징에 있어서 전형적인 인간 ES 세포와 매우 유사하다.
실시예 20. Tert 리포터 작제물을 사용함으로써 유도 인자 서브세트와 함께 다능성을 유도하는 siRNA("유도 siRNA")를 확인하는 분석(예상 실시예)
Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로부터 선택되는 3개의 유도 인자 서브세트와 함께 조합하여 사용될 때, 인간 성인 섬유아세포 군집에서 다능성을 유도하거나, 다능성 유도를 증가시킬 수 있는 능력을 갖는 siRNA를 확인하는 1차 스크린에서 완전 인간 게놈 siRNA 라이브러리를 사용한다. 상기 스크린은, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로부터 선택되는 3개의 유도 인자 서브세트의 유도 활성을 보완할 수 있는 후보 siRNA를 확인하기 위해 iPS-마커 유전자 Tert의 활성화를 위한 리포터 분석을 이용한다. 예를 들면, 유실 Sox2 활성을 보완하는 siRNA를 확인하기 위해 테스트 siRNA를 Oct3/4, Klf4 및 c-Myc와 함께 조합하여 사용할 수 있다. 2차 스크린에서 후보 유도 siRNA를 같은 분석법으로 다시 테스트하고, 또다른 iPS-마커 유전자 Cyp26a1의 발현 또한 테스트된 세포에서 분석한다.
tert 프로모터 리포터 레트로바이러스의 생성:
하기의 상류 프라이머 hTERT-475F:
Figure 112010002911839-pct00012
; 및
및 하기의 하류 프라이머 hTERT+49R:
Figure 112010002911839-pct00013
을 사용하여 인간 게놈 DNA으로부터 0.5 kb 단편의 인간 tert 프로모터를 PCR 증폭시킨다.
hTERT 엑손 1(월드 와이드 웹 genome.ucsc.edu에서 2003년 7월 인간 게놈 조립체 상의 염색체 5, 염기 1306027)의 출발점으로부터 상류(+) 또는 하류(-) 염기의 번호에 의해 프라이머에 번호 매김한다. 예로서, 문헌 [Padmanabhan et al., (2006), Journal of Nuclear Medicine, 47(2) 270-277]을 참조한다.
이어서, 증폭된 단편을 프로모터가 없는 pGL4.11[luc2P] 벡터(위스콘신주 매디슨 소재의 Promega) 중 luc2P ORF에 대해 5' 방향으로 서브클로닝한다. 이어서, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 전체 tert-luc2 리포터 카세트를 PCR 증폭시키고, pMX 레트로바이러스 벡터로 서브클로닝하고, 서열 분석하여 입증하고, Plat-A 세포에 패키징하여(문헌 [Morita et al, (2000), Gene Therapy, 7(12): 1063-1066] 참조) Tert-luc 리포터("TLR") 동종숙주역 레트로바이러스를 생성한다.
세포 배양, 바이러스 감염 및 siRNA 형질감염
10 ml의 배지 중 6 x 105개의 세포로 성인 또는 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(Lonza)를, 직경이 10 cm인 세포 배양 플레이트 접시 중의 FBM 배지에 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅한다. 성인 또는 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(Lonza)를, 직경이 10 cm인 세포 배양 플레이트 접시 중의 FBM 배지에 접시당 10 ml의 배지 중 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅한다. 인간 출생 후 진피 섬유아세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FGM에서 배양한다. 18시간 후, 가끔씩 진탕시켜 주면서 (실시예 2에 기술된) mCAT1 아데노바이러스 벡터를 포함하는 행크 평형 염 용액 또는 FBM 배지 3 ml와 함께 30분 동안 실온에서 세포를 MOI 1 내지 5로 인큐베이션시킨다. 이어서, 12 ml의 완전 FBM 배지를 각 접시에 첨가하고, 세포를 48시간 동안 배양한다. 48시간 후, 배지를 제거하고, TLR 레트로바이러스 및 상기 기술된 바와 같이 제조된 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 중 임의의 3개를 코딩하는 레트로바이러스의 혼합물을 첨가하고, 접시당 3 ml의 배지 중 m.o.i. 약 10-50으로 각 바이러스를 첨가하고, 30분 동안 실온에서 계속하여 감염시킨다. 이어서, 12 ml의 FBM 배지를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션시킨다. TLR 레트로바이러스와, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 중 임의의 3개를 코딩하는 레트로바이러스를 첨가한 후 24시간이 경과하였을 때, 마트리겔(20 g/㎠)로 코팅된 384 또는 96웰 세포 배양 플레이트 중 FBM 배지에 웰당 25 또는 100 ㎕의 배지 중 104개의 세포/㎠의 밀도로 세포를 플레이팅한다. 생성된 세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 배양한다. 24시간 후, 각 siRNA에 대하여 50 nM의 최종 농도로("테스트 siRNA 웰") 인간 유전자 표적에 대해 4개의 siRNA와 함께 제조사의 프로토콜에 따라 혼합된, 항생제를 함유하지 않는 Opti-MEM® I 환원 혈청 배지(Invitrogen), 리포펙트아민™-RNAiMax 형질감염 시약(Invitrogen)을 함유하는 혼합물 50 또는 200 ㎕(각각 384 또는 96웰에 대해)로 각 웰의 배지를 대체시킨다. 따라서, 대략적으로 총 25,000 여개의 표적 인간 유전자(즉, 전부는 아니지만, 대부분의 발현된 서열)에 대한 siRNA를 본 분석에서 테스트한다. 본 분석에서 "음석 대조군"으로서는 상기 기술된 바와 같이 형질도입된 20웰("음성 대조군 웰")의 세포를 (벡터 또는 포유동물 서열에 대해 상동성이 부족한 것으로 조사된) 20개의 스크램블된 siRNA 세트로 형질감염시킨다.
TLR과 siRNA 처리된 인간 섬유아세포의 루시퍼라제 분석
48시간 후, 각 웰로부터 세포 용해물을 제조하고, 베르톨트 루매트(Berthold-Lumat) B9501 루미노미터(Berthold-Lumat, 영국 허트 소재의 St Alban)를 사용하여 Ad-nanog-luc로 감염된 세포에서의 nanog 프로모터 활성의 척도로서의 루시퍼라제 활성을 루시페린 및 ATP(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma)의 존재하에 측정한다. 각 테스트 siRNA 웰로부터의 루시퍼라제 활성을, 음성 대조군 웰에 대해 측정된 평균 루시퍼라제 활성과 비교한다. siRNA 웰이 음성 대조군 웰 평균값보다 현저히 더 높은 루시퍼라제 활성을 갖는 것으로 측정될 경우, 상응하는 siRNA 서열("후보 유도 siRNA")을 2차 스크린에서 테스트한다.
2차 스크린
첫번째 2차 스크린에서는 상기 기술된 것과 동일한 세포 배양 조건을 사용하여 48웰 포맷으로 세포를 플레이팅한다. 24시간 후, 1차 스크린에서 확인된 후보 유도 siRNA(표적 유전자당 n=10)로 웰을 형질감염시키고, 부피는 48웰 포맷으로 조정한다. 이어서, 세포를 추가로 72시간 동안 배양한다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, Cyp26a1 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 측정한다.
실시예 21. qRT-PCR을 사용함으로써 유도 인자 서브세트와 함께 다능성을 유도하는 siRNA("유도 siRNA")를 확인하는 분석(예상 실시예)
Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로부터 선택되는 3개의 유도 인자 서브세트와 함께 조합하여 사용될 때, 인간 성인 섬유아세포 군집에서 다능성을 유도하거나, 다능성 유도를 증가시킬 수 있는 능력을 갖는 siRNA를 확인하는 1차 스크린에서 완전 인간 게놈 siRNA 라이브러리를 사용한다. 상기 스크린은, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로부터 선택되는 3개의 유도 인자 서브세트의 유도 활성을 보완할 수 있는 후보 siRNA를 확인하기 위해 iPS 마커 유전자 Tert의 발현을 검출하기 위해 qRT-PCR 분석을 이용한다. 예를 들면, 유실 Sox2 활성을 보완하는 siRNA를 확인하기 위해 테스트 siRNA를 Oct3/4, Klf4 및 c-Myc와 함께 조합하여 사용할 수 있다. 2차 스크린에서 후보 유도 siRNA를 같은 분석법으로 다시 테스트하고, 또다른 iPS-마커 유전자 Cyp26a1의 발현 또한 테스트된 세포에서 분석한다.
세포 배양, 바이러스 감염 및 siRNA 형질감염
성인 또는 신생아 정상 인간 피부 섬유아세포(Lonza)를, 직경이 10 cm인 세포 배양 플레이트 접시 중의 FBM 배지에 접시당 10 ml의 배지 중 104개의 세포/㎠의 밀도로 플레이팅한다. 인간 출생 후 진피 섬유아세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FGM에서 배양한다. 18시간 후, 가끔씩 진탕시켜 주면서 (실시예 2에 기술된) mCAT1 아데노바이러스 벡터를 포함하는 행크 평형 염 용액 또는 FBM 배지 3 ml와 함께 30분 동안 실온에서 세포를 MOI 1 내지 5로 인큐베이션시킨다. 이어서, 12 ml의 완전 FBM 배지를 각 접시에 첨가하고, 세포를 48시간 동안 배양한다. 48시간 후, 배지를 제거하고, TLR 레트로바이러스 및 상기 기술된 바와 같이 제조된 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 중 임의의 3개를 코딩하는 레트로바이러스의 혼합물을 첨가하고, 접시당 3 ml의 배지 중 m.o.i. 약 10-50으로 각 바이러스를 첨가하고, 30분 동안 실온에서 계속하여 감염시킨다. 이어서, 12 ml의 FBM 배지를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션시킨다. TLR 레트로바이러스와, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 중 임의의 3개를 코딩하는 레트로바이러스를 첨가한 후 24시간이 경과하였을 때, 마트리겔(20 g/㎠)로 코팅된 384 또는 96웰 세포 배양 플레이트 중 FBM 배지에 웰당 25 또는 100 ㎕의 배지 중 104개의 세포/㎠의 밀도로 세포를 플레이팅한다. 생성된 세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 배양한다. 24시간 후, 각 siRNA에 대하여 50 nM의 최종 농도로("테스트 siRNA 웰") 인간 유전자 표적에 대해 4개의 siRNA와 함께 제조사의 프로토콜에 따라 혼합된, 항생제를 함유하지 않는 Opti-MEM® I 환원 혈청 배지(Invitrogen), 리포펙트아민™-RNAiMax 형질감염 시약(Invitrogen)을 함유하는 혼합물 50 또는 200 ㎕(각각 384 또는 96웰에 대해)로 각 웰의 배지를 대체시킨다. 따라서, 대략적으로 총 25,000 여개의 표적 인간 유전자(즉, 전부는 아니지만, 대부분의 발현된 서열)에 대한 siRNA를 본 분석에서 테스트한다. 본 분석에서 "음석 대조군"으로서는 상기 기술된 바와 같이 형질도입된 20웰("음성 대조군 웰")의 세포를 (벡터 또는 포유동물 서열에 대해 상동성이 부족한 것으로 조사된) 20개의 스크램블된 siRNA 세트로 형질감염시킨다.
리커버올 전체 핵산 단리 키트(Ambion 제조)를 사용하여 콜로니로부터 전체 RNA를 추출한다다. 역전사 후에 택맨 프리앰프(Applied Biosystems 제조)를 사용하여 Tert 또는 CYP26A1을 증폭시킨다. 이어서, PCR 프라이머 세트 TERT, HsOOl 62669_m1 및 CYP26A1, HsOOl 75627_m1 (Applied Biosystems로부터 이용가능)를 사용하여 ABI PRISM 7900HT 장치(Applied Biosystems 제조)로 실시간 정량적 PCR을 실시한다.
siRNA 웰이 음성 대조군 수준에 비해 더 높은 수준으로 Tert mRNA 발현을 유도하는 것으로 측정될 경우, 상응하는 siRNA 서열("후보 유도 siRNA")을 2차 스크린에서 테스트한다.
2차 스크린
첫번째 2차 스크린에서는 상기 기술된 것과 동일한 세포 배양 조건을 사용하여 48웰 포맷으로 세포를 플레이팅한다. 24시간 후, 1차 스크린에서 확인된 후보 유도 siRNA(표적 유전자당 n=10)로 웰을 형질감염시키고, 부피는 48웰 포맷으로 조정한다. 이어서, 세포를 추가로 72시간 동안 배양한다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 행크 평형 염 용액으로 세척하고, Cyp26a1 mRNA 수준을 상기 기술된 바와 같이 qRT-PCR에 의해 측정한다. 다른 유도 인자와 함께 조합하여 사용될 경우, Tert 및 Cyp26a1, 둘 모두의 발현을 유도하는 것으로서 확인된 후보 유도 siRNA를 추가로 테스트하여 상기 후보 유도 siRNA가 실제로 1차 스크린에서 사용되는 상응하는 유도 인자 서브세트와 함께 조합하여 사용될 경우 다능성을 유도할 수 있는지 여부를 측정한다.
실시예 22. 적어도 하나의 키메라 IF-VP 16 폴리펩티드를 포함하는 섬유아세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
실시예 7에 기술된 바와 같은 유도 프로토콜 및 분석법을 수행하지만, 단, 4개의 IF 중 하나로서 전장의 인간 Sox2 레트로바이러스 대신 키메라 인간 Sox2-VP16 융합 폴리펩티드를 발현하는 레트로바이러스를 사용한다. Sox2-VP16 융합 폴리펩티드는, Sox2 DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 Sox2의 아미노산 1-183과, 인간 Sox2 단편의 C-말단에 융합된 강한 전사활성 인자 도메인인 헤르페스 VP16 단백질(진뱅크 등록 번호. AAA45864)의 아미노산 411-490을 포함한다(예로서, 문헌 [Sadowski et al (1988), Nature, 6;335(6190):563-564] 참조). Sox2-VP16 융합 단백질의 서열은 하기와 같다:
Figure 112010002911839-pct00014
실시예 23. Oct3/4. Sox2 및 Klf4의 바이러스 발현과, c-Myc의 단백질 도입의 조합을 사용한 섬유아세포로부터 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
세포 배양 및 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 레트로바이러스 감염은 실시예 7에 기술된 바와 같이 실시하지만, 단, 4시간의 바이러스 감염 인큐베이션 이후에 3개의 바이러스 함유 폴리브렌 용액을, 하기 아미노산 서열:
YGRKKRRQRRR(서열 번호 1); RKKRRQRR(서열 번호 2); YARAAARQ ARA(서열 번호 3); THRLPRRRRRR(서열 번호 4); GGRRARRRRRR(서열 번호 5); 또는 KKKKKKKK(서열 번호 17)를 갖는 단백질 도입 도메인과 그의 N-말단에서 융합된, 하기 인간 c-Myc의 아미노산 서열:
서열 번호 12 (인간 c-Myc):
Figure 112010002911839-pct00015
을 포함하는 정제된 인간 c-Myc-PTD 융합 폴리펩티드를 함유하는 MC-배지로 대체한다.
c-Myc-PTD 융합 단백질의 서브클로닝 및 정제는 본질적으로는 문헌 [Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sons]에 기재되어 있는 바와 같이 실시한다. 레트로바이러스 감염 기간(Oct3/4, Sox2 및 Klf4 레트로바이러스) 이후에, 폴리브렌-바이러스 용액을 제거하고, 100 nM 농도로 정제된 c-Myc-PTD 융합 폴리펩티드를 함유하는 2 ml의 MC-ES 배지로 대체하고, 배양물을 37℃에서 약 3시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 배지를 MC-ES 배지로 대체하고, 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이 계속하여 유도 프로토콜 및 분석을 실시한다. 특히, 외인성 유전자가 게놈 내로 통합되는 경우, 예로서, 레트로바이러스 형질도입 이후에는 단백질 도입에 의한 c-Myc의 강제 발현이 잠재된 장기간의 바람직하지 못한 효과(예로서, 세포 형질전환 또는 암을 유도할 수 있는 위험)를 막는다.
실시예 24. Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 단백질 도입을 사용한 섬유아세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
인간 출생 후 진피 섬유아세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 배양한다. 단백질 도입 3일 전에, 6웰 세포 배양 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종한다.
Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 융합 단백질의 서브클로닝 및 정제는 본질적으로는 문헌 [Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sons]에 기재되어 있는 바와 같이 실시한다. 상기 배지를, 하기 아미노산 서열:
YGRKKRRQRRR(서열 번호 1); RKKRRQRR(서열 번호 2); YARAAARQARA(서열 번호 3); THRLPRRRRRR(서열 번호 4); GGRRARRRRRR(서열 번호 5); 또는 KXKKKKKK(서열 번호 17)를 갖는 단백질 도입 도메인과 그의 N-말단에서 융합된, Oct3/4(서열 번호 6), Sox2(서열 번호 8), Klf4(서열 번호 10) 및 c-Myc(서열 번호 12)의 정제된 융합 단백질(각각 100 nM)을 포함하는 2 ml의 MC-ES 배지로 대체시킴으로써 유도를 개시한다. 이어서, 세포를 융합 단백질과 함께 37℃에서 약 3시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 배지를 10 μM Y-27632로 보충된 MC-ES 배지로 대체시킨다. 유도 기간 동안에는 매일 상기 배지를 1시간 동안 각각의 융합 단백질 100 nM을 함유하는 MC-ES 배지로 대체시키고, 이어서, 그 다음날까지 상기 배지를 융합 단백질을 함유하지 않는 MC-ES 배지로 대체시킨다. 유도 기간 후에는 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이 분석을 실시하여 유도된 다능성 줄기 세포 후보물질을 확인한다.
실시예 25. Oct3/4, Sox2 및 Klf4의 단백질 도입과 HDAC 저해제 처리를 사용한 섬유아세포로부터의 인간 다능성 줄기 세포의 유도(예상 실시예)
인간 출생 후 진피 섬유아세포를 FGM-2 싱글쿼츠로 보충된 FBM에서 배양한다. 단백질 도입 3일 전에, 6웰 세포 배양 플레이트에 103개의 세포/㎠로 섬유아세포를 파종한다.
Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 융합 단백질의 서브클로닝 및 정제는 본질적으로는 문헌 [Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sons]에 기재되어 있는 바와 같이 실시한다. 상기 배지를, 하기 아미노산 서열:
YGRKKRRQRRR(서열 번호 1); RKKRRQRR(서열 번호 2); YARAAARQARA(서열 번호 3); THRLPRRRRRR(서열 번호 4); GGRRARRRRRR(서열 번호 5); 또는 KKKKKKKK(서열 번호 17)를 갖는 단백질 도입 도메인과 그의 N-말단에서 융합된, Oct3/4(서열 번호 6), Sox2(서열 번호 8) 및 Klf4(서열 번호 10)의 정제된 융합 단백질(각각 100 nM)을 포함하는 2 ml의 MC-ES 배지로 대체시킴으로써 유도를 개시한다.
이어서, 세포를 융합 단백질과 함께 37℃에서 약 3시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 배지를 최종 농도 1 μM의 히스톤 데아세틸라제 저해제 MS-275 및 Rho 키나제 저해제 10 μM Y-27632로 보충된 MC-ES 배지로 대체되어 보충된 MC-ES 배지로 대체하였다. 추후의 유도 기간 동안에는 매일 상기 배지를 1시간 동안 각각의 융합 단백질 100 nM을 함유하는 MC-ES 배지로 대체시키고, 이어서, 유도 기간이 종결시(유도 개시 후 약 14일)까지 추후 몇일간 상기 배지를 10 μM Y-27632를 함유하며, 융합 단백질을 함유하지 않는 MC-ES 배지로 대체시킨다. 유도 기간 후에는 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이 분석을 실시하여 유도된 다능성 줄기 세포 후보물질을 확인한다.
실시예 26. 레트로바이러스 형질도입에 의한 3개 또는 4개의 외인성 유전자의 강제 발현에 유발된 인간 다능성 줄기 세포의 유도
뮤린 배아 섬유아세포 (MEF)를 12웰 플레이트에 플레이팅하고, MEF 배지(10% FBS 및 겐타마이신으로 보충된 DMEM) 중 5000개의 세포/㎠의 밀도로 파종하고, 밤새도록(대략 16시간) 배양하였다. 이어서, 세포를 1 ml 레트로바이러스/폴리브렌 용액 중에 인큐베이션시켰다. 레트로바이러스/폴리브렌 용액은 5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc); 3개의 인자(4개의 인자에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 또는 c-Myc 중 어느 것을 제외한 것); 또는 2개의 인자(Oct3/4 및 Sox2) 중 어느 것을 코딩하는 각 레트로바이러스 벡터 0.25 ml의 혼합물을 포함하였다. 2개 또는 3개의 유전자 형질도입을 위해서, 배양 배지를 바이러스 운반 용액에 1 ml가 될 때까지 첨가하였다. 세포를 37℃에서 제조된 각 바이러스로 감염시켰다. "Oct4a"는 "Oct3/4"와 등가인 것이다. 이어서, 바이러스 상청액을 그 다음날 마우스 ES 배지로 대체하였다. 배지를 매 2-3일마다 교체하였다.
바이러스 형질도입 후 대략 12일 경과하였을 때, 콜로니를 알칼리성 포스파타제(ALP) 염색시키고, 클로닝된 콜로니 유래 세포는 청보라색으로 염색되었다. 도 28에 표시한 바와 같이, ALP 양성 콜로니의 갯수를 기록하였다. 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc); 3개의 인자의 임의의 조합; 및 2개의 인자(Oct3/4 및 Sox2)를 받은 시료에서는 ALP 양성 콜로니가 관찰되었다.
실시예 27. 레트로바이러스 형질도입에 의한 2개, 3개, 또는 4개의 외인성 유전자의 강제 발현에 유발된 마우스 다능성 줄기 세포의 마우스 유래의 신경 줄기 세포로의 유도
앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Reynolds et al., 1992]), 9주령된 C57BL/6 마우스(일본 도쿄 소재의 Oriental Yeast)의 뇌실의 밑 부분으로부터 성체 마우스 유래의 신경 줄기 세포(NSC: neural stem cell)를 단리하였다. 간략하면, 트립신 분해에 의해 성체 마우스 뇌를 단일 세포로 해리시키고, 100 lg/mL 인간 트란스페린(Sigma), 20 nM 프로게스테론(Sigma), 100 IM 퓨트레신(Sigma), 30 nM 아셀렌산나트륨(Sigma) 및 5 lg/mL 인슐린(Sigma)을 함유하는 둘베코 변형 이글스 배지/햄 F-12 배지(DMEM/F12; Invitrogen) 중에 세포를 현탁시켰다. 현탁된 세포를 조직 배양 접시에 플레이팅하였다. 세포를 자유 부유 뉴로스피어로서 NSC 배지(100 lg/mL 인간 트란스페린, 20 nM 프로게스테론, 100 IM 퓨트레신, 30 nM 아셀렌산나트륨, 5 lg/mL 인슐린, 20 ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; Sigma) 및 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF; Sigma)를 함유하는 DMEM/F12) 중에서 배양함으로써 미분화된 증식 상태로 유지시켰다. 주사하기 하루 전날 오르니틴/라민으로 코팅된 12웰 세포 배양 플레이트 상에 NSC를 단일층으로서 104개의 세포/㎠로 파종하고, 1 ml의 NSC 배지 중에서 배양하였다. 1박 후에 세포를 1 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액 중에서 인큐베이션시켰다. 레트로바이러스/폴리브렌 용액은 5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc); 3개의 인자(4개의 인자에서 Sox2 또는 c-Myc를 제외한 것); 또는 2개의 인자(Oct3/4 및 Klf4) 중 어느 것을 코딩하는 각 레트로바이러스 벡터 0.25 ml의 혼합물을 포함하였다. 2개 또는 3개의 유전자 형질도입을 위해서, 배양 배지를 바이러스 운반 용액에 1 ml가 될 때까지 첨가하였다. 세포를 37℃에서 감염시켰다. 이어서, 바이러스 상청액을 그 다음날 마우스 ES 배지로 대체하였다. 배지를 매 2-3일마다 교체하였다.
바이러스 형질도입 후 대략 12일 경과하였을 때, 콜로니를 알칼리성 포스파타제(ALP) 염색시키고, 클로닝된 콜로니 유래 세포는 청보라색으로 염색되었다. 도 28에 표시한 바와 같이, ALP 양성 콜로니의 갯수를 기록하였다. 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc); 3개의 인자의 조합 둘 모두; 및 2개의 인자(Oct3/4 및 Klf4)를 받은 시료에서는 ALP 양성 콜로니가 관찰되었다(도 29에 나타냄).
실시예 28. 레트로바이러스 형질도입에 의한 3개, 또는 4개의 외인성 유전자의 강제 발현에 유발된 마우스 다능성 줄기 세포의 유도
도 4와 관련된 실시에 5에 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 성체 마우스 유래의 골수 세포(Losac)를 수득하였다. 레트로바이러스 형질도입 하루 전날, 세포를 6웰 세포 배양 플레이트에 104개의 세포/㎠로 파종하고, 2 ml의 저혈청 배지 중에서 배양하였다. 1박 후에 세포를 2 ml의 레트로바이러스/폴리브렌 용액(5 ㎍/ml의 폴리브렌으로 보충된, 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc); 3개의 인자(4개의 인자에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 또는 c-Myc 중 어느 것을 제외한 것) 중 어느 것을 코딩하는 각 레트로바이러스 벡터 0.5 ml의 혼합물) 중에서 인큐베이션시켰다. 바이러스 상청액을 그 다음날 마우스 ES 배지로 대체하였다. 이때, 몇몇 시료를 또한 10 ng/ml FGF 또는 0.1 μM MS-275로 3일 동안 처리하였다. 이어서, 그 다음날, 배지를 마우스 ES 배지로 대체하고, 배지를 매 2-3일마다 교체하였다.
바이러스 형질도입 후 대략 9 또는 15일 경과하였을 때, 콜로니를 알칼리성 포스파타제(ALP) 염색시키고, 클로닝된 콜로니 유래 세포는 청보라색으로 염색되었다. 도 30에 표시한 바와 같이, ALP 양성 콜로니의 갯수를 기록하였다. 15일째 분석된 시료 중에서, 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)를 받은 시료 및 4개의 인자에서 c-Myc, Oct3/4, 또는 Klf4 중 어느 것을 제외한 것을 받은 시료 중에서 ALP 양성 콜로니가 관찰되었다(도 28).
ALP 양성 콜로니는 또한 바이러스 형질도입 후 9일째 분석된 4-유전자 형질도입 시료 중에서도 관찰되었지만, 상기 갯수는 15일째 4-유전자 형질도입 시료 중에서 관찰된 콜로니 갯수보다는 적었다. 9일째 4-유전자 형질도입 시료 중 MS-275에 노출되지 않은 시료와 비교하여 MS-275에 노출된 시료에서 더 많은 콜로니가 관찰되었다.
실시예 29. 레트로바이러스 형질도입에 의한 2개 또는 4개의 외인성 유전자의 강제 발현에 유발된 마우스 다능성 줄기 세포의 유도
도 4와 관련된 실시에 5에 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 성체 마우스 유래의 골수 세포(Losac)를 수득하였다. 실시예 30에 기술된 방법에 따라 레트로바이러스 형질도입을 실시하였다. 그러나, 본 실험에서, 레트로바이러스/폴리브렌 용액은 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc) 중 어느 것; 또는 2개의 인자의 상이한 조합(도 31에 나타냄)을 코딩하는, 동량의 레트로바이러스 벡터의 혼합물을 포함하였다.
바이러스 형질도입 후 대략 15일 경과하였을 때, 콜로니를 알칼리성 포스파타제(ALP) 염색시키고, 클로닝된 콜로니 유래 세포는 청보라색으로 염색되었다. 도 31에 표시한 바와 같이, ALP 양성 콜로니의 갯수를 기록하였다. 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)를 받은 시료 및 Sox2 및 c-Myc의 조합을 받은 시료 중에서 ALP 양성 콜로니가 관찰되었다(도 31)
실시예 30. iPS 세포 대 인간 ES 세포주 및 모체 섬유아세포에서 전체 유전자 발현 차이의 분석
각각 실시예 14, 16 및 17에 기술되어 있는 것은, iPS 세포주, 1-8, 2-4 및 3-2에 대해 수득된 전체 유전자 발현 데이타(GEO 등록 번호 GSE9709)를 인간 ES 세포주(hES 세포주): MEF 상에서 배양된 Sheff4; 마트리겔 상에서 배양된 Sheff4 및 MEF 상에서 배양된 H14 세포주; 및 iPS 세포주 모체 섬유아세포에 대한 전체 유전자 발현 데이타와 비교하였다. (1) hES 세포주에서보다 iPS 세포주에서 현저히 더 높은 수준으로 발현되는 유전자; (2) iPS 세포주에서보다 hES 세포주에서 현저히 더 높은 수준으로 발현되는 유전자; (3) hES 세포주 및 모체 섬유아세포에서보다 iPS 세포주에서 현저히 더 높은 수준으로 발현되는 유전자; 및 (4) hES 세포주에서보다 iPS 세포주에서 현저히 더 높은 수준으로 발현되지만, 모체 섬유아세포에서보다는 현저히 더 높은 수준으로 발현되지 않는 것인 유전자를 확인하기 위해 유전자 발현 데이타를 비교하였다. p≤0.01의 컷오프로 스튜던트의 T 검정에 의해 데이타를 비교하였다. 결과는 표 13-16에 제시되어 있다.
표 13은 hES 세포주에서보다 iPS 세포주에서 5배 이상의 수준으로 발현된 유전자 목록을 나타낸다(P≤0.01). 표 14는 iPS 세포주에서보다 hES 세포주에서 2배 이상의 수준으로 발현된 유전자 목록을 나타낸다(P≤0.01). 표 15는 hES 세포주 및 모체 섬유아세포, 둘 모두에서보다 iPS 세포주에서 5배 이상의 수준으로 발현된 유전자 목록을 나타낸다(P≤0.01). 표 16은 hES 세포주에서보다 iPS 세포주에서 5배 이상의 수준으로 발현되지만, 모체 섬유아세포에서보다는 현저히 더 높은 수준으로 발현되지 않는 것인 유전자 목록을 나타낸다(P≥0.05).
이들 결과는, 실시예 14에 기술되어 있는 바와 같이, iPS 세포주와 hES 세포주 사이에 전체 유전자 발현이 전반적으로 유사함에도 불구하고, iPS 세포주는 hES 세포주와 비교하여 유전자 발현에 있어 현저한 차이를 보인다는 것을 시사하였다.
실시예 31. Oct3/4 폴리펩티드 아미노산 서열 변이체(예상 실시예)
표 17(인간 Oct3/4의 PMUT 분석)에 기초하여, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 하기 Oct3/4 아미노산 서열 변이체 중 임의의 것을 생성하고, 이를 Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드와 함께; 또는 Sox2, Klf4 및 c-Myc 폴리펩티드와 함께 사용하여 이전 실시예에 기술되어 있는 다분화성 또는 다능성 줄기 세포를 유도한다.
하기의 아미노산 치환 쌍 중 임의의 것을 포함하는 서열 번호 6의 아미노산 서열: Oct3/4 변이체2AA-1(H4→N 및 F9→I); Oct3/4 변이체2AA-2(P15→M 및 G18→L); 및 Oct3/4 변이체2AA-3(I60→F 및 L84→V).
하기의 10개의 아미노산 치환(Oct3/4 변이체10AA) 세트를 포함하는 서열 번호 6의 아미노산 서열:
H4→N, F9→I, P15→M, G18→L, I60→F, L84→V, P62→S, V101→I, G109→I 및 P112→I.
하기의 20개의 아미노산 치환(Oct3/4 변이체20AA) 세트를 포함하는 서열 번호 6의 아미노산 서열:
H4→N, F9→I, P15→M, G18→L, I60→F, P62→S, Q79→D, L84→V, V101→I, G109→I, P112→I, G161→L, D166→E, L169→I, V173→F, F175→A, E215→D, E219→D, A223→M, V227→F.
하기의 25개의 아미노산 치환(Oct3/4 변이체25AA) 세트를 포함하는 서열 번호 6의 아미노산 서열:
H4→N, F9→I, P15→M, G18→L, V51→I, I60→F, P62→S, C63→S, Y67→F, Q79→D, L84→V, L90→M, Q94→D, V101→I, G109→I, P112→I, G161→L, D166→E, L169→I, V173→F, F175→A, E215→D, E219→D, A223→M, V227→F.
표 1은 본 실시예에서 사용된 4개의 유전자 또는 3개의 유전자 및 마우스 동종숙주역 레트로바이러스 벡터(MCAT: 마우스 유래의 양이온성 아미노산 수송체)의 수용체의 유전자 명칭, NCBI 번호, 상기 유전자가 삽입되어 있는 바이러스 벡터, 삽입체 크기, 5'-말단 제한 부위, 3'-말단 제한 부위, 번역 부위의 길이, 3'-비번역 부위의 길이, 클론 ID 및 공급업체를 보여준다.
[표 1]
Figure 112010002911839-pct00016
표 2에는 실시예 4 내지 7의 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니의 갯수가 요약되어 있다. 세포 유형에 따른 계대배양의 횟수도 첨부되어 있다. 4개의 유전자 도입일은 레트로바이러스 벡터가 감염된 날이다. 로트 번호는 론자(Lonza) 제품 번호이다. 기증자의 나이는 론자 제품에 있는 기증자 정보에 기초한 것이다. 콜로니 갯수는 10 ㎠당 알칼리성 포스파타제 양성 소형 세포로 이루어진 콜로니 갯수이다.
[표 2]
Figure 112010002911839-pct00017
표 3에는 101일째 클론 1-8의 핵형 분포가 요약되어 있다. 김자 염색 후, 염색체 갯수를 계수하였다. 100개의 세포 중 67개가 정상적인 핵형을 나타내었다.
[표 3]
Figure 112010002911839-pct00018
인간 iPS 세포(클론 1-8mTeSR) 중 100개의 세포를 분석하였다.
표 4는 도 7 및 도 15에서 사용된 프라이머 서열을 보여준다.
[표 4]
Figure 112010002911839-pct00019
표 5에는 유전자칩 인간 맵핑 500K 어레이 세트를 사용하여 분석된 인간 iPS 클론 1-8 및 섬유아세포(5F0438 및5F04156)의 SNP 유전자형 분석이 요약되어 있다. 클론 1-8의 SNP가 판정된 467,946개의 SNP 중 464,069개(99.17%)에서 모체 세포의 것과 일치하였고, 그중 3,877개(0.83%)는 모체 세포와 상이하였다. 대조적으로, 클론 1-8mTeSR의 SNP는 판정된 470,960개의 SNP 중 오직 284,950개(60.50%)에서만 비관련 기증자 세포(5F0416)의 것과 일치하였고, 그중 186,010개(39.50%)는 비관련 세포와 상이하였다.
[표 5]
Figure 112010002911839-pct00020
표 6. PCR 증폭된 DNA를 서열 특이 올리고뉴클레오티드 프로브(SSOP)(Luminex)와 하이브리드화시키는 것을 사용하여 인간 iPS1-8(1-8 mTeSR), iPS 2-4(mTeSR) 및 iPS 3-2(mTeSR); 및 섬유아세포(5F0438 및 5F0416)의 HLA-A, HLA-B, HLA-Cw 및 HLA-DR 유형을 분류하였다.
[표 6]
Figure 112010002911839-pct00021
표 7에는 콜로니의 hES 세포 마커 유전자 발현 패턴이 요약되어 있다. 4개의 유전자를 형질도입 후 17일째 콜로니를 알칼리성 포스파타제에 대하여 염색하였다. 모든 ALP(+) 콜로니와 18개의 ALP(-) 콜로니를 절개하고, 이들의 hES 마커 유전자 발현에 대하여 RT-PCR로 측정하였다. 각 콜로니를 분류하고, 갯수를 계수하였다. 증폭된 cDNA 시료를 사용하여 40회 반복된 RT-PCR에 의해서 "+"는 유전자가 발현되었음을 나타내고, "-"는 어느 것도 검출되지 않았음을 나타낸다.
[표 7]
Figure 112010002911839-pct00022
Figure 112010002911839-pct00023
표 8에는 신생아 섬유아세포를 사용하여 실시된 실험에서의 알칼리성 포스파타제 양성 콜로니의 갯수가 요약되어 있다. 4개의 유전자 도입일은 레트로바이러스 벡터가 감염된 날이다. 기증자를 론자 제품의 로트 번호로 표시한다. 콜로니 갯수는 10 ㎠당 알칼리성 포스파타제 양성 소형 세포로 이루어진 콜로니 갯수이다(ND: 비측정).
[표 8]
Figure 112010002911839-pct00024
표 9에는 Nanog 및 Oct3/4의 프로모터 부위의 메틸화 분석을 위해 사용하는 엠프리콘에 상응하는 게놈의 위치와 크기가 열거되어 있다. A열, B열 및 C열에는 각각 엠프리콘에 상응하는 게놈의 명칭, 위치 및 크기가 제시되어 있다.
[표 9]
Figure 112010002911839-pct00025
표 10에는 Nanog 및 Oct3/4의 프로모터 부위의 메틸화 분석을 위해 사용하는 프라이머 세트가 열거되어 있다. A열 및 B열은 각각 프라이머 명칭 및 프라이머 서열(유전자 특이 서열에 대한 것은 대문자로 표기, 태그 서열에 대한 것은 소문자로 표기)이 제시되어 있다.
[표 10]
Figure 112010002911839-pct00026
표 11에는 실시에 15의 ALP 양성 콜로니의 상대적인 mRNA 발현에 관해 요약되어 있다. 콜로니 갯수는 도 16-23과 대응된다. 콜로니 #5-2-32, #5-2-49, #5-2-51, #7-2-37이 분석된 인간 ES 세포 마커 모두를 발현하였다. 대조적으로, 섬유아세포성 콜로니 #3-1-212, #3-1-215, #5-1-4는 비록 트랜스유전자를 고도로 발현하기는 하였지만, Nanog만을 발현하였다.
[표 11]
Figure 112010002911839-pct00027
표 12에는 클론-2-4 및 3-2의 상대적인 mRNA 발현에 관해 요약되어 있다. 전체 RNA를 클론 2-4 및 3-2로부터 추출하였다. ES 세포 마커 유전자의 발현은 실시예 16 및 17에 기술되어 있는 바와 같이, qRT-PCR에 의해 측정하였다. 클론-2-4 및 -3-2, 둘 모두, ES 세포 마커 유전자 발현을 보였다. 모든 발현치는 인간 iPS 클론-1-8에 대해 표준화하였다(94일째).
[표 12]
Figure 112010002911839-pct00028
[표 13]
Figure 112010002911839-pct00029
Figure 112010002911839-pct00030
Figure 112010002911839-pct00031
Figure 112010002911839-pct00032
Figure 112010002911839-pct00033
Figure 112010002911839-pct00034
Figure 112010002911839-pct00035
Figure 112010002911839-pct00036
Figure 112010002911839-pct00037
Figure 112010002911839-pct00038
Figure 112010002911839-pct00039
Figure 112010002911839-pct00040
Figure 112010002911839-pct00041
Figure 112010002911839-pct00042
Figure 112010002911839-pct00043
Figure 112010002911839-pct00044
Figure 112010002911839-pct00045
Figure 112010002911839-pct00046
Figure 112010002911839-pct00047
Figure 112010002911839-pct00048
Figure 112010002911839-pct00049
Figure 112010002911839-pct00050
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Figure 112010002911839-pct00052
Figure 112010002911839-pct00053
Figure 112010002911839-pct00054
Figure 112010002911839-pct00055
Figure 112010002911839-pct00056
Figure 112010002911839-pct00057
Figure 112010002911839-pct00058
[표 14]
Figure 112010002911839-pct00059
Figure 112010002911839-pct00060
Figure 112010002911839-pct00061
Figure 112010002911839-pct00062
Figure 112010002911839-pct00063
Figure 112010002911839-pct00064
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Figure 112010002911839-pct00066
Figure 112010002911839-pct00067
[표 15]
Figure 112010002911839-pct00068
Figure 112010002911839-pct00069
Figure 112010002911839-pct00070
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[표 16]
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[표 17]
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[표 18]
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[표 19]
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[표 20]
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본원에서는 바람직한 실시태양을 기술하였지만, 그러한 실시태양은 단지 일례로서 제공되는 것이다. 여러 가지로 변형, 변화 및 치환될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물의 실시태양에 관한 각종 대안도 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 특허청구범위가 본 발명의 범주를 정의하는 것이며, 본 특허청구범위의 범주 내의 방법 및 조성물 및 그의 등가물은 그러한 특허청구범위에 포함되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BAYER SCHERING PHARMA AKTIENGESELLSCHAFT <120> MULTIPOTENT/PLURIPOTENT CELLS AND METHODS <130> 36588-704.602 <140> PCT/US08/07375 <141> 2008-06-13 <150> 61/040,646 <151> 2008-03-28 <150> PCT/EP07/010019 <151> 2007-11-20 <150> JP 2007-159382 <151> 2007-06-15 <160> 67 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg 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sapiens <400> 7 Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu 1 5 10 15 Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu 20 25 30 Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys 35 40 45 Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg 50 55 60 Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys 85 90 95 Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe 100 105 110 Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln 115 120 125 Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg 130 135 140 Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser 145 150 <210> 8 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 35 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Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu Arg Asp 260 265 270 Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala 275 280 285 Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro 290 295 300 Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met 305 310 315 <210> 9 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe Met Val Trp Ser Arg Gly Gln 1 5 10 15 Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro Lys Met His Asn Ser Glu Ile 20 25 30 Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys 35 40 45 Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala Lys Arg Leu Arg Ala Leu His Met Lys 50 55 60 Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro Arg Arg Lys 65 70 75 <210> 10 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Val Ser Asp Ala Leu Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser 1 5 10 15 Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys Thr Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn 20 25 30 Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val 35 40 45 Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp 50 55 60 Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr Glu Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu 85 90 95 Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala 100 105 110 Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser 115 120 125 Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro 130 135 140 Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ser Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe 165 170 175 Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala 180 185 190 Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln 195 200 205 Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala 210 215 220 Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser 225 230 235 240 Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His Pro Val Val Val Ala Pro 245 250 255 Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg Thr Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala 260 265 270 Val Ser Ser Cys Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly 275 280 285 His Arg Pro Ala Ala His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser 290 295 300 Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp 305 310 315 320 Cys His Pro Ala Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly 325 330 335 Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro 340 345 350 Pro Leu His Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu 355 360 365 Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr 370 375 380 Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro 405 410 415 Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 420 425 430 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln 435 440 445 Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu 450 455 460 His Met Lys Arg His Phe 465 470 <210> 11 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Ser Thr Ala Asp 100 105 110 Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125 Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140 Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 195 200 205 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val 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Claims (132)

  1. 인간의 출생 후 세포에서 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 인간 다능성 줄기 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드가 Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 인간의 출생 후 세포와 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제, Rho 관련 키나제의 저해제, 또는 그의 조합을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 Rho 관련 키나아제 저해제는 Y-27632 또는 HA-1077인 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, c-Myc 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계가, 인간의 출생 후 세포 내로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 벡터가 재조합 레트로바이러스를 포함하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 벡터가 핵산 발현 벡터인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 발현 벡터가 플라스미드 발현 벡터인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드를 강제 발현시키는 단계가, 인간의 출생 후 세포 내로 상기 폴리펩티드를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간의 출생 후 세포가 bFGF 존재하에 배양되는 것인 방법.
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  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간의 출생 후 세포가 인간 성체 유래의 세포인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인간의 출생 후 세포가, 인간 성체 골수 유래의 단핵 세포, 인간 신생아 피부 섬유아세포, 배꼽 정맥 내피 세포, 배꼽 동맥 평활근 세포, 출생 후 골격근 세포, 출생 후 지방 세포, 출생 후 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 단핵 세포 및 태반 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, HDAC 저해제가 트리코스타틴 A, 트리코스타틴 C, 옥삼플라틴, 트라폭신 A, FR901228, FR225497, 아피시딘, HC-독소, WF27082, 클라마이도신, 살리실 하이드록삼산(SBHA), 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), 아젤라인 비스하이드록삼산(ABHA), 아젤라인-1-하이드록사메이트-9-아닐리드(AAHA), M-카르복시 신남산 비스하이드록사미드(CBHA), 6-(3-클로로페닐우레이도) 카프로익 하이드록삼산(3-Cl-UCHA), MW2796, MW2996, 부티르산나트륨, 이소발레레이트, 발프로인산, 발레레이트, 4-페닐 부티르산(4-PBA), 페닐 부티르산(PB), 프로피오네이트, 부틸아미드, 이소부틸아미드, 페닐 아세테이트, 3-브로모프로피오네이트, 트리부티린, 아르기닌 부티레이트, 이소부틸 아미드, 발프로에이트, MS-275 및 CI-994로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, HDAC 저해제가 MS-275인 방법.
  14. (i) Oct3/4 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 및 Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터, 및 (ii) HDAC 저해제, Rho 관련 키나제의 저해제, 또는 그의 조합을 포함하는, 시험관내에서 인간 다능성 줄기 세포를 생성하기 위한 조성물로서, 상기 Rho 관련 키나제의 저해제는 Y-27632 또는 HA-1077인 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, c-Myc 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, HDAC 저해제가 트리코스타틴 A, 트리코스타틴 C, 옥삼플라틴, 트라폭신 A, FR901228, FR225497, 아피시딘, HC-독소, WF27082, 클라마이도신, 살리실 하이드록삼산(SBHA), 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), 아젤라인 비스하이드록삼산(ABHA), 아젤라인-1-하이드록사메이트-9-아닐리드(AAHA), M-카르복시 신남산 비스하이드록사미드(CBHA), 6-(3-클로로페닐우레이도) 카프로익 하이드록삼산(3-Cl-UCHA), MW2796, MW2996, 부티르산나트륨, 이소발레레이트, 발프로인산, 발레레이트, 4-페닐 부티르산(4-PBA), 페닐 부티르산(PB), 프로피오네이트, 부틸아미드, 이소부틸아미드, 페닐 아세테이트, 3-브로모프로피오네이트, 트리부티린, 아르기닌 부티레이트, 이소부틸 아미드, 발프로에이트, MS-275 및 CI-994로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, HDAC 저해제가 MS-275인 조성물.
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