JPH11514857A

JPH11514857A - 抗原虫剤の標的としてのヒストンデアセチラーゼ

Info

Publication number: JPH11514857A
Application number: JP9512810A
Authority: JP
Inventors: デユルスキイ，ポーラ・エム; ガーネツト，アン・エム; マイヤーズ，ロバート・ダブリユ; ラトレイ，サンドラ・ジエイ; シユマツツ，デニス・エム
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-09-20
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 1999-12-21
Also published as: EP0855024A4; AU6979096A; AU712801B2; CA2231251A1; WO1997011366A1; EP0855024A1

Abstract

(57)【要約】ヒストンデアセチラーゼ阻害は、潜在的な抗原虫化合物を同定するための標的を提供する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は原虫感染症に対する治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称抗原虫剤の標的としてのヒストンデアセチラーゼ発明の背景寄生原虫類はヒト及び動物の多様な感染症に関与している。該感染症の多くは宿主の生命にかかわり、畜産業界に多大な経済的損失をもたらす。例えば、マラリアは、該疾患を撲滅しようとする国際的な非常な努力にも拘わらず、依然としてヒトの健康を大いに脅やかしている。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉによって引き起こされるシャガス病及びＴ．ｂｒｕｃｅｉによって引き起こされるアフリカ睡眠病のようなトリパノソーマ症はアフリカや南アメリカでは珍しくない。また、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、クリプトスポリジウム属によって引き起こされる免疫減弱宿主の日和見感染は開発途上国でますます増大している。経済的に極めて重要な原虫感染症は、アイメリア属の原虫が媒介して感染する家畜の広範囲に及ぶ病気であるコクシジウム症である。アイメリア属のうちで最も重要な原虫には、家禽の原虫、即ち、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ及びＥ．ｍａｘｉｍａがある。コクシジウム症は、家禽の高罹患率及び高死亡率に関与し、甚大な経済的損失をもたらし得る。シャガス病のようなある種の原虫感染症には満足すべき治療法がない。他の原虫感染症では原虫の薬剤耐性株が発生し得る。従って、新規且つ有効な抗原虫薬を同定することが依然として求められている。しかし、駆虫薬の発見は、殆どの場合、寄生虫集団に対する天然産物及び合成化合物の生物学的スクリーニングによる無作為の労力を要するプロセスの結果であった。このプロセスは、抗原虫薬の標的を同定してスクリーニングプロセスに組み込むことができれば、はるかに容易且つより特異的になり得る。ヒストンデアセチラーゼ（脱アセチル酵素）とヒストンアセチルトランスフェラーゼは共にヒストンの純アセチル化レベルを制御する。ヒストンデアセチラーゼの作用を阻害すると、高アセチル化されたヒストンが凝集し、それが、遺伝子発現の改変、細胞分化及び細胞周期の停止を含む多様な細胞性応答に影響を与える。最近、トリコスタチンＡ（trichostatin A）及びトラポキシンＡ（trapoxin A）がそれぞれ哺乳動物のヒストンデアセチラーゼの可逆阻害剤及び不可逆阻害剤として記載された〔例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１９９５，１７（５）：４２３−４３０参照〕。トリコスタチンＡが、部分精製された酵母のヒストンデアセチラーゼを阻害することも記載された〔ＳａｎｃｈｅｚｄｅｌＰｉｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９４，３０３：７２３−７２９〕。トリコスタチンＡは抗かび抗生物質であり、ネズミにおいては赤白血病細胞の抗トリコモナス活性や細胞分化活性、ｓｉｓ−形質転換線維芽細胞においては表現型の復帰を誘発する能力を有することが証明された〔例えば、米国特許第４，２１８，４７８号；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１９９５，１７（５）：４２３−４３０及び該論文中に引用されている参考文献を参照されたい〕。環状テトラペプチドであるトラポキシンＡは、ｖ−ｓｉｓ−形質転換ＮＩＨ３６３細胞の形態学的復帰を誘発する〔Ｙｏｓｈｉｄａ及びＳｕｇｉｔａ，Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１９９２，８３（４）３２４−３２８〕。本発明者は、トラポキシンＡと構造的に関連する多くの環状テトラペプチドがヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり且つ抗原虫活性をも有することを見出した。発明の要旨本発明は、抗原虫剤の標的としてのヒストンデアセチラーゼに関する。より特定的に言えば、本発明は、テスト化合物がヒストンデアセチラーゼの作用を阻害し得るかどうかを決定することにより潜在的な抗原虫剤を同定する方法に関する。本発明はさらに、原虫感染症に罹患している宿主にヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を治療上有効量投与することにより原虫感染症を治療する方法に関する。図面の簡単な説明図１は、ＨｅＬａ細胞ヒストンの高アセチル化を引き起こすヒストンデアセチラーゼ阻害剤を示す。図２は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のヒストンの高アセチル化を引き起こすヒストンデアセチラーゼ阻害剤を示す。発明の詳細な説明１つの態様において、本発明は抗原虫活性を有する化合物を同定する方法を提供し、該方法は、（ａ）ヒストンデアセチラーゼ又は該酵素を含む抽出物を、（ｉ）ヒストンデアセチラーゼと相互作用する既知量の標識化合物、及び（ii）既知稀釈度のテスト化合物又は天然産物抽出物と接触させるステップ；及び（ｂ）前記テスト化合物により誘発された前記標識化合物の相互作用の阻害率（％）を定量するステップを含む。別の態様において、本発明は抗原虫活性を有する化合物を同定する方法を提供し、該方法は、（ａ）宿主又は原虫の無傷の細胞をテスト化合物又は天然産物抽出物と接触させるステップ；（ｂ）前記細胞を破壊してヒストンを得るステップ；及び（ｃ）ヒストンのアセチル化レベルを測定するステップを含む。本発明の方法は、化合物を抗原虫薬としてスクリーニングする容易且つ特異的なアッセイを提供する。本発明において、ヒストンデアセチラーゼ（本明細書ではＨＤＡ又はＨＤＡアーゼとも称される）は、精製若しくは部分精製された天然酵素、クローン化ヒストンデアセチラーゼ若しくはその改変体、該酵素の粗試料、又はヒストンデアセチラーゼ活性を含む抽出物であってよい。該酵素は、哺乳動物源由来（例えば、ヒト頚ガン、ＨｅＬａ細胞）、鳥類源由来（例えば、ニワトリの肝臓若しくは赤血球の核）又は原虫源由来（例えば、Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ若しくはＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ）であってよい。原虫のヒストンデアセチラーゼを用いるのが好ましい。所望の酵素活性を保有するヒストンデアセチラーゼのフラグメントも本発明の範囲内に包含される。ヒストンデアセチラーゼと相互作用する化合物は、酵素の基質である化合物、酵素とその活性部位で結合する化合物、又は別の部位に結合して酵素活性を変える作用をする化合物であってよい。基質は、アセチル化ヒストン、若しくは該ヒストン由来の標識アセチル化ペプチドフラグメント、例えば、ＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ε−Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ε−Ａｃ）−ＶａｌＮＨ₂、又は他の合成若しくは天然基質であってよい。ヒストンデアセチラーゼに結合する化合物の例としては、ｎ−ブチレート、トリコスタチン、トラポキシンＡのような公知阻害剤や、本明細書に記載されている他の阻害剤がある。ヒストンデアセチラーゼと相互作用する化合物は、該化合物と該酵素との相互作用のレベルを容易に定量し得るように標識するのが好ましい。好ましい放射性標識はトリチウムである。テスト化合物は、合成化合物、精製試料、粗試料、又は、植物、微生物若しくは動物源から得た天然産物の初抽出物であってよい。本発明の１つの実施態様は、テスト化合物によって誘発されるヒストンデアセチラーゼ活性の阻害に基づいている。該酵素の阻害アッセイには、ヒストンデアセチラーゼ又は該酵素を含む抽出物を、それぞれ既知濃度で存在する酵素基質とテスト化合物との混合物に加えるステップを含む。酵素の量は、該基質の≦２０％がアッセイ中に消費されるように選択する。該アッセイは、一連の異なる稀釈レベルのテスト化合物を用いて実施する。インキュベーション後、酵素作用により放出された標識基質部分を分離し、計数する。該アッセイは一般に、（テスト化合物を含まない）対照及び（テスト化合物の代わりに公知酵素阻害剤を含む）陽性対照と平行して行う。当業界で承認された方法を用い、酵素活性の５０％を阻害するテスト化合物の濃度（ＩＣ₅ ₀ ）を測定する。酵素阻害率はテスト化合物の阻害活性の最も直接的な測定値であるが、本発明者は、酵素活性部位への結合に対してテスト化合物を公知阻害剤と競合させる競合的結合アッセイから得られた結果が上記酵素阻害アッセイから得られた結果と十分に相関することを見出した。該結合アッセイは、部分精製酵素よりもヒストンデアセチラーゼを含む粗抽出物を使用し得るために、より便利な酵素阻害率評価法である。粗抽出物の使用は必ずしも酵素阻害アッセイに適当であるわけではない。というのは、抽出物中に存在する他の酵素がヒストンデアセチラーゼ基質に作用し得るからである。競合的結合アッセイは、ヒストンデアセチラーゼ又は該酵素活性を含む抽出物を、それぞれ既知濃度で混合物中に存在するテスト化合物と標識阻害剤との混合物に加えて行う。インキュベーション後、酵素−阻害剤複合体を、結合しなかった標識阻害剤及び非標識テスト化合物から分離し、計数する。標識阻害剤とヒストンデアセチラーゼとの結合を５０％阻害するのに要するテスト化合物の濃度（ＩＣ₅₀）を計算する。好ましい実施態様において、本発明の方法は、ヒストンデアセチラーゼ又はアイメリア若しくはプラスモジウム属のような原虫源から得たヒストンデアセチラーゼを含む抽出物を用いる。より好ましい実施態様において、本発明の方法は、上記の酵素阻害アッセイ又は結合アッセイにおいて、宿主のヒストンデアセチラーゼに対するテスト化合物のＩＣ₅₀を測定して、宿主のものよりも寄生虫のヒストンデアセチラーゼに対して選択性を有するテスト化合物を同定するステップをさらに含む。該アッセイは、原虫宿主から得たヒストンデアセチラーゼを用いる、先に記載のアッセイと同じであり、例えば、宿主のヒストンデアセチラーゼは、ヒトのような哺乳動物源又はニワトリのような鳥類源から得ることができる。寄生虫のヒストンデアセチラーゼに対して選択的である阻害剤の同定に有用な別の方法は、酸・尿素・トリトン（ＡＵＴ）ゲル電気泳動を用いてヒストンのアセチル化レベルを測定する方法である。従って、宿主のヒストンを全く若しくは殆ど高アセチル化することなく寄生虫のヒストンを高アセチル化し得る化合物が、選択的ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であると考えられる。酵素阻害又は結合アッセイに粗試料又はヒストンデアセチラーゼを含む抽出物を用いる場合、テスト化合物の標的は、ヒストンのアセチル化レベルを調べて確認することができる。例えば、該酵素を含む宿主又は寄生虫の無傷の細胞をテスト化合物で処理する。あるいは、該酵素を含む宿主又は寄生虫の無傷の細胞を標識した酢酸ナトリウム（¹⁴Ｃが好ましい標識である）で処理する。どちらの場合にも、細胞を溶解し、ヒストンを部分精製し、酸・尿素・トリトン（ＡＵＴ）ゲル電気泳動にかけて分析する。タンパク質の検出は、染色又はフルオログラフィーにより放射性標識を検出して行う。そのようなＡＵＴゲル上ではアセチル化種の移動が遅いために特異的にアセチル化した種は容易に区別し得る。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンを高アセチル化する。ＡＵＴゲル電気泳動はテスト化合物で処理した無傷の細胞を用いるので、この方法は細胞環境内でヒストンデアセチラーゼ阻害剤に変換され得るプロドラッグの同定にも用い得るが、該酵素自体をベースとするアッセイではそのような同定はできないであろう。別の態様において、本発明は原虫感染症の治療法を提供し、該方法は、原虫感染症に罹患している宿主に、ヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を治療上有効量投与することを含む。治療上有効量とは、原因原虫のヒストンデアセチラーゼを阻害するのに十分な量であり得る。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり得、従って原虫感染症の治療に有用であり得る公知化合物の例には、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、ＨＣ−ｔｏｘｉｎ、クラミドシン（chlamydocin）、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ− １７４６、アピシジン（apicidin）及びその類似体が含まれるがそれらには限定されない。トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、ＨＣ−ｔｏｘｉｎ、クラミドシン、Ｃｙ−２及びＷＦ−３１６１並びにその誘導体は当業界では周知である。ＨＣ−ｔｏｘｉｎはＬｉｅｓｃｈら（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３８，４５−４８に、トラポキシンＡはＩｔａｚａｋｉら（１９９０）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４３，１５２４−１５３２に、ＷＦ−３１６１はＵｍｅｈａｎａら（１９８３）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３６，４７８−４８３に、Ｃｌｙ−２はＨｉｒｏｔａら（１９７３）Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７，９５５−９５６に、クラミドシンはＣｌｏｓｓｅら（１９７４）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５７，５３３−５４５に、また、Ｔａｎ１７４６はＴａｋｅｄａＹａｋｕｈｉｎＫｏｇｙｏＫ．Ｋ．の日本国特許第７１９６６８６号に記載されている。本明細書に引用されているアピシジン及びその類似体は以下の構造式を有する：アピシジンＩａ、Ｉｂ、Ｉｃは、１９９４年７月２７日に出願された係属出願ＵＳＳＮ０８／２８１，３２５号及び１９９５年５月２３日に出願された同８／４４７，６６４号に記載されている。該化合物は、上記出願明細書に開示されているようにフザリウム属の株から生成する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は抗原虫剤として有用である。従って、該阻害剤は、ヒトや家禽を含む動物の原虫感染症の治療及び予防に用い得る。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いる得る原虫感染症の例及びそれぞれの原因病原体には、（１）アメーバ症（双核アメーバ属、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）；（２）ランブル鞭毛虫症（ランブル鞭毛虫）；（３）マラリア（Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｃｐａｒｕｍ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ及びＰ．ｏｖａｌｅを含むプラスモジウム属）；（４）リーシュマニア症（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ及びＬ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓを含むリーシュマニア属）；（５）トリパノソーマ病及びシャガス病（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ、Ｔ．ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｔ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｅｖａｎｓｉ、Ｔ．ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｔ．ｖｉｖａｘ及びＴ．ｃｒｕｚｉを含むトリパノソーマ属）；（６）トキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）；（７）新胞子虫症（ neosporosis）（Ｎｅｏｓｐｏｒａｃａｎｉｎｕｍ）；（８）バベシア症（バベシア属）；（９）クリプトスポリジア症（クリプトスポリジウム属）；（１０）赤痢（大腸バランチジウム）；（１１）膣炎（Ｔ．ｖａｇｉｎｉｔｉｓ及びＴ．ｆｏｅｔｕｓを含むトリコモナス属）；（１２）コクシジウム症（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ．Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｂｏｖｉｓ、Ｅ．ｍｅｌａｇｒａｍａｔｉｓを含むアイメリア属並びにイソスポラ属）；（１３）腸肝炎（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）；並びに（１４）アナプラズマ属、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ属、リューコサイトゾーン属、微胞子虫類、サルコシスチス属、タイレリア属及びニューモシスチス・カリニにより引き起こされる感染症が含まれる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、アピコンプレクサ亜門のメンバーによって引き起こされる原虫感染症の治療又は予防に用いるのが好ましい。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒト及び動物のマラリア、トキソプラズマ症、クリプトスポリジア症及びトリパノソーマ病の治療又は予防、並びにコクシジウム感染症の治療や予防、特に家禽のコクシジウム症の防除処置に用いるのがなお好ましい。家禽のコクシジウム症の予防におけるような、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の持続的な投与が考えられる場合、該阻害剤は宿主のヒストンデアセチラーゼよりも原虫の該酵素に対して選択的であるのが好ましい。そのような選択的阻害剤を長期間投与することにより、ヒストンデアセチラーゼの阻害による宿主への有害作用が最小限になると考えられる。ヒト及び動物の寄生虫感染症の発症を阻止するためにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いる２つの特定の例は、食餌又は飲料水に入れて阻害剤を連続投与することによる（１）ヒトの風土病的流行地域におけるプラスモジウム（マラリア）感染症の予防及び（２）家禽のコクシジウム症の予防である。マラリアは全世界の死因の第１位を占める。マラリアは風土病的流行地域では蚊を媒介として感染し、極めて急速に致命的な感染症に進行し得る。従って、マラリアを媒介する蚊が存在する地域に居住するか又は該地域を訪れる個人は、感染症の予防のために決まって予防薬を用いる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、１日当たり１回以上経口又は非経口投与し得る。投薬量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。該化合物は、患者又は動物が寄生虫感染症に罹患する恐れがある期間全体を通して投与し得る。コクシジウム症は、ヒトにも動物にも発症し得る病気であり、数種のコクシジウム属によって引き起こされる。コクシジウム症のうち最も経済的に重要なものは、家禽に発生するコクシジウム症である。家禽のコクシジウム症は、アイメリア属の寄生原虫によって引き起こされる。この病気は、汚染された糞便を介して家禽群全体に極めて急速に伝染し得る。該寄生虫は、腸の組織を破壊し、それによって、腸壁に損傷を与えて栄養の吸収を妨げる。家禽小屋にコクシジウム症が発生すると、養家禽家に莫大な経済的損失をもたらし得るので、予防策として飼料中に抗コクシジウム剤を用いることが慣例となっている。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、家禽の生存期間中の一時期又は全期間を通じて、飼料又は飲料水に入れて投与する。投薬量は飼料又は飲料水中０．１〜５００ｐｐｍの範囲である。ヒト及び動物の確立された寄生虫感染症を治療するために、該感染症の疑いがあるか又は感染していると診断されたら直ぐヒストンデアセチラーゼ阻害剤を経口又は非経口投与し得る。治療期間は、特定の寄生虫感染症及び該感染症の重篤度に準じて異なる。一般に該治療は、寄生虫が根絶されるか及び／又は該感染症の症状がなくなるまで続ける。２つの特定の例は、（１）動物又はヒトのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍの治療、及び（２）ヒトの急性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアの治療である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍは、ヒト及び動物の腸管壁の細胞に感染して該細胞を破壊する寄生原虫である。該感染症は、極めて急速に確立し、患者に急性作用を及ぼす。ヒトの場合、患者は５〜７日間重症の赤痢にかかる。免疫減弱患者では、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ感染症はなかなか根治せず、致命的となり得る。動物の場合には、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ感染症は若い乳牛の死因の第１位を占める。Ｃ．ｐａｒｖｕｍ感染症は、症状や、糞便の検査により容易に診断し得る。該感染症の疑いがあったり及び／又は感染していると診断されたら、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた治療を開始し得る。投薬量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。治療は、該感染症が治癒するまで１日１回以上経口的又は非経口的に行う。通常、該投薬期間は１〜３週間である。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、ヒトに急性の致命的マラリア感染症を引き起こす。該感染症は治療せずに放っておくと、患者が死に至る場合が極めて多い。マラリア感染症は患者の症状や血液試料の検査により容易に診断し得る。診断されたら直ぐ治療を開始する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、該感染症が治癒するまで、１日１回以上、経口又は非経口投与する。投薬量は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、治療を要する宿主に、他の抗原虫剤の場合と類似の方法で投与し得る。例えば、該阻害剤は、非経口、経口、局所又は経直腸投与し得る。投与量は、用いられる特定の化合物、関与する感染器官、特定の宿主、該感染症の重篤度、宿主の身体状態及び選択された投与経路に応じて異なり得る。適切な投薬量は当業者が容易に決定し得る。ヒト及び動物の原虫感染症の治療における投薬量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。ヒト及び動物の予防用に用いる場合、投薬量は０．０１１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。特に家禽の抗コクシジウム剤として用いる場合、該化合物は、動物の飼料や飲料水に入れて投与するのが好ましい。投薬量は０．１〜５００ｐｐｍの範囲である。本発明の組成物はヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び不活性担体を含む。該組成物は、ヒト及び家畜に用いる場合には医薬組成物の形態、また家禽のコクシジウム症の防除用には飼料組成物の形態であってもよい。用語「組成物」とは、有効成分と担体を構成する不活性成分とを含む生成物、並びに２種以上の成分の組み合わせ、複合体若しくは凝集体、１種以上の成分の分離体又は１種以上の成分の他のタイプの反応から直接又は間接的に得られる任意の生成物を包含するものとする。従って、本発明の組成物には、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と不活性担体を混合することにより形成される組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は有効成分としてヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含み、該組成物はさらに、医薬上許容し得る担体及び場合によって他の治療用成分をも含み得る。該組成物は、経口、経直腸、局所投与並びに（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口投与に適当な組成物を含むが、任意の所与のケースに最も適当な経路は、有効成分を投与する特定の宿主や症状の性質及び重篤度に依存する。該医薬組成物は単位剤形として製剤し、医薬業界で周知の方法のいずれかを用いて製造するのが便利である。実際の使用に際しては、慣用の医薬製剤法に従い、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を医薬担体との均質混合物中の有効成分として組み合わせることができる。担体は、投与経路、例えば、経口又は（静脈内を含む）非経口投与に望ましい剤形に応じて多様な形態をとり得る。経口剤形組成物の製造には、通常の医薬媒体のいずれかを用い得る。例えば、懸濁剤、エリキシル剤及び溶剤のような経口液体製剤の場合、水、グリコール、油、アルコール、矯味・矯臭剤、保存剤、着色剤などを用い得る。また、散剤、カプセル剤及び錠剤のような経口固体製剤の場合には、スターチ、糖、微晶質セルロース、稀釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような担体が含まれ得る。錠剤及びカプセル剤は投与し易いことから最も有利な経口剤形であり、該剤形に固体医薬担体が用いられることは明らかである。所望なら、錠剤を標準的な水性又は非水性技術によりコーティングしてもよい。上記の一般的な剤形に加えて、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、制御放出手段及び／又は投与装置により投与することもできる。経口投与に適した本発明の医薬組成物は、それぞれ所定量の有効成分を含むカプセル剤、カシェ剤若しくは錠剤、散剤若しくは顆粒剤、水性液、非水性液、水中油滴型エマルション若しくは油中水滴型エマルション中の溶剤若しくは懸濁剤のような離散単位として製剤し得る。そのような組成物は、任意の製薬法に従って製造し得るが、いずれの方法も、有効成分と１種以上の必要な成分を構成する担体とを混和するステップを含む。一般に、該組成物は、有効成分を、液体担体若しくは微細に分割された固体担体又はその両方と均質且つ十分に混合し、必要なら、その後で、混合生成物を所望の剤形に成形して製造する。例えば錠剤は、場合によって１種以上の補助成分を加えて圧縮又は成形して製造し得る。圧縮錠剤は、有効成分を、場合によって結合剤、滑沢剤、不活性稀釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、適当な機械を用いて散剤又は顆粒剤のような自由流動形態に圧縮して製造し得る。すりこみ錠剤は、不活性液体稀釈剤で湿潤した粉末化化合物の混合物を適当な機械で成形して製造し得る。錠剤は１個当たり約１〜約５００ｍｇの有効成分を含み、カシェ剤又はカプセル剤は１個当たり約１〜約５００ｍｇの有効成分を含むのが望ましい。非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水中のこれら有効成分の溶液又は懸濁液として製造し得る。油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中の分散剤として製造してもよい。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。注射に適した医薬剤形には、滅菌水性溶剤又は懸濁剤、及び滅菌注射用溶剤又は分散剤を必要時に調合するための滅菌散剤が含まれる。いずれの場合にも、剤形は滅菌され且つ注射器で注入し易い程度に流動性でなければならない。該剤形は、製造及び貯蔵条件下に安定であり且つ細菌や菌類のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、その適当な混合物及び植物油を含む溶媒又は分散媒であってよい。適当な局所製剤には、経皮投与装置、エアゾール、クリーム、軟膏、ローション、丸衣剤などが含まれる。有効成分を含むこれらの製剤は慣用法に従って製造し得る。例えば、所望の稠度を有するクリーム又は軟膏の製造に十分な量の親水性物質と約５〜１０重量％の化合物を含む十分な量の水を混合してクリームや軟膏を製造する。経直腸投与に適した医薬組成物（ここで、担体は固体である）が単位薬用量の座薬として最も好ましい。適当な担体には、ココアバターや当業界で通常用いられている他の物質が含まれる。座薬は、軟化又は溶融担体と組み合わせて混合し、次いで冷却、成形して形成するのが便利である。上記医薬組成物は、適切な場合には、上記担体成分の他に、１種以上の追加担体成分、例えば、稀釈剤、緩衝剤、矯味・矯臭剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（酸化防止剤を含む）などや、組成物を対象受容者の血液と等張にするために含有される物質を含み得る。家禽のコクシジウム症の防除処置に用いる場合、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は飼料組成物の１成分として投与するのが便利である。適当な家禽飼料組成物は、典型的には約１〜約１，０００ｐｐｍ、好ましくは、約０．０１〜約０．１重量％のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。最適なレベルは、当然、関与するアイメリアの種に応じて異なり、当業者が容易に決定し得る。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに関わる病原体の防除には、家禽飼料の食餌の約０．０１〜約０．１重量％のレベルが特に有用であり、腸内に寄生する種の類似の防除に好ましい濃度は、食餌の約０．０１〜約０．１重量％である。盲腸や腸のコクシジウム症の病原性作用の軽減には約０．０１〜約０．１重量％の量が有利である。家禽飼料を製造する場合、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を微粉剤形態で家禽飼料と機械的に混合して同飼料中に分散させるか、又は中間組成物（プレミックス）と機械的に混合して同組成物に分散させた後、他の成分とブレンドして、家禽に与える最終家禽飼料を容易に製造し得る。家禽飼料の典型的な成分には、糖蜜、発酵残留物、コーンミール、ひきオートムギ及び押しオートムギ、コムキの麦芽やふすま入り飼料及びふすま入り粗挽き小麦粉、アルファルファ、クローバー並びに肉粉と共に、骨粉、炭酸カルシウム及びビタミン類のようなミネラル補助成分が含まれる。式Ｉの化合物を含む組成物は、粉末又は液体濃縮物形態で製造することもできる。標準的な家畜製剤慣行に従い、ラクトース又はスクロースのような慣用の水溶性賦形剤を散剤に混和して、該製剤の物性を改良することができる。従って、本発明の特に適当な散剤は、５０〜１００％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗの組み合わせ体と、０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ｗ／ｗの慣用家畜用賦形剤を含む。これらの散剤は、例えば、中間体プレミックスを介して動物飼料に添加してもよいし、動物が飲む水に稀釈してもよい。本発明の濃縮液は、水溶性化合物組み合わせ体を含むのが適当であり、場合によって、家畜に許容し得る水溶性溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマール、又は最大３０％ｖ／ｖのエタノールとの混合溶媒を含み得る。濃縮液は、動物、特に家禽の飲料水に加え得る。実施例に用いた材料の製造法１．アピシジン（Ｉａ）（ａ）フザリウム属の接種培養ＡＴＣＣ７４３２２フザリウム属ＡＴＣＣ７４３２２を含む寒天斜面培地の一部を、以下の組成を有する５０ｍｌの種培地を含有する２５０ｍｌ容のバッフル無しフラスコに無菌移植した：酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）４．０ｇ／Ｌ麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ）８．０ｇ／Ｌグルコース４．０ｇ／ＬＪｕｎｌｏｎ（ポリアクリル酸、ＫｏｕｙｏｋＴｒａｄｉｎｇＣｏ．，Ｔｏｋｙｏ）１．５ｇ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（滅菌前にｐＨを７．０に調整）培養体を半径２インチの回転振とう盤（２２０ｒｐｍ）上２５℃、８５％相対湿度（ｒｈ）で３日間インキュベートしてバイオマスを得た。バイオマスを部分に分け、グリセロールを含む滅菌バイアルに移し、（凍結栄養菌糸として）凍結した。該菌糸を１０〜１５％グリセロールの最終濃度で−７５℃に維持した。室温に解凍した上記凍結栄養菌糸のバイアルを種培地に接種し（種培地５０ｍｌ当たり１ｍｌ）、培養体を上記条件下に２〜４日間インキュベートした。種培養体の調製にも以下の組成を有する種培地を用い得る：コーンスティープリカー５．０ｇ／Ｌトマトペースト４０．０ｇ／Ｌオート粉１０．０ｇ／Ｌグルコース１０．０ｇ／Ｌ微量成分ミックス^* １０ｍｌ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（滅菌前にｐＨを６．８に調整）^* 組成（ｇ／Ｌ）＝ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１．０）；ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ（１．０）；ＣｕＣｌ₂・Ｈ₂Ｏ（０．０２５）；ＣａＣｌ₂（０．１）；Ｈ₃ＢＯ₃（０．０５６）；（ＮＨ₄）₆ＭｏＯ₂・４Ｈ₂Ｏ（０．０１９）；ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．２）。（ｂ）フザリウム属の産生培養種培地のアリコート（１２ｍｌ）を以下の組成を有する産生培地の液状部２２０ｍｌ中に植え込んだ：グルコース１５０．０ｇ／ＬＮＺアミンＴｙｐｅＡ４．０ｇ／Ｌ（ＳｈｅｆｆｉｅｌｄＰｒｏｄｕｃｔｓ）尿素４．０ｇ／ＬＫ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／ＬＫＣｌ０．２５ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２５ｇ／ＬＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．９ｇ／ＬＣａＣＯ₃ １６．５ｇ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（ｐＨ７．０）。この混合物をぐるぐるかき混ぜてバイオマスを分散させ、次いで、６７５ｃｍ³ の蒸気滅菌した大粒のバーミキュライト（固体部分）を含有する２Ｌ容の回転培養容器中に注いだ。回転ビンの内容物を振とう／混合して、全体に均一な接種と適用範囲を確実にした。回転ビンをＷｈｅａｔｏｎ回転装置上で水平方向に約４ｒｐｍで回転させながら２２℃、７５％ｒｈで２４日間インキュベートして、発酵培地中で第２の代謝産物を得た。該培養から、上記産生培地の液状部を含む液体培地（２５０ｍｌ容のバッフル無しフラスコ中５０ｍｌ）中で所望の代謝物も産生した。フラスコを２２℃、７５％ｒｈで７〜１４日間インキュベートした。さらに上記液体産生培地を用い、２３Ｌ容のタンク発酵装置中での発酵も行った。１０Ｌの産生培地＋１０ｍｌのＰｏｌｙｇｌｙｃｏｌ２０００（Ｄｏｗ）を５００ｍｌの種培養体と共に接種し、２１℃で、４００ｒｐｍに設定した攪拌下に、風量５Ｌ／分及び圧力０．３バールで発酵させた。攪拌は５００ｒｐｍから６００ｒｐｍに加速し、風量は発酵６日目（０日は発酵開始日）に１０Ｌ／分に増大した。生成物を単離するために１４日後に発酵ブイヨンを採取した。同じ条件を以下の組成を有する産生培地を用いる２３Ｌ容のタンク発酵にも用いた：グルコース１５０．０ｇ／Ｌフルクトース１５．０ｇ／Ｌスクロース４０．０ｇ／ＬＮＺアミンＴｙｐｅＥ４．０ｇ／Ｌ（ＳｈｅｆｆｉｅｌｄＰｒｏｄｕｃｔｓ）尿素４．０ｇ／ＬＫ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／ＬＫＣｌ０．２５ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２５ｇ／ＬＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．９ｇ／ＬＣａＣＯ₃ ８．０ｇ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（ｐＨ７．０）。（ｃ）アピシジンの単離及び精製上記のように調製した発酵ブイヨン（１．６Ｌ）をメチルエチルケトン（ＭＥＫ）で抽出した。溶媒を蒸発させた後、残留水性懸濁液を凍結乾燥した。得られた固体塊を塩化メチレンで十分にすり砕き、濾過した。先ず、溶液を、９７：３（ｖ／ｖ）の塩化メチレン−メタノールを用いる無水Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０の１００ｍｌ容ベッド上で高速分別して、０．６カラム容量の洗浄を行った後、化合物Ｉａ富化試料を得た。溶離剤として酢酸エチル／塩化メチレン（１：２ｖ／ｖ）を用いるＥＭシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにかけて最終精製を実施し得る。収量：約５ｍｇの均一物質。２．アピシジン類似体Ｉｂ及びＩｃ（ａ）Ｆｕｓａｒｉｕｍｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍの種培養ＦｕｓａｒｉｕｍｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍＡＴＣＣ７４２８９を含む寒天斜面培地の一部を、以下の組成を有する種培地５０ｍｌを含む２５０ｍｌ容のバッフル無しフラスコに無菌移植した：酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）４．０ｇ／Ｌ麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ）８．０ｇ／Ｌグルコース４．０ｇ／ＬＪｕｎｌｏｎ（ポリアクリル酸、ＫｏｕｙｏｋＴｒａｄｉｎｇＣｏ．，Ｔｏｋｙｏ）１．５ｇ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（滅菌前にｐＨを７．０に調整）。培養体を半径２インチの回転振とう盤（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、８５％相対湿度（ｒｈ）で２日間インキュベートしてバイオマスを得た。バイオマスを部分に分け、グリセロールを含有する滅菌バイアルに移し、（凍結栄養菌糸として）凍結した。これらを１０〜１５％グリセロールの最終濃度で−７５℃に維持した。上記凍結栄養菌糸のバイアルを室温に解凍し、種培地に接種（種培地５０ｍｌ当たり１ｍｌ）し、培養体を上記条件下にインキュベートした。（ｂ）Ｆｕｓａｒｉｕｍｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍの産生培養種培養体のアリコート（上記種培地中１２ｍｌ）を、以下の組成を有する産生培地の液状部２２０ｍｌ中に植え込んだ：グルコース１５０．０ｇ／Ｌフルクトース１５．０ｇ／Ｌスクロース４０．０ｇ／ＬＮＺアミンＴｙｐｅＥ４．０ｇ／Ｌ（ＳｈｅｆｆｉｅｌｄＰｒｏｄｕｃｔｓ）尿素４．０ｇ／ＬＫ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／ＬＫＣｌ０．２５ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２５ｇ／ＬＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．９ｇ／ＬＣａＣＯ₃ ８．０ｇ／Ｌ蒸留水１Ｌまでの量（ｐＨ７．０）。この混合物をぐるぐるかき回してバイオマスを分散させ、６７５ｃｍ³の蒸気滅菌した大粒のバーミキュライト（固体部分）を含有する２Ｌ容の回転培養容器中に注いだ。回転ビンの内容物を振とう／混合して、均一な接種及び適用範囲を確実にした。回転ビンを、Ｗｈｅａｔｏｎ回転装置上で水平方向に約４ｒｐｍで回転させながら、２２℃、７５％ｒｈで１９日間インキュベートして、発酵培地中で第２代謝産物を得た。（ｃ）単離及び精製２２５ｍｇの化合物Ｉａを含む上記のように調製した発酵ブイヨン（５．６Ｌ）を、メチルエチルケトンを用い、２時間攪拌して、消費したバイオマスを濾去して抽出した。減圧下に溶媒を蒸発させ、得られた水性懸濁液を蒸発させた後、得られた半固体残留物を２００ｍｌの塩化メチレン中に入れ、濾過して、大量の不溶性非関連物質を除去した。溶液を再度蒸発させ、新たに得られた残留物をメタノールに溶解した。メタノール中のＳｅｐｈａｄｅｘＬＸ−２０の９５０ｃｃカラム上のゲル濾過により分別を進め、０．５５〜０．６５カラム容量後に化合物Ｉａと数種の関連類似体が溶出した。その後、塩化メチレン中のメタノールのステップ勾配で溶離する１２０ｃｃＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０カラム上のフラッシュクロマトグラフィーにかけた。３％メタノール洗浄に対応する画分中で標的化合物が一緒に溶出した。最初のシリカカラムから溶出した物質を、塩化メチレン／酢酸エチルの３：１ｖ／ｖ混合物から酢酸エチル含量を徐々に１００％まで増大させて溶離する新規の１２０ｃｃＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０カラムにかけ、溶出順に４つの画分を得た。画分IIIは、Ｉｂを含む化合物の混合物を含み、該画分をそのままＨＰＬＣ（上記と同一条件）にかけて処理した。勾配溶離中１５．５分後に均質化合物Ｉｂが認められた。一方、画分IVは、ＨＰＬＣにかけるにはあまりに複雑であることが判明したので、先ず該画分をＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０上でゲル濾過してさらに濃厚にしてから、ＨＰＬＣ（５０℃に維持した９×２５０ｍｍＺｏｒｂａｘＲｘＣ₈ カラム、流速２ｍｌ／分、３０％水性アセトニトリルで１時間→６０％アセトニトリル勾配の２時間かけてのアイソクラチック溶離）にかけて化合物Ｉｃの最終精製を行った。Ｖｅ＝６．９−７．２のカラム容量。３．アピシジン類似体IIＡ及びIIＢ酸素雰囲気下に３ｍｌの塩化メチル及び０．１５ｍｌのピリジン中に７．２ｍｇのＣｕ^(II)（ＯＡｃ）₂を含む溶液を調製した。該溶液に、３ｍｌの塩化メチレン中５０ｍｇのアピシジンの溶液を一度に加えた。溶液を室温で１２時間攪拌し、次いで、４時間４５℃に加熱した。溶媒を減圧除去し、残留物を６ｍｌのメタノール／水（１：１）に溶解し、これに１５０ｍｇのＮａＩＯ₄を加えた。溶液を４０℃で４８時間攪拌した。溶液をブラインで稀釈、塩化メチレンで抽出し、有機層を脱水（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過、減圧濃縮した。粗生成物を、溶離剤として１：１のアセトン／ヘキサンを用いる分取薄層クロマトグラフィー（３×１０００μｍシリカゲルプレート）にかけて部分精製した。下方のバンドを、溶離剤として１：１のアセトン／ヘキサンを用いる分取ＴＬＣ（１×１０００μｍシリカゲルプレート）にかけて再精製し、化合物IIＡ（３ｍｇ）及び化合物IIＢ（２ｍｇ）を得た。両化合物とも満足すべき陽子ＮＭＲスペクトルを生成した。物性：化合物IIＡ：Ｒ_f＝０．３３（溶離剤として１：１のアセトン／ヘキサンを用いるＴＬＣによる）Ｔ_r＝６．１分（溶離剤５０：５０のアセトニトリル／水、流速２ｍｌ／分、４．６×３０ｃｍＺｏｒｂａｘＲＸ−８カラムによる）ＭＳ：６３８（Ｍ＋１）；化合物IIＢ：Ｒ_f＝０．１７（溶離剤として１：１のアセトン／ヘキサンを用いるＴＬＣによる）Ｔ_r＝５．７分（溶離剤５０：５０のアセトニトリル／水、流速２ｍｌ／分、４．６×３０ｃｍＺｏｒｂａｘＲＸ−８カラムによる）ＭＳ：６０８（Ｍ＋１）。３．２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジンアピシジン（２５ｍｇ，０．０４０１ｍｍｏｌ）を分子ふるいにかけた（３：２）ＣＨ₂Ｃｌ₂／１−ブタノール（４ｍｌ）に溶解し、２０％水酸化パラジウム −炭（約２．５ｍｇ）を加えた。該系を水素ガスで３回真空パージし、反応混合物を１ａｔｍのＨ₂下に２時間２３℃で激しく撹拌した（ＴＬＣ制御；ＳｉＯ₂ ，１：１のアセトン−ヘキサン；アピシジンＲ_f ０．５０，Ｎ−デスメトキシアピシジンＲ_f ０．３８）。次いで、反応混合物をセライトプラグを介して濾過し、塩化メチレンで十分に洗浄し、濾液を真空濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，１：３：９６のＮＨ₄ＯＨ−ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃，３×９ｃｍ）にかけて精製し、真空濃縮して、白色粉末としてＮ−デスメトキシアピシジン（２２．２ｍｇ，理論量２３．８ｍｇ，９３％）を得た。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（２ｍｌ／分で４０％アセトニトリル−水→アセトニトリルの勾配溶離，８．５分でピーク溶出；ＺｏｒｂａｘＲｘ−Ｃ８，４．６ｍｍ×２５ｃｍ）；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５００ＭＨｚ）満足すべき結果を得た；ＥＳＩ−ＭＳ（ＭｅＣＮ−Ｈ₂Ｏ−ＴＦＡ）ｍ／ｅ５９４（Ｍ⁺，Ｃ₃₃Ｈ₄₇Ｎ₅Ｏ₅の計算値：５９３．７７）。Ｎ−デスメトキシアピシジン（１０ｍｇ，０．０１６８ｍｍｏｌ）を分子ふるいにかけたＣＨＣｌ₃（１７０μｌ）に溶解し、０℃に冷却した。ピリジニウムブロミドペルブロミド（８．１ｍｇ，０．０２５３ｍｍｏｌ，１．５当量）をそのまま０℃で加え、反応混合物を窒素雰囲気下に０℃で４５分間攪拌した（ＴＬＣ制御；ＳｉＯ₂，１：３：９６のＮＨ₄ＯＨ−ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃；Ｎ−デスメトキシアピシジンＲ_f ０．４０，２−ブロモ−Ｎ−デスメトキシアピシジンＲ_f ０．４４）。０℃で反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ₃でクエンチし、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機層を水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、真空濃縮した。粗残留物を分取逆相ＨＰＬＣ（２０ｍｌ／分での４０％アセトニトリル−水→アセトニトリルの勾配溶離，２２分でピーク溶出）にかけて精製し、凍結乾燥して、白色粉末として２−ブロモ−Ｎ−デスメトキシアピシジン（４．３ｍｇ，理論量１１ｍｇ，４０％）を得た。分析用ＲＰ− ＨＰＬＣ（２ｍｌ／分での４０％アセトニトリル−水→アセトニトリルの勾配溶離，９分でピーク溶出；ＺｏｒｂａｘＲｘ−Ｃ８，４．６ｍｍ×２５ｃｍ）；¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５００ＭＨｚ）満足すべき結果を得た；ＥＳＩ−ＭＳ（ＭｅＣＮ−Ｈ₂Ｏ−ＴＦＡ）ｍ／ｅ６７４（Ｍ⁺，Ｃ₃₃Ｈ₄₆Ｎ₅Ｏ₅Ｂｒの計算値：６７２．６７）。２−ブロモ−Ｎ−デスメトキシアピシジン（２ｍｇ，０．００３０ｍｍｏｌ）を分子ふるいにかけたＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍｌ）に溶解し、２０％水酸化パラジウム −炭（約０．５ｍｇ）を加えた。該系をジュウテリウムガスで２回真空パージし、反応混合物を１ａｔｍのＤ₂下に２３℃で２時間激しく攪拌した（ＴＬＣ制御；ＳｉＯ₂，１：３：９６のＮＨ₄ＯＨ−ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃；２−ブロモ− Ｎ−デスメトキシアピシジンＲ_f ０．４０，２−Ｄ−Ｎ−デスメトキシアピシジンＲ_f ０．３４）。次いで、反応混合物をセライトプラグを介して濾過し、塩化メチレンで十分に洗浄し、濾液を真空濃縮して、白色粉末として２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン（１．４ｍｇ，理論量１．８ｍｇ，８０％）を得た。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（２ｍｌ／分での４０％アセトニトリル−水→アセトニトリルの勾配溶離，２−Ｄ−Ｎ−デスメトキシアピシジンの場合には９．８分及び２−ブロモ−Ｎ−デスメトキシアピシジンの場合には１０．７分でピーク溶出；ＺｏｒｂａｘＲｘ−Ｃ８，４．６ｍｍ×２５ｃｍ）；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５００ＭＨｚ）満足すべき結果を得た；ＥＳＩ−ＭＳ（ＭｅＣＮ−Ｈ₂Ｏ−ＴＦＡ）ｍ／ｅ５９５（Ｍ⁺，Ｃ₃₃Ｈ₄₆ Ｎ₅Ｏ₅Ｄの計算値：５９４．７８）。 ³Ｈ₂を用いて２−ブロモ−Ｎ−デスメトキシアピシジンを２−Ｄ−Ｎ−デスメトキシアピシジンに変換する上記ステップを繰り返して、標記三重水素化化合物を得た。４．ＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ε−¹⁴Ｃ−Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ε−¹⁴Ｃ−Ａｃ）−ＶａｌＮＨ₂ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，２０μｌ）中のＡｃＧｌｙ−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−ＶａｌＮＨ₂（０．５ｍｇ，０．３２μｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸ナトリウム（５ｍｇ）、次いでジクロロメタン中の［¹⁴Ｃ］アセチルクロリドの溶液（５μｌ，５０μＣｉ，０．８７７μｍｏｌ，比活性＝５７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で０．５時間攪拌し、メタノール（２００μｌ）を加え、溶液をガラスウールプラグを介して濾過し、炭酸ナトリウムを除去した。濾液を窒素下に４５℃でほぼ乾燥するまで濃縮し、得られた残留物をメタノール（５００μｌ）に再溶解した。粗生成物を、Ｖｙｄａｃ２１０ＨＳ５４カラム（９．４×２５０ｍｍ）を用い、移動相が３０分間での５％→２０％アセトニトリル／０．１％水性トリフルオロ酢酸の勾配からなり、流速が３ｍｌ／分の分取逆相ＨＰＬＣにかけて精製した。生成物を含む画分を合わせ、真空濃縮してアセトニトリルを除去し、１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液を用いてｐＨを６．８に調整し、標識した標記化合物（水溶液４ｍｌ中の１７μＣｉ，予測比活性＝１１４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を得た。該化合物は、ＨＰＬＣ分析（Ｖｙｄａｃ２１０ＨＳ５４カラム，４．６×２５０ｍｍ，２０分間での５％→２５％アセトニトリル／０．１％水性トリフルオロ酢酸の移動相勾配、１ｍｌ／分）にかけて測定すると、＞９９％の放射線化学純度を有していた。５．ＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ε−³Ｈ−Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ε−³Ｈ−Ａｃ）−ＶａｌＮＨ₂ ３：２のＤＭＦ−水（１００μｌ）中のＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＶａｌＮＨ₂（３．１ｍｇ，２．０μｍｏｌ）の溶液に、ナトリウム［³Ｈ］アセテート（２：１のＤＭＦ−水中０．２Ｍ溶液４０ μｌ，８μｍｏｌ，比活性＝２．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、次いで、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ，ＤＭＦ中０．２５Ｍ溶液４８μｌ，１２ μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ，ＤＭＦ中０．２５Ｍ溶液４８μｌ，１２μｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ，ＤＭＦ中０．５Ｍ溶液４８μｌ，２４μｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で一晩放置し、酢酸（２０μｌ）及びメタノール（１８０μｌ）を加えた。Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５１０カラム（９．４×２５０ｍｍ）上の多重注入によるＨＰＬＣ（流速５ｍｌ／分；２１０ｎｍでの検出；１６分間での４％→１６％アセトニトリル／０．１％水性トリフルオロ酢酸の移動相勾配）にかけて生成物を単離した。生成物を含む画分を合わせ、エタノールで連続フラッシュしながら真空濃縮してＴＦＡを除去した。標識した標記化合物（３．７ｍＣｉ，予測比活性＝３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をエタノール中の溶液（１．５ｍｌ）として得た。該化合物は、ＨＰＬＣ分析（ＺｏｒｂａｘＲｘ−Ｃ８カラム，４．５×２５０ｍｍ，１５／８５／０．１のメタノール：水：過塩素酸，１ｍｌ／分，２２０ｎｍ）にかけて測定すると、９２．５％の放射線化学純度を有していた。以下の非限定的実施例により本発明を説明する。実施例１：競合的結合アッセイ（ａ）溶解物の調製ニワトリの肝臓：３〜５羽の３週齢のニワトリの肝臓を摘出し、氷冷リン酸塩緩衝塩水（ｐＨ７．４）中でリンスし、さいの目に切断し、再度、０．１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む氷冷５０ｍＭＮ− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）で３、４回リンスする。次いで、組織をＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、ポリトロンホモジナイザー中でホモジナイズし、３，０００×ｇで１０分間遠心する。次いで、上清をさらに１００，０００×ｇで１時間遠心する。ペレット及び脂質の浮上層を廃棄し、上清をニワトリ肝臓Ｓ１００画分と称し、結合アッセイ用に取っておく。タンパク質濃度を予測した後、上清（Ｓ１００）をアリコート化し、−８０℃で凍結する。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ卵母細胞：約２×１０⁹個のＥ．ｔｅｎｅｌｌａ卵母細胞を５ｍｌのＰＢＳ／０．１ｍＭＰＭＳＦに懸濁し、４．０ｍｍ及び１．０ｍｍのガラスビーズの等量混合物（ｖ／ｖ）４ｍｌを加える。次いで、ガラスビーズ −卵母細胞混合物を２０分間振とうして、卵母細胞を破壊する。顕微鏡で破壊効率を調べる。得られたホモジネートをガラスビーズから分離し、３，０００×ｇで１０分間遠心する。次いで、上清をさらに１００，０００×ｇで１時間遠心する。ペレットを廃棄し、上清をＥ．ｔｅｎｅｌｌａＳ１００画分と称し、結合アッセイ用に取っておく。タンパク質濃度を予測した後、上清（Ｓ１００）をアリコート化し、−８０℃で凍結する。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ：（５０％を超える寄生虫感染赤血球を含む）Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉマラリア感染マウスから２２．５ｍｌの血液を採取し、氷上に１５分間置いたサポニン〔１００：１容量のリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中１０％サポニン〕で処理して寄生虫を放出し、２，０００×ｇで１０分間遠心する。ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで、凍結、総容量２ｍｌ中に０．１ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳ（ＰＢＳ／ＰＭＳＦ）中で３回解凍する。次いで、ＰＢＳ／ＰＭＳＦを加えて、容量を１０ｍｌとし、懸濁液を１００，０００×ｇで１．５時間遠心する。ペレットを廃棄し、上清をＰ．ｂｅｒｇｈｅｉＳ１００画分と称し、結合アッセイ用に取っておく。タンパク質濃度を予測した後、上清（Ｓ１００）をアリコート化し、−８０℃で凍結する。（ｂ）競合的結合アッセイ各アッセイ管は、最終容量１ｍｌ中、１．３ｎｇ／ｍｌの³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン、１５０〜２００μｇの適切なＳ１００上清及び０．００１〜１０μｇ／ｍｌの潜在的ＨＤＡ阻害剤濃縮物を含む。（ｉ）標識基質：２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン（１８．６９ｍＣｉ／ｍｇ）をエタノール中１：１００に稀釈し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｔｏｎ）１ｍｌ当たり該溶液２μｌを加える。これによりアッセイ液１ｍｌ当たり１．３ｎｇの２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン（５４，０００ＤＰＭ／ｍｌ）を得る。（ii）潜在的ＨＤＡ阻害剤：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１ｍｌ当たりテスト化合物２ｍｇを含むストック溶液を調製する。該ストック溶液をエタノール中１，０００、１００、１０、１及び０．１μｇ／ｍｌに稀釈する（この場合には全滴定を要する）。陰性対照としてエタノールを用い、陽性対照として非標識Ｎ−デスメトキシアピシジンの１００μｇ／ｍｌ溶液を用いる。アッセイには、６μｌのテスト化合物溶液、陽性対照及び陰性対照を用いる。（iii）（ａ）からの上清：Ｓ１００試料を、ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液中３．０ｍｇのタンパク質／ｍｌ（ニワトリ肝臓）又は４ｍｇのタンパク質／ｍｌ（寄生虫）の濃度に稀釈する。アッセイには５０μｌを用いる。潜在的ＨＤＡ阻害剤（ii）のストック溶液を５０ｍＭＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液に稀釈して、０．００１〜１０μＭの範囲の最終濃度のテスト化合物を得る。³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジンを１．３ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加える。各管に、５０μｌの寄生虫又はニワトリ肝臓Ｓ１００溶液（１５０〜２００μｇ）を加える。アッセイ混合物を２５℃で１時間インキュベートし、次いで、ポリエチレンイミンを含浸させたＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂフィルター（水３３０ｍｌ当たり２ｍｌのポリエチレンイミンに室温で１時間ソーキングして前処理したフィルター）を介して吸引する。アッセイ管を１〜２ｍｌのＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｔｏｎで３回リンスし、前記フィルターを介して吸引した。次いで、フィルターを乾燥し、リン光（scintilant）を計数する。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ及びニワトリ肝臓溶解物を用いる結合アッセイで、化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、IIＡ、IIＢ、トリコスタチン、トリコスタチン酸（trichost atic acid）及びＨＣ−ｔｏｘｉｎを評価した。トリコスタチン酸は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ溶解物でもニワトリ肝臓溶解物でも＞１，０００ｎＭのＩＣ₅₀値を示した。他の化合物は全て、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ溶解物では４〜６０ｎＭの範囲のＩＣ₅₀ 値を示し、ニワトリ肝臓溶解物では、化合物IIＡ及びIIＢを除き、２〜３５ｎＭの範囲のＩＣ₅₀値を示した。化合物IIＡ及びIIＢは、ニワトリ肝臓溶解物よりもＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対して選択的である（ニワトリ肝臓において、ＩＣ₅₀＞１，０００ｎＭ）。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ⁽¹⁾及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ⁽²⁾に対する化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、トリコスタチン、トリコスタチン酸、ＨＣ−ｔｏｘｉｎの抗寄生虫活性をｉｎｖｉｔｒｏで評価した。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ溶解物でもニワトリ肝臓溶解物でも＞１，０００ｎＭのＩＣ₅₀値を示したトリコスタチン酸は、いずれの寄生虫に対しても活性ではなかった。他の化合物は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに対して８〜２５０ｎｇ／ｍｌの範囲の最低阻害濃度を有し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対するＩＣ₅₀値は７〜１１５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。⁽¹⁾ 概して、Ｃｒａｎｅ，Ｓｃｈｍａｔｚ，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｈａｂｂｅｒｓｅｔｔ及びＭｕｒｒａｙ，Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ：ｉｎｖｉｔｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄｂｏｖｉｎｅｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ（１９８４）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ８８：５２１−５３０に記載の手順に従う。⁽²⁾ 概して、Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓら，“ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＡｎｔｉｍａｌａｒｉａｌＡｃｔｉｖｉｔｙＩｎＶｉｔｒｏｂｙａＳｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄＭｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅ”ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９７９，１６：７１０−７１８に記載の手順に従う。実施例２：ヒストンのアセチル化状態の測定ＨｅＬａ細胞ヒストンの調製：３７℃で増殖中の約２×１０⁷個のＨｅＬａ細胞を標準組織培地（１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ）中の種々の化合物で４時間処理した。次いで、細胞を約１０ｍｌの総容量のＰＢＳ中でこすり落としてフラスコから取り出した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、約３ｍｌの溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ緩衝液；０．４５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。懸濁液を１０秒間ぐるぐるかき回して混合、１５分間氷上でインキュベートし、溶解緩衝液中３０％スクロースの１ｍｌクッションを介して１，３００×ｇで１０分間遠心して核をペレット化した。上清を廃棄し、次いで、核を１．０ｍｌの水に再懸濁した。Ｈ₂ＳＯ₄を０．４Ｍの最終濃度になるまで加え、核懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、次いで、１３，０００×ｇで１０分間遠心してペレット化した。ペレットを廃棄し、上清タンパク質に１０容量の氷冷アセトンを加え、−２０℃で一晩放置して、可溶性タンパク質を沈降させた。これらのタンパク質（主にヒストン）を１０，０００×ｇで１５分間４℃で遠心してペレット化し、ゲル電気泳動用にＡＵＴ試料緩衝液（試料緩衝液：０．９Ｍ酢酸、０．０２％ｗ／ｖメチルグリーン）に再懸濁した。ゲル電気泳動：Ａｌｆａｇｅｍｅら（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９，３７２９の方法に従い、但し、Ｌｅｎｎｏｘ及びＣｏｈｅｎ（ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７０，５３２−５４９）に記載のように変更を加えて、酸・尿素・トリトン（ＡＵＴ）ポリアクリルアミドゲルを実施した。ＨｅＬａ細胞及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍのヒストンを最適に分離するために、分離用のゲルに、７．５Ｍの尿素、１２％のアクリルアミド、０．３８％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０８％のビスアクリルアミド及び０．８７Ｍの酢酸を含めた。充填用のゲルには、７．５Ｍの尿素、０．３７％のＴｒｉｔｏｎＸ −１００、６％のアクリルアミド、０．０４％のビスアクリルアミド及び０．８７Ｍの酢酸を含めた。ゲルを１Ｍ酢酸中で泳動させた。３５０Ｖで１時間ゲルを予備電気泳動させ、４５０Ｖで３．５時間泳動させた。ゲルは、７％酢酸、２０％メタノール中のクーマシーブリリアントブルーＲで染色し、次いで７％酢酸及び２０％メタノール中で脱色するか、又はＥｎｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ製）で処理し、脱水して、フルオログラフィーにより放射性標識を検出した。図１に示されているように、アピシジン、トリコスタチン及びＨＣ−ｔｏｘｉｎにより、ヒストンのゲルプロフィールには非処理細胞と異なる移動が生じる。この変化は、Ｈ４ヒストンの場合に最も顕著であった。処理細胞中ではヒストンが高アセチル化されるために、Ｈ４の上方バンドは顕著に増加し、Ｈ４の下方バンドは減少した。これは、ヒストンのアセチル化状態が高度であればある程、ヒストンのゲル中での移動が遅くなるために生じる。¹⁴ ＣアセテートによるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの標識：約１×１０⁹個のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（約６０％の寄生虫感染）を、種々の濃度のテスト化合物及び２５０μＣｉの¹⁴Ｃ酢酸ナトリウムを含む１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、下記のようにヒストンを調製した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍヒストンの調製：Ｃａｒｙら（１９９４）ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙＲｅｓｅｒａｃｈ，８０，２５５−２５８の方法に従ってヒストンを調製した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球に１／１００容量の１０％サポニン／ＰＢＳを加えて赤血球を溶解し、放出された寄生虫をＰＢＳで洗浄してペレット化した。寄生虫を１ｍｌの低張溶解緩衝液〔１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、２ｍＭのＰＭＳＦ、０．２ｍＭのＮ−α−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、０．２５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１０μｇ／ｍｌのペプスタチン〕に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、ダウンス（dounce）ホモジナイザー中１００ストロークで溶解した。１３，０００×ｇで１０分間遠心して核濃厚ペレットを得、ペレットを水に再懸濁し、ヒストンを調製、ＨｅＬａ細胞について記載したようにＡＵＴゲル上で泳動させた。図２に示されているように、アピシジンとトリコスタチンとにより、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍヒストンが高アセチル化される。これは、¹⁴Ｃ−アセチル化量の全体的な増加及び標識ヒストンのバンドパターンの移動によって示される。処理した寄生虫の上方への移動は、（ゲル中での泳動が遅い）多くのアセチル化リシンを含むヒストン集団の増加と、（ゲル中での移動が速い）非アセチル化又は低アセチル化ヒストンの数の減少とにより生じる。実施例３：ヒストンデアセチラーゼ阻害アッセイ（全ての温度は℃である）ヒストンデアセチラーゼ活性及び阻害アッセイ１：標準アッセイ液は、総容量４０μｌ中：ＨＥＰＥＳ−ナトリウム、ｐＨ７．４（４００ｎｍｏｌ）、約１１４ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を有する基質〔ＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ε−¹⁴Ｃ−Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ（ε−¹⁴Ｃ−Ａｃ）−ＶａｌＮＨ₂〕〔Ｋｅｒｖａｂｏｎら（１９７９）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ１０６：９３−９６参照〕（１００ｐｍｏｌ）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡアーゼ）活性源を含んでいた。加えたＨＤＡアーゼの量は、基質の≦２０％がアッセイ中に消費されるように選択した。酵素を添加して反応を開始し、４１℃で６０分間反応を進めた。６０分経過したときに、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．２（２００μｌ）中のＡｍｂｅｒｌｉｔｅＡＧ５０Ｗ×４カチオン交換樹脂−ナトリウム形態（２００〜４００メッシュ）の５０％スラリーを加えて反応を停止した。該樹脂は、残留基質にも（部分）脱アセチル化ペプチジル生成物にも結合する。次いで、クエンチした反応体を２５℃で少なくとも３０分間ときどき攪拌しながらインキュベートし、さらに２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．２（７６０μｌ；最終容量１，０００μｌ）を加えて稀釈し、さらに、少なくとも３０分間２５℃でときどき攪拌しながらインキュベートし、次いで、１０，０００×ｇで１分間遠心した。酵素により放出された¹⁴Ｃ−アセテートを含む上清のアリコート（８００ μｌ）を取り出し、Ａｑｕａｓｏｌ２液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）カクテル（１０ｍｌ）と混合し、ＢｅｃｋｍａｎモデルＬＳ−５８０１ＬＳＣで計数した。アセテートの放出が特異的にＨＤＡアーゼの作用によるものかどうかを確認するために、公知ＨＤＡアーゼ阻害剤〔初期には、１〜５ｍＭのブチレート（Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１７１６−１７２３参照）、後には、かつて、ＨＤＡアーゼ阻害剤であると証明されたＤＭＳＯ中４０〜１，０００ｎＭのアピシジン〕を含む対照の並行インキュベーションを行った。阻害剤の存在下に生成した放射能の量を阻害剤の不在下に得られた値から差し引いて、ＨＤＡアーゼ依存性アセテート生産量を計算した。阻害実験では、検査すべき阻害剤を標準アッセイカクテルにジメチルスルホキシド中の所望濃度（反応体中のＤＭＳＯの最終濃度は２．５％ｖ／ｖで一定に維持した）で加え、ＨＤＡアーゼ活性を、阻害剤を含まず２．５％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯを含む対照（阻害剤を含まない）のインキュベーションにおいて認められた活性と比較した。ヒストンデアセチラーゼ活性及び阻害アッセイ２：標準アッセイ液は、総容量２００μｌ中：ＨＥＰＥＳ− ナトリウム、ｐＨ７．４（２，０００ｎｍｏｌ）、約３Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を有するＡｃＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ε−³Ｈ−Ａｃ）−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ε−³Ｈ−Ａｃ）−ＶａｌＮＨ₂（１１ｐｍｏｌ）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡアーゼ）活性源を含んでいた。加えたＨＤＡアーゼの量は、基質の≦２０％がアッセイ中に消費されるように選択した。酵素を添加して反応を開始し、４１℃で６０分間反応を進めた。６０分経過したときに、０．１Ｍの酢酸及び０．５Ｍの塩酸を含む水溶液（２０μｌ）、次いで酢酸エチル（１，０００μｌ）を加えて反応を停止した。次いで、クエンチした反応体を２５℃ で少なくとも１５秒ぐるぐるかき回し、１０，０００×ｇで１分間遠心した。酵素により放出された³Ｈ−アセテートを含む酢酸エチル相のアリコート（９００ μｌ）を取り出し、Ａｑｕａｓｏｌ２液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）カクテル（６ｍｌ）と混合し、ＢｅｃｋｍａｎモデルＬＳ−５８０１ＬＳＣで計数した。アセテートの放出が特異的にＨＤＡアーゼの作用によるものかどうかを確認するために、公知ＨＤＡアーゼ阻害剤〔初期には、１〜５ｍＭのブチレート、後では、かつて、ＨＤＡアーゼ阻害剤であると証明されたＤＭＳＯ中４０〜１，０００ｎＭのアピシジン〕を含む対照の並行インキュベーションを行った。阻害剤の存在下に生成した放射能の量を阻害剤の不在下に得られた値から差し引いて、ＨＤＡアーゼ依存性アセテート生産量を計算した。阻害実験では、検査すべき阻害剤を標準アッセイカクテルにジメチルスルホキシド中の所望濃度（反応体中のＤＭＳＯの最終濃度は２．５％ｖ／ｖで一定に維持した）で加え、ＨＤＡアーゼ活性を、阻害剤を含まず２．５％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯを含む対照（阻害剤を含まない）のインキュベーションにおいて認められた活性と比較した。ＨＤＡアーゼ源としてのＨｅＬａ核抽出物の調製：Ｃｏｕｓｅｎｓら（前掲）の方法に従ってＨｅＬａ核を調製した。得られた核ペレットに〜４容量の冷２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ナトリウム（ｐＨ７．４）を加えて低張溶解し、４℃で１０分間ときどきぐるぐるかき回しながらインキュベートした。次いで、懸濁液を１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心し、得られた上清をＨＤＡアーゼ活性源として用いた。ＨＤＡアーゼ源としてのニワトリ赤血球核抽出物の調製：ニワトリを二酸化炭素で窒息させて殺し、断頭して、１／１０容量の抗凝集溶液（１６ｍＭのクエン酸、８９ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１６ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１３０ｍＭのグルコース）を含有する氷上のビーカー中に出血させた。血液を４層のチーズクロスを介して濾過し、赤血球を沈降（１，５００×ｇ、５分、４℃）させ、上清を廃棄した。赤血球を、３容量の緩衝液Ａ〔１０ｍＭのＴｒｉｓクロリド（ｐＨ７．２）、５０ｍＭの重亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、８．６％ｗ／ｖのスクロース〕中の懸濁液で２回洗浄し、次いで遠心（１，５００×ｇ、５分、４℃）した。洗浄した赤血球を等容量の緩衝液Ａに懸濁し、１／１００容量の１０％ｖ／ｖサポニン（０．１％ｖ／ｖの最終濃度）を加え、懸濁液を〜２０分ときどきゆるやかにかき混ぜながら、顕微鏡により細胞の＞９５％が溶解したことが判明するまでインキュベートした。懸濁液を遠心（１，５００×ｇ、５分、４℃）して、溶解していない細胞をペレット化した。得られた上清を慎重に注ぎ出し、追加の緩衝液Ａで稀釈（２容量：最終の緩衝液Ａ／出発赤血球比＝３：１）し、遠心（３，０００×ｇ，４５分，４℃）して、上清を廃棄した。得られた核ペレットを３容量の緩衝液Ａ中に懸濁して２回洗浄し、次いで、遠心（３，０００× ｇ、４５分、４℃）し、次いで、３容量の緩衝液Ａ（重亜硫酸ナトリウム及びＰＭＳＦを含まない）で３回目の洗浄をした。得られた核ペレットに〜４容量の冷２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ナトリウム（ｐＨ７．４）を加えて低張溶解し、４℃で１０分間ときどきぐるぐるかき回しながらインキュベートした。次いで、懸濁液を１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心し、得られ上清をＨＤＡアーゼ活性源として用いた。ＨＤＡアーゼ源としてのＥｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ抽出物の調製：Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａの胞子形成卵母細胞からのＳ１００抽出物を上記のように調製した。該抽出物の一部（２．５ｍｌ）をセントリコン（centri con）限外濾過装置を用いて１／５に濃縮し、得られた濃縮物（５００μｌ）を、２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡にしたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム上のクロマトグラフィーにかけた。アピシジン阻害性ＨＤＡアーゼ活性を含む画分（１８〜２３）（５００μｌ）をプールし、ＥｉｍｅｒｉａＨＤＡアーゼ活性源として用いた。ＨＤＡ触媒活性とアピシジン結合との相関関係全ニワトリ肝臓ホモジネートをイオン交換クロマトグラフィーにかけると、アピシジン及びブチレート阻害性ＨＤＡアーゼ活性は２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン結合活性と同時溶出した。アニオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過によるニワトリ赤血球核ＨＤＡアーゼの部分生成によっても酵素活性と結合活性の同時溶出が生じた。さらに、Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ胞子形成卵母細胞のホモジネートを硫酸アンモニウム沈降及びゲル濾過にかけると、カラム上で２−³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジン結合活性と同時溶出したブチレート及びアピシジン阻害性ＥｉｍｅｒｉａＨＤＡアーゼが部分精製された。これらのデータは、宿主と寄生虫のいずれにおいても結合活性及び酵素活性が直接関連すること、及び実際に³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジンの結合標的がＨＤＡアーゼであることを強力に示唆した。ヒストンデアセチラーゼ阻害アッセイ（アッセイ１）で、アピシジン、トリコスタチン、トリコスタチン酸、ＨＣ−ｔｏｘｉｎ及びｎ−ブチレートを評価した。その結果は、酵素及び³Ｈ−Ｎ−デスメトキシアピシジンの競合的結合アッセイで得られた結果と相関する。従って、結合アッセイで全く活性を示さなかったトリコスタチン酸は酵素阻害アッセイでも不活性である。他の化合物は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ及びニワトリ肝臓抽出物を用いた酵素阻害アッセイにおいて２〜２０ｎＭの範囲のＩＣ₅₀値を示した（但し、文献記載のものと一致するＩＣ₅₀値を有していたｎ−ブチレートを除く）。従って、リガンドとしてヒストンデアセチラーゼの阻害剤又は基質を用いる結合アッセイは、抗原虫剤の同定及び設計に用い得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＡＧ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガーネツト，アン・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者マイヤーズ，ロバート・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ラトレイ，サンドラ・ジエイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者シユマツツ，デニス・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原虫活性を有する化合物を同定する方法であって、（ａ）ヒストンデアセチラーゼ又はヒストンデアセチラーゼを含む抽出物を、（ｉ）ヒストンデアセチラーゼと相互作用する既知量の標識化合物；及び（ii）既知稀釈度のテスト化合物又は天然抽出物と接触させるステップ；及び（ｂ）前記テスト化合物によって誘発される前記標識化合物の相互作用阻害率（％）を定量するステップを含む方法。２．前記標識化合物がヒストンデアセチラーゼに結合する、請求項１に記載の方法。３．前記標識化合物がヒストンデアセチラーゼの基質である、請求項１に記載の方法。４．前記ヒストンデアセチラーゼが原虫のヒストンデアセチラーゼである、請求項１に記載の方法。５．（ｄ）前記テスト化合物によって誘発される、前記標識化合物の宿主ヒストンデアセチラーゼとの相互作用の阻害率を定量するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。６．原虫のヒストンデアセチラーゼを阻害する化合物を治療上又は予防上有効な量宿主に投与することを含む、原虫感染症を治療又は予防する方法。７．前記化合物が、原虫のヒストンデアセチラーゼを宿主のヒストンデアセチラーゼよりも高度に阻害する、請求項６に記載の方法。８．前記原虫感染症がアピコンプレクサ亜門に属する原虫によって引き起こされる、請求項６に記載の方法。９．前記原虫感染症が、コクシジウム症、マラリア、クリプトスポリジア症又はトキソプラズマ症である、請求項６に記載の方法。１０．前記化合物が、ＴＡＮ−１７４６、ＨＣ−ｔｏｘｉｎ、クラミドシン、ＷＦ−３１６１、トラポキシンＡ及びＣｌｙ−２からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。１１．抗原虫活性を有する化合物を同定する方法であって、（ａ）宿主又は原虫の無傷の細胞をテスト化合物又は天然産物抽出物と接触させるステップ；（ｂ）前記細胞を破壊してヒストンを得るステップ；及び（ｃ）ヒストンのアセチル化レベルを測定するステップを含む方法。１２．酸・尿素・トリトンゲル電気泳動を用いてヒストンのアセチル化レベルを測定する、請求項１１に記載の方法。１３．不活性担体及び有効量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、原虫感染症の予防又は治療に有用な組成物。１４．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＡＮ−１７４６、ＨＣ−ｔｏｘｉｎ、クラミドシン、ＷＦ−３１６１、トラポキシンＡ及びＣｌｙ−２からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。