JP5547064B2 - 多重分化能性／多能性細胞及び方法 - Google Patents

多重分化能性／多能性細胞及び方法 Download PDF

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Description

本発明は多重分化能性/多能性細胞及び方法に関する。
再生医療の分野は、損傷された細胞、組織又は器官の修復、置換又は再生を助けるために企画された治療を包含する。再生医療の１つのブランチは、種々の範囲の細胞をもたらす能力を有する胚性幹細胞（ES）に依存する細胞治療を包含する。ESに基づく細胞治療は、種々の健康状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、発作、脊髄障害、心発作、腎不全、オステオポローシス、I型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、熱傷及び創傷の処理の見込みがある。しかしながら、そのような治療の進行は、広範囲の要因、例えば受容体と免疫学的に適合できないドナーに由来するES細胞の免疫拒絶の可能性により妨げられて来た。
この開示は、ある場合、多能性であり、そしてある場合、多分化能性であるヒト幹細胞を包含する。この開示はさらに、そのようなヒト幹細胞の生成方法、そのような幹細胞の使用方法、及び関連する組成物を包含する。
従って、１つの観点においては、多能性、体性、非胚性であり、そして長期自己再生の性質を有するヒト幹細胞が供給される。いくつかの態様においては、そのようなヒト幹細胞は、外因性遺伝子、例えばOct3/4ポリペプチドをコードする第１外因性遺伝子、Sox2ポリペプチドをコードする第２外因性遺伝子、及びKlf4ポリペプチドをコードする第３外因性遺伝子を含んで成る。１つの態様においては、外因性遺伝子を含んで成るヒト幹細胞は、３及びわずか３種の外因性遺伝子を含んで成り、ここで第１外因性遺伝子はOct3/4ポリペプチドをコードし、第２外因性遺伝子は、Sox2ポリペプチドをコードし、そして第３外因性遺伝子はKlf4ポリペプチドをコードする。
さらなる態様においては、外因性遺伝子は上記第１，２及び３外因性遺伝子から実質的に成る。もう１つの態様においては、外因性遺伝子は、Oct3/4ポリペプチドをコードする第１外因性遺伝子、Sox2ポリペプチドをコードする第２外因性遺伝子、Klf4ポリペプチドをコードする第３外因性遺伝子、及びマウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター（mCAT）（例えば、mCAT1）のアミノ酸配列をコードする第４外因性遺伝子を含んで成る。もう１つの態様においては、外因性遺伝子を含んで成るヒト幹細胞は、４及びわずか４種の外因性遺伝子を含んで成り、ここで第１外因性遺伝子はOct3/4ポリペプチドをコードし、第２外因性遺伝子はSox2ポリペプチドをコードし、第３外因性遺伝子はKlf4ポリペプチドをコードし、そして第４外因性遺伝子はc-Mycポリペプチドをコードする。
さらなる態様においては、外因性遺伝子は上記第１、第２、第３及び第４外因性遺伝子から実質的に成る。ある態様においては、外因性遺伝子は、c-Mycポリペプチドをコードする遺伝子を包含しない。他の態様においては、外因性遺伝子は、c-Mycポリペプチドをコードする遺伝子を包含する。外因性遺伝子がc-Mycポリペプチドをコードする遺伝子を包含する１つの態様においては、外因性遺伝子はマウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター（mCAT）のアミノ酸配列をコードする第５外因性遺伝子を包含する。ある態様においては、外因性遺伝子は、TERTポリペプチドをコードする遺伝子を包含しない。
ある態様においては、外因性遺伝子は、HPV16E6ポリペプチド又はHPV16E7ポリペプチドをコードする遺伝子を包含しない。さらなる態様においては、外因性遺伝子は、TERTポリペプチド、SV40大T抗原ポリペプチド、HPV16E6ポリペプチド又はBmi１ポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子を包含しない。さらに他の態様においては、外因性遺伝子を含んで成るヒト幹細胞は、癌を誘発できる外因性遺伝子を含まない。さらに他の態様においては、ヒト幹細胞は、次のポリペプチドの３又はそれ以上をコードする外因性遺伝子を含んで成る：Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、Klf4ポリペプチド、及びc-Mycポリペプチド。
もう１つの観点においては、体性、非胚性、アルカリホスファターゼに対して陽性であり、そして遺伝子TDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogの２又はそれ以上の遺伝子を発現する幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのような幹細胞は多能性である。
関連する観点においては、ヒト幹細胞に比較して、１〜1000個の遺伝子（例えば、１〜700個の遺伝子、１〜500個の遺伝子、１〜300個の遺伝子、１〜200個の遺伝子、１〜100個の遺伝子、１〜50個の遺伝子、3〜20個の遺伝子、5〜20個の遺伝子、5〜50個の遺伝子、10〜50個の遺伝子、20〜50個の遺伝子、30〜100個の遺伝子、又は50〜100個の遺伝子）での高レベルの遺伝子発現を有するヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのようなヒト幹細胞は、アルカリホスファターゼ陽性であり、そしてTDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogから選択された２又はそれ以上（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10）の遺伝子を発現する。
もう１つの観点においては、ヒト胚幹細胞に比較して、本明細書に提供される表13、15又は16に列挙される遺伝子の２又はそれ以上（例えば、３又はそれ以上、４又はそれ以上、５又はそれ以上、10又はそれ以上、15又はそれ以上、25又はそれ以上、50又はそれ以上、75又はそれ以上、100又はそれ以上、又は200又はそれ以上）での高レベルの遺伝子発現を有するヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのようなヒト幹細胞は、アルカリホスファターゼ陽性であり、そしてTDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogから選択された２又はそれ以上（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10）の遺伝子を発現する。
さらなる観点においては、ヒト胚幹細胞に比較して、本明細書に提供される表14に列挙される遺伝子の２又はそれ以上（例えば、３又はそれ以上、４又はそれ以上、５又はそれ以上、10又はそれ以上、15又はそれ以上、25又はそれ以上、50又はそれ以上、75又はそれ以上、100又はそれ以上、又は200又はそれ以上）での低レベルの遺伝子発現を有するヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのようなヒト幹細胞は、アルカリホスファターゼ陽性であり、そしてTDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogから選択された２又はそれ以上（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10）の遺伝子を発現する。
もう１つの観点においては、ヒト胚幹細胞に比較して、１〜1000個の遺伝子（例えば、１〜300個の遺伝子、又は200又は１〜50個の遺伝子）での低レベルの遺伝子発現を有するヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのようなヒト幹細胞は、アルカリホスファターゼ陽性であり、そしてTDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogから選択された２又はそれ以上（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10）の遺伝子を発現する。
さらなる観点においては、１〜100個の遺伝子の発現レベルが、ヒト胚幹細胞においてよりもヒト線維芽細胞において発現レベルに接近しているヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様においては、そのようなヒト幹細胞は、アルカリホスファターゼ陽性であり、そしてTDGFl、 Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、zfp42、Sox2、Oct3/4及びNanogから選択された２又はそれ以上（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10）の遺伝子を発現する。
さらにもう１つの観点においては、ヒト対象からの非胚性生後細胞の培養された集団においてOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドの発現を誘発することを含んで成る、ヒト対象から自己由来の幹細胞の生成方法が、本明細書において提供される。ある態様においては、この方法により生成される自己由来の幹細胞は奇形腫を形成できる。１つの態様においては、そのような生成された自己由来の幹細胞は多能性である。
さらなる観点においては、ヒト生後細胞におけるOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドの発現を促進し、高い核：細胞質比を有し、そして１又は複数のコロニーを取囲む細胞よりもサイズが小さい１又は複数の細胞コロニーを入手し、そして前記１又は複数のコロニーの少なくとも１つを単離することを含んで成る方法により生成されるヒト幹細胞が本明細書において供給される。ある態様おいては、上記方法により生成されるヒト幹細胞は、多能性ヒト幹細胞である。ある態様においては、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの誘発された発現は、ヒト生後細胞中に、１又は複数の発現ベクター、例えばレトロウィルス発現ベクター、レンチウィルス発現ベクター、アデノ関連のウィルス発現ベクター、アデノウィルス発現ベクター、組換えレトロウィルス又は核酸発現ベクター、例えばプラスミド発現ベクターを導入することにより達成される。１つの態様においては、上記方法は、ヒト生後細胞におけるc-Mycポリペプチドの発現の誘発を包含しない。
もう１つの態様においては、前記方法は、ヒト生後細胞におけるc-Mycポリペプチドをコードする外因性遺伝子の発現の誘発を包含しない。さらなる態様においては、前記方法は、さらにヒト生後細胞におけるc-Mycポリペプチドの発現の誘発を包含する。ある態様においては、前記方法がc-Mycポリペプチドの発現の誘発を包含する場合、前記方法は、誘発因子をコードする４及びわずか４個の外因性遺伝子の発現の誘発を包含し、ここで前記外因性遺伝子はOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、Klf4ポリペプチド及びc-Mycポリペプチドをコードする。１つの態様においては、前記方法は、誘発因子をコードする４個の外因性遺伝子の発現の誘発を包含し、ここで前記４個の外因性遺伝子はOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、Klf4ポリペプチド及びc-Mycポリペプチドをコードする。
さらにもう１つの態様においては、前記方法は、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、Klf4ポリペプチド及びc-Mycポリペプチドから実質的に成るポリペプチド組の発現の誘発を包含する。もう１つの態様においては、前記方法は、誘発因子をコードする３及びわずか３個の外因性遺伝子の発現の誘発を包含し、ここで前記外因性遺伝子はOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドをコードする。もう１つの態様においては、前記方法は、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドから実質的に成るポリペプチド組の発現の誘発を包含する。さらにもう１つの態様においては、ヒト幹細胞を生成するための上記方法はまた、ヒト生後細胞とヒストンデアセチラーゼインヒビターとの接触を包含する。
他の態様においては、上記方法は、ヒト生後細胞中に、（i）Oct3/4ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第１の精製されるポリペプチドを；（ii）Sox2ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第２の精製されたポリペプチドを；及び（iii）Klf4ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第３の精製されたポリペプチドを導入することによる、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現の誘発を包含する。ある態様においては、前記第１、第２及び第３の精製されたポリペプチドの少なくとも１つはさらに、タンパク質トランスダクションドメインを含んで成る。
ある態様においては、本明細書に開示されるヒト幹細胞は、１又は複数の次の性質を有する：多能性；多分化能性；奇形腫を形成する能力；正常な二倍体核型；少なくとも約30回〜少なくとも約100回、継代され得る子孫；ヒト胚性幹細胞よりも短いテロマー；大気酸素条件（例えば、５％酸素以上〜約21％酸素）下での末分化表現型を伴っての増殖する能力；コロニーでの増殖；生物学的サンプルからの調製の後、４又はそれ以下の回数、継代されたヒト体細胞又は生後細胞の誘発；胎児ヒト体細胞からの誘発；成人体細胞からの誘発；次の細胞のいずれかを含んで成る細胞集団からの誘発：成人皮膚線維芽細胞、成人末梢血単核細胞、 成人骨髄由来の単核細胞、新生児ヒト皮膚線維芽細胞、 ヒト臍静脈内皮細胞、 ヒト臍動脈平滑筋細胞、 ヒト生後骨格筋細胞、ヒト生後脂肪細胞、 ヒト生後末梢血単核細胞又はヒト臍血液単核細胞；前記細胞集団からの誘発（前記集団は、凍結貯蔵され、そして調製の前、融解された細胞の組成物から調製された）。
本明細書に提供される多くの観点は、上記ヒト幹細胞のいずれかに関する。そのような観点は次のものを包含する：ヒト幹細胞の精製された集団；ヒト幹細胞から分化された細胞（例えば、分化された細胞の精製された集団）。そのような分化された幹細胞は、膵臓β細胞、神経幹細胞、皮質ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、希突起膠細胞又はその前駆体細胞、肝細胞又は肝性幹細胞又は心筋細胞。他の関連する観点は、次の方法を包含する：ヒト幹細胞を凍結保存媒体に懸濁し、そして得られる懸濁液を凍結することによる前記細胞の貯蔵方法；ヒト幹細胞を分化することによる分化された細胞（上記分化された細胞のいずれかを包含する）の生成方法；ヒト対象中への分化された細胞（例えば、他の細胞型を実質的に有さない分化された細胞）の導入方法（ここで、分化された細胞は対象と同じゲノムを共有するか、又は対象と免疫適合できる）。
さらなる関連する観点は次のものを包含する：ヒト幹細胞及び凍結媒体を含んで成る組成物；ヒト幹細胞、及び精製された成長因子（例えば、約4ng/ml〜約100ng/mlの濃度での）を含んで成る媒体を含んで成る組成物。種々の態様においては、そのような成長因子は、１又は複数の次のものを包含する：bFGF、 FGF-2、 PDGF、 EGF、 IGF、 インスリン、 TGFb-I 、アクチビンA、 Noggin、 BDNF、 NGF、 NT-1、 NT-2、NT-3、IGF, IGFI, IGFII又はFGF-成長因子ファミリーメンバー。
さらにもう１つの観点においては、次の成分の少なくとも１つを含んで成る組成物が本明細書において供給される：
（i）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びOct3/4ポリペプチド；
（ii）キャリヤー試薬及び精製されたOct3/4ポリペプチド；
（iii）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びSox2ポリペプチド；
（iv）キャリヤー試薬及び精製されたSox2ポリペプチド；
（v）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びKlf4ポリペプチド；
（vi）キャリヤー試薬及び精製されたKlf4ポリペプチド；
（vii）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びc-Mycポリペプチド；
（viii）キャリヤー試薬及び精製されたc-Mycポリペプチド；又は
（i）〜（viii）のいずれかの組合せ。
ある態様においては、上記組成物は少なくとも２，３又は４個の成分（i）〜（viii）を含む。さらなる観点においては、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドを含んで成るポリペプチドのヒト生後細胞における発現を誘発することを含んで成る、ヒト幹細胞の生成方法が提供される。ある態様においては、その方法に使用されるヒト生後細胞は、生物学的サンプルからの調製の後、４又はそれよりも少ない回数、継代される。ある態様においては、ヒト生後細胞は、凍結貯蔵され、そして次に融解されたヒト生後細胞を含んで成る組成物から精製された。１つの態様においては、ヒト生後細胞は成人からである。
ある態様においては、前記方法に使用されるべきヒト生後細胞は、成人骨髄由来の単核細胞、生後ヒト皮膚線維芽細胞、臍静脈内皮細胞、臍動脈平滑筋細胞、生後骨格筋細胞、生後脂肪細胞、生後末梢血単核細胞、臍血液単核細胞又は胎盤細胞を含んで成る。ある態様においては、この方法に使用されるヒト生後細胞は、生物学的サンプルからの調製の後、４個又はそれ以下の回数、継代されている。ある態様においては、生後ヒト細胞は、誘発された発現の前、約103個の細胞/cm2〜約104個の細胞/cm2の密度で培養される。ある態様においては、ヒト生後細胞は、５％又はそれ以下（例えば２％又はそれ以下）の血清濃度で培養される。ある態様においては、前記ヒト生後細胞は、誘発された発現の前、１又は複数のbFGF、 FGF-2、 PDGF、 EGF、 IGF、 インスリン、 TGFb-I 、アクチビンA、 Noggin、 BDNF、 NGF、 NT-1、 NT-2、NT-3又はFGF-成長因子ファミリーメンバーの存在下で培養される。
ある態様においては、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現誘発は、ヒト生後細胞中に、Oct3/4、Sox2及びKlfポリペプチドをコードする１又は複数の発現ベクターを導入することにより行われる。そのようなベクターは例えば、組換えレトロウィルス、レンチウィルス又はアデノウィルス；レトロウィルス発現ベクター、レンチウィルス発現ベクター、核酸発現ベクター又はプラスミド発現ベクターを包含する。他の態様においては、組換えレトロウィルスが誘発される発現のために使用される場合、前記方法は、培養されたヒト細胞中に、マウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター（mCAT）ポリペプチドの発現のための発現ベクターを導入し、その後、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドをコードする１又は複数のレトロウィルスベクターを導入することを包含する。
ある態様においては、この方法は、c-Mycポリペプチドの発現の誘発を包含しない。他の態様においては、前記方法は、c-Mycポリペプチドの発現の誘発を包含する。１つの態様においては、前記方法は、TERTポリペプチドの発現の誘発を包含しない。
ある態様においては、この方法はまた、生後ヒト細胞とヒストンデアセチラーゼインヒビターとの接触を包含する。
ある態様においては、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現の誘発は、ヒト生後細胞中に、１又は複数の発現ベクターを導入することを含んで成る。ある態様においては、ヒト幹細胞を生成するための上記方法はまた、誘発された発現段階の後、周囲細胞よりもサイズが小さい、１又は複数の細胞コロニーを単離し、そしてアルカリホスファターゼ、nanog、TDGFl、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、CYP26A1、 TERT及びzfp4を発現する１又は複数のコロニーの少なくとも１つを同定することをさらに含んで成る。
ある態様においては、前記方法は、ヒト生後細胞の培養物中に次のものを導入することによる、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現を誘発することを含んで成る：
（i）Oct3/4ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第１の精製されるポリペプチドを；（ii）Sox2ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第２の精製されたポリペプチドを；及び（iii）Klf4ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る第３の精製されたポリペプチド。１つの態様においては、少なくとも１つの上記ポリペプチドはさらに、タンパク質トランスダクションドメインを含んで成る。
他の態様においては、ヒト生後細胞におけるOct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現の誘発は、それらと、少なくとも１つの下記のものとを接触することにより実施される：
（i）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びOct3/4ポリペプチド；
（ii）キャリヤー試薬及び精製されたOct3/4ポリペプチド；
（iii）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びSox2ポリペプチド；
（iv）キャリヤー試薬及び精製されたSox2ポリペプチド；
（v）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びKlf4ポリペプチド；
（vi）キャリヤー試薬及び精製されたKlf4ポリペプチド；
（vii）タンパク質トランスダクションドメインのアミノ酸配列を含んで成る精製されたポリペプチド及びc-Mycポリペプチド；又は
（i）〜（vii）のいずれかの組合せ。
ある態様においては、この方法により生成されるヒト幹細胞は、奇形腫を形成できる。ある態様においては、この方法により生成されるヒト幹細胞は、多能性であり、そして外胚葉、中胚葉及び内胚葉を形成できる。
もう１つの観点においては、
（i）第１及び第２の培養されたヒト体細胞を供給し；
（ii）前記第１の培養されたヒト体細胞と試験剤とを接触し；
（iii）前記第２の培養されたヒト体細胞と負の対照剤とを接触し；
（iv）前記接触された第１及び第２の培養された細胞における胚性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを決定し；そして
（v）段階（iii）において決定された発現レベルを比較し、そして前記接触された第１の培養された細胞における胚性幹細胞マーカー遺伝子発現レベルが前記接触された第２の培養された細胞において決定されたその発現レベルよりも高い場合、前記試験剤が多能性又は多分化能性を刺激することを示唆し、そして前記接触された第１の培養された細胞における胚性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルが前記接触された第２の培養された細胞において決定されたそのレベルと同じか又はそれよりも低い場合、前記試験剤が多能性又は多重分化能性を刺激するのを失敗したことを示唆することを含んで成り、ここで前記胚性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルの決定がtert又はCyp26A1の発現レベルを決定することを含んで成る、ヒト体細胞（例えば、生後ヒト体細胞）における多能性又は多重分化能性を刺激する剤の同定方法が本明細書において提供される。
段階（iii）において決定された発現レベルを比較し、そして前記接触された第１の培養された細胞における胚性幹細胞マーカー遺伝子発現レベルが前記接触された第２の培養された細胞において決定されたその発現レベルよりも高い場合、前記試験剤が多能性又は多分化能性を刺激することを示唆し、そして前記接触された第１の培養された細胞における胚性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルが前記接触された第２の培養された細胞において決定されたそのレベルと同じか又はそれよりも低い場合、前記試験剤が多能性又は多重分化能性を刺激するのを失敗したことを示唆することを含んで成り、ここで前記胚性幹細胞マーカー遺伝子はtert又はCyp26A1を含んで成る。
さらなる観点においては、
（i）対象と免疫適合性であるドナーを同定し；
（ii）健康なドナーの生後細胞から、誘発される多能幹細胞系を生成し；そして
（iii）前記誘発された多能性幹細胞系から分化された１又は複数の細胞を、対象中に移植することを含んで成る、その必要な対象において細胞移植を実施するための方法が本明細書において提供される。ある態様においては、前記ドナーは、HLA遺伝子型が受容体のHLA遺伝子型に適合する場合、免疫適合性であるものとして同定される。１つの態様においては、前記免疫適合性ドナーは、その免疫適合ドナーからの血液サンプルを遺伝子型決定することにより同定される。又は態様においては、前記誘発された多能性幹細胞系は、単核血液細胞から誘発される。
本明細書に記載されるヒト幹細胞、組成物及び方法のいくつかの態様においては、Oct3/4ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、前記Sox2ポリペプチドが配列番号９に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、前記Klf4ポリペプチドが配列番号11に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、又は前記c-Mycポリペプチドは配列番号13に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成る。
他の態様においては、Oct3/4ポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、前記Sox2ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、前記Klf4ポリペプチドが配列番号10に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成り、又は前記c-Mycポリペプチドは配列番号12に対して少なくとも70％(例えば、75%、80%、85%、90%、95%又は100%)同一であるアミノ酸配列を含んで成る。
ある態様においては、前記Oct3/4ポリペプチドがヒトOct3/4又はマウスOct3/4のアミノ酸配列を含んで成り、前記Sox2ポリペプチドがヒトSox2又はマウスSox2のアミノ酸配列を含んで成り、そして前記Klf4ポリペプチドがヒトKlf4又はマウスKlf4のアミノ酸配列を含んで成る。ある態様においては、Oct3/4ポリペプチドはOct3/4以外のOctファミリーメンバーであり、Sox2ポリペプチドはSox2以外のSox2ファミリーメンバーであり、Klf4ポリペプチドはKlf4以外のKlf4ファミリーメンバーであり、そしてc-Mycポリペプチドはc-Myc以外のc-Mycファミリーメンバーである。１つの態様におては、c-Mycポリペプチドは、c-Myc−エストロゲン受容体（c-Myc-ER）融合ポリペプチドである。
引例による組込み：
本明細書に言及されるすべての出版物、特許及び特許出現は、それぞれの個々の出版物、特許又は特許出願が引例により組み込まれることを特別に及び個々に示されているかのように、同じ程度に引例により、本明細書に組み込まれる。
本発明の新規特徴が、特許請求の範囲に特別に示されている。本発明の特徴及び利点の良好な理解が、本発明の原理が使用される、例示態様を示す次の詳細な記載により得られ、そして付随する図面は次の通りである：
図１は、細胞の誘発の程度及びアプローチの概要である。
図２は、４種の遺伝子の導入に続く、成人骨髄由来の細胞におけるNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。Oct3/4、Sox2、 Klf4及びc-Mycが、低血清条件下で、成人骨髄由来の単核細胞から確立された細胞中に導入された。RNAが得られるコロニーから抽出され、そしてヒトNanog及びヒトTert遺伝子の発現が定量的PCRにより示された。４種の遺伝子が導入されていない線維芽細胞及び間葉幹細胞が実験において対照として使用された。遺伝子発現の量は、発現の量がヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子の発現の量により、及び新生児皮膚線維芽細胞から誘発されたアルカリホスファターゼ（ALP）−陽性コロニーにおけるHPRT遺伝子発現の量を１として設定することにより、標準化された、相対値として提供される。Nanog及びTertの発現が、４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc）が導入され、そしてALPに対して陽性であるコロニーにおいて有意に高かったことが確かめられた。
図３は、４種の遺伝子の導入に続く新生児線維芽細胞におけるNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycが、新生児皮膚に由来する一次培養物線維芽細胞中に導入され；RNAが得られるコロニーから抽出され；そしてヒトNanog及びヒトTert遺伝子の発現された量が定量的PCRにより決定された。４種の遺伝子が導入されていない親線維芽細胞及び間葉幹細胞が実験において対照として使用された。遺伝子発現は、図２に概略される同じ方法を用いて標準化された。Nanog及びTertの発現が、４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc）が導入され、そしてALPに対して陽性であるコロニーにおいて有意に高かったことが確かめられた。
図４は、３種の遺伝子の導入及びヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビターにより処理に続く成熟マウス骨髄由来の細胞におけるNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。３種の遺伝子（Oct3/4、Sox2及びKlf4）が、低血清条件下で確立されたマウス骨髄由来の細胞中に導入された。細胞はまた、MS−275（0.1又は1.0μM）、すなわちHDACインヒビターにより処理された。RNAが得られるコロニーから抽出され、そしてNanog発現の量が定量的PCRにより決定された。３種の遺伝子が導入され、そしてヒストンデアセチラーゼインヒビターにより処理された細胞から、ALP−陽性群（コロニー）が形成され、そしてそれらのコロニーにおけるNanogの発現が、ALP−陰性コロニーよりも有意に高いことが確認された。この図においては、Wl、W2、W3、W4、W5及びW6は、例12に使用される６ウェルプレートの個々のウェルの名称を表す。
図５は、ヒトiPSクローン１−８の特徴化を示す。その親線維芽細胞（ロット5F0438）の形態学がパネルａに示され；ネズミ胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞上で培養されたヒトiPSクローン１−８細胞の形態学がパネルｂに示され；mTeSR1培地におけるヒトiPSクローン１−８の形態学がパネルｃに示され；mTeSR1培地におけるクローン２−４がパネルｄに示され；そしてmTeSR1培地におけるクローン３−２細胞がパネルｅに示される。クローン１−８の成長曲線がパネルｆ及びgに示される。矢印は試験の日付を示す。四角は細胞増殖速度を評価するために細胞数を計数するための期間を示す。パネルｈは、101日でのiPSクローン１−８由来の細胞の正常な核型を示す多色核型像である。
図６は、ヒトiPSクローン１−８における転写因子、細胞表面抗原及びALP活性の特徴化を示す。ヒトiPS細胞（クローン１−８）は、Nanog (パネル a)、SSEA-3 (パネル b)、SSEA-4 (パネル c)、TRA- 1-60 (パネル d)、TRA- 1-81 (パネル e)、CD9 (パネル f)、CD24 (パネル g)、Thy-1 (CD90とも呼ばれる) (パネル h)について染色された。緑色蛍光染色は、ヒトiPSクローン１−８がそれらの表面抗原のすべてを発現することを示す。ALP染色は、iPSクローン1-8ALP陽性であることを示す。矢印は、緑色蛍光染色の領域を示す。
図７は、ヒトiPSクローン１−８細胞の遺伝子発現のRT−PCR分析を示す。パネルａは、クローン１−８及びその親線維芽細胞（NeoFB）におけるhESマーカー遺伝子発現のRT−PCR分析を示す。遺伝子は、30サイクルで検出されたが、但しCYP26A1（35サイクル）を除く。パネルｂは、クローン１−８における４種のトランスジーンのサイレンス化を示す。遺伝子トランスダクションの17日後にえられた粗線維芽細胞が対照として使用された。“エキソ”プライマー組は、外因性遺伝子の発現を選択的に検出し；そして“合計”のプライマー組は、内因性及び外因性遺伝子発現を検出した。
図８は、ヒトiPSクローン１−８細胞の全体的遺伝子発現の分散プロット分析を示す。分散プロットは、mTeSR1において培養されたヒトiPSクローン１−８細胞と、MEFと共に培養されたH14hES細胞（公的なデータベースGEOからのGSM151741）との間（パネルa)の、又はクローン１−８と、それらの親線維芽細胞との間（パネルｂ）の全体的遺伝子発現の比較を示す。ES細胞特異的遺伝子の記号は、両分散プロットにおいて線により示される。発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色等級で示された。矢印は、代表的色彩領域を示す。
図９は、異なった細胞系の全体的遺伝子発現、及び全体的遺伝子発現分析に基づく遺伝子系統樹を示す。細胞が、International Stem Cell Initiativeにより同定された遺伝子組に基づく遺伝子系統樹において密集された（表21を参照のこと）。サンプルは、mTeSRにおいて培養されたクローン１−８について“1-8mTeSR”として示され；MEF−ならし培地において培養されたクローン１−８について“1-8CM”として示され；凍結融解処理の後、TeSRにおいて培養されたクローン１−８について“1- 8mTeSR(f&t)”として示され；mTeSR培地において培養されたクローン２−４について“2-4mTeSr”として示され；MEF上で培養されたクローン２−４について“2-4MEF”として示され；mTeSR培地において培養されたクローン３−２について“3-2mTeSR”として示され；親線維芽細胞について“5F0438”又は“5F0416”として示され；MEF上で培養されたSheff4系について"hESl ," "hES2," "hES3" (それぞれGSM 194307, GSM 194308, GSM 194309)として示され；マトリゲル上で培養されたSheff4系について"hES4," 又は"hES5" (それぞれGSM 194313, GSM 194314)として示され；MEF上で培養されたH14系について" hES6,"又は "hES7" (GSM151739, GSMl 51741)として示され；GSM96262について“線維芽細胞１”として示され；GSM96263について“線維芽細胞２”として示され；そしてGSM96264について“線維芽細胞３”として示される。発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色等級で示された。
図10は、異なった細胞系の全体的遺伝子発現、及び全体的遺伝子発現分析に基づく遺伝子系統樹を示す。細胞は、線維芽細胞に比較される場合（３種のGEOデータ）、0.99〜１の比率でのヒトES細胞（７種のGEOデータ）におけるNanog遺伝子発現と相互関係する遺伝子組に基づく遺伝子系統樹において密集された。サンプルは、mTeSRにおいて培養されたクローン１−８について“1-8mTeSR”として示され；MEF−ならし培地において培養されたクローン１−８について“1-8CM”として示され；親線維芽細胞について“4F0438”として示され；MEF上で培養されたSheff４系について"hESl、" "hES2、" "hES3" (それぞれGSM 194307, GSM 194308, GSM 194309)として示され；マトリゲル上で培養されたSheff4系について"hES4、" "hES5" (それぞれGSM194313, GSM194314)として示され；MEF上で培養されたH14系について"hES6" 、"hES7" (それぞれGSMl 51739, GSM151741)として示され；GSM96262について“線維芽細胞1”として示され；GSM96263について“線維芽細胞２”として示され、そしてGSM96264について“線維芽細胞３”として示される。発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色等級で示された。
図11は、ヒトiPS1-8におけるプロモーターのメチル化分析を示す。Oct3/4プロモーター（遠位エンハンサー（Oct3/4−Z1）及び近位プロモーター領域（Oct3/4−Z2）を包含する）及びNanogプロモーター（近位プロモーター領域（Nanog−Z1, −Z2）を包含する）の一部が、CpGのメチル化について分析された（パネルａ）。パネルｂは、％により示される場合、丸により示されるGpGに基づくメチル比率を示す。
図12は、94日間、培養されたヒトiPS−１−８mTeSR細胞由来の細胞の奇形腫形成能力を示す。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞がSCIDマウス精巣中に注入され、そして注入の後56日間、分析された。パネルａはホルマリン固定された奇形腫組織のHE及びアルシアンブルー染色を示す。奇形腫は、次の３種の胚葉の代表的組織を含んだ：ne：神経上皮、ca：軟骨、et：内皮管。移植片由来の組織は、HuNu染色により宿主組織から区別された（パネルb-d）。ネスチン−発現神経上皮がパネルｂに示され；コラーゲンII発現軟骨細胞がパネルｃに示され；α−フェトプロテイン発現内皮管がパネルｄに示される。矢印は、染色の代表的領域を示す。
図13は、種々の条件下で培養された細胞の奇形腫−形成能力を示す。奇形腫１（パネルT−１）は、94日間、培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞に由来した。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞がSCIDマウス精巣中に注入され、そして注入の後56日間、分析された。奇形腫２（パネルT-2）は、102日間、培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞に由来した。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞がSCIDマウス精巣中に注入され、そして注入の後48日間、分析された。奇形腫−１（パネルT-1）において、平滑筋細胞（α−SMAに対して陽性）及びセクレタリー内皮（MUC-1に対して陽性）が、図12において観察される３種の胚葉の他に観察された。矢印は、染色の代表的領域を示す。
図14は、種々の条件下で培養された細胞の奇形腫−形成能力を示す。奇形腫３（パネルT3）は、114日間、培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞に由来した。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞がSCIDマウス精巣中に注入され、そして注入の後42日間、分析された。図12及び13に類似する３種の胚葉が観察された。T-F1及びF2図は、134日間、培養された（継代19）、凍結融解されたiPS-1-8mTeSR細胞由来の奇形腫を示す。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞がSCIDマウス精巣中に注入され、そして注入の後46日間（パネルT-F1）、及び48日間（パネルT-F2）分析された。３種の胚葉から成る組織が観察された。メラニン細胞がまた、T-F2実験において観察された。多能性が、凍結及び融解の後でさえ、維持された。矢印は、染色の代表的領域を示す。
図15は、ヒトiPSクローン１−８において検出されるとトランスジーンのサザンブロット及びPCR分析を示す。Oct3/4、Sox2及びKlf4トランスジーンが、サザンブロット分析により検出された。ヒトiPSクローン１−８は、Oct3/4トランスジーン及びSox2トランスジーンの約10のコピー及びKlf4トランスジーンの１つのコピーを有することが推定された。C-Mycトランスジーンに関しては、ゲノムPCR分析が行われた。プライマー組は、完全な第２イントロンを含むよう企画された。黒の矢印は、興味あるトランスジーンの位置を示す。白の矢印は内因性c-Mycの位置を示す。
図16は、４種の遺伝子（Oct4, Sox2, Klf4及びc-Myc）により誘発されたALP陽性コロニーにおけるhESマーカー遺伝子発現プロフィールを示す。コロニーは、４種の遺伝子トランスダクションの後17日で、ALPについて染色された。すべてのALP（＋）コロニーは、hESマーカー遺伝子発現について分析され、そして評価された。パネルaは、Nanog、TDGFl、Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3を発現するコロニーの数を示す。パネルｂは、オクタ−陽性コロニーの形態学を示す。パネルc-dは、個々の実験により分類されたhES細胞マーカー遺伝子の数を示す。
図17は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図18は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図19は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図20は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図21は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図22は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図23は、ES細胞関連の８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、 Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、TERT、CYP26A1及びGDF3）の遺伝子発現プロフィール及びALP活性により分類される、４種の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4 及びc-Myc）により誘発されたコロニーの形態を示す。丸は、採取されたコロニーを示す。 図24は、ヒトOct3/4予測の突然変異耐性図面のグラフ表示である。 図25は、ヒトSox2予測の突然変異耐性図面のグラフ表示である。 図26は、ヒトKlf4予測の突然変異耐性図面のグラフ表示である。 図27は、ヒトc-Myc予測の突然変異耐性図面のグラフ表示である。
図28は、マウス胚線維芽細胞からALP陽性コロニーを誘発するためへのトランスジーンの使用を示す。（Sox2, c-Myc及びKlf4）及び（Oct4, Sox2及びc-Myc）の遺伝子組合せが、12日目でALPコロニーを誘発することができる。 図29は、成熟マウス神経幹細胞からALP陽性コロニーを誘発するためへのトランスジーンの使用を示す。MEF細胞に比較して、熟成神経幹細胞は、AlPコロニーを誘発するために外因性Sox2の発現を必要としない。 図30は、マウス骨髄由来の細胞からALP陽性コロニーを誘発するためへの３種又は４種のトランスジーンの使用を示す。ALPコロニーは、c-Myc又はKlf4なしに誘発され得る。 図31は、マウス骨髄由来の細胞からALP陽性コロニーを誘発するためへの２種又は４種のトランスジーンの使用を示す。Sox2及びc-Mycの組合せが、AlPコロニーを誘発できる。
目次
I. 概要 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・20
II. 細胞の調製・・・・・・・・・・・・・・・・・21
A. 誘発され得る細胞の説明 ・・・・・・・・・・21
B. 細胞の採取 ・・・・・・・・・・・・・・・・24
III . 誘発・・・・・・・・・・・・・・・・・・・28
A. 概要 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・28
B. 細胞培養 ・・・・・・・・・・・・・・・・・28
C. 誘発因子 ・・・・・・・・・・・・・・・・・34
D. HDACインヒビター ・・・・・・・・・・・・・36
E. IF発現ベクター ・・・・・・・・・・・・・・39
１．組換えウィルス・・・・・・・・・・・・・41
２．核酸ベクター・・・・・・・・・・・・・・52
３．タンパク質トランスダクション・・・・・・52
F. 誘発因子配列 ・・・・・・・・・・・・・・・54
G. 誘発された細胞コロニーのサブクローニング ・70
H. 誘発された細胞の継代及び維持 ・・・・・・・71
IV. 誘発された細胞の分析・・・・・・・・・・・・72
A. メチル化分析 ・・・・・・・・・・・・・・・74
B. 自己再生アッセイ ・・・・・・・・・・・・・75
C. 核型分析 ・・・・・・・・・・・・・・・・・76
D. 奇形腫分析 ・・・・・・・・・・・・・・・・76
E. 全体的な遺伝子発現 ・・・・・・・・・・・・77
V. 誘発された細胞の説明 ・・・・・・・・・・・・78
VI. 細胞分化・・・・・・・・・・・・・・・・・・85
VII . 細胞療法・・・・・・・・・・・・・・・・・90
VIII. 分析方法・・・・・・・・・・・・・・・・・92
IX. 細胞の貯蔵・・・・・・・・・・・・・・・・・97
X. 実施例 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・97
XI. 表 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・154
I. 概要：
本発明の開示は、誘発された多分化能及び多能性幹細胞及び関連する方法及び組成物を特徴とする。多能性幹細胞は、すべての３種の胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞への分化する能力を有し；対照的に、多分化能性幹細胞は、特定の胚葉の１又は複数の細胞型をもたらすが、しかし必ずしもすべての３種の胚葉にではない。
多分化能性又は多能性になるよう細胞の誘発方法は、ポリペプチド、特にES細胞の自己再生及び/又は多能性の維持又は調節において役割を演じるタンパク質の発現の誘発に基づかれる。そのようなタンパク質の例は、Oct3/4、Sox2、Klf2及びc-Myc転写因子であり、それらのすべてはES細胞において高く発現される。誘発された発現は、興味あるポリペプチドをコードする発現ベクターの細胞中への導入、組換えウィルスによる細胞のトランスダクション、興味ある精製された外因性ポリペプチドの細胞中への導入、興味あるポリペプチド（例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Myc）をコードする内因性遺伝子の発現を誘発する非天然に存在する試薬と細胞との接触、又は興味あるポリペプチドをコードする遺伝子（内因性遺伝子Oct3/4, Sox2, Klf4又はc-Myc）の発現を誘発するいずれか他の生物学的、化学的又は物理学的手段を包含することができる。
細胞を誘発するためのいくつかの基本的段階が図１に示されている。それらの段階は、ドナー、例えばヒトドナー又は第三者からの細胞の採取（100）；ポリペプチド、例えばOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの発現の誘発による細胞の誘発（110）；多分化能性又は多能性幹細胞の同定（120）；コロニーの単離（130）；及び任意には、細胞の貯蔵（140）を包含することができる。細胞の培養又は拡張を包含する、細胞を維持するための段階は、それらのすべての段階間で変化する。さらに、細胞の貯蔵は、前記工程において、多くの段階の後、存在することができる。細胞は、多くの状況、例えば治療又は他の用途に使用され得る（150）。
胚性幹（ES）細胞は、自己再生性であり、且つ多能性である。誘発された細胞はまた、自己再生性であり、且つ多能性であり得る。しかしながら、ES細胞と対照的に、誘発された細胞は、広範囲の細胞及び組織、例えば非胚性組織から誘導され得る。
誘発された細胞（例えば、誘発された多分化能性又は多能性幹細胞）は、多くの用途を有する。それらは、分化された細胞、例えばニューロン、肝細胞又は心筋細胞への生成を可能にする条件にゆだねられ得る。それらはまた、他のタイプの幹細胞、例えば他の特定の細胞系に分化する能力を有する、神経幹細胞、肝性幹細胞又は心臓幹細胞をもたらすことができる。誘発された細胞及びそれらから分化された細胞はまた、医学療法、例えば細胞置換療法のために有用である。誘発された細胞は非胚細胞から誘発され得るので、細胞療法は、彼又は彼女の組織由来の細胞を対象に供給し、それにより、免疫拒絶の可能性を低めることを包含する。
この開示は、誘発された多分化能性及び多能性幹細胞、それらの調製及びそれらの貯蔵を記載する。この開示はさらに、誘発された多分化能性及び多能性幹細胞から分化された細胞、それらの調製及びそれらの貯蔵を記載する。誘発された細胞、それから分化された細胞の細胞療法のためへの使用がまた記載される。分析方法及び細胞銀行化方法がまた提供される。
II. 細胞の調製：
A. 誘発され得る細胞の説明：
多分化能性又は多能性細胞は、広範囲の種類の哺乳類細胞から誘発され得る。適切な哺乳類細胞集団の例は、線維芽細胞、骨髄由来の単核細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、末梢血単核細胞、マクロファージ、肝細胞、ケラチン細胞、口腔ケラチン細胞、毛嚢真皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、滑液細胞、腎臓細胞、皮膚上皮細胞又は造骨細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
細胞はまた、多くの異なった型の組織、例えば骨髄、皮膚（例えば、真皮、表皮）、筋肉、脂肪組織、末梢血液、包皮、骨格筋又は平滑筋に起因することができる。細胞はまた、新生児組織、例えば次のものから誘発され得るが、但しそれらだけには限定されない：臍帯組織 (例えば、臍帯、臍帯血、 臍帯血管)、 羊膜、 胎盤、 又は他の種々の新生児組織 (例えば、 骨髄液、 筋肉、 脂肪細胞、 末梢血液、 皮膚、 骨格筋、等)。
細胞は、誕生、例えば帝王切開誕生〜死亡の期間以内に対象から採取された新生児又は生後組織に由来する。例えば、組織は、誕生後10分以上、1時間以上、１日以上、１ヶ月以上、２ヶ月以上、６ヶ月以上、１年以上、２年以上、５年以上、10年以上、15年以上、18年以上、25年以上、35年以上、45年以上、55年以上、65年以上、80年以上、80年以下、70年以下、60年以下、50年以下、40年以下、30年以下、20年以下、又は10年以下である対象からであり得る。対象は、新生児であり得る。ある場合、対象は子供又は成人である。いくつかの例においては、組織は、誕生後２，５，10又は20時間のヒトからである。他の例においては、組織は、誕生後１，２，３，４，５，６，９又は12ヶ月のヒトからである。ある場合、組織は、誕生後１年、2 年、 3 年、 4 年、 5 年、 18 年、 20 年、 21 年、 23 年、 24 年、 25 年、 28 年、 29 年、 31 年、 33 年、 34 年、 35 年、 37 年、 38 年、 40 年、 41 年、 42 年、 43 年、 44 年、 47 年、 51 年、 55 年、 61 年、 63 年、 65 年、 70 年、 77 年又は85 年のヒトからである。
細胞は、胚段階よりも後の成長の段階で非胚組織からであり得る。他の場合、細胞は胚に由来する。ある場合、細胞は、胎児段階よりも後の成長の段階での組織からであり得る。他の場合、細胞は胎児に由来することができる。
細胞は好ましくは、ヒト対象からであるが、但しまた、非ヒト対象、例えば非ヒト哺乳類に由来され得る。非ヒト哺乳類の例は、非ヒト霊長類（例えば、サル、モンキー、ゴリラ）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）、ウシ、ブタ、羊、ウマ、イヌ、ネコ又はウサギを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
細胞は、種々の疾病状態を有する対象から採取され得る。細胞は、悪い健康状態を有さない対象から採取され得る。他の場合、対象は、疾病又は障害、例えば慢性健康状態、例えば心血管疾患、眼の疾患（例えば、網膜黄斑部変性）、聴力疾患（例えば、聴覚障害）、糖尿病、認識障害、うつ病、双極性障害、痴呆、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、オステオポローシス、肝疾患、腎疾患、自己免疫疾患、炎症性関節腫張又は増殖性疾患（例えば、癌）を有するか、又はそれらの高い危険性を有する。他の場合、対象は、急性健康状態、例えば発作、脊髄損傷、火傷又は創傷を有するか、又はその高い危険性を有する。ある場合、対象は、彼又は彼女のさらなる使用（例えば、自家療法）、又は処理又は治療を必要とするもう１つの対象の使用（例えば、同種療法）のために細胞を供給する。ある場合、ドナー及び受容体は、免疫学的に適合できるか、又はHLA適合される。
誘発されるべき細胞は、単一細胞又は細胞集団から得られる。前記集団は相同又は異種であり得る。細胞は、ヒト細胞サンプル、例えば生検又は血液サンプルに見出される細胞集団であり得る。しばしば、細胞は体細胞である。細胞は細胞系であり得る。ある場合、細胞は他の細胞に見出される細胞に由来する。ある場合、細胞は他の細胞に融合される細胞に由来しない。ある場合、細胞は他の細胞に人工的に融合される細胞に由来しない。ある場合、細胞は、体細胞核トランスファー（SCNT）として知られている工程を受けた細胞、又はSCNTを受けた細胞の子孫である細胞ではない。
細胞集団は、分化された細胞及び末分化の細胞の両者を包含する。ある場合、前記集団は、分化された細胞を主に含む。他の場合、前記集団は、末分化細胞、例えば末分化幹細胞を主に含む。集団内の末分化細胞は、多能性又は多分化能性になるよう誘発され得る。ある場合、細胞集団内の分化された細胞は、多能性又は多分化能性になるよう誘発される。
細胞集団は、末分化幹細胞又は純粋幹細胞を包含する。ある場合、末分化幹細胞は、次の遺伝子：Nanog, Oct3/4, Sox2及びTertの少なくとも４個の遺伝子、少なくとも３個の遺伝子、少なくとも２個の遺伝子、少なくとも１つの遺伝子、又はいずれでもない遺伝子のDNAメチル化又はヒストン修飾のためにヘテロクロマチン形成による後生不活性化修飾を受けていない幹細胞である。そのような遺伝子、例えばTert、Nanog、Oct3/4又はSox2の活性化又は発現は、ヒト多能幹細胞がヒト生後組織に存在する末分化幹細胞から誘発される場合、存在することができる。
B. 細胞の採取：
ヒト体細胞の入手方法は、例えばSchantz and Ng (2004), A Manual for Primary Human Cell Culture, World Scientific Publishing Co., Pte, Ltdに記載されるように、十分に確立されている。ある場合、前記方法は、例えば生検（例えば、皮膚サンプル）、採取された血液、肺胞又は他の肺洗浄により、細胞サンプルの入手を包含する。組織から調製された細胞からの初期プレート化密度は、その特定組織からの細胞の予測される生存性又は粘着性のような変数に基づいて変動され得ることが理解されるべきである。種々の型の体細胞の入手方法は、次の典型的な方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない：
１．骨髄：
ドナーは、一般的に麻酔され、そして腹位に置かれる。腸骨の後部境界から、採取用注射針が皮膚中に及び腸骨表面から骨髄に、直接的に挿入され、そして骨髄液が注射器中に吸引される。体性幹細胞が、骨髄の骨原性領域から骨髄細胞を単離することにより富化される。次に、単核細胞画分が、密度傾斜遠心分離により吸引物から調製される。次に、集められた粗単核細胞画分が、誘発のために本明細書に記載される方法への使用の前、培養される。
２．生後皮膚：
真皮を含む皮膚組織を、例えば膝又は殿部の裏から採取する。次の、皮膚組織が0.6％トリプシン/ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）/F−12、及び１％抗生物質/抗真菌剤において37℃で30分間インキュベートされ、そして皮膚の内側は下方に面している。
皮膚組織がひっくり返された後、ピンセットを用いて、皮膚の内側を軽くこする。皮膚組織をハサミを用いて1mm2の切片に切除し、そして次に、1200rpmで室温で10分間、遠心分離する。上清液が除去され、そして25mlの0.1％トリプシン/DMEM/F-12/１％抗生物質を用いて、200−300rpmで37℃で40分間、撹拌される。組織沈殿物が十分に消化されたことを確かめた後、3mlのウシ胎児血清（FBS）（JRHにより製造される）が添加され、そしてガーゼ（PIPにより製造されるType I）、100μmのナイロンフィルター（FALCONにより製造される）及び40μmのナイロンフィルター（FALCOHにより製造される）により連続的に濾過される。得られる濾液を、1200rpmで及び室温で10分間、遠心分離し、上清液を除去した後、DMEM/F-12/1％抗生物質、すなわち抗真菌剤が添加され、沈殿物が洗浄され、そして次に、1200rpm及び室温で10分間、遠心分離される。このようにして得られた細胞画分が、誘発の前、培養される。
皮膚幹細胞が、頭皮組織から真皮乳頭を単離することにより富化され得る。ヒト頭皮組織（0.2〜2cm又はそれ以下）をすすぎ、過剰の脂肪組織を切除し、そして小さな断片に切除する。それらの組織断片を、DMEM中、12.5mg/mlのジスパーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）において酵素消化する。酵素処理の後、表皮を真皮から剥離し；そして毛嚢が真皮から引抜かれる。毛嚢がリン酸緩衝溶液（PBS）により洗浄され；そして表皮及び真皮が除かれる。顕微鏡がこの方法のために使用され得る。単一の真皮乳頭由来の細胞がDMEM及び10％FCSを含む媒体においてプラスチック組織培養皿上で拡張された乳頭を１週間、培養することにより生成される。単一の真皮乳頭細胞が生成される場合、それらの細胞が除かれ、そしてFGM-2 SingleQuots (Lonza)により補充されたFBMにおいて培養されるか、又は血清なしで、20 ng/mlの EGF、40 ng/ml のFGF-2及びB27の存在下で培養される。
表皮幹細胞がまた、ヒト頭皮組織（0.5〜2cm2又はそれ以下）から富化され得る。ヒト頭皮組織をすすぎ、過剰の脂肪組織を切除し、そして小さな断片に切除する。それらの組織断片を、DMEM中、12.5mg/mlのジスパーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）において、４℃で24時間、酵素消化する。酵素処理の後、表皮を真皮から剥離し；そして毛嚢が真皮から引抜かれる。球芽及び損なわれていない外毛根鞘（ORS）を、顕微鏡下で切除する。洗浄の後、小胞をプラスチック皿中に移す。次に、膨らんだ領域が、細かな針を用いて、上方の小胞から切開される。洗浄の後、その膨らんだ部分を新しい皿に移し、そしてDMEM/F12及び10％FBSを含む培地において培養する。細胞が同定された後、培養培地をEpiLifeTM Extended-Lifespan血清フリー培地 (Sigma)に変える。
３．生後骨格筋：
筋肉、例えば上腕ニ頭筋の外側頭又は脚の縫工筋を含む結合組織の表皮が切断され、そして筋肉組織が切除された後、それは縫合される。得られる全筋肉を、ハサミ又はメスにより細かく切り刻み、そして次に0.06％コラゲナーゼタイプLA及び10％FBSを含むDMEM（高グルコース）に懸濁し、そして37℃で２時間インキュベートする。
細胞を、細かく切り刻まれた筋肉から遠心分離により集め、そして10％FBSを含むDMEM（高グルコース）に懸濁する。その懸濁液を、40μmの孔サイズを有するマイクロフィルター及び次に、20μの孔サイズを有するマイクロフィルターに通した後、得られる細胞画分を、未分化幹細胞を含む精製された粗細胞として培養し、そして本明細書に記載されるようなヒト多能性幹細胞の誘発のために使用することができる。
４．生後脂肪組織：
本発明に使用するための脂肪組織に由来する細胞を、当業者に知られている種々の方法により単離することができる。例えば、そのような方法は、アメリカ特許第6,153,432号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。脂肪組織の好ましい源は、大網脂肪組織である。ヒトにおいては、脂肪細胞は典型的には、脂肪吸引により単離される。
脂肪細胞に由来する細胞の単離の１つの方法においては、脂肪組織を、0.01％〜0.5％、例えば0.04％〜0.2％、0.1％のコラゲナーゼ；0.01％〜0.5％、例えば0.04％又は0.2％のトリプシン；及び/又は0.5ng/ml〜10ng/mlのジスパーゼ、又は有効量のヒアルロニダーゼ又はDNアーゼ（DNA消化酵素）、及び約0.01〜約2.0mM、例えば約0.1〜約1.0mM、又は0.53mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）により、25〜50℃、例えば33〜40℃、又は37℃で、10分〜3時間、例えば30分〜１時間、又は45分間、処理する。
細胞を、20μm〜800μm、より好ましくは40μm〜400μm、及び最も好ましくは70μmのナイロン又はチーズ布メッシュフィルターに通す。次に、培養培地における細胞を、直接的に、又はフィコール又はパーコール又は他の粒子グラジエントを用いて、示差遠心分離にゆだねる。細胞を、100〜3000xg、より好ましくは200〜150xg、最も好ましくは500xgで、１分〜１時間、より好ましくは２〜15分及び最も好ましくは５分間、４〜50℃、好ましくは20〜40℃及びより好ましくは約25℃で遠心分離する。
このようにして得られた脂肪組織の細胞を、末分化幹細胞を含む精製された粗細胞として、本明細書に記載される方法に従って培養し、そしてヒト多能性又は多分化能性幹細胞の誘発のために使用することができる。
５．血液：
約50ml〜約500mlの静脈血液又は臍帯血を集め、そして単核細胞画分を、例えばKanof et al., (1993), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevack, and W. Strober, eds.), ch. 7.1.1.-7.1.5, John Wiley & Sons, New York)に記載のようにして、Ficall-Hypaque方法により得る。
単核細胞画分の単離の後、約１×107〜１×108個のヒト末梢血液単核細胞を、10％胎児ウシ血清、100μg/mlのストレプトマイシン及び100単位/mlのペニシリンを含むRPMI 1640培地に再懸濁し、そして次に、約１×107個の細胞/皿の密度で100mmのプラスチックペトリ皿にプレートし、そして8％CO2下で37℃のインキュベーターにおいてインキュベートする。10分後、懸濁液に残る細胞を除去し、そして付着細胞をピペットにより収穫する。次に得られる付着性単核細胞画分を培養し、その後、本明細書に記載のようにして誘発する。ある場合、このように得られた末梢血液由来の又は臍帯血由来の付着細胞画分を末分化幹細胞を含む精製された粗細胞として、本明細書に記載される方法に従って培養し、そして多能性又は多分化能性ヒト幹細胞の誘発のために使用する。
末梢血液中のマクロファージを、10％加熱不活性化されたウシ胎児血清（FBS; JRH Biosciences, Lenexa, KS）、2mMのL-グルタミン、500U/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシンにより補充された低グルコースDMEMにおいて単核細胞画分を培養することにより富化することができる。マクロファージを拡張するために、末梢血液単核細胞を、10μg/mlのFN（Sigma, St. Louis, MO）により４℃で一晩、処理されたプラスチックプレート上に２×106/mlの密度で広げる。次に細胞を、保湿された雰囲気下で、37℃及び5％CO2下で、いずれの追加の成長因子も伴わないで、培養する。浮遊細胞を含む培地を３日ごとに変える。観察される線維芽細胞特徴を有するマクロファージを、誘発実験のために使用することができる。
ある場合、末梢血液、臍帯血又は骨髄からの細胞画分を、アメリカ特許出願連続番号11/885,112号に記載のようにして、拡張し、そして次に、本明細書に記載される誘発方法に使用する。
III . 誘発：
A.概要：
誘発工程の間、あるポリペプチドの誘発された発現は、一定期間、培養された細胞において実施され、この後、誘発された細胞は、多分化能性及び多能性幹細胞を特徴づける多くの性質（例えば、形態学的遺伝子発現）についてスクリーンされる。次に、それらのスクリーニング基準を満たす誘発された細胞がサブクローン化され、そして拡張され得る。ある場合、誘発される細胞は、その誘発工程の前、一定期間、培養され得る。他方では、誘発される細胞は、従来の培養期間を伴わないで、誘発工程に直接使用され得る。ある場合、異なった細胞培養培地は、誘発工程の前、間及び後、異なった点で使用される。例えば、１つのタイプの培養培地が、組織採取の後、及び/又は誘発工程の前、直接的に使用され得るが、ところが第２タイプの培地は、誘発工程の間及び/又は後、使用される。時には、第３タイプの培養培地が、誘発工程の間及び/又は後、使用される。
B. 細胞培養：
採取の後、組織又は細胞サンプルは、採取された特定細胞又は組織のために適切ないずれかの培地において培養され得る。組織又は細胞が培養され得るいくつかの代表的な培地は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：多分化能性成人前駆体細胞（MAPC）培地；FBM（Lonzaにより製造される）；胚性幹細胞（ES）ES培地；間葉細胞幹細胞増殖培地（MSCGM）（Lonzaにより製造される）；MCDB202変性培地；内皮細胞培地キット−２（EBM2）（Lonzaにより製造される）；変性ダイベッコ培地（IMDM）（Sigma）；ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM);MEF-ならしES（MC-ES）；及びmTeSRTM（StemCell Technologies, Vancouver, Canadaから入手できる）（例えば、Ludwig et a., (2006), Nat Biotechnol., 24(2): 185-187を参照のこと）。他の場合、ヒトES細胞の増殖のための他の培養条件が、Skottman et al, (2006), Reproduction, 132(5):691-698に記載のようにして、使用される。
MAPC（2％FBS）培地は次のものを含んで成る：60％ダルベッコ変性イーグル培地−低グルコース、40％MCDB201、インスリントランスフェリンセレニウムサプリメント、（0.01mg/mlのインスリン；0.0055mg/トランスフェリン；0.005μg/mlの亜セレン酸ナトリウム）、１Xリノレン酸アルブミン(1mg/mlのアルブミン；２モルのリノレン酸/１モルのアルブミン)、1Mのデキサメタゾン、2％ウシ胎児血清、1nMのデキサメタゾン、10-4Mのアスコルビン酸及び10μg/mlのゲンタマイシン。
FBM（2％FBS）培地は次のものを含んで成る：MCDB202変性培地、2％ウシ胎児血清、5μg/mlのインスリン、50mg/mlのゲンタマイシン及び50ng/mlのアンホテリシン−B。
ES培地は次のものを含んで成る：40％ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）、40％F12培地、2nMのL−グルタミン、１X非必須アミノ酸（Sigma, Inc. St. Louis, MO）、20% Knockout Serum ReplacementTM (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)及び10μg/mlのゲンタマイシン。
MC-ES培地は次の通りにして調製され得る：ES培地は、マイトマイシンC−処理されたネズミ胚線維芽細胞（MEF）に基づいて20〜24時間、条件づけされ、収穫され、0.45μMのフィルターを通して濾過され、そして約0.1mMのβ−メルカプトエタノール、約10ng/mlのbFGF又はFGF−2及び任意には約10ng/mlのアクチビンAにより補充される。ある場合、照射されたMEFが、マイトマイシンC−処理されたMEFの代わりに使用される。他の場合、STO（ATCC）又はヒト線維芽細胞がMEFの代わりに使用される。
細胞は、特定の血清により補充された培地において培養され得る。ある態様においては、血清はウシ胎児血清（FBS）である。血清はまた、ウシ胎児血清（FCS）である。ある場合、血清はヒト血清（例えば、ヒトAB血清）であり得る。血清の混合物、例えばFBS及びヒトAB、FBS及びFCS、又はFCS及びヒトABの混合物がまた使用され得る。
組織の採取及び細胞の調製の後、適切な培養条件の使用により、調製された細胞間に存在することができる組織幹細胞又は前駆体細胞の拡張を促進することが有用である。ある場合、低血清培養又は血清フリーの培地（本明細書に記載されるような）は、組織幹細胞又は前駆体細胞の拡張を促進することができる。適切な培養培地は、MAPC、FBM又はMSCGMを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
一次培養は通常、細胞がドナー、例えばヒトから単離された直後、存在する。細胞はまた、一次培養の後、サブ培養され得る。“二次”サブカルチャーは、１度、サブ培養された一次培養細胞を記載し、“三次”サブカルチャーは、２度、サブ培養された一次培養物を記載し、“四次”サブカルチャーは、３度、サブ培養された一次培養細胞を記載し、そして同様である。ある場合、一次細胞は、二次サブカルチャー、又は四次サブカルチャーにゆだねられる。ある場合、一次細胞は、四次以下のサブカルチャーにゆだねられる。本明細書に記載される培養技術は一般的に、一次〜四次サブカルチャー間の期間からの培養を包含するが、しかし他の培養期間もまた使用され得る。好ましくは、細胞は、一次培養〜二次サブカルチャーまで培養される。
ある場合、細胞は、約1〜約12日、例えば２日、３日、4.5日、５日、6.5日、７日、８日、９日、10日、又は本明細書に記載される誘発方法を受ける前、約１〜約12日のいずれか他の日数、培養され得る。他の場合、細胞は、12日以上、例えば約12〜約20日間；約12〜約30日間；又は約12〜約40日間、培養され得る。ある態様においては、誘発されるべき細胞は、４度又はそれ以下の回数（例えば、３，２，１又は０回）、継代される。
ある場合、誘発の前、細胞は低密度で、例えば約１×103個の細胞/cm2〜約１×104個の細胞/cm2で培養される。他の場合、誘発の前（例えば、誘発の直前）、細胞は、１×103個の細胞/cm2〜約３×104個の細胞/cm2；又は約1×104個の細胞/cm2〜約３×104個の細胞/cm2の密度で培養される。
しばしば、細胞及び/又は組織は、細胞への誘発因子の導入の前及び/又は間、上記のようにして、第１培地において培養され；そして次に、細胞は、細胞への誘発因子の導入の間及び/又は後、第２又は第３培地において培養される。第２又は第３培地は、Skottman et ai, (2006), Reproduction, 132(5):691-698に記載されるように、MEF-Conditioned (MC)-ES, mTeSRlTM培地又は他のES細胞培地であり得る。
多くの例においては、細胞は、細胞における遺伝子又はポリペプチドの誘発された発現の開始の前（例えば、レトロウィルス感染期間の直後）、MAPC、FBM又はMSCGM培地において培養され；そして次に、誘発された発現の開始に続いて、細胞は、MC−ES培地、mTeSR1TM培地、又は本明細書に記載されるような他のES細胞場位置において培養される。
細部培養は、誘発因子の導入の前、間又は後、低血清培養条件下で実施され得る。“低血清培養条件”とは、次の範囲の濃度の血清を含む細胞培養培地の使用を言及する：0％（v/v）（すなわち、血清フリー）〜約5％（v/v）、例えば0% 〜 2%、0% 〜 2.5%、0% 〜 3%、0% 〜 4%、0% 〜 5%、0.1% 〜 2%、0.1% 〜 5%、0%、0.1%、0.5%、1%、1.2%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%又は5%。ある場合、低血清濃度は、約0％（v/v）〜約2％（v/v）である。ある場合、血清濃度は約2％である。他の態様においては、細胞は、“高血清条件”、すなわち5％（v/v）以上から約20％（v/v）の血清、例えば6％、7％、8％、10％、12％、15％又は20％の血清下で培養される。
高血清条件下での培養は、誘発因子の導入の前、間及び/又は後、行われる。低濃度の血清を有する培地は、末分化幹細胞の富化において特に有用である。例えば、MSCはしばしば、組織、例えば骨髄、脂肪、筋肉又は皮膚、等が高濃度血清（5％又はそれ以上）を含む培養培地において培養される場合、プラスチックの培養皿に付着する非造血細胞（例えば、間質細胞）を単離することにより得られる。しかしながら、それらの培養条件下でさえ、非常に少数の末分化細胞が、特に細胞が一定の培養条件（例えば、低継代数、低密度培養又は低酸素）下で継代される場合、維持され得る。
低又は高血清条件のいずれかが細胞培養のために使用される場合、１又は複数の成長因子、例えば線維芽細胞成長因子（FGF）−２；塩基性FGF(ｂFGF)；血小板由来の成長因子（PDGF）、表皮成長因子（EGF）；インスリン様の成長因子（IGF）；IGFII；又はインスリンが、培養培地に含まれ得る。細胞培養培地を補充するために使用され得る成長因子は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：形質転換成長因子β−１（TGFβ−１）、アクチビンA、Noggin、脳由来の神経栄養因子（BDNF）、神経成長因子（NGF）、ニューロトロピン（NT）−1、NT-2又はNT-3。ある場合、１又は複数のそのような因子が、MC−ES培地又は他の細胞培養培地において、bFGF又はFGF-２の代わりに使用される。
本明細書に記載される培養培地（例えば、MAPC、FBM、MC-ES、MSCGM、EMDM、mTeSRlTM）における成長因子（例えば、FGF-2、bFGF、PDGF、EGF、IGF、インスリン、IGF EI,TGF β-1 、アクチビンA、Noggin、BDNF、NGF、NT-I 、NT-2、NT-3）の濃度は、約4ng/ml 〜約50ng/ml, 例えば約2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml,5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、10 ng/ml、12 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、17 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、45 ng/ml又は50 ng/mlであり得る。成長因子の濃度はまた、約4ng/ml〜約10ng/ml；4 ng/ml 〜 約 20 ng/ml;約 10 ng/ml 〜 約 30 ng/ml;約 5 ng/ml 〜 約 40 ng/ml;又は 約 10 ng/ml 〜 約 50 ng/mlでもあり得る。他の場合、より高い濃度、例えば約500ng/ml〜約100ng/ml；又は約50ng/ml〜約75ng/mlの濃度の成長因子が使用され得る。
成長因子は、単独で又は組合して使用され得る。例えば、FGF-2は単独で培地に添加され得；もう１つの例においては、PDGF及びEGFの両者が培養培地に添加される。しばしば、特定の細胞型のために適切な成長因子が使用され得る。例えば、皮膚細胞は、約20ng/mlのEGF及び/又は約40ng/mlのFGF-2の存在下で培養され得るが、ところが表皮細胞は約50ng/mlのEGF及び/又は5μg/mlのインスリンの存在下で培養され得る。
誘発された細胞は、アポプトーシスを低めるために、rho又はrho−関連のタンパク質キナーゼ（ROCK）インヒビターの存在下で維持され得る。ROCKインヒビターは、細胞が厳しい処理、例えば酵素処理にゆだねられる場合、特に有用であり得る。例えば、Y-27632（Calbiochem；水溶性）又はFasudil (HA1077：Calbiochem)、すなわちRho関連のキナーゼ（Rho関連のコイル巻きされたコイル含有タンパク質キナーゼ）の添加が、本発明のヒト多能性及び多分化能性幹細胞を培養するために使用され得る。ある場合、Y-27632又はFasudilの濃度は、約2.5μM〜約20μM、例えば約2.5μM、５μM、10μM、15μM又は20μMである。
誘発された細胞は、好ましくは毎日の培地交換を伴って、37℃、５％CO2インキュベーター（例えば、大気酸素レベル下で）中で、維持培養培地において培養され得る。ある態様においては、ヒト生後組織に存在する本発明の末分化幹細胞から誘発されたヒト多能性幹細胞を培養し、そして増殖するために、細胞は、MEF−被覆されたプラスチック培養皿又はマトリゲル被覆されたプラスチック培養皿上で、本明細書に記載される添加剤を含む培養培地において５〜７日ごとにサブ培養されることが好ましい。誘発された細胞のための維持培養培地の例は、いずれかの及びすべての完全ES細胞培地（例えば、MC-ES）を包含する。
維持培養培地は、ｂ−FGF又はFGF2により補充され得る。ある場合、維持培養培地は、他の因子、例えばIGF−II、アクチビンA、又は本明細書に記載される他の因子により補充される。例えばBendall et al, (2007), Nature, 30:448(7157): 1015-21を参照のこと。ある態様においては、誘発された細胞は、約14〜約40日間、例えば、15、 16、 17、 18、 19、 20、 23、 24、 27、 28、 29、 30、 31、 33、 34、 35、 36、 37、 38日間、又は約14〜約40日間の他の期間、培養され、そして観察され、その後、形態学的特徴に基づいて、多分化能性又は多能性候補体幹細胞コロニーが同定され、そして選択される。
多分化能性又は多能性候補体幹細胞コロニーを同定するための形態学的特徴は、周囲細胞に対して丸く小さな細胞サイズ及び高い核：細胞質比を包含するが、但しそれらだけには限定されない。誘発された候補体細胞のサイズは、約5μm〜約10μm；約 5 μm 〜 約 15 μm;約 5 μm 〜 約 30 μm;約 10 μm 〜 約 30 μm;又は約 20 μm 〜 約 30 μmであり得る。高い核：細胞質比は、約 1.5: 1 〜 約 10: 1、例えば約 1.5:1 ; 約 2: 1 ; 約 3: 1; 約 4: 1 ; 約 5: 1 ; 約 7: 1 ; 約 8: 1; 約 9.5: 1 ;又は約 10: 1であり得る。ある場合、誘発された細胞コロニーは、マウスES細胞に比較して、平らな形態学を示す。例えば、末梢血液細胞又はフィーダーフリーの培地において培養された細胞に由来する誘発された候補体細胞は、周囲細胞に比較して、平らな形態学を示すことができる。誘発された細胞クローンを同定するためのもう１つの形態学的特徴は、親細胞間（例えば、線維芽細胞間）の空間内での小さな単層コロニーの形成である。
誘発された細胞は、組織培養品種のプラスチック上にプレートされ、そして直接、培養される。他方では、細胞は、被覆された支持体、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、マトリゲルTM（BD Bioscience）、コラーゲン又はラミニンにより被覆された支持体上にプレートされ、そして培養される。ある場合、未処理のペトリ皿が使用され得る。適切な細胞培養容器は、例えば35mm、60mm、100mm及び150mmの細胞培養皿、６ウェルの細胞プレート、及び他のサイズの同等の細胞培養容器を包含する。ある場合、細胞はフィーダー細胞と共に培養される。例えば、細胞は、MET（例えば、照射された又はマイトマイシン処理されたMEF）の層又はカーペット上で培養され得る。
典型的には、誘発された細胞は、低密度でプレートされ得（又は培養され得）、これは、細胞を約１：８〜約１：３、例えば約１：８；約１：６；約１：５；約１：４；又は約１：３に分割することにより達成され得る。細胞は、約103個の細胞/cm2〜約104個の細胞/cm2の密度でプレートされ得る。いくつかの例においては、細胞は、約 1.5 x 103 個の細胞/cm2 〜 約 104 個の細胞/cm2;約 2 x 103 個の細胞/cm2 〜 約 104 個の細胞/cm2;約 3 x 103 個の細胞/cm2 〜 約 104 個の細胞/cm2;約 4 x 103 個の細胞/cm2 〜 約 104 個の細胞/cm2;又は約 103 個の細胞/cm2 〜 約 9 x 103 個の細胞/cm2の密度でプレートされ得る。いくつかの態様においては、細胞は、104個の細胞/cm2以上、例えば約1.25 x 104個の細胞/cm2 〜 約3 x 104個の細胞/cm2の密度でプレートされ得る。
C. 誘発因子：
多分化能性又は多能性に成るためへの細胞の誘発は、多くの手段で達成され得る。ある態様においては、１又は複数のの細胞における多能性又は多分化能性の誘発方法は、誘発因子の発現の誘発を包含する。誘発された発現は、興味あるポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入し、興味ある精製された外因性ポリペプチドを細胞中に導入し、又は興味あるポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を誘発する天然に存在しない試薬と細胞とを接触することを包含する。
ある場合、IF組は、１又は複数の次のものを包含する：Oct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド、Klf4 ポリペプチド又はc-Myc ポリペプチド。ある場合、前記組は、ｃ-Mycポリペプチドを包含しない。例えば、IF組は、１又は複数のOct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びklf4ポリペプチドを包含するが、しかしc-Mycポリペプチドを包含しない。ある場合、IF組は、細胞形質転換の危険性又は誘発する危険性を高めるポリペプチドを包含しない。細胞形質転換を誘発するc-Mycの能力は記載されている。例えばAdhikary et al., (2005), Nat. Rev. MoI. Cell Biol., 6(8):635-645を参照のこと。
多くの場合、前記組は、c-Mycポリペプチドを包含する。ある場合、そのc-Mycポリペプチドはc-Mycの構成的活性変異体である。ある場合、前記組は、活性を誘発できるc-Mycポリペプチド、例えばc-Myc-ERポリペプチドを包含する。例えば、Littlewood, et al., (1995), Nucleic Acid Res., 23(10): 1686-90を参照のこと。
他の場合、前記IF組は、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドを包含するが、しかしTERTポリペプチド、SV40大T抗原ポリペプチド、HPV16E6ポリペプチド、HPV16E7ポリペプチド又はBmi1ポリペプチドを包含しない。ある場合、IF組は、TERTポリペプチドを包含しない。ある場合、IF組は、SV40大T抗原を包含しない。他の場合、IF組は、HPV16E6ポリペプチド又はHPV16E7ポリペプチドを包含しない。
ある場合、IF組は３種のIFを包含し、ここで３種のIF中の２種はOct3/4ポリペプチド及びSox2ポリペプチドである。他の場合、IF組は２種のIF、例えばc-Mycポリペプチド及びSox2ポリペプチド、又はOct3/4及びKlf4ポリペプチドを包含する。ある場合、IF組は、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドに制限される。他の場合、IF組は、次の４種のIF組に制限され得る：Oct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド、Klf4 ポリペプチド及びc-Myc ポリペプチド。
IF組は、Oct 3/4、Sox2及びKlf4の他に、IFを包含することができる。そのような追加のIFは、Nanog、TERT、LEN28、 CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecatl及び Tellポリペプチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ある場合、追加のIF組は、c-Mycポリペプチドを包含しない。ある場合、追加のIF組は、細胞形質転換又は癌の誘発の危険性を高めるポリペプチドを包含しない。
IFの誘発された発現は、少なくとも約７日〜少なくとも約40日の期間、例えば8 日、 9 日、 10 日、 1 1 日、 12 日、 13 日、 14 日、 15 日、 16 日、 17 日、 18 日、 19 日、 20 日、 21 日、 25 日、 30 日、 33 日又は37 日間、維持され得る。
ヒト細胞集団中の細胞における多能性の誘発の効率は、最初に培養された親細胞の合計数の少なくとも約0.001％〜少なくとも約0.1％、例えば0.002%、0.0034%、 0.004%、 0.005%、0.0065%、0.007%、0.008%、0.01%、0.04%、0.06%、0.08%又は0.09%である。時には、ドナーの年齢、組織の起源、又は培養条件に依存して、より高い効率が達成され得る。
D. HPACインヒビター：
細胞の誘発は、IF組の誘発された発現と、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビターとを組合すことにより達成され得る。誘発されるべき細胞は、ヒト生後組織に存在する末分化幹細胞であり得る。他の場合、誘発されるべき細胞は、分化された細胞であるか、又は分化された及び末分化の細胞の混合物である。
HDACは、特定組のIF、例えばOct3/4、Sox2及びKlf4の誘発された発現と組合わされ得る。例えば、ヒト体細胞は、HDACインヒビター処理が、Oct3/4、Sox2及びKlf4の誘発された発現又はOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの誘発された発現と組合された後、多能性になるよう誘発される。ある場合、ヒト多能性幹細胞は、３種の遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2及びKlf4）、又は３種の遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2及びKlf4）＋c-Myc遺伝子又はHDACインヒビターを、Tert、Nanog、Oct3/4及びSox2の個々の遺伝子が後生不活性化を受けていないヒト生後組織に存在する末分化幹細部中の導入することにより誘発され得る。さらなる他の場合、ヒト多能性幹細胞は、３種の遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2及びKlf4）、又は３種の遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2及びKlf4）＋c-Myc遺伝子又はヒストンデアセチラーゼインヒビターを、末分化幹細胞が一次培養又は二次サブカルチャー、又は低密度でのサブカルチャーにより増幅されている末分化幹細胞中に導入し、そして低濃度血清を含んで成る培養培地においてサブ培養することにより、誘発される。
細胞は、１又は複数のHDACにより、約２時間〜約５日、例えば３、６、12、14、18時間、１、２、３又は４日間、処理され得る。HDACインヒビターによる処理は、細胞におけるIFの誘発された発現の間又は後、開始する。他の場合、HDACインヒビター処理は、誘発された発現の前、開始し、そして誘発された発現の間、維持される。
HDACインヒビターの適切な濃度は、使用される特定のHDACインヒビターに依存して、約0.001ｎM〜約10mMの範囲であるが、しかし処理された細胞における細胞生存生を有意に低めないよう選択される。HDAC濃度は、0.01nM〜1000nMの範囲である。いくつかの態様においては、HDAC濃度は、約0.01nM〜約1000nM、例えば約0.05 nM、 0.1 nM、 0.5 nM、 0.75 nM、 1.0 nM、 1.5 nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 50 nM、 100 nM、 200 nM、 300 nM、 500 nM、 600 nM、 700 nM、 800 nM、又は約0.01nM〜約1000nMの他の濃度である。細胞は、１〜５日又は１〜３日間、暴露される。例えば、細胞は、１，２，３，４又は５日間、暴露される。
多種類のHDACインヒビターが、誘発実験のために使用され得る。好ましい態様においては、HDACインヒビターMS-275が使用される。適切なHDACインヒビターの例は、次のいずれかを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
A. トリコスタチンA及びその類似体、例えば：トリコスタチンA（TSA）；及びトリコスタチンC（Koghe et al, (1998), Biochem. Pharmacol, 56: 1359-1364）。
B. ペプチド、例えば：オキサムフラチン[（２E）−５−[３−[（フェニルスルホニル）アミノフェニル]−ペント−２−エン−４−イノヒドロキサム酸（Kim et al, (1999), Oncogene, 18:2461-2470）；トラポキシンA（シクロ−（L−フェニルアラニル−L−フェニルアラニル−D−ピペコリニル−L−２−アミノ−８−オキソ−９、10−エポキシ−デカノイル）（Kijima et al., (1993), J. Biol. Chem., 268:22429-22435）；FR901228、デプシペプチド（Nakajima et al, (1998). Ex. Cell Res., 241 : 126-133）；FR225497、環状テトラペプチド（H. Mori et al, (2000), PCT国際特許公開WO 00/08048号）；アピシジン、環状テトラペプチド[シクロ−（N−O−メチル−L−トリプトフェニル−L−イソロイシニル−D−ピペコリニル−L−２−アミノ−８−オキソデカノイル）]（Darkin-Rattray et al, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:13143-13147）；アピシジンIa、アピシジンIb、アピシジンIc、アピシジンIIa及びアピシジンIIb（P. Dulski et al, PCT 国際特許公開WO 97/11366号）；HC−トキシン、環状テトラペプチド（Bosch et al, (1995), Plant Cell, 7: 1941-1950）；WF27082、環状テトラペプチド（PCT国際特許公開WO98/48825号）；及びクラミドシン（Boschなど., 前記）。
C. ヒドロキサム酸に基づくハイブリッド極性化合物（HPC）、例えば：サリチルヒドロキサム酸（SBHA）（Andrews et al, (2000), International J . Parasitology, 30:761-8）；スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）（Richon et al, (1998), Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95: 3003-7）；アゼラインビスヒドロキサム酸（ABHA）（Andrewsなど., 前記）；アセライン−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（AAHA）（Qiu et al, (2000), MoI Biol. Cell, 11 :2069-83）；M−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド（CBHA）（Riconなど., 前記）；６−（３−クロロフェニルウレイド）カルボンヒドロキサム酸、（３−Cl−UCHA）（Richonなど., 前記）；MW2796（Andrewsなど., 前記）：及びMW2996（Andrewsなど., 前記）。
D. 短鎖脂肪酸（SCFA）化合物、例えば：酪酸ナトリウム（Cousens et al,(1979), J. Biol. Chem., 254: 1716-23）；イソバレレート（McBain et al., (1997), Biochem. Pharm., 53: 1357- 68）；バレレート（McBainなど., 前記）；４−フェニル酪酸（４−PBA）（Lea and Tulsyan, (1995), Anticancer Research, 15:879-3）；フェニル酪酸（PB）（Wang et al, (1999), Cancer Research 59: 2766-99）；プロピネート（McBainなど., 前記）；ブチルアミド(Lea and Tulsyan,前記); イソブチルアミド(Lea and Tulsyan, 前記); フェニルアセテート(Lea and Tulsyan, 前記); 3-ブロモプロピオネート(Lea and Tulsyan, 前記); トリブチリン(Guan et al., (2000), Cancer Research, 60:749-55); アルギニン ブチレート;イソブチルアミド;及びバルプロエート。
E. ベンズアミド誘導体、例えば：MS−275［N−（２−アミノフェニル）−４−［N−（ピリジン−３−イル−メトキシカルボニル）アミノメチル］ベンズアミド］（Saito et al., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:4592-7）；MS−275の3’−アミノ誘導体（Saitoなど., 前記）；及びCI-994.
ヒストンデアセチラーゼインヒビター処理は、例えば次の通りに実施され得る。HDACインヒビターの濃度は、特定のインヒビターに依存するが、しかし好ましくは、0.001nM〜約10mM、及びより好ましくは、約0.01nM〜約1000nMである。ヒストンデアセチラーゼインヒビターの有効量又は用量は、細胞、特に未分化幹細胞の生存率を有意に低めないヒストンデアセチラーゼインヒビターの量として定義される。細胞は、１〜５日又は１〜３日間、暴露される。暴露期間は、１日以下でもあり得る。特定の態様においては、細胞は、約１〜５日間、培養され、そして次に、有効量のヒストンデアセチラーゼインヒビターに暴露される。しかしながら、ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、培養の開始で添加され得る。そのような時間枠内で、遺伝子担持のベクター、例えば３種の遺伝子（Oct3/4、Sox2及びKlf4）をコードする核酸を含むベクターが、既知方法により、培養された細胞中に導入される。
E. IF発現ベクター：
IFの誘発された発現は、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドをコードする１又は複数の哺乳類発現ベクターを、細胞集団に導入することを含んで成る。IFは外因性遺伝子として細胞中に導入され得る。ある場合、外因性遺伝子は、宿主細胞及びその子孫のゲノム中に組み込まれる。他の場合、外因性遺伝子は、宿主細胞及びその子孫においてエピソーム状態で持続する。外因性遺伝子は、外部源からの細胞中に導入される遺伝子である。本明細書において使用されるような遺伝子は、興味あるポリペプチド、例えばIFをコードする読取り枠を通常包含する核酸である。遺伝子は好ましくは、読取り枠に操作可能に結合されるプロモーターを含む。ある場合、天然バージョンの遺伝子はすでに細胞に存在することができるが、しかし追加の“外因性遺伝子”は、ポリペプチド発現を誘発するために細胞に添加される。
１又は複数の哺乳類発現ベクターは、細胞の合計集団の20％以上、例えば25%、 30%、 35%、 40%、 44%、 50%、 57%、 62%、 70%、 74%、 75%、 80%、 90%、又は細胞の20％以上の他の％の細胞中に導入され得る。単一の哺乳類発現ベクターは、複数の上記IFを含むことができる。他の場合、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycポリペプチドをコードする１又は複数の発現ベクターが使用される。いくつかの態様においては、発現されるべきIFの個々は、別々の哺乳類発現ベクター上にコードされる。
ある場合、IFは、輸送タンパク質アミノ酸配列、例えばアメリカ特許第6,773,920号、第6,521,455号、第6,251,398号及び第6,017,735号に記載のようにVP22ポリペプチドのそれと整合して、遺伝子的に融合される。特に、VP22ポリペプチドは、WO97/05265号の図４に開示される完全なHSV1 VP22配列（1−301）のアミノ酸60−301及び159−301に対応するポリペプチドを包含する。他のヘルペスウィルスからのV22 タンパク質相同体の配列に基づく相同タンパク質及びフラグメントが、アメリカ特許第6,017,735号に記載されている。そのようなVP22配列は、トランスフェクトされていないか又はトランスダクトされていない隣接細胞に、VP22融合ポリペプチド発現ベクターによりトランスフェクトされた脂肪からのVP22融合タンパク質の細胞輸送を付与する。例えば、Lemken et al, (2007), Mo. I Ther, 15(2):310- 319を参照のこと。従って、IF-VP22融合ポリペプチドをコードするベクターの使用は、本明細書に記載される誘発方法におけるトランスフェクトされた哺乳類発現ベクターの機能的効率を有意に高めることができる。
適切な哺乳類発現ベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：組換えベクター、核酸ベクター、例えばプラスミド、人工細菌染色体、人工酵母染色体、人工ヒト染色体、cDNA、 cRNA及びPCR生成物発現カセット。IFの発現を駆動するための適切なプロモーターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：レトロウィルスLTR要素；構成プロモーター、例えばCMV、HSV1-TK、SV40、 EF-1α, β−アクチン；PGK及び誘発可能プロモーター、例えばTet−オペレーター要素を含むそれら。ある場合、１又は複数の哺乳類発現ベクターは、IFの他に、トランスフェクトされているか又は感染されている細胞の同定又は選択を促進するマーカー遺伝子をコードする。マーカー遺伝子の例は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：蛍光タンパク質をコードする遺伝子、例えばEGFP, DS-Red、YFP及びDFP；選択剤に対して耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えばneoR遺伝子、及びブラストサイジン耐性遺伝子。
１．組換えウィルス：
IFの誘発された発現は、IFをコードするDNA又はRNAを担持する組換えベクターを、１又は複数の細胞に導入することにより達成され得る。容易に参照するために、時にはウィルスは、それがコードするIFにより、本明細書に言及されるであろう。例えば、Oct3/4ポリペプチドをコードするウィルスは、“Oct3/4ウィルス”として記載され得る。ある場合、ウィルスは、IFの１つ以上のコピーをコードすることができるか、又は一度に、１つ以上のIF、例えば２つのIFをコードすることができる。
組換えウィルスの組合せ又は組が、種々のIF組の発現の誘発のために細胞に導入され得る。ある場合、組換えウィルスにより発現されるIF組は、Oct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド、Klf4 ポリペプチド又はc-Myc ポリペプチドの１又は複数のポリペプチドを含む。ある場合、前記組は、c-Mycポリペプチドを含まない。例えば、IF組は、Oct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド、及びKlf4 ポリペプチドを含むが、しかしc-Mycポリペプチドを含まない。ある場合、IF組は、細胞形質転換の危険性又は癌を誘発する危険性を高めるポリペプチドを含まない。細胞形質転換を誘発するc-Mycの能力は記載されている。例えば、Adhikary et al, (2005), Nat. Rev. MoI. Cell Biol, 6(8):635-645を参照のこと。
ある場合、発現されるべきIF組は、c-Mycポリペプチドを包含する。一定の場合、そのc-Mycポリペプチドは、c-Mycの構造的活性変異体である。ある場合、その組は、活性を誘発できるc-Mycポリペプチド、例えばc-Myc-ERポリペプチドを包含する。例えば、Littlewood, et al, (1995), Nucleic Acid Res., 23(10): 1686-90を参照のこと。
他の場合、前記IF組は、Oct3/4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチドを包含するが、しかしTERTポリペプチド、SV40大T抗原ポリペプチド、HPV16E6ポリペプチド、HPV16E7ポリペプチド又はBmi1ポリペプチドを包含しない。ある場合、IF組は、TERTポリペプチドを包含しない。ある場合、IF組は、SV40大T抗原を包含しない。他の場合、IF組は、HPV16E6ポリペプチド又はHPV16E7ポリペプチドを包含しない。
ある場合、IF組は３種のIFを包含し、ここで３種のIF中の２種はOct3/4ポリペプチド及びSox2ポリペプチドである。他の場合、IF組は２種のIF、例えばc-Mycポリペプチド及びSox2ポリペプチドを包含する。ある場合、IF組は、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドに制限される。他の場合、IF組は、次の４種のIF組に制限され得る：Oct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド、Klf4 ポリペプチド及びc-Myc ポリペプチド。
IF組は、Oct 3/4、Sox2及びKlf4の他に、IFを包含することができる。そのような追加のIFは、Nanog、TERT、LEN28、 CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecatl及び Tellポリペプチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ある場合、追加のIF組は、c-Mycポリペプチドを包含しない。ある場合、追加のIF組は、細胞形質転換又は癌の誘発の危険性を高めるポリペプチドを包含しない。
個々のウィルスは、時間内に又は同時に、連続的に細胞に添加され得る。ある場合、少なくとも１つのウィルス、例えばOct3/4ウィルス、Sox2ウィルス、Klf4ウィルス又はc-Mycウィルスが、１又は複数の他のウィルスが添加される時間とは異なった時間で、細胞に添加される。いくつかの例においては、Oct3/4ウィルス、Sox2ウィルス及びKlf4ウィルスが同時に又は時間内に非常に接近して細胞に添加され、そしてc-Mycウィルスは、他のウィルスが添加される時間とは異なった時間で添加される。
少なくとも２種の組換えウィルスが、同時に又は時間内に非常に接近して細胞に添加され得る。いくつかの例においては、Oct3/4ウィルス及びSox2ウィルスは、同時に又は時間内に非常に接近して添加され、そしてKlf4ウィルス又はc-Mycウィルスは異なった時間で添加される。いくつかの例においては、Oct3/4 ウィルス 及び Sox2 ウィルス; Oct3/4 ウィルス 及び Klf4 ウィルス; Oct3/4 ウィルス 及び c-Myc ウィルス; Sox2 ウィルス 及び KJf4 ウィルス; Sox2 ウィルス 及び c-Myc ウィルス; 又は Kl f4 及び c-Myc ウィルスは、同時に又は時間内に非常に接近して添加される。
ある場合、少なくとも３種のウィルス、例えばOct3/4ウィルス、Sox2ウィルス及びKlf4ウィルスが、同時に又は時間内に非常に接近して、細胞に添加される。他の場合、少なくとも４種のウィルス、例えば、Oct3/4ウィルス、Sox2ウィルス及びKlf4ウィルス、及びc-Mycウィルスは、同時に又は時間内に非常に接近して、細胞に添加される。
時には、ウィルス感染の効率は、同じウィルスによる反復処理により改良され得る。ある場合、１又は複数のOct3/4ウィルス、Sox2ウィルス、Klf4ウィルス、又はc-Mycウィルスは、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくと４種の別々の時間で細胞に添加される。
組換えウィルスの例は、レトロウィルス（レンチウィルスを包含する）；アデノウィルス；及びアデノ関連ウィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されない。しばしば、組換えレトロウィルスは、ネズミモロニー白血病ウィルス（MMLV）であるが、しかし他の組換えレトロウィルス、例えばニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス(MLV)、ミンク細胞フォーカス誘発ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、テナガザル白血球ウイルス、メイスンファイザーモンキーウイルス又はニワトリ肉腫ウイルスがまた使用され得る。例えば、アメリカ特許第6,333,195号を参照のこと。
他の場合、組換えレトロウィルスは、レンチウィルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス-1 (HIV-I); サル免疫不全ウイルス(SIV);又はネコ免疫不全ウイルス(FIY)）である。例えば、Johnston et al., (1999), Journal of Virology, 73(6):4991-5000 (FIV); Negre D et al., (2002), Current Topics in Microbiology and Immunology, 261 :53-74 (SFV); .Naldini et al., (1996), Science, 272:263-267 (HIV)を参照のこと。
組換えレトロウィルスは、標的細胞への侵入を助けるためのウィルスポリペプチド（例えば、レトロウィルスenv）を含んで成る。そのようなウィルスポリペプチドは、当業界において良く確立されている。例えば、アメリカ特許第5,449,614号を参照のこと。ウィルスポリペプチドは、両栄養性ウィルスポリペプチド、例えば複数の種に由来する細胞、例えば元の宿主種外の細胞中への侵入を助ける両栄養性envであり得る。例えば、前記を参照のこと。ウィルスポリペプチドは、元の宿主種外の細胞中への侵入を助ける異栄養性ウィルスポリペプチドであり得る。例えば、前記を参照のこと。ある態様においては、ウィルスポリペプチドは、自己指向性ウィルスポリペプチド、例えば、元の宿主種の細胞中への侵入を助ける自己指向性envである。
細胞へのレトロウィルスの侵入を助けることができるウィルスポリペプチドの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：MMLV両栄養性env, MMLV指向性env, MMLV異栄養性env, 水疱性口内炎ウィルス−gタンパク質（VSV-ｇ）、HIV−１env、テナガザル白血病ウィルス（GALV）env, RDl14、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10Al env遺伝子、及びそれらの変異体、例えばキメラ、例えば、Yee et al., (1994), Methods Cell Biol., Pt A:99-l 12 (VSV-G)；アメリカ特許第5,449,614号を参照のこと。ある場合、ウィルスポリペプチドは、発現、又は受容体への増強された結合を促進するために遺伝子的に修飾される。
一般的に、組換えウィルスは、ウィルスDNA又はRNA構造体を生産体細胞中に導入することにより生成される。ある場合、生産体細胞は、外因性遺伝子を発現しない。他の場合、生産体細胞は、１又は複数の外因性遺伝子、例えば１又は複数のgag、 pol又はenvポリペプチド、及び/又は１又は複数のレトロウィルスgag、pol又はenvポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成る“パッケージング細胞”である。レトロウィルスパッケージング細胞は、ウィルスポリペプチド、例えば標的細胞中への侵入を助けるVSV-gをコードする遺伝子を含んで成ることができる。
ある場合、パッケージング細胞は、１又は複数のレンチウィルスタンパク質、例えばgag、 pol、 env、 vpr、 vpu、 vpx、 vif、 tat、 rev又はnefをコードする遺伝子を含んで成る。ある場合、パッケージング細胞は、アデノウィルスタンパク質、例えばE1A又はE1B、又は他のアデノウィルスタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る。例えば、パッケージング細胞により供給されるタンパク質は、レトロウィルス由来のタンパク質、例えばgag、pol 及びenv；及びランチウィルス由来のタンパク質、例えばgag、 pol、 env、 vpr、 vpu、 vpx、 vif、 tat、 rev又はnef；及びアデノウィルス由来のタンパク質、例えばE1A及びE1Bであり得る。多くの例においては、パッケージング細胞は、ウィルスベクターが由来するウィルスとは異なるウィルスから由来するタンパク質を供給する。
パッケージング細胞系は、いずれかの容易にトランスフェクトできる細胞系を包含するが、但しそれだけには限定されない。パッケージングの細胞系は、293T細胞、NIH3T3、COS又はHeLa細胞系に基づかれる。パッケージング細胞はしばしば、ウィルスパッケージングのために必要とされるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に欠失するウィルスベクタープラスミドをパッケージするために使用される。そのようなウィルスベクターによりコードされるタンパク質から欠いているタンパク質又はポリペプチドを供給できるいずれかの細胞が、パッケージング細胞として使用され得る。
パッケージング細胞系の例は、Platinum-E (Plat-E); Platinum-A (Plat-A); BOSC 23 (ATCC CRL 11554);及び Bing (ATCC CRL 1 1270)を包含するが、但しそれらだけには制限されない。例えば、Morita et al., (2000), Gene Therapy, 7: 1063-1066; Onishi et al, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329；アメリカ特許第6,995,009号を参照のこと。市販のパッケージング系、例えばAmpho-Pak 293 細胞系、Eco-Pak 2-293細胞系、RetroPack PT67細胞系及びRetro-X Universal Packaging System (すべてClontechから入手できる)もまた有用である。
レトロウィルス構造体は、広範囲のレトロウィルス、例えばMMLV、HIV−１、SIV、FIV又は本明細書に記載される他のレトロウィルスから誘導され得る。レトロウィルス構造体は、特定ウィルスの複製の１つよりも多くのサイクルのために必要なすべてのウィルスポリペプチドをコードすることができる。ある場合、ウィルス侵入の効率は、他の因子又は他のウィルスポリペプチドの添加により改良される。他の場合、レトロウィルス構造体によりコードされるウィルスポリペプチドは、複製の１以上のサイクルを支持しない。例えば、アメリカ特許第6,872,528号を参照のこと。そのような環境下で、他の因子又は他のウィルスポリペプチドの添加は、ウィルス侵入の促進を助けることができる。典型的な態様においては、組換えレトロウィルスは、VSV-ｇポリペプチドを含むが、しかしHIV-1 envポリペプチドを含まないHIV-1ウィルスである。
レトロウィルス構造体は、プロモーター、多−クローニング部位及び/又は耐性遺伝子を含んで成る。プロモーターの例は、CMV、SV40、 EF1α、β−アクチン；レトロウィルスLTRプロモーター、及び誘発できるプロモーターを含んで成るが、但しそれらだけには限定されない。レトロウィルス構造体はまた、パッケージングシグナル（例えば、MFGベクターに由来するパッケージングシグナル；psiパッケージングシグナル）を含んで成る。当業界において知られているいくつかのレトロウィルス構造体の例は、pMX、pBabeX、又はそれらの誘導体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例えば、Onishi et ai, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329を参照のこと。
ある場合、レトロウィルス構造体は、自己−不活性化するレンチウィルスベクター（SIN）である。例えば、Miyoshi et al, (1998), J. Virol, 72(10):8150-8157を参照のこと。ある場合、レトロウィルス構造体は、LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG又はMFGである。Miyoshi et al, (1998), J. Virol, 72(10): 8150-8157; Onishi et al, (1996), Experimental Hematology, 24:324-329; Riviere et al., (1995), PNAS, 92:6733-6737を参照のこと。
ウィルスベクタープラスミド（又は構造体）は、pMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo（pMXs−IBは、pMXs−puroのプロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラスチシジンを担持するベクターである）（Kimatura et al., (2003), Experimental Hematology, 31 : 1007-1014）；MFG（Riviere et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:6733-6737）；pBabePuro（Morgenstern et al., (1990), Nucleic Acids Research, 18:3587-3596）；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG（Miyoshi et al., (1998), Journal of Virology, 72:8150-8157）及びレトロウィルスシステムとしての同様のもの、及びpAdex1（Kanegae et al., (1995), Nucleic Acids Research, 23:3816-3821）及びアデノウィルスシステムとしての同様のものを包含する。典型的な態様においては、レトロウィルス構造体は、ブラスチシジン (例えば, pMXs-IB), プロマイシン (例えば, pMXs-puro, pBabePuro); 又は根尾マイシン (例えば, pMXs-neo)を含んで成る。例えば、Morgenstern et al., (1990), Nucleic Acids Research, 18:3587-3596を参照のこと。
レトロウィルス構造体は、１又は複数のIFをコードすることができる。典型的な態様においては、Oct3/4、Sox2, Klf4又はc-Mycポリペプチド、又はそれらの変異体をコードするpMXベクターが、生成され、又は得られる。例えば、Oct3/4がpMXs-puro中に挿入され、pMX-Oct3/4が創造され；Sox2がpMXs-neo中に挿入され、pMX-Sox2が創造され；Klf4がpMX2-IB中に挿入され、pMX-Klf4が創造され；そしてc-MycがpMXs-IB中に挿入され、pMX-c-Mycが創造される。
パッケージング細胞から組換えウィルス生成方法及びそれらの使用は、十分に確立されている。例えば、アメリカ特許第5,834,256号; 第6,910,434号; 第5,591,624号; 第5,817,491 号; 第7070994号; 及び第6,995,009号を参照のこと（引用により本明細書に組み込まれる）。多くの方法は、パッケージング細胞系中へのウィルス構造体の導入により開始する。ウィルス構造体は、当業界において知られている次のいずれかの方法により導入され得るが、但しそれらの方法だけに制限されない：リン酸カルシウム方法（例えば、未審査の日本特許公開公報第2-227075号を参照のこと）、リポフェクション方法（Feigner et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:7413-7417）、エレクトロポレーション方法、マイクロインジェクション、Fugeneトランスフェクション及び同様のもの、並びに本明細書に記載されるいずれかの方法。
１つの例においては、pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4又はpMX-c-Mycが、Fugene HD (Roche)トランスフェクションにより、PlatE細胞中に導入される。細胞培養培地が、FGM-2 Single Quots (Lonza)により補充されたFBM（Lonza）を含んで成る新鮮な培地により交換され得る。いくつかの態様においては、培地は、ウィルス構造体の導入に続いて、約12〜約60時間、例えば生産体細胞へのウィルス構造体の導入に続いて、約 12 〜 約 18 時間; 約 18 〜 約 24; 約 24 〜 約 30; 約 30 〜 約 36; 約 36 〜 約 42; 約 42 〜 約 48; 約 48 〜 約 54;又は約 54 〜 約 60 時間で置換される。
培地は、生産体細胞へのウィルス構造体の導入の後、約24〜約48時間で置換され得る。上清液が、新鮮な培地の添加に続いて、約４〜約24時間、例えば４時間で回収され得る。ある場合、上清液は、新鮮な培地の添加に続いて約４時間ごとに回収され得る。回収された上清液は、0.45μMのフィルター（Millipore）に通され得る。ある場合、回収された上清液は、１又は複数の次のもの由来のレトロウィルスを含んで成る：pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4 又はpMX-c-Myc。
アデノウィルストランスダクションは、IF組の発現を誘発するために使用され得る。アデノウィルスの生成方法及びそれらの使用は、Straus, The Adenovirus, Plenum Press (NY 1984), 451 496; Rosenfeld, et al., (1991), Science, 252:431-434；アメリカ特許第6,203,975号、第5,707,618号及び第5,637,456号に記載のように、十分に確立されている。他の場合、アデノウィルス関連のウィルストランスダクションが、IF組の発現を誘発するために使用される。アデノ関連ウィルスの調製方法及びそれらの使用は、例えばアメリカ特許第6,660,514号及び第6,146,874号に記載のように、十分に確立されている。
典型的な態様においては、アデノウィルス構造体が得られるか又は生成され、ここでアデノウィルス構造体、例えばアデノ−Xは、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-MycをコードするDNAを含んで成る。アデノウィルス構造体、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)又は Fugene HD (Roche)は、当業界において知られているいずれかの方法により、HEK293細胞中の導入され得る。ある場合、前記方法はさらに、（１）細胞が、トランスフェクションの後、約10〜約20日、例えば約11、13、14、15、18又は20日で生じる細胞効果（CPE）を示す場合、それらの細胞を採取し；（２）前記細胞を、約２〜約５回、例えば約３回の凍結−融解サイクルにゆだね；（３）得られるウィルス含有液体を集め；（４）アデノウィルス精製キット（Clontech）を用いてウィルスを精製し；そして（５）−80℃で前記ウィルスを貯蔵することを含んで成る。ある場合、アデノウィルスストックの力価又はプラークの形成単位（PFU）は、本明細書に記載のようにして、アデノ−X急速力価キット（Clontech）を用いて決定される。
細胞は、異なった細胞型又は異なった宿主に起因する細胞を天然において標的化する組換えレトロウィルスにより感染され得る。感染効率を助けるためには、外因性受容体が最初にヒト細胞中に導入され得る。例えば、外因性マウス受容体が、ネズミモロニー白血病ウィルス（MMLV）の侵入を助けるために、ヒト細胞、例えば生後皮膚線芽細胞に添加され得る。外因性受容体は、特にその受容体がウィルスポリペプチド、例えばMMLVenv又はHIVenvを認識する場合、ウィルス侵入を促進することにより、感染効率を改良することができる。外因性受容体の例は、当業界において知られている特定のレトロウィルス又はレンチウィルスにより認識されるいずれかの受容体を包含するが、但しそれだけには限定されない。ネズミ受容体、mCAT1、 GenBank受託番号NM_007513タンパク質が、ヒト標的細胞のMMLV感染を助けるために使用される。
外因性受容体は、本明細書に記載される方法により導入され得る。外因性受容体の導入方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、Fugeneトランスフェクション、マイクロインジェクション、又はエレクトロポレーションを包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的な態様においては、ウィルス、例えば組換えアデノウィルス又はレトロウィルス（例えば、レンチウィルス）が、標的細胞に外因性受容体を導入するために使用される。さらなる典型的な態様においては、組換えアデノウィルスが、ヒト細胞にmCAT1を導入するために使用され、そして次に、組換えレトロウィルス、例えばMMLVがIF遺伝子、例えばOct3/4、Sox2、Klf4又はc-Mycを細胞に導入するために使用される。
ある場合、mCAT1タンパク質をコードするDNAを含んで成るアデノウィルス、例えばpADEX-mCAT1構造体を用いることにより生成されるアデノウィルスの溶液が、生成されるか又は得られる。アデノウィルス溶液は、ハンクス液を含んで成る。典型的な態様においては、細胞の感染は、（１）p-ADEX-mCATlアデノウィルス溶液と、細胞、例えばヒト非胚性線維芽細胞とを、約1m.o.i.〜約50m.o.i.の感染多重度（ウィルス：脂肪の比）、例えば約1 m.o.i.、 約 5 m.o.i.、 約 7.5; m.o.i.、 約 10 m.o.i.、 約 15 m.o.i.、 約 20 m.o.i.、 約 30 m.o.i.、 約 40 m.o.i.又は約 50 m.o.i.で接触し；（２）前記細胞を、アデノウィルス溶液と共に室温で約15分〜約２時間、例えば約 15 分、 約 30 分、 約 45 分、 約 1時間、 約 1.25 時間、 約 1.5 時間、 約 1.75 時間又は約 2 時間インキュベートし；そして（３）培養培地における体細胞集団を、約24〜約60時間、例えば約 24 時間、約 30 時間、約 36 時間、約 42 時間、約 48 時間、約 54 時間又は約 60 時間、培養することにより達成される。
細胞は、広範囲の種類の方法を用いて感染され得る。ある場合、細胞の感染は、
（１）pMX-Oct3/4レトロウィルス、pMX-Sox2レトロウィルス、pMX-Klf4又はpMX-c-Mycの１又は複数、２又はそれ以上、３又はそれ以上、又はすべての４種を組合し、レトロウィルス溶液を得；
（２）前記レトロウィルス溶液を、約２μg/ml〜約15μg/mlのポリブレン、例えば約 2 ug/ml、 約 3 ug/ml、 約 5 ug/ml、 約 7 ug/ml、 約 10 ug/ml、 約 12 ug/ml又は 約 15 ug/mlのポリブレンにより補充し；
（３）レトロウィルス溶液と体細胞とを、約0.5m.0.1.〜約10m.o.i.例えば約 0.5 m.o.i.、約 1 m.o.i.、約 2 m.o.i.、約 5 m.o.i.、約 7.5 m.o.i.又は約 10 m.o.i.のm.o.i（ウィルス；細胞の比）で接触し；
（４）段階（３）の接触を、37℃で、約２〜約24時間、例えば約 2 時間、約 3 時間、約 4 時間、約 5 時間、約 6 時間、約 7 時間、約 9 時間、約 10 時間、約 1 1 時間、約 12 時間、約 14 時間、約 15 時間、約 16 時間、約 17 時間、約 18 時間、約 19 時間、約 20 時間、約 21 時間、約 22 時間、約 23 時間又は約 24 時間続け；
（５）段階（４）の後すぐに、本明細書に記載のようにして、培地をMC-ES培地に変え；そして
（６）そのMC-ES培地を、新鮮な培地に１〜２日ごとに変えることにより生じる。
ある場合、体細胞の感染は、本明細書に記載される段階（１）〜（６）を、細胞とレトロウィルス溶液とを接触する前、体細胞を一定時間、例えば約48時間インキュベートよる追加の段階を伴って実施することにより生じる。そのようなプレインキュベーションは、体細胞が、ウィルストランスダクション、トランスフェクション又は他の方法により導入される外因性受容体を発現する場合、必要である。従って、いくつかの態様においては、アデノウィルス又はレンチウィルスが、外因性受容体、例えばmCATを体細胞に導入するために使用される場合、そのような細胞は、少なくとも約30〜少なくとも約60時間、例えば約30、約35、約40、約48、約52、約55又は約60時間の一定時間、培養される必要がある。
細胞の感染は、当業界において知られているいずれかの方法により達成され得る。Palsson, B., et al., (1995), WO95/10619号; Morling, F.J. et al., (1995), Gene Therapy, 2:504-508; Gopp et al., (2006), Methods Enzymol, 420:64-8を参照のこと。例えば、感染は、細胞へのウィルスの添加に続いてすぐの期間、細胞を遠心分離にゆだねることを包含する“回転−感染”又は“スピノキュレーション（spinoculatio）”方法により達成され得る。ある場合、ウィルスは、感染の前、例えば超遠心分離により濃縮され得る。ある場合、他の技法が、レトロウィルスの標的細胞中への侵入を助けるか、又は改良するために使用され得る。例えば、レトロウィルスは、特定細胞型への侵入を助けるか又は指図するためにリポソーム又は免疫リポソームと接触され得る。例えば、Tan et al., (2007), MoI. Med.. 13(3-4):216-226を参照のこと。
本明細書に記載される細胞の感染方法は、外因性受容体、例えばmCAT1又は本明細書に記載される他の外因性受容体を発現する細胞を感染するために使用され得る。外因性受容体がいかにして導入されるかに依存して、感染の前、細胞のプレインキュベーション期間は、変えられる必要がある。ある場合、外因性受容体を発現しない細胞が使用される。いくつかの組換えレトロウィルス、例えばVSV-G偽タイプの組換えレトロウィルスは、細胞を効果的に侵入するために、外因性受容体の助けを必要としない。いくつかの例においては、VSV-G偽型の組換えレトロウィルスは、本明細書に記載される方法（但し、細胞の予備培養のタイミングが異なる）に従って、細胞に導入される。
２．核酸ベクター：
核酸ベクタートランスフェクション（例えば、過渡的トランスフェクション）方法が、IFをヒト細胞中に導入するために使用され得る。トランスフェクション品種の核酸発現ベクターの調製方法及びトランスフェクション方法は十分に確立されている。例えば、Sambrook and Russell (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd ed, (CSHL Press); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (2005), 9.1 -9.14を参照のこと。
高い効率のトランスフェクション方法の例は、例えばTrompeter (2003), J Immunol. Methods, 274(1 -2):245-256、及び国際特許出願の公開WO2002086134号、WO200200871号及びWO2002086129号に記載のような“ヌクレオフェクション”、脂質に基づくトランスフェクション試薬、例えばFugene（商標）6 及びFugene（商標）HD(Roche)、DOTAP, 及びPLUSTM (Invitrogen, Carlsbad, CA)、 DreamfectTM (OZ Biosciences, Marseille, France)、 GeneJuiceTM (Novagen, Madison, WI)、ポリエチレンイミン(例えば、Lungwitz et al., (2005), Eur. JPharm. Biopharm., 60(2):247-266を参照のこと)、及びGeneJammerTM (Stratagene, La Jolla, CA)と組合してのリポフェクタミンTMLTX, 及び例えばアメリカ特許出願番号11/195,066号に記載のようなナノ粒子のトランスフェクション試薬によるトランスフェクションを包含する。
３．タンパク質トランスダクション：
誘発方法は、少なくとも１つのIFを細胞中に直接的に導入するためにタンパク質トランスダクションを使用することができる。ある場合、タンパク質トランスダクション方法は、キャリヤー剤、及び上記IFの１つのアミノ酸配列を含んで成る、少なくとも１つの精製されたポリペプチドを含む組成物と細胞とを接触することを包含する。適切なキャリヤー剤及びそれらの使用方法の例は、市販の試薬、例えばアメリカ特許第6,841,535号に記載されるChariotTM (Active Motif, Inc., Carlsbad, CA)；Bioport（商標）(Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA)、GenomeONE (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)、及び ProteoJuiceTM (Novagen, Madison, WI)、又は例えばアメリカ特許出願番号10/138,593号に記載されるようなナノ粒子タンパク質トランスダクション試薬を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
タンパク質トランスダクション方法は、タンパク質トランスダクションドメイン（PTD）配列に融合される上記IF（IF−PTD融合ポリペプチド）の１つのアミノ酸配列を含んで成る少なくとも１つの精製されたポリペプチドと細胞とを接触することを含んで成る。PTDドメインは、IF配列のアミノ末端に融合され得；又はPTDドメインは、IF配列のカルボキシ末端に融合され得る。ある場合、IF−PTD融合ポリペプチドは、それが復元される細胞へのその輸送を促進することができる、変性されたポリペプチドとして細胞に添加される。
PTD融合タンパク質の生成及びそれらの使用方法は、例えばアメリカ特許第5,674,980号、第5,652,122号及び第6,881,825号に記載のように、当業界においては確立されている。また、Becker-Hapak et ai, (2003), Curr Protocols in Cell Biol, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。典型的なPTDドメインアミノ酸配列は、次のいずれかを包含するが、但しそれらだけには限定されない：YGRKKRRQRRR (配列番号1); RKKRRQRR (配列番号2); YARAAARQARA (配列番号3); THRLPRRRRRR配列番号4); 及びGGRRARRRRRR (配列番号5)。
ある場合、個々の精製されたIFポリペプチドが、異なった時間で、連続的に細胞に添加される。他の態様においては、精製されたc-Mycポリペプチドを除く、少なくとも３種の組の精製されたIFポリペプチド、例えばOct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド及びKlf4 ポリペプチドが細胞に添加される。いくつかの態様においては、４種の組の精製されたIF−ポリペプチド、例えば精製されたOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycポリペプチドが細胞に添加される。いくつかの態様においては、精製されたIFポリペプチドが、１つの組成物（すなわち、IFポリペプチドの混合物を含む組成物）として細胞に添加される。
いくつかの態様においては、細胞は、精製されたIFポリペプチドの存在下で、約30分〜約24時間、例えば1 時間、 1.5 時間、 2 時間、 2.5 時間、 3 時間、 3.5 時間 4 時間、 5 時間、 6 時間、 7 時間、 8 時間、 12 時間、 16 時間、 18 時間、 20 時間、又は約30分〜約24時間のいずれか他の期間インキュベートされる。いくつかの態様においては、細胞のタンパク質トランスダクションは、ほぼ毎日〜ほぼ５日ごとの、例えば1.5日ごとの、２日ごとの、３日ごとの頻度で、又はほぼ毎日〜ほぼ４日ごとのいずれか他の頻度で、同じか又は異なったIFポリペプチドにより反復される。
ある場合、本明細書に記載される方法は、タンパク質トランスダクション及び本明細書に記載のようなIF組の発現を誘発するためにいずれかの組合せでの発現ベクタートランスダクション/トランスフェクションを利用する。いくつかの態様においては、レトロウィルス発現バクターは、細胞におけるOct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドの発現を誘発するために使用され、そして精製されたc-Mycポリペプチドは、本明細書に記載されるようにタンパク質トランスダクションにより細胞中に導入される。HDACインヒビター処理が、精製されたIFポリペプチドの他に使用され得る。ある場合、精製されたc-Mycポリペプチドを除く、少なくとも３種の組の精製されたIFポリペプチド、例えばOct3/4 ポリペプチド、Sox2 ポリペプチド及びKlf4 ポリペプチドが、HDACインヒビター処理にまたゆだねられる細胞に添加される。
F. 誘発因子配列：
本明細書に記載される誘発方法に使用されるIFのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードする外因性遺伝子が、本明細書に記載される。いくつかの態様においては、IFアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、例えばヒト又はマウスOct3/4、ヒト又はマウスSox2, ヒト又はマウスKlf4、又はヒト又はマウスc-Mycポリペプチドのアミノ酸配列である。他の態様においては、IFのアミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、IFアミノ酸配列に対して機能的に又は構造的に相同であるIFの天然に存在しないアミノ酸配列変異体である。
２種のポリペプチドの構造的及び機能的相同性の評価は一般的に、お互いに対するそれらのアミノ酸配列の％同一性の決定を包含する。複数のアミノ酸配列間の配列同一性は、従来の方法により決定される。例えばAltschul et al, (1997), Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402;及び Henikoff and Henikoff (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1992)を参照のこと。手短には、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ延長ペナルティー、及びHenikoff and Henikoff (前記)の"BLOSUM62" 評点マトリックスを用いて、一列整列評点を最適化するために一列整列される。次に、％同一性が、（［同一の適合の合計数］/［２種の配列を一列整列するために、より長い方の配列の長さ＋より長い方の配列中に導入されるギャップの数］）（100）として記載される。
当業者は、２種のアミノ酸配列を一列整列するために利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解するであろう。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及びもう１つのペプチドのアミノ酸配列の同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質一列整列方法である。FASTAアルゴリズムはPearson and Lipman (1988), Proc. Nat' I Acad. Sci. USA, 85:2444、及び Pearson (1990), Meth. Enzymol., 183:63に記載されている。手短には、FATAは、保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、問題の配列（例えば、配列番号6−13のいずれか）、及び最高密度の同一性（ktup変数が１である場合）又は同一性対（ktup＝2）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することにより配列類似性を特徴づける。
次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対のアミノ酸の類似性を比較することにより再評点が付けられ、そして領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残りのみを含むよう“整えられる（trimmed）”。“カットオフ”値（配列の長さ及びhtup値に基づいての予定された式により計算される）よりも高い評価を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域は、それらの領域がギャップを有するおおよその一列整列を形成するために連結され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch- Sellers algorithm (Needleman and Wunsch (1970), J. MoI. Biol., 48:444-453; Sellers (1974), SIAMJ. Appl. Math., 26:787)の改良法を用いて一列整列される。
FASTA分析のための例示的パラメーターは、次のものである：ktup＝１、キャップ開始ペナルティー＝10、キャップ延長ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Pearson (1990), Meth. Enzymol., 183:63の添付 2により説明されるように、評点マトリックスファイル（“SMATRIX”）を改変することにより、FASTAプログラム中に導入され得る。
低、中位の又は高い緊張条件下で、配列番号６−13のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸からの少なくとも100個のヌクレオチドのプローブに対して特異的にハイブリダイズする、本明細書記載されるような、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Mycポリペプチドをコードするアミノ酸（例えば、外因性遺伝子）がまた本明細書に記載される。低い緊縮ハイブリダイゼーション条件は例えば、２×SSC及び0.1％SDSにおいて42℃で、約40％〜約70％のGC含有率の100個のヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを包含する。
中位の緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、例えば、0.5×SSC及び0.1％SDSにおける50℃での条件を包含する。高緊縮性ハイブリダイゼーション条件は例えば、0.2×SSC及び0.1％SDSにおける65℃での上記プローブとのハイブリダイゼーションを包含する。それらの条件下で、ハイブリダイゼーション温度が高められる場合、より高い相同性を有する核酸が得られる。Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Mycポリペプチドをコードするそのような核酸は、本明細書に記載されるように、それらのIFの誘発された発現において有用である。
IFの特定のアミノ酸配列変異体が本明細書に記載される方法における使用のために有用であるかどうかの決定における多くの考慮が当業者に有用である。それらの考慮は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：（１）IFについての既知構造体−機能の関係、例えば、多くの場合、機能的に別々であり、そして独立した機能であり得ることが示されている、モジュラードメイン、例えばDNA結合アルゴリズムにより示されるように、IFの天然に存在する相同体（例えば、パラ体及びオルト体）間でのアミノ酸配列保存の存在、著しくは、機能的効果、すなわちタンパク質のその機能に基づくアミノ酸配列における特定のアミノ置換の“耐性”を都合よく予測する多くの生物情報アルゴリズムが当業界において知られている。そのようなアルゴリズムは、例えばpMUT、SEFT、PolyPhen及びSNPs3Dを包含する。再考のためには、Ng and Henikoff (2006), Ann Rev Genomics Hum Genet., 7:61-80を参照のこと。
例えば、pMUTは、所定の配列位置での特定のアミノ酸置換が配列相同性に対してタンパク質の機能に影響を及ぼすかとうかを、高い程度の精度（全体的に84％）で予測する。Ferrer-Costa et al, (2005), Bioinformatics, 21(14):3176-3178; Ferrer-Costa et al, (2004), Proteins, 57(4):811-819;及び Ferrer-Costa et al., (2002), J MoI Biol, 315:771-786を参照のこと。PMUTアルゴリズムサーバーは、WWW：//mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/に基づいて公的に入手できる。従って、いずれかのIFポリペプチドアミノ酸配列に関しては、IFポリペプチド機能に基づくいずれかの所定のアミノ酸置換の予測される中性度又は有害性を提供する“アミノ酸置換マトリックス”が生成され得る。
天然に存在しない配列変異体は、多くの既知方法により生成され得る。そのような方法は、“遺伝子シャフリング”（アメリカ特許第6,521,453号に記載される）；“RNA突然変異誘発”（Kopsidas et al, (2007), BMC Biotechnology, 7: 18- 29に記載される）；及び“エラープロンPCR法”を包含するが、但しそれらだけには限定されない。エラープロンPCR方法は、次の４種の方法に分けられ得る：
（ａ）ヌクレオチド濃度を不均衡にし、そして/又は化合物、例えば塩化マンガンを添加することにより、ポリメラーゼの適合度を低める方法（例えば、Lin-Goerke et al., (1997), Biotechniques, 23:409-412を参照のこと）、
（ｂ）ヌクレオチド類似体を用いる方法（例えば、アメリカ特許第6,153,745号を参照のこと）、
（ｃ）“突然変異誘発性”ポリメラーゼを用いる方法（例えば、Cline, J. and Hogrefe,H.H. (2000), Strategies (Stratagene Newsletter), 13: 157-161を参照のこと）、及び
（ｄ）組合された方法（例えば、Xu et al., (1999), Biotechniques, 27: 1 102-1 108を参照のこと）。
他のPCRに基づく突然変異誘発方法は、例えば、Osuna et al., (2004), Nucleic Acids Res., 32(17):el36 and Wong et al., (2004), Nucleic Acids Res. ,10;32(3):e26、及び当業者において知られている他の文献に記載されるそれらの方法を包含する。
IFのアミノ酸配列変異体の機能の維持、欠失又は獲得の確認は、評価されるタンパク質機能に従って、種々のタイプのアッセイにより決定され得る。例えば、IFが転写活性化因子、例えばOct3/4である場合、機能は細胞に基づくプロモーター−レポーターアッセイを用いて容易に評価され、ここで前記レポーター構造体はアッセイされるべき転写活性化因子ポリペプチドについての１又は複数の同系標的要素を含んで成る。プロモーター−レポーター構造体を生成し、それらを細胞中に導入し、そして種々のレポーターポリペプチド活性をアッセイするための方法は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (2005), 3.16-3.17 and 9.1-9.14において詳細に見出され得る。プロモーター活性は、レポーターポリペプチドの性質（例えば、酵素活性又は蛍光）、レポーターポリペプチド発現（例えば、ELISAアッセイによる）、又はレポーターmRNA発現（例えば、蛍光ハイブリダイゼーション技法による）を測定することにより定量化され得る。適切なレポーターポリペプチドは、例えばホタルルシフェラーゼ、Renillaルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、増強された緑色蛍光タンパク質）、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ALP及びホースラディシュペルオキシダーゼを包含する。
例えば、ルシフェラーゼ活性は、適切な発光源性基質、例えばホタルルシフェラーゼに関しては、ホタルルシフェリン、又はRenillaルシフェラーゼに関しては、コエレンテラジンを供給することにより検出され得る。適切な基質の存在下でのルシフェラーゼ活性は、多くの標準技法、例えば免疫測定法により定量化され得る。例えば、アメリカ特許第5,744,320号を参照のこと。蛍光ポリペプチド（例えば、EGFP）は、当業界において知られている多くの検出方法（例えば、蛍光定量法又は蛍光顕微鏡）により、生存細胞において検出され、そして定量化され得る。蛍光ポリペプチドを用いての生存細胞におけるレポーターアッセイスクリーン、例えば大量処理スクリーニング法がアメリカ特許第6,875,578号に見出され得る。
転写活性化因子である多くのIF、すなわち転写活性化因子が、モノマー、マルチマーとして、又は他のポリペプチドと共にヘテロマー複合体として結合する、特定の標的要素を含むプロモーターをトランス活性化するポリペプチドは、本明細書に記載されている。天然に存在する転写活性化因子、例えばKlf4は、次のような２種のドメインから最少構成されるモジュラータンパク質である：標的化されるべき遺伝子を指図するDNA結合ドメイン、及び転写組織との相互作用を通して転写応答の性質及び程度を支配する活性化ドメイン。それらの２種のドメインは典型的には、１つの転写活性化因子のDNA結合ドメイン、例えばDNA結合ドメインSox2が、十分に機能的な“キメラ”転写活性化因子、例えばKamachi et al, (1999), MoI Cell Biol., 19(1): 107-120に記載されるようなキメラSox2転写活性を生成するために、もう１つの転写活性化因子、例えばヘルペスVP16の転写ドメインに結合され得るような独立した態様で作動する。
本明細書に提供されるガイドの観点から、本明細書に記載される方法において操作できる広範囲のIF配列変異体（例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Myc配列変異体）は、過度の努力を伴わないで、当業者により容易に固定され得る。
Oct3/4ポリペプチド：
本明細書において言及される場合、“Oct3/4ポリペプチド”は、ヒトOct3/4、マウスOct3/4、又は下記のいずれかのポリペプチドを包含する：
（i）次のヒトnanog遺伝子オクタマー要素に結合するDNA結合ドメイン（DBD）を包含し：
5' -TTTTGCAT-3'；そして
（ii）１又は複数のnanogオクタマー要素を含んで成るプロモーターをトランス活性化できる。例えば、Kuroda et al, (2005), MoI and Cell Biol., 25(6):2475-2485を参照のこと。
いくつかの態様においては、Oct3/4は、上記機能的性質を有し、そしてヒトPOUクラス５ホモボックス１（(POU5F1; GenBank受託番号NP_002692）としても知られている、ヒトOct3/4のアミノ酸配列に対応する配列番号６に対して少なくとも70％、例えば75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一の、又は配列番号６に対して少なくとも70％〜100％同一のいずれか他の％同一であるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Oct3/4は、上記機能的性質を有し、そして配列番号６、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する配列番号６に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
他の態様においては、Oct3/4は、上記機能的性質を有し、そして合計30個までのアミノ酸置換、欠失、挿入又はそれらのいずれかの組合せを有する配列番号６、例えば、0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 15、 20、25又はいずれか他の数のアミノ酸置換、欠失、挿入又は0〜30のそれらのいずれかの組合せを有する配列番号６のアミノ酸を含んで成るポリペプチドである。
配列番号６（ヒトOct3/4）：
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEV
WGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEP
CTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTL
GVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQ
ARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKG
KRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEA
FPPVSVTTLGSPMHSN。
いくつかの態様においては、Oct3/4は、上記機能的性質を有し、そして配列番号７に対して少なくとも70％同一の、例えば高く保存されたPOU DNA結合ドメインを含んで成るヒトOct3/4のアミノ酸138−290に対応する、配列番号７に対して75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、又は少なくとも70％〜100％のいずれか他の％同一のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Oct3/4は、上記機能的性質を有し、そして配列番号７、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号７に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
配列番号７（ヒトOct3/4のPOU/DNA結合ドメイン）：
DΠCALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFK
NMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSEENRVRGNLENLFLQCP
KPTLQQISHIAQQLGLEKDWRVWFCNRRQKGKRSSS。
本明細書に記載されるようなOct3/4ポリペプチドは、天然に存在するか又は天然に存在しないヒトOct3/4の相同体を包含することができる。天然に存在するヒトOct3/4の相同体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GenBank受託番号：NP_002692; NP_001 108427; NP_001093427; NP_001009178;及びNP_038661として列挙されるそれら、又は上記構造的及び機能的基準を満たすいずれか他のOctファミリーメンバー。
天然に存在しないヒトOct3/4の相同体の例は、Niwa et al., (2002), MoI Cell Biol, 22(5): 1526-1536;及びLunde et al, (2004), Curr. Biol, 14(l):48-55に記載されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
250の配列を包含するPSI−BLAST多重一列整列に基づいてヒトOct3/4アミノ酸配列（配列番号６）のpMUT分析は、表17に示されるように、アミノ酸置換マトリックス（ASM）を生成する。ヒトOct3/4アミノ酸配列における個々の野生型アミノ酸位置に関して、表17は、アミノ酸置換（20個の可能なアミノ酸の）がタンパク質の機能に対して有害であるか（太文字及び下線が引かれている）又は中性（プレーンテキスト）であることが予測されることを示す。同系nanog遺伝子オクタマー要素（上記）に結合し、そして１又は複数のnanog標的要素を含むプロモーターをトランス活性化するOct3/4ポリペプチドの能力についての機能的アッセイは、例えばKuroda et al., (前記); and Loh et al., (2006), Nat. Genet., 39(4):431-440に記載のように、当業界において知られている。
Sox2ポリペプチド：
本明細書において言及される場合、“Sox2ポリペプチド”は、ヒトSox2、マウスSox2、又は下記のいずれかのポリペプチドを包含する：
（i）次のヒトnanog遺伝子Sox要素に結合するDNA結合ドメイン（DBD）を包含し：
5'-TACAATG-3'；そして
（ii）１又は複数のnanog遺伝子プロモーターSox要素を含んで成るプロモーターをトランス活性化できる。例えば、Kuroda et al, (2005), MoI and Cell Biol., 25(6):2475-2485を参照のこと。
いくつかの態様においては、Sox2ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そしてヒトSox2 、すなわち性−決定領域Y-ボックス２タンパク質(GenBank受託番号NP_003097）のアミノ酸配列に対応する配列番号８に対して少なくとも70％、例えば75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一の、又は配列番号８に対して少なくとも70％〜100％同一のいずれか他の％同一であるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Sox2ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして配列番号８、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する配列番号８に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
他の態様においては、Sox2ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして合計30個までのアミノ酸置換、欠失、挿入又はそれらのいずれかの組合せを有する配列番号８、例えば、0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 15、 20、25又はいずれか他の数のアミノ酸置換、欠失、挿入又は0〜30のそれらのいずれかの組合せを有する配列番号８のアミノ酸を含んで成るポリペプチドである。
配列番号８（ヒトSox2）：
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRG
QRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKY
RPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMN
GWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMN
GSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMIS
MYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM。
いくつかの態様においては、Sox2は、上記機能的性質を有し、そして配列番号９に対して少なくとも70％同一の、例えば高く保存されたHigh Mobility Group-Sox-TCF (HMG-Sox-TCF)モチーフ DNA結合ドメイン(DBD)を含んで成るヒトSox2のアミノ酸40−115に対応する、配列番号９に対して75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、又は少なくとも70％〜100％のいずれか他の％同一のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Sox2は、上記機能的性質を有し、そして配列番号９、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号９に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
配列番号９（HMG-Sox2-TCF DBD）：
RVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAK
RLRALHMKEHPDYKYRPRRK。
本明細書に記載されるようなSox2ポリペプチドは、天然に存在するか又は天然に存在しないヒトSox2の相同体を包含することができる。天然に存在するヒトSox2の相同体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GenBank受託番号：NP_001098933; NP_035573, ACA58281 ; BAA09168; NP_001032751 ;及びNP_648694として列挙されるそれら、又は上記構造的及び機能的基準を満たすいずれか他のOctファミリーメンバー。
天然に存在しないヒトSox2の相同体の例は、Kamachi et al, (1999), MoI Cell Biol., 19(1): 107-120に記載されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
250の配列を包含するPSI−BLAST多重一列整列に基づいてヒトSox2アミノ酸配列（配列番号８）のpMUT分析は、タンパク質の機能に対して有害であるか又は中性であることが予測されるアミノ酸置換を示すASM(表18)を生成する。nanog遺伝子Sox要素に結合し、そして１又は複数のnanog Sox要素を含むプロモーターをトランス活性化するSox2ポリペプチドの能力についての機能的アッセイは、例えばKuroda et al., (前記)に記載のように、当業界において知られている。
Klf4ポリペプチド：
本明細書において言及される場合、“Klf4ポリペプチド”は、ヒトKlf4、マウスKlf4、又は下記のいずれかのポリペプチドを包含する：
（i）次のKlf標的要素に結合する亜鉛- フィンガー DNA結合ドメイン（DBD）を包含し：
5'-GAGGTCC-S' 又は 5'-GGGGTGT-3'；そして
（ii）１又は複数の上記要素を含んで成るプロモーターをトランス活性化できる。例えば、Nakatake et al., (2006), MoI Cell Biol., 24(20):7772-7782を参照のこと。
いくつかの態様においては、Klf4ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そしてヒトKlf4 、すなわちKruppel-Like Factor 4 (GenBank受託番号NP_004226）のアミノ酸配列に対応する配列番号10に対して少なくとも70％、例えば75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一の、又は配列番号10に対して少なくとも70％〜100％同一のいずれか他の％同一であるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Klf4ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして配列番号10、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号10に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
他の態様においては、Klf4ポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして合計30個までのアミノ酸置換、欠失、挿入又はそれらのいずれかの組合せを有する配列番号10、例えば、0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 15、 20、25又はいずれか他の数のアミノ酸置換、欠失、挿入又は0〜30のそれらのいずれかの組合せを有する配列番号８のアミノ酸を含んで成るポリペプチドである。
配列番号10（ヒトKlf4）：
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLA
AATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATV
SSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAP
FNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEY
GSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPA
AHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQV
PPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHL
RTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLAL
HMKRHF。
いくつかの態様においては、Klf4は、上記機能的性質を有し、そして配列番号11に対して少なくとも70％同一の、例えば高く保存された亜鉛−フィンガーモチーフ DNA結合ドメイン(ZF-DBD)を含んで成るヒトKlf4のアミノ酸382−469に対応する、配列番号11に対して75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、又は少なくとも70％〜100％のいずれか他の％同一のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、Klf4は、上記機能的性質を有し、そして配列番号11、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号11に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
配列番号11（ヒトKM4-ZF-DBD）：
KRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTR HYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRH。
本明細書に記載されるようなKlf4ポリペプチドは、天然に存在するか又は天然に存在しないヒトKlf4の相同体を包含することができる。天然に存在するヒトKlf4の相同体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GenBank受託番号：NP_001017280, NP_057354 (Klf2); AAP36222 (Klf5); NP_034767; 及びNP_446165として列挙されるそれら、又は上記構造的及び機能的基準を満たすいずれか他のKlfファミリーメンバー。天然に存在しないヒトKlf4ポリペプチドの例は、上記機能的性質を有し、そして配列番号10又は11に対して少なくとも70％、例えば75％、80％、85％、90％又は70％〜100％同一であるアミノ酸配列を含んで成るそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
いくつかの態様においては、Klf4ポリペプチドは、記機能的性質を有する天然に存在しないポリペプチドである。
136の配列を包含するPSI−BLAST多重一列整列に基づいてヒトKlf4アミノ酸配列（配列番号10）のpMUT分析（上記）は、タンパク質の機能に対して有害であるか又は中性であることが予測されるアミノ酸置換を示すASM(表19)を生成する。上記標的要素に結合し、そして１又は複数の標的要素を含むプロモーターをトランス活性化するKlf4ポリペプチドの能力についての機能的アッセイは、例えばNakatake el al., (前記)に記載のように、当業界において知られている。
c-Mycポリペプチド：
本明細書において言及される場合、“c-Mycポリペプチド”は、ヒトc-Myc、マウスc-Myc、又は下記のいずれかのポリペプチドを包含する：
（i）塩基性ヘルックス−ループ−ヘルックスロイシンジッパードメインを含み、そして次の配列を含んで成る標的要素に結合し：
5'-CACGTG-3';又は5'-C/GACCACGTGGTG/C-3'；そして
（ii）１又は複数の上記標的要素を含んで成るプロモーターをトランス活性化できる。例えば、Cowling et al., (2006), Seminars in Cane. Biol., 16:242-252を参照のこと。
いくつかの態様においては、c-Mycポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そしてヒトc-Myc 、すなわち骨髄細胞腫性腫瘍遺伝子相同体(GenBank受託番号NP_002458）のアミノ酸配列に対応する配列番号12に対して少なくとも70％、例えば75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一の、又は配列番号12に対して少なくとも70％〜100％同一のいずれか他の％同一であるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、c-Mycポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして配列番号12、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号12に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
他の態様においては、c-Mycポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして合計30個までのアミノ酸置換、欠失、挿入又はそれらのいずれかの組合せを有する配列番号12、例えば、0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 15、 20、25又はいずれか他の数のアミノ酸置換、欠失、挿入又は0〜30のそれらのいずれかの組合せを有する配列番号12のアミノ酸を含んで成るポリペプチドである。
配列番号12（ヒトc-Myc）：
MDFFRWENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQ
PPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLE
MVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFΠCNΠIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARK
DSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSWFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFS
PSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDWSVEKRQAPGKRSE
SGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQ
ISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKV
VILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA。
いくつかの態様においては、c-Mycは、上記機能的性質を有し、そして配列番号13に対して少なくとも70％同一の、例えば高く保存された塩基性ヘルックス−ループ−ヘルックスロイシンジッパー（LZ） DNA結合ドメインを含んで成るヒトc-Mycのアミノ酸370−454に対応する、配列番号13に対して75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%、又は少なくとも70％〜100％のいずれか他の％同一のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。いくつかの態様においては、c-Mycポリペプチドは、上記機能的性質を有し、そして配列番号13、例えば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、１〜５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入）を有する配列番号13に対して少なくとも70％〜100％同一（例えば、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%同一）のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
配列番号13（ヒトc-Myc bHLH-LZドメイン）：
KRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKWILKKATAYILSVQAEEQK
LISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA。
本明細書に記載されるようなc-Mycポリペプチドは、天然に存在するか又は天然に存在しないヒトc-Mycの相同体を包含することができる。天然に存在するヒトc-Mycの相同体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GenBank受託番号：NP_001005154、NP_036735、NP_034979、P0C0N9及びNP_001026123として列挙されるそれら、又は上記構造的及び機能的基準を満たすいずれか他のOctファミリーメンバー。天然に存在しないヒトc-Mycの相同体の例は、Chang et al., (2000), MoI Cell Biol., 20:4309-4319に記載されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
250の配列を包含するPSI−BLAST多重一列整列に基づいてヒトc-Mycアミノ酸配列（配列番号12）のpMUT分析（上記）は、タンパク質の機能に対して有害であるか又は中性であることが予測されるアミノ酸置換を示すASM(表20)を生成する。上記標的要素に結合し、そして１又は複数の標的要素を含むプロモーターをトランス活性化するc-Mycポリペプチドの能力についての機能的アッセイは、例えばGu et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2935-2939に記載のように、当業界において知られている。
ある場合、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-MycポリペプチドDNA結合ドメインのいずれかが、ヘルペスVP16トランス活性化ドメイン融合され、本明細書に記載される誘発方法において誘発因子として使用され得るキメラ性融合タンパク質が生成される。１つの態様においては、ヘルペスVP16トランス活性化ドメインは、次のアミノ酸配列を含んで成る：
TKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSM
MQDQLGYPQHSTTAPITDVSLGDELRLDGEEVDMTPADALDDFDLEMLGDVESPSPGMTHD
PVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG。
いくつかの態様においては、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Mycポリペプチド、又はそれらの組合せのいずれかが、本明細書に記載される誘発方法への使用のためのペプチドトランスダクション組成物として供給される。そのような組成物は、次の少なくとも１つを含む：
（i）アミノ又はカルボキシ末端でタンパク質トランスダクションドメインを含んで成る精製されたOCT3/4ポリペプチド；
（ii)キャリヤー試薬及び精製されたOCT3/4ポリペプチド；
（iii）タンパク質トランスダクションドメイン及びSox2ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成る精製されたSox2ポリペプチド；
（iv）キャリヤー試薬及び精製及び精製されたSox2ポリペプチド；
（v）タンパク質トランスダクションドメインを含んで成る精製されたKlf4ポリペプチド；
（vi）キャリヤー試薬及び精製されたklf4ポリペプチド；
（vii）タンパク質トランスダクションドメインを含んで成る精製されたc-Mycポリペプチド；
（viii）キャリヤー試薬及び精製されたc-Myc−ポリペプチド；
（ix）(i)〜（vi）のいずれかの組合せ、ここで前記組成物は、c-Mycポリペプチドのアミノ酸を含んで成る精製されたポリペプチドを実質的に有さない。
いくつかの態様においては、タンパク質トランスダクションドメインは、IF配列のアミノ末端に融合される。他の態様においては、PTDドメインは、IF配列のカルボキシ末端に融合される。いくつかの態様においては、IF−PTD融合ポリペプチドは、変性ポリペプチドとして細胞に添加され、前記ポリペプチドは、次に変性される細胞中へのその輸送を促進する。PTD融合タンパク質の生成及びそれらの使用方法は、例えばアメリカ特許第5,674,980号、第5,652,122号及び第6,881,825号に記載されるように、当業界において知られている。例えば、Becker-Hapak et al, (2003), Curr. Protocols in Cell Biol, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。典型的なPTDドメインアミノ酸配列は、次のものを包含するか、但しそれらだけには限定されない：YGRKKRRQRRR (配列番号1); RKKRRQRR (配列番号2); YARAAARQARA (配列番号3); THRLPRRRRRR (配列番号4);及びGGRRARRRRRR (配列番号5)。
適切なキャリヤー剤及びそれらの使用方法の例は、アメリカ特許第6,841,535号に記載されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
G. 誘発された細胞コロニーのサブクローニング：
細胞コロニーは、当業界において知られているいずれかの方法によりサブクローン化され得、精製の前、全細胞集団に見出されるよりも、全細胞集団に対して高い割合の生成されるヒト幹細胞を含む、ヒト幹細胞の純粋な集団が得られる。ある場合、誘発された細胞は、約14日〜約40日、例えば15 日、16 日、 17 日、 18 日、 19 日、 20 日、 23 日、 24 日、 27 日、 28 日、 29 日、 30 日、 31 日、 33 日、 34 日、 35 日、 36 日、 37 日、 38 日、又は約14日〜約40日の他の期間、培養され、そして観察され、その後、本明細書に記載のように、形態学的特徴に基づいて“誘発された細胞”を含んで成るクローンが同定され、そして選択される。
誘発された細胞は、ほぼ１〜２日ごとに、好ましくは毎日の培地交換を伴って、37℃、5％CO2下で維持培養培地において培養され得る。維持培養培地の例は、いずれか及びすべての完全ES培地（例えば、MC-ES）を包含する。その維持培養培地は、ｂ−FGF又はFGF2により補充され得る。ある場合、維持培養培地は、他の因子、例えばIGF-II又はアクチビンAにより補充される。
細胞培養物を生理学的緩衝液、例えばハンクス液により洗浄した後、興味ある生態学的特徴を示すコロニーが、底側上にシリコーングリースにより被覆されたクローニング環により取囲まれる。約100μl（又は50μl〜150μl）の“霊長類ES細胞のための分離培地”（RoproCELL, Tokyou, Japanにより製造される）が、そのクローニング環に添加され、そして37℃で約20分間インキュベートされ、細胞懸濁液が形成される。分離されたコロニーを含む環における細胞懸濁液が、約2mlのMC-ES培地（又は本明細書に記載される他の培地）に添加され、そしてMEF−被覆された24ウェルプレートの１つのウェル、又は同等の表面積の他の細胞培養容器にプレートされる。５％CO2（大気O2）細胞培養インキュベーターにおいてコロニー由来の細胞を、37℃で約14時間、培養した後、培地を交換する。続いて、培地は、二次サブカルチャーが行われる約８日後まで、ほぼ２日ごとに交換される。
いくつかの態様においては、第１のサブカルチャーにおいては、培地が除去され、細胞がハンクス液により洗浄され、そして霊長類ES細胞のための分離培地（ReproCell, Tokyo, Japan）が前記細胞に添加され、そして37℃で10分間インキュベートされる。インキュベーションの後、MC-ES培地（2ml）が、得られる細胞懸濁液に添加され、分離培地の活性が停止される。次に細胞懸濁液が遠心分離管に移され、そして200xgで4℃で５分間、遠心分離される。上清液が除かれ、細胞ペレットがMC-ES培地に再懸濁され、そしてその再懸濁された細胞がMEF−被覆された24ウェルプレートの４個のウェル上にプレートされ、そして二次サブカルチャーが調製されるまで、約７日間、培養される。
上記方法により調製された二次サブカルチャーにおいては、細胞が、マトリゲルTMにより被覆された60mmの細胞培養皿上に、20μg/cm2の濃度でプレートされる。約８日後（IFの誘発された発現の開始の約５週間後）、三次サブカルチャーが調製され、ここで細胞は２つのマトリゲルTM−被覆された60mmの細胞培養皿上にプレートされ、この１つは続いて、遺伝子発現分析のために使用され、そして他の１つは下記のように連続して継代される。サブカルチャーの１つは、本明細書に記載されるように、遺伝子発現分析のために使用され、そして他の１つは誘発された細胞のクローンに由来する細胞系を維持するために、必要なら継代される。
H. 誘発された細胞の継代及び維持：
サブクローニングの後、誘発された細胞は、約５〜７日ごとに、サブ培養され得る。ある場合、細胞はハンクス液により洗浄され、そしてジスパーゼ又は霊長類ES細胞のための分離培地が添加され、そして37℃で５〜10分間インキュベートされる。およそコロニーの半分以上が分離される場合、MC-ES培地が添加され、分離培地の酵素活性が停止され、そして得られる細胞/コロニー懸濁液が遠心分離管に移される。懸濁液中のコロニーは、管の底に沈殿され、上清液が注意して除かれ、そして次に、MC−ES培地が添加され、コロニー再懸濁される。コロニーのサイズを試験したあと、非常に大きなコロニーが、ピペットをゆっくり上下にすることにより、より小さなサイスに分解される。ほぼサイズ分けされたコロニーは、サブカルチャーの前よりも約３〜６倍の基本領域を有する、マトリゲル被覆されたプラスチックの培養上にプレートされる。例えば、細胞は、約1:6〜約1:3、例えば約１：６、１：５、１：４又は１：３に分けら得る。
本発明のヒト生後組織に存在する未分化幹細胞から誘発されたヒト多能性幹細胞を培養するために有用な培養培地の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ES培地、及びヒトES細胞を培養するための適切な培養培地、例えばMEF−ならしES培地（MC-ES）、又は本明細書に記載される他の培地、例えばmTeSR1TM。いくつかの例においては、細胞は、本明細書に記載されるようにROCKインヒビターの存在下で維持される。
IV. 誘発された細胞の分析：
形態学的特徴に基づいて最初に同定されたそれらのコロニーからサブ培養された細胞コロニーが、多能性幹細胞に関連する多くの次の性質（但し、それらだけには限定されない）のいずれかについてアッセイされ得る：ALP活性の発現、ES細胞マーカー遺伝子の発現、タンパク質マーカーの発現、親細胞に比較してOct3/4及びNanogプロモーターの低メチル化、長期自己再生、正常な二倍体核型、及び外胚葉、中胚葉及び内胚葉組織を含んで成る奇形腫を形成する能力。
細胞（同定された細胞又は生存細胞）にけるALP活性を検出するための多くのアッセイ及び試薬は、当業界において知られている。典型的な態様においては、分析されるべきコロニーは、10％ホルマリン中性緩衝液により、室温で約５分間、例えば２〜５分間、固定され、そして次に、PBSにより洗浄される。ALP、１段階BCIP（５−グロモ−４−3’−インドールホスフェートｐ−トルイジン塩）及びPierce （Rockford IL)により製造されるNBT（ニトロ−ブルー塩化テトラゾリウム）の発色性基質が添加され、そして室温で20〜30分間、反応される。ALP活性を有する細胞が、ブルー−バイオレット染色される。
ALP活性について試験された推定上のiPS細胞コロニーが、一連のヒト胚幹細胞マーカー（ESCM）遺伝子、例えばNanog、 TDGFl、 Dnmt3b、 Zfp42、 FoxD3、 GDF3、 CYP26A1 、 TERT、 Oct 3/4、 Sox2、 Sall4及びHPRT（但し、それらだけには限定されない）の発現についてアッセイされ得る。例えば、Assou et al, (2007), Stem Cells, 25:961-973を参照のこと。遺伝子発現分析のための多くの方法は、当業界において知られている。例えば、Lorkowski et al., (2003), Analysing Gene Expression, A Handbook of Methods: Possibilities and Pitfalls, Wiley-VCHを参照のこと。適切な核酸に基づく遺伝子発現アッセイの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：定量的RT−PCR（qRT-PCR）、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ドットブロット、RNアーゼ保護、及びSAGE。
いくつかの態様においては、推定上のiPS細胞コロニーにおけるESCM遺伝子mRNA発現レベルが、qRT-PCRにより決定される。推定上のiPS細胞コロニーが収穫され、そして全RNAが、“ホルムアミド又はパラホルムアルデヒド固定された、パラフィン埋封された（FFPE）組織のためのRecoverall全核酸単離キット”（Ambion, Austin, TXにより製造される）を用いて抽出される。ある場合、RNA抽出のために使用されるコロニーは、固定されたコロニー、例えばALP活性について試験されたコロニーである。コロニーは、RNA抽出のために直接、すなわち従来の固定化を伴わないで、使用され得る。
典型的な態様においては、抽出されたRNAからのcDNAの合成の後、標的遺伝子は、TaqMan（商標）PreAmp mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CAにより製造される)を用いて増幅される。即時定量的PCRは、上記ESCM遺伝子のmRNAを検出するために、次のPCRプライマー組（Applied Biosystemsからの）を用いるABI Prism 7900HTを用いて実施される：Nanog、Hs02387400_gl、 Dnmt3b、HsOOl 71876_ml、FoxD3、Hs00255287_sl、Zfp42、Hs01938187_sl 、TDGFl、 Hs02339499_gl、TERT、Hs00162669_ml 、 GDF3、Hs00220998_ml 、CYP26A1、Hs00175627_ml、 GAPDH、Hs99999905_ml)。
推定上のiPS細胞コロニーは、タンパク質マーカー、例えばSSEA-3、SSEA-4、TRA-I -60、 TRA-I -81、CD9、CD24、Thy-1及びNanog（但し、それらだけには限定されない）の発現のための免疫細胞学的方法によりアッセイされ得る。広範囲の免疫細胞学的アッセイ、例えば蛍光免疫細胞学的アッセイは、例えばHarlow et al., (1988), Antibodies: A Laboratory Manual 353-355, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 及びまた, The Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (2004), Molecular Probes, Inc., Eugene, ORに記載のように知られている。
典型的な態様においては、推定上のiPS細胞コロニーにおける１又は複数の上記タンパク質マーカーの発現は次の通りにアッセイされる。培養された細胞が10％ホルムアルデヒドにより10分間、固定され、そして0.1％ゼラチン/PBSにより室温で約１時間、ブロックされる。細胞は、SSEA-3 (MC-631 ; Chemicon)、SSEA-4 (MC813-70; Chemicon)、TRA-1-60 (abl6288; abeam)、TRA-1 -81 (abl6289; abeam)、 CD9 (M-L13; R&D systems)、CD24 (ALB9; abeam)、Thyl (5E10; BD Bioscience)又はNanog (MAB 1997; R&D Systems)に対する一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートされる。
Nanog染色のために、細胞は、ブロッキングの前、0.1％TritonX-100/PBSにより透過される。細胞コロニーは、PBSにより３度、洗浄され、次にAlexaFluor 488-接合された二次抗体(Molecular Probes)及びHoechst 33258 (Nacalai)と共に室温で１時間インキュベートされる。さらなる洗浄の後、蛍光が蛍光顕微鏡、例えばAxiovert 200M顕微鏡（Carl Zeiss）により検出される。
A. メチル化分析：
いくつかの態様においては、誘発された細胞の特徴は、それらの親細胞に比較してOct3/4及びNanogのゲノムプロモーターの低められたメチル化である。分析されるべき適切なOct3/4プロモーター領域は、保存された領域１（CR1）を包含するOct3/4近位プロモーター、及びCR4を包含するOct3/4プロモーター遠位エンハンサーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。分析されるべきNanogプロモーター領域は、Oct3/4及びSox2結合部位を包含するNanog近位プロモーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。例えば、Rodda et al, (2005), J Biol. Chem., 280:24731-24737 及び Yang et al., (2005), J Cell Biochem., 96:821-830を参照のこと。ゲノムDNAの定量的分析のための多くの方法は、例えばBrena et al., (2006), J MoI. Med., 84(5):365-377に記載されるように、知られている。
典型的な態様においては、推定上の誘発された細胞及び比較のために使用される細胞から単離されたゲノムDNAが、単離され、そして亜流酸水素により処理される。亜流酸水素処理されたゲノムDNAは次に、T7プロモーター配列を含むプライマーによりPCR−増幅される。その後、RNA転写体が、T7ポリメラーゼを用いて生成され、そして次にRNアーゼAにより処理され、メチル化−特異的分割生成物が生成される。個々のCpG部位のメチル化は、分割生成物のMALDI−TOF質量分光計により評価される。前記方法の詳細な説明は、例えばEhich et al, (2005), Proc. Natl. Acad. ScL USA, 102: 15785-15790に提供される。
B. 自己−再生アッセイ：
幹細胞の特徴の１つは、老化を受けないで、連続的に増殖するそれらの能力である。従って、誘発された細胞は、インビトロで連続的に継代するそれらの能力について評価される。ある場合、誘発された細胞は、インビトロで少なくとも約30〜少なくとも約100回、例えば約33、35、40、45、51、56、60、68、75、80、90、93、100又は少なくとも約30〜少なくとも約100回のいずれか他の回数、継代されるそれらの能力についてアッセイされる。
もう１つの評価においては、誘発された細胞は、親細胞におけるIFの誘発された発現の開始から約30日〜約500日間、例えば40 日、50 日、 60 日、 70 日、 80 日、 100 日、 150 日、 180 日、 200 日、 250 日、 300 日、 400 日、 450 日、又は親細胞におけるIFの誘発された発現の開始から約30日〜約500日のいずれか他の期間、増殖するそれらの能力についてアッセイされる。いくつかの態様においては、誘発された細胞の長期自己再生が、細胞が所定の培地（例えば、mTeSR1培地）及びフィーダー細胞、例えば本明細書に記載されるようなmTeSR1培地の存在下で継代される場合、決定される。
C. 核型分析：
もう１つの可能な分析として、誘発された細胞は、二倍体及び正常な安定した核型、例えば細胞がインビトロで少なくとも１年間、継代された後、安定しているかについて評価される。多くの核型分析方法は当業界において知られている。いくつかの態様においては、核型分析方法は、例えばBayani et a!., (2004), Curr. Protoc, Cell Biol., Chapter 22:Unit 22.5に記載されるように多色FLSHである。
他の態様においては、核型分析は、例えばVermeesch et al., (2007), Eur. J. Hum. Genet., 15(11): 1 105-1 1 14に記載されるように、分子核型分析を包含する。典型的な態様においては、誘発された細胞は、0.02μg/mlのコレセミドにより約２〜約３時間、前処理され、約0.06〜約0.075MのKClと共に約20分間インキュベートされ、そして次に、Curnoy定着剤により固定される。その後、多色FLSH分析のために、細胞は多色、FISHプローブ、例えばCambio, Ltd (Cambridge, UK からのStarTISH（商標）Human Multicolour FISH (M-FISH) キットにおけるそれらのプローブによりハイブリダイズされる。
D. 奇形腫分析：
多能性幹細胞は、免疫無防備状態の動物中に注入される場合、外胚葉、中胚葉及び内胚葉組織を含んで成る奇形腫を形成する能力を有すると思われる。誘発された細胞又は誘発された多能性幹細胞（iPS）又はES細胞様多能性幹細胞は、インビトロでの長期自己再生能力及び３種の胚層に分化する多能性を有する細胞を言及し、そして前記多能性幹細胞は、試験動物、例えばマウス中に移植される場合、奇形腫を形成できる。
誘発された細胞は、免疫無防備状態の動物モデルにおける奇形腫形成アッセイにより多能性について評価され得る。免疫無防備状態の動物は、免疫抑制剤、例えばサイクロスポリン又はFK−506を投与されている齧歯動物である。例えば、免疫無防備状態の動物モデルは、SCIDマウスであり得る。約0.5×106〜約2.0×106、例えば0.6 x 106、0.8 x 106、1.O x 106、1.2 x 106、1.5 x 106, 1.7 x 106、又は約0.5×106〜約2.0×106個の他の数の誘発された細胞/マウスが、生後７〜８週の免疫無防備状態の動物の精巣の髄質中に注入される。６〜８週後、奇形腫が、PBS、続いて10％緩衝されたホルマリンにより動物を環流した後、切除される。次に、切除された奇形腫が、免疫組織学的分析にゆだねられる。
ヒト奇形腫と宿主（例えば、齧歯動物）組織とを区別する１つの方法は、ヒト特異的核マーカーHuNuについての免疫染色を包含する。免疫組織学的分析は、外胚葉（例えば、神経外胚葉）、中胚葉組織の存在の決定を包含する。外胚葉組織のためのタンパク質マーカーは、ネスチン、GFAP及びインテグリンβ１を包含するが、但しそれらだけには限定されない。中胚葉組織のためのタンパク質マーカーは、コラーゲンII、Brachyury及びオステオカルシンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。内胚葉組織のためのタンパク質マーカーは、α−フェトプロテイン（α−FP）及びHNF3βを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
E. 遺伝子発現：
いくつかの態様においては、遺伝子発現分析は、推定上のiPS細胞コリニーに対して実施される。そのような遺伝子発現分析は、推定上のiPS細胞コロニーからの遺伝子発現プロフィールと、次の１又は複数の細胞型（但し、それらだけには限定されない）のそれらのプロフィー路との比較を包含することができる：（i）親細胞、すなわち推定上のiPS細胞コロニーが誘発される１又は複数の細胞；（ii）ヒトES細胞系；又は（iii）確立されたiPS細胞系。当業界において知られているように、ヒトES細胞系についての遺伝子発現データは、公的な源、例えばNCBI“Gene Expression Omnibus”データベースにおけるWWW上で入手できる。
例えば、Barrett et al, (2007), Nuc. Acids Research, D760-D765を参照のこと。従って、いくつかの態様においては、推定上のiPSコロニーからの遺伝子発現プロフィールをES細胞系のそれらのプロフィールとの比較は、推定上の細胞コロニーからの実験的に得られたデータと、公的データベースを通して入手できる遺伝子発現データとの比較を必要とする。遺伝子発現データが公的に入手できるヒトES細胞系の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：hE14 (GEO データ組受託番号GSMl 51739 及びGSMl 51741)、Sheff4 (GEO寄託番号 GSM 194307、GSM 194308及び GSM 193409), h_ES 01 (GEO 受託番号 GSM 194390)、h_ES H9 (GEO受託GSM194392),及びh_ES BG03 (GEO 受託番号GSM194391)。
核酸マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイにより、１又は複数のiPS細胞系から単離された全RNAを分析することにより、遺伝子発現を達成することがまた可能である。全体的な遺伝子発現分析のための適切なマイクロアレイプラットフォームの例は、Human Genome Ul 33 ＋2.0マイクロアレイ(Affymetrix) 及びthe Whole Human Genome Oligo Micoarray (Agilent)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。遺伝子発現プロフィールの比較のための多くの分析方法は、例えばSuarez-Farinas et al, (2007), Methods MoI. Biol., 377:139-152, Hardin et al, (2007), BMC Bioinformatics, 8:220-232, Troyanskaya et al, (2002), Bioinformatics, 18(11): 1454- 1461, 及び Knudsen (2002), A Biologist's Guide to Analysis of DNA Microarray Data, John Wiley & Sonsに記載されるように、知られている。
いくつかの態様においては、本明細書に記載される方法により生成される細胞からの遺伝子発現データが、他の細胞型、例えばヒトES細胞系、親細胞、及び多分化能性幹細胞系（但し、それらだけには限定されない）よう得られるそれらのデータに比較される。適切な統計学的分析マトリックス及び方法は、Pearson Correlation, Euclidean Distance, Hierarchical Clustering (例えばEisen et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(25): 14863-14868参照のこと)、及びSelf Organizing Maps (例えばTamayo et al, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(6):2907-2912を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
V. 誘発された細胞の説明：
誘発された細胞は、多能性又は多分化能幹細胞に関連する次の一定の性質を共有することができる：ALP活性の発現、ES細胞マーカー遺伝子の発現、タンパク質マーカーの発現、ES細胞又は親細胞に比較しての遺伝子マーカーの高い又は低い発現、親細胞に対しての一定のプロモーター（例えば、Oct3/4及びNanog）の低メチル化、長期自己再生能力、正常な二倍体核型、形態学的特徴、及び外胚葉、中胚葉及び内胚葉を含んで成る奇形腫を形成する能力（但し、それらだけには限定されない）。誘発された細胞の組織は、細胞及びもう１つの成分、例えば培養培地への補充物を包含する。
誘発された細胞は、アルカリホスファターゼ（ALP）活性に対して陽性であり得る。それらは、ALPを発現し、そして２〜10個（例えば、３，４，５，６，７，８，９又は10個）の次のES細胞マーカー遺伝子から発現することができる：TDGFl, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26al, TERT, zfp42, Sox2, Oct3/4及び Nanog。ある場合、誘発された細胞は、Tert又はCyp26a1を発現する。ある場合、誘発された細胞は、Tert及びCyp26a1の両者を発現する。ある場合、誘発された細胞は、ALP活性に対して陽性であり、そして前述のES−細胞マーカー遺伝子のすべてを発現する。ある場合、誘発された細胞は、ALP活性に対して陽性であり、そしてNanogを発現する。ある場合、誘発された細胞は、ALP活性に対して陽性であり、そして１又は複数のTERT、CYP26A1又はGPF3を発現する。ある場合、誘発された細胞は、ALP活性に対して陽性であり、そして１又は複数のNanog, TDGF及びDnmt3bを発現する。
誘発された細胞は、複数の次のマーカータンパク質を発現することができる：TDGFl、Dnmt3b、 FoxD3、 GDF3、 Cyp26al、 TERT、 zfp42、 Sox2、 Oct3/4及び Nanog
SSEA-3、SSEA-4、 TRA-I -60、 TRA-I -81 、 CD9、 CD24又はThy-1。ある場合、誘発された細胞は、前述のマーカータンパク質のすべてを発現する。典型的な対応においては、ヒト多能性幹細胞は、細胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-I -60、TRA-I -81 、 CD9、CD24及びCD90、及びES細胞マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4、 TDGFl 、 Dnmt3b、 GABRB3、 GDF3、 Zfp42、 ALP、 CD9及びThy-1を発現する。
誘発された細胞は、１又は複数の胚幹細胞、例えばヒト胚幹細胞におけるそれらの遺伝子の発現レベルに比較して、１又は複数の遺伝子（例えば、内因性遺伝子）の発現レベル、例えば高いか又は低い発現レベルでの差異を示すことができる。好ましくは、遺伝子発現の差異は、１又は複数の統計学的試験（例えば、スチューデントt−試験、又は他のパラメトリック又は非パラメトリック試験）によれば、統計学的に有意である。例えば、発現の差異は、0.05以下か又は等しい、0.01以下か又は等しい、又は0.001以下か又は等しいp値を有する。
誘発された細胞及び胚幹細胞における異なった発現レベルを示す遺伝子の数は、1 〜 1000 個の遺伝子、1 〜 700 個の遺伝子、1 〜 500 個の遺伝子、1 〜 300 個の遺伝子、1 〜 200 個の遺伝子、1 〜 100 個の遺伝子、1 〜 50 個の遺伝子、3 〜 20 個の遺伝子、5 〜 20 個の遺伝子、5 〜 50 個の遺伝子、10 〜 50 個の遺伝子、20 〜 50 個の遺伝子、30 〜 100 個の遺伝子、又は50 〜 100 個の遺伝子、1又は複数個の遺伝子、2 又は それ以上の遺伝子、3 又は それ以上の遺伝子、5 又は それ以上の遺伝子、10 又は それ以上の遺伝子、15 又は それ以上の遺伝子、20 又は それ以上の遺伝子、50 又は それ以上の遺伝子、70 又は それ以上の遺伝子、又は 100 又は それ以上の遺伝子、500 又は それ以上の遺伝子、1000 又は それ以上の遺伝子、9 個の遺伝子、12 個の遺伝子、42 個の遺伝子、70 個の遺伝子、又は 100 個の遺伝子であり得る。遺伝子発現レベルの差異は、少なくとも２倍、例えば少なくとも 3 倍、4 倍、5 倍、6 倍、7 倍、10 倍、2 〜 50 倍、2 〜 30 倍、2 〜 20 倍、2 〜 10 倍、又は 2 〜 5 倍であり得る。
ある場合、誘発された細胞及び胚幹細胞において異なった発現レベルを示す遺伝子は、ヒト胚幹細胞におけるよりも誘発された細胞において、より高いレベルの発現を示す。ある場合、誘発された細胞において、より高いレベルの発現を示す遺伝子は、表13、 15又は16に列挙される遺伝子の1 又はそれ以上、2 又はそれ以上、3 又はそれ以上、4 又はそれ以上、5 又はそれ以上、10 又はそれ以上、15 又はそれ以上、25又はそれ以上、50 又はそれ以上、75 又はそれ以上、100 又はそれ以上、又は200 又はそれ以上である。
ある場合、胚幹細胞に比較して、誘発された細胞において異なった発現レベルを示す遺伝子は、誘発された細胞に比較して、ヒト胚幹細胞においてより高いレベルで発現される。ある場合、ヒト胚幹細胞において高いレベルで発現される遺伝子は、表14に列挙される遺伝子の1 又はそれ以上、2 又はそれ以上、 3 又はそれ以上、 4 又はそれ以上、 5 又はそれ以上、 10 又はそれ以上、 15 又はそれ以上、 25 又はそれ以上、 50 又はそれ以上、 75 又はそれ以上、 100 又はそれ以上、又は200 又はそれ以上である。
ある場合、遺伝子又は遺伝子組は、胚幹細胞に比較される場合、及び親細胞、例えば線維芽細胞に比較される場合、誘発された細胞においてより高い発現レベルを示す。例えば、胚幹細胞及び親細胞の両者においてよりも誘発された細胞においてより高い発現を示す遺伝子は、表15に列挙される遺伝子の1 又はそれ以上、2 又はそれ以上、 3 又はそれ以上、 4 又はそれ以上、 5 又はそれ以上、 10 又はそれ以上、 15 又はそれ以上、 25 又はそれ以上、 50 又はそれ以上、 75 又はそれ以上、 100 又はそれ以上、 又は200 又はそれ以上である。
遺伝子又は遺伝子組は、胚幹細胞におけるその発現レベルよりも、親細胞（例えば、線維芽細胞）における発現レベルに近いレベルで誘発された細胞において発現され得る。遺伝子又は遺伝子組は例えば、胚幹細胞に比較される場合、誘発された細胞において高い発現レベルを示すことができるが、しかし親細胞、例えば線維芽細胞に比較される場合、そうでない。親細胞ではなく、胚細胞においてよりも誘発された細胞において、より高い発現レベルを示す遺伝子は、表16に列挙される遺伝子の1 又はそれ以上、2 又はそれ以上、 3 又はそれ以上、 4 又はそれ以上、 5 又はそれ以上、 10 又はそれ以上、 15 又はそれ以上、 25 又はそれ以上、 50 又はそれ以上、 75 又はそれ以上、 100 又はそれ以上、 又は200 又はそれ以上であり得る。
誘発された細胞内のテロマーの長さは、胚幹細胞内の染色体の末端でのテロマーの長さよりも短い。ある場合、誘発された細胞におけるテロマーは、胚幹細胞系内のテロマーよりも、少なくとも0.1 kB、少なくとも 0.25 kB、 少なくとも 0.5 kB、 少なくとも 1 kB、 少なくとも 2 kB、 少なくとも 3 kB、 少なくとも 4 kB、 又は少なくとも 5 kB短い。ある場合、誘発された細胞は、胚幹細胞系におけるよりも少なくとも 1、少なくとも 2、少なくとも 3、少なくとも 4、少なくとも 5、少なくとも 6、少なくとも 8、少なくとも10又は少なくとも15よりも短いテロマーを有する。
誘発された細胞は、IFをコードするが外因性遺伝子（又はトランスジーン）を含んで成る。誘発された細胞は、本明細書に記載されるいずれかの組のIFをコードする外因性遺伝子を含んで成る。例えば、誘発された細胞は、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycポリペプチドをコードする４種の外因性遺伝子を含んで成る。ある場合、誘発された細胞は、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycポリペプチドをコードする４種の外因性遺伝子を含んで成るが、しかし誘発因子をコードする他の外因性遺伝子は含まない。
他の場合、誘発された細胞は、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドコードする外因性遺伝子を含んで成るが、しかしc-Mycポリペプチドをコードする外因性遺伝子含まない。ある場合、誘発された細胞は、Oct3/4、Sox2及びKlf4ポリペプチドをコードする３種の遺伝子から実質的に成る外因性遺伝子を含む。ある場合、ヒト多能性幹細胞は、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycをコードする外因性遺伝子の少なくとも１つのコピーを担持する。ある場合、外因性遺伝子を含む誘発された細胞のいずれかがまた、マウス由来のカチオン性トランスポーター１（mCAT-1）、すなわち自己指向性レトロウィルスのための受容体のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする外因性遺伝子を含む。
外因性遺伝子の導入の後、ある点で、1又は複数の外因性遺伝子がサイレンシングされる。ある場合、Oct3/4外因性遺伝子はサイレンシングされ；Klf4外因性遺伝子はサイレンシングされ；Sox2外因性遺伝子はサイレンシングされ；又はc-Mycトランスジーンはサイレンシングされる。ある場合、すべての４種の外因性遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc）がサイレンシングされる。ある場合、すべての３種の外因性遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2及びKlf4）はサイレンシングされる。
誘発された細胞は、本明細書に記載される誘発された多能性幹（iPS）細胞系：1-8：2-4；又は3-2の同定特性のすべてを共有することができる。細胞系iPS-1-8は、ブダペスト条約に従って国際特許機構寄託機関（IPOD）に寄託される。寄託物のための証明書番号は、FERM BP-10956である。IPODの住所は次の通りである：
International Patent Organism Depositary (IPOD)
AIST Tsukuba Central 6
1-1, Higashi 1-chome
Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken 305-8566
Japan
ある場合、ヒト多能性又は多分化能性幹細胞は、Tert、nanog、 Oct3/4及びSox2遺伝子が後生不活性化を受けていないヒト生後組織に存在する末分化幹細胞から誘発される。ある場合、細胞は、組織に存在する分化細胞から、又は組織に存在する分化及び末分化細胞の組合せから誘発される。
誘発された細胞におけるNanog及びOct3/4のプロモーター領域は、親線維芽細胞に比較して、低又は脱メチル化され得る。誘発された細胞は、ヒトES細胞−培養条件下で培養される場合、長期再生能力を有する幹細胞であり得る。
幹細胞の特徴の１つは、老化をうけないで連続的に増殖するそれらの能力である。従って、誘発された細胞は、インビトロで連続して継代され得る。ある場合、誘発された細胞は、インビトロで少なくとも約30〜少なくとも100回、例えば約33、35、 40、 45、 51、 56、 60、 68、 75、 80、 90、 93、 100回、又は他の回数、継代され得る。誘発された細胞は、親細胞においてIFの誘発された発現の開始から約30日〜約500日間、例えば40 日間、50 日間、 60 日間、 70 日間、 80 日間、 100 日間、 150 日間、 180 日間、 200 日間、 250 日間、 300 日間、 400 日間、 450 日間、又は約30日〜約500日以外の他の日数、増殖することができる。いくつかの態様においては、誘発された細胞は、500日以上の間、増殖する。
典型的には、誘発された細胞は、大気酸素条件（例えば、約21％の酸素）下で末分化表現型を伴って増殖することができる。他の場合、誘発された細胞は、５％酸素〜約21％酸素の範囲の酸素条件下で末分化細胞として増殖する。一般的、誘発された細胞はコロニー下で増殖する。
誘発された細胞は、インビトロ多能性機能、例えばヒトES細胞のインビトロ分化を誘発するための条件下で外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化する能力を有し；そしてそのような細胞はさらに、始原生植細胞（例えば、精子、卵母細胞）に分化する能力を有する。
ある場合、誘発されたヒト多能性幹細胞及び親細胞（例えば、ヒト生後組織に存在する末分化幹細胞）は、同一又はほとんど同一のSNP遺伝子型を有する。ある場合、誘発された細胞及び親細胞は、同じHLA型（例えば、HLA-A、B、Cw、DR、DQ、DP及びBw）を有する。
本明細書に供給される組成物は、誘発された細胞の他に、又は誘発された細胞から分化された細胞の他に、他の成分を含むことができる。ある場合、組成物は、そのような細胞及び凍結保存剤、例えばアメリカ特許出願番号第10/902,571号；第11/142,651号；又はHa et al., (2005), Hum. Reprod., 20(7): 1779-1785に記載される凍結保存媒体を含んで成る。
組成物は、そのような細胞及び培養培地、例えばヒトES培養培地を含んで成る。ある場合、培養培地は、１又は複数の成長因子、例えばFGF-2、bFGF、PDGF、EGF、IGF、又はそれらの誘導体から構成される培地である。いくつかの例においては、組成物は、ヒト誘発された多能性又は多分化能性幹細胞、及びFGF-2又はbFGF、又はそれらの誘導体を含んで成る培地を含んで成る。他の場合、組成物は、ヒト誘発された多能性又は多分化能性幹細胞、及びヒトES培養培地及びFGF-2又はbFGF、又はそれらの誘導体を含んで成る培地を含んで成る。さらにもう１つの例においては、組成物は、本明細書に記載されるヒト誘発された多能性又は多分化能性幹細胞及びMC-ES培地を含んで成る。
ある場合、培養培地におけるFGF又はFGF2の濃度はまた、2ng/ml〜約50ng/ml、例えば約2 ng/ml、3 ng/ml、 4 ng/ml、5 ng/ml、 6 ng/ml、 7 ng/ml、 8 ng/ml、 10 ng/ml、 12 ng/ml、 14 ng/ml、 15 ng/ml、 17 ng/ml、 20 ng/ml、 25 ng/ml、 30 ng/ml、 35 ng/ml、 40 ng/ml、 45 ng/ml、 50 ng/mlである。bFGF又はFGF2の濃度はまた、約4 ng/ml 〜 約 10 ng/ml; 約 4 ng/ml 〜 約 20 ng/ml;約 10 ng/ml 〜 約 30 ng/ml;約 5 ng/ml 〜 約 40 ng/ml;又は約 10 ng/ml 〜 約 50 ng/mlであり得る。他の場合、bFGF又はFGF2のより高い濃度、例えば約50 ng/ml 〜 約100 ng/ml;約50 ng/ml 〜 約75 ng/mlの濃度が使用され得る。同様に、培養培地は、本明細書に記載されるように、約2ng/ml〜約100ng/mlの濃度である、bFGF又はFGF2以外の成長因子を含むことができる。
VI. 細胞分化：
誘発された細胞は、種々の系統の細胞型に分化され得る。分化された細胞の例は、外胚葉（例えば、ニューロン及び線維芽細胞）、中胚葉（例えば、心臓筋細胞）、又は内胚葉（例えば、膵臓細胞）系統からのいずれかの分化された細胞を包含する。分化された細胞は、１又は複数の次のものであり得る：膵臓β細胞、神経幹細胞、ニューロン（例えば、ドーパミン作用性ニューロン）、希突起膠細胞、希突起膠細胞子孫細胞、肝細胞、肝幹細胞、神経膠星状細胞、ミオサイト、造血細胞又は心筋細胞。
誘発された細胞に由来する分化された細胞は、最終的に分化された細胞であり得、又はそれらは特定系統の細胞をもたらすことができる。例えば、誘発された細胞は、種々の多分化能細胞型、例えば神経幹細胞型、心臓幹細胞又は肝臓幹細胞に分化され得る。次に、肝細胞は新規細胞型にさらに分化され得、例えば神経幹細胞はニューロンに分化し；心臓幹細胞は心筋細胞に分化され得；そして肝臓幹細胞は肝細胞に文化され得る。
誘発された細胞を、より特殊化された細胞型に分化するための多くの方法が存在する。誘発された細胞を分化するための方法は、幹細胞、特にES細胞、MSCs、 MAPCs、MIAMI、造血幹細胞（HSC）を分化するために使用されるそれらの方法に類似する。ある場合、分化はエクスビボで生じ；ある場合、分化はインビボで生じる。
ES細胞から神経幹細胞を生成するためのいずれかの既知方法が、誘発された細胞から神経幹細胞を生成するために使用され得る。例えば、Reubinoff et al., (2001), Nat, Biotechnol., 19(12): 1 134- 40を参照のこと。例えば、神経幹細胞は、ノギン又は他の骨形態形成タンパク質アンタゴニストの存在下で浮遊する凝集体として誘発された細胞を培養することにより生成され得る。例えば、Itsykson et al., (2005/ MoI, Cell Neurosci., 30(l):24-36を参照のこと。もう１つの例においては、神経幹細胞は、成長因子、例えばFGF-2の存在下で凝集体を形成するために懸濁液において誘発された細胞を培養することにより生成され得る（Zhang et al., (2001), Nat.Biotech., (19): 1 129-1 133）。
ある場合、凝集体は、FGF-2を含む血清フリー培地において培養される。もう１つの例においては、誘発された細胞は、FGF-2を含んで成る血清フリー培地の存在下で、マウス間質細胞系、例えばPA6と共に同時培養される。さらにもう１つの例においては、誘発された細胞は、分化を直接的に誘発するために、FGF-2を含む血清フリー培地に直接的に移行される。
誘発された細胞に由来する神経幹細胞は、ニューロン、乏突起膠細胞又は星状細胞膠腫に分化され得る。しばしば、神経幹細胞を生成するために使用される条件はまた、ニューロン、乏突起膠細胞する星状細胞膠腫を生成するためにも使用され得る。
ドーパミン作用性ニューロンは、パーキンソン病及び他の神経変性疾患において中心的役割を演じ、そして従って、特に興味あるものである。ドーパミン作用性ニューロンの分化を促進するために、誘発された細胞は、血清フリー条件下でPA6マウス間質細胞系と共に同時培養され得る。例えば、Kawasaki et al., (2000) Neuron, 28(1 ):31-40を参照のこと。他の方法もまた記載されている（例えば、Pomp et al., (2005), Stem Cells 23(7):923-30;アメリカ特許第6,395,546号、例えば, Lee et al., (2000), Nature Biotechnol, 18:675-679を参照のこと）。
乏突起膠細胞はまた、誘発された細胞からも生成され得る。凝集された細胞の乏突起膠細胞への分化は、ES細胞又は神経幹細胞を乏突起膠細胞に分化するための既知方法により達成され得る。例えば、乏突起膠細胞は、間質細胞と共に誘発された細胞又は神経幹細胞を同時培養することにより生成される（Hermann et al. (2004), J Cell Sci. 117(Pt 19):4411-22を参照のこと）。もう１つの例においては、乏突起膠細胞は、インターロイキン（IL）−６受容体又は誘導体がIL-6サイトカイン又はその誘導体に結合されている、融合タンパク質の存在下で誘発された細胞又は神経幹細胞を培養することにより生成され得る。乏突起膠細胞はまた、当業界において知られている他の方法により、誘発された細胞から生成され得る。例えば、Kang et al, (2007) Stem Cells 25, 419-424を参照のこと。
星状細胞膠腫はまた、誘発された細胞から生成され得る。星状細胞膠腫は、bFGF及びEGFと共に神経原性培地の存在下で誘発された細胞又は神経幹細胞を培養することにより生成され得る。例えば、Brustle et al, (1999), Science, 285:754-756を参照のこと。
誘発された細胞は、当業界において知られている方法により、膵臓β細胞に分化され得る。例えば、Lumelsky et al., (2001) Science, 292:1389-1394; Assady et al., (2001 ), Diabetes, 50: 1691-1697; D'Amour et al., (2006), Nal. BiotechnoL, 24: 1392-1401 ; D'Amour et al., (2005), Nat. Biotechnol 23: 1534-1541を参照のこと。前記方法は、アクチビンAにより補充された血清フリー培地において誘発された細胞を培養し、続いて、すべてのトランス−レチノン酸により補充された血清フリー培地の存在下で培養し、続いてbFGF及びニコチンアミドにより補充された血清フリー培地の存在下で培養することを含んで成る。例えば、Jiang et al., (2001),Cell Res., 4:333-444を参照のこと。
他の例においては、前記方法は、血清フリー培地、アクチビA、及びWntタンパク質の存在下で誘発された細胞を、約0.5〜約6日間、例えば約0, 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6日間、培養し；続いて、約0.1％〜約２％、例えば0.2％FBS及びアクチビンAの存在下で約１〜約４日、例えば約1, 2, 3又は４日間、培養し；続いて2％FBS、FGF-10及びKAAD-シクロパミン（ケト−N−アミノエチルアミノカプロイルジヒドロシンナモイルシクロパミン）及びレチノン酸の存在下で約１〜約５日、例えば1, 2, 3, 4又は5日間、培養し；続いて、１％B27、γセクレターゼインヒビター及びエクステンジン−４と共に約１〜約４日は、例えば1, 2, 3又は4日間、培養することを含んで成る。
肝細胞又は肝幹細胞は、誘発された細胞から分化され得る。例えば、酪酸カリウムの存在下での誘発された細胞の培養は、肝実質細胞を生成できる。例えば、Rambhatla et al., (2003), Cell Transplant, 12:1-1 1を参照のこと。もう１つの例においては、肝実質細胞は、アクチビンAの存在下で血清フリー培地において誘発された細胞を培養し、続いて線維芽細胞成長因子−４及び骨形態形成タンパク質−２下で前記細胞を培養することにより生成され得る。例えば、Cai et al, (2007), Hepatology, 45(5): 1229-39を参照のこと。典型的な態様においては、誘発された細胞は、アクチビンAの存在下で誘発された細胞を約２〜約６日、例えば約２、約３、約４、約５又は約６日間、培養し、そして次に肝実質細胞成長因子（HGF）の存在下で誘発された細胞を約５日〜約10日、例えば約５、約６、約７、約８、約９又は約10日間、培養することにより、肝細胞又は肝幹細胞に分化される。
誘発された細胞はまた、心筋細胞に分化され得る。骨形態形成タンパク質（BMP）シグナル化の阻害は、心筋細胞の生成をもたらす。例えば、Yuasa et al, (2005), Nat. Biotechnol, 23(5):607-l 1を参照のこと。従って、典型的な態様においては、誘発された細胞は、胚様体の形成、及び胚様体の約１〜約４週、例えば約１、約２、約３又は約４週間の培養の前、nogginの存在下で約２〜約６日、例えば約２、約３、約４、約５又は約６日間、培養される。
他の例においては、心筋細胞は、白血病阻害因子（LIF）の存在下で誘発された細胞を培養することにより、又はES細胞から心筋細胞を生成するために当業界において知られている他の方法に、それらをゆだねることにより生成され得る。例えば、Bader et al, (2000), Circ. Res., 86:787-794, Kehat et al, (2001), J Clin. Invest., 108:407-414; Mummery et al, (2003), Circulation, 107:2733-2740を参照のこと。
誘発された細胞から他の細胞型を生成するための方法の例は、次のことを包含する：
（１）脂肪細胞を生成するために、レチノン酸、白血病阻害因子（LIF）、甲状腺ホルモン（T3）、及びインスリンの存在下で誘発された細胞を培養し（例えば、Dani et al, (1997), J. Cell ScL, 1 10:1279-1285）；
（２）軟骨細胞を生成するためにBMP-2又はBMP-4の存在下で誘発された細胞を培養し（Kramer et al, (2000), Mech, Dev., 92:193-205）；
（３）平滑筋を生成するための条件下で誘発された細胞を培養し（例えば、Yamashita et al, (2000), Nature, 408:92-96を参照のこと）；
（４）角質細胞を生成するためにβ−１インテグリンの存在下で誘発された細胞を培養し（例えば、Bagutti et al, (1996), Dev. Biol, 179: 184-196を参照のこと）；
（５）インターロイキン−３（IL-3）及びマクロファージを生成するためのマクロファージコロニー刺激因子の存在下で誘発された細胞を培養し（例えば、Lieschke and Dunn (1995), Exp. Hemat., 23:328-334を参照のこと；
（６）肥満細胞を生成するために、IL-3及び幹細胞因子の存在下で誘発された細胞を培養し（例えば、Tsai et al, (2000), Proc. Natl. Acad. ScL USA, 97:9186-9190を参照のこと）；
（７）メラニン細胞を生成するために、デキサメタゾン及び間質細胞層、すなわちスチール因子の存在下で誘発された細胞を培養し（例えば、Yamane et al, (1999), Dev. Dyn., 216:450-458を参照のこと）；
（８）造芽細胞を生成するために、デキサメタゾン、レチノン酸、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェートの存在下で胎児マウス造芽細胞と共に誘発された細胞を同時培養し（例えば、Buttery et al, (2001), Tissue Eng., 7:89-99を参照のこと）；
（９）骨芽細胞を生成するために骨形成原因子の存在下で誘発された細胞を培養し（Sottile et al, (2003), Cloning Stem Cells, 5:149-155を参照のこと）；
（10）骨格筋細胞を生成するために、誘発された細胞においてインスリン様成長因子−２を過剰発現し、そしてジメチルスルホキシドの存在下で前記細胞を培養し（例えば、Prelle et al, (2000), Biochem. Biophys. Res. Commun., 277:631-638を参照のこと）；
（11）白血球を生成するための条件に、誘発された細胞をゆだね；又は（12）造血前駆体細胞を生成するために、BMP4、及び１又は複数のSCF, FLT3, IL-3, IL-6及びGCSFの存在下で誘発された細胞を培養すること（Chadwick et al, (2003), Blood, 102:906-915を参照のこと）。
ある場合、分化された細胞の亜集団が精製されるか又は単離され得る。ある場合、所望する細胞型に対して特異的な１又は複数のモノクローナル抗体が細胞集団と共にインキュベートされ、そしてそれらの結合された細胞が単離される。他の場合、所望する亜集団の細胞が、細胞型特異的プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を発現する。
特定の態様においては、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ−EGFP融合タンパク質が、細胞型特異的態様で発現される。精製方法は、緑色蛍光細胞を選択するための細胞を分類し、そして必要なら、前記分類を反復し、細胞型依存性態様下（例えば、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ−EGFP）を発現する細胞のために富化された細胞集団を得ることを含んで成る。所望する亜集団の細胞の選択はまた、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ/ガンシクロビル（HSVtk/GCV）自殺遺伝子システムによる増殖細胞の負の選択により、又はビシストロン性レポーターを発現する細胞の正の選択により達成され得る（例えば、Anderson et al. (2007) MoI Ther. (1 1):2027-2036を参照のこと）。
VII . 細胞療法：
誘発された細胞、又はその誘発された細胞から分化された細胞は、疾病（例えば、遺伝子欠損）を処理するための治療剤として使用され得る。その治療は、疾病の原因に向けられ得；又は他方では、治療は疾病又は病状の効果を処理することであり得る。誘発された細胞は、対象における損傷部位に又はそれに接近して移行され得；又は前記細胞は、その細胞の損傷された部位への移動又は標的化を可能にする態様で対象に導入され得る。移行された細胞は好都合には、損傷された外傷を受けた細胞を置換することができ、そして対象の全体的状態の改良を可能にする。ある場合、移行された細胞は、組織再生又は修復を刺激することができる。
移行された細胞は、誘発された細胞から分化された細胞であり得る。移行された細胞はまた、誘発された細胞から分化された多分化能性幹細胞であり得る。ある場合、移行された細胞は、分化されいない誘発された細胞であり得る。
対象への処理の回数は変化することができる。誘発された及び/又は分化された細胞の対象への導入は１回の現象であり得るが、しかし一定の状況下で、そのような処理は限定された時間、改良を誘発し、そして進行する反復された処理を必要とする。他の状況下で、細胞の複数回の投与が、効果が観察される前、必要とされる。正確なプロトコールは、疾病又は病状、処理される個々の対象の疾病の段階及びパラメーターに依存する。
細胞は次の経路のいずれかを通して対象に導入され得る：非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、気管内又は脊髄液。
誘発された細胞は、細胞に分化され、そして次に、広範囲の疾病又は障害を有する対象に移行され得る。神経学的疾病又は障害を有する対象は特に、幹細胞に分化され、そして次に、損傷部位に移植され、神経学的病状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷又は他の中枢神経系障害が処理される。例えば、Morizane et al., (2008), Cell Tissue Res., 331(l):323-326; Coutts and Keirstead (2008), Exp. Neurol, 209(2):368- 377; Goswami and Rao (2007), Drugs, 10(10):713-719を参照のこと。
パーキンソン病の処理に関しては、誘発された細胞は、ドーパミン作用ニューロンに分化され、そして次に、パーキンソン病を有する対象の線状体中に移植され得る。多発性硬化症の処理に関しては、神経幹細胞が乏突起神経膠細胞又はその前駆体に分化され、次に、MSを有する対象に移行される。
いずれかの神経学的疾病又は障害の処理に関しては、有用なアプローチは、対象に神経幹細胞を導入することである。例えば、アルツハイマー病、脳梗塞又は脊髄損傷を処理するためには、誘発された細胞は神経幹細胞に分化され、続いて損傷部位に移植される。誘発された細胞はまた、それらの移動を、脳及び脊髄修復のために、損傷部位に向ける役割に応答して構築され得る。例えば、Chen et al., (2007), Stem Cell Rev., 3(4):280-288を参照のこと。
神経学的障害以外の疾病がまた、誘発された細胞、例えば誘発された多分化能性又は多能性幹細胞をから分化される細胞を用いる幹細胞治療により処理され得る。変性心疾患、例えば虚血性心筋障害、伝導病及び先天性欠損が、幹細胞治療から有益である。例えばJanssens et al., (2006), Lancet, 367: 1 13-121を参照のこと。
膵臓島細胞（又はランゲルハンス島の一次細胞）が、糖尿病（１型糖尿病）を有する対象中に移植される。例えば、Burns et al., (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2:255-266を参照のこと。いくつかの態様においては、誘発された細胞に由来する膵臓β細胞が、糖尿病（例えば１型糖尿病）を有する対象に移植され得る。
他の例においては、誘発された細胞由来の肝細胞又は肝幹細胞が、肝臓疾患、例えば肝炎、肝硬変又は肝不全を有する対象中に移植される。
誘発された細胞由来の造血細胞又は造血幹細胞（HSC）が、血液又は他の血液の癌又は免疫障害を有する対象中に移植され得る。造血細胞又はHSCにより実施的に処理される血液の癌の例は、次の癌を包含する：急性リンパ性白血病、急性骨髄芽球白血病、慢性骨髄白血病（CHL）、ホジキン病、多発性骨髄腫及び非ホジキン性リンパ腫。しばしば、そのような疾病を有する対象は、急速に分裂する血液細胞を殺すために、放射線及び/又は化学療法処理を受けるべきである。誘発された細胞由来のHSCのそれらの対象への導入が細胞の消耗されたレザバーの再増殖を助けることができる。
ある場合、誘発された細胞由来の造血細胞又はHSCはまた、癌を直接的に攻撃するためにも使用され得る。例えば、異系HSCの移植は、腎臓癌の処理に有望であることが示された。例えば、Childs et al., (2000), N. Engl. J. Med., 343:750-758を参照のこと。いくつかの態様においては、誘発された細胞由来の異種又はさらに自己由来のHSCでさえ、腎臓又は他の癌を処理するために、対象中に導入され得る。
誘発された細胞由来の造血細胞又はHSCはまた、血液細胞以外の細胞又は組織、例えば筋肉、血管、又は骨を生成するか又は修復するために対象中に導入され得る。そのような処理は、多くの障害のために有用であり得る。
ある場合、誘発された細胞は、免疫無防備状態の動物、例えばSCIDマウス中に導入され、そして分化を可能にされる。移植された細胞は、分化された細胞型及び腫瘍細胞の混合物を形成できる。興味ある特定の分化された細胞型が、系統特異的マーカーの使用により、例えば蛍光活性化された細胞分類（FACS）、又は他の分類方法、例えば磁気活性化された細胞分類（MACS）により、腫瘍細胞から選択され、そして精製され得る。次に、分化された細胞は、病状を処理するために対象（例えば、自己由来の対象、HLA−適合された対象）中に移植され得る。疾病又は病状は、造血障害、内分泌不全、退化性神経学的障害、毛髪脱落、又は本明細書に記載される他の疾病又は病状であり得る。
VIII.分析方法：
単独で又は他の剤、例えば本明細書に記載される誘発因子と組合して、多能性を、一次体細胞（例えば、皮膚細胞、単核血液細胞又は骨髄細胞）又は細胞系（例えば、HEK293細胞、Hela細胞、多分化能性幹細胞系、又は成熟幹細胞系）において誘発できる剤を同定するためのアッセイ方法がまた、本明細書に記載される。前記方法はまた、多能性を誘発する誘発因子の能力（例えば、多能性を誘発する効率）を高める剤を同定するための方法を包含することができる。いくつかの態様においては、アッセイ方法に使用されるべき細胞は、Tert、Nanog、Oct3/4又はSox2の後生不活性化を受けていない。
いくつかの態様においては、多能性又は多分化能性を誘発する試験剤の能力は、１又は複数のアルカリホスファターゼ（ALP）、ESマーカー遺伝子又はタンパク質マーカーの発現を誘発する試験剤の能力を決定することにより、一次スクリーンエンドポイントで評価される。多くの場合、そのような決定は、試験剤の誘発能力と、負の対照剤（例えば、対象遺伝子又はタンパク質マーカーを誘発する制限された又は存在しない能力を有する剤）とを比較することにより実施される。ほとんどの場合、試験剤の対照剤とのインキュベーションの前及び間、細胞は、サンプルを採取し、そしてそれを、従来の培養段階を伴わないでアッセイに直接使用することが可能であるが、培養される特定細胞型に対して適合された細胞培養培地、例えば本明細書に記載されるような細胞培養のためのいずれかの細胞培養培地において培養される。ある場合、試験剤インキュベーション期間の後、細胞は、本明細書に記載されるように、MC-ES培地において培養される。
スクリーニングアッセイのために適切なESマーカー遺伝子の例は、Tert、Cyp26A1, Nanog、Oct3/4又はSox2を包含するが、但しそれらだけには限定されない。マーカーの発現は、標準方法、例えば本明細書に記載される方法のいずれか、例えばqPCRにより、mRNFレベル又はタンパク質レベルを検出するか、又は定量化することにより決定され得る。他の態様においては、ESマーカー遺伝子プロモーターからの１又は複数の要素を含むレポーター構造体が、細胞と試験剤との接触の前、アッセイされるべき細胞中に導入される。プロモーター構造体を生成し、それらを細胞中に導入し、そして種々のレポーターポリペプチド活性をアッセイするための方法は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (2005), 3.16-3.17 and 9.1- 9.14に、詳細に見出され得る。
特定細胞型が従来の方法によりトランスフェクトするのに困難である場合、本明細書に記載のように、ウィルストランスダクションが、ウィルスプロモーター−レポーター構造体を導入するために使用され得る。プロモーター活性は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素活性又は蛍光）、レポーターポリペプチド発現（例えば、ELISAアッセイによる）、又はレポーターmRNA発現（例えば、蛍光ハイブリダイゼーション技法による）の性質を測定することにより定量化され得る。適切なレポーターポリペプチドは、例えばホタルルシフェラーゼ、Renillaルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、増強された緑色蛍光タンパク質）、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びホースラディシュペルオキシダーゼを包含する。
Nanog、Sox2、Oct3/4、TERT又はCyp26A1プロモーター活性化因子の誘発を検出するための典型的なプロモーターレポーター構造体は、Kuroda et al, (2005), MoI. Cell Biol, 25(6):2475-2485 (Nanogについて); Zhan et al., (2005), Cell Biochem. Biophys., 43(3):379-405 (Oct3/4 及び Sox2について);及び Tzukerman et al, (2000), MoI. Biol. Cell, 11(12):4381-4391 (hTertについて),及び Loudig et al, (2005), Biochem. J., 392(Ptl):241-248に記載される。いくつかの態様においては、アッセイされた細胞におけるALP活性の存在は、試験剤の誘発活性のための予備試験として使用される。前述のアッセイのいずれかにおけるこの結果、例えば対照剤に対してよりも試験剤に対して有意に高いレベルの活性が、試験剤が誘発活性を有する予備指示として取られる。
そのような候補誘発剤は、ESマーカー遺伝子、タンパク質マーカー、長期自己再生、Oct3/4、Sox2及びNanogプロモーターの低メチル化、奇形腫を形成する能力、及び外胚葉、中胚葉又は内胚葉系統の細胞型へのエクスビボでの分化する能力（但し、それらだけには限定されない）の発現の決定を包含する。多能性又は多分化能性を決定するために、本明細書に記載されるいずれかのアッセイにおける一次スクリーンにおける試験剤と接触される細胞を試験することにより、さらにスクリーンされ得る。
アッセイのための条件は、変化し、そして使用されるアッセイプロトコールの性質、及び使用される細胞及び剤の性質に依存する。そのようなアッセイに関しては、エンドポイントアッセイの前、細胞培養期間は、少なくとも3日〜少なくとも約40日、例えば5、6、 9、 10、 12、 14、 20、 21 、 25、 26、 27、 30、 32、 34、 36、 38日、又は少なくとも約30日〜少なくとも約40日以外の他の期間、変化することができる。さらに、ほとんどの場合、試験剤インキュベーションについての時間は、少なくとも約30分〜約40日、例えば1 時間、2 時間、 12 時間、 18 時間、 1 日、 3 日、 5 日、 7 日、 14 日、 21 日、 25 日、 30 日、 34 日、又は少なくとも約30分〜少なくとも約40日以外のいずれか他の期間である。
いくつかの態様においては、試験されるべき剤は、siRNA、例えば約19塩基対の標的遺伝子配列を含んで成り、そしてRNAインターフェレンスの標的遺伝子発現を阻害できる二本鎖RNAであるが、但しそれらだけには限定されない。例えばScherr et al, (2007), Cell Cycle, 6(4):444-449を参照のこと。いくつかの態様においては、アッセイされるべきsiRNAは、例えばMiyagishi et al, (2003), Oligonucleotides, 13(5):325- 333; 及び Huesken et al, (2005), Nat. Biotechnol, 8:995-1001に記載されるように、全ゲノムsiRNAライブラリーを包含するが但しそれらだけには限定されない。
適切な全ゲノムsiRNAライブラリー、例えば市販の整列されたsiRNAライブラリーは、Qiagen (Valencia, CA)からの"Human Whole Genome siRNA Set V4.0"; Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO)からの"Human siGENOME siRNA Library - Genome"; 及びAmbion (Austin, TX)Silencer（商標）Human Genome siRNA Libraryを包含する。siRNAを導入するための方法及び試薬は、市販の試薬、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：LipofectamineTM RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA)、TransMessenger Transfection Reagent (Qiagen, Valencia, CA)又は Dharma FECT（商標）(Dharmacon, Lafayette, CO)。例えば、Krausz (2007), MoI. Biosyst, 3(4):232-240を参照のこと。いくつかの態様においては、ウィルスRNAiライブラリーが、例えばRoot et al, (2006), Nat. Methods, 3(9):715-719に記載されるようにして使用される。
任意には、スクリーンされるべき誘発試験剤は、小分子である。試験分子は、選択される個々の小分子であり得るか、又はある場合、スクリーンされるべき小分子試験剤は、組合せライブラリー、すなわち多くの化学的“構築ブロック”を組合すことにより、化学的合成又は生物学的合成により生成される種々の化合物の収集物からである。例えば、線状組合せ化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラリーは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について、あらゆる可能な手段で、アミノ酸と呼ばれる化学構築ブロック組を組合すことにより形成される。
何百万もの化合物は、化学的構築ブロックのそのような組合せ混合を通して合成され得る。実際、理論的に、100個の相互交換できる化学的構築ブロックの合成組合せ混合が、１億個のテトラマー化合物又は100億個のペンタマー化合物をもたらす。例えば、Gallop et al, (1994), J. Med. Chem., 37(9), 1233-1251参照のこと。組合せ化学ライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業界において良く知られている。
組合せ化学ライブラリーは、例えばHobbs et al, (1993), Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 90:6909-6913に記載されるような、ダイバーソマー、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチド；Chen et al., (1994), J. Amer. Chem. Soc, 116:2661-2662に記載されるような少化合物ライブラリーの類似有機合成物；Cho, et al, (1993), Science, 261 : 1303- 1305に記載されるようなオリゴカルバメート；Campbell et al., (1994), J. Org. Chem., 59: 658-660に記載されるようなペプチジルホスホネート：及びチアゾリジノン及びメタチアザノン（アメリカ特許第5,549,974号）、ピロリジン（アメリカ特許第5,525,735号及び第5,514,134号）、ベンゾジアゼピン（アメリカ特許第5,288,514号）を含む小有機分子ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
多くの組合せライブラリー、例えばComGenex(Princeton, NJ); Asinex (Moscow, Russia); Tripos, Inc. (St. Louis, MO); ChemStar, Ltd. (Moscow, Russia); 3D Pharmaceuticals (Exton, PA); 及びMartek Biosciences (Columbia, MD)が市販されている。
ある場合、活性を誘発するためにスクリーンされるべき試験剤は、本明細書に記載される１又は複数の誘発因子（例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4又はc-Myc）、例えば本明細書に記載される１，２，３又は４個の誘発因子と組合して使用され得る。
ある場合、試験剤は、１つの誘発因子、例えばOct3/4、Sox2、Klf4又はc-Mycと組合してスクリーンされる。他の場合、試験剤は、２種の誘発因子、例えばOct3/4 及び Sox2; Oct3/4 及び Klf4; Oct3/4 及び c-Myc; Sox2 及び Klf4; Sox2 及び c-Myc;又はKlf4- 及び c-Mycと組合してスクリーンされる。いくつかの態様においては、試験剤は、３種の誘発因子、例えばOct3/4、Sox2、及び Klf4; Oct3/4、Klf4、及び c-Myc; Oct3/4、Sox2、及び c-Myc; or Sox2、 Klf4、及び c-Mycと組合してスクリーンされる。試験剤はまた、誘発因子組、例えばOct3/4、Sox2、KJf4及びc-Mycの組合せにより、多能性誘発の効率を高めるそれらの能力についてアッセイされ得る。
IX. 細胞の貯蔵：
収穫された組織、細胞、誘発された細胞、誘発された多能性細胞、誘発された多分化能性細胞、収穫された組織から分化された細胞、又は本明細書に記載される他の細胞が貯蔵され得る。従って、前記工程の間のいずれかの点からの細胞又は材料は、前記工程の後での完結又は使用のための改良のために貯蔵され得る。
貯蔵方法は、凍結保存媒体を用いてのいずれかの方法、例えば本明細書に記載される方法であり得る。いくつかの典型的な凍結保存媒体は、"Cryopreservation Medium For Primate ES Cells" (ReproCELL, Tokyo, Japan)又はmFreSRTM (StemCell Technologies, Vancouver, CA)を包含する。細胞は好ましくは、液体窒素において急速に凍結され、そして液体窒素貯蔵容器に貯蔵される。他の適切な凍結保存媒体、及び本明細書に記載される方法により生成される細胞の凍結保存/融解のための方法は、例えばアメリカ特許出願番号10/902,571号及び11/142,651号に提供される。また、Ha et al, (2005), Hum. Reprod., 20(7): 1779-1785も参照のこと。
X. 例：
次の特定の例は、単なる例示として構成されており、いかなる方法でも、本発明の開示を制限するものではない。さらなる労力を伴わないで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明のをその十分な程度まで利用できると思われる。本明細書に引用されるすべての出版物は、引用によりその全体を本明細書に組み込まれる。URL又は他のそのような識別子又はアドレスが言及される場合、そのような識別子は変化することができ、そしてインターネットでの特定の情報が行き来するが、しかし同等の情報がインターネット調査により見出され得ることが理解されている。それらに対する参照は、そのような情報の利用性及び公的な配布を示す。
例１．レトロウィルスベクターの調製：
表１におけるようにして構成される４種の遺伝子（Oct3/4-pMx、Sox2-pMx、Klf4-pMx 及び c-Myc- pMx）についてレトロウィルスベクタープラスミドを、Fugene HD (Rocheにより製造される)を用いて、パッケージング細胞系Plat-E [Experimental Hematology, 2003, 31 (1 1): 1007-1014]中に導入した。レトロウィルスベクタープラスミドの導入の約24〜48時間後、培地を、遺伝子導入される予定である細胞のために適切な培地により交換した。レトロウィルスベクターが導入されるPlat-E細胞を、４時間以上、培養した後、上清液を回収し、そして45μmの直径のフィルター（Milliporeにより製造される）に通した。４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液を、上記方法により調製した。
３種の遺伝子（Oct3/4-pMx、Sox2-pMx及びKlf4-pMx）のためのレトロウィルスベクタープラスミドを、Fugene HD (Rocheにより製造される)を用いて、パッケージング細胞、すなわちPlat-E細胞中に導入した。レトロウィルスベクター導入後の24〜48時間の間、培地は、遺伝子が導入される予定である細胞のために適切な培地により交換された。レトロウィルスが導入されるPlat-E細胞を、４時間以上、培養した後、上清液を回収し、そして45μmの直径のフィルター（Milliporeにより製造される）に通した。３種の遺伝子（Oct3/4、Sox2 及びKlf4）のレトロウィルスベクター溶液を、上記方法により調製した。
例２．アデノウィルスベクターの調製：
両栄養性レトロウィルスの使用は、実験に対して感染の有意な危険性を提供する。この危険性は、レトロウィルスが腫瘍原性タンパク質（例えば、c-myc）をコードする場合、特に関心のことである。従って、我々は、マウス受容体、すなわちマウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター１（mCAT1）を選択的に認識する自己指向性レトロウィルスベクターを利用した。我々は、mCAT1をコードする遺伝子を担持し、従って、mCAT1受容体を発現するヒト細胞の自己指向性レトロウィルスによる選択的感染を可能にするアデノウィルスベクターによりヒト細胞を感染した。
最初に、マウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター（mCAT1）遺伝子のコード領域の配列を有するcDNAを担持するアデノウィルスベクターを構成した。特に、Adeno- X Expression System 1キット (TakaraBio Clontechにより製造される)を使用した。Adeno-X Expression System1キットにおいては、TakaraBioによるキットに添付される実験方法に基づいて、mCAT1遺伝子を、pShuttleと呼ばれるベクターのマルチ−クローニング部位中にサブクローン化した。
続いて、発現カセットを、PI-Sce I部位及びI-Ceu I部位、すなわちpShuttleの発現カセットの両端上の切断部位により切除し、そして所望する遺伝子を含むDNAフラグメントを、上記キットにおけるAdeno-XウィルスDNA中のPI-Sec I部位とI-Ceu I部位との間に挿入し、これを次に、制限酵素Swa Iにより処理し、組込みが不成功であるアデノウィルスDNAを除去した。プラスミドを用いてE. コリDH5株を形質転換し、所望する遺伝子がアデノウィルスDNA中に正しく導入されたかどうかを、制限酵素処理、PCR、等により確かめた。プラスミドを多量に調製し、そしてPac I制限酵素により切断した。このようにして得られた組換えアデノウィルスDNAを用いて、遺伝子をHEK293細胞（MicroBix）中に導入し、そしてLipofectamin 2000 (Invitrogenにより製造される)を用いて、６ウェルにプレートし、そして２週間後、細胞が細胞変性効果（CPE）を示す場合、細胞を、それらが培地に存在する場合、収集した。
続いて、細胞懸濁液が凍結及び融解に３度ゆだねられた後、細胞を破壊し、細胞に存在するウィルス粒子を、液体中への開放を可能にした。このようにして調製されたウィルス懸濁液を、HEK293細胞（５×106個の細胞）の１つの100mmプラスチック培養皿に添加し、細胞を感染し、ウィルスを増殖した。さらに、ウィルスがHEK293細胞の４個の150mmプレートを用いて、多量に調製された後、ウィルスを、Adenovirus Purification キット (Clontechにより製造される)を用いて精製し、そして-80℃で凍結貯蔵した。
mCAT1アデノウィルスベクターの力価（プラーク形成単位、PFU）を、Adeno-X Rapid Titerキットを用いて決定した。24ウェルプレート上に、HEK293細胞を、５×104個の細胞/500μl/ウェルの濃度でプレートした。連続的に希釈された（10-2〜10-7）ウィルスベクター50μlを、500μlの培地と共に混合し、そして次に、それを用いて、細胞を感染した。５％CO2及び37℃での48時間の培養の後、培地を吸引し、細胞を５分間、乾燥し、そして次に、500μlの冷100％メタノールを用いて、細胞を、-20℃で10分間、静置することにより固定した。メタノールの吸引の後、ウェルを、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液500μlにより３度、洗浄した。マウス抗−ヘキソン抗体を、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液により1000倍に希釈し、そしてその250μlをウェルに添加した。
37℃で１時間、静置した後、抗体溶液を除き、そしてウェルを、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液500μlにより３度、洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ−ラベルされたラット抗−マウス免疫グロブリン抗体を、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液により500倍に希釈し、そしてその250μlをウェルに添加した。37℃で１時間、静置した後、抗体溶液を除き、そして１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液500μlにより３度、洗浄した。250μlのDAB（ジアミノベンジジン）溶液（10倍のDAB濃縮物が安定したペルオキシダーゼ緩衝液により希釈されている）を、ウェルに添加し、そして室温で10分間、静置した。DABを吸引した後、500μlのリン酸緩衝液を添加した。20倍の対物レンズを用いて、６種の視聴フィールドにおける褐色の陽性細胞の数を計数した。
標準の20倍の対物レンズの半径：0.5mm
１つの観察フィールドにおける面積：7.853×10-3cm2
ウェルの面積：2cm2
ウェルの観察フィールド：2cm2/7.853×103cm2＝254.7観察フィールド
（32/6）×254.7/（0.55×10-5）＝2.5×108ifu (感染単位)/ml 。
例３．アルカリホスファターゼ染色：
多能性幹細胞の特徴であるアルカリホスファターゼ活性を確かめるための染色を、次の態様で実施した。培養培地の除去の後、10％ホルマリン中性緩衝液をウェルに添加し、そして細胞を室温で５分間、固定した。リン酸緩衝液等による洗浄の後、アルカリホスファターゼの発色性基質、すなわち１段階NBT/BCIP（Pierceにより製造される）を添加し、そして室温で20〜30分間、反応せしめた。アルカリホスファターゼ活性を有する細胞はすべて、青紫色に染色された。
例４．定量的PCRによるコロニーの遺伝子発現の決定：
ALP−陽性コロニーを包含する個々のコロニーにおける標的遺伝子の発現を、次の態様での定量的PCRを用いて決定した。多能性又は多分化能性幹細胞の誘発により進行したコロニーを収穫し、そしてRNAを、FFPEについてのRecoverall全核酸単離キット（Ambionにより製造される）を用いて抽出した。その抽出されたRNAからcDNAを合成した後、標的遺伝子を、Taqman Preamp mastermix (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて増幅した。
定量的PCRのためのプライマーとして、Taqman遺伝子exprESsionアッセイ (Applied Biosystemsにより製造される)を使用した。次のものは、標的遺伝子の名称及び個々のプライマーの製品コードを示す。ヒトHprt: Hs99999909_ml、ヒトNanog: Hs02387400_gl、 ヒトTert: Hs00162669_ml、マウスHprt: Mm01545399_ml、マウスNanog: Ma02019550_sl。
定量的PCRのための正の対照として、次の態様により確立された間葉幹細胞から抽出されたcDNAを使用した。
ヒト骨髄由来の単核細胞（hBMMNCs(Lonzaにより製造される)、 Lot 060175 A: 女性、21歳、黒人）の１つのバイアル（2.5×107個の細胞）を、37℃の水浴において融解し、そして10mlのMSCGM培地（間葉細胞のための増殖培地）（Lonzaにより製造される）10mlに懸濁した。凍結溶液におけるDMSOを除去するために、これを300g及び4℃で７分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。
このようにして得られた細胞塊状物を10mlのMSCGM培地に再懸濁し、そして100mmのプレート上に105個の細胞/cm2の密度でプレートし、そして37℃で培養した。７日後、培地を交換した。この時点で、古い培地における懸濁された細胞を、300g及び4℃での５分間の遠心分離により集め、そして新鮮な培地と共に細胞に戻した。13日目、付着細胞が集密性になる場合、上清液を除去し、非付着性細胞をリン酸緩衝液により洗浄し、そして付着細胞を、0.05％トリプシン−EDTA溶液により分離し、そして3000個の細胞/cm2の密度でプレートした。RNAを、三次サブカルチャーの細胞から集め、そしてcDNAを合成した。
例５．生後ヒト成人骨髄細胞に存在する末分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発：
生後ヒト成人骨髄組織に存在する末分化幹細胞を含むヒト成人骨髄由来の細胞（商品名：ヒト骨髄−由来の単核細胞）から、細胞を低血清（２％）及び高血清（10％）培養条件下で確立し、そして多能性幹細胞を誘発するための実験に使用した。従って、凍結された骨髄由来の単核細胞（hBMMNCs (Lonzaにより製造される)、Lot 060809B: 女性、20歳、白人/及びhBMMNCs (Lonzaにより製造される)、Lot 060470B: 女性、20歳、黒人）の１つのバイアル（2.5×107個の細胞）をそれぞれ、37℃の水溶において融解し、そして低血清培養への使用のために、10mlのMAPC培地に懸濁した。凍結溶液におけるDMSOを除去するために、これを300g及び4℃で７分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。
このようにして得られた細胞塊状物を再懸濁し、そして10ng/mlのフィブロネクチンにより被覆された100mmのプレート上に105個の細胞/cm2の密度でプレートした。成長因子[10 ng/ml PDGF-BB (Peprotechにより製造される)、10 ng/ml EGF (Peprotechにより製造される)、10 ng/ml IGF-II (Peprotechにより製造される)]を添加した。３日後、成長因子のみを添加した。７日後、懸濁された細胞及び培地を集め（但し、付着細胞を除く）、そして300g及び４℃で５分間、遠心分離した。
上清液を除いた後、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。その細胞懸濁液を、元の10cm皿に戻し、そして成長因子をそれに添加した。10日目、付着細胞が集密性になる場合、上清液を除き、非付着性細胞を、リン酸緩衝液により洗浄し、そして付着細胞を、0.05％トリプシン−EDTA溶液による分離により集め、そして細胞バンカー（Juji Fieldにより製造される）を用いて、一次培養物を凍結貯蔵した。
同じロットのヒト骨髄由来の単核細胞を用いて、細胞を、高血清条件下で10％FBSを含むMSCGM培地（Lonzaにより製造される）により確立した。ヒト骨髄由来の単核細胞を、10mlのMSCGM培地に添加されている100mmプレートに、105個の細胞/cm2の密度でプレートし、そして37℃で培養した。7日後、懸濁された細胞及び培地を集め（但し、付着細胞を除く）、そして300g及び4℃で５分間、遠心分離し、そして上清液を除去した後、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。細胞懸濁液を元の10cm皿に戻し、そして培養を続けた。13日目、付着細胞が集密性になる場合、上清液を除き、非付着性細胞を、リン酸緩衝液により洗浄した。付着細胞を、0.05％トリプシン−EDTA溶液による分離により集め、そして細胞バンカー（Juji Fieldにより製造される）を用いて、一次培養物を凍結貯蔵した。
高血清及び低血清条件下で確立され、そして凍結貯蔵されている、ヒト骨髄由来の一次培養の１つのバイアルをそれぞれ、37℃のインキュベーターにおいて融解した。その確立のために使用される培地2mlを、それぞれ細胞に添加し、そして細胞を、６−ウェルプラスチック培養皿上に104個の細胞/cm2の密度でプレートし（ここで、それらのウェルは、20μg/cm2の濃度でマトリゲル（BD Bioscienceにより製造された）により被覆されている）、そして14時間、培養した。（二次サブカルチャー細胞）14時間後、培地を除去し、そしてウェル当たりハンクス溶液500μl中、10のm.o.i.に等しい量で例２において調製されたmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染した。
確立のために使用される培地それぞれ2mlを、個々のウェルに添加し、そして37℃で培養した。mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、個々のウェルの培地を、例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（4μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加されている）2mlにより交換し、そして37℃で14時間、培養した。ウィルス上清液を除き、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次に、MEF−ならしES培地による培地交換を、２日ごとに続けた。４種の遺伝子導入の14日後の試験に基づいて、１つの典型的なコロニーが、誘発された多能性幹細胞の特徴を示すロット060809Bの低血清条件グループにおいて見出された。前記コロニーは、周囲の細胞よりも著しく小さな細胞から構成された。多能性幹細胞−様コロニーの他に、多くのコロニーが、低血清グループ及び高血清グループの両者におて観察されたが、しかしそれらはアルカリホスファターゼにより染色されなかった。
多能性幹細胞−様コロニーを単離するために、ウェルをハンクス溶液により洗浄し、そして次にコロニーを、シリコーングリースが適用されている底にクローニング環（Iwakiにより製造される）により囲んだ。100μlのDetachment Medium For Primate ES Cells (ReproCELLにより製造される)を環に添加し、そして37℃で10〜20分間、培養した。分離されたコロニーを含む環における細胞懸濁液を、2mlのMEF−ならしES培地に添加し、そしてMEF−被覆された24ウェルプレートの１つのウェル上にプレートした。37℃での８〜14時間の培養の後、培地を交換し、そして続いて、培地交換を２日ごとに続け、そして８日後、二次サブカルチャーを行った。
培地を除き、ハンクス溶液により洗浄し、Detachment Medium For Primate ES Cells (ReproCELLにより製造される)を添加し、37℃で10分間、培養し、そして2mlの培地を添加し、反応を停止した。細胞懸濁液を、遠心分離管に移し、そして４℃及び200gで５分間、遠心分離し、上清液を除去した。細胞を、MEF−ならしES培地に再懸濁し、そしてMEF−被覆された24ウェルプレートの４ウェルにプレートした。培地交換を２日ごとに続け、そして二次サブカルチャーの７日後、細胞をアルカリホスファターゼ染色にゆだね、そしてクローン化されたコロニー由来の細胞を青紫色に染色した。
さらに、定量的PCRにより、Nanog及びTertがアルカリホスファターゼ活性−陽性多能性幹細胞のコロニーにより発現されたことが確認された。例４において確立された間葉幹細胞に比較して、Nanogの発現された量は、30倍ほど高かった。Tertの発現は前記多能性幹細胞においてのみ示され、そして間葉幹細胞においては示されなかった。図２は、４種の遺伝子の導入後、ヒト成人骨髄由来の細胞におけるNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。Oct3/4、Sox2、Klf4 及びc-Mycを、低血清条件下で、ヒト成人骨髄に由来する単核細胞から確立された細胞中に導入した。RNAを、得られるコロニーから抽出し、そしてヒトNanog及びヒトTert遺伝子の発現が、定量的PCRにより示された。
４種の遺伝子が導入されていない、線維芽細胞及び間葉幹細胞を、実験において対照として使用した。遺伝子発現の量を、発現の量がヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子の発現の量により、及び新生皮膚線維芽細胞から誘発されたアルカリホスファターゼ（ALP）−陽性コロニーにおけるHPRT遺伝子発現の量の１つとして設定することにより、標準化された。Nanog及びTertの発現が、４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）が導入され、そしてALPに対して陽性であるコロニーにおいて有意に高いことが確認された。図２に示されるように、Nanog及びTertは、４種の遺伝子の導入にかかわらず、コロニーを形成しなかった細胞においては発現されなかった。
前述から、ヒト成人骨髄由来の細胞が使用される場合、多能性幹細胞は、低血清培養グループから得られたが、しかし高血清グループからはすべてを得られなかった（Lot 060809B 及び Lot 060470B）（表２）。また、低血清条件下での培養は、未分化細胞の維持のために適切であった。
例６．ヒト新生児皮膚に存在する未分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発：
ヒト新生児組織、すなわち出生直後のヒト組織に由来する細胞（商品名：新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞、一次培養物）を用いて、ヒト新生児の皮膚に存在する未分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発が試みられた。
凍結された新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞（一次培養物、Lonzaにより製造される、Lot 5F0438）の１つのバイアルを、37℃のインキュベーターにおいて融解し、そして２％ウシ胎児血清、5μg/mlのインスリン、50μg/mlのゲンタマイシン、50ng/mlのアンホテリシン−B（FBM培地、Lonzaにより製造される）を含むMCDB202変性培地に懸濁し、12mlの細胞懸濁液を得た。2mlの個々の細胞懸濁液を、20μg/cm2の濃度で、その底がマトリゲル（BD Biosciences）により被覆されている６ウェルプラスチック培養皿上にプレートした（二次サブカルチャー細胞）。
14時間後、培地を除き、そしてウェル当たり500mlのハンクス溶液中、５のm.o.i.に等しい量での例２において調製されたmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染した。個々のウェルに、2mlのFBM培地を、それぞれ添加し、そして37℃で培養した。mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、個々のウェルの培地を例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（4μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加されている）2mlにより交換し、そして37℃で４時間、培養した。
ウイルス上清液を除き、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次に、MEF−ならしES培地による培地交換を２日ごとに続け、そして４種の遺伝子の導入の14日後、６−ウェルプレートの１つのウェルを、アルカリホスファターゼ染色にゆだねた。結果として、６個の多能性幹細胞−様アルカリホスファターゼ−陽性コロニーを得た。アルカリホスファターゼ−陽性コロニーは、新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞よりも著しく小さな細胞から構成された。
続いて、定量的PCRにより、Nanog及びTertがアルカリホスファターゼ活性−陽性多能性幹細胞のコロニーにより発現されたことが確認された。図３は、４種の遺伝子の導入に続いて、新生児線維芽細胞においてNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。Oct3/4、 Sox2、Klf4 及びc-Mycを、新生児皮膚由来の一次培養線維芽細胞中に導入し；RNAを得られたコロニーから抽出し；そしてヒトNanog及びヒトTert遺伝子の発現される量を、定量的PCRにより決定した。４種の遺伝子が導入されていない、親線維芽細胞及び間葉幹細胞を、実験において対照として使用した。遺伝子発現を、図２に概略されるのと同じ方法を用いて標準化した。
Nanog及びTertの発現が、４種の遺伝子が導入され、そしてALPに対して陽性であるコロニーにおいて有意に高かったことが確認された。図３に示されるように、例５における高血清（10％）培養条件下で確立された間葉幹細胞に比較される場合、４種の遺伝子の導入の前新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞はNanogを発現せず、ところが、４種の遺伝子の導入の後の細胞の場合、コロニーを形成しない細胞においては９倍ほど、及びアルカリホスファターゼ活性−陽性コロニーにおいては18倍ほどのNanogの発現が観察された（図３）。他方では、Tertの発現はアルカリホスファターゼ活性−陽性コロニーにおいてのみ示された。これから、多能性幹細胞は、アルカリホスファターゼ活性及びNanog−陽性及びTert−陽性の特徴により定義され得る。また、新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞は多能性幹細胞を誘発する比較的高い効率を有し、そして４種の遺伝子の導入によりNanogを発現できる細胞であることが確認された。
多能性幹細胞のコロニーを、次の態様で単離した。遺伝子導入の17日後、特徴的形状を有する６つのコロニーを、残るウェルから選択した。ハンクス溶液によりウェルを洗浄した後、コロニーを、クローニング環（Iwakiにより製造されている）（その底は、シリコーングリースが適用されている）により囲んだ。100μlのDetachment Medium For Primate ES Cells (ReproCELLにより製造される)を、前記環に添加し、そして37℃で20分間、培養した。分離されたコロニーを含む環における細胞緩衝液を、2mlのMEF−ならしES培地に添加し、そしてMEF−被覆された24ウェルプレートの１つのウェルにプレートした。37℃で14時間の培養の後、培地を交換し、そして続いて、培地交換を２日ごとに続け、そして８日後、二次サブカルチャーを行った。培地を除き、細胞をハンクス溶液により洗浄し、Detachment Medium For Primate ES Cellsを添加し、そして37℃で10分間、培養し、そして2mlの培地を添加し、反応を停止した。
細胞懸濁液を、遠心分離管に移し、そして4℃及び200gで５分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。細胞をMEF−ならしES培地に再懸濁し、そしてMEF−被覆された24ウェルプレートの４個のウェル上にプレートした。下記サブカルチャー方法での二次サブカルチャーの７日後、細胞を、20μg/cm2の濃度で、その底がマトリゲルにより被覆されている60mmのプラスチック培養皿上にプレートした。さらに８日後（４種の遺伝子の導入の37日後）、三次サブカルチャーを行い、そして２つのマトリゲル−被覆された60mmのプラスチック培養皿上にプレートし、そしてその一部をアルカリホスファターゼ染色及びRNA抽出に使用した。その結果は、クローン化されたコロニーに由来する細胞が、アルカリホスファターゼ活性−陽性であり、そしてNanog及びTertを高率で発現することを確認し、それにより、それらが多能性幹細胞であることを保証する。
誘発された多能性幹細胞を、維持及び増殖のために５〜７日ごとにサブカルチャーした。サブカルチャーが行われるプラスチック培養皿から、培地を除き、細胞をハンクス溶液により洗浄し、ジスパーゼ又はDetachment Medium For Primate ES Cellsを添加し、そして37℃で５〜10分間、培養した。半分以上のコロニーを分離した場合、ES培地を添加し、反応を停止し、そして細胞懸濁液を遠心分離管に移した。コロニーが管の底上に沈殿した場合、上清液を除去し、そしてES培地を懸濁のために再び添加した。コロニーサイズを試験した後、いずれかの非常に大きなコロニーを、ゆっくりピペットで取ることにより、適切なサイズに分けた。おおよそにサイズ分けされたコロニーを、サブカルチャーの前よりも約３〜６倍大きな基本的面積を有する、マトリゲル被覆されたプラスチック培養皿上にプレートした。
表２に示されるように、上記ロット5F0438以外のロット5F0474における新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞が、多能性幹細胞の好ましい誘発を示した。例５への比較から、若い個人に由来する細胞又は培養時間が短い細胞が多能性幹細胞の誘発のために適切であると思われた。
上記結果から、末分化細胞を含むヒト生後組織であるヒト新生児組織に由来する細胞が
２％血清を含む培養培地において二次サブカルチャーにゆだねられ、多能性幹細胞を誘発することが可能であった。
例７．ヒト成人皮膚に存在する未分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発：
次に、ヒト成人皮膚に存在する未分化幹細胞を含むヒト成人組織由来の細胞（商品名：Adult Normal Human Skin Fibroblasts、一次培養物）を用いて、本発明の多能性幹細胞の誘発を行った。
凍結された成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（一次培養物、Lonzaにより製造される、ロット6F3535：28歳、女性、白人、ロット6F4026：39歳、女性、白人）の１つのバイアルをそれぞれ、37℃のインキュベーターにおいて融解し、FBM培地に懸濁し、そして12mlの細胞懸濁液を、それぞれ得た。細胞懸濁液それぞれ2mlを、その底がマトリゲルに被覆されている６−ウエルプラスチック培養皿上に、20μg/cm2の濃度でプレートした（二次サブカルチャー細胞）。
14時間後、培地を除き、そしてウェル当たり500μlのハンクス溶液中、５のm.o.i.に等しい量での例２において調製されたmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染せしめた。個々のウェルに、2mlのFBM培地を添加し、そして37℃で培養した。mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、個々のウェルの培地を、例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4 及びc-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（4μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加されている）2mlにより交換し、そして37℃で４時間、培養した。ウィルス上清液を除き、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次にMEF−ならしES培地による培地交換を、２日ごとに続け、そして４種の遺伝子の導入の13日後、アルカリホスファターゼ染色を行った。結果として、ウェル当たり２つの多能性幹細胞−様アルカリホスファターゼ−陽性コロニーが、ロット6F3535から得られ、ところがアルカリホスファターゼ−陽性コロニーはロット6F4242から得られなかった（表２）。
例６への比較から、皮膚線維芽細胞間の新生児由来の細胞は、多能性幹細胞誘発の高い効率を有した。また、成人正常ヒト皮膚線維芽細胞間で、若いドナー由来の細胞は、より高い形質転換効率を有した。前述から、多能性幹細胞の誘発の効率が年齢−依存性態様で低下することが示された。
例８．三次サブカルチャーの新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いての試験：
凍結された新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞（一次培養物、Lonzaにより製造される、ロット5F0439）の１つのバイアルを、37℃のインキュベーターにおいて融解し、FBM培地に懸濁し、そして２つの100mmプラスチックの培養皿上にプレートした（二次サブカルチャー）。70〜90％の集密性が得られるまで、６日間、培養した後、細胞を、0.025％トリプシン−EDTA溶液（Lonzaにより製造される）を用いて分離し、４℃及び200gで５分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。集められた二次サブカルチャーされた細胞を、細胞バンカーを用いて凍結貯蔵した。
凍結された二次サブカルチャー細胞を、37℃のインキュベーターにおいて融解し、12mlのFBM培地に懸濁し、4℃及び200gで５分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。細胞を懸濁し、そしてその底が20μg/cm2の濃度でマトリゲルにより被覆された100mmのプラスチックの培養皿上に104個の細胞/cm2の密度でプレートした（三次サブカルチャー）。14時間後、培地を除去し、そして2mlのハンクス溶液中、5のm.o.i.に等しい量での例２において調製されたmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染せしめた。個々のウェルに、10mlのFBM培地を添加し、そして37℃で培養した。
mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、培地を除き、そして例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4、 Sox2、Klf4及び c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（4μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加された）10mlにより交換し、そして37℃で４時間、培養した。ウィルス上清液を除き、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次にMEF−ならしES培地による培地交換を２日ごとに続け、そして４種の遺伝子の導入の14日後、アルカリホスファターゼ染色を行った。結果として５種の多能性幹細胞−様アルカリホスファターゼ−陽性コロニーを得た。底の面積に基づいて計算することにより、これは、６ウェルプレートのウェル当たり0.83コロニーが得られたことを示す（表２）。
例６への比較から、多能性幹細胞の誘発の効率が延長された培養期間と共に低下することが示された。
例９．臍帯に存在する未分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（１）：
ヒト臍帯、すなわち誕生直後のヒト組織由来の細胞（商品名：正常ヒト臍帯静脈内皮細胞、一次培養物）を用いて、臍帯に存在する未分化幹細胞からの本発明のヒト多能性幹細胞の誘発が試みられた。
凍結された正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（一次培養物、Lonzaにより製造される）の１つのバイアルを、37℃のインキュベーターにおいて融解し、そしてLonzaにより製造される内皮細胞培地キット−２（２％血清）（この後、EBM−２として言及される）に懸濁し、12mlの細胞懸濁液を得た。約105個の細胞/2ml/ウェルでの個々の細胞懸濁液を、その底が20μg/cm2の濃度でマトリゲルにより被覆されている、６−ウェルプラスチック培養皿にプレートした（二次サブカルチャー）。６時間後、培地を除き、そして、ウェル当たり500μlのハンクス溶液中、５のm.o.i.に等しい量での例２において調製されたmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染せしめた。
それぞれ2.5mlのEBM-2培地を個々のウェルに添加し、そして37℃で培養した。mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、個々のウェルの培地を、例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（5μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加されている）それぞれ2mlにより交換し、そして37℃で４時間、培養した。ウィルス上清液を除去し、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次に、MEF−ならしES培地による培地交換を２日ごとに続けた。４種の遺伝子の導入の12日後、コロニーが確認された。
４種の遺伝子の導入の13日後、誘発されたコロニーを、アルカリホスファターゼ活性により染色した。
上記結果から、未分化細胞を含む、誕生の直後のヒト組織であるヒト臍帯に由来する細胞が２％血清を含む培養培地における二次サブカルチャーにゆだねられる場合、多能性幹細胞を誘発することが可能であった。
例10．臍帯に存在する未分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（２）：
下記のようにして、ヒト臍帯、すなわち誕生直後のヒト組織由来の細胞（商品名：正常ヒト臍帯動脈平滑筋細胞、三次サブカルチャー）を用いて、臍帯に存在する未分化幹細胞からの本発明のヒト多能性幹細胞の誘発が試みられた。
凍結された正常ヒト臍帯動脈平滑筋細胞（三次培養物、Lonzaにより製造される）の１つのバイアルを、37℃のインキュベーターにおいて融解し、そしてLonzaにより製造される平滑筋細胞培地キット−２（５％血清）（この後、SmGM−２として言及される）に懸濁し、12mlの細胞懸濁液を得た。約105個の細胞/2ml/ウェルでの個々の細胞懸濁液を、その底が20μg/cm2の濃度でマトリゲル(Becton Dickinsonにより製造される)により被覆されている、６−ウェルプラスチック培養皿(Becton Dickinsonにより製造される)にプレートした（四次サブカルチャー）。１日後、培地を除き、そして、ウェル当たり500μlのハンクス溶液中、1.25〜５のm.o.i.に等しい量でのmCAT1アデノウィルスベクターを添加し、そして室温で30分間、感染せしめた。それぞれ2.5mlのSmGM-2培地を個々のウェルに添加し、そして37℃で培養した。
mCAT-1アデノウィルスベクターの導入の48時間後、個々のウェルの培地を、例１において調製された４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）のレトロウィルスベクター溶液（5μg/mlの最終濃度でのポリブレンが添加されている）それぞれ2mlにより交換し、そして37℃で４時間、培養した。ウィルス上清液を除去し、そしてMEF−ならしES培地により交換した。次に、MEF−ならしES培地による培地交換を２日ごとに続けた。４種の遺伝子の導入の13日後、コロニーが確認された。しかしながら、誘発されたコロニーは、アルカリホスファターゼ活性により染色されなかった。
上記結果から、誕生の直後、ヒト組織であるヒト臍帯に由来する細胞は、臍帯に存在する未分化細胞を含むが、細胞が５％血清を含む培養培地における四次サブカルチャーにゆだねられる場合、多能性幹細胞の誘発がより興味あるものであることが示された。
例11．マウス生後組織に存在する未分化幹細胞からのマウス多能性幹細胞の誘発：
マウス骨髄由来の細胞、すなわちマウス生後組織を用いて、マウス生後組織に存在する未分化幹細胞からの本発明の多能性幹細胞の誘発を試みた。
大腿骨及び頸骨を、生後４〜６週のマウス（c57BL/6N系統、生後４週、雌）から、いずれの他の組織を伴わないで注意して抽出した。集められた骨を70％エタノールに短時間ソーキングすることにより、骨の外側に係合した細胞を殺して骨髄以外の細胞の汚染を防止した。エタノール処理の後、骨を、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) (SIGMA)にすぐに移し、骨髄の内部の細胞の効果を妨げた。個々の骨の外側をKimwipeによりぬぐい、結合組織を除去した。すべての処理された骨を、IMDMを含む乳鉢に移し、そして乳棒により押しつぶした。IMDMにより数日、洗浄した後、骨をハサミにより断片に切断した。IMDMによる数回のさらなる洗浄の後、骨断片を遠心分離管に移した。
IMDMの除去の後、５匹のマウスの骨断片当たり0.2％コラゲナーゼI（SIGMAにより製造される）を含むIMDM10mlを添加し、そして37℃で１時間、振盪した。振盪の後、その懸濁液をPipetmanを用いて数度、撹拌し、そして次に、上清液をもう１つの管に移し、これに、等量の冷10％FBS含有IMDMを添加し、酵素反応を停止した。酵素処理の後、骨断片を、冷10％FBS含有IMDMを含む乳鉢に移し、そして乳棒により再び押しつぶし、そして数回の撹拌の後、上清液を集めた。このようにして集められた細胞懸濁液を、直径70μm及び40μmのナイロンメッシュに連続的に通すことにより濾過した。細胞懸濁液を４℃及び600gで７分間、遠心分離し、そしてマウス深部骨髄に由来する細胞を集めた。
マウス深部骨髄に由来する細胞を、MAPC培地に懸濁し、そして105個の細胞/cm2の密度でプレートした。細胞プレートに関して、10ng/mlのフィブロネクチン（Becton Dickinson）を含むリン酸緩衝液により前もって被覆された皿を使用した。培地に、成長因子［10 ng/ml PDGF-BB (Peprotechにより製造される)、10 ng/ml EGF (Peprotechにより製造される)、1000 単位/ml LIF (Chemiconにより製造される)］を、使用の時点で単に添加した。プレート化の３日後、成長因子を、培地を交換しないで添加した。6日後、非付着性細胞をリン酸緩衝液により洗浄し、そして付着細胞を、0.05％トリプシン−EDTA溶液（Invitrogenにより製造される）により分離して集め、そして細胞バンカー（Juji Fieldにより製造される）を用いて細胞を一次培養物のように、凍結貯蔵した。
凍結貯蔵された一次培養細胞を、37℃の水浴において融解し、そして２％FBSを含む培地であるMAPC培地10mlに懸濁した。凍結溶液におけるDMSOを除去するために、それを4℃及び300gで７分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。得られる細胞塊状物を再懸濁し、そして0.1％ゼラチン/リン酸緩衝液によりゼラチン被覆された底を有する12ウェルプラスチックプレート上に2.5×103個の細胞/cm2の密度でプレートし、そしてそれぞれ2mlのMAPC培地を添加した（二次サブカルチャー）。
８〜14時間後、培地を除き、そして例１におけるようにして調製されたそれぞれの2mlの４種の遺伝子レトロウィルスベクター溶液をそれに添加し、そして37℃で４〜14時間、培養した。次に、ウィルス溶液を除去し、そしてマウスES培地［0.3％の最終濃度のFBS（Invitrogenにより製造される）、1000単位/mlのLIF（Chemiconにより製造される）及び0.1mMの２−メルカプトエタノールが添加されているES培地］により交換した。次に、マウスES培地による培地交換を３日ごとに続け、そして４種の遺伝子の導入の５〜７日後、前記多能性幹細胞は、マウスES細胞−様小細胞を含んで成るコロニーを形成した。誘発された多能性幹細胞のコロニーをアルカリホスファターゼ活性により青紫色に染色した。
12ウェルプレートの残りのウェルから、マウス多能性幹細胞をサブカルチャーし、そしてサブカルチャーをゼラチン被覆された100mmプレートに続けた。７番目のサブカルチャー細胞から、RNAを、RNeasyミニキット（QIAGENにより製造される）を用いて抽出し、そしてcDNAを合成した。cDNAを用いて、定量化PCRを行い、Nanogの発現を確認した。
７番目のサブカルチャーのマウス多能性幹細胞を、３×105個の細胞/マウスで３匹の同系C57BL/6Nマウスの背部に皮下移植し、そして38日後、形成される奇形腫を抽出した。奇形腫はすべての３匹のマウスにおいて形成された。抽出された奇形腫から、スライスを調製し、そして３種の胚層への分化能力を、免疫学的染色及び組織学的染色（HE染色、アルシアンブルー染色）により分析した。結果として、外胚葉系としてのMAP2−陽性細胞（神経系）及びGFAP−陽性細胞（神経系）、中胚葉系としての骨格筋細胞（筋細胞）及び軟骨組織、及び内胚葉系としての腸管組織が観察された。
マウス多能性幹細胞を維持し、そして増殖するために、それらを３〜４日ごとにサブカルチャーした。培地を、サブカルチャーが行われるプラスチック培養皿から除去し、リン酸緩衝液により洗浄し、0.05％トリプシン−EDTA溶液を添加し、そして37℃で５分間、培養した。細胞が分離した場合、ES培地を添加し、反応を停止し、そして細胞懸濁液を遠心分離管に移した。200ｇでの５分間の遠心分離の後、上清液を除き、そしてマウスES培地に沈殿物を懸濁した後、細胞を104個の細胞/cm2の密度でゼラチン被覆されたプレートにプレートした。同じサブカルチャー方法により低血清下で培養されたマウス骨髄に由来する細胞から誘発された多能性幹細胞を、長時間、培養した。
上記のように、多能性幹細胞を、低血清条件下で確立された生後マウス骨髄由来の細胞から誘発した。
例12．３種の遺伝子の導入及びヒストンデアセチラーゼインヒビター処理によるマウス多能性幹細胞の誘発：
マウス生後組織であるマウス骨髄由来の細胞を用いて、多能性幹細胞の誘発を、３種の遺伝子の導入及びヒストンデアセチラーゼインヒビター処理により実施した。
例11に類似する態様で調製した後、凍結貯蔵された未分化幹細胞を含むマウス骨髄由来の一次培養細胞を、0.1％、ゼラチン/リン酸緩衝液によりゼラチン被覆された底を有する24−ウェルプラスチックプレート（Becton Dickinsonにより製造される）上へ５×103個の細胞/cm2の密度でプレートし、そしてそれぞれ2mlのMAPC培地を添加した。
８時間後、培地を除き、例１におけるようにして調製された、3種の遺伝子（ヒトOct3/4、Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクター溶液それぞれ2mlを添加し、そしてさらに、1又は0.1μMの最終濃度でのMS−275、すなわちヒストンデアセチラーゼインヒビターの添加の後、それらを37℃で14時間、培養した。次に、ウィルス溶液の除去の後、１又は0.1μMの最終濃度でのMS−275、すなわちヒストンデアセチラーゼインヒビターを含むMAPC培地それぞれ2mlを添加した。３日後、培地を、マウスES培地［0.3％の最終濃度のFBS（Invitrogenにより製造される）、1000単位/mlのLIF（Chemiconにより製造される）及び0.1mMの２−メルカプトエタノールが使用の時点でES培地に添加された］により交換した。
マウスES培地による培地交換を、２〜３日ごとに続けた。３種の遺伝子（ヒトOct3/4, Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクターの導入の12日後、細胞を、24ウェルプラスチックプレートの個々のウィルスから、６ウェルプラスチックプレートの個々のウェルにサブカルチャーした。その一部をまた、24ウェルプラスチックプレートにおいて培養した。前記３種の遺伝子導入及びMS−275処理の15日後、多能性幹細胞は、マウスES細胞−様小細胞から構成されるコロニーを形成した。前記多能性幹細胞のコロニーは、アルカリホスファターゼ活性により青紫色に染色された。
次に、Nanog遺伝子の発現される量を、定量的PCRにより確認し、そしてアルカリホスファターゼ活性を有する多能性幹細胞のコロニー中のマウスNanogの発現を確認した（図４）。図４は、３種の遺伝子の導入及びヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビターによる処理に続くマウス成熟骨髄由来の細胞におけるNanog及びTert遺伝子の相対的発現を示す。３種の遺伝子（Oct3/4, Sox2及びKlf4）を、低血清条件下で確立されたマウス骨髄由来の細胞中に導入した。細胞をまた、MS−275（0.1又は1.0μM）、すなわちHDACインヒビターにより処理した。RNAを得られるコロニーから抽出し、そしてNanog発現の量を、定量的PCRにより決定した。３種の遺伝子が導入され、そしてヒストンデアセチラーゼインヒビターにより処理された細胞から、ALP−陽性細胞グループ（コロニー）が形成され、そしてそれらのコロニーにおけるNanogの発現がALP−陰性コロニーよりも有意に高いことが確認された。図においては、W1、W2、W3、W4、W5及びW6は、例12において使用される６ウェルプレートの個々のウェルの名称を表す。
前記３種の遺伝子導入及びMS−275処理の18日後、多能性幹細胞を、６ウェルプレートの個々のウェルから、ゼラチン被覆された100mmプレートにサブカルチャーした。サブカルチャーを同様に続けた。
３種の遺伝子導入及びMS−275処理の29日後、マウス多能性幹細胞を、２×107個の細胞/マウスで同系C57BL/6Nマウスの背部に皮下移植し、そして34日後、形成される奇形腫を抽出した。抽出された奇形腫から、スライスを調製し、そして３種の胚層への分化能力を、免疫学的染色及び組織学的染色（HE染色、アルシアンブルー染色）により分析した。結果として、外胚葉系としてのGFAP−陽性細胞（神経系）及びケラチン生成細胞（皮膚細胞）、中胚葉系としての平滑筋アクチン−陽性細胞（平滑筋細胞）、骨組織及び軟骨組織、及び内胚葉系としての腸管組織（MUC−1に対して陽性の内胚葉上皮）が観察された。
例13．３種の遺伝子の導入によるマウス多能性幹細胞の誘発：
次に、マウス生後組織であるマウス骨髄に由来する細胞を用いて、マウス多能性幹細胞の誘発を、３種の遺伝子の導入により実施した。
例11における調製の後、凍結貯蔵された末分化幹細胞を含むマウス骨髄由来の一次培養細胞を、0.1％ゼラチン/リン酸緩衝溶液によりゼラチン被覆された底を有する24ウェルプラスチックプレート（Becton Dickinsonにより製造される）上に１×104個の細胞/cm2の密度でプレートし、そしてそれぞれ2mlのMAPC培地を添加した。
２日後、培地を除き、例１におけるようにして調製された、3種の遺伝子（ヒトOct3/4、Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクター溶液それぞれ2mlを添加し、そして37℃で１日の培養の後、そのウィルス溶液を除き、そしてそれぞれ2mlのMAPC培地を添加した。３日後、培地を、マウスES培地［0.3％の最終濃度のFBS（Invitrogenにより製造される）、1000単位/mlのLIF（Chemiconにより製造される）及び0.1mMの２−メルカプトエタノールが使用の時点でES培地に添加された］により交換した。次に、マウスES培地による培地交換を、２〜３日ごとに続けた。３種の遺伝子（ヒトOct3/4, Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクターの導入の11日後、細胞を、24ウェルプラスチックプレートの個々のウェルから、６ウェルプラスチックプレートの個々のウェルにサブカルチャーした。
次に、マウスES培地による培地交換を、２〜３日ごとに続けた。前記３種の遺伝子導入の19日後、多能性幹細胞は、マウスES細胞−様小細胞から構成されるコロニーを形成した。アルカリホスファターゼ活性を確認するために、培地を除き、そして次に、10％ホルマリン中性緩衝溶液をウェルに添加し、そして室温で5分間、固定した。リン酸緩衝液、等による洗浄の後、アルカリホスファターゼの発色性基質を含んで成る１段階NBT/BCIP溶液（Pierceにより製造される）を添加し、そして室温で20〜30分間、反応せしめた。前記多能性幹細胞のコロニーを、アルカリホスファターゼ活性により青紫色に染色した。
次に、Nanog遺伝子の発現される量を、定量的PCRにより確認し、そしてアルカリホスファターゼ活性を有する多能性幹細胞のコロニーのマウスNanogの発現を確認した。
マウス生後組織であるマウス骨髄由来の細胞を用いて、多能性幹細胞の誘発が、３種の遺伝子の導入により行われた。
例11において調製した後、凍結貯蔵された未分化肝細胞を含むマウス骨髄由来の一次培養細胞を、底が0.1％ゼラチン/リン酸緩衝溶液によりゼラチン被覆されている、６−ウェルプラスチックプレート（Becton Dickinsonにより製造される）上に、１×104個の細胞/cm2の密度でプレートし、そしてMAPC培地を2mlの部分で添加した。
２日後、培地を除き、例１におけるようにして調製された３種の遺伝子（ヒトOct3/4, Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクター溶液を2mlの部分で添加し、そして37℃で１日間の培養の後、ウィルス溶液を除き、そしてMAPC培地を2mlの部分で添加した。３日後、培地を、マウスES培地［0.3％の最終濃度のFBS（Invitrogenにより製造される）、1000単位/mlのLIF（Chemiconにより製造される）及び0.1mMの２−メルカプトエタノールが使用の時点でES培地に添加された］により交換した。マウスES培地による培地交換を２〜３日ごとに続けた。３種の遺伝子（ヒトOct3/f, Sox2及びKlf4）レトロウィルスベクターの導入の９日後、細胞を、６ウェルプラスチックプレートの個々のウェルから10cmプラスチック皿の個々のウェルにサブカルチャーした。
マウスES培地による培地交換を、２〜３日ごとに続けた。前記３種の遺伝子導入の７日後、多能性幹細胞は、マウスES細胞−様小細胞から構成されるコロニーを形成した。アルカリホスファターゼ活性を確認するために、培地を除き、そして次に、10％ホルマリン中性緩衝溶液をウェルに添加し、そして室温で5分間、固定した。リン酸緩衝液、等による洗浄の後、１段階NBT/BCIP溶液（Pierceにより製造される）、アルカリホスファターゼの発色原基質を添加し、そして室温で20〜30分間、反応せしめた。前記多能性幹細胞のコロニーを、アルカリホスファターゼ活性により青紫色に染色した。
次に、Nanog遺伝子の発現される量を、定量的PCRにより確認し、そしてアルカリホスファターゼ活性を有する多能性幹細胞のコロニーのマウスNanogの発現を確認した。
前記３種の遺伝子導入の49日後、マウス多能性幹細胞を、２×107個の細胞/マウスで同系C57BL/6Nマウスの背部上に皮下移植し、そして13及び17日後、形成される奇形腫を抽出した。スライスを抽出された奇形腫から調製し、そして３種の胚層への分化能を、免疫学的及び組織学的染色（HE染色、アルシアンブルー染色）により分析した。結果として、外胚葉系としてのGFAP−陽性細胞（神経系）及びケラチン生成細胞、中胚葉系としての平滑筋アクチン−陽性細胞（平滑筋細胞）、骨組織及び軟骨組織、及び内胚葉系としての腸管組織（MUC−１に対して陽性の内胚葉上皮）が観察された。
同様に、前記３種の遺伝子の導入の後、FACSAriaにより、GFP及びSSEA−１陽性に基づいて単一分類されたマウス多能性幹細胞を、２×107個の細胞/マウスで同系C57BL/6Nマウスの背部に皮下移植し、そして13及び14日後、形成される奇形腫を抽出した。スライスを抽出された奇形腫から調製し、そして３種胚層への分化能力を、免疫学的及び組織学的染色、（HE染色、アルシアンブルー染色）により分析した。結果として、外胚葉系としてGFAP、Nestin又はNeurofilamentに対して陽性の細胞由来の神経管、及び中胚葉系としての軟骨組織、及び内胚葉系としての陽管組織（MUC−１及びα−フェトプロテインに対して陽性の内胚葉上皮）が観察された。
上記結果から、多能幹細胞を、生後組織に存在する未分化幹細胞におけるOct3/4、Sox2及びKlf4の３種の遺伝子の個々の誘発された発現により得た。多能性幹細胞は、インビトロでの長期自己再生能力を示し、そして発現されたES細胞マーカー、Nanog発現及びアルカリホスファターゼ活性、及びすべての３種の胚層（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）からの組織誘導体の分化能力を示した。
例14．ヒト誘発された多能性幹細胞の長期拡張及び特徴づけ：
iPS-1-8と呼ばれる、例６において新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ロット＃5F0438）から生成されたヒト誘発された多能性幹（iPS）細胞系をさらに、例６に記載のようにして、クローニングシリンダー及び0.25％トリプシン−EDTAによりサブクローン化した。ヒトiPS-1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8及び1-9と呼ばれる９種のサブクローンを得た。ヒトiPS-1-8クローンと呼ばれる９種のサブクローンの１つを、マトリゲル（BD Bioscience）−被覆された培養皿上で、0.1mMの２−メルカプトエタノール及び10ng/mlのbFGFにより補充されたヒトES培地、又はmTeSR1定義の培地（Stem cell Technologies）において、MEFフィーダー細胞上で都合よく拡張した。
培地を毎日、ヒトiPS−１−８クローン培養のために交換し、そして通常、５〜20μMのY−27632（Calbiochem）により処理し、継代工程により誘発される細胞アポプトーシスを回避した。培養を続けるための継代のために、ヒト誘発された多能性幹細胞をハンクス溶液により洗浄し、0.25％トリプシン−EDTA（Gibco）において37℃で３分間インキュベートし、そして次に、培養培地を添加し、トリプシン活性を停止した。ヒト誘発された多能性幹細胞を、300xg及び室温又は4℃で5分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。沈殿したヒト誘発された多能性幹細胞を、培養培地中に再懸濁した。多能性幹細胞を通常１：４〜１：６の分割比を用いて新規培養皿中に分けた。ヒトiPS-1-8クローンを、ES細胞のための細胞凍結溶液を用いて、その製造業者のマニュアルに従って凍結した。
ヒトiPS-1-8クローンは、マイトマイシン−C処理されたマウス胚線維芽細胞（MEF）上で培養される場合、小さく、丸型で且つコンパクトな細胞から成る一定の端を有する典型的なヒトES細胞コロニーとは形態学的に区別できなかった（図５）。図５は、ヒトiPSクローン１−８の特徴化を示す。その親線維芽細胞（ロット5F0438）の形態選択学がパネルaに示され；ネズミ胚線維細胞（MEF）フィーダー細胞上で培養されたヒトiPSクローン1-8細胞の形態学がパネルｂに示され；mTeSR1培地におけるヒトiPSクローン1-8細胞の形態学がパネルｃに示され；mTeSR1培地におけるクローン2-4細胞がパネルｄに示され；そしてmTeSR1培地におけるクローン3-2細胞がパネルｅに示される。クローン1-8の成長曲線がパネルｆ及びｇに示される。矢印は、試験の日付を示す。四角は、細胞増殖速度を評価するために細胞数を計数するための期間を示す。パネルｈは、101日でiPSクローン１−８由来の細胞の正常な核型を示す多色核型イメージである。
ヒトiPS-1-8クローンは、mTeSR1培地において活性的に増殖した。mTeSR1培地において培養される細胞由来のヒト：iPS-1-8クローンは、ヒトiPS-1-8mTeSR細胞と呼ばれた。ヒトiPS-1-8クローンは、30回以上、継代され得、そして４種の因子の感染の後、半年以上、培養され得る（図5ｆ,g）。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞は、液体窒素において貯蔵され得、そして５〜20μMのY-27632の存在下でmTeSR培地において再培養され得た。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞の集団二倍化時間は、４種の因子の感染の後、123〜143日に対応する、継代19〜26間で分析される場合、約48.5時間であった。
長期培養されたヒトiPS-1-8クローン（1-8mTeSR）の核型分析を、ギームザ染色及び多色−FISH分析を用いて実施した。ヒトiPS細胞を、0.02μg/mlのコレセミドにより２時間、前処理し、続いて0.075MのKClと共に20分間インキュベートし、そして次に、Carnoy固定剤により固定した。多色−FISH分析に関しては、細胞を、多色FISHプローブ（Cambio）によりハイブリダイズし、そしてDMRA2蛍光顕微鏡（Leica）下で分析した。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞は、いずれかの染色体トランスロケーション又は欠失も伴わないで、mTeSR(68%)下での長期培養の後、正常な核型（46XY）を主に維持した（図5h、表３）。
アルカリホスファターゼ染色に関しては、細胞を10％ホルマリン中性緩衝溶液（Wako）により室温で５分間、固定し、PBSにより洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ基質１段階NBT/BCIP(Pierce)と共に室温で20〜30分間インキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を有する細胞を、青紫色に染色した。免疫細胞化学に関しては、培養された細胞を10％ホルムアルデヒドにより10分間、固定し、そして0.1％ゼラチン/PBSにより室温で１時間、ブロックした。
細胞を、SSEA-3 (MC-631 ; Chemicon)、SSEA-4 (MC813-70; Chemicon) TRA-1-60 (abcam)、TRA-1 -81 (abcam)、 CD9 (M-Ll3; R&D systems)、CD24 (ALB9; abcam)、CD90 (5E10; BD bioscience)又は Nanog (R&D systems)に対する一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。Nanog染色に関しては、細胞を、ブロッキングの前、0.1％Triton X−100/PBSにより透過した。細胞をPBSにより３度、洗浄し、そして次に、AlexaFluor 488−接合二次抗体（Melecular Probes）及びHoechst 33258と共に室温で１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、蛍光をAxiovert 200M顕微鏡（Carl Zeiss）により検出した。
ヒトiPS-1-8mTeSR細胞は、アルカリホスファターゼ（この後、“ALP”として言及される）活性、及び炭水化物抗原SSEA-3及びSSEA-4、硫酸ケラチン抗体TRA-1-60及びTRA-1-8、及びタンパク質抗原CD9、CD24、Thy-1（CD90）染色に対して陽性であった（図６）。
図６は、ヒトiPSクローン1−8における転写因子、細胞表面抗原及びALP活性の特徴づけを示す。ヒトiPS細胞（クローン1−8）を、Nanog (パネルa)、SSEA-3 (パネルb)、 SSEA-4 (パネルc)、TRA-1 -60 (パネルd)、TRA-1 -81 (パネルe)、CD9 (パネルf)、CD24 (パネル g)、 Thy- 1 (CD90とも呼ばれる) (パネルh)のために染色した。緑色蛍光染色は、ヒトiPSクローン1−8がそれらの表面抗原のすべてを発現することを示す。ALP染色は、iPSクローン1−8がALP陽性であることを示す。矢印は、緑色蛍光染色の領域を示す。
全RNAを、RNeasy (Qiagen)を用いることにより、遺伝子トランスダクションの17日後に得られる、ヒトiPS-1-8クローン、その親線維芽細胞及び粗線維芽細胞から単離した。cDNAをSuperScript III （Invitrogen）により合成した。遺伝子発現を、Extaq（Takara）を用いて、PCRにより検出した。プライマーの配列は、表４に記載される。“エキソ”プライマー組は、外因性発現を選択的に検出し、そして“全”プライマー組は内因性発現を検出した。
ヒトiPS-1-8クローンは、ヒトESマーカー遺伝子Nanog、TERT、Sall4、Zfp42、GDF3、Dnmt3b、TDGFl、GABRB3及びCYP26A1を、それらのマーカー遺伝子のいずれも発現しなかった親線維芽細胞を通して発現した（図7a）。粗線維芽細胞とは対照的に、ヒトiPS-1-8クローンは、４種の遺伝子Oct4、Sox2、Klf4及びc-Mycの誘発された発現をダウンレギュレートした（図7b）。図7は、ヒトiPSクローン1-8細胞の遺伝子発現のRT-PCR分析を示す。パネルaは、クローン1-8及びその親線維芽細胞（NeoFB）においてhESマーカー遺伝子発現のRT-PCR分析を示す。遺伝子は、CYP26A1（35サイクル）を除く30のサイクルで検出された。パネルｂは、クローン1-8において４種のトランスジーンのサイレンシングを示す。遺伝子トランスダクションの17日後に得られる粗線維芽細胞を、対照として使用した。“エキソ”プライマー組は、内因性及び外因性遺伝子発現の両者を検出した。
マトリゲル上でのmTeSR1(1-8mTeSR) 及びマトリゲル上でのMEF−ならし培地において培養されたヒトiPS細胞及びその親線維芽細胞（5F0438）を、全体的遺伝子発現について分析した。マイクロアレイ研究を、Affymetrix Human Genome Ul33 Plus 2.0 遺伝子発現アレイ (Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて行った。GeneChip（商標）Human Genome Ul33 Plus 2.0 アレイは、単一アレイに基づいて、転写されたヒトゲノムの包括的範囲を提供し、そして38,500の十分に特徴づけられたヒト遺伝子を包含する、47,000以上の転写体及び変異体の発現レベルを分析する。
手短には、全RNAを、RNAeasy (Qiagen)により細胞から抽出した。ビオチン−ラベルされたcRNAを、Affymetrix技術的プロトコールに従って、1μgの全RNAから逆転写した。15μgのcRNAを断片化し、そしてAffymetrix U133 plus 2 GeneChipアレイに対して、45℃で16時間ハイブリダイズし、そして次に、洗浄し、そしてAffimetrix Fluidics (Affymetrix)を用いて染色した。アッセイを、Affimetrix GCS3000スキャナーにおいて走査し、そして得られる像をGCOSソフトウェアを用いて分析した。この実験及びGEOからのデータを、GeneSpring 7.3.1.ソフトウェアにより調査した。
拡散プロット分析に関しては、マトリゲル上でのmTeSR1 (1-8mTeSR)において培養された、ヒト誘発された多能性幹細胞クローン1-8及びその親線維芽細胞（5FO438）を、クローン1-8及びGEO（GSM151741）からのデータであるH14hES系の両者について現在のフラッグコール（P<0.04）又はマージナルフラッグコール（0.04≦P＜0.06）による21,080組の遺伝子に基づいて分析し、比較目的のためにヒトES細胞の代表として使用した。図８は、ヒトiPSクローン1-8細胞の全体的遺伝子発現の分散プロット分析を示す。分散プロットは、mTeSR1において培養されたヒトiPSクローン1−8細胞とMEFによるH14 hES細胞との間（公的なデータベースGEOからのGSM151741）（パネルa）、又はクローン1-8とその親線維芽細胞との間（パネルｂ）の全体的遺伝子発現の比較を示す。ES細胞特異的遺伝子の記号は、両分散プロットにおいて線により示される。発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色順位で示された。矢印は、色の代表的領域を示す。
クラスター分析に関しては、mTeSR1において培養されたクローン1-8（1−8mTeSR）、MEF−ならし培地において培養されたクローン1-8（1-8 CM）、及びその親線維芽細胞（5F0438）についてのDNAマイクロアレイデータを、MEF上で培養されたSheff4系（hESl :GSM194307、 hES2: GSM194308、 hES3: GSM194309）、マトリゲル上で培養されたSheff4系（hES4: GSM194313、hES5: GSM194314）、MEF上で培養されたH14系（hES6: GSM151739、hES7: GSM151741）、及び３種の線維芽細胞（線維芽細胞１のためのGSM96262、線維芽細胞２のための GSM96263及び線維芽細胞３のためのGSM96264）についてのDNAマイクロアレイデータと比較した。
ヒトiPS系（1-8、2-4及び3-2）及びそれらの親線維芽細胞の全体的遺伝子発現プロフィールを、マイクロアレイ技法を用いて分析した。International Stem Cell Initiativeにより定義される遺伝子組を用いての階層クラスター分析（表21を参照のこと）は、ヒトiPS系 (1-8, 2-4, 及び3−2)がヒトES細胞系によりクラスター化されたが、しかしそれらの親皮膚由来の細胞から分離されたことを示した（図９）。図９は、異なった細胞系の全体的遺伝子発現、及び全体的遺伝子発現分析に基づく遺伝子系統樹を示す。細胞は、International Stem Cell Initiativeにより同定された遺伝子組に基づいて遺伝子系統樹においてクラスター化された（表21を参照のこと）。
サンプルを、mTeSRにおいて培養されたクローン1-8については“1-8mTeSR”；MEF−ならし培地において培養されたクローン1-8については“1-8CM”；凍結融解処理の後、mTeSRにおいて培養されたクローン1-8について“1-8mTeSR(f&t)”；MEF上で培養されたクローン1−8については“1-8MEF”；mTeSR培地において培養されたクローン2-4については“2-4mTeSR”；MEF上で培養されたクローン2-4については、“2-4MEF”；mTeSR培地において培養されたクローン3-2については、“3-2mTeSR”；親線維芽細胞については“5F0438”又は“5F0416”；MEF上で培養されたSheff4系については、"hESl," "hES2," "hES3" (それぞれGSM 194307、GSM 194308、GSM 194309)；マトリゲル上で培養されたSheff4系については、"hES4," 又は"hES5" (それぞれGSM 194313, GSM 194314)；MEF上で培養されたH14系については" hES6," 又は "hES7" (GSMl51739, GSMl51741)；GSM96262については“線維芽細胞１”；GSM96263については“線維芽細胞２”；及びGSM96264については“線維芽細胞３”としてそれぞれ命名された。発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色順位で示された。
ヒトES細胞系Sheff4とH14との間、及びヒトiPS細胞系1−8とヒトES細胞系H14との間のピアソン相関係数はそれぞれ0.675及び0.835であった（図９）。iPS系1−8、2−4及び3−2及びhES細胞系の全体的遺伝子発現プロフィール間での類似するピアソン相関係数が観察された。この分析は、ヒトiPS細胞系1−8が、ヒトES細胞系H14と類似する遺伝子発現パターンを有したことを示す。
ヒトiPS細胞系（クローン1−8）とヒトES細胞系H14との間の分散プロット分析は、ヒトES細胞マーカー遺伝子、Nanog、Oct3/4、TDGFl、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、 CD9及びThy-1がヒトiPS細胞系とヒトES細胞系H14との間に高い相関性を示した（図8a）ことを示唆する。対照的に、クローン1−8は、親新生児線維芽細胞とは異なった（図8b）。これは、Nanog−関連遺伝子を用いてクラスター分析により認識された。ヒトiPS細胞系1−8とヒトES細胞系H14との間、及びヒトiPS細胞系1−8とその親線維芽細胞との間のピアソン相関係数はそれぞれ、0.908及び0.100であった（図10）。図10は、異なった細胞系の全体的遺伝子発現、及びその全体的遺伝子発現分析に基づく遺伝子系統樹を示す。
細胞は、線維芽細胞（３種のGEOデータ）と比較される場合、0.99〜1の比率のヒトES細胞（７種のGEOデータ）におけるNanog遺伝子発現と相互関係される遺伝子組に基づいて遺伝子系統樹においてクラスター化された。サンプルは、mTeSRにおいて培養されたクローン1−8について“1−8mTeSR”；MEF−ならし培地において培養されたクローン1−8について“1−8CM”；親線維芽細胞について“5F0438”；MEF上で培養されたSheff4系について"hESl" "hES2" "hES3"(それぞれGSM194307、GSM194308、GSM194309)；マトリゲル上で培養されたSheff4系について"hES4" "hES5" (それぞれGSM194313、GSM194314)；MEF上で培養されたH14系について"hES6" "hES7" (それぞれGSMl51739、GSM151741)；GSM96262について“線維芽細胞１”；GSM96263について“線維芽細胞２；及びGSM96264について“線維芽細胞３”としてそれぞれ命名された。
発現強度は、赤（高）〜緑（低）の比色順位で示された。1−8、2−4及び3−2細胞系及びそれらの親線維芽細胞についての全体的遺伝子発現データは、受託番号GSE9709としてGene Expression Omnibus (GEO)データベース寄託された。それらの分析は、ヒトiPS細胞系が遺伝子発現に関して、ヒトES細胞系に類似することを示す。
クローン1−8及び2−4におけるNanog及びOct3/4のプロモーター領域を、個々のCpG部位のメチル化について分析した。亜硫酸水素塩−処理されたゲノムDNA10ngを、T7プロモーターを含むプライマーによりPCR−増幅し、そして転写体をRNアーゼ Aにより処理した。メチル化されたCpG配列に起因するフラグメントはA−塩基の変わりにGを含むので、それらはその対応するメチル化されていないCpGに起因する分子量よりも16Da高い分子量を有した。この質量差異は、MALDI-TOF質量分光計（Autoflex, Bruker Daltonics）を用いて検出された。質量分光計により生成されるスペクトルを、EpiTYPER (Sequenom)を用いて分析した。個々のCpG部位の％メチル化を、メチル化されていないフラグメント及びメチル化されたフラグメントからのシグナルのピーク下の面積を用いて計算した。表９は、メチル化分析のために使用されるアンプリコンに対応するゲノムにおける位置及びサイズを列挙する。表10は、メチル化分析のために使用されるプライマー組を列挙する。
保存された領域１（CR1）を含むOct3/4近位プロモーター、CR4を含むOct3/4プロモーター遠位エンハンサー、及びOct3/4及びSox2結合部位を含むNanog近位プロモーターを試験した（図11a）。図11bに示されるように、それらの領域におけるサイトシン−ホスフェート−グアノシン（CpG）ジヌクレオチドを、親線維芽細胞に比較してクローン1−8及び2−4由来の細胞において脱メチル化した。
ヒトiPS−1−8mTeSR細胞−緩衝液（0.5〜２×106個の細胞/マウス）を、Hamilton注射器を用いて、生後７〜８週目のSCIDマウス（CB17, Oriental Yeast）の左精巣の髄質中に注射した。６〜８週後、奇形腫を、PBS、続く10％緩衝ホルマリンによる還流下で切除し、そして組織学的分析にゆだねた。ヒトiPS−1−8mTeSR細胞は、SCIDマウスの精巣への移植の４〜８週後、奇形腫をもたらした。
奇形腫を積層培地に埋め、そして低温装置上で10μmで切断した。一連の断片を、ヘマトキシリン−エオシン（HE）により染色し、一般的形能学を可視化した。軟骨の検出のために、アルシアンブルー染色を用いるか又はHEと共に組合された。
免疫染色に関しては、断片をImmunoblock (Dainippon-Sumitomo)により30分間、処理し、非特異的結合を阻止した。スライドを次の一次抗生物質と共にインキュベートした：抗Nestinポリクローナル抗体（PRB-570C, COVANCE, 1 :300）、抗タイプIIコラーゲンポリクローナル抗体（LB- 1297, LSL, 1 :200）、抗平滑筋アクチンポリクローナル抗体（RB-9010-R7, LAB VISION, 1 : 1）、抗−フェトプロテインポリクローナル抗体（A0008, DAKO, 1 :500）、抗MUC−１ポリクローナル抗体（RB-9222-P0, LAB VISION, 1 :100）、及び抗ヒト核モノクローナル抗体(HuNu) (MAB 1281, CHEMICON, 1 :300)。タイプIIコラーゲンに関しては、一次抗体による処理の前、断片をヒアルロニダーゼ（25mg/ml）と共に30分間インキュベートした。抗原の局在化を、適切な二次抗体を用いて可視化した（Alexa fluor 594及び688, Molecular Probes, 1 :600）。核をDAPIにより染色した。免疫染色された奇形腫断片を、蛍光顕微鏡（Axio Imager Zl , Zeiss）下で分析した。
ヒトiPS-1-8mTeSR細胞の奇形腫は、3種の胚層、神経外胚葉、中胚葉、内胚葉を代表する組織を含んだ。図12は、94日間、培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞にに由来する奇形腫を示す（T1）。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞をSCIDマウス精巣中に注入し、そして注入後56日で分析した。奇形腫精巣のHE及びアルシアンブルー染色は、奇形腫が神経上皮（ネスチン、に対して陽性）、軟骨（コラーゲンIIに対して陽性）、内胚葉管（α−フェトプロテイン）を含んだことを表した。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞由来を、HuNu染色により宿主組織から区別した。T1奇形腫においては、平滑筋細胞（α−SMAに対して陽性）及び分泌上皮（MUC−1に対して陽性）をまた観察した（図13）。
102日間及び114日間、培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞を、SCIDマウス精巣中に注入し、そしてそれぞれ、注入後、48日及び42日（T3）で分析した（T2, 図13、T3, 図14）。３種の胚層、すなわち神経外胚葉、中胚葉及び内胚葉を代表する細胞を観察した。ヒトiPSが低温保存され得るかどうかを確かめるために、ヒトiPS-1-8mTeSR細胞を凍結し、液体窒素に貯蔵し、そして再培養した。それらの細胞をSCIDマウス精巣中に注入し、そして注入後46日（T-F1）及び48日（T-F2）で分析した。３種の胚層、すなわち神経外胚葉、中胚葉及び内胚葉を代表する組織を観察した。メラニン細胞をまた、T-F2奇形腫において観察した（図14）。従って、多能性が凍結及び融解を通して維持された。
サザンブロット分析及びゲノムPCR分析の両者は、ヒトiPS-1-8クローンが４種のトランスジーンを含むことを示した。サザンブロット分析においては、cDNAフラグメントを、その対応するpMXベクタープラスミドから、制限酵素消化（POU5F1のためのXhoI、Sox2のためのNotI、 KIF4のためのPstI）により調製した。それらのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動及びQIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）により、32P−ラベルされたプローブとして精製した。ゲノムDNAを、ヒトiPSクローン1−8及びその親線維芽細胞から調製した。5μgの個々のゲノムDNAを、KpnI (POU5F1 、Sox2及び Klf4)により消化した。
フラグメントを、HybondXL膜 (GE Healthcare)上にブロットされた0.8％アガロースゲル上で分離し、そして32P−レベルされたプローブによりハイブリダイズした。ヒトiPSクローン1−8は、Oct3/4トランスジーン及びSox2トランスジーンの両者の約10のコピー及びklf4トランスジーンの１つのコピーを担持することが示された（図15）。ゲノムPCR分析においては、表４においてc-Myc-totalとして示されるプライマー組を命名し、その結果、アンプリコンはc-Mycの全第二イントロンを含んだ。従って、トランスジーンのアンプリコンサイズ（338bp）は、エンドジーンのアンプリコン（1814bp）よりも小さかった。ベクタープラスミド及び親線維芽細胞ゲノム、すなわち感染核17日間の培養物から得られた培養された粗線維芽細胞ゲノムを、対照鋳型として使用した。ゲノムPCRは、クローン1−8細胞がc-Mycトランスジーンを担持することを確かめた（図15）。
SNP遺伝子型決定を、GeneChip Human Mapping 500K Array Set (Affymetrix)の使用により、その製造業者のプロトコールに従って実施した。マトリゲル上でのmTeSR1において培養されたヒトiPS-1-8mTeSR細胞、その親線維芽細胞（5F0438）、及び異なったドナー由来の線維芽細胞（5F0416）を、このアッセイのために分析した。アレイ組は、StyI及びNspIチップを含む。２アリコートの250ngのDNAをそれぞれ、NspI及びStyIにより消化した。個々の酵素調製物を、その対応するSNPアレイに対してハイブリダイズした（それぞれNspI及びStyIアレイに基づいて262,000及び238,000）。Dynamic Modelアルゴリズム138によるP＝0.33での93％カールレート閾値（Dynamic Modelアルゴリズム信頼閾値）を、個々のアッセイに使用した。
ヒトiPS-1-8mTeSR細胞が線維芽細胞（5F0438）から生成されるかどうかを確かめるために、我々はヒトiPS-1-8mTeSR細胞と使用される線維芽細胞との間のSNP遺伝子型決定を比較した（表５）。ヒトiPS-1-8mTeSR細胞のSNPは、SNPの467,946のうち464,069（99.17％）において親細胞のSNPと一致し、そしてそれらの3,877（0.83％）において親細胞のSNPとは異なる。対照的に、ヒトiPS-1-8mTeSR細胞のSNPは、SNPと呼ばれる470,960のうち284,950（60.50％）においての−無関係のドナー細胞（5F0416）のSNPと一致し、そしてそれらの186,010（39.50％）において無関係の細胞のSNPとは異なる。従って、ヒトiPS-1-8クローン（1−8mTeSR）及び親細胞は、お互いほとんど同じSNP遺伝子型を有し、このことは、両細胞が単一のドナーに起因したことを強く示唆する。
HLA DNA分類を、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（SSOP）（Luminex）によるPCR−増幅されたDNAのハイブリダイゼーションを利用することにより実施した。多能性幹細胞誘発の工程に関連するDNA突然変異比率を調べるために、ゲノム全体の単一ヌクレオチド多形現象アレイ分析を、ヒトiPSクローン1−8（n＝2）、その親皮膚−由来の細胞（n＝2）及びもう１つのドナー由来の皮膚細胞（n＝1）に対して実施した。著しい差異は、ヒトiPSクローン1−8とその親細胞との間に観察されなかった（表５）。ヒトiPS細胞系1−8、2−4及び3−2のHLA遺伝子型は、それらのそれぞれの親細胞の遺伝子型と同一であることが、それらの観察と一致する。
HLA-A、HLA-B、HLA-Cw、HLA-DR、HLA- DQ、HLA-DP 及び Bw遺伝子座を決定するために、製造業者の説明書に従って、アッセイを実施した。ヒトiPS細胞は、細胞移植治療においては有望な材料であり、それらは免疫拒絶を克服することができる。なぜならば、ヒトiPS細胞は対象の細胞から直接的に生成され、そして同一のHLA型であるからである。我々は、ヒトiPS-1-8クローン（1-8mTeSR）、親細胞（5F0438）及び無関係の線維細胞（5F0416）のHLA分類を実施した。予測されるように、iPS-1-8クローンのHLA型は、5F0438のHLA型と完全に一致するが、しかし5F0416のそれとは一致しなかった（表６）。
前述から、ヒト多能性幹細胞は、ヒト生後組織に生存する未分化幹細胞におけるOct3/4、Sox2, Klf4及びc−Mycの４種の遺伝子の個々の誘発された発現により得られた。ヒト多能性幹細胞は、インビトロでの長期自己再生能力、及び外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化する多能性を示す。ヒト多能性幹細胞は、発現された細胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24及び CD90及びES細胞マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4、TDGFl、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9及びThy-1であった。ヒト多能性幹細胞におけるNanog及びOct3/4のプロモーター領域は、親線維芽細胞に比較して脱メチル化された。ヒト多能性幹細胞は、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycトランスジーンの少なくとも１つのコピーを担持する。誘発されたヒト多能性幹細胞及び親細胞（ヒト生後組織に存在する未分化幹細胞）は、ほとんど同じSNP遺伝子型をお互い有し、そして誘発されたヒト多能性幹細胞のHLA型は親細胞（ヒト生後組織に存在する未分化幹細胞）のそれと完全に同一であった。
例15．４種の遺伝子導入された新生児線維芽細胞の一次培養物の遺伝子発現プロフィール：
２種のロットの新生児線維芽細胞（5F0416及び5F0474）を、６ウェルプレートの35mmの直径のウェル中に103個の細胞/cm2又は104個の細胞/cm2で接種し、そして4種の遺伝子のトランスダクションの前、FGM-2 SingleQuots (Lonzaにより製造される)により補充されたFBMにおいて培養した。細胞を、２×105ifu/ウェルでmCAT1−アデノウィルスベクターにより感染せしめ、そして次に、例6に記載のようにして、４種の遺伝子を担持するレトロウィルスベクターにより感染した。８個のウェルを、この研究のための調製した（二重反復しての２種の異なったロット及び２種の異なった密度）。
４種の遺伝子の感染の17日後、細胞を固定し、そして例３に記載のようにして、アルカリホスファターゼ（ALP）のために染色した。合計で、163のALP陽性（＋）コロニーを、４種の独立した実験において観察した。すべての163のALP（＋）コロニー及び18のALP陰性（ALP（−））コロニーを分解し、そしてそれらのコロニーからの全RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolationキット(Ambionにより製造される)を用いて抽出した。cDNA調製の後、興味ある遺伝子を、Taqman preamp (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて増幅した。
即時定量的PCRを、PCRプライマー組（Applied Biosystemsにより製造される、Nanog、Hs02387400_gl、Dnmt3b、Hs00171876_ml、FoxD3、Hs00255287_sl、Zfp42、 Hs01938187_sl、TDGFl、Hs02339499_gl、TERT、HsOOl62669_ml、GDF3、Hs00220998_ml、CYP26A1、 HsOOl75627_ml、GAPDH、Hs99999905_ml）を用いて、ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystemsにより製造される)により実施し、コロニーにおけるヒトES細胞マーカーの遺伝子発現を決定した。ヒトES細胞において発現することが報告されている８種の遺伝子（Nanog、TDGFl、Dnmt3b 、Zfp42 、FoxD3、GDF3、CYP26A1及び TERT遺伝子）を、多能性幹細胞マーカー遺伝子として選択した。標準曲線を、個々のプライマー対について生成した。すべての発現値は、GAPDHに対して標準化された。
マウスES細胞及びマウスiPS細胞が多層化された/凝集されたコロニーを形成することは知られている。従って、我々は最初に、ヒト線維芽細胞において４種の遺伝子の異所性発現により誘発された、マウスES細胞のような凝集されたコロニーを分析した（例えば、図23におけるコロニー＃１−２−F及び１−２−B）。しかしながら、それらのコロニーはすべてALP（−）である。次に、我々はコロニーにおけるNanog遺伝子発現を分析した。Hanog遺伝子発現を、163のALP陽性コロニーのうち161、及び18のALP陰性コロニーのうち16において観察された。他方では、TERT及びCYP26A1遺伝子が、それぞれ163のALP陽性コロニーのうち26及び24のコロニーにおいてのみ観察された（図16a）。ヒトES細胞において多能性状態と密接に関連し、そしてそれらの分化に基づいて強くダウンレギュレートされることが良く知られている遺伝子、例えばNanog、TDGF及びDnmt3bは、４種の遺伝子トランスダクションにより誘発される高い傾向を有した。
ALP陽性コロニーを、８種のヒトマーカー遺伝子の遺伝子発現パターンに基づいて40のグループに分類することができる（表７及び表８）。コロニーが８種のマーカー遺伝子発現の合計数により分類される場合、コロニー数の分布は正常な分布を従え、このことは、コロニー誘発における確立工程の存在を示唆する（図16c、d）。さらに、ヒト線維芽細胞におけるヒトES細胞マーカー遺伝子発現の効率がドナー差異に影響された。
誘発の17日後に形成されるコロニーの定量的遺伝子発現分析は、トランスジーンc-Myc及びOct4がすべての分析されたコロニーにおいて高い発現を示したことを示唆する（表11）。さらに、内因性Nanog発現は、８種のヒトES細胞マーカー遺伝子の1又は複数の遺伝子の発現を欠いている細胞を包含する、ALP陽性コロニーのほとんどにおいて非常に高かった（表11）。それらの結果は、ヒト皮膚線維芽細胞からの多能性幹細胞誘発の工程が、マウスiPS細胞生成について記載される工程よりも遅いことを示唆する。163のALP陽性コロニーのうちわずか４のコロニーが、Nanog、TDGFl、Dnmt3b 、Zfp42 、FoxD3、GDF3、Cyp26a1及び TERTに対して陽性であった（オクタ−陽性コロニー）。
それらのオクタ陽性コロニーにおける細胞は、次の共通する特徴を示した：１）高い核：細胞質比を伴っての小さなサイズ、及び２）線維芽細胞間の空間内での小さな単層コロニーの形成（図16c）。それらの特徴は、ヒトES細胞の特徴と一致する。しかしながら、それらの３種の特徴はまた、１又は複数のES細胞マーカー発現を欠いているALP（＋）コロニーのいくつかにおいても観察された。さらに、それらの３種の特徴を有する大きなコロニーは、ALP発現を欠いている（図23、コロニー＃7-1-1）。線維芽細胞特徴を有するALP（＋）コロニー（図17-23及び表、７，８，12，13におけるコロニー#5-1-7、#3-1-214、#3-2-233、#3-1-212、#3-1-215、 #5-1-4は通常、１又は複数のES細胞マーカー遺伝子発現を欠いていた。
それらの結果は、誘発された多能性幹細胞が、高い核：細胞質比を有する小さな細胞を含んでいる小さな単層コロニーから単離され得るが、しかし線維芽細胞コロニー、弱められたコロニー又は多層化されたコロニーからは単離され得ないことを示唆する。表８は、ヒト新生児線維芽細胞を用いてのALP陽性コロニー数に基づく実験及び結果のすべてを要約する。
例16．ヒト新生児皮膚線維芽細胞からのヒトiPS-2-4クローンの生成：
mCAT1のためのアデノウィルスベクタープラスミドを、293細胞中にトランスフェクトした。mCAT1−アデノウィルスを、それらの細胞から、３回の凍結−融解サイクルにより単離し、アデノウィルス精製キット（Clontech）を用いて精製し、そして-80℃で貯蔵した。ベクターストックの力価を、Adeno-X急速力価キット（Clontech）により決定した。
複製不完全MMLV由来のレトロウィルスベクターpMxを、ヒトOct3/4、Sox-2、c-Myc及び Klf4の異所性発現のために使用した。組換えレトロウィルスを、Plat-E パッケージングシステム(Morita et al., (2000), Gene Therapy, 7: 1063- 1066)にベクターをトランスフェクトし、続いてFGM -2 SingleQuots (Lonza)により補充されたFBM（Lonza）においてインキュベートすることにより生成した。トランスフェクションの24〜48時間後、Plat-E培養物からの上清液を、少なくとも４時間の間隔で数度、集め、そして0.45μmのフィルターに通した。
MEF−ならし培地（MEF-CM）調製のために、20% ノックアウト血清置換体(KSR, Invitrogen)、2 mM L- グルタミン (Sigma)、1X 非必須アミノ酸(Sigma)、10 μg/ml のゲンタマイシン、10 ng/mlの bFGFにより補充されたヒトES培地（DMEM/F12）（Gibco）を、マイトマイシン−C処理されたMEF（Reprocell）上で20−24時間ならし、収穫し、0.45μmのフィルターに通し、そして0.1mMの２−メルカプトエタノール（Sigma）及び10ng/mlのbFGFにより、使用の前、補充した。
ヒト新生児組織、すなわち誕生直後のヒト組織由来の細胞（商品名：新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞、一次培養物）を用いて、ヒト新生児の皮膚に存在する末分化幹細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発を試みた。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（Lonza; ロット5F0416）を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養した。４種の遺伝子の導入の３日間、線維芽細胞を、６ウェルプレートに103個の細胞/cm2で接種した。18時間後、細胞を、500μlのハンクス溶液中、mCAT1アデノウィルスベクター溶液と共に混合し、そして室温で30分間インキュベートした。次に、細胞を2mlの培地に添加し、そして48時間、培養した。続いて、細胞を、2mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液（5μg/mlのポリブレンにより補充された、例1において調整された４種の遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及びc-Mycの個々のための等体積のレトロウィルスベクター懸濁液の混合物）において、37℃で４時間〜一晩インキュベートした。ウィルス上清液を、MEF−ならしES培地により交換した。次に、培地を毎日、交換した。
遺伝子導入の33日後、特徴的な形状を有するコロニーを、ウェルからピンセットにより採取した。採取されたコロニーを、24ウェルプレート中のマトリゲル被覆されたウェル中に移し、そして10μMのY−27632により補充されたmTeSR1定義の培地において維持した。14時間後、培地を交換した。培地交換を毎日続けた。感染の54日後、二次培養を実施した。67日で、ヒトiPS-2-4クローンを、サブクローン化し、そしてヒト、iPS-2-4サブクローンと命名した。
継代のために、培地を除き、そして細胞をハンクス溶液により洗浄し、続いて0.25％のトリプシン−EDTAにより37℃で３分間、処理した。新鮮な培地を添加し、反応を停止した。細胞懸濁液を4℃及び200xgで５分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。細胞を、10μMのY−27632により補充されたmTeSR1定義の培地に再懸濁し、そしてプレートした。
ヒトiPS-2-4サブクローンを、マトリゲル（BD Biosciences）−被覆された皿上でのmTeSR1定義の培地（Stem cell Technologies）において都合よく拡張した。我々は、サブクローンiPS-2-4に由来する細胞を命名し、そしてヒトiPS-2-4mTeSR細胞としてmTeSR1培地において培養した。培地を、ヒトiPS-2-4mTeSR細胞培地により毎日交換し、そして通常、Y−27632（Calbiochem）により処理し、継代の後の細胞アポプトーシスを回避した。継代のために、細胞をハンクス溶液により洗浄し、0.25％トリプシン−EDTA（Gibco）において37℃で３分間、インキュベートし、そして次に培養培地を添加した。細胞を300×g及び室温又は4℃で5分間、遠心分離し、そして上清液を除去した。細胞を培養培地中に再懸濁した。ヒトiPS-2-4mTeSR細胞は、高い核：細胞質比を有する、小さな丸型の細胞から成る定義された縁を有するコロニー下で増殖する、典型的なヒトES細胞及びヒトiPS-1-8mTeSR細胞とは形態学的に区別できない。
４−遺伝子感染の59日後、一部の細胞を固定し、そして例３に記載されるようにして、アルカリホスファターゼ（ALP）のために染色した。細胞から成るコロニーは、ALPに対して陽性であり、そしてコロニーからの全RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation kit (Ambionにより製造される)を用いて抽出した。cDNA調製の後、興味ある遺伝子を、Taqman preamp (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて増幅した。
即時定量的PCRを、PCRプライマー組（Applied Biosystemsにより製造される、Nanog、 Hs02387400_gl、Dnmt3b、Hs00171876_ml、FoxD3、Hs00255287_sl、Zfp42、Hs01938187_sl、 TDGFl、Hs02339499_gl、TERT、Hs00162669_ml、GDF3、Hs00220998_ml、CYP26A1、Hs00175627_ml、 GAPDH、Hs99999905_ml）を用いて、ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystemsにより製造される)により実施し、コロニーにおけるヒトES細胞マーカーの遺伝子発現を決定した。クローン２−４は、ES細胞マーカー遺伝子の発現を示した（表12）。
iPS1-8系に関して観察されるように、サザンブロット分析及びゲノムPCR分析の両者は、その2-4系が組み込まれたOct 3/4、 Sox2、Klf4及びc-Mycトランスジーンを含んだことを示した。同様に、2-4iPS系は、細胞表面マーカーCD24、CD90、TRA 1-60、TRA- 1-81、SSEA3及びSSEA4を発現し；正常な核型、その親細胞と同一のHLA遺伝子型、1-8系の発現パターンに類似する全体的遺伝子発現パターン、及び1-8系において観察されるようなNanogプロモーター低メチル化を有した。
上記結果から、ヒト多能性幹細胞を、ヒト生後組織に存在する未分化幹細胞におけるOct 3/4、 Sox2、Klf4及びc-Mycの４種の遺伝子の個々の誘発された発現により得た。ヒト多能性幹細胞は、インビトロ長期自己再生能力を示し、そしてES細胞マーカー遺伝子Nanog、 Oct3/4、TDGFl、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9及びThy-1を発現した。
例17.ヒト新生児皮膚線維芽細胞からのヒトiPS-3-2クローンの生成：
例16に従って、ヒト親新生児皮膚線維芽細胞（Lonza; ロット5F0438）を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養した。４種の遺伝子導入の3日前、線維芽細胞を、６ウェルプレート中に103個の細胞/cm2で接種した。18時間後、細胞をハンクス溶液500μl中、mCAT1アデノウィルスベクター溶液と共に混合し、そして室温で30分間インキュベートした。次に細胞を2mlの培地に添加し、そして48時間、培養した。続いて、細胞を、2mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液（5μg/mlのポリブレンにより充填された、例１において調製された4種の遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4 and c- Myc）の個々のための等体積のレトロウィルスベクター懸濁液の混合物）において、37℃で４時間〜一晩インキュベートした。ウィルス上清液を、MEF−ならしES培地により交換した。次に、培地を毎日交換した。
遺伝子導入の21日後、特徴的形状を有するコロニーを、皿の１つからピンセットにより直接的に採取した。採取されたコロニーを、24ウェルプレートにおけるマトリゲル被覆されたウェルに移し、そして10μMのY−27632により補充されたmTeSR1定義の培地に維持した。
14時間後、培地を交換した。培地交換を毎日続けた。感染の40日後、二次サブクローニングを行い、そして細胞を、マトリゲル被覆された皿上でのmTeSR1定義の培地（幹細胞技法）において都合良く拡張した。培地を毎日、交換し、そして通常、Y−27632（Calbiochem）により処理し、継代の後の細胞アポプトーシスを回避した。継代のために、細胞をハンクス溶液により洗浄し、0.25％トリプシン−EDTA（Gibco）において37℃で５分間インキュベートし、そして次に、培養培地を添加した。細胞を、300xg及び室温で5分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。細胞を、培養培地中に再懸濁した。
細胞は、十分に定義された縁を伴ってコロニーにおいて増殖し、そして高い核：細胞質比を有する、小さく、丸型の細胞から成る、典型的なES細胞、ヒトiPS-1-8mTesR細胞及びヒトiPS-2-4mTeSR細胞とは形態学的に区別できなかった。従って、我々はこのクローンを、ヒトiPS-3-2クローンと命名した。ヒトiPS-3-2クローンは、mTeSR1培地において活動的に増殖した。我々は、mTeSR1培地において培養するヒトiPS-3-2クローンに起因するそれらの細胞を、ヒトiPS-3-2mTeSR細胞として命名した。
４−遺伝子感染の48日後、細胞を固定し、そして例３に記載されるようにして、アルカリホスファターゼ（ALP）のために染色した。コロニーからの全RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation kit (Ambionにより製造される)を用いて抽出した。cDNA調製の後、興味ある遺伝子を、Taqman preamp (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて増幅した。即時定量的PCRを、PCRプライマー組（Applied Biosystemsにより製造される、Nanog、 Hs02387400_gl、Dnmt3b、Hs00171876_ml、FoxD3、Hs00255287_sl、Zfp42、Hs01938187_sl、 TDGFl、Hs02339499_gl、TERT、Hs00162669_ml、GDF3、Hs00220998_ml、CYP26A1、Hs00175627_ml、 GAPDH、Hs99999905_ml）を用いて、ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystemsにより製造される)により実施し、コロニーにおけるヒトES細胞マーカーの遺伝子発現を決定した。クローン3−2は、ES細胞マーカー遺伝子の発現を示した（表14）。ゲノムPCR分析は、その3−2系が組み込まれたOct 3/4、 Sox2、Klf4及びc-Mycトランスジーンを含んだことを示した。同様に、3−2iPS系は、その親細胞と同一のHLA遺伝子型、及び1-8系の発現パターンに類似する全体的遺伝子発現パターンを有した。
上記結果から、ヒト多能性幹細胞を、ヒト生後組織に存在する未分化幹細胞におけるOct 3/4、 Sox2、Klf4及びc-Mycの４種の遺伝子の個々の誘発された発現により得た。ヒト多能性幹細胞は、インビトロ長期自己再生能力を示し、そしてES細胞マーカー遺伝子Nanog、 Oct3/4、TDGFl、Dnmt3b、GABRB3、GDF3、Zfp42、ALP、CD9及びThy-1を発現した。
例18．レトロウィルストランスダクション及びHDACインヒビター処理による、Oct3/4、Sox2及びKlf4の誘発された発現によるヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養した。レトロウィルストランスダクション及びヒストンデアセチラーゼ処理の３日前、線維芽細胞を、６ウェル細胞培養プレート中に103個の細胞/cm2で接種した。18時間後、細胞を、５のMOIでmCAT1アデノウィルスベクター（例２に記載される）を含むハンクス溶液500μlにおいて、時折振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。
その後、2mlのFBM培地を個々のウェルに添加し、そして細胞を48時間、培養した。続いて、細胞を2mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液（5μg/mlのポリブレンにより補充された、調製される個々のウィルスに関して約10のm.o.i.で、Oct3/4、 Sox2及びKlf4（例１及び５に記載される）をコードするレトロウィルスベクター等体積の混合物）において、37℃で４時間〜一晩インキュベートした。次に、ウィルス上清液を、1μMの最終濃度でヒストンデアセチラーゼインヒビターMS−275により補充されたMC-ES培地により交換した。次の日、培地を、MC−ES培地により交換し、そしてその後、毎日交換した。
ウィルストランスダクション及びMS-275 処理の17〜33日後、特徴的形状（例えば、小さく、丸型で、そして高い核：細胞質比を有する）を有するコロニーを、ピンセットによりウェルから採取した。次に、採取されたコロニーを、24ウェルプレートにおけるマトリゲル被覆されたウェル中に移し、そして10μMのY−27632により補充された、mTeSR1定義の培地において維持した。14時間後、培地を交換した。その後、培地を毎日交換した。ウィルストランスダクション及びMS−275処理の38〜54日後、二次サブカルチャーを実施した。継代のために、培地を除去し、そして細胞をハンクス溶液により洗浄し、続いて0.25％トリプシン−EDTAにより37℃で3〜5分間、処理した。新鮮な培地を添加し、反応を停止した。細胞懸濁液を4℃及び200xgで５分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。細胞を、10μMのY−27632により補充された、mTeSR1定義の培地に再懸濁し、そして６−ウェル培養皿のマトリゲル被覆されたウェルにプレートした。
得られるヒトiPSクローンを、マトリゲル（BD Bioscience）−被覆された培養皿上でのmTeSR1定義された培地において拡張した。培養培地を、ヒトiPS細胞培養のために毎日、交換した。ヒトiPS細胞系を継代するために、細胞をハンクス溶液により洗浄し、0.25％トリプシン−EDTA（Gibco）において37℃で３〜５分間インキュベートし、そして次に、培養培地を添加した。得られる細胞懸濁液を、300xg及び室温又は4℃で5分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。
細胞を、培養培地中に再懸濁し、そして上記のようにしてプレートした。継代の後、培地を10μMのY−27632（Calbiochem）により補充し、細胞アポプトーシスを回避した。得られるヒトiPS細胞は、典型的なヒトES細胞、及び定義される縁を有し、そして小さな、丸型の細胞から成り、そして高い核：細胞質比を有するコロニー下で増殖するヒトiPS-1-8mTeSR細胞とは形態学的に区別できない。例14−15におけるように記載されるすべての分析によれば、得られるヒトiPS細胞は、インビトロでの長期再生能力を示し、そして多くの特徴において、典型的なヒトES細胞に非常に類似する。
例19．レトロウィルストランスダクションによる、Oct3/4、Sox2及びKlf4の誘発された発現によるヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養した。レトロウィルストランスダクションの３日前、線維芽細胞を、６ウェル細胞培養プレート中に103個の細胞/cm2で接種した。18時間後、細胞を、５のMOIでmCAT1アデノウィルスベクター（例２に記載される）を含むハンクス溶液500μlにおいて、時折振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。その後、2mlのFBM培地を個々のウェルに添加し、そして細胞を48時間、培養した。続いて、細胞を2mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液（5μg/mlのポリブレンにより補充された、調製される個々のウィルスに関して約10のm.o.i.で、Oct3/4、 Sox2及びKlf4（例１及び５に記載される）をコードするレトロウィルスベクター等体積の混合物）において、37℃で４時間〜一晩インキュベートした。次に、ウィルス上清液を、MC-ES培地により交換した。次の日、培地を、MC−ES培地により交換し、そしてその後、毎日交換した。
ウィルストランスダクションの17〜33日後、特徴的形状（例えば、小さく、丸型で、そして高い核：細胞質比を有する）を有するコロニーを、ピンセットによりウェルから採取した。次に、採取されたコロニーを、24ウェルプレートにおけるマトリゲル被覆されたウェル中に移し、そして10μMのY−27632により補充された、mTeSR1定義の培地において維持した。14時間後、培地を交換した。その後、培地を毎日交換した。ウィルストランスダクションの38〜54日後、二次サブカルチャーを実施した。継代のために、培地を除去し、そして細胞をハンクス溶液により洗浄し、続いて0.25％トリプシン−EDTAにより37℃で3〜5分間、処理した。新鮮な培地を添加し、反応を停止した。細胞懸濁液を4℃及び200xgで５分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。細胞を、10μMのY−27632により補充された、mTeSR1定義の培地に再懸濁し、そして６−ウェル培養皿のマトリゲル被覆されたウェルにプレートした。
得られるヒトiPSクローンを、マトリゲル（BD Bioscience）−被覆された培養皿上でのmTeSR1定義された培地において拡張した。培養培地を、ヒトiPS細胞培養のために毎日、交換した。ヒトiPS細胞系を継代するために、細胞をハンクス溶液により洗浄し、0.25％トリプシン−EDTA（Gibco）において37℃で３〜５分間インキュベートし、そして次に、培養培地を添加した。得られる細胞懸濁液を、300xg及び室温又は4℃で5分間、遠心分離し、そして上清液を除いた。細胞を、培養培地中に再懸濁し、そして上記のようにしてプレートした。
継代の後、培地を10μMのY−27632（Calbiochem）により補充し、細胞アポプトーシスを回避した。得られるヒトiPS細胞は、典型的なヒトES細胞、及び定義される縁を有し、そして小さな、丸型の細胞から成り、そして高い核：細胞質比を有するコロニー下で増殖するヒトiPS-1-8mTeSR細胞とは形態学的に区別できない。例14−15におけるように記載されるすべての分析によれば、得られるヒトiPS細胞は、インビトロでの長期再生能力を示し、そして多くの特徴において、典型的なヒトES細胞に非常に類似する。
例20.Tert レポーター構造体を用いてサブセットの誘発因子と組合しての多能性を誘発するsiRNA（“誘発siRNA”）を同定するためのアッセイ（予測例）：
完全なヒトゲノムsiRNAライブラリーを、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycから選択された３種の誘発因子のサブセットと組合して使用される場合、ヒト成人線維芽細胞集団において多能性を誘発するか、又は多能性の誘発を高める能力を有するsiRNAを同定するために一次スクリーンに使用される。前記スクリーンは、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycから選択された３種の誘発因子のサブセットの誘発活性を補足することができる候補体siRNAを同定するためにiPS-マーカー遺伝子Tertの活性化についてのレポーターアッセイを使用する。例えば、試験siRNAは、ミッションがSox2活性を補足するsiRNAを同定するためにOct3/4、Klf4及びc-Mycと組合して使用され得る。二次スクリーンにおいては、候補体誘発siRNAを、同じアッセイにおいて再び試験し、そしてもう１つのiPS-マーカー遺伝子Cyp26A1の発現をまた、試験された細胞においてアッセイする。
Tertプロモーターレポーターレトロウィルスの生成：
ヒトtertプロモーターの0.5kbフラグメントを、下記上流プライマーｈTERT-475F：
5'-GCAGCCCTGGGTCTCCAGATCTGGCCAGC-S'（配列番号14）
及び下記下流プライマーhTERT＋49R：
5'GGTGGCCGGGGCCAGGGCTAGCCACGTGC-3'（配列番号15）
を用いて、ヒトゲノムDNAからPCR増幅する。
プライマーを、hTERTエキソン１の開始の上流（＋）又は下流（−）の塩基の数により番号づける（染色体5, WWW.genome.ucsc.edu 上での2003年７月でのヒトゲノムアセンブリー上で塩基1306027）。例えば、Padmanabhan et al., (2006), Journal of Nuclear Medicine, 47(2) 270-277を参照のこと。
次に、増幅されたフラグメントを、プロモーターを欠くpGL4.ll [luc2P]ベクター（Promega, Madison, WI）においてluc2P ORFに5’側でサブクローン化する。次に、例１に記載されるように、完全なtert-luc2レポーターカセットをPCR増幅し、pMXレトロウィルスベクターにサブクローン化し、配列決定により確認し、そしてPlat-A細胞にパッケージングし（Morita et al, (2000), Gene Therapy, 7(12): 1063-1066を参照のこと）、Tert-lucレポーター（“TLR”）自己指向性レトロウィルスを生成する。
細胞培養、ウィルス感染及びsiRNAトランスフェクション：
10mlの培地中、成人又は新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞（Lonza）の６×105個の細胞と、104個の細胞/cm2の密度で、10cmの直径の細胞培養プレートに、FBM培地と共にプレートする。成人又は新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞（Lonza）を、皿当たり10mlの培地において、104個の細胞/cm2の密度で10cmの直径の細胞培養プレートにFBM培地と共にプレートする。ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。18時間後、細胞を、５のMOIでmCAT1アデノウィルスベクター（例２に記載される）を含む3mlのFBM培地又はハンクス溶液と共に、時折振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。その後、12mlの完全FBM培地を個々の皿に添加し、そして細胞を48時間、培養した。
48時間後、培地を除去し、そしてTLRレトロウィルス、及び上記のようにして調製されたOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycのいずれか３種コードするレトロウィルスの混合物を添加し、3mlの培地中、約10〜50のm.o.i.での個々のウィルスを皿当たり添加し、そして感染を室温で30分間、続ける。その後、12mlのFBM培地を添加し、そしてプレートを37℃でインキュベートする。TLRレトロウィルス、及びOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycのいずれか３種をコードするレトロウィルスの添加の24時間後、細胞を、ウェル当たり25又は100μlの培地において、104個の細胞/cm2の密度で、マトリゲル（20g/cm2）により被覆された384又は96ウェル細胞培養プレートにおいてFBM培地と共にプレートする。得られる細胞を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。
24時間後、個々のウェルの培地を、個々のsiRNA（“試験siRNAウェル”）について50nMの最終濃度で、ヒト遺伝子標的物に対する４個のsiRNAと共に、その製造業者のプロトコールに従って混合された、抗生物質フリーのOpti-MEM（商標）I Reduced Serum培地(Invitrogen)、 LipofectamineTM-RNAiMax トランスフェクション試薬(Invitrogen)を含む混合物50又は200μl（それぞれ384又は96ウェルのための）により置換する。従って、合計約25,000個の標的物ヒト遺伝子（すなわちすべてではないが、ほとんどの発現された配列）に対するsiRNAを、アッセイにおいて試験する。アッセイにおける“負の対照”として、上記のようなトランスダクションされた細胞の20のウェル（“負の対照ウェル”）を、20組のスクランブルドsiRNA（ベクター又は哺乳類配列に対する相同性の欠乏について調べられている）によりトランスフェクトする。
TLR及びsiRNA−処理された線維芽細胞のルシフェラーゼアッセイ：
48時間後、細胞溶解物を個々のウェルから調製し、そしてルシフェラーゼ活性を、Berthold-Lumat B9501 luminometer (Berthold-Lumat, St Albans, Herts, UK)を用いて、Ad−Nanog−luc−感染された細胞におけるnanogプロモーター活性の尺度として、ルシフェリン及びATP（Sigma, St, Louis, MO）の存在下で測定する。試験siRNAウェルの個々からのルシフェラーゼ活性を、負の対照ウェルについて測定された平均ルシフェラーゼ活性と比較する。siRNAウェルが負の平均対照ウェル値よりも有意に高いルシフェラーゼ活性を有することが決定される場合、その対応するsiRNA配列（“候補体誘発siRNA”）が二次スクリーンにおいて試験される。
二次スクリーン：
１つの二次スクリーンにおいては、細胞を、上記と同じ細胞培養条件を用いて、48ウェル形にプレートする。24時間後、ウェルを、一次スクリーンにおいて同定された候補体誘発siRNA（標的遺伝子当たりn=10）によりトランスフェクトするが、しかし48ウェル培養形に関しては体積が調節される。次に、細胞を、さらに72時間、培養する。その後、培地を除き、細胞をハンクス溶液により洗浄し、そしてCyP26al mRNAのレベルをqRT-PCRにより決定する。
例21．qRT-PCRを用いてサブセットの誘発因子と組合しての多能性を誘発するsiRNA（“誘発siRNA”）を同定するためのアッセイ（予測例）：
完全なヒトゲノムsiRNAライブラリーを、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycから選択された３種の誘発因子のサブセットと組合して使用される場合、ヒト成人線維芽細胞集団において多能性を誘発するか、又は多能性の誘発を高める能力を有するsiRNAを同定するために一次スクリーンに使用される。
前記スクリーンは、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycから選択された３種の誘発因子のサブセットの誘発活性を補足することができる候補体siRNAを同定するためにiPS-マーカー遺伝子Tertの発現を検出するためのqRT-PCRアッセイを使用する。例えば、試験siRNAは、ミッションがSox2活性を補足するsiRNAを同定するためにOct3/4、Klf4及びc-Mycと組合して使用され得る。二次スクリーンにおいては、候補体誘発siRNAを、同じアッセイにおいて再び試験し、そしてもう１つのiPS-マーカー遺伝子Cyp26A1の発現をまた、試験された細胞においてアッセイする。
細胞培養、ウィルス感染及びsiRNAトランスフェクション：
成人又は新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞（Lonza）を、皿当たり10mlの培地中、104個の細胞/cm2の密度で、10cmの直径の細胞培養プレートに、FBM培地と共にプレートする。ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。18時間後、細胞を、１〜５のMOIでmCAT1アデノウィルスベクター（例２に記載される）を含む3mlのFBM培地又はハンクス溶液と共に、時折振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。その後、12mlの完全FBM培地を個々の皿に添加し、そして細胞を48時間、培養した。
48時間後、培地を除去し、そしてTLRレトロウィルス、及び上記のようにして調製されたOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycのいずれか３種コードするレトロウィルスの混合物に添加し、3mlの培地中、約10〜50のm.o.i.での個々のウィルスを皿当たり添加し、そして感染を室温で30分間、続ける。その後、12mlのFBM培地を添加し、そしてプレートを37℃でインキュベートする。TLRレトロウィルス、及びOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycのいずれか３種をコードするレトロウィルスの添加の24時間後、細胞を、ウェル当たり25又は100μlの培地において、104個の細胞/cm2の密度で、マトリゲル（20g/cm2）により被覆された384又は96ウェル細胞培養プレートにおいてFBM培地と共にプレートする。得られる細胞を、FGM-2 SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。
24時間後、個々のウェルの培地を、個々のsiRNA（“試験siRNAウェル”）について50nMの最終濃度で、ヒト遺伝子標的物に対する４個のsiRNAと共に、その製造業者のプロトコールに従って混合された、抗生物質フリーのOpti-MEM（商標）I Reduced Serum培地(Invitrogen)、 LipofectamineTM-RNAiMax トランスフェクション試薬(Invitrogen)を含む混合物50又は200μl（それぞれ384又は96ウェルのための）により置換する。従って、合計約25,000個の標的物ヒト遺伝子（すなわちすべてではないが、ほとんどの発現された配列）に対するsiRNAを、アッセイにおいて試験する。アッセイにおける“負の対照”として、上記のようなトランスダクションされた細胞の20のウェル（“負の対照ウェル”）を、20組のスクランブルドsiRNA（ベクター又は哺乳類配列に対する相同性の欠乏について調べられている）によりトランスフェクトする。
コロニーからの全RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation キット(Ambionにより製造される)を用いて抽出する。逆転写の後、Tertも又CYP26A1を、Taqman preamp (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて増幅する。次に、即時定量的PCRを、PCRプライマー組TERT、HsOOl62669_ml及びCYP26A1、 HsOOl75627_ml (Applied Biosystemsにより製造される)を用いて、ABI PRISM 7900HT 装置 (Applied Biosystemsから入手可能)により実施する。
siRNAウェルが負の対照レベルに対して高レベルのTert mRNA発現を誘発することが決定される場合、その対応するsiRNA配列（“候補体誘発siRNa”）が二次スクリーンにおいて試験される。
二次のスクリーン:
１つの二次スクリーンにおいては、細胞を、上記と同じ細胞培養条件を用いて、48ウェル形にプレートする。24時間後、ウェルを、一次スクリーンにおいて同定された候補体誘発siRNA（標的遺伝子当たりn=10）によりトランスフェクトするが、しかし48ウェル培養形に関しては体積が調節される。次に、細胞を、さらに72時間、培養する。その後、培地を除き、細胞をハンクス溶液により洗浄し、そしてCyP26A1 mRNAのレベルを上記に記載のようにqRT-PCRにより決定する。他の誘発因子と組合して使用される場合、Tert及びCyp26A1の両者の誘発発現として同定される候補体誘発siRNAは、一次スクリーンに使用される誘発因子のその対応するサブセットと組合して使用される場合、それらが実際、多能性を誘発できるかどうかを決定するために、さらに試験される。
例22.少なくとも１つのキメラ性IF-VP16ポリペプチドを含む線維芽細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
誘発プロトコール及びアッセイを、例７に記載のようにして実施するが、しかしキメラ性ヒトSox2-VP16融合ポリペプチドを発現するレトロウィルスが、４種のIFの１つとして、十分な長さのヒトSox2レトロウィルスの代わりに使用される。Sox2-VP16融合ポリペプチドは、Sox2 DNA結合ドメインを含む、ヒトSox2のアミノ酸1-183、及びヘルペスVP16タンパク質（GenBank Accession No. AAA45864）のアミノ酸411-490、すなわちヒトSox2フラグメントのC末端に融合される強いトランス活性化因子ドメイン（例えば、Sadowski et al (1988), Nature, 6;335(6190):563-564を参照のこと）を含んで成る。Sox2-VP16融合タンパク質の配列は下記の通りである：
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRG
QRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKY
RPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMN
GWSNGSYSMMQDQLGYPQHSTTAPITDVSLGDELRLDGEEVDMTPADALDDFDLEM
LGDVESPSPGMTHDPVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG（配列番号16）。
例23.Oct3/4、Sox2及びKlf4のウィルス発現、及びc-Mycのタンパク質トランスダクションの組合せを用いての線維芽細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
Oct3/4、Sox2及びKlf4レトロウィルスによる細胞培養及び感染を、例７に記載のようにして行うが、但し４時間のウィルス感染インキュベーションの後、３種のウィルス含有ポリブレン溶液が、ヒトc-Mycのアミノ酸配列を含んで成る精製されたヒトc-Myc-PTD融合ポリペプチドを含むMC培地により交換される：
配列番号12（ヒトc-Myc）：
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPS
E
DIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDM
V
NQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSS
LYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLH
EE
TPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQH
NYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNE
LK
RSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR
N
SCA
下記アミノ酸配列を有するタンパク質トランスダクションドメインにより、そのN末端で融合される：
YGRKKRRQRRR (配列番号1); RKKRRQRR (配列番号2); YARAAARQARA (配列番号3); THRLPRRRRRR (配列番号4); GGRRARRRRRR (配列番号5); 又は KKKKKKKK(配列番号17)。
c-Myc-PTD融合タンパク質のサブクローニング及び精製を、Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sonsに記載のようにして実質的に実施する。
レトロウィルス感染期間（Oct3/4、Sox2及びKlf4レトロウィルスによる）の後、ポリブレン−ウィルス溶液を除き、そして100nMの濃度で精製されたc-Myc-PTD融合ポリペプチドを含むMC-ES培地2mlにより交換し、そして培養物を、37℃で約３時間インキュベートする。その後、培地を、MC-ES培地により交換し、そして誘発プロトコール及びアッセイを、例７に記載のように続ける。タンパク質トランスダクションによるc-Mycの誘発された発現は、特に外因性遺伝子がゲノム中に組み込まれる場合、例えば、レトロウィルストランスダクションに続いて、外因性c-Myc遺伝子を導入する可能性ある長期の所望しない効果（例えば、細胞形質転換、又は癌を誘発する危険性）を回避する。
例24．Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycのタンパク質トランスダクションを用いての線維芽細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。タンパク質トランスダクションの3日前、線維芽細胞を、６ウェル細胞培養プレート中に、103個の細胞/cm2で接種する。
Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc融合タンパク質のサブクローニング及び精製を、Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sonsに記載のようにして、実質的に実施する。誘発は、培養培地を、下記アミノ酸配列を有するタンパク質トランスダクションドメインにより、それらのN−末端で融合される、Oct 3/4 配列番号6)、Sox2 (配列番号8)、Klf4 (配列番号10)及びc-Myc (配列番号12)の精製された融合タンパク質（それぞれ100nM）を含むMC-ES培地2mlにより交換することにより開始される：
YGRKKRRQRRR (配列番号1); RKKRRQRR (配列番号2); YARAAARQARA (配列番号3); THRLPRRRRRR (配列番号4); GGRRARRRRRR (配列番号5); 又はKXKKKKKK (配列番号17)。
次に細胞を、融合タンパク質と共に37℃で約３時間インキュベートする。その後、培地を、10μMのY−27632により補充されたMC−ES培地により交換する。誘発期間の間、培地を、100nMの個々の融合タンパク質を含むMC-ES培地により毎日１時間にわたって交換し、そして次に、培地を、次の日まで、融合タンパク質を有さないMC−ES培地により交換する。誘発期間の後、アッセイを例７に記載のようにして行い、誘発された多能性幹細胞候補体を同定する。
例25．Oct3/4、Sox2及びKlf4のタンパク質トランスダクション及びHDACインヒビター処理を用いての線維芽細胞からのヒト多能性幹細胞の誘発（予測例）：
ヒト生後皮膚線維芽細胞を、FGM-2SingleQuotsにより補充されたFBMにおいて培養する。タンパク質トランスダクションの3日前、線維芽細胞を、６ウェル細胞培養プレート中に、103個の細胞/cm2で接種する。
Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc融合タンパク質のサブクローニング及び精製を、Becker-Hapak et al., (2003), Curr. Protocols Cell Biol, Unit 20.2, John Wiley & Sonsに記載のようにして、実質的に実施する。誘発は、培養培地を、下記アミノ酸配列を有するタンパク質トランスダクションドメインにより、それらのN−末端で融合される、Oct 3/4 配列番号6)、Sox2 (配列番号8)、及びKlf4 (配列番号10)の精製された融合タンパク質（それぞれ100nM）を含むMC-ES培地2mlにより交換することにより開始される：
YGRKKRRQRRR (配列番号1); RKKRRQRR (配列番号2); YARAAARQARA (配列番号3); THRLPRRRRRR (配列番号4); GGRRARRRRRR (配列番号5); 又はKKKKKKKK (配列番号17)。
次に細胞を、融合タンパク質と共に37℃で約３時間インキュベートする。その後、培地を、10μMのY−27632により補充されたMC-ES培地により交換し、次に、1μMの最終濃度でのヒストンデアセチラーゼインヒビターMS-275及び10μMのY−27632のRhoキナーゼインヒビターにより補充されたMC-ES培地により交換する。続く誘発期間の間、培地を、それぞれ100nMの融合タンパク質を含むMC-ES培地により、１時間にわたって毎日交換し、そして次に培地を、誘発期間の最後まで（誘発の開始後、約14日）、10μMのY−27632を含む、融合タンパク質フリーのMC−ES培地により交換する。誘発期間の後、アッセイを例７に記載のようにして実施し、誘発された多能性幹細胞候補体を同定する。
例26．レトロウィルストランスダクションによる３又は４種の外因性遺伝子の誘発された発現によるマウス多能性幹細胞の誘発：
マウス胚線維芽細胞（MEF）を、12ウェルプレートにプレートし、MEF培地（10％FBS及びゲンタマイシンにより補充されたDMEM）に、5000個の細胞/cm2の密度で接種し、そして一晩（約16時間）、培養した。次に細胞を、1mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液においてインキュベートした。そのレトロウィルス/ポリブレン溶液は、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 又はc-Myc）；３種の因子（前記４種の因子−Oct3/4、 Sox2、 Klf4 又はc-Mycのいずれか）；又は２種の因子（Oct3/4及びSox2）のいずれかをコードする個々のレトロウィルスベクター0.25mlの混合物（5μg/mlのポリブレンにより補充される）を含んだ。２又は３種の遺伝子のトランスダクションに関しては、培養培地をウィルス担持の溶液に1mlまで添加した。細胞を、調製された個々のウィルスにより、37℃で感染せしめた。“Oct4a”は、“Oct3/4”に等しい。次の日、マウスES培地により交換した。培地は２〜３日ごとに交換された。
ウィルストランスダクションの約12日後、コロニーをアルカリホスファターゼ（ALP）染色にゆだね、そしてクローン化されたコロニー由来の細胞を青紫に染色した。ALP陽性コロニーの数を、図28により示されるようにして、記録した。ALP−陽性コロニーを、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）；３種の因子のいずれかの組合せ；及び２種の因子（Oct3/4及びSox2）を受けたサンプルにおいて観察した。
例27．マウス由来の神経幹細胞中へのレトロウィルストランスダクションによる、２、３又は４種の外因性遺伝子の誘発された発現によるマウス多能性幹細胞の誘発：
成熟マウス−由来の神経幹細胞（NSC）を、前記のようにして（Reynolds et al., 1992）, 生後９週目のC57BL/6マウス（Oriental Yeast, Tokyo, Japan）の副脳室領域から単離した。手短には、成熟マウス脳を、トリプシン消化により単一細胞に解離し、そして細胞を、100 lg/mlのヒトトランスフェリン（Sigma）、20nMのプロゲステロン（Sigma）、100 lMのプトレッシン（Sigma）、30nMの亜セレン酸ナトリウム（Sigma）及び5 lg/mlのインスリン（Sigma）を含むダルベッコ変性イーグル培地/ Ham's F- 12培地(DMEM/F12; Invitrogen)に懸濁した。その懸濁された細胞を、組織培養皿にプレートした。
細胞を、NSC培地（100 lg/mlのヒトトランスフェリン、20nMのプロゲステロン、100 lMのプトレッシン、30nMの亜セレン酸ナトリウム、5 lg/mlのインスリン、20ng/mlのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；Sigma）、及び20ng/ml表皮成長因子（EGF；Sigma）を含むDMEM/F12）において浮動性神経球体として、それらを培養することにより、末分化増殖状態で維持した。NSCを、感染の1日前、Ornitin/Lamin被覆された12ウェル細胞培養プレート上で単層として、104個の細胞/cm2で接種し、そして1mlのNSC培地において培養した。一晩後、細胞を、1mlのレトロウィルス/ポリブレン容液においてインキュベートした。
レトロウィルス/ポリブレン溶液は、４種の因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 及び c-Myc）；３種の因子（４種の因子−Sox2又はc-Myc）；又は5μg/mlのポリブレンにより補充された２つの因子（Oct3/4及びKlf4）のいずれかをコードする個々のレトロウィルスベクター0.25mlの混合物を含んだ。２又は３種の遺伝子トランスダクションに関しては、培養培地を、ウィルス担持溶液に1mlまで添加した。細胞を37℃で感染した。次に、ウィルス上清液を、次の日、マウスES培地により交換した。培地を２〜３日ごとに交換した。
ウィルストランスダクションの約12日後、コロニーをアルカリホスファターゼ（ALP）染色にゆだね、そしてクローン化されたコロニー由来の細胞を青紫に染色した。ALP陽性コロニーの数を、図28により示されるようにして、記録した。ALP−陽性コロニーを、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）；３種の因子のいずれかの組合せ；及び２種の因子（Oct3/4及びSox2）（図29に示すような）を受けたサンプルにおいて観察した。
例28．レトロウィルストランスダクションによる３又は４種の外因性遺伝子の誘発された発現によるマウス多能性幹細胞の誘発：
成熟マウス由来の骨髄細胞（Losac）を、図4に関連する例５に記載されるのと同じ方法を用いて入手した。レトロウィルストランスダクションの1日前、細胞を６ウェル培養プレートに104個の細胞/cm2で接種し；そして2mlの低血清培地において培養した。一晩後、細胞を2mlのレトロウィルス/ポリブレン溶液（４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）；３種の因子（４種の因子−Sox2、Oct3/4、Klf4 又はc-Myc）のいずれかをコードする個々のレトロウィルスベクター0.5mlの混合物（5μg/mlのポリブレンにより補充された）においてインキュベートした。ウィルス上清液を次の日、マウスES培地により交換した。その時点で、いくつかのサンプルをまた、10ng/mlのFGF又は0.1μMのMS−275のいずれかにより、３日間、処理した。次の日、培地をマウスES培地により交換し、そしてその後、２〜３日ごとに交換した。
ウィルストランスダクションの約９又は15日後、コロニーをアルカリホスファターゼ（ALP）染色にゆだね、そしてクローン化されたコロニー由来の細胞を青紫に染色した。ALP陽性コロニーの数を、図30により示されるようにして、記録した。15日目に分析されたサンプルのうち、ALP−陽性コロニーを、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）を受けたサンプル及び４種の因子−c-Myc、Oct3/4又はKlf4のいずれかを受けたサンプルにおいて観察した。
ALP−陽性コロニーはまた、ウィルストランスダクションの９日後に分析された４種−遺伝子トランスダクションサンプルにおいて観察されたが、しかしその数は、15日での４種の遺伝子トランスダクションサンプルにおいて観察されたコロニーの数よりも少なかった。９日での４種−遺伝子トランスダクションサンプルにおいては、より多くのコロニーが、MS−275に暴露されなかったサンプルに比較して、MS-275に暴露されたサンプルにおいて観察された。
例29．レトロウィルストランスダクションによる２又は４種の外因性遺伝子の誘発された発現によるマウス多能性幹細胞の誘発：
成熟マウス由来の骨髄細胞（Losac）を、図4に関連する例５に記載されるのと同じ方法を用いて入手した。レトロウィルストランスダクションを、例30に記載される方法に従って実施した。しかしながら、この実験においては、レトロウィルス/ポリブレン溶液は、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）；又は２種の因子の異なった組合せ（図31に示すような）のいずれかをコードするレトロウィルスベクターの等体積の混合物を含んだ。
ウィルストランスダクションの約15日後、コロニーをアルカリホスファターゼ（ALP）染色にゆだね、そしてクローン化されたコロニー由来の細胞を青紫に染色した。ALP陽性コロニーの数を、図31により示されるようにして、記録した。ALP−陽性コロニーを、４種の因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4 及びc-Myc）を受けたサンプル及びSox2、及びc-Mycの組み合わせを受けたサンプルにおいて観察した。
例30．iPS細胞対ヒトES細胞系及び親線維細胞における全体的遺伝子発現差異の分析：
それぞれ、例14, 16及び17に記載のようにして、iPS細胞系、1−8、2−4及び3−2について得られた全体的遺伝子発現データ（GEO受託番号GSE9709）を、次のヒトES細胞（hES細胞）系についての全体的遺伝子発現データに比較した：MEF上で培養されたSheff4；マトリゲル上で培養されたSheff4及びMEF上で培養されたH14系；及びiPS系親線維芽細胞。遺伝子発現データを、（１）hES細胞系においてよりもiPS細胞系において有意に高いレベルで発現される；（２）iPS細胞系においてよりもhES細胞系において有意に高レベルで発現される；（３）hES細胞系及び親線維芽細胞においてよりもiPS細胞系において有意に高いレベルで発現される；そして（４）hES細胞系においてよりもiPS細胞系において有意に高いレベルで発現されるが、しかし親線維芽細胞においてよりも有意に高いレベルでは発現されなかった遺伝子を同定するために比較した。データは、p≦0.01のカットオフを伴って、スチューデントｔ−検定により比較された。その結果は、表13−16に示される。
表13は、hES細胞系においてよりもiPS細胞系において５倍又はそれ以上高いレベルで発現される遺伝子の列挙を示す（p≦0.01）。表14は、iPS細胞系においてよりもhES細胞系において２倍又はそれ以上高いレベルで発現される遺伝子の列挙を示す（p≦0.01）。表15は、hES細胞系及び親線維芽細胞の両者においてよりもiPS細胞系において５倍又はそれ以上高いレベルで発現される遺伝子の列挙を示す（p≦0.01）。表16は、hES細胞系においてよりもiPS細胞系において５倍又はそれ以上高いレベルで発現されるが、親線維芽細胞においてよりも有意に高いレベルでは発現されなかった遺伝子の列挙を示す（p≦0.05）。
それらの結果は、例14に記載されるように、iPS細胞系とhES細胞系との間の全体的遺伝子発現における全体的類似性にもかかわらず、iPSはhES細胞系に関して有意な遺伝子発現差異を示すことを示唆した。
例31. Oct3/4ポリペプチドアミノ酸配列変異体（予測例）：
表17（ヒトOct3/4のPMUT分析）に基づいて、次のOct3/4アミノ酸配列変異体のいずれかが特定部位の突然変異誘発により生成され、そして前述の例に記載されるように、多分化能性又は多能性幹細胞を誘発するために、Sox2ポリペプチド及びKlf4ポリペプチド、又はSox2、Klf4及びc-Mycポリペプチドに関して使用される。
次のアミノ酸置換対を伴っての配列番号６のアミノ酸配列：Oct3/4変異体2AA-1（H4→N 及びF9→I); Oct3/4変異体2AA-2 (Pl5→M及びGl8→L)及びOct3/4変異体2AA-3 (I60→F 及び L84→V)。
次の10のアミノ酸置換組を伴っての配列番号６のアミノ酸配列（Oct3/4変異体10AA）：H4→N、F9→I、 P15→M、 G18→L、 I60→F、 L84→V、P62→S、VIOl→I、 G109→I及び Pl12→I。
次の20のアミノ酸置換組を伴っての配列番号６のアミノ酸配列（Oct3/4変異体20AA）：H4→N、 F9→I、P15→M、G18→L、I60→F、P62→S、Q79→D、L84→V、V1Ol→I、G109→I、 Pl12→I、G161→L、D166→E、 L169→I、V173→F、F175→A、E215→D、E219→D、A223→M、 V227→F。
次の25のアミノ酸置換組を伴っての配列番号６のアミノ酸配列（Oct3/4変異体25AA）：H4→N、F9→I、 P15→M、 G18→L、 V51→I、 I60→F、 P62→S、 C63→S、 Y67→F、 Q79→D、 L84→V、 L90→M、 Q94→D、V101→I、 G109→I、 P112→I、 G161→L、 D166→E、 L169→I、 V173→F、 F175→A、 E215→D、 E219→D、 A223→M、 V227→F。
表１は、遺伝子名称、NCBI番号、前記遺伝子が挿入されたウィルスベクター、挿入体サイズ、5’末端での制限部位、3’末端での制限部位、翻訳された領域の長さ、3’末翻訳領域の長さ、クローンID、及び例に使用される、４種の遺伝子又は３種の遺伝子及びマウス自己指向性レトロウィルスベクター（mCAT：マウス由来のカチオン性アミノ酸トランスポーター）の供給業者を示す。
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表２は、例４〜７のアルカリホスファターゼ陽性コロニーの数を要約する。細胞型に関しては、サブカルチャーの数が付随されている。４種の遺伝子導入の日は、レトロウィルスベクターが感染された日である。ロット番号は、Lonza製品のロット番号である。ドナーの年齢は、Lonza製品のドナー情報に基づかれる。コロニーの数は、10cm2当たりアルカリホスファターゼ陽性小細胞から構成されるコロニーの数である。
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表３は、101日でのクローン１−８の核型の分布を要約する。ギームザ株、すなわち染色体数が計数された。キエムサ（Giemsa）染色の後、100の細胞のうち67が正常な核型を示した。
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表４は、図７及び15で使用されるプライマー配列を示す。
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表５は、GeneChip Human Mapping 500K Array Setを用いて分析された、ヒトiPSクローン1−8及び線維芽細胞（5F0438及び5F04156）のSNP遺伝子型決定を要約する。クローン1−8のSNPは、467,946のSNPのうち464,069（99.17%）で親細胞のそれと一致し、そしてそれらの3,877(0.83%)で親細胞のそれとは異なった。対照的に、クローン1−8mTeSRのSNPは、470,960のSNPのうち284,950（60.50%）においてのみ無関係のドナー細胞（5F0416）のそれと一致し、そしてそれらの186,010（39.50%）で無関係の細胞のそれとは異なった。
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表６は、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（SSOP）（Luminex）とのPCR−増幅されたDNAのハイブリダイゼーションを用いて、分類された、ヒトiPS1-8(1-8mTeSR)、iPS2-4(mTeSR)及びiPS3-2(mTeSR)；及び線維芽細胞（5F0438及び5F0436）のHLA-A、HLA-B、HLA-Cw及びHLA-DR型を示す。
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表７及び表８は、コロニーにおけるhES細胞マーカー遺伝子発現パターンを要約した。コロニーは、４種の遺伝子トランスダクションの17日後でのアルカリホスファターゼについて染色された。すべてのALP（＋）コロニー及び18のALP（−）コロニーが分離され、そしてRT-PCRによるそれらのhESマーカー遺伝子発現を決定された。個々のコロニーが分類され、そして計数された。“＋”は遺伝子発現を表し、そして“−”は増幅されたcDNAサンプルを用いて40サイクルのRT−PCRにより検出されなかったことを表す。
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表9は、新生児線維芽細胞を用いての実験のアルカリホスファターゼ陽性コロニーの数を要約する。４種の遺伝子導入の日は、レトロウィルスベクターが感染された日である。ドナーは、Lonza製品のロット番号を示す。コロニーの数は、10cm2当たりのアルカリホスファターゼ陽性小細胞から構成されるコロニーの数である。ND：決定されなかった。
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表10は、Nanog及びOct3/4のプロモーター領域のメチル化分析のために使用するアンプリコンに対応するゲノムの位置及びサイズを列挙する。縦列A、B及びCは、それぞれアンプリコン名称、アンプリコンに対するゲノムの位置及びサイズを示す。
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表11は、Nanog及びOct3/4のプロモーター領域のメチル化分析のために使用するプライマー組を列挙する。縦列A及びBはそれぞれプライマーの名称及びプライマーの配列（遺伝子特異的配列：大文字、標識配列：小文字）を列挙する。
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表12及び表13は、例15のALP陽性コロニーにおける相対的mRNA発現を要約する。コロニーの数は、図16−23に対応する。コロニー#5-2-32、 #5-2-49、#5-2-51、 #7-2-37は、すべての分析されたヒトES細胞マーカーを発現した。対照的に、線維芽細胞コロニー#3-1-212、 #3-1-215、#5-1-4は、それはトランスジーンを高く発現したが、Nanogのみを発現した。
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表14は、クローン2-4及び3-2における相対的mRNA発現を要約する。全RNAがクローン2-4及び3-2から抽出された。ES細胞マーカー遺伝子の発現は、例16及び17に記載のようにして、qRT-PCRにより決定された。クローン2-4及び3-2の両者は、ES細胞マーカー遺伝子発現を示した。すべての発現値は、ヒトiPSクローン-1-8（94日）に対して標準化された。
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好ましい態様が本明細書において記載されてきたが、そのような態様は単なる例により提供される。多くの変動、変更及び置換は可能である。本明細書に記載される方法及び組成物の態様に代わる種々の手段が本発明の実施に使用され得ることは理解されるべきである。次の請求項は本発明の範囲を定義し、そしてそれらの請求項の範囲内の方法及び組成物、及びそれらの同等物はそれにより保護されることが意図される。

Claims (5)

  1. 多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の工程：
    （ａ）Oct3/4、Sox2およびKlf4の3種の遺伝子を含む誘発因子を体細胞に導入する工程、および
    （ｂ）工程（ａ）において誘発因子が導入された体細胞をヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビターおよび／またはROCKインヒビターと接触させる工程
    を含む方法。
  2. 前記誘発因子が、さらにc-Mycを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記体細胞がヒト由来である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記HDACインヒビターが、MS-275、バルプロエート（VPA）、酪酸ナトリウムおよびトリコスタチンA（TSA）から成る群より選択される少なくとも一つの薬剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ROCKインヒビターが、Y-27632および／またはHA1077である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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