JP6433902B2 - 初期化幹細胞 - Google Patents
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Description
[1] 外来性の初期化遺伝子が導入され、該外来性の初期化遺伝子の全てが後天的な発現抑制を受けていない自己複製可能な培養細胞であって、前記初期化遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子およびKlfファミリー遺伝子から成る群から選択される1以上の遺伝子である前記細胞。
[2] 前記初期化遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子およびKlfファミリー遺伝子である、[1]に記載の細胞。
[3] 前記Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、前記Soxファミリー遺伝子がSox2であり、前記Mycファミリー遺伝子がc-Mycであり、および前記Klfファミリー遺伝子がKlf4である、[1]または[2]に記載の細胞。
[4] 前記初期化遺伝子が、染色体に組み込まれている、[1]から[3]のいずれかに記載の細胞。
[5] 内在性のOct3/4が発現しておらず、NANOG、ZEB1およびZEB2が発現している、[1]から[4]のいずれかに記載の細胞。
[6] 高密度培養により外来性の初期化遺伝子の発現が抑制される、[1]から[5]のいずれかに記載の細胞。
[7] 高密度培養により内在性Oct3/4の発現が増大する、[1]から[6]のいずれかに記載の細胞。
[8] 高密度培養によりヒストンH3の9番目のリジンのトリメチル化が亢進する、[1]から[7]のいずれかに記載の細胞。
[9] (1)体細胞へ初期化遺伝子を導入する工程、および、
(2)該外来性の初期化遺伝子の全てが発現抑制を受けていない細胞を選択する工程
を含む自己複製可能な培養細胞の製造方法であって、前記初期化遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子およびKlfファミリー遺伝子から成る群から選択される1以上の遺伝子である前記方法。
[10] 前記初期化遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子およびKlfファミリー遺伝子である、[9]に記載の方法。
[11] 前記Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、前記Soxファミリー遺伝子がSox2であり、前記Mycファミリー遺伝子がc-Mycであり、および前記Klfファミリー遺伝子がKlf4である、[9]または[10]に記載の方法。
[12] 前記初期化遺伝子をレトロウィルスで導入する、[9]から[11]のいずれかに記載の方法。
[13] 前記細胞が、内在性のOct3/4が発現しておらず、NANOG、ZEB1およびZEB2が発現している細胞である、[9]から[12]のいずれかに記載の方法。
[14] [1]から[8]のいずれかに記載された培養細胞を高密度培養する工程を含む、多能性幹細胞を製造する方法。
[15] 前記高密度培養が1.5×105個/cm2以上の細胞密度で行われる、[14]に記載の方法。
[16] 前記多能性幹細胞では外来性遺伝子の発現が抑制されている、[14]または[15]に記載の方法。
[17] 前記高密度培養時に、mTOR活性化剤が添加された培地を用いる、[14]から[16]のいずれかに記載の方法。
[18] mTOR活性化剤がVPAである、[17]に記載の方法。
[19] [1]から[8]のいずれかに記載された培養細胞をGSK3β阻害剤が添加された培地で培養する工程を含む、神経幹細胞を製造する方法。
[20] 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[19]に記載の方法。
[21] 前記培地へさらにMEK阻害剤を添加する、[19]または[20]に記載の方法。
[22] 前記MEK阻害剤がPD0325901である、[21]に記載の方法。
上記の方法で得られたiRS細胞は、自己複製により増殖が行われ、導入した初期化遺伝子が継代培養を継続後にも発現が抑制されないことによって特徴づけられる。さらに、iRS細胞は、特異的なマーカー遺伝子の発現の有無によっても特徴づけられる。例えば、内在性のOct3/4、Klf4、c-Myc、TDGF1、Rex1、E-cadherin(ECAD)およびEPCAMから選択されるマーカー遺伝子の発現が、ES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞と比較して有意に低い、または発現が無い細胞、ならびにNanog、ZEB1およびZEB2から選択されるマーカー遺伝子を発現している細胞、好ましくは、Nanogの発現が体細胞よりも有意に高く、ZEB1および/またはZEB2の発現が多能性幹細胞よりも有意に高い細胞をiRS細胞とする。より好ましくは、iRS細胞は、内在性のOct3/4を発現しておらず、かつNanog、ZEB1およびZEB2を発現している細胞であり、さらに好ましくは、Nanogを多能性幹細胞と同等に発現し、かつZEB1およびZEB2を体細胞と同等に発現する細胞である。この他にも、ヒストンH3の4番目のリジン(H3K4)のモノメチル化(H3K4me1)、ジメチル化(H3K4me2)およびトリメチル化(H3K4me3)、ヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のモノメチル化(H3K9me1)、ジメチル化(H3K9me2)、トリメチル化(H3K9me3)およびアセチル化(H3K9Ac)、ヒストンH3の14番目のリジン(H3K14)のアセチル化(H3K14Ac)、ヒストンH3の27番目のリジン(H3K27)のモノメチル化(H3K27me1)、ジメチル化(H3K27me2)およびトリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3の36番目のリジン(H3K36)のモノメチル化(H3K36me1)、ジメチル化(H3K36me2)およびトリメチル化(H3K36me3)、ヒストンH4の8番目のリジン(H4K8)のアセチル化(H4K8Ac)ならびにヒストンH4の20番目のリジン(H4K20)のモノメチル化(H4K20me1)が、多能性幹細胞に比べて有意に低い、または当該修飾が無い細胞をiRS細胞とすることができる。
本発明において、マーカー遺伝子の発現の検定は、核酸増幅法によってRNA量を測定することによって行われてもよく、特異的抗体を用いてその翻訳産物量を特定することによって行われてもよい。
上記の方法で得られたiRS細胞は、高密度培養することで、多能性幹細胞へ変換することができる。ここで多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能をも併せもつ幹細胞である。
上記の方法で得られたiRS細胞は、GSK3β阻害剤を添加された培地で培養することで、神経幹細胞へ変換することができる。
本発明は、iRS細胞を作製するためのキットを提供する。本キットには、上述した初期化遺伝子、遺伝子導入試薬、化合物、培養液、解離溶液および培養容器のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
<Intermediately Reprogrammed Stem (iRS)細胞の製造>
OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC(Takahashi K, et al, Cell. 131, 861-872, 2007)およびDsRed(Okita K, et al, Nature. 448, 313-317, 2007)をレトロウィルスを用いてヒト線維芽細胞TIG1(Ohashi, M, et al, Exp. Gerontol., 15, 539-549, 1980)へ導入した。続いて、遺伝子を導入したTIG1(1×105個)を3cmディッシュ中へ播種した。この時、4.0×105個のMEF をフィーダー細胞として用い、培地は、10%FBSを含有するMEMを用いた。4日間培養後、細胞を0.25%トリプシン/EDTA 溶液を用いて剥離し、10cmディッシュへ遺伝子導入したTIG1(5×104個)を播種した。この時、2.5×106個のMEF をフィーダー細胞として用い、培地は、10%FBSを含有するMEMを用いた。
<iRS細胞の培養>
上記の方法で得られたiRS細胞は、2.5×105個をマトリゲルコートした3cmディッシュ上でMEF馴化培地中で培養し、2日おきに0.25%トリプシン/EDTA 溶液を用いて細胞を剥離し継代を行った。この時、培地交換は毎日行った。
iRS細胞についてマイクロアレイを用いて遺伝子解析を行い、ヒトiPS細胞(201B7株、京都大学より入手)、ヒトES細胞(京都大学より入手)およびTIG1と共にクラスター解析を行ったところ、iRS細胞の遺伝子発現プロファイルは、ヒトiPS細胞やES細胞のそれとは異なるものであり、さらに、TIG1とも異なるものあった(図2A)。さらに、PCRを用いてOCT4、SOX2、KLF4およびc-MYC(以上は、外来性および内在性のそれぞれを検出した)、ならびにNANOG、TDF1、REX1、E-cadherin(ECAD)、EPCAM、ZEB1、ZEB2およびSLUGの発現を検出した。その結果を図2Bに示す。
<iRS細胞から多能性細胞の作製>
iRS細胞をマトリゲルコートした3cmディッシュへ高密度培養(1×106個)で播種し、MEF馴化培地中で培養を継続すると3日目よりDsRed陰性の細胞が散見され、6日目にはDsRed陰性の細胞塊が確認できた。10日目にはES細胞様コロニーが確認できた(図3A)。この時の外来性のOCT4およびSOX2の発現量を定量PCRで確認したところ、高密度培養から6日目で、外来性の遺伝子の発現はなくなり、以後、再発現することはなかった(図3B)。さらに、内在性のOCT4、TDGF1およびECADの発現量を定量PCRで確認したところ、これらの多能性マーカー遺伝子の発現が確認された(図3C)。同様に、他の多能性マーカー遺伝子のmRNAの発現量をヒートマップで確認したところ、6日目と10日目にはほぼ同様の遺伝子発現プロファイルであることが確認された(図3D)。さらに、多能性を示す表面抗原マーカーであるSSEA4およびECADに対して、免疫染色法により検査したところ、6日目からいずれの表面抗原も認識することができた(図3E)。以上より、iRS細胞を高密度培養行うことで、多能性細胞へと変換することが可能であった。
iRS細胞をマトリゲルコートした3cmディッシュへ高密度培養(1×106個)で播種し、MEF馴化培地へ0.5mMのVPAを添加し培養を継続したところ播種後6日目でのDsRedが陰性である細胞への変換率が格段に高くなった(図4A)。一方、20nMのラパマイシンを培地へ添加したところ、DsRed陰性の細胞は現れなかった(図4A)。この時のmTORのリン酸化を測定したところ、VPA添加ではリン酸化mTOR(p-mTOR)の量が増大し、ラパマイシン添加では減少していた(図4B)。以上より、iRS細胞から多能性細胞への変換にはmTORシグナル伝達が重要な役割を果たしていることが確認された。従って、mTORシグナル伝達を亢進する低分子化合物(例えば、VPA)はiRS細胞から多能性細胞への変換に有用であることが示唆された。
iRS細胞をマトリゲルコートした3cmディッシュへ高密度培養(1×106個)で播種し、MEF馴化培地中で培養を継続した後、1日目、3日目および6日目の各ヒストンのメチル化およびアセチル化について免疫染色法により調べた。その結果を図5および6に示す。高密度培養1日目のiRS細胞においては調べたヒストンの修飾についてはほとんど陰性であったが、3日目にはヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のトリメチル化(H3K9me3)(図6A)、H3K27のトリメチル化(H3K27me3)、H3K27のアセチル化(H3K27Ac)(図6B)およびH3K36のジメチル化(H3K36me2)(図6C)が亢進することが確認された。さらに、6日目には、先ほどの修飾に加えてH3K4のモノメチル化(H3K4me1)、ジメチル化(H3K4me2)およびトリメチル化(H3K4me3)、H3K9のアセチル化(H3K9Ac)、H3K14のアセチル化(H3K14Ac)、H3K36のトリメチル化(H3K36me3)、ヒストンH4(H4)のK8のアセチル化(H4K8Ac)およびH4K20のモノメチル化(H4K20me1)が亢進することが確認された(図5)。以上より、iRS細胞は、高密度培養することによりヒストンの修飾が変化することで多能性を獲得することが確認された。
<iRS細胞から神経幹細胞の作製>
iRS細胞をマトリゲルコートした3cmディッシュへ高密度培養(1×106個)で播種し、N2およびB27を含有するDMEM/F12(N2B27)へ3μMのCHIR99021(GSK3β阻害剤)および0.5μMのPD0325901(MEK阻害剤)を添加した培地に交換して6日間培養後、コロニーピックアップを行ったところ神経幹細胞様の細胞が現れた(図7A)。この神経幹細胞様の細胞を継続培養後、免疫染色でTUJ1(ニューロンマーカー遺伝子)、O4(オリゴデンドロサイトマーカー遺伝子)およびGFAP(アストロサイトマーカー遺伝子)に対する抗体で染色したところ、これらのマーカー遺伝子が陽性である細胞が確認された。従って、神経幹細胞様の細胞は、各神経系の細胞への分化能を有する神経幹細胞であることが確認された(図7B)。即ち、iRS細胞をGSK3β阻害剤およびMEK阻害剤を添加した培地中で培養することによって神経幹細胞へと誘導できることが確認された。さらに、GSK3β阻害剤のみでも同様のことが確認された(図7C)。以上より、iRS細胞を少なくともGSK3β阻害剤を添加した培地で培養することで神経幹細胞を誘導できることが確認された。
Claims (13)
- 外来性の初期化遺伝子が導入され、該外来性の初期化遺伝子の全てが後天的な発現抑制を受けていない自己複製可能な培養細胞であって、前記初期化遺伝子が、Oct3/4、Oct1、Oct2、Oct5およびOct6から成る群から選択されるOctファミリー遺伝子、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15およびSox17から成る群から選択されるSoxファミリー遺伝子、c-Myc、N-MycおよびL-Mycから成る群から選択されるMycファミリー遺伝子、並びにKlf4、Klf2およびKlf5から成る群から選択されるKlfファミリー遺伝子であり、内在性のOct3/4が発現しておらず、内在性のNANOG、ZEB1およびZEB2が発現している前記細胞を6日間〜10日間、1.5×10 5 個/cm 2 以上の細胞密度で高密度培養する工程を含む、多能性幹細胞を製造する方法。
- 前記多能性幹細胞では外来性遺伝子の発現が抑制されている、請求項1に記載の方法。
- 前記高密度培養時に、mTOR活性化剤を添加された培地を用いる、請求項1または2に記載の方法。
- mTOR活性化剤がVPAである、請求項3に記載の方法。
- 外来性の初期化遺伝子が導入され、該外来性の初期化遺伝子の全てが後天的な発現抑制を受けていない自己複製可能な培養細胞であって、前記初期化遺伝子が、Oct3/4、Oct1、Oct2、Oct5およびOct6から成る群から選択されるOctファミリー遺伝子、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15およびSox17から成る群から選択されるSoxファミリー遺伝子、c-Myc、N-MycおよびL-Mycから成る群から選択されるMycファミリー遺伝子、並びにKlf4、Klf2およびKlf5から成る群から選択されるKlfファミリー遺伝子であり、内在性のOct3/4が発現しておらず、内在性のNANOG、ZEB1およびZEB2が発現している前記細胞をGSK3β阻害剤が添加された培地で、6日間〜10日間、1.5×10 5 個/cm 2 以上の細胞密度で高密度培養する工程を含む、神経幹細胞を製造する方法。
- 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項5に記載の方法。
- 前記培地へさらにMEK阻害剤を添加する、請求項5または6に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がPD0325901である、請求項7に記載の方法。
- 前記Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、前記Soxファミリー遺伝子がSox2であり、前記Mycファミリー遺伝子がc-Mycであり、および前記Klfファミリー遺伝子がKlf4である、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記初期化遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記自己複製可能な培養細胞が、高密度培養により外来性の初期化遺伝子の発現が抑制される細胞である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記自己複製可能な培養細胞が、高密度培養により内在性Oct3/4の発現が増大する細胞である、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記自己複製可能な培養細胞が、高密度培養によりヒストンH3の9番目のリジンのトリメチル化が亢進する細胞である、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
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