KR102232244B1 - Mhy1485 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법 - Google Patents

Mhy1485 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MHY1485 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따라 체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 역분화 인자를 형질도입시킨 후 MHY1485를 처리하였을 경우 유도만능줄기세포로의 역분화 효율이 현저히 상승하므로, 이를 효과적으로 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도에 이용할 수 있다.

Description

MHY1485 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법{A composition for enhancing efficiency of reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells comprising MHY1485 or a derivative thereof and method for enhancing efficiency of reprogramming using the same}
본 발명은 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1) 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 역분화 인자를 형질도입시킨 후 MHY1485를 처리함으로써 유도만능줄기세포로의 역분화 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포 치료제 생산을 위해서는 그 공급원이 되는 줄기세포의 대량 체외 배양이 필수적으로 이루어져야 하고, 안전하면서 경제적이어야 임상에서 세포치료제로 사용될 수 있다. 그러나 현재 인간 전능성 줄기세포의 증식 배양을 위하여 동물유래 지지세포를 사용하거나 동물유래 산물을 포함하고 있는 특수 젤을 도포한 용기에서 배양을 하기 때문에, 이종 단백 오염으로 인한 안전성에 대한 우려가 발생할 수 있다. 또한 고가의 특수 젤을 사용할 경우에 경제적인 면에서 대량생산에 적합하지 않다.
따라서 본 발명자들은 태반 유래 세포 조건화 배지를 이용하여 무동물, 무지지세포를 이용한 전능성 줄기세포 배양 방법을 선행 발명(제10-1395214호) 하였으며 케모카인 수용체인 CXCR2의 기전에 의해서 증식 및 분화 가능함을 선행 발명(제10-1756337호, 제10-1766372호) 하였다.
한편, mTOR(mammalian target of rapamycin)는 지금까지 용량, 시간, 억제 여부 또는 활성화 여부 등 다양한 조건과 방법에 의하여 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화에 영향을 미친다고 알려져 있다. 예를 들어, 역분화인자를 체세포에 도입시키기 전에 오토파지가 증가하면 대규모의 세포 내 재배열이 일어나고, 세포호흡이 감소하면서 절약한 ATP를 역분화 유도에 활용할 수 있다는 것이 기존의 통념이다.
그러나, 어느 조건에서 어떻게 역분화가 억제 또는 활성화되는지에 대하여 아직 명확하게 정의되어 있지는 않다.
본 발명자들은 체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 역분화 인자를 형질도입시킨 후 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1)를 처리하였을 경우 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화(reprogramming) 효율이 현저히 상승하는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 MHY1485 또는 이의 유도체를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 체세포에 MHY1485 또는 이의 유도체를 처리하여 배양하는 배양 단계를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MHY1485 또는 이의 유도체의 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 용도에 관한 것이다.
본 발명은 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1) 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로(induced pluripotent stem cell; iPS)의 역분화(reprogramming) 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 역분화 인자를 형질도입시킨 후 MHY1485를 처리하였을 경우, 유도만능줄기세포로의 역분화 효율이 현저히 상승하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 MHY1485 또는 이의 유도체를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물이다.
상기 MHY1485 또는 이의 유도체의 처리 농도는 0.1 내지 10.0 ug/mL, 0.2 내지 10.0 ug/mL, 0.5 내지 10.0 ug/mL, 0.8 내지 10.0 ug/mL, 0.1 내지 5.0 ug/mL, 0.2 내지 5.0 ug/mL, 0.5 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 5.0 ug/mL, 0.1 내지 5.0 ug/mL, 0.2 내지 5.0 ug/mL, 0.5 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 3.0 ug/mL, 0.1 내지 3.0 ug/mL, 0.2 내지 3.0 ug/mL, 0.5 내지 3.0 ug/mL 또는 0.8 내지 3.0 ug/mL, 예를 들어, 1.0 내지 3.0 ug/mL인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질들은 역분화 인자로서, 체세포로 형질도입되어 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
상기 체세포는 인간 제대정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells; HUVEC), 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts; HDF) 및 인간 태반 유래 세포(Human placenta derived cells; HPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포일 수 있다.
상기 조성물은 CXCR2의 활성화제를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 활성화제는 리간드(ligand)인 것일 수 있으며, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, GRO-α 또는 IL-8일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 인간 태반 유래 세포 조건화 배지(Placenta-derived cells conditioned media; PCCM)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "인간 태반 유래 세포 조건화 배지"란 태반 유래 세포를 젤라틴-코팅된 웰 플레이트상에 접종하고, 세포배양액을 첨가하여 상기 태반 유래 세포를 배양한 후, 배양액만을 수거함으로써 제조된 배지를 의미한다. 인간 태반 유래 지지세포를 사용할 경우, 인간 배아줄기세포의 미분화상태를 유지할 수 있음이 규명됨으로써 그 효용이 대두되고 있다.
구체적으로, 상기 PCCM 배지는 인간 태반 유래 세포를 배양액이 첨가된 세포 성장 배지에서 배양하는 태반 유래 세포 배양 단계; 및 세포 성장 배지로부터 배양액을 수거하는 배양액 수거 단계를 수행함으로써 제공될 수 있고, 상기 배양액은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F-12일 수 있으며, 혈청대체제를 더 포함할 수 있다. PCCM 배지에는 CXCR2의 리간드가 함유되어 있다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법이다:
체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 형질도입하는 체세포 형질변환 단계; 및
상기 형질변환된 체세포에 MHY1485 또는 이의 유도체를 처리하여 배양하는 배양 단계.
상기 MHY1485(CAS Number 326914-06-1) 또는 이의 유도체의 처리 농도는 0.1 내지 10.0 ug/mL, 0.2 내지 10.0 ug/mL, 0.5 내지 10.0 ug/mL, 0.8 내지 10.0 ug/mL, 0.1 내지 5.0 ug/mL, 0.2 내지 5.0 ug/mL, 0.5 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 5.0 ug/mL, 0.1 내지 5.0 ug/mL, 0.2 내지 5.0 ug/mL, 0.5 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 5.0 ug/mL, 0.8 내지 3.0 ug/mL, 0.1 내지 3.0 ug/mL, 0.2 내지 3.0 ug/mL, 0.5 내지 3.0 ug/mL 또는 0.8 내지 3.0 ug/mL, 예를 들어, 1.0 내지 3.0 ug/mL인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 체세포는 인간 제대정맥 내피세포, 인간 섬유아세포 및 인간 태반 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포일 수 있다.
상기 배양 단계는 CXCR2의 활성화제 존재하에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 활성화제는 리간드(ligand)인 것일 수 있으며, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, GRO-α 또는 IL-8일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양 단계는 인간 태반 유래 세포 조건화 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 역분화 유도 방법은 체세포 배양 단계에서 형성된 콜로니로부터 줄기세포를 분리하는 줄기세포 분리 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1) 또는 이의 유도체를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화(reprogramming) 효율 증진용 조성물 및 이를 이용한 역분화 효율 증진 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따라 체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 역분화 인자를 형질도입시킨 후 MHY1485를 처리하였을 경우 유도만능줄기세포로의 역분화 효율이 현저히 상승하므로, 이를 효과적으로 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도에 이용할 수 있다.
도 1a는 체세포에 역분화(reprogramming) 인자를 형질도입하고 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1)를 처리하면서 배양하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 MHY1485를 처리 유무에 따른 인간 제대정맥 내피세포(Primary Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC), 인간 섬유아세포(Primary Dermal Fibroblasts, HDF) 및 인간 태반 유래 세포(Human placenta derived cells; HPC)에서의 단백질 발현량을 나타낸 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 1c는 HUVEC, HDF 및 HPC 세포에 대하여 MHY1485를 처리하였을 경우 오토파지의 억제 여부를 확인한 면역형광법(Immunofluorescence Assay) 분석 결과 사진사진이다.
도 2a는 HUVEC, HDF 및 HPC 세포에 대하여 MHY1485 처리 유무와 인간 태반 유래 세포 조건화 배지(Placenta-derived cells conditioned media; PCCM) 사용 유무에 따른 리프로그래밍(reprogramming) 효율의 차이를 비교한 사진이다.
도 2b는 HUVEC, HDF 및 HPC 세포에 대하여 MHY1485 처리 유무와 PCCM 배지 사용 유무에 따른 리프로그래밍 효율의 차이를 비교한 그래프이다.
도 2c는 HUVEC, HDF 및 HPC 세포에 대하여 MHY1485를 처리한 경우와 PCCM 배지를 사용한 경우에 따른 리프로그래밍 효율의 차이를 서로 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: MHY1485에 의한 역분화 효율 증진 여부의 확인
mTOR(mammalian target of rapamycin) 활성화제인 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(이하 MHY1485, CAS Number 326914-06-1)가 역분화(reprogramming) 효율에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, 도 1a와 같이 인간 제대정맥 내피세포(Primary Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC, ATCC #PCS-100-010), 인간 섬유아세포(Primary Dermal Fibroblasts, HDF, ATCC # PCS-201-012) 및 인간 태반 유래 세포(Human placenta derived cells; HPC)에 샌다이 바이러스(Sendai virus; SeV) 시스템을 이용하여 역분화 인자(OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4; OSKM)를 형질도입하였다.
이후 24시간 뒤에 인간 태반 유래 세포 조건화 배지(Placenta-derived cells conditioned media; PCCM) 또는 성장배지(growth medium; GM)에서 MHY1485 2 ug/mL를 24시간마다 1회씩 3주 동안 처리하여 일주일 동안 배양한 후, 마트리겔(Matrigel)이 코팅된 배양디쉬 위에 MHY1485와 함께 mTeSR 배지를 이용하여 2주 동안 일반적인 만능줄기세포 배양 조건에서 역분화를 유도하였다.
이후 웨스턴 블랏으로 CXCR2, mTOR 및 cMYC의 발현을 확인하고 줄기세포 표지 마커에 특이적인 Tra-60으로 염색하여 오토파지(autophagic flux) 활성을 확인하였다.
도 1b에서 확인할 수 있듯이, MHY1485를 처리하였을 때 체세포에서 CXCR2, mTOR, cMYC의 발현이 증가한 반면, LC3a/b의 발현은 감소하였고 p62의 발현이 증가함으로써 오토파지가 비활성화됨을 나타내었다.
도 1c에서 확인할 수 있듯이, 면역형광법(Immunofluorescence Assay)을 수행하여 mTOR 억제제인 라파마이신(Rapamycin)을 대조군으로 MHY1485를 처리하였을 때 체세포에서 LC3a/b의 발현이 감소됨으로써 오토파지가 억제된 것을 검증하였다.
실시예 2: 역분화 효율 증진 효과에 있어서의 MHY1485와 CXCR2 자극의 상관관계 확인
도 2a에서 확인할 수 있듯이, MHY1485를 처리하였을 경우에, 처리하지 않았을 경우와 대비하여 모든 세포에서 역분화 효율이 증가하였으며, 또한 역분화 효율은 GM에서보다는 PCCM)에서 더 우세하였다.
따라서, MHY1485의 처리에 의해 오토파지가 비활성화되고 리프로그래밍 효율이 증가함을 확인하였다.
도 2b 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, MHY1485을 처리하지 않은 그룹보다 처리한 그룹에서 역분화 효율이 유의하게 높게 나타났다.
리프로그래밍
효율 (%)		 GM -MHY1485 GM +MHY1485 hPCCM -MHY1485 hPCCM +MHY1485
HPC 0.08 0.35 0.30 0.92
HDF 0.01 0.04 0.02 0.07
HUVEC 0.05 0.13 0.10 0.39
도 2c 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, HUVEC, HDF 및 HPC 세포에 대하여 MHY1485를 처리한 그룹과 PCCM 배지에서 역분화 유도한 그룹을 3가지 세포에서 각각 3개 디쉬(dish)씩 확인하여 전체 n수 9개로 비교한 결과 MHY1485를 처리한 그룹이 유의하게 역분화 효율이 높게 나타났다.
GM +MHY1485 hPCCM -MHY1485
리프로그래밍 효율 (%) 0.17 0.14
따라서 PCCM 배지를 이용함으로써 얻을 수 있는 역분화 효율 증가 효과에 비해서도 MHY1485를 처리함으로써 얻을 수 있는 역분화 효율의 상승 효과가 유의하게 높음을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민 또는 이의 유도체를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 효율 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 체세포는 인간 제대정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells; HUVEC), 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts; HDF) 및 인간 태반 유래 세포(Human placenta derived cells; HPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 CXCR2의 활성화제를 더 포함하는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인간 태반 유래 세포 조건화 배지(Placenta-derived cells conditioned media; PCCM)를 더 포함하는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 조성물.
  6. 다음 단계를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 효율 증진 방법:
    체세포에 OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 형질도입하는 체세포 형질변환 단계; 및
    상기 형질변환된 체세포에 4,6-디-4-모르폴리닐-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민 또는 이의 유도체를 처리하여 배양하는 배양 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 체세포는 인간 제대정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells; HUVEC), 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts; HDF) 및 인간 태반 유래 세포(Human placenta derived cells; HPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 배양 단계는 CXCR2의 활성화제 존재하에서 수행되는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 배양 단계는 인간 태반 유래 세포 조건화 배지(Placenta-derived cells conditioned media; PCCM)에서 수행되는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 역분화 유도 방법은 배양 단계에서 형성된 콜로니로부터 유도만능줄기세포를 분리하는 세포 분리 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진 방법.
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