CN106566799B - 一种肝干细胞的定向分化体系和方法 - Google Patents

一种肝干细胞的定向分化体系和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系和方法，包括一种化学成份明确的扩增培养基，用于小鼠或人肝干细胞的体外培养；以及一种化学成份明确的分化培养基，用于将小鼠或人肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞。本发明可以从小鼠胚胎肝脏组织或者由人多能干细胞分化获得肝母细胞中选择性扩增肝干细胞，肝干细胞可在此条件下培养超过20代，并维持稳定的肝干细胞分子表型；本发明进一步将培养的小鼠或者人肝干细胞诱导分化为可分泌白蛋白，代谢尿素等功能的成熟肝细胞。

Description

一种肝干细胞的定向分化体系和方法
本发明是申请日为2014年11月12日，申请号为：CN201410635815.7，发明名称为“一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系和方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系和方法，包括一种化学成份明确的扩增培养基，用于小鼠或人肝干细胞的体外培养；以及一种化学成份明确的分化培养基，用于将小鼠或人肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞。
背景技术
我国每年因肝病死亡的患者超过30万，但是每年可供移植肝脏仅能满足5％肝病患者的需求。可供移植肝脏的匮乏严重限制了该治疗手段的临床应用。已有的临床前和临床研究表明，成熟肝细胞或肝干细胞移植后可在损伤肝脏中再植并重建肝脏，但是无论是成熟肝细胞或者肝干细胞同样存在来源匮乏的问题。
将人多能干细胞(胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞)体外诱导分化为可体外稳定培养的肝干细胞不仅可为肝病患者的细胞移植提供稳定的细胞来源，且避免了利用胎肝组织所涉及的伦理学问题，优势显而易见。但是目前多能干细胞的定向诱导大多都是通过多步骤的时序性的分化过程，最终获得有功能的、终末分化的细胞(Wobus AM&Boheler KREmbryonic Stem Cells:Prospects for Developmental Biology and CellTherapy.Physiol.Rev.2005；85(2):635-678。)目前，仍无法将分化体系稳定地维持在特定的中间发育阶段，比如组织干细胞阶段。同时，目前也无有效的将人多能干细胞诱导分化为可稳定扩增的肝干细胞的方法。
因此，本领域尚缺乏有效手段扩增肝干细胞，尤其是无法在化学成分明确的培养条件下实现肝干细胞的如长期体外培养和定向分化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化体系，该体系包括一种化学成份明确的扩增培养基，用于小鼠或人肝干细胞的体外培养；以及一种化学成份明确的分化培养基，用于将小鼠或人肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞。
本发明的另一目的在于提供一种肝干细胞的长期体外培养和定向分化的方法，该方法可将人多能干细胞诱导分化为肝干细胞，并且可以维持肝干细胞长期稳定扩增并保持定向分化为成熟肝细胞的能力。
本发明的第一方面，是提供一种小鼠或人肝干细胞的长期体外培养体系，该体系是一种化学成份明确的用于培养小鼠或人肝干细胞的扩增培养基，所述的扩增培养基包括：
液体基础培养基，
0.1％-10％(体积百分含量)胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，
3nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂，
0.1μM-50μM的转化生长因子β受体抑制剂，
0.1μM-50μM的溶血磷脂酸，
0.1μM-50μM的1-磷酸鞘氨醇，
0.1-100ng/mL的表皮生长因子，
和0.1-1mg/mL的人重组白蛋白或者牛血清白蛋白。
所述的液体基础培养基，选自MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基、1640细胞培养基中的一种或两种以上。
优选的，所述的扩增培养基含有0.5μM-5μM的糖原合成激酶3β抑制剂；
优选的，所述的扩增培养基含有1μM-10μM的转化生长因子β受体抑制剂；
优选的，所述的扩增培养基含有1μM-10μM的溶血磷脂酸；
优选的，所述的扩增培养基含有0.1μM-5μM的1-磷酸鞘氨醇；
优选的，所述的扩增培养基含有1-50ng/mL的表皮生长因子。
优选的，所述的扩增培养基还包括：0.1-5mM尼克酰胺和0.1-100μg/mL的维生素C。
所述的糖原合成激酶3β抑制剂可以是CHIR99021或者其他小分子糖原合成激酶3β抑制剂；
所述的转化生长因子β受体抑制剂可以是E-616452或者其他转化生长因子β受体抑制剂。
本发明的第二方面，是提供一种小鼠或人肝干细胞的定向分化体系，该体系是一种化学成份明确的可以将肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞的分化培养基，所述的分化培养基包括：
液体基础培养基，
0.1-100ng/mL肝细胞生长因子,
0.1-100ng/mL抑瘤素M，
10nM-10μM的地塞米松，
10nM-10μM的γ-分泌酶抑制剂Compound E，和
0.1μM-50μM的转化生长因子β受体抑制剂E-616452。
所述的液体基础培养基，选自MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基、1640细胞培养基中的一种或两种以上。
优选的，所述的分化培养基含有5-50ng/mL肝细胞生长因子；
优选的，所述的分化培养基含有5-50ng/mL抑瘤素M；
优选的，所述的分化培养基含有50nM-5μM的地塞米松；
优选的，所述的分化培养基含有100nM-5μM的γ-分泌酶抑制剂Compound E；
优选的，所述的分化培养基含有1μM-20μM的转化生长因子β受体抑制剂E-616452。
本发明的第三方面，是提供一种小鼠或人肝干细胞的长期体外培养和定向分化的方法，该方法包括以下步骤：
A、利用前述的扩增培养基，从肝母(Hepatoblasts)细胞中选择性扩增肝干细胞，并对肝干细胞进行体外培养和传代；
B、利用前述的分化培养基，将步骤A获得的肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞。
步骤A中，所述的肝干细胞肝母细胞是从小鼠胚胎肝脏组织或者由人多能干细胞分化获得的。
从小鼠胚胎肝脏组织获得肝母细胞干细胞，为本领域公知常识，可参见文献：Weiss MC,Strick-Marchand H.Isolation and characterization of mouse hepaticstem cells in vitro.Semin Liver Dis 2003；23:313-324.。
由人多能干细胞分化获得肝母细胞干细胞，为本领域公知常识，可参见文献：Takayama K,Nagamoto Y,Mimura N,Tashiro K,Sakurai F,Tachibana M,Hayakawa T,etal.Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells onHuman Laminin 111-Coated Dishes.Stem Cell Reports 2013；1:322-335。
本发明的方法，可以从小鼠胚胎肝脏组织或者由人多能干细胞分化获得肝母细胞中选择性扩增肝干细胞，将肝干细胞长期体外培养，并定向诱导分化为成熟肝细胞。
本发明的第四方面，是提供根据前述的一种小鼠或人肝干细胞的长期体外培养和定向分化的方法制备得到的肝干细胞和成熟肝细胞。
本发明的第五方面，是提供根据所述的肝干细胞和成熟肝细胞在制备肝脏疾病的治疗细胞、肝脏组织工程、肝脏疾病体外药物筛选中的应用。
本发明的有益效果：使用本发明的化学成份明确的肝干细胞扩增培养基可以从小鼠胚胎肝脏组织或者由人多能干细胞分化获得肝母细胞中选择性扩增肝干细胞，肝干细胞可在此条件下培养超过20代，并维持稳定的肝干细胞分子表型；本发明的方法无需使用磁珠或者流式分选的复杂的、高成本的细胞纯化手段，所培养的肝干细胞纯度可以达到99％。使用本发明的化学成份明确的肝干细胞分化培养基可以将培养的小鼠或者人肝干细胞诱导分化为可分泌白蛋白，代谢尿素等功能的成熟肝细胞。
附图说明
图1为利用化学成份明确的扩增培养基选择性培养小鼠胚胎肝干细胞，细胞培养至第五代后，即无法检测到内皮细胞和间质细胞基因的表达(A)；且EpCAM阳性的肝干细胞纯度可以达到98.5％(B)；细胞培养至20代仍可保持正常的核型(C)，和稳定的基因表达谱(D)。
图2为培养的细胞具有肝干细胞的表型、表达肝干细胞的标志分子，如共表达Albumin(ALB)和keratin 19(K19)，肝前体细胞标记物DLK1,EpCAM和CD133，肝源性转录因子HNF4α和FoxA2，同时共表达上皮细胞分子标记物E-Cadherin和β-Catenin(A)；流式细胞术分析结果显示细胞表达CD133(99％阳性率),Ki-67(88％阳性率),DLK1(94％阳性率),and K19(99％positive)(B)；免疫荧光染色结果显示，培养的单个肝干细胞具有双向分化潜能，可以分化为ALB阳性的肝细胞和K19阳性的胆管上皮细胞(C)。图3为培养的肝干细胞在三维Matrigel中形成的胆管样结构，A和B为在相差显微镜下观察到的胆管养结构，B为A图中矩形框的放大图；C为透射电子显微镜观察到的胆管；免疫细胞化学染色显示形成的胆管样结构表达胆管的标志分子(D,E,F)。
图4培养人多能干细胞分化获得的肝干细胞，培养的细胞表达肝干细胞的标志分子，如共表达CD54/DLK1(A)，AFP/HNF4(B),EpCAM/HNF4(C)，pan-CK/FoxA2(D)，E-cad/Ki-67(E)；流式细胞术分析结果显示细胞Ki-67的阳性率可以达到99％；EpCAM的阳性率可以达到89％(F)。
图5为肝干细胞分化为成熟肝细胞，在分化诱导条件下经过两周的体外培养，肝干细胞可以高比例的分化为表达并可分泌ALB的成熟肝细胞(A，B和C，B为A图中矩形框的放大图)；分化后的细胞具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力(D)，同时可以摄入荧光素标记的胆酸并将胆酸分泌到细胞间胆管(E)；分化后的细胞具有合成尿素的能力(F)。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：扩增小鼠胚胎肝干细胞
取怀孕12.5天的小鼠胚胎，取出胚胎肝脏，用Accutase酶(Invitrogen公司)消化后，将单细胞悬液接种于0.5％Matrigel基质胶(BD Bioscience公司)或者20μg/mlLaminin(Invitrogen公司)包被的6孔培养板，培养基为DMEM/F12(Invitrogen公司)，包含胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液(Invitrogen公司)，3μM CHIR99021(Tocris公司)，2μME-616452(Sigma-Aldrich公司)，5μM的溶血磷脂酸(Sigma-Aldrich公司)，0.5μM的1-磷酸鞘氨醇(Sigma-Aldrich公司)，20ng/mL的表皮生长因子(R&D Systems公司)和50μg/mL的人重组白蛋白(R&D Systems公司)。细胞生长至70％汇合时用Accutase酶进行传代培养。
该培养条件可以选择性的扩增胚胎肝干细胞，如图1所示，细胞培养五代后不再能检测到血管内皮和成纤维细胞的存在(图1A)，且肝干细胞的纯度可以达到95％以上(图1B)。肝干细胞在此条件下可以连续传代超过20代，并保持细胞核型(图1C)和基因表达谱的稳定(图1D)。
在该条件培养的细胞表达肝干细胞的标志分子(图2)，如共表达Albumin(ALB)和keratin 19(K19)，肝前体细胞标记物DLK1,EpCAM和CD133，肝源性转录因子HNF4α和FoxA2，同时共表达上皮细胞分子标记物E-Cadherin和β-Catenin(图2A)。流式细胞术分析结果显示细胞表达CD133(99％阳性率),Ki-67(88％阳性率),DLK1(94％阳性率),and K19(99％positive)(图2B)。
免疫荧光染色结果显示，培养的单个肝干细胞具有双向分化潜能，可以分化为ALB阳性的肝细胞和K19阳性的胆管上皮细胞(图2C)。培养的肝干细胞在三维Matrigel中可以形成胆管样结构(图3A,B)。电子显微镜观察显示胆管细胞的内腔面有大量的微绒毛(图3C)；且形成的胆管样结构表达胆管的标志分子，如K19，Integrinα6，Integrinβ4和Aqu1等(图3D,E,F)。
以上结果表明本发明建立的肝干细胞培养体系可以从小鼠胚胎肝脏中选择性的扩增肝干细胞，并可以在体外维持肝干细胞的长期稳定自我更新。
实施例2：扩增人多能干细胞分化获得的肝干细胞
人多能干细胞H1和Hues9细胞(Wicell公司)培养于0.5％基质胶包被的6孔培养板，培养基为为DMEM/F12，包含1％N2(Invitrogen公司),1％B27(Invitrogen公司)和20ng/ml bFGF(Invitrogen公司)。细胞生长至50％融合时更换培养基为DMEM/F12，B27(无胰岛素)，100ng/ml Activin A(R&D Systems公司)培养四天诱导细胞分化为内胚层细胞；然后更换培养基为DMEM/F12，包含1％N2,1％B27，5μM SB431542(Sigma-Aldrich公司)和10ng/ml BMP4(Invitrogen公司)培养2天诱导细胞进一部分化为腹侧前肠；然后更换培养基为DMEM/F12，包含1％N2,1％B27，10ng/ml bFGF和10ng/mlBMP4培养5天诱导细胞分化为肝母细胞。再次将培养基更换为DMEM/F12，包含胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，3μMCHIR99021，2μM E-616452，5μM的溶血磷脂酸，0.5μM的1-磷酸鞘氨醇，20ng/mL的表皮生长因子和50μg/mL的人重组白蛋白，进行肝干细胞扩增培养。细胞生长至70％汇合时用Accutase酶进行传代培养。
该培养条件可以选择性的扩增人多能干细胞分化获得的肝干细胞，且获得的人肝干细胞在该条件下可连续培养超过20代。如图4所示，培养的细胞表达肝干细胞的标志分子，如共表达CD54/DLK1(图4A)，AFP/HNF4(图4B),EpCAM/HNF4(图4C)，pan-CK/FoxA2(图4D)，E-cad/Ki-67(图4E)。流式细胞术分析结果显示细胞Ki-67的阳性率可以达到99％；EpCAM的阳性率可以达到89％(图4F)。
以上结果表明本发明建立的肝干细胞培养体系可以从人多能干细胞分化获得的肝母细胞中选择性的扩增人肝干细胞，并可以在体外维持人肝干细胞的长期稳定自我更新。
实施例3：诱导肝干细胞分化为成熟肝细胞
接种小鼠或者人体外培养的肝干细胞于0.5％基质胶包被的6孔培养板(10000细胞/孔)。培养基为DMEM/F12，包含胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，20ng/mL肝细胞生长因子,20ng/mL抑瘤素M，100nM的地塞米松1μM的γ-分泌酶抑制剂Compound E和2μM的转化生长因子β受体抑制剂E-616452。
经过两周的体外培养，成熟肝细胞标志分子的表达显著上调；在此诱导条件下肝干细胞可以高比例的分化为表达并可分泌ALB的成熟肝细胞；分化后的细胞具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力，同时可以摄入荧光素标记的胆酸并将胆酸分泌到细胞间胆管；分化后的细胞具有合成尿素的能力(图5)。
以上结果表明本发明建立的肝干细胞分化体系可以将肝干细胞高效的诱导分化为具有功能的成熟肝细胞。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，该方法采用一种化学成份明确的可以将肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞的分化培养基，所述的分化培养基包括：
液体基础培养基，
0.1-100ng/mL肝细胞生长因子,
0.1-100ng/mL抑瘤素M，
10nM-10μM的地塞米松，
10nM-10μM的γ-分泌酶抑制剂Compound E，和
0.1μM-50μM的转化生长因子β受体抑制剂E-616452；
所述的液体基础培养基，选自MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基、1640细胞培养基中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，所述的分化培养基包括：
5-50ng/mL肝细胞生长因子；
5-50ng/mL抑瘤素M；
50nM-5μM的地塞米松；
100nM-5μM的γ-分泌酶抑制剂Compound E；
1μM-20μM的转化生长因子β受体抑制剂E-616452。
3.根据权利要求1或2所述的一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤：
利用如权利要求1或2所述的分化培养基，将肝干细胞诱导分化为成熟肝细胞。
4.根据权利要求3所述的一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，所述的肝干细胞是利用如下扩增培养基，从肝母细胞中选择性扩增肝干细胞，并进行体外培养和传代的：
扩增培养基包括：
液体基础培养基，
体积百分含量0.1％-10％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，
3nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂，
0.1μM-50μM的转化生长因子β受体抑制剂，
0.1μM-50μM的溶血磷脂酸，
0.1μM-50μM的1-磷酸鞘氨醇，
0.1-100ng/mL的表皮生长因子，和
0.1-1mg/mL的人重组白蛋白或者牛血清白蛋白；
所述的液体基础培养基，选自MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基、1640细胞培养基中的一种或两种以上。
5.根据权利要求4所述的一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，所述的扩增培养基包括：
0.5μM-5μM的糖原合成激酶3β抑制剂；
1μM-10μM的转化生长因子β受体抑制剂；
1μM-10μM的溶血磷脂酸；
0.1μM-5μM的1-磷酸鞘氨醇；
1-50ng/mL的表皮生长因子。
6.根据权利要求4所述的一种小鼠或人肝干细胞的定向分化的方法，其特征在于，所述的扩增培养基还包括：0.1-5mM尼克酰胺和0.1-100μg/mL的维生素C。
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