JPWO2013018851A1 - 誘導肝幹細胞から肝分化誘導する方法及び誘導肝前駆細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
<低分子化合物>
TGF-β RI Kinase Inhibitor IX (ALK4, 5 and 7) Inhibitor、A-83-01
(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)、
AP12009(TGF-β2アンチセンス化合物“Trabedersen”)、
Belagenpumatucel-L(TGF-β2アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン)、
CAT-152(Glaucoma - lerdelimumab(抗-TGF-β-2モノクローナル抗体))、
CAT-192(Metelimumab(TGFβ1を中和するヒトIgG4モノクローナル抗体)、
GC-1008(抗-TGF-βモノクローナル抗体)、
から選択することができる。
(1) 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
(2) 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、およびTTRを発現する、
ことを特徴とする。
(1) 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
(2) 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4を発現する、
ことを特徴とする細胞が含まれる。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.377:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTA(invitrogen, 25200-056)で培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632(10μM)に懸濁後、マトリゲルでコート(10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間)した6 wellプレートに播種された(約4×104細胞/1 mL培地/well)。約3時間後、培地をmTeSR1(100 ng/mLのbFGFを含む)2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.390と呼ぶ(表7Aを参照)。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.377:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632(10μM)に懸濁後、マトリゲルでコート(10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間)した6 wellプレートに播種された(約4×104細胞/1 mL培地/well)。約3時間後、培地をaFGF[10 ng/mL]/ReproStem(bFGF不含)2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.391と呼ぶ(表7Aを参照)。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.377:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632(10μM)に懸濁後、マトリゲルでコート(10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間)した6 wellプレートに播種された(約4×104細胞/1 mL培地/well)。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01(TOCRIS Cat. No. 2939)/mTeSR1(100 ng/mLのbFGFを含む)2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.393と呼ぶ(表7Aを参照)。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.377:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632(10μM)に懸濁後、マトリゲルでコート(10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間)した6 wellプレートに播種された(約4×104細胞/1 mL培地/well)。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01/aFGF[10 ng/mL]/ReproStem(bFGF不含)2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.394と呼ぶ(表7Aを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレート(コーニング3471)に播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.472と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞はTGF-β阻害剤(A-83-01)0.1μM添加ReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.473と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM(OsM)及び0.1μMデキサメサゾン(DEX)添加ReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.474と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM(OsM)、0.1μMデキサメサゾン(DEX)及び0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01添加ReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.475と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM(OsM)、0.1μMデキサメサゾン(DEX)、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、0.1%DMSO添加ReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.476と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)(100 ng/mLのbFGFを含む)を用いてフィーダー細胞(1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(NO.451:約50%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM(OsM)、0.1μMデキサメサゾン(DEX)、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、1%DMSO添加ReproStem(bFGF不含)/Y-27632(5μM)に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種(約8×104細胞/5 mL培地/well)し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.477と呼ぶ(表7Bを参照)。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/STEMCELL Technologies)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1(No.1133(45継代):約50〜80%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1.2×106を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
No.1141:A-83-01(TOCRIS Cat. No.2939)
No.1142:ALK5 Inhibitor I, [3-(Pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, MERCK Calbiochem 616451
No.1143:TGF-β RI Kinase Inhibitor II 616452 MERCK Calbiochem
2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine
No.1144:SB431542 Cayman 13031
4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl] benzamide, Dihydrate,
No.1145:LY-364947 Cayman 13341 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline
ALBの発現は、各々、24.11、393.55、163.71、296.67、94.46、114.78倍に、
AATの発現は、各々、3.00、19.83、13.45、22.18、12.15、14.36倍に、
TTRの発現は、各々、128.22、935.16、966.14、1,262.14、614.17、482.45倍に、
AFPの発現は、各々、33.02、655.37、747.65、720.03、394.40、369.23倍に、
それぞれ上昇した。
液体窒素で凍結保存してあったヒト誘導肝幹細胞AFB1-1 No.1543(36継代)を、マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cmの培養皿上で、ヒトES・iPS細胞用培地(mTeSR1/ STEMCELL Technologies)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿)と共培養した。
No.1545:A-83-01(TOCRIS 2939)
No.1546:SB-505124(SIGMA S4696)
2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-2-tert-butyl-3H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine hydrochloride
No.1547: TGF-β RI Inhibitor III 616453 MERCK Calbiochem
2-(5-Benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine, HCl
No.1548:SD-208, TGF-β RI Inhibitor V 616456 MERCK Calbiochem
2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)pteridin-4-yl)pyridin-4-yl amine
No.1549:TGF-β RI Kinase Inhibitor VIII 616459 CALBIO
6-(2-tert-Butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl)-quinoxaline
ALBの発現は、各々、20.95、23.2、25.55、21.35、24.67であり、
AATの発現は、各々、23.57、23.56、24.09、23.54、23.54、
TTRの発現は、各々、16.96、17.24、18.13、17.4、17.24、
AFPの発現は、各々、17.21、18.61、20.24、17.48、19.25、
KRT7の発現は、各々、20.51、19.8、19.45、20.05、19.89、
KRT19の発現は、各々、22.05、20.33、20.29、20.45、20.36、
DLK1の発現は、各々、18.15、18.77、18.74、19.1、18.66、
GAPDHの発現は、各々、14.22、13.25、13.76、13.72、14.24、
であった。このように、肝細胞マーカー、肝前駆細胞マーカー、胆管上皮マーカーの発現が検出された。従って、TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導が行われ、誘導肝前駆細胞へ分化した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(No.806(42継代):約50〜80%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1(No.946(37継代):約50〜80%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1(No.946(37継代):約50〜80%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
) X1/250を含むReproStem(bFGF無添加)2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.951と称する。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
ALBの発現は、11,284、16,667、13,278倍に
AATの発現は、70.4、90.9、78.3倍に、
TTRの発現は、59.3、83.3、78.6倍に、
AFPの発現は、7,178、10,000、6931倍に
それぞれ上昇した。そして、CYP3A4はヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(No.664)の発現量を1として1,003、1,389、1,038倍に上昇した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
ALBの発現は、3,706、4,306、2,559倍に、
AATの発現は、201、224、129倍に、
TTRの発現は、156、166、89倍に、
AFPの発現は、4,414、4,227、3,414倍に
それぞれ上昇した。また、ヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(No.664 )の発現量を1として、
CYP1A2の発現は、6.4、4.9、10.8倍に、
CYP2C9の発現は、9.0、6.6、4.5倍に、
CYP3A4の発現は、12.8、9.7、5.3倍に
それぞれ上昇した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1(No.663(35継代):約50〜80%コンフルエント/培養皿)を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
マトリゲルでコート(60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置)した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ ReproCell)を用いてフィーダー細胞(約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿)と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS(-)で洗浄後、0.25%トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地(ReproStem/ReproCELL)に懸濁して1/10量を遠心洗浄(1,000 rpm、5分間)した。
Claims (18)
- 誘導肝幹細胞を、TGF-β阻害剤の存在下にて1〜4週間培養する工程;を含む、
誘導肝幹細胞から誘導肝前駆細胞または肝細胞を分化させる方法。 - 誘導肝前駆細胞を、TGF-β阻害剤の存在下にて1〜4週間培養する工程;を含む、
誘導肝前駆細胞から肝細胞を分化させる方法。 - TGF-β阻害剤が、
・A-83-01(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-フェニルチオカルバモイル-4-キノリン-4-イルピラゾール)、
・ALK5 Inhibitor I(3-(ピリジン-2-イル)-4-(4-キノニル)]-1H-ピラゾール)、
・LDN193189(4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)、
・SB431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、
・SB-505124(2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン塩酸塩水和物)、
・SD-208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)プテリジン-4-イル]ピリジン-4-イル-アミン)、
・SB-525334(6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン)、
・LY-364947(4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン)、
・LY2157299(4-[2-(6-メチル-ピリジン-2-イル)-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-キノリン-6-カルボン酸アミド)、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor II 616452(2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン)、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor III 616453(2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-イル-2-tert-ブチル-1H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン, HCl)、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor IX 616463(4-((4-((2,6-ジメチルピリジン-3-イル)オキシ)ピリジン-2-イル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド)、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor VII 616458(1-(2-((6,7-ジメトキシ-4-キノリル)オキシ)-(4,5-ジメチルフェニル)-1-エタノン)、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor VIII 616459(6-(2-tert-ブチル-5-(6-メチル-ピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)-キノキサリン)、
・AP12009(TGF-β2アンチセンス化合物“Trabedersen”)、
・Belagenpumatucel-L(TGF-β2アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン)、
・CAT-152(Glaucoma - lerdelimumab(抗-TGF-β-2モノクローナル抗体))、
・CAT-192(Metelimumab(TGFβ1を中和するヒトIgG4モノクローナル抗体)、
・GC-1008(抗-TGF-βモノクローナル抗体)、
からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。 - 培養を、bFGFの非存在下にて行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 培養を、フィーダー細胞の非存在下にて行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 培養を、マトリゲルおよびコラーゲンよりなる群から選択される物質の存在下にて行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 誘導肝幹細胞を、多能性幹細胞培養用培地中、フィーダー細胞の存在下にて事前培養したのち、TGF-β阻害剤の存在下での培養を行う、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 培養を、ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸及び血清から選択される物質の存在下にて行う、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも、下記(1)および(2)の要件:
(1) 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
(2) 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AATおよびTTRを発現する、
ことを特徴とする誘導肝前駆細胞。 - (2)の要件が、肝幹/前駆細胞マーカーが、DLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4を発現する、である、請求項9に記載の誘導肝前駆細胞。
- 誘導肝前駆細胞で発現している(1)胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子の発現量が、胚性幹細胞または誘導肝幹細胞で発現しているこれらの遺伝子の発現量と比較して1/10〜1/100倍である、請求項9または10に記載された誘導肝前駆細胞。
- 誘導肝前駆細胞で発現している(2)肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP遺伝子の発現量が、胚性幹細胞または誘導肝幹細胞で発現しているこれらの遺伝子の発現量と比較して10〜50,000倍に上昇している、請求項9〜11のいずれかに記載された誘導肝前駆細胞。
- 誘導肝前駆細胞で発現している(2)肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4遺伝子の発現量が、胚性幹細胞または誘導肝幹細胞で発現しているこれらの遺伝子の発現量と比較して10〜50,000倍に上昇している、請求項9〜12のいずれかに記載された誘導肝前駆細胞。
- 1〜2週間、接着培養又は浮遊培養可能である、請求項9〜13のいずれかに記載された誘導肝前駆細胞。
- さらに胆管上皮細胞マーカーKRT7を発現する、請求項9〜14のいずれかに記載の誘導肝前駆細胞。
- さらに肝細胞増殖因子HGFを発現する、請求項9〜15のいずれかに記載の誘導肝前駆細胞。
- 誘導肝幹細胞を、TGF-β阻害剤の存在下にて1〜4週間培養することにより分化させて作製される、請求項9〜16のいずれかに記載の誘導肝前駆細胞。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法を実施する工程を含む、誘導肝前駆細胞または肝細胞の製造方法。
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