KR102215508B1 - 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법 - Google Patents

다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102215508B1
KR102215508B1 KR1020157025863A KR20157025863A KR102215508B1 KR 102215508 B1 KR102215508 B1 KR 102215508B1 KR 1020157025863 A KR1020157025863 A KR 1020157025863A KR 20157025863 A KR20157025863 A KR 20157025863A KR 102215508 B1 KR102215508 B1 KR 102215508B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
population
hepatocytes
bile duct
days
Prior art date
Application number
KR1020157025863A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150119427A (ko
Inventor
고든 켈러
신이치로 오가와
아난드 가네컬
크리스틴 베어
비니타 엠 카마스
미나 오가와
제임스 수라피시트차트
Original Assignee
유니버시티 헬스 네트워크
더 호스피탈 포 식 칠드런
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 헬스 네트워크, 더 호스피탈 포 식 칠드런 filed Critical 유니버시티 헬스 네트워크
Publication of KR20150119427A publication Critical patent/KR20150119427A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102215508B1 publication Critical patent/KR102215508B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/724—Glycosyltransferases (EC 2.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/14—Coculture with; Conditioned medium produced by hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

다능성 줄기세포로부터 간세포 및/또는 담관세포 계통 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 이 방법은 (a) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계; (b) 세포 집단의 간세포 및/또는 담관세포 전구세포의 성숙, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하여 간세포 계통 세포, 예컨대 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 집단을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 성숙 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다. 임의로, 방법은 또한 응집체 내의 cAMP 경로의 활성화 및 공동-응집체의 형성을 포함한다.
[대표도]
도 11a, 11b, 11c

Description

다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법 {METHODS FOR GENERATING HEPATOCYTES AND CHOLANGIOCYTES FROM PLURIPOTENT STEM CELLS}
본 개시내용은 인간 다능성 줄기세포로부터 기능성 간세포의 생산 방법에 관한 것이다.
인간 다능성 줄기세포 (hPSC; 배아 줄기세포; hESC 및 유도된 다능성 줄기세포; hiPSC 포함)로부터 기능성 간세포를 생산하는 능력은 약물 대사 연구 및 간 질환의 치료를 위한 세포-기반 요법을 위한 간세포의 공급원을 제공할 것이다. 간세포는 약물 대사를 책임지고 따라서 신체로부터 생체 이물 (xenobiotic) 제거를 책임지는 세포이기 때문에 특히 중요하다1 - 3. 상기 역할 및 개체는 특정 약물을 대사하는 그의 능력이 상이할 수 있다는 사실에 비추어4, 대표적인 집단 샘플로부터 기능성 간세포의 이용 가능성은 제약 산업 내에서 약물 발견 및 시험에 대해 막대한 영향을 가질 것이다. 약물 시험을 위한 새로운 토대를 제공하는 것에 추가로, hPSC-유래 간세포는 간 질환 환자에 대한 잠재적인 새로운 요법을 제공할 수 있다. 간 이식이 말기 간 질환에 대한 효과적인 치료법을 제공하지만, 생존가능한 공여자 장기의 부족은 상기 방식으로 치료될 수 있는 환자 집단을 제한한다5 - 7. 간세포 이식 및 hPSC-유래 간세포를 사용하여 개발된 생체인공 간 장치는 특정 종류의 간 질환 환자에 대한 생명을 구하는 대체 요법을 제시한다. 그러나, 상기 적용은 hPSC로부터 대사적으로 기능성인 성숙 세포를 생성하는 능력에 의존한다. 상기 세포의 재생가능하고 효율적인 생성은 간세포 성숙을 제어하는 조절 경로에 대한 이해가 빈약하다는 사실 때문에 현재까지 간단하지 않은 문제이다.
기능성 인간 간세포의 잠재적인 치료 및 상업적인 중요성을 고려하여, hPSC로부터 상기 세포의 생성을 위한 프로토콜의 최적화를 향한 유의한 노력이 경주되었다8 -16. 거의 모든 방법은 진정 (definitive) 내배엽의 유도, 내배엽의 간의 운명으로의 특정화 (specification), 간모세포로 알려진 간 전구세포의 생성 및 간모세포의 성숙 간세포로의 분화를 포함하는 분화 배양액에서 간 발생의 핵심 시기를 재현하기 위해 시도하였다17. 대부분의 연구에서, 분화는 내배엽 유도 및 간의 특정화을 포함하는 초기 발생기를 조절하는 것으로 알려진 경로 효능제 및 길항제의 후속적인 첨가와 함께 단일층 방식으로 유도된다. 상기 전략을 사용하여, 상기 초기 분화 단계를 최적화하고, 마커, 예컨대 Hex, 알파-태아단백질 및 알부민의 발현에 의해 규정되는 진정 내배엽, 간모세포 및 미성숙 간세포에 고도로 풍부화된 집단을 생성하는 것이 가능하였다17. 상기 초기 분화 단계는 합리적으로 잘 확립된 반면, 예를 들어 I상 및 II상 약물-대사 효소 활성에 의해 규정되는 바와 같은 기능성 세포로의 간세포의 성숙을 촉진하는 조건은 설명되지 않았다. 상이한 프로토콜에 의해 생산된 집단은 그의 성숙 상태가 상당히 상이하고, 대부분의 경우에 미성숙 간세포를 제시한다.
본 개시내용의 측면은 연장된 노달 효능제 (extended nodal agonist) 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 간세포 계통 (lineage) 세포를 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은
(a) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계;
(b) 세포 집단의 간세포 전구세포의 성숙, 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하여 간세포 계통 세포, 예컨대 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 집단을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 성숙 유도 단계는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 간세포 및/또는 담관세포 계통 세포는 간모세포이다. 한 실시양태에서, 방법은 간모세포의 팽창된 집단을 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 간세포 계통 세포는 성숙 간세포이거나 또는 담관세포 계통 세포는 성숙 담관세포이다.
일부 실시양태에서, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단은 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 유도된다. 다능성 줄기세포는 임의로 인간 ESC (hESC) 또는 인간 iPSC (hiPSC)이다.
연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단은 한 실시양태에서 배상체 (EB)에서 내배엽 세포를 유도함으로써 얻는다. 또 다른 실시양태에서, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단은 단일층으로 존재하는 내배엽 세포를 유도함으로써 얻는다. 각각의 경우에, 유도된 내배엽 집단은 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 생산하기 위해 연장된 기간 동안 노달 효능제, 예를 들어 악티빈의 존재 하에 배양된다.
한 실시양태에서, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단은 적어도 80%, 85%, 90%, 95 CXCR4 + 및 cKIT + 양성 세포 및/또는 적어도 70%, 75%, 80% SOX17 + 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 특정화 단계는 연장된 노달 효능제 처리 (예를 들어 악티빈 처리) 유도된 내배엽 집단을 FGF 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. FGF는 예를 들어 bFGF, FGF10, FGF2 또는 FGF4 또는 그의 조합일 수 있다. 조합물은 예를 들어 순차적으로 첨가될 수 있다.
한 실시양태에서, 특정화 단계는 먼저 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 약 40 내지 60시간, 임의로 약 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 60시간 동안 FGF10 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 접촉시킨 후, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 약 4 내지 7일, 임의로 약 4, 5, 6 또는 7일 동안 bFGF 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 응집체는 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90% 알부민 양성 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 응집체는 배양액에서 24, 25, 26, 27, 또는 28일 후에 생성된다.
일부 실시양태에서, 응집체는 효소 처리 및/또는 수동 분리에 의해 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단의 단일층으로부터 생성된다.
성숙, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 하나 이상의 추가의 단계를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포 및/또는 응집체를 포함하는 세포 집단은 간세포 성장 인자 (HGF), 덱사메타손 (DEX) 및/또는 온코스타틴 M (OSM) 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편의 존재 하에 배양된다.
한 실시양태에서, 성숙, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙을 유도하기 위해서 응집체의 세포 내에서 cAMP 경로를 활성화하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, cAMP 경로의 활성화는 응집체를 cAMP 및/또는 cAMP 유사체 (예를 들어, 8-브로모아데노신-3'5"-시클릭 모노포스페이트, 디부티릴-cAMP, 아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-cAMPS) 및/또는 8-브로모아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-8-Br-cAMPS)) 및/또는 임의의 다른 cAMP 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 예를 들어 약 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 HGF, DEX 및 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 응집전 집단을 배양한 후, cAMP 효능제 및 DEX 및 임의로 HGF를 포함하는 성숙 배지를 응집체에 첨가한다.
한 실시양태에서, 생산된 간세포의 집단은 기능성 간세포를 포함하는 집단이다.
실시양태에서, 간세포, 임의로 기능성 간세포는 간세포 및/또는 담관세포 전구세포, 및/또는 응집 및/또는 cAMP 신호전달 유도 없이 생산된 비-연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 (예를 들어 연장된 기간 동안 노달 효능제, 예컨대 악티빈으로 처리되지 않은 유도된 내배엽 집단으로부터) 생산된 간세포를 포함하는 세포 집단에 비해 ALB, CPS1, G6P, TDO, CYP2C9, CYP2D6, CYP7A1, CYP3A7, CYP1A2, CYP3A4, CYP2B6, NAT2 및 UGT1A1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 간세포, 임의로 기능성 간세포는 ASGPR-1+ 세포이다.
한 실시양태에서, 담관세포 운명은 세포 집단의 응집체를 노치 (notch) 효능제로 처리함으로써 특정화된다.
한 실시양태에서, 생산된 담관세포의 집단은 기능성 담관세포의 집단이다. 기능성 담관세포는 예를 들어 간세포 및 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단의 세포에 비해 및/또는 노치 효능제로 처리되지 않은 응집체로부터 생산된 집단의 세포에 비해 Sox9, CK19 및 CFTR (낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자)로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2 또는 3개의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 담관세포의 집단의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 CK19+ 담관세포이다. 다른 실시양태에서, 기능성 담관세포의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 CFTR+ 담관세포이다.
언급된 바와 같이, 방법은 단일층으로 성장한 내배엽 세포 집단에 적용될 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 다능성 줄기세포 집단으로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a) 단일층으로 배양된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계;
d) 임의로 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, 덱사메타손 및/또는 온코스타틴 M 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 성숙 배지와 접촉시키는 단계;
e) 세포 집단의 간세포 및 담관세포 전구세포의 팽창된 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창 단계
를 포함하고, 여기서 성숙 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다.
또한, 내배엽 집단은 배상체에 포함될 수도 있다.
따라서, 개시내용의 추가의 측면은 다능성 줄기세포 집단으로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 제공하고, 이 방법은
a) 임의로 다능성 줄기세포를 BMP4 효능제와 접촉시킴으로써 다능성 줄기세포의 배상체 (EB)를 형성하는 단계;
b) EB를 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 유도된 내배엽 세포 집단을 분리하여 분리된 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
d) 분리된 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
e) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계;
f) 임의로 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, 덱사메타손 및/또는 온코스타틴 M 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 성숙 배지와 접촉시키는 단계;
g) 세포 집단의 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도 단계는 응집체 내의 cAMP 경로를 활성화하여, 세포 집단의 간세포 및/또는 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 집단으로의 성숙을 유도하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 응집체를 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단일층 또는 EB는 유도 배지 내의 노달 효능제와 적어도 약 1일, 2일, 3일 또는 약 4일 동안 접촉된다.
한 실시양태에서, 내배엽 집단의 분리 전의 단계 (예를 들어 배상체 (EB) 시기)에서, EB는 노달 효능제와 함께 적어도 36, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58 또는 60시간 동안 또는 적어도 약 1일, 2일, 3일 또는 약 4일 동안 배양된다.
따라서, 개시내용의 또 다른 측면은 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은
a) 단일층으로 배양되거나 배상체로 형성된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 적어도 하나의 FGF 효능제 및 하나의 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
d) 간세포 및/또는 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, OSM 및 DEX를 포함하는 성숙 배지와 접촉시키고;
(ii) 임의로 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 약 20 내지 약 40일 후에, 예를 들어 배양 약 24 내지 약 28일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
(iii) 응집된 세포를 응집된 세포 성숙 배지에서 배양하고;
(iv) 임의로 응집 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집 6일 내에, 임의로 배양 약 27 내지 약 36일 후에 응집된 세포 내의 cAMP 경로를 활성화하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 응집된 세포 성숙 배지는 간세포 성숙을 촉진하는 인자 또는 담관세포 발생을 촉진하는 인자 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 응집된 세포는 응집시에 임의로 TGF베타 길항제, 예컨대 SB431542의 존재 하에 wnt 효능제, 예컨대 CIHR 99021로 처리된다. 본원에서 제시되는 바와 같이, 예를 들어 제26일에 (또는 임의로 1 또는 2일 후, 예를 들어 EB를 사용하는 실시양태에서 제27일에) Wnt 경로 및 SMAD 경로의 활성화는 알부민+/HNF4+ 전구세포 집단의 팽창을 촉진한다. 예를 들어, 상기 집단의 10배 이하의 팽창은 wnt 효능제가 첨가될 때 얻을 수 있음이 제시된다.
한 실시양태에서, 응집된 세포는 wnt 효능제 및 임의로 TGF베타 길항제 (예컨대 SB431542)로 약 6 내지 약 12일, 바람직하게는 약 8 내지 약 10일, 임의로 약 9일 동안 처리된다.
추가의 실시양태에서, Wnt 길항제, 예컨대 XAV939 (약어로 XAV로도 언급됨) 및/또는 Mek/Erk 길항제, 예를 들어 PD0325901 (약어로 PD로도 언급됨)이 cAMP 활성화 단계 동안 첨가된다. cAMP 신호전달의 활성화 동안 Wnt 길항제 및/또는 MEK/Erk 길항제의 첨가는 CYP 효소의 발현을, 예를 들어 성인 간 세포에서 관찰되는 수준까지 또는 그 초과로 증가시킨다. 예를 들어, cAMP의 존재 하에 첨가되는, 예를 들어 약 제28일 내지 약 제32일 배양액에 첨가되는 MEK/Erk의 억제제는 간세포의 CYP3A4a 수준을 증가시킨다. Wnt 길항제와 조합한 MEK/Erk 길항제의 첨가도 CYP1A2의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, Wnt 길항제는 XAV939이다. 또 다른 실시양태에서, MEK/Erk 길항제는 PD0325901이다.
한 실시양태에서, 응집 약 1 내지 약 4일 후에, 세포는 노치 효능제로 처리된다. 상기 시기에 노치 효능제의 첨가는 담관세포 성숙을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 담관세포 성숙이 바람직한 경우, cAMP 신호전달의 유도는 생략된다.
예를 들어 노치 길항제, 예컨대 감마-세크레타제 억제제 (GSI) L695,458을 사용한 노치 신호전달의 추가의 억제는 담관세포 발생을 억제하는 것으로 본원에서 제시되고, 생산된 세포는 간세포의 특징을 보유한다. 한 실시양태에서, 방법은 응집 약 1 내지 약 4일 후에, 예를 들어 간세포 분화가 요구되는 실시양태에서 세포를 노치 길항제로 처리하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법은
a) 단일층으로 배양되거나 배상체로 형성된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 임의로 약 4 내지 약 8일 동안 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 임의로 약 1, 2, 3, 또는 약 4일 동안 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 적어도 하나의 FGF 효능제 및 적어도 하나의 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 임의로 약 4 내지 약 10일 동안 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계;
d) 간세포 또는 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, Dex 및/또는 OSM을 포함하는 성숙 배지로 임의로 약 10 내지 14일 동안 배양하고;
(ii) 임의로 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 약 20 내지 약 40일 후에, 예를 들어 배양 약 24 내지 약 28일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
(iii) 응집체를 Dex를 포함하는 성숙 배지에서 약 1 내지 10일 동안 배양하고;
iv) a) 응집체를 Dex 및 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제를 포함하는 성숙 배지에서 약 6일 내지 약 10일 동안 배양하고, 임의로 응집체 생성 단계의 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집체 생성 단계의 6일 내에, 임의로 배양 약 27 내지 약 36일 후에 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제를 첨가하거나; 또는
b) 응집체를 노치 효능제 및 임의로 cAMP 효능제, HGF, 및/또는 EGF를 포함하는 성숙 배지에서 약 6일 내지 약 20일 동안 배양하고, 임의로 응집체 생성 단계의 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집체 생성 단계의 6일 내에, 임의로 배양 약 20 내지 40일 후에 노치 효능제를 첨가하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 배양 약 20일 후에 및/또는 배양 40일 전에 응집시키는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 담관세포 전구세포의 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도 방법을 제공하고, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 (i) 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 효능제와 함께 배양하여 적어도 하나의 담관세포 전구세포의 담관세포, 임의로 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 포함한다.
노치 효능제는 예를 들어 표면, 예컨대 세포, 플라스틱, ECM 또는 비드에 결합된 임의의 노치 리간드일 수 있다. 한 실시양태에서, 노치 리간드는 노치 리간드 델타이다. 한 실시양태에서, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF의 존재 하에 노치 신호전달 공여자 (예를 들어 노치 효능제), 예컨대 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와 적어도 또는 약 5 내지 약 90일 동안 접촉시켜 담관세포 전구세포의 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 포함한다.
임의로, 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 효능제 (예를 들어 노치 신호전달 공여자)와 접촉시키는 것은 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을, 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF를 포함하는 성숙 배지에서 노치 신호전달 공여자, 예컨대 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 90일 동안, 임의로 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 60일, 적어도 또는 약 30일, 적어도 또는 약 25일, 2 적어도 또는 약 1일 및/또는 적어도 또는 약 14일 동안 공동 배양하여 담관세포 전구세포의 담관세포, 임의로 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 포함하고, 임의로 기능성 담관세포는 분지형, 낭포, 관형 또는 구체 유형 구조를 형성한다.
또 다른 실시양태에서,
(a) 본원에 기재되는 임의의 방법에 따라 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 세포의 집단을 생산하는 단계;
(b) 세포의 집단, 또는 임의로 간세포 및/또는 담관세포 풍부화된 또는 단리된 집단을 대상체 내로 도입하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포의 간세포 및/또는 담관세포 집단의 풍부화 또는 단리를 추가로 포함한다. 임의로, 세포의 간세포 및/또는 담관세포 집단은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 약 95% 이하의 간세포 및/또는 담관세포 (예를 들어 임의로 기능성 간세포 및/또는 담관세포)를 포함한다.
본 개시내용은 또한 약물 발견, 약물 대사 분석, 생체인공 간 장치의 개발을 위한 및/또는 간 병태 및 질환의 치료를 위한 세포 대체 요법으로서의 간세포 및/또는 담관세포 집단의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 다음 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 개시내용의 바람직한 실시양태를 나타내는 구체적인 실시예는 단지 예시를 위해 제시됨을 이해하여야 하고, 그 이유는 개시내용의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 분명해질 것이기 때문다.
본 개시내용의 실시양태는 이제 도면과 관련하여 설명될 것이다:
도 1은 hESC-유래 배상체에서 내배엽 유도를 보여준다. 도 1(a)는 분화 프로토콜의 모식도이다. EB는 제6일에 트립신 처리되고, 적절한 시기의 진정 내배엽을 생성하기 위해 악티빈의 존재 하에 2일 동안 단일층으로 도말된다. 간의 계통은 BMP4 및 FGF의 존재 하에 배양함으로써 상기 내배엽 집단으로부터 특정화된다. 간 성숙은 먼저 HGF, 덱사메타손 (Dex) 및 온코스타틴 M (OSM)을 12일 동안 첨가한 후, 생성된 3D 응집체를 Dex로 보충된 간세포 배지에서 8일 동안 배양하고, 이어서 추가의 12일 (제32일-제44일) 동안 cAMP 유사체, 8-br-cAMP를 첨가한 상기 배지에서 배양하는 단계적 방식을 통해 유도된다. 도 1(b)는 제6일 악티빈- 및 악티빈/Wnt3a-유도된 집단에서 CXCR4+, CKIT+ (CD117) 및 EPCAM+ 세포의 비율을 제시하는 유동 세포 측정 분석을 보여준다. 도 1(c)는 제6일 악티빈- 및 악티빈/Wnt3a-유도된 집단에서 SOX17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율을 제시하는 세포내 유동 세포 측정 분석을 보여준다. SOX17+ 및 FOXA2+ 집단의 크기는 악티빈 단독으로 유도된 EB (Sox17: 91 +/- 1.8%, FoxA2: 80.3 +/- 2.5%)에 비해 악티빈/Wnt3a 유도된 EB (Sox17: 96.2 +/- 1.1%, FoxA2: 88.5 +/- 2.9%)에서 유의하게 더 컸다: * P < 0.05 (P = 0.002), ** P < 0.01 (P = 0.005); 스튜던트 (Student) t-시험, n = 4. 도 1(d)는 악티빈 및 악티빈/Wnt3a-유도된 EB에서 T, SOX17, GSC 및 FOXA2 발현의 RT-qPCR 기반 분석을 보여준다. EB는 나타낸 시점에서 분석되었다. 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 SD를 나타낸다. 도 1(e)는 악티빈/Wnt3a 유도된 EB에서 CXCR4+, CKIT+, SOX17+ 및 FOXA2+ 집단의 발달의 동역학을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. 도 1(f)는 신경 기초 배지에서 악티빈으로 유도 제6일 EB에서 CXCR4+, CKIT+, EPCAM+, Sox17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다.
도 2(a): 나타낸 시토카인을 사용하여 특정된 단일층 배양액에서 알부민 발현의 RT-qPCR 분석. 세포를 상이한 인자 (bFGF 10 ng/ml; BMP4 50 ng/ml; HGF 20 ng/ml; 또는 bFGF 20 ng/ml + BMP4 50 ng/ml)로 6일로부터 제12일까지 처리한 후, DEX, HGF 및 OSM와 함께 배양하고, 제24일에 분석하였다. 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 bFGF (20 ng/ml) 배양액에서의 발현과 비교하여 제시된다. *** P < 0.001: bFGF 처리 배양액과 비교. 스튜던트 t-시험, n = 3. (b) FGF10의 존재 및 부재 하에 특정된 집단에서 알부민 발현의 RT-qPCR 분석. 배양액을 제6일과 제8일 사이에 FGF10 (50 ng/ml) + BMP4 (50 ng/ml)로 처리하였다 (또는 처리하지 않았다). 이 시기에, FGF10을 제거하고, 세포를 제8일과 제12일 사이에 bFGF/BMP4에서 배양하였다. 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 FGF10 (-) 배양액에서의 발현과 비교하여 제시된다. * P < 0.05, 스튜던트 t-시험, n = 3.
도 3은 악티빈 신호전달의 기간이 간의 발생에 영향을 줌을 보여준다. 도 3(a)는 제6일 악티빈/Wnt3A-유도된 EB에서 및 이로부터 유래된 단일층 집단에서 SOX17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율을 보여주는 세포내 유동 세포 측정 분석이다. 단일층 집단은 직접 특정화 배지 (-악티빈)에서 또는 2일 동안 악티빈 (50 ng/ml) 내에서, 이어서 특정화 배지 (+악티빈)에서 배양된다. 집단을 특정화 배지에서 2 또는 4일 배양한 후 분석하였다 (-악티빈 군에 대해 총 제8일 및 제10일 및 +악티빈 군에 대해 총 제10일 및 제12일). 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. 제10/12일에 SOX17+의 비율은 비-처리된 집단에 비해 악티빈-처리된 군에서 유의하게 더 높았다 (73.3 +/- 7.5% vs 45.9 +/- 3.7%). 이와 유사하게, 제8/10일 및 제10/12일에서 FOXA2+ 세포의 비율은 비-처리된 집단에 비해 악티빈 처리된 군에서 유의하게 더 높았다 (제8일: 96.1 +/- 0.9% vs 76.5 +/- 10.1%, 제12일: 92.7 +/- 2.5% vs 50.2 +/- 6.3%). 도 3(b)는 악티빈 처리된 및 비-처리된 단일층 배양액 내의 총 세포 수를 도시한 것이다. 제6일 EB-유래 세포는 직접 간 분화 배지에서 또는 악티빈의 존재 하에 2일 동안 배양한 후 간 분화 배지에서 배양하였다. 도 3(c)는 비-처리된 세포 및 악티빈-처리된 내배엽으로부터 생성된 제8, 10 및 12일 배양액에서 집단 내의 CXCR4 및 CKIT 양성 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. 도 3(d)는 악티빈-처리된 (흑색 막대) 및 비-처리된 (회색 막대) 내배엽으로부터 생성된 간의 단일층 집단의 RT-qPCR 기반 발현 분석을 보여준다. 집단을 나타낸 내배엽 (HEX, AFP, ALB, 및 HNF4α) 및 중배엽 (MEOX1, MESP1, CD31 및 CD90) 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 악티빈 처리 집단 (회색 막대)은 전체 배양의 제12, 18 및 26일에 분석하고, 비-처리된 집단 (흑색 막대)은 배양 제10, 16 및 24일에 분석하였다. 나타낸 발현 수준은 TBP와 비교된다. 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. 도 3(e)는 악티빈 처리된 (제26일) 및 비-처리된 (제24일) 내배엽으로부터 유래된 단일층 집단에서 CD31+ CD90+ 및 EPCAM+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. CD31+ 및 CD90+ 집단은 처리된 배양액에 비해 비-처리된 배양액에서 유의하게 더 컸다 (CD31: 13.6 +/- 2.3% vs 0.49 +/- 0.11%, P < 0.001; CD90: 41.2 +/- 4.7% vs 8.5 +/- 1.19%, P < 0.001, 스튜던트 t-시험, n = 3). 이와 대조적으로, 더 높은 비율의 EPCAM+ 세포가 비-처리된 세포로부터 생성된 집단에 비해 악티빈-처리된 내배엽으로부터 유래된 집단에서 검출되었다 (EPCAM: 90.7 +/-2.7% vs 56.8 +/- 7.3%; P < 0.01, n = 3). 도 3(f)는 악티빈 처리된 (제26일) 및 비-처리된 (제24일) 내배엽으로부터 생성된 배양액 내의 알부민 양성 세포의 비율을 제시하는 면역염색 분석을 보여준다. 알부민은 알렉사(Alexa) 488로 가시화된다. 축척 막대: 200 ㎛. (g) 악티빈-처리된 (회색 막대; 제26일) 및 비-처리된 (흑색 막대; 제24일) 내배엽으로부터 생성된 단일층 배양액 내의 알부민 (ALB) 및 알파-태아단백질 (AFP) 세포의 비율을 나타내는 세포내 유동 세포 측정 분석. 도면 내의 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 (스튜던트 t-시험; n = 3). AL: 성인 간, FL: 태아 간.
도 4는 응집이 간의 성숙을 촉짐함을 보여준다. 도 4(a)는 배양 제28일에 간의 응집체의 위상차 영상이다. 축척 막대, 200 ㎛. 도 4(b)는 분화 제32일에 단일층 (흑색 막대) 및 3D 응집체 배양액 (회색 막대)에서 ALB, CPS1, TAT, G6P 및 TDO 발현의 RT-qPCR 기반 분석을 보여준다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 성인 간에서의 발현과 비교하여 제시된다. 도 4(c)는 단일층 (흑색 막대) 및 3D 응집체 배양액 (회색 막대)에서 분화 제32일에 CYP7A1, CYP3A7 및 CYP3A4 발현에 대한 RT-qPCR 기반 분석이다. 발현 수준은 TBP와 비교된다. 도 4(d)는 제36일에 단일층 (2D) 및 응집체 (3D) 내의 아시알로-당단백질 수용체-1+ (ASGPR-1) 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. ASGPR-1+ 세포의 빈도는 3D 응집체 배양액에서 유의하게 더 높았다 (2D: 28.8 +/- 3.1%, 3D: 64.7 +/- 4.26%, P < 0.001, n = 3). 모든 그래프 내의 막대는 3개의 독립적인 실험의 샘플의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, 스튜던트 t-시험, AL: 성인 간, FL: 태아 간, PH; 2일 동안 배양한 1차 간세포).
도 5는 cAMP 신호전달이 hESC-유래 간세포-유사 세포의 성숙을 유도함을 보여준다. 도 5(a)는 8-Br-cAMP의 존재 및 부재 하에 배양된 간의 응집체에서 PGC1-α, HNF4α, AFP, ALB, G6P, 및 TAT 발현의 RT-qPCR 분석이다. 발현 수준은 TBP와 비교된다. 도 5(b)는 8-Br-cAMP의 존재 및 부재 하에 배양된 간의 응집체에서 알파-태아단백질 (AFP)+ 및 알부민 (ALB)+ 세포 (제44일)의 비율을 보여주는 세포내 유동 세포 측정 분석이다. AFP+ 세포의 빈도는 비-유도된 집단에 비해 cAMP로 유도된 집단에서 유의하게 더 낮았다 (34.5 +/- 12.4% vs 56.9 +/- 3.6%, P < 0.05, 평균 +/- SD, n = 3). 다른 한편으로, ALB 양성 세포의 비율은 cAMP-처리된 집단에서 유의하게 더 높았다 (89.5 +/- 5.6% vs 82.3 +/- 3.0%, P < 0.05 (평균 +/- SD, n = 3). 도 5(c)는 HES2, H9 및 38-2 세포로부터 생성된 cAMP 처리된 췌장 응집체 및 간 응집체에서의 PGC1-α 발현의 RT-qPCR 분석이다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 비-처리된 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. 도 5(d)는 비-처리된 및 cAMP-처리된 응집체에서 제44일에서의 ICG 흡수를 보여준다. 모든 그래프 내의 막대는 3개의 독립적인 실험으로부터의 값의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, 스튜던트 t-시험, AL: 성인 간, FL: 태아 간.
도 6은 cAMP 신호전달이 hESC-유래 간세포에서 대사 효소 활성을 증가시킴을 보여준다. 도 6(a)는 8-Br-cAMP의 존재 및 부재 하에 배양된 간의 응집체 (제44일)에서 CYP3A7, CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6 및 UGT1A1의 발현을 보여준다. 1차 간세포 (PH)에서의 수준은 대조군으로 제시된다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 비-처리된 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. 도 6(b)는 비처리된 (-) 및 cAMP-처리된 (+) 단일층 집단 (제44일)에서 PGC1a, TAT, HNF4α, CYP1A2 및 CYP3A4의 발현을 보여주는 RT-qPCR 분석을 보여준다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 비-처리 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. 도 6(c)는 비-처리된 (-Act) 또는 연장된 악티빈 처리된 (+Act) 내배엽으로부터 생성된 cAMP 처리된 응집체 (제44일)에서 CYP1A2 및 ALB 발현의 RT-qPCR 분석을 보여준다. 도 6(d)는 8-Br-cAMP에서 6일 동안 (cAMP +/-) 또는 12일 동안 (cAMP +) 배양된 응집체에서 CYP1A2 발현의 RT-qPCR 분석을 보여준다. 도 6(e)는 hESC-유래 간 세포가 시험관 내에서 CYP1A2 활성을 제시함을 보여준다. 비-처리된 및 cAMP-처리된 응집체 및 1차 간세포를 페나세틴 (200 μΜ)과 함께 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 페나세틴으로부터 O-탈에틸화된 대사물질인 아세트아미노펜을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 활성은 10,000개 세포마다 제시된다 (*p < 0.05, n = 5). 도 6(f)는 hESC-유래 간 세포가 시험관 내에서 CYP2B6 활성을 제시함을 보여준다. cAMP-처리된 응집체 및 1차 간세포를 부프로피온 (1 μΜ)과 함께 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 부프로피온으로부터 대사물질 O-히드록시-부프로피온의 형성은 HPLC에 의해 측정하였다. 활성은 50,000개 세포마다 제시된다 (n = 3). 도 6(g)는 술파메타진 (SMZ)의 N-아세틸화 SMZ로의 대사가 II상 효소(들) NAT1 및/또는 NAT2의 존재를 나타냄을 제시한다. cAMP-처리된 응집체 및 1차 간세포를 SMZ (500 μΜ)와 함께 48 hr 동안 배양하고, N-아세틸화 SMZ를 HPLC에 의해 측정하였다. 활성은 10,000개 세포마다 제시된다 (n = 3). 도 6(h)는 총 UGT 활성을 나타내는 cAMP-처리된 응집체에 의한 4-메틸움벨리페론 (4-MU)으로부터 4-MU 글루쿠로니드 (4-MUG)의 생성을 보여주는 HPLC 분석이다. cAMP-처리된 응집체 및 1차 간세포를 4-MU와 함께 48시간 동안 배양하였다. 4MUG의 형성을 HPLC에 의해 측정하였다. 활성은 10,000개 세포마다 제시된다 (n = 3). 모든 그래프 내의 막대는 3개의 독립적인 실험으로부터 샘플의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, 스튜던트 t-시험, PH; 1차 간세포.
도 7은 상이한 다능성 줄기세포주로부터의 간의 분화를 보여준다. 도 7(a)는 H9 hESC, H1 hESC 및 38-2 iPSC로부터 생성된 악티빈/Wnt3a 유도된 제6일 EB 내의 CXCR4+, CKIT+, EPCAM+, SOX17+ 및 FOXa2+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. 도 7(b)는 상이한 시간 동안 악티빈으로 처리된 H9, H1 및 38-2-유래 내배엽으로부터 생성된 단일층 배양액에서 알부민 발현의 RT-qPCR 분석을 보여준다. 상이한 집단을 다음과 같은 시간에 분석하였다: 악티빈 부재: 분화 제24일, 2일 악티빈: 제26일, 4일 악티빈: 제28일. 도 7(c)는 상이한 hPSC 주로부터 생성된 ALB 및 AFP 양성 세포의 빈도를 보여주는 세포내 유동 세포 측정 분석을 보여준다 (악티빈 부재 (-): 분화 제24일, 2일 악티빈: 제26일, 4일 악티빈: 제28일). 도 7(d)는 배양 제26일에 H9-유래 간의 세포의 형태를 보여주는 위상차 영상이다. 축척 막대: 200 ㎛. 도 7(e)는 8-Br-cAMP의 존재 및 부재 하에 배양된 H9- 및 iPSC (38-2)-유래 간의 응집체 (제44일)에서 CYP3A7, CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6 및 UGT1A1을 보여주는 RT-qPCR 분석을 보여준다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 비-처리 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. 모든 그래프 내의 막대는 3개의 독립적인 실험으로부터의 값의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, 스튜던트 t-시험, AL: 성인 간, FL: 태아 간, PH: 1차 간세포.
도 8 (a) (b) (c)는 CHIR99021이 진정 내배엽 세포를 유도할 수 있음을 보여준다. (a) 악티빈/wnt3a 또는 (b) 악티빈/CHIR 99021을 사용한 배상체 유도 제6일에 또는 (c) 악티빈/wnt3a 또는 (d) 악티빈/CHIR 99021을 사용한 단일층 유도 제7일에 CXCR4+, CKIT+ 및 EPCAM+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석. (e), (f) 및 (g) NSG 마우스에서 이소성 간 조직. 이식 2개월 후의 hESC-유래 간세포의 클러스터 (화살촉)를 보여주는 장간막의 H&E 염색 절편의 현미경 사진. 배율은 5X이었다. 장 (화살표), 이식된 세포 (화살촉). (f) 도 8(c)의 H&E 염색 절편의 고배율 (10X) 현미경 사진. (g) (h) 이식 2개월 후의 장간막 영역 내의 hESC-유래 세포의 존재를 보여주는 조직화학적 염색. 인간 알부민의 이중 염색 (알렉사 488: 화살표로 제시된 녹색 및 화살촉으로 제시된 CK19 (Cy3: 적색))은 이식된 세포가 간세포 및 담관세포 계통으로 분화할 잠재력을 가짐을 보여준다. HESC-유래 간세포-유사 세포는 알부민 양성 세포 (화살표)로 관찰된 반면, 담관세포 유사 세포는 CK19를 발현하고, 도관 유사 구조 (화살촉)로 발견되었다.
도 9는 간 전구세포 증식 및 성숙에 영향을 주는 인자를 제시한다. 도 9(a)는 Wnt 신호전달 및 Smad 신호전달에 의한 간 전구세포 집단의 팽창을 보여준다. 상이한 농도의 CHIR99021 (0.3 μΜ, 1 μΜ 및 3 μΜ) 및 TGF베타 억제제 SB431542 (6 μΜ)에서 H9-유래 제27일 간 전구세포의 배양 9일 후의 ALB+AFP+ 세포 수의 증가 배수가 제시된다. 도 9(b) 및 (c)는 H9-유래 제27일 간 전구세포의 배양 9일 (제36일) 후의 ALB 양성 세포의 존재 (b) 및 ALB 및 HNF4α의 이중 양성 (c)을 보여주는 면역형광 염색을 보여준다. 도 9(d) 및 (e)는 Wnt/β-카테닌 및 MEK/Erk 신호전달의 억제가 제44일 응집체 (3개 모두)에서 CYP3A4 (에르킨힙 +camp 충분) 및 CYP1A2의 발현을 증가시킴을 보여준다. Wnt 억제제 XAV 939 (1 μΜ) 및 MEK/Erk 억제제 PD0325901 (1 μΜ)을 8-Br-cAMP와 함께 분화 제30일에 단독으로 또는 함께 응집체 배양액에 첨가하였다. CYP3A4 (d) 및 CYP1A2 (e)의 발현은 성인 간에서 발견된 수준과 비교하여 제시된다. cAMP와 함께 MEK/ErK 억제제의 첨가는 성인 간에서 발견된 것에 대등한 CYP3A4 발현 수준을 유도한 반면, cAMP와 함께 Wnt 및 MEK/ErK 억제제 둘 모두의 첨가는 가장 높은 수준의 CYP1A2 발현을 유도하였다. 도 9(f)는 상이한 세포외 기질 (ECM) 상에서 제26일 간세포-유사 세포에서의 ALB의 발현을 보여준다. 제시된 값은 1로 설정된 젤라틴 상에서 배양된 세포와 비교된다.
도 10은 간 전구세포 내의 노치 신호전달 경로가 담관세포 계통의 분화에 영향을 줌을 보여준다. (a) 콜라겐/매트리겔 (Matrigel) 매트릭스에서 생성된 3차원 (3D) 조직으로부터의 H&E 염색 절편의 고 배율 (20X) 현미경 사진. H9-유래 제25일 간 전구세포를 저 클러스터 배양 접시에서 48시간 동안 OP9- 델타 1 간질 (stromal) 세포와 5:1의 비로 혼합 (응집)하였다. 키메라 응집체를 3D 공동 배양액을 확립하기 위해 유형 1 콜라겐 (80%) 및 매트리겔 (20%)의 혼합물에 포매하였다. 배양액을 HGF 20 ng/ml 및 EGF 50 ng/ml을 함유하는 배지에 GSI의 존재 또는 부재 하에 9일 동안 유지시켰다. 응집체 형태는 GSI로 처리된 배양액에서 유지되었다. 상기 응집체는 알부민을 발현하는 간세포-유사 세포를 함유하였다. GSI의 부재 하에, 응집체는 광대한 분지형 구조를 발생시켰다. 분지 내의 세포는 상피 형태를 제시하고, 내강 (inner lumen) 주위에 조직적인 형태를 보였다. 상기 세포는 CK19를 발현하였고, 이것은 이들이 담관세포이고 분지형 구조가 발생하는 담관을 나타낼 수 있음을 시사한다. 도 10(b)는 노치 신호전달의 활성화가 도관 구조에서 CK19 및 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR)의 발현을 상향조절함을 보여준다. 제시된 값은 GSI의 존재 하에 배양된 세포와 비교된다. 노치 (-) 공동 배양액 내의 세포 (즉, GSI로 처리된)는 알부민의 발현에 의해 입증되는 바와 같이 간세포의 특징을 보유하였다. 도 10(c)는 3D 공동 배양액에서 CFTR의 발현이 단일층 배양액에서 발견되는 것보다 더 높게 유도됨을 보여준다. 제시된 값은 단일층 조건에서 배양된 세포와 비교된다.
도 11은 간세포/담관세포 분화 프로토콜의 모식도이다. (a) 진정 내배엽을 생성하기 위한 단일층 배양액은 또한 wnt3a 또는 CHIR 99021과 함께 악티빈의 존재 하에 생성되었다. 단일층 유도시에 제5일의 내배엽 세포는 EB에서 제6일의 세포와 동등하다. 제5일 이후의 추가의 악티빈 처리는 또한 간 전구세포 및 성숙 간세포의 생성을 위한 단일층 배양액에 필요하다. (b) 진정 내배엽을 생성하기 위해 사용된 EB 배양액. (c) 담관세포를 생성하기 위해 사용된 프로토콜의 모식도. 단일층 배양액에서 생성된 진정 내배엽은 배양 제25일까지 간 전구세포 (간모세포)의 생성을 유발하는 간의 운명으로 특정화되었다. 간 전구세포를 분리하고 2일 동안 저 클러스터 접시에서 OP9/OP9 델타 세포와 응집시켰다. 키메라 응집체를 콜라겐/매트리겔 겔에 포매하고, 범 (pan) 노치 신호전달의 억제제 (예를 들어 노치 길항제), 감마-세크레타제 억제제 (GSI) L-685, 458의 존재 또는 부재 하에 HGF (20 ng/ml) 및 EGF (50 ng/ml)로 보충된 배지에서 배양하였다.
도 12는 hESC-유래 내피 세포가 간의 성숙을 향상시킴을 보여준다. (a) hESC-유래 내피 세포 (RFP-양성) 및 간모세포로 이루어진 키메라 응집체의 생성을 위해 사용되는 프로토콜. RFP(+)/CD34(+) 내피 세포는 EB를 BMP4로 4일 동안 유도한 후, VEGF 및 bFGF로 추가의 2일 동안 유도함으로써 생성되었다. FACS 단리된 RFP(+)/CD34(+) 내피 세포를 콜라겐 유형 I 코팅 웰에 도말하고, VEGF 및 bFGF의 존재 하에 EGM-2 배지로 6일 동안 배양하였다. 키메라 응집체를 생성하기 위해, 배양된 RFP(+)/CD34(+) 세포를 트립신 처리하고, 분리하고, 애그리웰 (Aggrewell) 플레이트 내에 웰당 100개 세포의 세포 밀도로 넣었다. 배일 2일 후에, 제25일 간모세포를 RFP(+)/CD34(+) 내피 응집체 상에 웰당 1000개 세포의 세포 밀도로 배치하였다. 축척 막대 100 ㎛. (b) 제33일에 내피/간 응집체 내의 RFP 양성 세포를 보여주는 위상차 및 형광 영상. RFP는 내피 세포 없이 생성된 간의 응집체에서 검출되지 않는다. 축척 막대 100 ㎛. (c) 제33일에 내피/간세포 응집체 내의 RFP 양성 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석. (d) 제44일에 내피 세포가 존재하고 존재하지 않는 응집체에서 CYP3A4 발현을 보여주는 RT-qPCR 분석. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 성인 간 샘플에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다.
도 13은 hPSC-유래 간세포의 성숙에 대한 3D 겔 배양의 효과를 보여준다. 간모세포 또는 간모세포 및 내피 세포 (end)로 이루어진 응집체는 배양 제25일에 생성된 후, VEGF 및 bFGF로 보충된 간세포 배양 배지에서 액체 내에서 추가의 7일 동안 배양하고, 이어서 cAMP, PD0325901 (PD) 및 XAV939로 보충된 동일한 배지에서 12일 동안 배양하였다. 콜라겐의 성숙에 대한 효과를 시험하기 위해서, 제32일 키메라 응집체를 콜라겐 유형 1 겔에 포매하고, cAMP, PD0325901 및 XAV939의 존재 하에 12일 동안 배양하였다. 모든 배양액을 제44일에 수거하고, qRT-PCR에 의해 나타낸 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정된다. ALB 및 CYP3A4의 발현은 성인 간에서의 그의 수준과 비교한 변화 배수로 제시된다. AFP 및 CYP3A7의 발현은 태아 간에서의 그의 수준에 비교한 변화 배수로 제시된다. AL: 성인 간, FL: 태아 간.
도 14. hPSC 분화 배양에서 간모세포 발생 시기의 특성화. (a) 분화 프로토콜의 모식도. (b) 단일층 유도 방식으로 제7일에 CXCR4+, CKIT+, 및 EPCAM+ 집단의 발생을 보여주는 유동 세포 측정 분석. (c) 도 14a에 나타낸 배양 조건에서 유지된 H9-유래 간모세포에서 나타낸 유전자의 발현을 보여주는 RT-qPCR. 나타낸 유전자의 발현은 배양 제7, 13, 19 및 25일에 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 태아 간에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. AL: 성인 간, FL: 태아 간.
도 15. 노치 신호전달은 hPSC-유래 간모세포-유사 집단으로부터 담관세포 발생을 촉진한다. 노치 경로의 길항제인 감마-세크레타제 억제제 (GSI)의 존재 또는 부재 하에 HGF (20 ng/ml), EGF (50ng/ml), 및 TGFb1 (5 ng/ml)로 보충된 배지에서 OP9와의 공동 배양 후에 간모세포-유래 세포에서 ALB 및 CK19의 RT-qPCR-기반 발현 분석. 세포를 수거하고, 배양 제30, 33, 및 36일에 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 제27일 간모세포 응집체에서의 발현 수준과 비교한 변화 배수로 제시된다. (b) OP9와 함께 또는 그 없이 배양한 후 간모세포-유래 세포에서 노치 표적 유전자 HES1, HES5 및 HEY1의 RT-qPCR 기반 발현 분석. 세포를 배양 제36일에 검정하였다. 이 분석을 위해, 제27일 간모세포 응집체를 노치 신호전달 길항제 감마-세크레타제 억제제 (GSI)의 존재 또는 부재 하에 HGF, EGF, 및 TGFb1 (5 ng/ml)을 함유하는 배지에서 OP9 (OP9+) 간질 세포 또는 매트리겔 (OP9-) 상에 도말하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 매트리겔 상에 배양된 제36일에 세포에서의 발현 수준과 비교한 변화 배수로 제시되었다. 이 값은 1로 설정되었다. 모든 그래프 내의 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균의 표준 편차 (SD)를 나타낸다. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (스튜던트 t-시험; n = 3).
도 16. 3차원 배양은 담관세포 성숙을 촉진한다: 제25일 hESC-유래 세포 및 OP9 간질 세포 (GFP+)로 이루어진 키메라 응집체의 형태. H9-유래 제25일 간모세포를 저 클러스터 배양 접시에서 48시간 동안 OP9 간질 세포와 4:1의 비로 혼합 (응집)하였다. 키메라 응집체를 3D 겔 배양액을 확립하기 위해 유형 1 콜라겐 (1.2 mg/ml) 및 매트리겔 (40%)의 혼합물에 포매하였다. 배양액을 GSI의 존재 또는 부재 하에 HGF, EGF 및 TGFb1을 함유하는 배지에서 2주에 걸쳐 유지하였다. (b) 3D 배양에서 발생한 관형, 낭포 또는 구체 형태를 보이는 구조의 비율. 값은 GSI의 존재 또는 부재 하에 발생한 총 구조의 비율로서 제시된다. 값은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. (c) 3D 겔에서 발생한 수집한 구조의 RT-qPCR 기반 발현 분석. 배양액을 제44일에 수거하고, 세포를 간세포 (ALB, AFP 및 CYP3A7) 및 담관세포 (CK19, Sox9 및 CFTR) 계통을 나타내는 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 GSI로 처리된 집단에서의 발현 수준과 비교한 변화 배수로 제시된다.
도 17. hPSC-유래 담관세포는 생체 내에서 도관-유사 구조를 형성한다. (a-b) HGF, EGF 및 TGFb1을 함유하는 배지에서 9일 동안 OP9 간질 세포와 함께 공동 배양된 제25일 간모세포-유래 세포의 이식 8주 후에 매트리겔 플러그 (plug) 내의 담관세포 이식편의 조직학적 분석. 공동 배양 후에, 세포를 분리하고, 면역결핍 NOD/SCID/IL2rg -/- (NSG) 마우스의 유방 지방 패드 내로 이식하였다 (수여자당 106). 다중 도관 구조가 저 (a) 및 고 배율 영상 (b) (H&E 염색)에서 유방 지방 패드에서 가시화되었다. (c-d) 이식 후에 유방 지방 패드에서 발생한 hESC-유래 도관 구조에서 RFP-양성 세포를 검출하기 위한 면역염색. 상기 연구를 위해, 담관세포를 ROSA 유전자좌로부터 RFP를 발현하는 HES2-RFP hESC로부터 생성시켰다. OP9 간질 세포와의 공동 배양 9일 후에 생성된 담관세포를 NSG 마우스의 유방 지방 패드 내에 이식하였다. 이식 8주 후에 발생한 이식편은 면역조직화학에 의해 RFP+ 세포의 존재에 대해 분석하였다. RFP-양성 세포는 모든 도관 구조에서 검출되었고, 이를 통해 세포가 인간에서 기원하고, HES2- RFP 세포로부터 유래함을 확인할 수 있다. RFP+ 구조는 저 (c) 및 고 (d) 배율의 영상에서 가시적이었다.
도 18. 기능성 CFTR 단백질을 함유하는 3D 겔에서 생성된 hPSC-유래 낭포 구조. (a) H9 (hESC)- 및 Y2-1 (iPSC)-유래 담관세포로부터 생성된 칼세인-그린-표지된 및 포르스콜린/IBMX (F/I) 자극된 낭포 구조의 대표적인 공초점 현미경 영상. 영상은 F/I 자극 24시간 후에 찍었다. 축척 막대 500 ㎛. (b) CFTR 억제제의 존재 또는 부재 하에 F/I 자극 24시간 후의 낭포 팽윤의 정도의 정량. F/I 자극된 낭포 팽윤은 속도 영상화 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 낭포의 총 크기는 F/I 자극 전의 크기에 대해 정규화하였다. 값은 3개의 개별적인 실험으로부터 얻은 것이다. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (스튜던트 t-시험; n = 3).
도 19. 낭성 섬유증 환자 iPSC로부터 담관세포의 생성. (a) 포르스콜린의 존재 또는 부재 하에 3D 겔 배양의 제44일에 CFTR 제거된 F508 iPS 세포 (CF-iPSC)로부터 유래된 담관세포 유사 세포의 위상차 영상. CF-iPSC-유래 간모세포 및 키메라 간모세포/OP9 응집체는 도 14a에 제시된 프로토콜을 사용하여 생성되었다. 콜라겐/매트리겔 배양액에 포매한 후, 2주 배양 기간의 처음 1주 동안 포르스콜린의 첨가에 의해 응집체로부터 낭포 형성을 유도하였다 (좌측). 포르스콜린 자극의 부재 하에, CF-iPSC 유래 담관세포는 속이 빈 낭포가 아니라 분지형 도관 구조를 형성하였다 (우측). (b) 배양 7 및 14일에 CF-iPSC 및 정상 iPSC (Y2-1)-유래 담관세포로부터 발생한 낭포 구조의 수의 정량. CF-iPSC 유래 담관세포는 2주의 배양 기간의 처음 1주 동안 포르스콜린의 존재 또는 부재 하에 3D 겔 조건에 유지하였다 (좌측 그래프). 정상 iPS 세포-유래 담관세포는 2주의 배양 기간의 처음 1주 동안 CFTR 억제제의 존재 또는 부재 하에 유지하였다 (우측 그래프). 포르스콜린의 첨가는 배양 7 및 14일 둘 모두에서 CF-iPSC 유래된 담관세포로부터 발새한 낭포 구조의 수를 증가시켰다 (좌측 그래프). 정상 iPSC-유래 담관세포에 대한 CFTR 억제제의 첨가는 낭포 형성을 지연하였다 (우측 그래프). (c) 제44일에 정상 iPSC- (상부 패널) 및 CF-iPSC-(하부 패널) 담관세포로부터 유래된 낭포의 조직학적 분석. 두 담관세포 집단을 2주의 배양 기간의 처음 1주 동안 포르스콜린의 존재 하에 배양하였다. 정상 iPSC-유래 담관세포에 대한 포르스콜린의 첨가는 큰 속이 빈 낭포의 형성을 유도하였다 (상부 패널). CF-iPSC-유래 낭포는 더 작고, 종종 내부 격막을 함유하였다 (하부 패널).
도 20. 소분자 교정자 (corrector) VX-809 및 C4를 사용한 처리에 의한 CF-iPSC-유래 담관세포에서 CFTR 기능의 회복. 웨스턴 블롯 분석은 VX-809 및 C4로 처리된 CF-iPSC-유래 담관세포에서 CFTR의 성숙 복합 글리코실화된 형태의 축적 (밴드 C)을 보여준다. 단백질의 돌연변이체 형태 (밴드 B)는 비교정된 (uncorrected) 세포에서 우세하였다. 인간 기관지 상피 세포 (HBE)를 양성 대조군으로 사용하였다. (b) 2명의 개별적인 환자 (997 CFTR del 및 C1 CFTR del - 둘 모두 델타F508 돌연변이 보유)로부터 CF-iPSC로부터 생성된 칼세인-그린-표지된 및 포르스콜린/IBMX (F/I) 자극된 낭포 구조의 대표적인 공초점 현미경 영상. 영상은 F/I 자극 24시간 후에 찍었다. 축척 막대 500 ㎛. (c) CFTR 억제제의 존재 또는 부재 하에 F/I 자극 24시간 후에 hPSC-낭포에서 관찰된 팽윤도의 정량. F/I 자극된 낭포 팽윤은 속도 영상화 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 낭포의 총 크기는 각각의 3개의 개별적인 실험으로부터 F/I 자극 전의 크기로 정규화된다. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (스튜던트 t-시험; n = 3).
도 21. OP9와의 공동 배양 9일 후에 간모세포-유래 집단 내의 ALB+ 및 CK19+ 세포의 비율을 보여주는 세포내 유동 세포 측정 분석. 세포를 GSI의 존재 또는 부재 하에 HGF, EGF 및 TGFb1을 함유하는 배지에서 배양하였다. Ctrl은 이소형 대조군을 보여준다.
도 22. 다른 hPSC로부터의 간모세포의 간의 특정화 및 분화. 도 14a에 나타낸 바와 같이 유지된 HES2 및 Y2-1 iPS 세포-유래 간모세포에서 나타낸 유전자의 발현을 보여주는 RT-qPCR 분석. 나타낸 유전자의 발현을 배양 제7, 13, 19 및 25일에 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 태아 간에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. AL: 성인 간, FL: 태아 간.
도 23. hPSC-유래 담관세포로부터 낭성 구조의 생성을 위해 사용된 3D 겔. (a) 제25일 hPSC 유래 간모세포 및 OP9 세포 (GFP+)로 이루어진 키메라 응집체를 생성하기 위해 사용된 분화 프로토콜의 모식도. 제25일 간모세포를 분리하고, 저 클러스터 배양 접시에서 4:1의 비로 OP9 세포와 함께 공동 배양하였다. 키메라 응집체를 유형 1 콜라겐 (1.2 mg/ml) 및 매트리겔 (20%)의 혼합물로 이루어진 겔에 포매하였다. (b) HGF, EGF 및 TGFb1을 함유하는 배지에서 배양 제44일에 OP9의 존재 또는 부재 하에 겔에서 발생한 구조의 RT-qPCR 기반 발현 분석. 노치 표적 유전자의 발현은 OP9의 존재 하에 유의하게 상향조절되었다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 OP9의 부재 하에 배양된 세포에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. (c) 제44일 배양에서 GSI의 존재 (우측 패널) 또는 부재 (좌측) 하에 OP9 세포와 함께 배양된 H9 유래 담관세포로부터 낭포 구조의 조직학적 분석 (H&E 염색). (d) OP9의 존재 또는 부재 하에 배양된 정상 iPSC-유래 담관세포로부터 생성된 구조에서 CFTR 단백질의 성숙 복합 글리코실화된 형태 (밴드 C)를 보여주는 웨스턴 블롯 분석. 비분화된 정상 iPSC를 음성 대조군으로 사용하였다. (e) OP9의 존재 또는 부재 하에 배양된 정상 iPSC-유래 담관세포로부터 생성된 구조에서 CFTR의 RT-qPCR 기반 발현 분석. 세포를 배양 제44일에 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 caco-2 세포 (장 결장 암종 세포주)에서의 발현값과 비교한 변화 배수로 제시된다. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (스튜던트 t-시험; n = 3).
도 24. 낭성 섬유증 환자 iPSC로부터 진정 내배엽 및 간모세포의 생성. 단일층 배양의 제7일에 CF-iPS 세포 (C1 del CFTR)로부터 CXCR4+, CKIT+, 및 EPCAM+ 집단의 발생을 보여주는 유동 세포 측정 분석. (b) 도 14a에 제시된 배양 조건에 유지된 CF-iPSC-유래 간모세포 집단에서 나타낸 유전자의 발현을 보여주는 RT-qPCR 분석. 나타낸 유전자의 발현은 배양 제7, 13, 19 및 25일에 분석하였다. 값은 TBP와 비교하여 결정하고, 1로 설정된 태아 간에서의 발현과 비교한 변화 배수로 제시된다. AL: 성인 간, FL: 태아 간.
본원에 기재되는 일련의 단계를 통해 다능성 줄기세포 (PSC)로부터 간세포 및 담관세포의 효율적인 생성을 위한, 및 대사적으로 기능성인 간세포 및/또는 담관세포의 생성을 위한 우수한 및 신뢰할 수 있는 플랫폼이 본원에 기재된다. 예를 들어, 임의로 특정 세포 집단의 팽창 및/또는 특정 운명을 증가시키는 하나 이상의 단계와 조합하여, 예를 들어 FGF 효능제 유도 및 BMP4 효능제 유도와 조합하여 응집을 유도하고 cAMP 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 연장된 노달 (예를 들어 악티빈) 신호전달 처리는 예를 들어 팽창된 간모세포를 포함하는 간세포 및 담관세포 계통 세포 및/또는 배상체에서 유도된 진정 내배엽으로부터 또는 단일층으로부터 추가의 조작에 의한 기능성 및 성숙 간세포 및 담관세포의 재현가능한 생성을 허용함이 제시된다.
본 개시내용의 한 측면은 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 간세포 또는 담관세포주 세포, 예컨대 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은 (a) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편의 조합물을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계, (b) 세포 집단의 간세포 및/또는 담관세포 전구세포의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하여 간세포의 팽창된 집단 및/또는 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 집단을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 성숙 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다.
응집은 성숙을 위해 중요하고 성숙을 촉진하는 것으로 본원에서 입증된다.
한 실시양태에서, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포는 간모세포 및/또는 미성숙 간세포 및/또는 미성숙 담관세포를 포함한다.
용어 "접촉" (예를 들어 내배엽 세포 집단과 성분 또는 성분들의 접촉)은 성분(들) 및 세포를 함께 시험관 내에서 인큐베이팅하는 (예를 들어, 화합물을 배양액 내의 세포에 첨가하는) 것을 포함하는 것으로 의도되고, 접촉 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 부착 배양에서, 또는 현탁 배양에서 처리될 수 있고, 성분은 일시적으로 실질적으로 동시에 (예를 들어 함께 칵테일 (cocktail)로) 또는 순차적으로 (예를 들어 제1 성분 첨가 1시간, 1일 또는 그 초과의 시간 내에) 첨가될 수 있다. 세포는 또한 세포를 안정화하거나 또는 세포를 추가로 분화시키기 위해 또 다른 작용제, 예컨대 성장 인자 또는 다른 분화제 또는 환경과 접촉될 수 있고, 예를 들어 실시예에서 상세히 설명되는 바와 같이, 예를 들어 다능성 (및/또는 분화된) 집단의 배양을 위해 관련 기술 분야에 알려진 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "내배엽" 및 "진정 내배엽"은 매우 초기 배아의 3개의 1차 배아 세포층 중의 하나를 지칭한다 (다른 2개의 배아 세포층은 중배엽 및 외배엽이다). 내배엽은 3개의 층 중의 최내층이다. 내배엽 세포는 먼저 배아 내장을 생성한 후, 식도, 위, 장, 직장, 결장, 인두낭 유도체, 편도선, 갑상선, 흉선, 부갑상선, 폐, 간, 담낭 및 췌장을 포함하는 유도체 조직을 생성하도록 분화한다.
본원에서 사용되는 "유도된 내배엽 세포 집단"은 예를 들어 도 1a에 제시된 "진정 내배엽 유도" 시기에 대응하는 내배엽 세포의 집단을 의미한다. 이 집단은 예를 들어 노달 효능제, 예컨대 악티빈에 노출된 배상체 (EB)로부터, 또는 임의로 노달 효능제 및 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 Wnt3a 또는 GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021 (스테몰레큘(Ste분자)™ CHIR99021 스템전트 (Stemgent)), 6-브로모-인디루빈-3'-옥심 (BIO) (케이만 케미컬 (cat:13123)), 또는 스테몰레큘™ BIO (스템전트, cat:04003)에 노출된 EB로부터 제조될 수 있다. 별법으로, 유도된 내배엽 세포 집단은 단일층으로 성장한 세포로부터 제조될 수 있다. 유도된 내배엽 세포 집단은 예를 들어 유동 세포 측정 및 하나 이상의 마커, 예컨대 표면 마커 CXCR4, CKIT 및 EPCAM 및 전사 인자 SOX17 및 FOXA2에 대한 분자 분석에 의해 확인될 수 있다. 유도된 내배엽 세포 집단은 또한 예를 들어 CXCR4 및 CKIT 또는 CXCR4 및 EPCAM을 공동 발현하는 적어도 또는 70, 80, 90 또는 95% 초과의 집단에 의해 확인될 수 있다. 유도된 내배엽 세포 집단은 또한 예를 들어 SOX17 및/또는 FOXA2를 발현하는 70, 80, 90 또는 95% 초과의 집단에 의해 확인될 수 있다. 유도된 내배엽 세포 집단은 예를 들어 2D (단일층) 또는 3D (배상체 또는 다른 형태의 응집체) 방식으로 존재할 수 있다. 유도된 내배엽 집단은 예를 들어 실시예 1에 예시되는 바와 같이 hESC 및 유도된 다능성 세포 (iPSC)로부터 유래될 수 있다.
유도된 내배엽 세포 집단은 예를 들어 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하기 위해 노달 효능제 연장된 기간 처리될 수 있다.
실시예 1에서 설명되고 도 3a에 제시되는 바와 같이, 제6일 세포 (방법이 단일층 유도를 포함할 때 제5일)를 FGF/BMP4를 사용한 특정화 전에 악티빈에서 추가의 2일 동안 배양하면, 악티빈 (예를 들어 노달 효능제의 일례)에서 추가의 2일 동안 배양되지 않은 세포에 비해 제12일에 측정된 보다 높은 비율의 SOX17+ FOXA2+ 세포가 생성된다. 상기 단계는 "연장된 악티빈" 처리로도 본원에서 언급되고, "연장된 노달 효능제"는 처리의 일례이다.
본원에서 사용되는 "연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단"은 노달 효능제, 예컨대 악티빈으로 연장된 기간, 예를 들어 약 1 내지 약 4일 또는 추가의 약 1, 2, 3 또는 4일 (예를 들어, 노달 효능제 처리를 포함할 수 있는 내배엽 유도기에 추가된 "연장된 기간") 동안 처리된 유도된 내배엽 세포 집단을 의미한다. 본원에서 제시되는 연장된 노달 효능제 처리는 배양 제26일에 HEX, AFP, ALB 및 HNF4α를 포함하는 간 전구세포 (간모세포) 발생을 나타내는 유전자의 보다 높은 발현 수준을 야기하였다 (도 3d에 제시된 바와 같이). 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단은 배상체 (EB)에서 내배엽 세포를 유도함으로써 또는 단일층으로 내배엽 세포를 유도함으로써 얻고, 여기서 유도된 내배엽 집단은 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 생산하기 위해 노달 효능제, 예를 들어 악티빈의 존재 하에 연장된 기간 동안 배양한다.
연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단은 한 실시양태에서 배상체 (EB)에서 내배엽 세포를 유도함으로써 얻는다. 또 다른 실시양태에서, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단은 단일층으로 내배엽 세포를 유도함으로써 얻는다. 각각의 경우에, 유도된 내배엽 집단은 노달 효능제, 예를 들어 악티빈의 존재 하에 연장된 기간 동안 배양된다.
임의로, 유도된 내배엽 집단은 예를 들어 유도된 내배엽 세포 집단이 EB로부터 유래되는 실시양태에서 순차적으로 분리된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된 세포" 또는 "분리된 세포 집단"은 예를 들어 서로로부터 물리적으로 분리된, 3D 응집체에 존재하지 않는 세포를 의미한다. 분리된 세포는 세포의 클러스터 또는 응집 덩어리를 의미하는 "세포 응집체"와 구분된다.
한 실시양태에서, 유도된 내배엽 집단은 적어도 80%, 85%, 90%의 CXCR4 + 및 cKIT + 양성 세포 및/또는 적어도 70%, 75%, 80%의 SOX17+ 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유도된 내배엽 세포 집단 (및/또는 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단)은 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 생산된다. 다능성 줄기세포는 임의로 인간 ESC (hESC) 또는 인간 iPSC (hiPSC)이다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성"은 상이한 조건 하에서 하나 초과의 분화된 세포 종류로 분화하는 능력, 및 예를 들어 3개의 배아 세포층에 특유한 세포 종류로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 세포는 예를 들어 누드 마우스 기형종 형성 검정을 사용하여 하나 초과의 세포 종류로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 다능성은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 증명된다.
용어 "전구세포"는 그의 분화에 의해 생성할 수 있는 세포에 비해 완전히 분화된 세포보다 발생 경로 또는 진행의 보다 이른 단계에 존재하는 세포 표현형을 갖는 세포를 의미한다. 전구세포는 발생 경로 및 세포가 발생하고 분화하는 환경에 따라 구별되는 여러 분화된 세포 종류 또는 분화된 단일 세포 종류를 생성할 수 있다.
용어 "줄기세포"는 본원에서 사용되는 바와 같이 증식, 자기 재생 및 분화된, 또는 분화가능한 딸 세포를 생성할 수 있는 매우 많은 모 세포를 생성하는 능력을 갖는 보다 많은 전구세포를 생성할 수 있는 비분화된 세포를 의미한다. 딸 세포는 예를 들어 모 발생 잠재력을 갖는 하나 이상의 세포를 계속 보유하면서 증식하고 하나 이상의 성숙 세포 종류로 후속적으로 분화하는 자손체를 생산하도록 유도될 수 있다.
용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 다능성 줄기세포를 나타내기 위해 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 5,843,780, 6,200,806 참조). 상기 세포는 또한 체세포 핵 치환으로부터 유래된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 얻을 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,945,577, 5,994,619, 6,235,970 참조). 배아 줄기세포의 독특한 특징은 배아 줄기세포 표현형을 규정한다. 따라서, 세포는 세포가 다른 세포와 구별될 수 있도록 하는 배아 줄기세포의 하나 이상의 특유한 특징을 갖는다면 배아 줄기세포의 표현형을 갖는다. 예시적인 독특한 배아 줄기세포 특징은 비제한적으로 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에 대한 반응성 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법은 (a) 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써 연장된 노달 효능제 처리 내배엽 세포 집단을 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단으로 특정화하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 특정화 단계는 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 FGF 효능제 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. FGF 효능제는 예를 들어 bFGF, FGF10, FGF2 또는 FGF4, 활성 단편 및/또는 그의 조합일 수 있다. 조합물은 세포에 예를 들어 순차적으로 첨가될 수 있다.
한 실시양태에서, 특정화 단계는 먼저 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 FGF10 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 약 40 내지 약 60시간, 예를 들어 약 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 또는 약 60시간 동안 접촉시킨 후, 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 bFGF 및 BMP4를 포함하는 특정화 배지와 약 4 내지 약 7일, 예를 들어 약 4, 5, 6 또는 약 7일 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 특정화 배지는 1% vol/vol B27 보충물 (인비트로겐: A11576SA), 아스코르브산, MTG, FGF10 (50 ng/ml) (예를 들어 제8일 내지 제10일), bFGF (20 ng/ml) (예를 들어 제10일 내지 제14일), 및 BMP4 (50 ng/ml)로 보충된 이스코브 변형 둘베코 (Iscove's Modified Dulbecco) 배지 (IMDM)를 포함한다.
임의로, 내배엽 세포 집단은 FGF10 및 BMP4와 1 내지 3일, 임의로 2일 동안 접촉된 후, bFGF 및 BMP4와 2 내지 6일, 임의로 3 내지 5일, 임의로 4일 동안 접촉된다. 일부 실시양태에서, 내배엽 세포 집단은 BMP4 및 FGF10 또는 bFGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 인큐베이팅된다. 임의로, 내배엽 세포 집단은 1% vol/vol B27, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, BMP4 및 FGF10 또는 bFGF을 보충한 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함하는 세포 배양 배지에서 인큐베이팅된다.
일부 실시양태에서, 내배엽 세포 집단이 분리된 후, 단일층 세포가 FGF 및 BMP4 효능제와 접촉된다.
다른 실시양태에서, 단일층 세포는 FGF 및 BMP4 효능제, 예컨대 BMP4와 접촉하기 전에 악티빈과 1 내지 4일, 임의로 1, 2, 3 또는 4일 동안 접촉된다. 임의로, 단일층 세포는 악티빈 A를 포함하는 세포 배양 배지, 임의로 bFGF, 악티빈 A 및 BMP4를 보충한 StemPRO-34를 포함하는 배지에서 인큐베이팅된다.
추가의 실시양태에서, 특정화 단계는 세포를 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 촉진하는 하나 이상의 인자를 포함하는 특정화 배지와 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "특정화 배지"는 세포 또는 세포 집단의 특정화를 촉진하거나 용이하게 하기 위해 사용되는 배양 배지를 의미한다. 간 특정화 배지의 일례는 1% vol/vol B27 (인비트로겐: A11576SA), 및 아스코르브산, MTG, BMP4 효능제 및 FGF10, bFGF, FGF4 및 FGF2로부터 선택되는 적어도 하나의 FGF 효능제로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함한다. 몇몇의 시기에 대해 및 일부 실시양태에서, 동일한 특정화 배지가 예를 들어 간세포 및 담관세포 계통 둘 모두를 특정화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 시기 및 다른 실시양태에서, 특정화 배지는 간세포 및/또는 담관세포 발생의 특정화를 촉진하는 하나 이상의 인자, 예를 들어 노치 길항제 또는 노치 효능제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "특정화"는 세포가 특정 세포 운명을 향하도록 인도하는 과정을 의미하고, 그 전에 세포 종류는 아직 결정되지 않고 세포가 특정 운명을 향하도록 하는 임의의 편향도 (bias)는 역전되거나 또 다른 운명으로 전환될 수 있다. 특정화는 전형적인 조건 하에서 세포의 운명이 변경될 수 없는 상태를 유도한다.
간의 운명을 따른 유도된 내배엽의 특정화는 예를 들어 실시예 9에서 제시되는 바와 같이 예를 들어 Tbx3, ALB, AFP, CK19, Sox9, NHF6베타 및 노치2를 포함하는 간 및/또는 담관세포 발현 유전자를 측정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 노치 2 발현은 HGF/DEX/OSM 처리 간모세포에서 상향조절됨이 입증된다. 노치2 단백질 및/또는 발현의 검출은 담관세포로 특정화될 수 있음을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 노치2는 실시예 9에서 설명되는 바와 같이 검출될 수 있다.
세포의 맥락에서, 용어 "분화된", 또는 "분화하는"은 상대적인 용어이고, "분화된 세포"는 비교되고 있는 세포보다 발생 경로의 하류로 더 진행된 세포이다. 따라서, 줄기세포는 계통-제한된 전구체 세포 (예컨대 유도된 내배엽 전구세포)로 분화할 수 있고, 이는 다시 경로의 보다 하류의 다른 종류의 전구체 세포로 분화한 후, 특정 조직 종류에서 특유한 역할을 수행하고 추가로 증식하는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 말기의 기능성 세포로 성숙할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "분화"는 유도된 내배엽 집단 및 특정화된 세포 집단, 예를 들어 간세포 또는 담관세포 특정화된 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 응집체는 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 적어도 90%의 알부민 양성 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 응집체는 배양액에서 24, 25, 26, 27, 또는 28일 후에 생성된다 (예를 들어, PSC가 얻어지는 날이 제0일로 간주된다).
임의로, 응집체는 효소 처리 및/또는 수동 분리에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 응집체는 세포를 콜라게나제 및/또는 TrypleLE 처리에 의해 분리함으로써 생성된다. 일부 실시양태에서, 세포를 후속적으로 초저 (ultra-low) 클러스터 접시 내에서 배양한다. 다른 실시양태에서, 단일층 배양액은 피페팅에 의해 기계적으로 파괴될 수 있거나, 또는 효소에 의해 분리되고, 저부착 플레이트에서 인큐베이팅하거나 세포 집단을 진탕함으로써 응집될 수 있다. 애그리웰이 임의로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포 (예를 들어 단일층 및 응집 전 세포)를 매트릭스 코팅된 플레이트, 임의로 매트리겔 코팅된 플레이트 상에 성장시킨다. 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포의 부착을 지지하는 다른 매트릭스 코팅된 플레이트, 예를 들어 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐 코팅된 플레이트가 또한 사용될 수 있다. 도 9f는 예를 들어 몇몇의 상이한 매트릭스 코팅 기재를 사용한 유도 제26일에서의 ALB 발현을 보여준다.
성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 하나 이상의 하위단계를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 응집체를 간세포 성장 인자 (HGF), 덱사메타손 (DEX) 및/또는 온코스타틴 M (OSM) 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편의 존재 하에 배양한다. 예를 들어, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, DEX 및/또는 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 응집 전에 약 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 배양할 수 있고/있거나 응집 후에 응집체는 HGF, DEX 및/또는 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 약 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 배양할 수 있다. 예를 들어, 약 10 ng/mL HGF의 첨가는 응집체의 생존을 촉진한다.
한 실시양태에서, 성숙의 유도, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 응집체의 세포 내의 cAMP 경로를 활성화하여, 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 분화 및/또는 성숙을 유도하는 것을 추가로 포함한다.
예를 들어 단일층 유도된 세포에 대해 제25일에 및 EB 유도된 세포에 대해 제26일에 세포의 연장된 노달 효능제 처리 및 응집은 예를 들어 cAMP 신호전달에 반응할 수 있는 집단을 생산한다. 본원에서 제시되는 바와 같이, cAMP의 활성화는 CYP 발현 및 간세포 성숙을 증가시킨다.
또 다른 실시양태에서, cAMP 경로의 활성화는 응집체를 cAMP 효능제 유사체, 예컨대 8-브로모아데노신-3'5"-시클릭 모노포스페이트 (8-Br-cAMP), 디부티릴-cAMP, 아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-cAMPS) 및/또는 8-브로모아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-8-Br-cAMPS)) 및/또는 임의의 다른 cAMP 효능제, 예컨대 콜레라 독소, 포르스콜린, 카페인, 테오필린 및 백일해 독소와 접촉시키는 것을 포함한다. 실험은 예를 들어 Sp-8-Br-cAMP (비올로그 (Biolog): Cat. No.: B 002 CAS No.: 127634-20-2]), 8-Br-cAMP 및 포르스콜린 (FSK) (시그마 (Sigma):66575-29-9)을 사용하여 수행되었다. 예를 들어, 포르스콜린 (FSK)(시그마: 66575-29-9)+XAV939+PD0325901을 포함하는 조합물은 CYP 발현을 증가시키고 간세포 전구세포의 간세포로의 성숙을 유도하는데 효과적이었다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "cAMP 효능제"는 cAMP, cAMP를 활성화하는 cAMP 유사체, 및 cAMP를 활성화하는 분자, 예컨대 콜레라 독소, 포르스콜린, 카페인, 테오필린 및 백일해 독소를 포함한다. 포스포디에스테라제 억제제인 IBMX (포스포디에스테라제는 cAMP 억제제임)도 일부 실시양태에서, 예를 들어 포르스콜린과 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 예를 들어 10 ng/ml HGF (20 ng/ml로부터 감소됨)의 첨가는 응집체의 생존을 촉진하는 반면, OSM의 유지는 1상 CYP 효소, 특히 CYP 3A4의 발현 유도에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 응집체는 OSM의 부재 하에 cAMP 유사체 및/또는 효능제와 함께 배양된다.
본원에서 사용되는 용어 "성숙"은 세포 (예를 들어 간모세포)가 보다 분화되고/되거나 완전한 기능성 상태, 예를 들어 생체 내에서 그의 기능성 상태를 달성하기 위해 필요한 과정이다. 한 실시양태에서, 미성숙 간세포 또는 간 전구세포가 성숙, 기능성 간세포로 되는 과정은 성숙으로 언급된다.
도 1a는 "간의 성숙 A"를 나타내고, 도 14a는 간모세포 분화를 나타낸다. 두 경우에 언급되는 세포 집단은 예를 들어 임의로 HGF 및 OSM 및/또는 cAMP와 조합하여 DEX의 존재 하에 계속 배양될 경우 간세포를 생산하거나, EGF, TGB1, HGF 및 EGF의 존재 하에 노치 효능제 (예를 들어 노치 신호 공여자), 예컨대 OP9, OP9 델타 및/또는 OP9 Jagged1 세포와 조합하여 배양될 경우 담관세포를 생산할 수 있는 간모세포 집단이다.
본원에서 사용되는 용어 "성숙 배지"는 세포 또는 세포 집단의 성숙을 촉진하거나 용이하게 하기 위해 사용되고 성숙 인자, 및 세포 팽창 인듀서 및 계통 인듀서를 포함할 수 있는 배양 배지를 의미한다. 간세포 성숙을 유도하기 위한 성숙 배지의 일례는 1% vol/vol B27 (인비트로겐: A11576SA) 및 아스코르브산, 글루타민, MTG 및 임의로 간세포 성장 인자 (HGF), 덱사메타손 (Dex) 및/또는 온코스타틴 M으로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함한다. 간세포를 유도하기 위한 성숙 배지의 또 다른 예는 EGF가 없는 간세포 배양 배지 (HCM) (론자 (Lonza): CC-4182)를 포함한다. 성숙 배지는 임의로 예를 들어 간세포 계통 세포의 팽창 및 그의 성숙을 유도하는 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제도 또한 포함한다. 성숙 배지는 간세포 및/또는 담관세포 발생, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창 및/또는 추가의 계통 선택을 촉진하는 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, Wnt 길항제는 단독으로 또는 TGF베타 길항제 및/또는 MEK/Erk 길항제와 조합하여 간세포 성숙을 촉진한다. 노치 효능제는 예를 들어 담관세포 계통 발생을 유도하는 것으로 본원에서 입증되고, 담관세포가 요구될 때 첨가된다. 이와 유사하게, 노치 길항제는 간세포 계통을 촉진하고, 예를 들어 담관세포 발생을 억제하기 위해 간세포가 요구될 때 첨가될 수 있다.
상이한 성숙 배지, 예를 들어 단일층 성숙 배지 (예를 들어 응집전 사용), 응집체 성숙 배지 (예를 들어 응집 후 사용); 예를 들어 간세포 발생을 촉진하는 인자를 포함하는 간세포 성숙 배지 및 예를 들어 담관세포 발생을 촉진하는 담관세포 성숙 배지가 순차적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 예를 들어 약 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 HGF, DEX 및 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 응집전 집단을 배양한 후, cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제 및 DEX 및 임의로 HGF를 포함하는 성숙 배지를 응집체에 첨가한다.
본원에서 사용되는 용어 "간세포"는 실질 간 세포를 의미한다. 간세포는 대부분의 간의 세포질 질량을 구성하고, 단백질 합성 및 저장, 탄수화물 대사, 콜레스테롤, 담즙산염 및 인지질 합성 및 외인성 및 내인성 물질의 해독, 변형 및 배출에 관여한다.
본원에서 사용되는 용어 "1차 간세포"는 살아있는 조직 (예를 들어 생검 물질)로부터 직접 채취하고 시험관 내에서 성장을 위해 확립된 간세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "간모세포"는 간 및 담관세포 계통의 세포, 예를 들어 간세포 또는 담관세포로 분화하는 능력을 갖는 전구세포를 의미한다. 간모세포는 예를 들어 미성숙 간세포 및 미성숙 담관세포를 포함할 수 있는 간세포 및 담관세포 전구세포의 하위세트 (예를 들어, 특정화된 세포 운명을 갖고 간세포로만 또는 담관세포로만 성숙할 수 있는 세포)이다. 일부 실시양태에서, 간모세포는 마커, 예컨대 Hex, HNF4, 알파-태아단백질 (AFP) 및 알부민 (ALB)의 발현에 의해 규정된다. 예를 들어, 간모세포는 노치 신호전달이 예를 들어 제28일 간모세포 함유 배양액에서 활성화될 때 담관세포 (예를 들어 CK19+ 세포)를 생성할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "간세포 전구세포"는 예를 들어 알부민 양성이고/이거나 CYP 효소를 발현하는 기능성 간세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "담관세포 전구세포"는 예를 들어 CK19 양성이고/이거나 CFTR을 발현하는 기능성 담관세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "미성숙 간세포"는 알부민을 발현하지만 기능성 CYP3A4 및/또는 CYP1A2 효소의 평가가능한 수준을 발현하지 않는 간세포 계통을 의미한다. 일부 실시양태에서, 미성숙 간세포는 성숙 간세포의 기능성을 획득하기 위해 성숙을 거쳐야 한다. 일부 실시양태에서, 미성숙 간세포는 마커, 예컨대 Hex, 알파-태아단백질 및 알부민의 발현에 의해 규정된다.
본원에서 사용되는 "성숙 간세포"는 CYP 효소, 예를 들어 CYP3A4 및 CYP1A2 및 알부민을 발현하는 간세포 계통 세포를 의미한다. 임의로, 성숙 간세포는 예를 들어 성인 세포에 대등한 기능성 또는 측정가능한 수준의 대사 효소, 예컨대 I상 및 II상 약물-대사 효소를 포함한다. I상 약물-대사 효소의 예는 시토크롬 P450 CYP1A2, CYP3A4 및 CYP2B6을 포함하고 이로 제한되지 않는다. II상 약물-대사 효소의 예는 아릴아민 N-아세틸트랜스퍼라제 NAT1 및 NAT2 및 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 UGT1A1을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 성숙 간세포는 대사적으로 활성인 간세포일 수 있다. 인도시아닌 그린 (ICG)의 세포 흡수는 성인 간세포의 특징이고29, 간 기능을 평가하기 위한 시험 물질로서 임상적으로 사용된다30. 성숙 간세포는 예를 들어 ICG 양성 염색 간세포이다. 간세포의 집단에서, 간세포의 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과의 간세포가 ICG 양성일 때 성숙으로 간주될 수 있다. 성숙 간세포는 "미성숙 간세포"에 비해 증가된 알부민을 발현하고, 예를 들어 미성숙 간세포보다 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100% 또는 200% 더 많은 알부민을 발현한다.
한 실시양태에서, 간세포는 기능성 간세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 간세포"는 예를 들어 알부민 및/또는 출발 세포에 비해 증가된 알부민을 발현하는, 간의 운명으로 유도되고 출발 세포보다 더 분화된 (예를 들어 내배엽 집단 세포, 간세포 전구체 또는 미성숙 간세포에 비해) 성인 간세포 (예를 들어 성숙 간세포) 및/또는 미성숙 간세포의 하나 이상의 특징을 보이는 간세포를 의미한다. 임의로, 기능성 간세포는 성숙 간세포이고, 기능성, 또는 예를 들어 성인 세포에 대등한 측정가능한 수준의 대사 효소, 예컨대 I상 및 II상 약물-대사 효소를 포함한다. 예를 들어, 기능성 간세포는 대사적으로 활성인 간세포일 수 있다. 인도시아닌 그린 (ICG)의 세포 흡수는 성인 간세포의 특징으로 간주되고29, 간 기능을 평가하기 위한 시험 물질로서 임상적으로 사용된다30. 기능성 간세포는 예를 들어 ICG 양성 염색 간세포이다. 간세포의 집단에서, 간세포의 집단은 예를 들어 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과의 간세포가 ICG 양성일 경우 기능성 간세포 집단으로 간주될 수 있다. 또 다른 예에서, 기능성 간세포는 알부민 분비 간세포이고, 간세포의 집단은 예를 들어 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과의 간세포가 알부민을 분비할 경우 간세포의 기능성 집단으로 간주될 수 있다.
실시양태에서, 간세포, 임의로 기능성 간세포는 간세포 및/또는 담관세포 전구세포, 및/또는 응집 및/또는 cAMP 신호전달 유도 없이 생산된 비-연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 생산된 간세포를 포함하는 세포 집단에 비해 ALB, CPS1, G6P, TDO, CYP2C9, CYP2D6, CYP7A1, CYP3A7, CYP1A2, CYP3A4, CYP2B6, NAT2 및 UGT1A1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 적어도 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%의 간세포, 임의로 기능성 간세포는 ASGPR-1+ 세포이다.
일부 실시양태에서, 기능성 간세포는 1차 성숙 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 이보다 높은 CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9 및/또는 CYP2D6의 핵산 또는 단백질 수준, 임의로 적어도 1.1, 2, 3, 4, 또는 5배 또는 1.1배 내지 5배 사이의 임의의 0.1 증분으로 증가된, 임의로 적어도 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105% 증가된 수준을 보인다. 예를 들어, 1차 간세포에서 발견된 것의 1.15배 내지 6.1배 (예를 들어 CYP1A2 6.1배 (610%), CYP3A4 13.2배 (1320%), CYP 2B6 2배 (200%), CYP2C9 1.52배 (152%), UGT1A1 2배 (200%), CYP2D6 1.15배 (115%))의 증가된 발현이 존재한다. 일부 실시양태에서, 간세포는 유사한 시기의 1차 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 더 높은 ALB, HNF4, AFP, CPS1, G6P, TDO1, NAT1, NAT2 및/또는 UGT1A1의 핵산 또는 단백질 수준, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%인 수준을 보인다.
다른 실시양태에서, 기능성 간세포는 간모세포 및/또는 미성숙 간세포에서의 것보다 더 높은 CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9 및/또는 CYP2D6의 핵산 또는 단백질 수준, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400% 또는 500%인 수준을 보인다. 일부 실시양태에서, 기능성 간세포는 간모세포 및/또는 미성숙 간세포에서의 것보다 더 높은 ALB, CPS1, G6P, TDO1, NAT1, NAT2 및/또는 UGT1A1의 핵산 또는 단백질 수준, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400% 또는 500%인 수준을 보인다.
다른 실시양태에서, 기능성 간세포는 수용체 아시알로-당단백질 수용체 1 (ASGPR1)을 발현한다. 다른 실시양태에서, 적어도 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%의 간세포, 임의로 기능성 간세포는 ASGPR-1+ 세포이다.
추가의 실시양태에서, 기능성 간세포는 시험관 내에서 CYP1A2 활성을 보인다. 임의로, 기능성 간세포는 1차 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 더 높은 CYP1A2 활성, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%인 수준을 보인다. 일부 실시양태에서, CYP1A2 활성은 세포를 페나세틴과 함께 인큐베이팅하고, 세포 내의 O-탈에틸화된 대사물질의 축적을 모니터링함으로써 측정된다.
추가의 실시양태에서, 기능성 간세포는 시험관 내에서 CYP2B6 활성을 보인다. 임의로, 기능성 간세포는 1차 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 더 높은 CYP2B6 활성, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%인 수준을 보인다. 일부 실시양태에서, CYP2B6 활성은 세포를 부프로피온과 함께 인큐베이팅하고 세포 내의 대사물질 O-히드록시-부프로피온의 형성을 모니터링함으로써 측정된다.
추가의 실시양태에서, 간세포는 시험관 내에서 NAT1 및/또는 NAT2 활성을 보인다. 임의로, 간세포는 1차 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 더 높은 NAT1 및/또는 NAT2 활성, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 1.1배, 2배, 3배 4배, 5배, 6배 또는 약 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%인 수준을 보인다. 일부 실시양태에서, NAT1 및/또는 NAT2 활성은 술파메타진 (SMZ)의 N-아세틸화 SMZ로의 대사에 의해 표시된다.
추가의 실시양태에서, 간세포는 시험관 내에서 UGT 활성을 보인다. 임의로, 간세포는 1차 간세포에서 발견되는 것에 대등하거나 더 높은 UGT 활성, 임의로 1차 간세포에서 발견되는 것의 적어도 50% 내지 100%, 75% 내지 125%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%인 수준을 보인다. 일부 실시양태에서, UGT 활성은 세포에서 4-메틸움벨리페론 (4-MU)으로부터 4-MU 글루쿠로니드 (4-MUG)의 생성에 의해 표시된다.
실시양태에서, 간세포, 임의로 기능성 간세포는 간세포 및/또는 담관세포 전구세포, 및/또는 응집 및/또는 cAMP 신호전달 유도 없이 생산된 비-연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단으로부터 생산된 간세포를 포함하는 세포 집단에 비해 ALB, CPS1, G6P, TDO, CYP2C9, CYP2D6, CYP7A1, CYP3A7, CYP1A2, CYP3A4, CYP2B6, NAT2 및 UGT1A1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 간세포, 임의로 기능성 간세포는 ASGPR-1+ 세포이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 기능성 간세포는 간세포 성숙을 나타내는 전체적인 유전자 발현 프로파일을 보인다. 임의로, 기능성 간세포는 간모세포 및/또는 미성숙 간세포의 전체적인 유전자 발현 프로파일보다 1차 간세포에 보다 유사한 전체적인 유전자 발현 프로파일을 보인다. 전체적인 유전자 발현 프로파일은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 마이크로어레이 분석에 의해 얻는다.
한 실시양태에서, 담관세포 운명은 세포 집단의 응집체를 노치 효능제로 처리함으로써 특정화된다.
본원에서 사용되는 용어 "담관세포"는 담관을 만드는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "담관세포 전구체"는 담관세포 (예를 들어 간모세포)로 분화하는 능력을 갖는 세포, 및 기능성 담관세포로 성숙할 수 있는 미성숙 담관세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 담관세포 계통의 세포는 마커, 예컨대 CK19, 세크레틴 수용체 (SR), 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR), 및 클로라이드 비카르보네이트 양이온 교환체 2 (Cl(-)/HCO(3)(-) AE)의 발현에 의해 규정된다.
본원에서 사용되는 용어 "미성숙 담관세포"는 성숙 담관세포의 기능성을 획득하기 위해 성숙을 거쳐야 하는 담관세포 계통 세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 임의로 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 또는 적어도 4일 동안 처리된 조기 노치 효능제 처리 세포를 임의로 포함하는 미성숙 담관세포는 CK19 및/또는 Sox9를 발현한다.
한 실시양태에서, 담관세포는 기능성 담관세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 담관세포"는 성인 담관세포 (예를 들어 성숙 담관세포)의 하나 이상의 특징을 보이고/보이거나 CK-19, MDR1 및/또는 CFTR 발현 담관세포 계통 세포인 담관세포를 의미한다. 예를 들어, 기능성 담관세포는 MDR1 수송체를 발현하고, 낭성 구조일 때 추적 염료, 예컨대 로다민123을 구조 내강 공간 (luminal space) 내로 수송한다. 또 다른 예로서, CFTR 기능적 활성은 예를 들어 도 18에 도시된 바와 같이, 예를 들어 낭성 구조에 대한 포르스콜린 유도 팽윤 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 담관세포의 집단에서, 집단은 예를 들어 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과의 세포가 세크레틴 수용체 (SR), 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR), CK-19 및/또는 클로라이드 비카르보네이트 양이온 교환체 2 (Cl(-)/HCO(3)(-) AE)를 발현할 경우 기능성 집단으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "성숙 담관세포"는 특정된 수송체 또는 세포막 수용체 활성, 예컨대 세크레틴 수용체 (SR), 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR), 및 임의로 클로라이드 비카르보네이트 양이온 교환체 2 (Cl(-)/HCO(3)(-) AE)를 발현하는 담관세포이다.
한 실시양태에서, 생산된 담관세포의 집단은 기능성 담관세포의 집단이다. 기능성 담관세포는 예를 들어 간세포 및 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단의 세포에 비해 및/또는 노치 효능제로 처리되지 않은 응집체로부터 생산된 집단의 세포에 비해 Sox9, CK19 및 CFTR (낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자)로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2 또는 3개의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함한다. 다른 실시양태에서, 담관세포의 집단의 적어도 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%는 CK19+ 담관세포이다. 다른 실시양태에서, 기능성 담관세포의 적어도 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%는 CFTR+ 담관세포이다.
용어 "발현"은 적용가능한 경우, 예를 들어, 전사, 번역, 폴딩 (folding), 변형 및 프로세싱 (processing)을 포함하고 이로 제한되지 않는, RNA 및 단백질 및 적절한 경우 분비 단백질의 생산에 관여하는 세포 과정을 의미한다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 얻은 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 언급되는 용어 "세포 배양 배지" (본원에서 "배양 배지" 또는 "배지"로도 언급됨)는 세포 생존성을 유지하고 증식 및 임의로 분화를 지지하는 영양소를 함유하는, 세포를 배양하기 위한 배지이다. 세포 배양 배지는 임의의 다음 성분을 적절한 조합으로 함유할 수 있다: 염(들), 완충제(들), 아미노산, 글루코스 또는 다른 당(들), 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물, 및 다른 성분, 예컨대 펩티드 성장 인자, 비타민 등. 특정 세포 종류에 사용되는 세포 배양 배지는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
적합한 배양 배지는 예를 들어 DMEM (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)), IMDM, RPMI, CMRL 및/또는 예를 들어 성분 및 임의로 다른 작용제가 첨가되는 기본 배양 배지 조성물을 제공하기 위해 내배엽 세포의 성장을 지지하는 임의의 다른 배지를 포함하는 적합한 기본 배양 배지를 포함할 수 있다.
다양한 배양 일수가 본원에서 언급된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 배양 기간이 상이할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, "제5일"은 일반적으로 예를 들어 PSC 단일층으로부터 유래된 유도된 내배엽 세포 집단을 지칭한다. EB로부터 유래된 유도된 내배엽 세포 집단은 이들이 EB 형성을 유도하기 위해 약 24시간 동안의 처리를 필요로 하기 때문에 유사한 배양 지점에 도달하기 위해 약 6일 동안 배양된다. 따라서, 제7일 단일층 유도 배양액은 제8일 배상체 유도 배양액 등과 동등한 것이다. 이 시기에 유도된 내배엽 집단은 예를 들어 Foxa2 및 Sox17을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 이와 유사하게, "제7일"은 일반적으로 2일 동안 연장된 노달 효능제 처리된 유도된 내배엽 집단을 지칭한다 (예를 들어 EB 방법에서는 제8일임). "제25일"은 일반적으로 세포가 응집되는 시기를 지칭한다 (단일층으로부터 유래될 경우, 또는 EB로부터 유래될 경우에는 제26일). 단일층 세포가 사용될 경우, 배양 기간이 일반적으로 1일 지연되면서 EB를 사용하는 동등한 방법이 사용될 수 있다. 도 11은 단일층 세포를 사용한 계획의 예 (도 11a) 및 EB를 사용한 예 (도 11b)를 제시한다. 담관세포의 생성을 위한 계획의 예는 도 11c 및 14a에 제시된다.
본원에서 사용되는 용어 "FGF 효능제"는 예를 들어 FGF를 포함하는 시토카인, 또는 FGF 신호전달 경로를 활성화하는, 예를 들어 FGF 수용체에 결합하여 활성화하는 소분자와 같은 분자를 의미한다. 예를 들어, FGF 수용체 활성화는 면역 검출에 의해 MEK/ERK, AKT 및/또는 PI3K 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "FGF"는 임의로 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 비롯하여 그의 활성 접합체 및 단편을 포함하는 임의의 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 인간 FGF1 (Gene ID: 2246), FGF2 (bFGF로도 알려짐; Gene ID: 2247), FGF3 (Gene ID: 2248), FGF4 (Gene ID: 2249), FGF5 (Gene ID: 2250), FGF6 (Gene ID: 2251), FGF7 (Gene ID: 2252), FGF8 (Gene ID: 2253), FGF9 (Gene ID: 2254) 및 FGF10 (Gene ID: 2255)을 의미한다. 특정 실시양태에서, FGF는 FGF10, FGF4 및/또는 FGF2이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF의 활성 접합체 및 단편"은 FGF 수용체에 결합하여 활성화하고 임의로 FGF 신호전달을 활성화하는 섬유모세포 성장 인자의 접합체 및 단편을 포함한다.
FGF의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, FGF 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
FGF10의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, FGF10 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
bFGF의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, bFGF 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
한 실시양태에서, BMP4 효능제는 BMP4, BMP2, 및 BMP7의 군으로부터 선택된다. BMP4, BMP7 및 BMP2는 예를 들어 배아 발생에서 동일한 수용체를 공유한다.
본원에서 사용되는 용어 "BMP4" (예를 들어 Gene ID: 652)는 골 형태 형성 단백질 4, 예를 들어 인간 BMP4, 및 예를 들어 BMP4 수용체 신호전달을 활성화할 수 있는, 임의로 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 활성 접합체 및 그의 단편을 의미한다. BMP, 예를 들어, BMP4의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, BMP 농도, 예를 들어 BMP4 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
언급된 바와 같이, 방법은 단일층으로 성장한 내배엽 세포 집단에 적용될 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 다능성 줄기세포 집단으로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a) 단일층으로 배양된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
d) 임의로 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, 덱사메타손 및/또는 온코스타틴 M 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 성숙 배지와 접촉시키는 단계;
e) 세포 집단의 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙의 유도, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도 단계를 포함하고, 여기서 성숙 유도는 세포 집단의 응집체의 생성을 포함한다.
또한, 내배엽 집단은 배상체에 포함될 수 있다. 따라서, 추가의 측면은 다능성 줄기세포 집단으로부터 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a) 임의로 다능성 줄기세포를 BMP4 효능제와 접촉시킴으로써 다능성 줄기세포의 배상체 (EB)를 형성하는 단계;
b) EB를 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 유도된 내배엽 세포 집단을 분리하여 분리된 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
d) 분리된 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
e) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시켜 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
f) 임의로 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, 덱사메타손 및/또는 온코스타틴 M 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 성숙 배지와 접촉시키는 단계;
g) 세포 집단의 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙의 유도, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도 단계는 응집체 내의 cAMP 경로를 활성화하여, 세포 집단의 간세포 및/또는 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 집단으로의 성숙을 유도하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 응집체를 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면은 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 기능성 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a) 단일층으로 배양되거나 배상체로 형성된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 적어도 하나의 FGF 효능제 및 적어도 하나의 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
d) 간세포 또는 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, OSM 및 DEX를 포함하는 성숙/특정화 배지로 배양하고;
(ii) 임의로 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 약 20 내지 약 40일 후에, 예를 들어 배양 약 24 내지 약 28일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
(iii) 응집된 세포를 응집된 세포 성숙 배지에서 배양하고;
(iv) 임의로 응집 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집 6일 내에, 임의로 배양 약 27 내지 약 36일 후에 응집된 세포 내의 cAMP 경로를 활성화하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 다능성 줄기세포의 배상체 (EB)는 다능성 줄기세포를 BMP4 (임의로 1-5 ng/ml BMP4 또는 약 5 ng/ml BMP4)의 존재 하에 12 내지 36시간, 임의로 약 24시간 동안 배양함으로써 형성된다.
EB가 형성된 후, 이를 노달 효능제로 보충된 유도 배지에서 3 내지 10일, 임의로 4 내지 8일 또는 약 5 또는 6일 동안 재배양하여 내배엽 세포 집단을 유도할 수 있다. 노달 효능제는 임의로 악티빈 A이다. EB는 또한 내배엽 세포 집단을 유도하기 위해 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 Wnt3a 또는 GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021과 임의로 접촉된다.
일부 실시양태에서, EB는 노달 효능제, 예컨대 악티빈 A의 존재 하에 추가로 1 내지 4일 동안 배양된다 (예를 들어 연장된 노달 효능제 처리) (즉, 내배엽 세포 집단과 적어도 하나의 FGF 효능제 및 하나의 BMP4 효능제의 조합물과 접촉하기 전에).
언급된 바와 같이, 세포는 이어서 예를 들어 응집 및 다양한 성숙 인자의 처리를 비롯하여 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하기 위해 처리된다. 상기 단계는 예를 들어 cAMP 활성화에 반응성인 세포의 집단을 생성할 수 있다. 연장된 노달 효능제 처리 및 응집은 cAMP 활성화에 반응성인 세포를 생성하는 단계이다.
cAMP 활성화에 반응성인 세포는 예를 들어 단일층 기반 방법을 위해 배양 26일 후의 것이다.
한 실시양태에서, 응집된 세포 성숙/특정화 배지는 간세포 성숙을 촉진하는 인자 또는 담관세포 발생을 촉진하는 인자 또는 둘 모두를 촉진하는 인자 및/또는 전구체 집단의 팽창을 증가시키는 인자를 포함할 수 있다.
예를 들어, 응집체는 예시된 바와 같이 간세포 또는 담관세포로 특정화될 수 있는 간모세포를 포함한다.
임의로, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 세포 응집체를 i) cAMP 신호전달 활성화제 (예를 들어 cAMP 유사체 및/또는 효능제) 및/또는 ii) Wnt/베타-카테닌 신호전달의 길항제 (예를 들어, Wnt 억제제 XAV 939) 및/또는 MEK/Erk 신호전달의 억제제 (예를 들어, MEK/Erk 억제제 PD0325901)와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. cAMP 신호전달의 활성화 동안 Wnt 길항제 및/또는 MEK/Erk 길항제의 첨가는 CYP 효소의 발현을, 예를 들어 성인 간 세포에서 발견되는 수준까지 또는 그 초과의 수준으로 향상시킨다. 예를 들어, 약 제28일 내지 약 제32일 배양액에 첨가된 cAMP의 존재 하에 MEK/Erk의 억제는 CYP3A4 수준이 증가된 간세포를 생성한다. Wnt 길항제와 조합된 MEK/Erk 길항제의 첨가도 CYP1A2의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, wnt 길항제는 예를 들어 XAV939, IWP2, DKK1, XXX (IWP2 (스템전트 04-0034), Dkk-1 (알앤디(R&D), 5439-DK-010)), IWR-1 엔도 (칼바이오켐 (Calbiochem) 681699-10)를 포함한다. Wnt 신호전달의 알려진 길항제는 딕코프 (Dickkopf) (Dkk) 단백질, Wnt 억제 인자-1 (WIF-1), 및 분비된 프리즐드(Frizzled)-관련 단백질 (sFRP)을 포함하고, 한 실시양태에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, MEK/Erk 길항제는 PD0325901, U0126 (프로메가 (Promega) V1121), PD 098059 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) P215-1MG)로부터 선택된다.
임의로, 세포 응집체는 0.1 내지 10 μΜ, 임의로 0.5 내지 2 μΜ 또는 약 1 μΜ XAV 939 및/또는 PD0325901와 접촉된다.
다른 억제제/활성화제의 농도는 예를 들어 본원에 기재되는 억제제/활성화제와 유사한 활성화/억제를 제시하는 농도이다.
또 다른 실시양태에서, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 세포 응집체를 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제 및 wnt 효능제, 예컨대 GSK3 선택적 억제제 (예를 들어, CHIR99021) 또는 TGF-β 길항제 (예를 들어, 억제제 SB431542) 둘 모두와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 임의로, 세포 응집체는 0.1 내지 10 μΜ, 임의로 0.2 내지 4 μΜ CHIR99021 및/또는 약 2 내지 10 μΜ 또는 약 6 μΜ SB431542와 접촉된다. TGF-β 억제제는 SB431542 (시그마-알드리치 S4317-5MG), SB525334 (시그마-알드리치 S8822-5MG), 및 A83-01 (토크리스 (Tocris), 2929)을 포함한다.
본원에서 제시되는 바와 같이, 예를 들어 제27일에 Wnt 경로의 활성화 및 TGF-β/SMAD 경로의 억제는 알부민+/HNF4+ 전구세포 집단의 팽창을 촉진한다. 예를 들어, 상기 집단의 10배까지의 팽창은 wnt 효능제가 첨가될 때 얻을 수 있음이 입증된다.
한 실시양태에서, 응집된 세포는 wnt 효능제 및 임의로 TGFβ 길항제 (예컨대 SB431542)로 약 6 내지 약 12일, 바람직하게는 약 8 내지 약 10일, 임의로 9일 동안 처리된다. 상기 처리는 예를 들어 간모세포의 팽창을 유발한다. 한 실시양태에서, 방법은 간모세포의 팽창된 집단을 생산하는 것을 포함한다. 상기 세포는 성숙 간세포 및/또는 담관세포를 포함하는 세포의 보다 분화된 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, TGF-β 길항제는 SB431542 (시그마-알드리치 S4317-5MG), SB 525334 (시그마-알드리치 S8822-5MG), A83-01 (토크리스, 2929)로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 응집된 세포 성숙 배지는 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 촉진하는 하나 이상의 인자, 임의로
TGF베타 길항제, 예컨대 알부민+/HNF4+ 전구세포 집단의 팽창을 촉진하는 SB431542와 임의로 조합되는 wnt 효능제, 예컨대 CIHR 99021; 또는
Wnt 길항제, 예컨대 XAV939 및/또는 Mek/Erk 길항제, 예를 들어 CYP 효소의 발현을 향상시키고 간세포 전구체의 성숙을 촉진하는, cAMP 활성화 단계 동안 첨가되는 PD0325901
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 응집된 세포 성숙 배지는 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 촉진하는 하나 이상의 인자, 임의로
담관세포 계통 특정화를 촉진하는 노치 효능제;
노치 길항제, 예컨대 간세포 계통 특정화를 촉진하는 감마-세크레타제 억제제 (GSI) L695,458
을 포함한다.
아래에서 설명되는 바와 같이, cAMP 유사체 8-Br-cAMP의 첨가는 H9-유래 응집체에서 CYP3A4 (16배), CYP1A2 (100배), 및 CYP2B6 (10배) 및 II상 효소 UGT1A1 (16배)의 유의한 발현 수준을 유도하였다 (도 7e).
또 다른 실시양태에서, 세포 응집체는 효소 처리 및/또는 수동 분리에 의해 간세포 및 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단의 단일층으로부터 생성된다.
한 실시양태에서, 임의로 세포 응집 전에 HGF, OSM 및 DEX를 포함하는 성숙/특정화 배지에서 배양된 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단은 내피 세포, 임의로 CD34+ 양성 내피 세포와 함께 공동 배양된다. 한 실시양태에서, 내피 세포는 배아 ESC, 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 내피 세포는 성숙 내피 세포, 임의로 인간, 및/또는 성숙 내피 세포로부터 유래된다.
CD34+ 내피 세포는 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 hESC로부터 생성될 수 있다. 실시예 8에 설명된 바와 같이, 내피 세포는 CD34+ 세포 (또한 CD31+ 및 KDR+)가 FACS에 의해 단리될 수 있는 약 6일 동안 BMP4, bFGF 및 VEGF의 조합물을 사용한 유도에 의해 생성될 수 있다. 분류된 CD34+ 세포는 내피 세포 성장 배지, 임의로 EMG2 배지에서 6일 동안 추가로 배양된 후, 키메라 응집체의 생성을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, HGF, OSM 및 DEX를 포함하는 성숙/특정화 배지에서 배양된 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단은 임의로 응집 용기 (예를 들어, 단일 세포 종류 또는 혼합된 세포 종류의 응집을 촉진하는 용기), 예컨대 애그리웰™을 사용하여, 키메라 응집이 달성될 때까지, 예를 들어 약 1일, 약 2일 또는 약 3일 (애그리웰을 사용할 때) 동안 키메라 응집체를 형성하기 위해 CD34+ 양성 내피 세포와 공동 배양된다. 응집은 또한 본원에 기재되거나 관련 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 실시예 8에서 설명되는 바와 같이, 내피 세포는 웰의 기저부를 코팅하기 위해 간의 세포 집단보다 빨리 용기에 첨가될 수 있다. 간의 세포 집단은 단일 세포 현탁액에 첨가될 수 있고, 예를 들어 제25일/26 간모세포는 내피 세포 상에 첨가되고, 혼합물은 애그리웰에서 배양될 수 있다. 적합한 응집시에, 키메라 간/내피 응집체는 후속적으로 애그리웰로부터 제거되고 배양될 수 있다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 내피 세포와 함께 배양된 응집체는 내피 세포를 함유하고, 단독으로 배양된 것보다 더 컸다. 또한, 추가의 12일 동안 배양된 키메라 간/내피 응집체는 내피 세포 없이 생성된 간 응집체보다 실질적으로 더 높은 수준의 CYP3A4 메시지를 발현함이 qRT-PCR 분석에 의해 입증되었다 (도 12d). 상기 수준은 cAMP를 첨가하지 않은 상태에서 달성되었기 때문에, 내피 세포는 hPSC-유래 간 세포의 성숙을 촉진할 수 있다. 한 실시양태에서, 간/내피 키메라 응집체는 적어도 또는 약 6일, 적어도 또는 약 8일, 적어도 또는 약 10일, 적어도 또는 약 12일, 또는 요구되는 또는 미리 선택된 수준의 CYP3A4 메시지가 얻어질 때까지 배양된다
추가의 실시양태에서, 간의 내피 키메라 응집체는 젤라틴 매트릭스, 임의로 콜라겐 함유 매트릭스, 임의로 겔에서 배양된다. 한 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 I 또는 IV이다. 한 실시양태에서, 젤라틴 매트릭스는 매트리겔, 라미닌, 피브로넥틴, 추출된 ECM (예를 들어 간 조직으로부터의 세포외 기질) 및/또는 그의 조합을 포함한다.
한 실시양태에서, 콜라겐 함유 매트릭스에서 배양된 응집체는 cAMP, PD0325901 및 XAV939의 존재 하에 배양된다.
3D 응집, cAMP 및 PD/XAV의 조합은 인간 다능성 줄기세포-유래 간세포의 유의한 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (도 9), (도 9d 및 e). AFP 및 태아 CYP3A7의 일부 발현은 유지되었다. 간 내피 키메라 응집체를 콜라겐 겔에서 cAMP, PD 및 XAV의 조합물로 처리하면 세포외 기질 단백질의 공급원을 제공하고, 집단의 성숙을 추가로 촉진함이 실시예 8에 제시된다. 도 13에 도시된 바와 같이, 내피 세포를 응집체에 첨가하는 것 (end)은 응집체를 액체 배양액 내에 유지할 때 ALB, CYP3A4, AFP 또는 CYP3A7의 발현 수준에 유의한 영향을 주지 않았다. 이와 대조적으로, 콜라겐 겔에서 응집체의 배양은 둘 모두 성인 간에서 발견된 것과 유사한, 거의 검출불가능한 수준으로 감소되었기 때문에 AFP 및 CYP3A7 발현에 대한 극적인 영향을 보였다.
한 실시양태에서, 예를 들어 응집 약 1 내지 약 4일 후에 세포를 노치 효능제로 처리한다. 상기 시기에 노치 효능제의 첨가는 담관세포 성숙을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 담관세포 성숙이 바람직한 경우, cAMP 신호전달은 생략된다.
따라서, 본 개시내용은 또한 담관세포 전구세포의 담관세포로의 성숙 유도 방법을 제공하고, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 효능제와 함께 배양하여 담관세포 전구세포의 담관세포, 임의로 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것
을 포함한다.
한 실시양태에서, 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 기능성 담관세포를 생산하는 방법은
a) 단일층으로 배양되거나 배상체로 형성된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 접촉시킴으로써 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
d) 담관세포 전구세포의 담관세포로의 성숙을 유도하고, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 임의로 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 약 20 내지 약 40일 후에, 예를 들어 배양 약 24 내지 약 28일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
(ii) 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 효능제를 포함하는 성숙 배지로 배양하는 것을 포함하고,
여기서, 노치 효능제는 노치 신호전달 공여자 세포, 임의로 OP-9, OP-Jagged1 및/또는 OP-9델타1 세포일 때, 노치 신호전달 공여자 세포는 세포 집단과 공동 응집된다.
추가의 실시양태에서, 응집체는 젤라틴 매트릭스, 임의로 콜라겐 함유 매트릭스, 임의로 겔에서 배양된다 (또는 노치 신호전달 공여자 세포를 포함할 때 공동 배양된다). 한 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 I 또는 IV이다. 한 실시양태에서, 젤라틴 매트릭스는 매트리겔, 라미닌, 피브로넥틴, 추출된 ECM (예를 들어, 간 조직으로부터의 세포외 기질) 및/또는 그의 조합을 포함한다.
또한, 예를 들어 노치 길항제, 예컨대 감마-세크레타제 억제제 (GSI) L695,458 (토크리스 #2627) DAPT (시그마-알드리치 D5942) LY 411575 (스템전트 04-0054) 및 L-685458)를 사용한 노치 신호전달의 억제는 담관세포 발생을 억제하는 것으로 본원에서 입증되고, 생산된 세포는 간세포의 특징을 보유한다.
또 다른 실시양태에서, 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 간세포 계통 세포, 예컨대 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포를 생산하는 방법이 제공되고, 이 방법은
a) 단일층으로 배양되거나 배상체로 형성된 다능성 줄기세포를, 노달 효능제, 예컨대 ActA 및 임의로 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 i) Wnt3a 및/또는 ii) GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021을 포함하는 유도 배지와 임의로 약 4 내지 약 8일 동안 접촉시켜 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 임의로 약 2, 3, 또는 약 4일 동안 접촉시켜 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 제공하는 단계;
c) 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포 집단을 적어도 하나의 FGF 효능제 및 하나의 BMP4 효능제 및/또는 그의 활성 접합체 및/또는 단편을 포함하는 특정화 배지와 임의로 약 4 내지 약 10일 동안 접촉시킴으로써 특정화하여 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계,
d) 간세포 또는 담관세포 전구세포의 임의로 팽창된 간모세포 집단 및/또는 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창을 유도하는 단계
를 포함하고, 여기서 성숙, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는
(i) 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 HGF, Dex 및 OSM을 포함하는 성숙 배지로 임의로 약 10 내지 14일 동안 배양하고;
(ii) 임의로 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 약 20 내지 약 40일 후에, 예를 들어 배양 약 24 내지 약 28일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
(iii) 응집체를 임의로 Dex를 포함하는 성숙 배지에서 1 내지 10일 동안 배양하고;
iv) a) 응집체를 Dex 및 임의로 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제를 포함하는 성숙 배지 (예를 들어 응집 성숙 배지)에서 약 6일 내지 약 10일 동안, 임의로 응집체 생성 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집 6일 내에, 임의로 배양 약 27 내지 약 36일 후에 배양하거나; 또는
b) 응집체를 노치 효능제 및 임의로 cAMP 효능제, HGF, 및/또는 EGF를 포함하는 성숙 배지에서 약 6일 내지 약 20일 동안 배양하고, 임의로 응집체 생성 단계의 약 1 내지 약 10일 내에, 예를 들어 응집체 생성 단계의 6일 내에, 임의로 배양 약 20 내지 40일 후에 노치 효능제를 첨가하는 것을 포함한다.
노치 효능제는 예를 들어 표면, 예컨대 세포, 플라스틱, ECM 또는 비드에 결합된 임의의 노치 리간드일 수 있다. 한 실시양태에서, 노치 리간드는 노치 리간드 델타 Jagged-1 (유로젠텍 (EUROGENTEC) 188-204), Jagged1 펩티드 (압캄 (abcam), ab94375), 재조합 인간 Pref-1/DLK-1/FA1 (알앤디 1144-PR)이다. 한 실시양태에서, 성숙, 및 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 신호전달 공여자, 예컨대 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와, 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF의 존재 하에 적어도 또는 약 5 내지 약 10일, 약 14일 또는 그 초과, 예를 들어 90일 동안, 임의로 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 60일, 적어도 또는 약 30일, 적어도 또는 약 25일, 2 적어도 또는 약 1일 및/또는 적어도 또는 약 14일 동안 접촉시켜 담관세포 전구세포의 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 포함한다. 생산된 구조체는 60일 초과 동안 배양액 내에 유지될 수 있음이 입증되었다. 따라서, 한 실시양태에서, 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단은 노치 신호전달 공여자 (노치 효능제), 예컨대 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와, 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF의 존재 하에 적어도 5일 동안 및 임의로 5 내지 90일, 또는 5 내지 60일 사이의 임의의 일까지 접촉된다.
임의로, 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 신호전달 공여자와 접촉시키는 것은 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 노치 신호전달 공여자, 예컨대 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와, 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF를 포함하는 성숙 배지에서 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 90일 동안, 임의로 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 60일, 적어도 또는 약 30일, 적어도 또는 약 25일, 2 적어도 또는 약 1일 및/또는 적어도 또는 약 14일 동안 공동 배양하여 담관세포 전구세포의 담관세포, 임의로 기능성 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 성숙, 및 임의로 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단을 OP9, OP9델타, 및/또는 OP9 Jagged1 세포와, 임의로 EGF, TGF베타1, HGF 및 EGF, 및/또는 HGF, TGF베타1 및 EGF의 존재 하에 적어도 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 또는 그 초과, 90일 동안, 임의로 적어도 또는 약 5 내지 적어도 또는 약 60일, 적어도 또는 약 30일, 적어도 또는 약 25일, 2 적어도 또는 약 1일 및/또는 적어도 또는 약 14일 동안 공동 배양하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "노치 신호전달의 활성화제" 또는 "노치 효능제"는 본원에서 사용되는 바와 같이 간세포 및/또는 담관세포에서 노치 신호전달을 활성화하는 임의의 분자 또는 세포를 의미하고, 노치 신호전달 공여자, 예컨대 OP9 세포, 일련의 골수-유래 마우스 간질 세포 및 노치 리간드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. OP-9 세포는 하나 이상의 노치 리간드를 내인성으로 발현하고, 이를 발현하도록 조작되었다. OP-9-Jagged1은 재조합 외인성 Jagged 1 노치 리간드를 과다발현하도록 조작되고, OP9-델타1은 재조합 델타1 노치 리간드를 과다발현하도록 조작된다. 한 실시양태에서, OP9 노치 신호전달 공여자는 OP9, OP9-Jagged1 또는 OP-델타1 세포로부터 선택된다. OP9 세포는 노치 리간드 델타를 발현한다. 이들은 노치 리간드를 발현하기 때문에, 노치 신호전달의 활성화제로서 작용할 수 있다. 또한, Jagged-1 (유로젠텍 188-204), Jagged1 펩티드 (압캄, ab94375) 및 재조합 인간 Pref-1/DLK-1/FA1 (알앤디 1144-PR)을 발현하는 분자 및/또는 세포도 포함된다. "노치 효능제"는 예를 들어 표면, 예컨대 세포, 플라스틱, ECM 또는 비드에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단은 10 내지 20 ng/ml, 임의로 약 20 ng/ml HGF 및/또는 25 내지 75 ng/ml, 임의로 약 50 ng/ml EGF의 존재 하에 OP9, OP9델타 및/또는 OP9Jagged1 세포와 함께 공동 배양하여 적어도 하나의 담관세포 전구세포의 기능성 담관세포로의 분화를 유도한다.
언급된 바와 같이, 간모세포 (예를 들어, 도 1a 및 14a에 도시된 시기 제25일 또는 제26일)는 단계 g)에서 응집될 수 있다고 (3D 응집체로도 언급됨), 단계 g)는 세포 집단의 간세포 및 담관세포 전구세포의 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도를 포함하고, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 세포 집단의 응집체를 생성하는 것을 포함한다. 상기 3D 응집체는 간세포로 성숙/분화되거나 또는 담관세포로 추가로 특정화될 수 있는 간모세포를 포함한다. 담관세포가 요구되는 실시양태에서, 추가의 계통 특정화는 응집체를 노치 신호전달 공여자, 예컨대 OP9, OP9델타 및/또는 OP9 Jagged1 세포와, 임의로 간모세포 및 노치 신호전달 공여자 세포를 포함하는 키메라 응집체로서 공동 배양함으로써 달성된다.
한 실시양태에서, 담관세포 전구세포를 포함하는 간모세포 집단은 매트리겔 및/또는 콜라겐을 포함하는 매트릭스/겔에서 OP9, OP9델타 및/또는 OP9Jagged1 세포와, 임의로 키메라 응집체로서 공동 배양된다.
한 실시양태에서, 매트릭스/겔은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 40%까지, 적어도 50% 또는 50%까지, 적어도 60% 또는 60%까지, 적어도 70% 또는 70%까지, 적어도 80% 또는 80%까지, 적어도 90% 또는 90%까지, 및/또는 100%까지의 매트리겔을 포함한다.
한 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 I 및/또는 콜라겐 IV를 포함한다. 한 실시양태에서, 매트릭스/겔은 약 0 내지 약 5 mg/mL 콜라겐 I, 임의로 약 1.0 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3.0 mg/mL, 또는 약 4.0 mg/mL 콜라겐 I을 포함한다. 한 실시양태에서, 매트릭스/겔은 약 1.0 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 약 1.4 mg/mL, 약 1.6 mg/mL, 약 1.8 mg/mL, 약 2.0 mg/mL, 약 2.25 mg/mL, 약 2.5 mg/mL, 약 2.75 mg/mL, 또는 약 3.0 mg/mL 콜라겐 I을 포함한다.
실시예 9에서 제시되는 바와 같이, 낭포 구조를 얻을 수 있고, 여기서 공동 배양액은 적어도 30% 또는 그 초과의 매트리겔 조성을 포함한다. 증가된 분지형 구조가 요구되는 경우, 매트리겔 농도는 예를 들어 약 20%로 감소될 수 있다
실시예 9에서 제시되는 바와 같이, 담관세포 분지형 및 낭포 구조를 발현하는 CFTR은 본원에 기재되는 방법을 사용하여 생산될 수 있다. CFTR은 팽윤 검정을 사용하여 제시되는 바와 같이 기능성이다. 따라서, 한 실시양태에서, 생산 및/또는 단리된 담관세포는 담관세포를 발현하는 CFTR이다.
본원에서 사용되는 용어 "노달 효능제"는 간세포 계통 세포에서 노달 신호 전달, 예컨대 "노달" (예를 들어 인간 노달, 예컨대 Gene ID: 4338) 또는 "악티빈"을 활성화하는 임의의 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "악티빈" 또는 "ActA"는 임의로 예를 들어 노달 신호 전달을 활성화할 수 있는 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 "악티빈 A" (예를 들어 Gene ID: 3624), 예를 들어 인간 악티빈, 및 그의 활성 접합체 및 단편 및 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 그의 활성 접합체 및 단편을 나타낸다. 악티빈의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 악티빈 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
본원에서 사용되는 용어 "HGF"는 간세포 성장 인자 (Gene ID: 3082), 예를 들어 인간 HGF, 및 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다. HGF의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, HGF 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
본원에서 사용되는 용어 "TGF베타"는 TGFb1, TGFb2 및 TGFb3, 예를 들어 인간 TGFb1, TGFb2 및 TGFb3, 및 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 그의 활성 접합체 및 단편 중의 임의의 하나를 의미한다. 아래에서 설명되는 바와 같이, TGFb1은 간모세포가 OP9와 공동 배양될 때 담관세포 분지화 (branching)를 촉진한다. TGFb2 및 TGFb3이 또한 시험되었고, 유사한 조건 하에서 분지화 구조를 촉진한다.
본원에서 사용되는 용어 "TGF베타1"은 전환 성장 인자 베타 1, 예를 들어 인간 TGF베타1 (Gene ID 7040) 및 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다. 담관세포 특정화를 위한 TGF베타1의 농도는 예를 들어 약 5 ng/ml 내지 약 10 ng/ml일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "wnt/베타-카테닌 효능제"는 간세포에서 wnt/베타-카테닌 수용체 신호전달을 활성화하는 임의의 분자를 의미하고, 예를 들어 Wnt3a 및 GSK3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR99021 (스테몰레큘™ CHIR99021 스템전트), 6-브로모-인디루빈-3'-옥심 (BIO) (케이만 케미컬 (cat:13123)), 또는 스템전트의 스테몰레큘™ BIO (cat:04003)를 포함한다. CHIR99021은 GSK3의 선택적 억제제이다. 고려되는 GSK3 선택적 억제제는 예를 들어 Wnt 신호전달 경로에서 GSK-3α/β에 대한 선택적 억제제이다. 예를 들어 간세포에서 Wnt/베타 수용체 신호전달은 예를 들어 qPCR에 의해 Axin2 유전자 발현을 측정함으로써 및/또는 예를 들어 퀴아겐 (Qiagen)의 시그날 (Cignal) TCF/LEF 리포터 (시그날 TCF/LEF 리포터 (luc) 키트: CCS-018L)를 사용하여 베타 카테닌 인산화를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Wnt3a"는 윙리스형 (wingless-type) MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 3A 인자 (예를 들어 Gene ID: 89780), 예를 들어 인간 Wnt3a, 및 천연 생성 활성 접합체 및 단편을 포함하는 그의 활성 접합체 및 단편을 의미한다. Wnt3a의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Wnt3a 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
본원에서 사용되는 용어 "효능제"는 예를 들어 경로 또는 신호전달 분자의 활성화제를 의미한다. 예를 들어, 노달 효능제는 노달 신호전달을 선택적으로 활성화하는 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "길항제"는 예를 들어 경로 또는 신호전달 분자의 선택적 억제제를 의미한다. 예를 들어, TGF 베타 길항제는 예를 들어 Smad의 인산화를 측정함으로써 TGF베타 신호전달을 선택적으로 억제하는 분자이다. A83-01은 SB431542보다 더 효능있는 smad2의 억제제이다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적 억제제"는 선택적 엔티티 (entity) 또는 경로를 관련 분자보다 적어도 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X배 더 효율적으로 억제하는 억제제를 의미한다. 예를 들어 GSK-3 선택적 억제제는 wnt 경로 내의 GSK-3을, 예를 들어 LiCl에 의해 억제되는 것보다 적어도 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X 더 효율적으로 또는 다른 경로 내의 다른 키나제, 다른 GSK 및/또는 GSK3을 억제하는 것보다 적어도 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X 더 효율적으로 억제한다. 예를 들어, CHIR 99021은 시험관내 키나제 검정에서 다른 키나제에 대해서는 거의 영향을 주지 않으면서, GSK3B를 약 5 nM의 IC50으로, GSK3a를 10 nM의 IC50으로 특이적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 선택적 억제제는 다른, 예를 들어, 2개의 다른, 3개의 다른 비관련 키나제보다 적어도 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X 더 낮은 IC50을 보일 수 있다. 이와 유사하게, 용어 "선택적 활성화제"는 선택적 엔티티 또는 경로를 관련 분자보다 적어도 1.5X, 2X, 3X, 4X 또는 10X 더 효율적으로 활성화하는 활성화제를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "활성 단편"은 크기는 더 작지만, 단편이 유래되는 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 여기서 활성 단편은 단편이 유래되는 전장 폴리펩티드에 비해 적어도 50%, 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 100%의 효과적인 생물학적 작용을 보이거나, 또는 임의로 단편이 유래되는 폴리펩티드에 비해 100% 더 큰, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 효과적인 생물학적 작용을 보인다.
본원에서 사용되는 용어 "활성 접합체"는 분자의 활성 부분의 활성을 전혀 또는 실질적으로 저해하지 않는, 예를 들어 장기간 저장, 열, 효소, 낮은 pH, 교반 등 하에서 안정성을 개선하기 위해 태그, 예컨대 형광 태그 또는 안정화 엔티티에 접합된 폴리펩티드 (또는 다른 분자)를 의미한다. 예를 들어, 접합체는 비접합된 폴리펩티드 또는 다른 분자에 비해 약 적어도 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 100% 또는 100% 초과, 예를 들어 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 4배 초과의 효과적인 생물학적 작용 (예를 들어 수용체 활성화 활성)을 보인다.
한 실시양태에서, 용어 "활성 단편 및 접합체"는 분자의 동족 (cognate) 수용체를 활성화하는 능력을 보유하는 분자의 단편 및 접합체를 의미한다. 임의로, 활성 단편 및 접합체는 전장 및/또는 비접합된 분자의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 활성을 보인다.
각각의 폴리펩티드에 대한 변이체, 예컨대 보존적 돌연변이체 변이체 및 활성화 돌연변이체 변이체도 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Dex"는 덱사메타손 (Dex)을 의미한다. Dex의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Dex 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
본원에서 사용되는 용어 "OSM"은 온코스타틴 M을 의미한다. OSM의 농도는 예를 들어 약 1 ng 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 1 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, OSM 농도는 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 또는 약 500 ng/ml이다.
언급된 바와 같이, 본 개시내용의 일부 실시양태는 간세포 및/또는 담관세포 성숙을 유도하기 위해 응집체 내의 cAMP 경로를 활성화하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "cAMP 경로"는 세포 소통에 사용되는 G 단백질-커플링된 수용체-촉발 신호전달 캐스케이드인 아데닐 시클라제 경로를 의미한다. cAMP 경로는 임의로 인간 cAMP 경로이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "cAMP 경로의 활성화"는 ATP를 cAMP로 전환시키는, 예를 들어 cAMP의 수준을 증가시키는 경로를 유도하는 것을 의미한다. cAMP 경로가 활성화될 때, 활성화된 GPCR은 부착된 G 단백질 복합체의 입체형태적 변화를 야기하고, 이것은 GDP를 GTP로 교환하는 G 알파 서브유닛을 생성하고 베타 및 감마 서브유닛으로부터의 분리를 유도한다. G 알파 서브유닛은 ATP를 cAMP로 전환하는 아데닐일 시클라제를 다시 활성화한다. cAMP 경로는 또한 아데닐일 시클라제 또는 PKA를 직접 활성화함으로써 하류에서 활성화될 수 있다. cAMP 경로를 활성화하는 분자는 cAMP, cAMP 유사체, 예컨대 8-브로모아데노신-3',5'-시클릭 모노포스페이트 (8-Br-cAMP), 디부티릴-cAMP, 아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-cAMPS) 및/또는 8-브로모아데노신-3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체 (Sp-8-Br-cAMPS))를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 8-Br-cAMP, 디부티릴-cAMP 및 Sp-cAMPS는 cAMP의 세포 투과성 유사체이다. cAMP 신호전달을 활성화하는 많은 다른 cAMP 유사체가 또한 관련 기술 분야에 알려져 있고, 사용될 수 있다. cAMP 경로를 활성화하는 다른 화합물 (예를 들어 cAMP 효능제)은 콜레라 독소, 포르스콜린, 카페인, 테오필린 및 백일해 독소를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 실험은 예를 들어 Sp-8-Br-cAMP (비올로그: Cat. No.: B 002 CAS No.: [127634-20-2]), 8-Br-cAMP 및 포르스콜린 (FSK) (시그마:66575-29-9)을 사용하여 수행하였고, 이들 화합물은 교환될 수 있음을 보여준다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, cAMP 경로는 간 응집체를 0.5 내지 50 mM의 세포 투과성 cAMP 유사체, 예컨대 8-Br-cAMP, 임의로 1-40, 1-30, 1-20, 5-15, 8-12 또는 약 10 mM 8-Br-cAMP와 접촉시킴으로써 임의로 활성화된다. 간 응집체는 임의로 세포 투과성 cAMP 유사체, 예를 들어 8-Br-cAMP와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 접촉된다.
성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도는 일련의 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포 및/또는 응집체를 포함하는 세포 집단은 HGF, 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 응집체는 B27, 아스코르브산, 글루타민, MTG, HGF, 덱사메타손 및 온코스타틴 M으로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포는 응집 전에 및/또는 응집 동안 HGF, 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함하는 세포 배양 배지, 임의로 B27, 아스코르브산, 글루타민, MTG, HGF, 덱사메타손 및 온코스타틴 M으로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)에서 배양된다. 세포 배양 배지는 임의로 또한 Rho-키나제 억제제 및 BSA로 보충된다. 예를 들어, 간세포 및/또는 담관세포 전구세포를 포함하는 세포 집단은 HGF, DEX 및 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 배양될 수 있고/있거나 응집체는 HGF, DEX 및 OSM을 포함하는 성숙 배지에서 6, 7, 8, 9, 10일 동안 배양될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 성숙, 추가의 계통 특정화 및/또는 팽창의 유도 단계는 응집체 내의 cAMP 경로를 활성화하여, 적어도 하나의 간세포 또는 담관세포 전구세포의 기능성 간세포 및/또는 담관세포로의 성숙을 유도하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, cAMP 경로의 활성화는 응집체를 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제, 예를 들어 상기한 바와 같은 cAMP 유사체 또는 cAMP 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제 및 DEX 및 임의로 HGF를 포함하는 성숙 배지가, HGF, DEX 및 OSM을 포함하는 성숙 배지에서, 예를 들어 약 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 배양한 후 응집체에 첨가된다.
한 실시양태에서, 응집체는 cAMP 경로가 활성화될 때까지 HGF, Dex 및 OSM을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 한 실시양태에서, 응집체는 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제 및 Dex를 포함하는 배지에서 배양된다. OSM은 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때 배지로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, HGF는 또한 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때 배지로부터 제거된다. 또 다른 실시양태에서, 배지 내의 HGF의 양은 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제의 첨가 후에 감소된다 (예를 들어 10 ng/ml HGF는 20 ng/ml HGF로 감소된다).
또 다른 실시양태에서, 응집체는 HGF, Dex 및 OSM에서 약 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 동안 배양되고, 이때 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가된다. 한 실시양태에서, OSM 및 임의로 HGF는 cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때 제거된다. 다른 실시양태에서, cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때, 배지 내의 HGF의 농도는 감소된다 (예를 들어 약 20 ng/ml에서 약 10 ng/ml로).
일부 실시양태에서, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 유도된 내배엽 세포 집단이 기능성 간세포 및/또는 담관세포로 분화/성숙한다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 세포의 집단으로부터 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 약 95% 초과의 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 생산을 유도한다.
성숙은 예를 들어 성숙 간세포 마커의 수준을 결정함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, CYP1A2, CYP2B6, CYP2D6, CYP3A4, CYP7A1, CYP2C9, ALB, CPS1, G6P, TAT, TDO1, NAT2, UGT1A1 및/또는 ASGPR1은 그의 발현이 예를 들어 RT-PCR에 의해 검출될 수 있는 성숙 간세포 또는 기능성 간세포 마커이다. 분화는 또한 성숙 간세포를 인식하는 항체, 예를 들어 ASGPR-1을 검출하는 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
한 실시양태에서, 내배엽 세포 집단은 다능성 줄기세포 (PSC), 예컨대 배아 줄기세포 (ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로부터 분화된다.
한 실시양태에서, 다능성 줄기세포는 포유동물, 예컨대 인간으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 다능성 줄기세포는 인간 ESC (hESC) 또는 인간 iPSC (hiPSC)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "iPSC" 및 "유도된 다능성 줄기세포"는 교환가능하게 사용되고, 예를 들어 하나 이상의 유전자 (SOX2 (Gene ID; 6657), KLF4 (Gene ID; 9314), cMYC (Gene ID; 4609), NANOG (Gene ID; 79923), LIN28/LIN28A (Gene ID; 79727) (이로 제한되지 않음)와 조합된 POU4F1/OCT4 (Gene ID; 5460) 포함)의 발현을 유도함으로써 비-다능성 세포, 일반적으로 성인 체세포로부터 인위적으로 유래된 (예를 들어, 유도된 또는 완전 역전 (reversal)에 의해) 다능성 줄기세포를 의미한다.
한 실시양태에서, 방법은 내배엽 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 다능성 줄기세포, 예컨대 ESC 또는 iPSC에서 진정 내배엽을 유도하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 내배엽 세포 집단의 획득은 다능성 줄기세포 배양액으로부터 배상체를 형성하는 것을 포함한다. EB는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 문헌 [Nostro, M.C. et al.18]에 기재된 방법에 의해 형성되고, 여기서 EB는 낮은 수준의 BMP4 효능제 내에서 24시간 동안 배양액 내의 작은 응집체로부터 형성된다.
또 다른 실시양태에서, 내배엽 세포 집단의 획득은 다능성 줄기세포 배양액을 단일층으로 얻고/얻거나 성장시키는 것을 포함한다.
EB 및/또는 단일층 세포는 이어서 고농도의 악티빈 A와 접촉하여 진정 내배엽을 유도한다. 임의로, EB 및/또는 단일층은 80 내지 120 ng/ml 또는 90 내지 110 ng/ml 악티빈, 임의로 약 100 ng/ml 악티빈 A에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 14일 동안 노출된다.
또 다른 실시양태에서, EB 및/또는 단일층 세포는 악티빈 A 이외에 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 Wnt3a 또는 GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021, 6-브로모-인디루빈-3'-옥심 (BIO), 또는 스테몰레큘™ BIO와 접촉된다. 예를 들어, GSK-3 특이적 억제제 BIO는 Wnt 신호전달의 활성화를 통해 인간 및 마우스 ESC에서 다능성을 유지하는 것으로 입증되었다.53
임의로, EB 및/또는 단일층 세포는 10 내지 40 ng/ml Wnt3a, 또는 20 내지 30 ng/ml Wnt3A, 임의로 약 25 ng/ml Wnt3a에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 노출된다. 또 다른 실시양태에서, EB 및/또는 단일층 세포는 약 0.03 μΜ 내지 약 30 μΜ CHIR-99021, 또는 약 0.1 μΜ 내지 약 3 μΜ, 임의로 약 0.3 μ 내지 약 1 μΜ CHIR-99021에 노출된다. 한 실시양태에서, EB는 약 0.1 μΜ 내지 약 2 μM에 노출된다. 또 다른 실시양태에서, 단일층 세포는 약 1 μΜ 내지 약 30 μΜ, 예를 들어 약 1 μΜ 내지 약 3 μΜ CHIR-99021에 노출된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 다른 GSK-3 억제제의 동등하게 유용한 양을 확인할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, EB 및/또는 단일층 세포는 먼저 80 내지 120 ng/ml 악티빈, 또는 90 내지 110 ng/ml 악티빈, 임의로 약 100 ng/ml 악티빈 A와 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 약 10일 동안 접촉된 후, 80 내지 120 ng/ml 악티빈, 또는 90 내지 110 ng/ml 악티빈, 임의로 약 100 ng/ml 악티빈 A 및 10 내지 40 ng/ml Wnt3a, 또는 20 내지 30 ng/ml Wnt3A, 임의로 약 25 ng/ml Wnt3a와 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 약 10일 동안 접촉하여 유도된 내배엽 세포 집단을 생산한다.
한 실시양태에서 및 다른 곳에서 설명되는 바와 같이, 유도된 내배엽 세포 집단은 노달 효능제, 예컨대 ActA와 함께 적어도 36, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58 또는 60시간 동안 또는 약 1 내지 약 4일 동안 배양되어 연장된 노달 효능제 처리 유도된 내배엽 집단을 생산한다.
임의로, 진정 내배엽을 유도하기 위한 기초 배지는 진정 내배엽의 유도를 위해 관련 기술 분야에 알려진 임의의 배지, 임의로 신경 기초 배지 또는 StemPro34이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 악티빈 A, 글루타민, 아스코르브산, MTG, bFGF 및 BMP4로 보충된다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 wnt/베타-카테닌 효능제, 예컨대 Wnt3a 또는 GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021로 추가로 보충된다.
유도된 내배엽 세포 집단을 얻기 위해 세포를 분화시키는 다른 방법도 사용될 수 있다.
명확한 내배엽 또는 유도된 내배엽 세포 집단은 임의로 표면 마커 CXCR4, CKIT 및 EPCAM 및 전사 인자 SOX17 및 FOXA2 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 규정된다. 일부 실시양태에서, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 내배엽 세포 집단이 악티빈 유도 후에 CXCR4, CKIT 및 EPCAM을 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 내배엽 세포 집단이 악티빈 유도 후에 SOX17 및/또는 FOXA2를 발현한다.
특정 실시양태에서, 방법은 임의로 기능성 간세포 및/또는 담관세포를 생성하기 위해 기능성 간세포 및/또는 담관세포를 풍부화 및/또는 단리하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 단리 단계는 세포 집단을 기능성 간세포 및/또는 담관세포에 결합하는 특정 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 단리된 세포 집단에 대해 용어 "단리된 집단"은 혼합된 또는 불균일한 세포 집단으로부터 제거되고 분리된 세포 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 세포가 단리되거나 풍부화되는 불균일한 집단에 비해 실질적으로 순수한 세포 집단이다. 세포는 예를 들어 단일 세포 현탁액, 단일층 및/또는 응집체일 수 있다. 예를 들어 담관세포를 포함하는 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 또한 노치 리간드 발현 세포, 예컨대 OP9, OP9델타 및/또는 OP9Jagged1 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어 간세포를 포함하는 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 또한 내피 세포를 포함할 수 있다. 임의로 분리된 세포 현탁액 및/또는 응집체 내의 단리된 집단은 예를 들어 스크리닝 용도, 질환 모델링 용도 및/또는 예를 들어 스캐폴드 (scaffold)를 포함하는 이식 용도 등에서 사용될 수 있다.
특정 세포 집단에 대해 용어 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 세포에 대해 적어도 약 65%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 세포 집단을 의미한다. 이와 유사하게, 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 "실질적으로 순수한" 집단은 약 30% 미만, 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만, 또는 1% 미만의 기능성 간세포 및/또는 담관세포가 아닌 세포 또는 본원에서 그 용어에 의해 규정되는 그의 자손체를 함유하는 세포 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 집단을 팽창시키는 방법을 포함하고, 여기서 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 팽창된 집단은 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 실질적으로 순수한 집단이다.
용어 "농축" 또는 "풍부화된"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 한 종류의 세포의 생산량 (비율)이 출발 배양액 또는 제제 내의 그 종류의 세포의 비율보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 증가함을 의미한다. 풍부화 및 부분적 정제는 교환가능하게 사용될 수 있다.
세포 집단은 상이한 방법, 예컨대 마커, 예컨대 세포 표면 마커 (예를 들어 FACS 분류 등)를 기초로 한 방법을 사용하여 풍부화될 수 있다.
세포 및 조성물
상기 논의된 바와 같이, 기능성 간세포 및/또는 담관세포는 본원에 기재되는 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 따라서, 본원의 추가의 측면은 본원에 기재되는 방법에 따라 생산된 세포 집단을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 예를 들어 본원에 기재되는 방법에 따라 생산되고 예를 들어 성숙 및/또는 기능성 세포의 마커를 발현하는 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포, 임의로 성숙 및/또는 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 풍부화된, 정제된 또는 단리된 세포 집단이다. 풍부화된, 정제된 또는 단리된 세포는 임의로 단일 세포 현탁액, 응집체, 키메라 응집체, 및/또는 분지형 구조 및/또는 낭포를 포함하는 구조이다.
한 실시양태에서, 성숙 및/또는 기능성 간세포에는 AFP 및/또는 태아 CYP3A7의 발현이 결여된다.
한 실시양태에서, 성숙 및/또는 기능성 담관세포는 MDR 수송체 유전자, 아쿠아포린, CFTR 및/또는 그의 돌연변이체를 발현한다.
한 실시양태에서, 세포 집단은 임의로 노치2를 발현하는 간모세포 집단이다.
한 실시양태에서, 단리된, 정제된 및/또는 풍부화된 집단은 시험관 내에서 생산된다.
한 실시양태에서, 세포 집단은 적합한 희석제를 포함하는 조합물 내에 포함된다.
적합한 희석제는 예를 들어 적합한 배양 배지, 또는 예를 들어 혈청, 혈청 대용물 또는 혈청 보충물 및/또는 적합한 동결보호제, 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO), 글리세롤 메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 피롤리돈을 포함하는 냉동 배지를 포함한다. 추가의 측면은 세포 배양 기초 배지에 대한 보충물로서 사용될 수 있는 FGF 및/또는 BMP4 효능제를 임의로 포함하는 배양 배지 보충 조성물을 포함한다. 보충물은 또한 본원에서 논의되는 다른 성분, 예컨대 악티빈 A, Wnt3A, GSK-3 선택적 억제제, 예컨대 CHIR-99021, HGF, 덱사메타손, 온코스타틴 M, 아스코르브산, 글루타민 및 B27 보충물을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 기능성 간세포 및/또는 담관세포는 간 및/또는 담도 질환이 발생한 대상체의 iPS로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 질환은 단일유전자 (monogenic) 질환, 예를 들어 낭성 섬유증, 아라질 (Alagille) 증후군, 진행성 가족성 간내 담즙정체증 (PFIC 유형 1, 2 및 3)이다.
한 실시양태에서, 질환은 낭성 섬유증이다. 한 실시양태에서, 대상체는 예를 들어 낭성 섬유증 유전자 내의 돌연변이, 예를 들어 델타F508, 997 CFTR del 및/또는 C1 CFTR 돌연변이를 보유한다. 도 9에 도시된 바와 같이, 설명된 방법은 낭성 섬유증 환자로부터 생성된/유래된 iPSC로부터 간모세포 집단을 생성할 수 있다.
한 실시양태에서, 질환은 복합 담도 질환, 임의로 원발성 경화성 담관염 또는 담도 폐쇄이다.
또 다른 측면은 본원에 기재되는 방법에 따라 제조된, 본원에 기재되는 세포의 집단을 포함하는 이식형 구축물 또는 체외 생체인공 간 장치 (BAL)를 포함한다.
용도
본원에 기재되는 기능성 간세포 및/또는 담관세포 및 그의 유도체는 하나 이상의 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어 방법은 간 및/또는 담도 질환이 발생한 대상체로부터 유래되거나 얻은 iPSC로부터 간 계통 세포의 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면은
i) 간 및/또는 담도 질환에 걸린 대상체로부터 유래되거나 얻은 세포로부터 iPSC를 생성하고;
ii) 간 계통 세포 및/또는 본원에 기재되는 방법에 따른 응집체 및/또는 구조, 임의로 분지형 구조 및/또는 낭포를 포함하는 간 계통 세포를 생성하는 것
을 포함하는, 간 및/또는 담도 질환 세포 모델을 생성하는 방법이다.
한 실시양태에서, 질환은 단일유전자 질환, 예를 들어 낭성 섬유증, 아라질 증후군, 진행성 가족성 간내 담즙정체증 (PFIC 유형 1, 2 및 3)이다. 한 실시양태에서, 질환은 복합 담도 질환, 임의로 원발성 경화성 담관염 또는 담도 폐쇄이다.
또 다른 측면은
i) 낭성 섬유증에 걸린 대상체로부터 유래되거나 얻은 세포로부터 iPSC를 생성하고;
ii) 담관세포 계통 세포 및/또는 본원에 기재되는 방법에 따른 구조, 임의로 분지형 구조 및/또는 낭포를 포함하는 담관세포 계통 세포를 생성하는 것
을 포함하는, 낭성 섬유증 세포 모델을 생성하는 방법이다.
예를 들어, 기능성 간세포 및/또는 담관세포는 약물 예측 독성 평가, 약물 스크리닝 및 약물 발견을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서 본원에 기재되는 방법을 사용하여 생성된 기능성 간세포 및/또는 담관세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키고, 1) 세포 팽창, 2) 간세포의 성숙 및/또는 담관세포 특정화, 3) 하나 이상의 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포 특성; 및/또는 4) 시험 화합물의 부재 하에 시험된 야생형 세포 집단 및/또는 다른 대조군에 비해 하나 이상의 간 및/또는 담도 질환 세포 모델 결여의 회복 및/또는 개선을 측정하는 것을 포함하는 검정이 제공된다.
한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 실시예 9에서 측정되는 바와 같이 하나 이상의 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포 특성을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 담관세포 특성은
a) I) 분지형 구조 및/또는 낭포의 존재 및/또는 수; II) 담관세포 마커 발현 수준, 형태 (성숙 및/또는 미성숙 형태) 및/또는 발현 패턴을 평가하는, 야생형 iPSC에 비해 간모세포/담관세포 계통 분화 능력;
b) 야생형 iPSC에 비해 담관세포 계통 형성의 동역학; 및/또는
c) 수송체 활성, 임의로 CFTR 활성
을 포함한다.
CFTR 활성은 예를 들어 예를 들어 cAMP 효능제, 예컨대 포르스콜린을 사용하여 낭포 팽윤을 측정함으로써 평가될 수 있다. 실시예 9는 CFTR 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예를 제시한다.
예를 들어, 화학적 교정자 VX809 및 Corr-4a는 포르스콜린 자극 검정에서 낭포 팽윤에 의해 측정되는 바와 같이 담관세포 낭포에서 돌연변이체 CFTR 활성을 회복/향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (실시예 9). 상기 또는 또 다른 특성의 회복 및/또는 개선은 , 예를 들어 새로운 약물/생물학적 물질의 평가를 위해 및/또는 환자 특이적 반응의 평가를 제공하는 추정되는 또는 알려진 CFTR 처리로 시험할 때 평가될 수 있다.
또 다른 측면은
i) CF 및/또는 CF 관련 질환의 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된, 임의로 낭포 내의 담관세포 계통 세포를 cAMP 활성화제, 임의로 포르스콜린 및 IBMX (3-이소부틸-1-메틸잔틴)와 접촉시키고,
ii) 임의로 시험 물질의 존재 하에 팽윤을 측정하고,
iii) 임의로 시험 물질의 존재 또는 부재 하에 야생형 세포 또는 다른 대조군과 비교하는 것
을 포함하는 기능성 CFTR 검정을 포함한다.
예를 들어, 시험 물질은 CFTR 채널 강화제 (potentiator), 예컨대 VX-770의 존재 하에 비교 및/또는 시험될 수 있다. VX-770은 특정 CF 돌연변이, G551D를 보유하는 환자에 대해 사용되는 FDA 승인 약물 (칼리데코 (Kalydeco)로도 알려짐)이다.
설명되는 세포는 또한 세포 이식을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼합된 세포 집단, 풍부화된 및/또는 단리된 기능성 간세포 및/또는 담관세포가 예를 들어 간 질환의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체 내로 도입될 수 있다.
따라서, 한 측면은 본원에 기재되는 방법에 따라 세포를 얻고/얻거나 단리된 간세포 및/또는 담관세포, 임의로 기능성 간세포 및/또는 담관세포를 제조하고, 상기 세포를 그를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 간 및/또는 담도 질환이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
예를 들어, 문헌 [Yusa et al. (55)]에는 iPSC-유래 간세포 내의 알려진 유전자 결함을 교정하고, 이를 재이식하는 것이 기재된 바 있다. 교정된 세포는 마우스 내로 다시 재이식되었고, 질병 상태에서 이전에 존재하지 않은 기능성을 보였다. 유사 (Yusa) 등은 그 목적을 위해 가장 적합한 트랜스포존 (transposon)이 인간 배아 줄기 (ES) 세포를 포함하는 포유동물 세포에서 효율적으로 옮길 수 있는 나방-유래 DNA 트랜스포존인 piggyBac임을 밝혀내었다. 이동 요소는 임의의 잔여 서열을 남기지 않으면서 piggyBac 도립 (inverted) 반복체가 인접한 도입유전자의 제거를 가능하게 한다. 생성된 iPSC-3-G5-A7은 모 섬유모세포에 비해 무손상 게놈인 교정된 A1AT를 보유하였고, 간세포-유사 세포로 분화시에 정상 A1AT 단백질을 발현하였다.
트랜스포존이 임의로 사용된다. 다른 발현 구축물 도입 방법은 렌티바이러스, 아데노바이러스 기반 방법을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 유전자의 세포 내로의 전달을 위한 효율적인 시스템은 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV) 및 렌티바이러스 기반 벡터이다. 인간에서 유전자 전달을 위한 다른 방법은 네이키드 (naked), 플라스미드 DNA 및 리포좀-DNA 복합체의 사용을 포함한다 ([Ulrich et al., 1996]; [Gao and Huang, 1995]). 하나 초과의 도입유전자가 전달된 벡터 구축물에 의해 발현될 수 있음을 이해하여야 한다. 별법으로, 각각 하나 이상의 상이한 도입유전자를 발현하는 별개의 벡터도 세포에 전달될 수 있다.
공동 형질감염 (별개의 분자 상의 DNA 및 마커)이 임의로 사용된다 (예를 들어, US 5,928,914 및 US 5,817,492 참조). 또한, 마커 (예컨대 녹색 형광 단백질 마커 또는 유도체)가 벡터 자체 (바람직하게는 바이러스 벡터) 내에서 유용하다.
인간 다능성 줄기세포에서 게놈 편집을 위해 통상적으로 사용되는 시스템은 예를 들어 각각 문헌 [Joung and Sander 2013(56)] 및 [Ran et al. 2013 (57)]에 기재된 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 CRISPR-Cas9 시스템이다.
추가의 방법은, 임의로 유전자 편집 및 돌연변이된 유전자에 대한 TALEN (전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제)와 조합된 ZFN (징크 핑거 (zinc finger) 뉴클레아제)를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Gaj et al. (58)]을 참조한다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 간 및/또는 담도 질환에 걸린 환자로부터 세포, 임의로 혈액 세포를 얻고, 게놈을 편집하고/하거나 기능성 및/또는 치료 단백질을 코딩하는 구축물을 삽입하고; 구축물의 삽입 전 또는 후에, 간모세포, 간세포 및/또는 담관세포를 본원에 기재되는 방법에 따라 유도하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 투여되는 세포 집단은 약 제25일/제26일 세포 집단이다. 한 실시양태에서, 세포는 간세포 또는 담관세포 운명으로 특정화된다.
또한, 이식 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 간 질환이 있는 대상체의 이식 및/또는 치료를 위한, 상기 세포 및 상기 세포를 포함하는 조성물의 용도가 포함된다.
ESC-유래된 이식되는 간세포는 이식되고 간세포 및 담관세포 계통의 세포로 분화할 수 있음이, 예를 들어 도 8c 내지 e에 제시되고 실시예 3에서 설명된다. 이와 유사하게, 실시예 9는 CFTR 기능성 담관세포가 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 생산될 수 있음을 제시한다.
따라서, 한 실시양태에서 본원에 기재되는 방법에 따라 생성된 간세포를 필요로 하는 대상체에게 상기 간세포를 이식하거나 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 간 질환 및/또는 담도 질환이 있는 대상체의 치료를 위한, 본원에 기재되는 방법에 따라 생성된 세포의 용도를 포함한다.
한 실시양태에서, 치료 유효량이 투여된다.
다케베 (Takebe) 등은 시험관 내에서 생성된 간의 버드 (liver bud)의 이식에 의해 인간 iPSC로부터 혈관화된 기능성 인간 간의 생성을 제시하였다.
한 실시양태에서, 얻어진 세포는 자가 세포, 예를 들어 대상체의 혈액 및/또는 피부 세포로부터 생성된 iPSC이다. 한 실시양태에서, PSC는 예를 들어 생검, 혈액 세포, 피부 세포, 모낭 및/또는 섬유모세포로부터 얻은 iPSC이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재되는 방법을 사용하여 생성된 간세포 및/또는 담관세포는 독성 스크리닝에서 시험 물질과 접촉된다. CYP는 약물 대사 및 생리활성화에 관여하는 주요 효소이다. 약물-약물 상호작용 검정, CYP 억제 검정 및 CYP 유도 검정을 비롯한 다양한 검정을 수행할 수 있다.
예를 들어, 약물은 CYP 이소자임의 유도 (CYP 유도) 또는 제시된 CYP 활성의 직접 억제 (CYP 억제)에 의해 다양한 CYP 이소자임의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. CYP 효소 활성의 변화는 다양한 약물의 대사 및/또는 청소에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 약물이 또 다른 약물의 CYP-매개 대사를 억제하면, 제2 약물이 독성 수준으로 신체 내에 축적될 수 있다.
다른 실시양태에서, CYP 억제 스크리닝을 수행할 수 있다. 본원에 기재되는 방법을 사용하여 생산된 간세포는 CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6, 및/또는 CYP7A1을 발현하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 예를 들어 LC-MS/MS 또는 형광 검정을 사용하여 하나 이상의 상기 이소자임의 억제에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다. CYP IC50 및/또는 Ki를 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CYP 효소의 유도를 평가할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 화합물은 유도된 CYP 효소에 대한 기질인 공동 투여되는 약물의 대사 증가를 야기하는 CYP 효소를 유도한다. 따라서, 상기 공동 투여되는 약물은 효능을 상실할 수 있다. CYP 효소, 예컨대 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C 및 CYP3A4는 유도에 민감하다. CYP의 촉매 활성 및 mRNA 수준은 대조군과 비교하여 측정될 수 있고, 그 결과는 유도 배수로 표현된다.
또 다른 실시양태에서, 약물 대사물질을 평가할 수 있고, 예를 들어 약물의 대사물질 스펙트럼을 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 상이한 농도의 시험 물질을 본원에 기재되는 방법을 사용하여 얻은 세포에 첨가하고, 세포를 생존, CYP 450 이소자임 활성, CYP 450 이소자임 mRNA 수준, 및/또는 대사물질 프로파일에 대해 평가한다. 방법은 예를 들어 일반적으로 약물을 스크리닝하기 위해 또는 환자의 약물에 대한 특이적 독성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 기능성 간세포 및/또는 담관세포가 조직 조작에 사용된다. 예를 들어, 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 정제된 집단에 대한 접근은 규정된 수의 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 조작된 구축물의 생성을 허용한다. 다른 예에서, 기능성 간세포 및/또는 담관세포의 정제된 집단은 생체인공 간 장치의 생성을 허용한다.
조사되고 있는 전체 장기 간 이식에 대한 대안은 단리된 세포 이식, 이식형 구축물의 조직 조작 및 체외 생체인공 간 장치 (BAL)의 사용을 포함한다 (참고문헌 51에서 검토됨). 상기 참고문헌의 451 페이지에 나타낸 바와 같이, "그의 향후 용도는 세포 성분의 선택 및 안정화에 따라 결정될 것이다". 세포주 및 비-인간 세포를 평가한 경우에도, 임상 용도에는 어려움이 존재한다. 인간 기능성 간세포 및/또는 담관세포 공급원의 제한도 상기 장치의 개발을 방해한다.
참고문헌 52에서 검토된 바와 같이, 간은 알부민을 포함하는 혈장 단백질, 보체 시스템의 성분 및 응혈 및 섬유소 용해 인자의 주요 공급원이다.
간 부전은, 그 중 몇몇은 수용성이지만 (암모니아, 페닐알라닌, 티로신) 많은 물질이 수난용성이고 수송 단백질, 주로 알부민 (중쇄 지방산, 트립토판 및 그의 대사물질, 내인성 벤조디아제핀 및 다른 신경-활성 물질, 머캅탄, 독성 담즙산, 빌리루빈, 중금속 및 내인성 혈관확장제)에 결합된 혈액으로 수송되는 저분자량 물질을 처리할 수 없도록 만든다. 이것은 직접적인 세포 독성을 통한 다발적인 2차 장기 기능부전 (예를 들어, 황달에 의한 급성 요세관 괴사), 기능성 항상성 변경 (예를 들어, 혈류역학 조절장애의 결과로서의 간신성 증후군) 또는 이 둘의 조합 (예를 들어, 간의 뇌병증 및 혼수상태)을 야기하는 내인성 독소의 축적을 유발한다. 투석 및 혈장 교환의 조합, 선택적 혈장 여과 및 흡착27 또는 선택적 혈장 교환 요법 기술이 간 지지 요법을 위해 개발되었다. 혈장 교환 기술은 예를 들어 수용성 독소와 함께 알부민-결합 독소의 청소를 증가시키기 위해 고 선택적 막 및 알부민 투석을 이용한다.
얻은 기능성 간세포 및/또는 알부민을 생산하는 간세포는 BAL에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능성 간세포가 얻어지면, 알부민 투석을 수행하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 간으로부터 분비되는 주요 단백질인 알부민 단백질을 생성할 수 있는 ES/iPS 유래된 간세포는 또한 BAL 및 알부민 투석에 사용될 수 있다. 인간 공급원으로부터 알부민의 생산은 예를 들어 BAL에서 중요하다. 알부민은 호르몬, 지방산 및 독성물질을 포함하는 다른 화합물을 수송한다. 알부민 투석의 이점은 독성 화합물 결합 알부민이 혈류로부터 제거될 수 있다는 것이다. 간 및 신장 질환에 임상적으로 사용되는 인간 혈청 알부민은 현재 공여된 혈액으로부터만 얻어진다. 알부민 분비 세포의 생성 및/또는 보다 높은 간 기능 활성은 BAL 시스템 확립을 위한 장점일 것이다.
한 실시양태에서, 방법은 환자 특이적 질환 hiPSC에 적용되고, 예를 들어 간 질환의 모델링을 위해 사용된다. 예를 들어, 간 질환 환자로부터의 간 또는 다른 세포는 단리되고, 추후 배양되고 기능성 간세포 및/또는 담관세포로 분화하기 위해 유도될 수 있는 hiPSC를 얻기 위해 처리될 수 있다. 이들 세포는 질환의 특징, 예컨대 질환에 관여하는 유전자 또는 환자의 면역 세포에 대한 반응을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 정상 세포 및 환자 특이적 질환 hiPSC는 기능성 간세포 및/또는 담관세포로 유도되고, 비교될 수 있다. 예를 들어, 정상 및 환자 특이적 hiPSC로부터의 췌장 전구세포 및 베타 세포의 유전자, 후생적 (epigenetic) 및 총단백질 (proteomic) 분석을 수행하였다. 상기 상세한 분석을 통해 정상 인간 간 발생을 조절하는 신호전달 경로, 전사 조절 네트워크 및/또는 세포 표면 마커 및 질환에서 기능하는 것을 발견할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유동물을 포함하는 동물계의 모든 구성원을 포함하고, 적합하게는 인간을 의미한다.
단리된 세포에 적용되는 용어 "처리하다", "처리하는", "처리" 등은 세포를 임의의 종류의 과정 또는 조건에 적용하거나 또는 임의의 종류의 조작 또는 절차를 세포에 대해 수행하는 것을 포함한다. 대상체에게 적용될 때, 이 용어는 의료 또는 외과적 치료, 또는 관리를 개체에게 제공하는 것을 의미한다.
대상체에게 적용되는 본원에서 사용되는 용어 "처리"는 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 요구되는 결과를 얻는 것을 목적으로 하는 방법을 의미하고, 예를 들어 제약적 개입, 수술방사선 요법 및 자연요법적 (naturopathic) 개입 및 시험 처리를 포함하는 의료 절차 및 적용을 포함한다. 유익한 또는 요구되는 임상 결과는 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 질환의 정도 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화하지 않은) 상태, 질환 확산의 억제, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 검출가능한 또는 비검출가능한 회복 (부분적인 또는 완전한)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. "처리"는 또한 처리되지 않은 경우의 예상되는 생존에 비해 생존을 연장함을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 도입되는 세포를 요구되는 부위에 적어도 부분적으로 국재화하는 방법 또는 경로에 의해 세포 (예를 들어 기능성 간세포 및/또는 담관세포)를 대상체 내로 도입하는 측면에서 교환가능하게 사용된다. 세포는 간에 직접 이식될 수 있거나, 또는 별법으로 적어도 일부의 이식된 세포 또는 세포의 성분이 생존가능한 상태로 유지되는 대상체 내의 요구되는 위치로 전달시키는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
키트
추가의 측면은 키트를 포함한다. 키트는 예를 들어 본원에 기재되는 방법에 사용 상기 기재된 하나 이상의 효능제, 길항제, 성숙 인자 등, 하나 이상의 배지, 본원에 기재되는 방법에 사용될 수 있는 세포 성장을 위한 용기 등 및/또는 본원에 기재되는 방법에 따라 팽창되고/되거나 제조된 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 본원의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 본원에서 생산된 세포 집단을, 임의로 설명서, 예를 들어 하나 이상의 배지, 세포 성장을 위한 용기 등을 포함하는, 예를 들어 상기 기재된 하나 이상의 효능제, 길항제, 성숙 인자 등과 함께 포함한다.
본 개시내용의 범위를 이해할 때, 용어 "포함하는" 및 그의 유도체는 본원에서 사용되는 바와 같이, 언급된 특징, 요소, 성분, 기, 정수, 및/또는 단계의 존재를 구체화하는 제한이 없는 용어로 의도되지만, 다른 비언급된 특징, 요소, 성분, 기, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 이것은 또한 유사한 의미를 갖는 단어, 예컨대 용어, "포함하는", "갖는" 및 이들의 유도체에도 적용된다. 마지막으로, 본원에서 사용되는 정도의 용어, 예컨대 "실질적으로", "약" 및 "대략"은 최종 결과가 유의하게 변하지 않도록 하는, 변형된 용어의 편차의 합리적인 양을 의미한다. 이들 정도의 용어는 편차가 변형하는 단어의 의미를 그 편차가 부정하지 않는다면 변형된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로서 고려되어야 한다.
본 개시내용의 범위를 이해할 때, 용어 "이루어지는" 및 그의 유도체는 본원에서 사용되는 바와 같이, 언급된 특징, 요소, 성분, 기, 정수, 및/또는 단계의 존재를 구체화하는 제한이 있는 용어로 의도되고, 다른 비언급된 특징, 요소, 성분, 기, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제한다.
본원에서 종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포괄되는 모든 수치 및 비율을 포함한다 (예를 들어 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5를 포함한다). 또한, 모든 수치 및 비율은 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 추정됨을 이해하여야 한다. 또한, 부정관사, 및 정관사는 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않으면 복수의 지시 대상을 포함함을 이해하여야 한다. 용어 "약"은 참조되는 수치의 평균 +/- 0.1 내지 50%, 5-50%, 또는 10-40%, 바람직하게는 10-20%, 보다 바람직하게는 10% 또는 15%를 의미한다.
또한, 특정 섹션에서 설명되는 정의 및 실시양태는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 적합한 것으로 이해되는 본원에 기재되는 다른 실시양태에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들어, 다음 문단들에서, 본 발명의 상이한 측면이 보다 상세하게 규정된다. 이와 같이 규정된 각각의 측면은 분명히 그 반대로 표시되지 않는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직한 또는 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직한 또는 유리한 것으로 표시된 다른 임의의 특징과 조합될 수 있다.
상기 개시내용은 본원을 일반적으로 설명한다. 보다 완전한 이해는 다음 구체적인 실시예를 참고로 하여 얻을 수 있다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 설명되고, 본원의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 형태의 변화 및 균등물의 치환은 환경이 제시하거나 편의상 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 특정 용어가 본원에서 사용되었지만, 상기 용어는 설명하기 위한 의미가 의도되는 것이지, 제한하기 위한 것이 아니다.
하기 비-제한적인 실시예는 본 개시내용을 예시하는 것이다:
실시예
실시예 1
EB에서 내배엽 유도
배상체 (EB)를 사용하여 hESC로부터 간의 세포를 생성하기 위해 사용된 전략을 도 1a에 도시한다. 단일층 배양을 사용하는 프로토콜과 유사하게16, 이것은 초기 배아에서 간 발생의 핵심 시기를 재현하는 특정 단계를 수반한다. EB는 이전에 설명된 바와 같이18, 낮은 수준의 BMP4에서 24시간 동안 배양함으로써 작은 응집체로부터 형성된다. EB를 후속적으로 고농도의 악티빈 A (이하 악티빈으로서 칭함)에 5일 동안 노출시켜, 표면 마커 CXCR4, CKIT 및 EPCAM 및 전사 인자 SOX17 및 FOXA2의 발현에 의해 규정되는 집단인 진정 내배엽을 유도한다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 90% 초과의 유도된 EB 집단은 악티빈 유도 5일 (총 6일 배양) 후에 CXCR4 및 CKIT 또는 CXCR4 및 EPCAM을 공동 발현한다. 세포내 유동 세포 측정 분석은 90% 초과의 집단이 SOX17을 발현하고, 80% 초과의 집단이 FOXA2+를 발현함을 보여주었다.
단일층 유도 프로토콜을 사용한 연구는 Wnt 신호전달이 아마도 전측 원시선 (anterior primitive streak) 형성의 향상 때문에 악티빈-유도된 내배엽 발생을 증강시킴을 보여주었다10. Wnt3A를 악티빈-유도된 EB 배양액에 첨가하면, EB 내의 CXCR4+, SOX17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율을 재현가능하게 증가시켰다 (도 1c). CXCR4 발현이 증가하면서, CKIT+CXCR4+ 및 CXCR4+EPCAM+ 세포의 비율은 집단의 95% 초과로 증가하였다. 분자 분석은 Wnt 유도된 EB에서 SOX17 및 FOXA2 발현의 증가된 수준을 보여주었고, 이것은 유동 세포 측정 데이타를 확인해준다 (도 1d). Wnt의 첨가는 Oct3/4의 발현의 감소를 촉진하지 않았지만, 제3일에 T (브라큐리 (brachyury)) 발현 및 제4일 및 제5일에 구스코이드 (Goosecoid; GSC) 발현의 증가를 유도하였다 (도 1d). Wnt는 마우스 ESC 모델19 및 단일층 hESC-유래 배양액10에서 입증된 바와 같이 원시선 형성을 향상시킨다. 동역학 분석은 분화 제3일과 제6일 사이에 CKIT+CXCR4+, SOX17+ 및 FOXA2+ 양성 세포의 비율의 신속하고 활발한 증가를 보여주었다 (도 1e). EB 내의 내배엽 유도는 사용된 기초 배지에 의해 영향을 받았다. StemPro34는 이전에 사용된 신경 기초 배지보다 더 효율적인 내배엽 유도를 지지하였다 (도 1f). 고 풍부화된 내배엽의 유도는 hPSC로부터 간세포-유사 세포의 효율적이고 재현가능한 생성에서 중요한 제1 단계이다. 예를 들어 적어도 90% CXCR4+CKIT+ 및 80% SOX17+ 세포의 유도 수준은 최적의 간 계통 발생을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
노달 / 악티빈 신호전달의 지속시간은 간 발생에 영향을 준다.
CXCR4+CKIT+ 집단을 간의 운명으로 특정화하기 위해, 제6일 EB를 분리하고, 세포를 FGF10 및 BMP4의 존재 하에 48시간 동안, 이어서 bFGF 및 BMP4 내에 6일 동안 매트리겔 코팅 플레이트 상에 단일층으로 도말하였다. FGF 및 BMP가 인간 및 마우스 특정화를 위해 중요함이 이전에 마우스20 및 인간 ESC 분화 배양액16에서 입증되었다. 시-타이엡 (Si-Tayeb) 등에서, FGF2 및 BMP4는 조합되었고, 생성된 80-85%의 세포가 알부민을 발현하였다. 상기 두 인자의 조합물은 시험 조건 하에서 최적 간 유도를 위해 필요한 것으로 밝혀졌다 (도 2a). FGF10/BMP4 단계는 분화 배양에서 bFGF/BMP4 단독에 비해 알부민 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 포함되었다 (도 2b). 상기 유도 조건에서, 상당한 수의 알부민 양성 세포는 분화 제12일 내지 제24일 사이에 배양액에서 지속적으로 발생하였다.
BMP4/FGF 특정화 단계는 간의 발생을 촉진하지만, 제10일의 배양액의 분석은 배양액 내의 SOX17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율이 90% 초과로부터 약 50%로 유의하게 감소함을 보여주었다 (도 3a). 이론에 매이지 않으면서, 상기 감소는 제6일 집단이 FGF 및 BMP4의 존재 하에 우선적으로 팽창된 비-내배엽 세포로 오염되었거나 또는 세포의 내배엽 운명이 아직 고정되지 않았고, 그 결과 몇몇은 사용된 조건 하에서 또 다른 운명을 채택하였음을 시사하였다. 연장된 악티빈/노달 신호전달이 시험관 내 마우스 ESC 분화 시스템에서 전측 원시선 세포로부터 내배엽 운명을 확립하기 위해 필요함이 이전에 입증되었다19. 연장된 신호전달이 인간 PSC에서 유용한지는 알려지지 않았다. 상기 신호전달 경로의 지속시간의 증가의 효과는 FGF/BMP4 특정화 단계 전에 악티빈 내에서 2일 동안 단일층 세포를 배양함으로써 인간 시스템에서 확장되었다. 악티빈으로 추가의 2일 동안 유도될 때, 제12일에 측정된 SOX17+ 및 FOXA2+ 세포의 비율은 비-처리된 군보다 유의하게 더 높았다 (도 3a). 이론에 매이지 않으면서, 총 세포 수는 처리된 집단에서 더 낮기 때문에 (도 3b), 이 시기에 악티빈 신호전달은 내배엽 세포의 생존을 우선적으로 지지하는 것이 가능하다.
연장된 악티빈 처리는 배양 제8일까지 CXCR4+CKIT+ 집단을 유지하였고 (도 3c), 배양 제26일에 HEX, AFP, ALB 및 HNF4α를 포함하는 간 전구세포 (간모세포) 발생을 나타내는 유전자의 보다 높은 발현 수준을 유도하였다 (도 3d). 비-처리된 CXCR4+CKIT+ 내배엽으로부터 생성된 배양액은 MEOX1, MESP1, CD31 및 CD90의 발현에 의해 및 제24일에 CD90+ 간엽계 세포 및 CD31+ 내피 세포의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 오염 중배엽을 함유하였다 (도 3d, e). 악티빈-처리된 내배엽으로부터 유래된 집단은 감소된 중배엽 유전자 발현을 보였고, 보다 많은 비율의 EPCAM+ 세포를 보유하고, 검출가능한 CD31+ 세포를 보유하지 않고, 훨씬 더 작은 CD90 집단을 보유하였다 (도 3e). 이러한 차이와 일치하게, 배양 제26일에 비-처리된 집단에 비해 처리된 집단에서 유의하게 더 높은 비율의 알부민 양성 세포가 관찰되었다 (도 3f, g). 흥미롭게도, AFP 양성 세포의 비율은 두 군 사이에서 상이하지 않았다. 이론에 매이지 않으면서, 이것은 이 시기에, 비-처리된 집단에서 그의 발현이 간 특이적이지 않을 수 있음을 시사한다.
응집은 간의 성숙을 촉진한다.
연장된 악티빈/노달 신호전달이 간의 발생을 촉진하지만, 유전자, 예컨대 알부및 및 HNF4α의 발현 수준은 성인 간에 비해 hESC-유래 집단에서 유의하게 더 낮았고, 이것은 제26일 배양액 내의 세포가 여전히 미성숙 상태임을 시사하였다. 이전의 연구는 세포 응집이 배양액 내의 1차 간세포의 분화된 표현형을 유지할 수 있고21 -23, hESC-유래 간 세포의 어느 정도의 성숙을 촉진함을 보여주었다24. 악티빈-처리된 내배엽으로부터 유래된 제26일 간모세포 집단의 성숙에 대한 응집의 역할을 이어서 조사하였다. 응집체는 효소 처리 및 수동 분리의 조합에 의해 단일층으로부터 생성된 후, HGF, 덱사메타손 (Dex) 및 온코스타틴 M (OSM)의 존재 하에 6일 동안 배양하였다 (도 4a). 응집은 분화에 영향을 주었고, ALB (알부민), CPS1 (카르바모닐-포스파타제 합성효소 1), TAT (티로신 아미노트랜스퍼라제), G6P (글루코스 6 포스파타제) 및 TDO (트립토판 2,3-디옥시게나제)를 비롯하여 간 기능과 연관된 많은 유전자의 발현 증가를 유도하였다 (도 4b). 일부 예에서, 수준은 성인 간에서 발견된 (ALB) 수준과 유사하거나 (TDO) 수준보다 더 높았다 (도 4b). 응집은 또한 CYP7A1, CYP3A7 및 CYP3A4를 포함하는 일부 시토크롬 P450 유전자의 발현을 증가시켰다. CYP3A4의 수준은 1차 간세포에서 발견되는 것과 유사하지만, 성인 간에서의 수준보다 훨씬 더 낮았다 (도 4c). CYP1A2 및 CYP2B6를 포함하는 다른 P450 유전자 및 II상 효소 UGT1A1의 발현은 임의의 유의한 수준으로 유도되지 않았다.
세포 표면 마커 아시알로-당단백질 수용체-1 (ASGPR-1)은 성숙 간세포에서 발견되고, hESC-분화 배양액에서 성숙 세포를 표시하는 것으로 밝혀졌다. 응집은 배양액에서 검출되는 ASGPR-1+ 세포의 비율을 극적으로 증가시키고, 이에 따라 50% 초과의 양성 세포를 함유하는 집단을 생성하였다 (도 4d). 면역염색은 ASGPR-1 및 E-카드헤린이 알부민+ 제32일 응집체 세포 상에서 검출됨을 보여주었다. 종합적으로, 상기 발견은 응집의 3-D 구조로의 간단한 처리가 간의 성숙을 나타내는 변화를 촉진함을 보여준다.
cAMP 신호전달은 hESC -유래 간세포-유사 세포의 성숙을 유도한다.
세포를 보다 성숙시키기 위해, cAMP 신호전달의 역할을 조사하였다. 간의 세포주를 사용한 연구는 상기 경로의 활성화가 부분적으로는, HNF4α와 함께 간세포 기능에 관여하는 많은 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행하는 공동-활성화제인 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 감마 동시활성화제 1-알파 (PGC1-α)의 유도를 통해 간의 유전자 발현을 유도할 수 있음을 보여주었다25 - 28. cAMP 신호전달이 hESC-유래 간세포-유사 세포의 성숙을 촉진할 수 있는지 결정하기 위해, cAMP의 세포 투과성 유사체인 8-브로모아데노신-3'5"-시클릭 모노포스페이트 (8-Br-cAMP)를 배양 제32일로부터 제44일까지 첨가하였다. 8-Br-cAMP 처리는 hESC-유래 간의 세포에서 PGC1-α의 발현을 유의하게 향상시켰지만 (15배), HNF4α의 발현은 그렇지 않았다 (도 5a). 8-Br-cAMP는 또한 G6P 및 TAT의 발현을 성인 간에서와 근접한 수준으로, 각각 평균 25배 및 33배로 유도하였다 (도 5a). 이와 대조적으로, AFP 및 ALB의 발현 수준은 8-Br-cAMP에 의해 하향조절되었다. 유동 세포 측정 분석은 AFP 발현 분석을 확인해 주었고, 비-처리된 대조군에 비해 8-Br-cAMP 처리된 응집체에서 AFP 양성 세포의 수의 감소 (54%로부터 26%로)를 보여주었다. ALB 양성 세포의 비율은 mRNA의 수준이 감소하였다는 사실에도 불구하고 감소하지 않았다 (도 5b). 이론에 매이지 않으면서, 이러한 차이는 RNA vs. 단백질 발현의 차이를 반영하는 것일 수 있다. 다른 조직, 예컨대 췌장이 또한 PGC-1α를 발현한다. 그러나, 간의 세포에서 관찰된 유도와 달리, PGC1-α의 발현은 hESC-유래 인슐린 양성 췌장 세포에서 cAMP 신호전달에 의해 유도되지 않았고 (도 5c), 이것은 상기 반응이 조직 특이적일 수 있음을 나타낸다.
인도시아닌 그린 (ICG)의 세포 흡수는 성인 간세포의 특징으로 간주되고29, 간의 기능을 평가하기 위한 시험 물질로서 임상적으로 사용된다30. cAMP 신호전달은 거의 모든 처리된 응집체가 ICG로 염색되었다는 관찰에 의해 입증되는 바와 같이 상기 활성을 보인 세포의 비율을 극적으로 증가시켰다 (도 5d).
공초점 현미경은 8-Br-cAMP의 존재 및 부재 하에 배양된 제44일 응집체에서 ALB 및 AFP 또는 ALB 및 HNF4α의 공동 발현을 평가하기 위해 사용되었다. 면역염색 분석은 유동 세포측정 데이타와 일치하였고, cAMP-처리된 응집체가 비-처리된 것에 비해 유사한 수준의 ALB를 발현하지만 AFP는 훨씬 더 낮은 수준으로 발현함을 보여주었다.
hESC-유래 단일층 및 응집체 집단에 의해, 및 HepG2 세포, Huh7 세포 및 동결보존된 간세포 (PH, 로트 OSI)에 의해 분비된 알부민 (ALB)의 수준을 ELISA 검정을 사용하여 검출하였다. 두 응집체 집단에서 HNF4α 단백질의 수준은 대등하였고, 이것은 PCR 분석을 확인해준다. hESC-유래 세포에 의한 알부민 분비는 8-Br-cAMP 처리에 의해 영향받지 않았지만, 응집 단계에 의해 극적으로 향상되었다. 알부민 분비는 단일층 배양액에서 낮은 수준으로 제20일에 검출가능하였지만, 제32일 응집된 배양액에서 극적으로 증가하였다 (약 5배). 단지 낮은 수준이 HepG2, Huh7 및 PH 세포에서 검출되었다. 이와 대조적으로, 성인 간세포의 특징인 인도시아닌 그린 (ICG)을 흡수하는 능력 (Stieger et al., 2012)은 cAMP 신호전달에 의해 향상되었다. cAMP-처리 및 비-처리에 의한 ICG 흡수 및 방출을 제44일 응집체에서 측정하였다.
cAMP 신호전달은 hESC -유래 간세포에서 대사 효소 활성을 증가시킨다.
cAMP 신호전달은 또한 핵심 I상 시토크롬 P450 유전자의 발현 패턴의 변화, 특히 태아 유전자 CYP3A7의 발현 수준의 감소, 및 성인 유전자 CYP3A4 (2.5배), CYP1A2 (18배) 및 CYP2B6 (4.7배)의 유의한 발현 증가를 유도하였다 (도 6a). 중요한 II상 효소인 UGT1A1이 또한 8-Br-cAMP에 의해 유의하게 유도되었다 (11배) (도 6a). CYP3A4 및 CYP1A2의 유도된 수준은 1차 간세포에서 발견되는 것보다 유의하게 더 높은 반면, CYP2B6의 수준은 두 집단에서 유사하였다. hESC-유래 집단에서 UGT1A1 발현은 1차 간세포에서 발견되는 수준에 도달하지 않았다. 이론에 매이지 않으면서, CYP1A2의 발현이 간으로 제한되고 출생 후에만 검출됨을 고려할 때31, 상기 발견은 cAMP 신호전달이 태아의 발생 시기 이후의 분화를 촉진함을 보여준다.
P450 유전자에 대한 cAMP 신호전달의 유도 효과는, 단일층 배양액에 첨가될 때 CYP1A2 및 CYP3A4의 발현 증가는 거의 검출되지 않았기 때문에 3D 응집체 내의 세포에서만 관찰되었다 (도 6b). PGC1-α 및 TAT의 발현은 아마도 상기 유전자의 프로모터 영역이 cAMP-반응 요소 결합 단백질 (CREB) 부위를 포함한다는 사실 때문에 단일층 방식으로 유도되었다. cAMP 반응에 영향을 주는 변수를 추가로 규정하기 위해, 연장된 악티빈 처리된 내배엽으로부터 생성된 응집체를 추가의 2일의 악티빈/노달 처리 없이 내배엽으로부터 생성된 응집체와 비교하였다. CYP1A2 및 ALB의 유도는 비-처리된 집단 (-Act)으로부터의 응집체에서 거의 관찰되지 않았고, 이것은 cAMP 신호전달이 고풍부화된, 적절하게 패턴화된 세포에 대해서만 효과적임을 시사한다 (도 6c). 상기 연구를 위해, 8-Br-cAMP을 12일 (제32일-제44일) 동안 배양액에 포함시켰다. 유전자 발현의 변화가 연속적인 신호전달에 의존적인지 결정하기 위해, 8-Br-cAMP로 6일 동안 유도한 후, 나머지 6일 동안 8-Br-cAMP의 부재 하에 유지된 세포를 전체 12일 동안 8-Br-cAMP에서 배양된 것과 비교하였다 (도 6d). CYP1A2의 발현은 보다 짧은 유도 시간 후에 유지되었고, 이것은 보다 높은 수준의 발현이 연속적인 신호전달에 의존적이지 않고, 간세포 성숙을 나타내는 변화를 반영함을 나타낸다.
P450 효소의 기능적 활성을 조사하기 위해서, 이소자임-선택적 마커 약물을 대사하는 능력을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 측정하였다. 8-Br-cAMP-처리된 세포는 1차 배양된 간세포만큼 높은 수준으로 CYP1A2-선택적 기질 페나세틴을 O-탈에틸화하였다 (도 6e). 비-처리된 세포는 검출가능한 활성을 보이지 않았다. 또한, 부프로피온의 히드록실화에 의해 측정된 CYP2B6 활성은 1차 간세포에서 발견되는 것과 대등한 수준으로 8-Br-cAMP-처리된 세포에서 검출되었다 (도 6f). 아릴아민 N-아세틸트랜스퍼라제 NAT1 및/또는 NAT2 (도 6g) 및 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 (UGT) (도 6h)를 포함하는 II상 대사 효소의 분석은 1차 배양된 간세포보다 더 높은 활성을 보여주었고, 이것은 cAMP 신호전달이 집단의 성숙과 일치하게 넓은 범위의 효소의 발현의 상향조절을 유도함을 나타낸다. 이들 관찰은 함께 cAMP 신호전달이 3-D 응집체에서 hESC-유래 간세포-유사 세포의 성숙을 촉진함을 나타낸다.
추가로, 2개의 핵심 효소, 즉 CYP1A2 및 CYP3A4의 대사 활성의 유도가능성을 또한 평가하였다. 8-Br-cAMP-처리된 세포는 CYP1A2-선택적 기질 페나세틴을 대사시킬 수 있었다. 란소프라졸을 사용하여 세포를 72시간 동안 유도하면, 상기 활성이 3.4배로 증가하였다. 비-처리된 (8-Br-cAMP) 세포는 유도가능하지 않은 낮은 수준의 활성을 보였다. 2개의 독립적인 1차 간세포 샘플은 기초 대사 활성보다 낮거나 대등한 수준을 보였지만, 보다 높은 수준의 유도 (18배 및 9배)를 보였다. CYP3A4 활성은 테스토스테론을 6β-히드록실 테스토스테론으로 대사시키는 세포의 능력에 의해 측정되었다. 8-Br-Camp 처리된 세포는 상기 활성을 나타내었다. CYP3A4 인듀서 리팜피신의 첨가는 활성을 2.2배 증가시켰고, 이것은 상기 효소도 hESC-유래 세포에서 유도가능함을 나타낸다. CYP1A2에서 관찰된 바와 같이, CYP3A4 활성은 비-유도된 세포에서 거의 검출되지 않았다. 1차 간세포는 낮지만 유의한 수준의 CYP3A4 유도를 보였다.
다른 hPSC 주로부터 간의 특정화 및 성숙
상기 상세히 설명된 방안이 상이한 인간 다능성 줄기세포주에게 널리 적용가능하지 결정하기 위해, hESC 주 H9 및 H1 및 유도된 다능성 세포 (iPSC) 주 38-2를 간의 운명으로 분화시키기 위한 프로토콜을 사용하였다. 3개의 모든 세포주로부터의 제6일 EB는 Wnt3a/악티빈 유도 단계 후에 고 비율의 CKIT+CXCR4+ 및 CKIT+EPCAM+ 세포를 함유하였다 (도 7a). EPCAM+ 세포의 비율이 모든 EB에서 높지만, H9-유래 세포는 다른 세포주로부터 생성된 세포보다 실질적으로 더 높은 수준의 EPCAM을 발현하였다. 95% 초과의 H9-유래 집단이 SOX17+ 및 FOXA2+를 발현하는 반면, 단지 65-70%의 iPSC-유래 세포만이 이들 전사 인자를 발현하기 때문에, EPCAM 발현 수준은 내배엽 유도의 정도와 상관관계가 있었다 (도 7a). 이러한 발견은 표면 마커 분석 단독은 내배엽 발생의 모니터링에 충분하지 않고 SOX17 및 FOXA2 발현의 정량적 분석이 상기 배엽 층의 유도를 측정하기 위해 필요함을 나타낸다. HES2 세포에서 관찰된 바와 같이, 연장된 악티빈/노달 신호전달은 각각의 세포주로부터의 CKIT+CXCR4+ 집단의 간의 발생을 개선하였다 (도 7b). 그러나, 유의한 수준의 ALB 발현을 생성하기 위해 필요한 악티빈 처리 지속시간은 세포주마다 달랐다. 더 높은 수준의 ALB 발현은 H9-유래 세포에서 악티빈 처리 2일 후에 달성된 반면, H1 및 38-2 세포 둘 모두는 4일의 추가의 악티빈 신호전달을 필요로 하였다. 상기 처리를 사용하여, 각각 H9, H1 및 38-2 세포주로부터의 90%, 85% 및 70% ALB+ 세포로 이루어지는 배양액을 생성할 수 있었다 (도 7c). 분화 제26일의 H9-유래 세포는 배양된 간세포와 매우 유사한 조약돌 형태를 보였다 (도 7d).
8-Br-cAMP의 첨가는 H9-유래 응집체에서 유의한 수준의 CYP3A4 (16배), CYP1A2 (100배), 및 CYP2B6 (10배) 및 II상 효소 UGT1A1 (16배)의 발현을 유도하였다 (도 7e). 유도 규모는 HES2-유래 세포에서보다 실질적으로 더 컸고, CYP1A2 및 CYP3A4의 발현 수준은 1차 간세포에서 발견되는 것보다 유의하게 더 높았다. 두 hESC 주 사이의 유도 차이의 이유는 현재 알려져 있지 않다. 8-Br-cAMP는 또한 hiPSC-유래 응집체 내의 상기 효소의 발현을 1차 간세포에서 발견되는 것만큼 높은 수준으로 유도하였다 (도 7e).
HES2 세포주에서 관찰된 바와 같이, H9-유래 세포는 란소프라졸-유도가능 CYP1A2 활성을 보유하였다. H9 및 iPSC-유래 세포는 또한 리팜피신으로 유도가능한 CYP3A4 활성을 보였다. 유도가능 CYP1A2 활성은 iPSC-유래 세포에서 검출가능하지 않았고, 이것은 아마도 상기 집단의 최적 미만의 분화를 반영한다.
cAMP 자극된 간 집단의 마이크로어레이 분석.
cAMP 유도 결과를 추가로 평가하고 1차 간세포와 비교하여 hESC-유래 간 집단의 발생 상태를 평가하기 위해, 상이한 집단의 전체적인 발현 프로파일을 비교하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 총 23038개의 여과된 전사체를 최종 분석에서 사용하였다. 이원 무감독 계층 (two-way unsupervised hierarchical) 클러스터 분석에 의해 3개의 군이 구별되는 집단으로 보임을 밝혀냈다. 3개의 cAMP-유도된 집단이 서로 가장 유사한 반면, 3개의 1차 간세포 집단은 가장 다른 발현 패턴을 보여주었다. 3개의 모든 샘플군들 사이에서 가장 통계상 유의한 가변성을 보인 784개의 전사체를 확인하기 위해서 FDR 교정된 ANOVA (q < 0.05)를 사용하였다. 이들 데이타의 계층 클러스터링된 시각화는 각각의 생물학적 군에서 고도로 발현된 전사체의 클러스터를 확인하였다. 이들 클러스터는 1차 간세포에서 181개의 전사체, 8-Br-cAMP-유도된 세포에서 106개의 전사체 및 비-처리된 세포에서 80개의 전사체로 이루어졌다. 8-Br-cAMP-유도된 세포에 풍부화된 유전자는 대부분의 핵심 P450 효소, 및 글루코스 신합성, 글루코스 항상성 및 지질 대사를 포함하는 간 기능의 많은 측면에 관여하는 것의 유전자 개체 발생 카테고리를 포함하였다. 1차 간세포에서 최고 수준으로 발현된 클러스터는 면역 시스템, 염증 관련 및 MHC 유전자로 이루어졌다. 비-유도된 hESC-유래 세포에서 검출된 클러스터는 임의의 풍부화된 유전자 온톨로지 (ontology) 카테고리를 함유하지 않았다.
보다 상세한 집단 비교를 위해, 간 기능의 핵심 측면에 관여하는 단백질을 코딩하는 선택된 세트의 전사체를 분석하였다. 이들은 I상 및 II 약물 대사 효소, 수송체, 응고 인자, 지단백질, 핵 수용체 및 전사 인자 및 일반적인 간 효소 및 다른 기능성 분자의 하위세트를 포함하였다. 상기 데이타의 분석은 많은 유전자가 8-Br-cAMP-처리된 hESC-유래 세포 및 1차 간세포에서 대등한 수준으로 발현됨을 밝혀내었다. 각각의 카테고리에서 선택된 유전자는 비처리된 세포 또는 1차 간세포에 비해 8-Br-cAMP 처리된 세포에서 유의하게 더 높은 수준으로 발현된다. 이들은 I상 효소 CYP1A2 및 CYP3A4를 포함하고, 이것은 qPCR 및 기능성 연구, II상 효소 SULT2A1, 수송체 SLCO1B1, 일반적인 간 효소 TAT, G6P 및 TDO (각각 티로신 대사, 글루코스 신합성 및 트립토판 대사를 담당함), 표면 수용체 ASGPR-1, 및 ALB를 학인해준다. 간세포에서 ICG의 세포성 흡수는 유기 양이온 수송체 SLCO1B1 및 SLCO1B3 및 Na+-독립적 수송체 SLC10A1에 의해 조절되기 때문에29, 이들의 발현 유도는 cAMP 처리된 응집체가 보다 높은 수준의 ICG 흡수를 보인다는 발견과 일치한다. 함께 살펴보면, 마이크로어레이 분석으로부터의 이들 데이타는 cAMP를 사용한 간모세포-시기 응집체의 유도는 간세포 성숙을 나타내는 전체적인 발현 변화를 나타낸다. 이들 분석에 기반하여, 상기 방안에 의해 생성된 hESC-유래 간의 세포는 1차 인간 간세포의 것과 적어도 동등한 발생 시기를 나타내는 것으로 보인다.
논의
약물 대사 분석 및 간 질환 치료를 위한 이식에 유용한 hPSC-유래 간세포에 대해, 세포는 비교적 성숙하고 핵심 I상 및 II상 약물-대사 효소를 포함하는 성인 간세포의 많은 특징을 보여야 한다. 현재까지, 많은 상이한 연구는 배아에서 핵심 발생 단계를 재현하기 위해 설계된 단계적인 (staged) 프로토콜을 사용하여 hESC 및 hiPSC 둘 모두로부터 미성숙 간 계통 세포를 생성하는 것이 가능함을 보여주었다. 상기 연구의 성공은 조기 분화 시기를 제어하는 경로가 합리적으로 잘 규정된다는 사실을 반영한다. 이와 대조적으로, 간세포 성숙을 제어하는 인자 및 세포 상호작용에 대한 이해는 빈약한 상태이고, 그 결과 극히 소수의 연구만이 대사적으로 기능성인 세포를 보고하였다. 두안 (Duan) 등12은 1차 간세포에서 발견되는 것과 대등한 수준의 CYP1A2, CYP3A4, CYP2C9 및 CYP2D6 효소 활성을 보인 H9 hESC로부터 간 세포를 유도하는 것이 가능함을 제시하였다. 두안 등은 그 몇몇이 혈청의 배치 사이에서 상이한 많은 인자를 포함하는 그들의 방법에 혈청을 사용하였다. 관련 인자는 규명되지 않았다. 상기 발견은 비교적 성숙 hESC-유래 간세포가 생성될 수 있음을 나타내지만, 연구는 성숙을 촉진하는 경로에 대한 임의의 상세한 내용을 제시하지 않고, 그 전략이 다른 hPSC 주에 널리 적용될 수 있음을 보여주지 않았다. 두안 등의 도 6에 제시된 바와 같이, 이들은 인간 ES 세포 (H9)로부터 간세포에서 대사 약물을 측정하였다. 페나세틴은 CYP1A2 활성을 유도하고 그 평가를 제공하고, 미다졸람, 부푸랄올 및 디클로페낙은 각각 CYP3A4, 및 CYP2B6 및 CYP2D6을 유도하고 그 평가를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재되는 HES2 세포주에서, 1차 간세포에 비교시에 거의 동등한 수준의 효소 활성 (CYP1A2 및 CYP2B6)이 관찰되었다. qPCR 분석에서, H9 세포에서 CYP1A2 및 CYP2B6의 발현 수준은 HES2 세포주에서 발견되는 것보다 5-8배 더 높았다. 본원에 기재되는 방법은 CYP 효소 CYP1A2 및 CYP2B6의 측면에서 1차 간세포와 매우 근접하게 유사한 세포를 생성한다. 이와 유사하게, 1차 간세포에 비해 거의 동일하거나 대등한 수준의 CYP2D6 발현이 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 세포에서 관찰된다.
몇몇의 다른 그룹은 hESC-유래 집단에서 특이적 전사 인자의 강제 (forced) 발현이 단독으로 또는 Swiss 3T3 세포와의 공동 배양과 함께 핵심 대사 효소를 발현하는 세포의 생성을 야기하는 성숙을 촉진할 수 있음을 밝혀내었다32 - 34. 그러나, 상기 방법의 주요 단점은 모든 실험을 위한 바이러스 형질도입의 필요, 및 감염 효율 및 효능 있는 전사 인자의 적절한 수준의 발현을 확립할 때의 차이를 포함하여 상기 조작에 의해 발생하는 가변성이다. 1차 간세포와 비교할 때, 상기 방법을 통해 생성된 hESC-유래 집단의 발현 수준은 1차 간세포에서 발견되는 것보다 상당히 더 낮았다.
본원에서, 성숙을 조절하는 경로에 대한 통찰이 제공된다. 또한, 3D 응집과 cAMP 신호전달의 조합이 간모세포의 성숙에서 중추적인 역할을 수행함이 입증된다. 또한, 내배엽 유도 후의 악티빈/노달 신호전달은 간모세포 전구세포 집단의 최적 생성을 위해 필수적이고, 풍부화된 전구세포 집단은 성숙 집단의 유도에 유용하다. 이들 3개의 구별되는 단계의 조합은 예를 들어 1차 성인 간세포에서 발견되는 것과 유사한 기능성 대사 효소의 발현 프로파일 및 수준을 보이는 간세포-유사 세포의 생성을 유도한다.
CXCR4+C-KIT+ 집단 내의 지속된 악티빈/노달 신호전달이 성숙 간세포의 생성에 유용하다는 관찰은 성숙 세포의 효율적인 생성을 위한 조기 세포의 적절한 조작의 중요성을 강조한다. 분화 제6일과 제8일 사이의 연장된 악티빈/노달 신호전달 (HES2 세포에 대해)은 유전자 발현 패턴 및 배양 제26일에 검출된 알부민-양성 세포의 비율에 영향을 주었다. 또한, 상기 단계는 cAMP에 반응하여 성숙함으로써 대사적으로 기능성인 간세포를 생성하는 간 세포 집단의 발생을 촉진하였다. 상기 추가의 신호전달 단계는 제6일 EB 표적 집단이 95% 초과의 CXCR4+CKIT+EPCAM+SOX17+ 세포로 이루어졌기 때문에 불량한 내배엽 유도에 대한 보상이 아니다. 오히려, 이론에 매이지 않으면서, 가능하게는 악티빈이 BMP 또는 FGF의 부재 하에 상기 계통을 유도하거나 그의 생존을 촉진하는 능력이 없기 때문에 오염 중배엽-유도체 (CD90+ 및 CD31+ 세포)를 감소시키는 것으로 보인다. 중배엽 오염의 감소에 추가로, 추가의 악티빈 배양 단계는 또한 상기 경로가 장관의 전후방 (anterior-posterior) 패턴화에서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있기 때문에35 , 36, 내배엽을 복측 전장 (ventral foregut) 운명으로 적절하게 패턴화할 때 역할을 수행할 수 있다. 지속된 악티빈/노달 신호전달은 또한 hESC로부터의 췌장 발생에 영향을 주는 것으로 이전에 입증되었다18.
특정 실시양태에서, 프로토콜의 성숙 시기는 2개의 구별되지만 상호 의존적인 단계를 수반한다. 제1 단계는 3D 응집체의 생성이다. 이전 연구는 3D 배양이 마우스 및 인간 1차 태아 간세포의 간세포 생존 및 성숙을 개선할 수 있음을 보여주었다24 , 37, 38. 최근에, 미키 (Miki) 등은 관류 생물반응기에서의 3D 배양이 hESC-유래 간세포의 분화를 개선할 수 있다고 보고하였고, 이것은 3D 환경이 세포의 성숙을 위해 중요할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이들 차이의 중요성은 태아 및 성인 간 대조군에 대한 비교가 이루어지지 않았기 때문에 해석이 어려웠다. 본 연구는 고정된 3D 방식의 배양이, 핵심 간 유전자, 예컨대 ALB, CPS1, G6P 및 TDO의 발현의 유의한 증가 및 성숙 간세포에서 발견되는 수용체인 ASGPR1을 발현하는 세포 비율의 극적인 증가에 의해 입증되는 바와 같이 분화를 촉진함을 보여주기 위해 상기 발견을 확장하였다. 유전자, 예컨대 CYP1A2 및 CYP3A4가 2D 배양에서는 유도되지 않기 때문에, 응집체 내의 성숙도 cAMP에 대한 반응을 위해 중요하였다. 응집이 성숙을 촉진하는 메카니즘은 현재 알려져 있지 않지만, 이론에 매이지 않으면서, 향상된 세포 상호작용 및 가능하게는 간 내의 간세포의 세포 형태를 어느 정도 모방하는 3D 구조 내의 극성 상피 세포의 생성과 관련될 수 있다.
성숙 전략의 제2 단계는 임의로 세포 투과성이고 보다 느리게 가수분해되는 cAMP 유사체 8-Br-cAMP의 첨가를 통한 3D 응집체 내의 cAMP 경로의 활성화이다. PGC1-α, TAT 및 G6P를 포함하는 간 내의 특정 유전자는 그의 프로모터 영역에 CREB 요소를 함유하고, 그 결과 cAMP 신호전달의 직접적인 표적이다25 , 39, 40. 이를 고려하여, 상기 표적 유전자를 2D 단일층 및 3D 응집체에서 유도하였다. PCR 및 마이크로어레이 분석은 경로의 활성화가 약물 대사, 미토콘드리아 생물발생 (biogenesis), 지질 합성 및 글루코스 대사를 포함하는 간세포 기능의 상이한 측면과 연관된 유전자 발현 패턴의 변화를 유도하기 때문에 cAMP 신호전달의 효과가 표적 유전자의 유도를 넘어서서 연장됨을 분명하게 보여준다. 이러한 전체적인 변화는 cAMP 신호전달이 간모세포의 성숙을 촉진한다는 해석을 지지한다. 지속된 cAMP 신호전달이 상승된 발현 수준의 유지를 위해 필요하지 않다는 사실은 그 효과가 성숙의 하나이고, 단지 특정 유전자의 발현의 유도 및 유지가 아니라는 해석을 추가로 지지한다. 가장 현저한 발현의 변화 중 몇몇은 1차 간세포에서 발견되는 것만큼 높거나 그보다 더 높은 수준으로 검출된 CYP1A2, CYP3A4 및 UGT1A1을 포함하는 핵심 약물-대사 효소에서 관찰되었다. HES2-유래 세포가 1차 간세포에서 발견되는 것과 대등한 수준의 기능성 효소를 제시하기 때문에, 전사체 수준은 기능을 나타내는 것이다. 유사한 유도 패턴이 2개의 hESC 주 및 하나의 hiPSC 주로부터의 간세포-유사 세포에서 관찰되었고, 이것은 상기 성숙 전략이 널리 적용가능함을 나타낸다.
내분비 호르몬, 예컨대 인슐린 및 글루카곤은 글루코스 대사에 대한 급성 효과 및 유전자 발현의 조절을 통한 만성 효과를 갖는 성인 간 내의 cAMP 수준에 대해 영향을 줄 수 있다. 단식 조건 하에서, cAMP 수준은 상향조절되어, PGC1-α 및 글루코스 신합성에 관여하는 유전자의 신속한 유도를 야기하여 에너지 공급을 보장한다41 , 42. 단식 조건 이외에, PGC1-α의 발현은 마우스 간에서 출생 1일 후에 극적으로 상향조절됨이 보고되었다43. 상기 상향조절은 신생아 간세포의 성숙을 신속하게 촉진하는 것으로 생각된다. 이론에 의해 제한되지 않지만, PGC-1α 발현의 상향조절을 통해, hESC-유래 간모세포의 cAMP 신호전달에 대한 효과는 어느 정도 재현될 수 있고, 단식 동안 간에서 및/또는 출생 후에 간세포 계통에서 관찰된 변화는 성숙 세포의 많은 특징을 보이는 세포의 생성을 야기한다.
요약하면, 본 발명자들은 1차 간세포의 것과 유사한 유전자 발현 프로파일을 보이는 세포의 생성을 유도하는 hPSC로부터 간 계통 세포의 성숙을 촉진하는 단계를 최초로 규정하였다. 대사적으로 기능성인 세포의 발생은 이들 발전이 제약 산업에서 약물 대사 분석을 위한 hPSC-유래 간세포-유사 세포의 통상적인 생산을 가능하게 할 것으로 증명하기 때문에 중요한 종점이다. cAMP-유도된 세포는 또한 생체인공 간 장치의 개발을 위한 및 궁극적으로 간 질환의 치료를 위해 세포 대체 요법의 이식을 위한 이상적인 후보 집단을 제공한다,
물질 및 방법 :
HPSC 배양 및 분화
HPSC를 이전에 설명된 바와 같이44 20% 낙-아웃(Knock-out) 혈청 대체물 (KSR)을 보충한 DEME/F12 (50:50; 깁코(Gibco))로 이루어지는 hESC 배지 내에서 방사선 조사한 마우스 배아 공급자(feeder) 세포 상에서 유지하였다. 배상체 (EB)의 생성에 앞서, hESC를 매트리겔™-코팅된 플레이트 상으로 1일 동안 통과시켜 공급자 세포의 집단을 고갈시켰다. 이 시기에, hESC를 0.25% 트립신-EDTA에 의해 분리시켜 이전에 설명된44 ,45 바와 같이 작은 클러스터를 생성한 후, 혈청 비함유 분화 (SFD) 배지 내에서 BMP4 (3 ng/ml)의 존재 하에 24시간 동안 (제0일 내지 제1일) 배양하였다. 제1일에, EB를 수거하고, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 2.5 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml), Wnt3a (25 ng/ml) 및 BMP4 (0.25 ng/ml)을 보충한 StemPRO-34®로 이루어진 유도 배지 A 내에서 3일 동안 재-배양하였다. 제4일에, EB를 수거하고, bFGF (10 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml), Wnt3a (25 ng/ml) 및 BMP4 (0.25 ng/ml)를 보충한 StemPRO-34® (배지 B) 내에서 재배양하였다. EB를 제6일에 수거하고, 단일 세포로 분리하고, 세포를 2일 동안 매트리겔™-코팅된 12 웰 플레이트 상에서 Wnt3A을 함유하지 않고 악티빈 A를 50 ng/ml의 농도로 함유하는 배지 B 내에서 4 x 105 세포의 농도로 배양하였다. 제8일에, 배지 B를 1% vol/vol B27 보충물 (인비트로겐: A11576SA), 아스코르브산, MTG, FGF10 (50 ng/ml) (제8일에서 제10일까지), bFGF (20 ng/ml) (제10일에서 제14일까지), 및 BMP4 (50 ng/ml)을 보충한 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM)로 이루어진 간 특정화 배지로 교체하였다. 배지를 제8일에서 제14일까지 2일마다 교환하였다. HES2-유래 간의 세포의 성숙을 촉진하기 위해, 이들을 성숙 배지 A 내에서 12일 동안 배양하였다. 성숙 배지 A는 1% vol/vol B27 보충물, 아스코르브산, 글루타민, MTG, 간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 덱사메타손 (Dex) (40 ng/ml) 및 온코스타틴 M (20 ng/ml)을 함유하는 IMDM으로 이루어졌다. 응집체는 배양의 제26일에 집단으로부터 생성하였다. 응집체를 생성하기 위해, 세포를 콜라게나제 및 TrypleLE로 분리한 후, 6 웰 초저 클러스터 접시 내에서 6 x 105 세포/웰의 농도로, Rho-키나제 억제제 및 0.1% BSA를 보충한 성숙 배지 A 내에서 배양하였다. 응집체를 이들 조건 하에 제32일까지 유지하고, 여기서 배지를 3일마다 교환하였다. 제32일에, 배지를 EGF를 함유하지 않은 간세포 배양 배지 (HCM) (론자: CC-4182)로 이루어진 성숙 배지 B로 교환하였다. 이 시기에 10 mM 8-Br-cAMP (바이오랩(Biolab): B007)를 첨가하였다. 배지를 3일마다 교환하였다. H9, H1 및 IPS 세포로부터 간세포 유사 세포를 생성하기 위해, 간 특정화 배지를 다음과 같이 변화시켰다. bFGF의 농도를 40 ng/ml로 증가시키고, 기본 배지는 제8일에서 제14일까지 배양을 위해 IMDM에서 H16 DMEM으로, 이어서 제14일에서 제20일까지 H16 DMEM + 25% 햄 (Ham) F12로 교체하였다. IMDM을 제20일 내지 제32일까지 사용된 성숙 배지 A에 대해 H21 DMEM + 25% 햄 F12 및 0.1% BSA로 교체하였다. 모든 시토카인은 인간의 것이고, 달리 진술하지 않으면 알앤디 시스템즈 (R&D Systems)로부터 구입하였다. EB 및 단일층 배양액을 5% CO2, 5% O2, 90% N2 환경 내에 유지하였다. 응집 배양액을 5% CO2 주변 공기 환경 내에 유지하였다.
유동 세포 측정
유동 세포 측정 분석을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다45. 세포 표면 마커에 대해, 염색을 10% FCS를 함유하는 PBS 내에서 수행하였다. 세포내 단백질에 대해, 염색을 PBS 내에서 4% 파라포름알데히드 (일렉트론 마이크로스코피 사이언스 (Electron Microscopy Science, 미국 펜실베니아주 해트필드)로 고정시킨 세포에 대해 수행하였다. 세포를 이전에 설명된 바와 같이45 Sox17 및 FoxA2 염색을 위해 90% 빙냉 메탄올로 20분 동안 투과시켰다. 알부민 및 알파-태아단백질 염색은 10% FCS 및 0.5% 사포닌 (시그마)을 함유하는 PBS 내에서 수행하였다. 염색된 세포를 LSRII 유동 세포측정기 (BD)를 사용하여 분석하였다.
면역염색
면역염색을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다45. 세포를 배양 웰 내에서 4% PFA로 37℃에서 15분 동안 고정하고, DPBS (CaCl2 및 MgCl2 함유) + 0.1% BSA 내에서 3회 세척한 후, 0.2% 트리톤(Triton)-X100을 함유한 세척 완충제 내에서 20분 동안 투과화시켰다. DPBS (CaCl2 및 MgCl2 함유) + 0.1% BSA 내에서 추가의 3회 세척 후에, 세포를 단백질 차단 용액 (다코(DAKO); X0909)으로 20분 동안 실온에서 차단시켰다. 알부민 및 알파-태아단백질 양성 세포의 평가를 위해, 세포를 1시간 동안 실온에서 염소 항-ALB 항체 (베틸(Bethyl)) 또는 토끼 항-AFP 항체 (다코)로 염색하였다. 이소형 대조군의 농도를 1차 항체에 매칭시켰다. 신호를 시각화하기 위해, 세포를 후속적으로 당나귀 항-염소 알렉사 488 항체 (인비트로겐) 또는 당나귀 항-토끼-Cy3 항체 (잭슨 이뉴모리서치 (Jackson Immunoresearch))와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. Sox17 염색을 위해, 상기 기재된 바와 같이 세포를 고정하고 투과시키고 차단하였다. 세포를 염소-항-SOX17 (알앤디)와 함께 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 신호를 당나귀 항-염소 알렉사 488 (인비트로겐)과 함께 인큐베이션에 의해 시각화하였다. ASGPR-1 염색을 위해, 응집체를 매트리겔™-코팅된 커버글래스 상에서 1일 동안 배양하였다. 부착 및 확산 이후, 세포를 4% PFA로 37℃에서 15분 동안 고정한 후, 냉 100% 메탄올로 10분 동안 투과시켰다. 세포를 위에서와 같이 세척하고 차단하였다. 고정된 세포를 염소 항-ASGPR-1 (산타 크루즈(Santa Cruz))와 함께 4℃에서 ?x야, 이어서 토끼 항 ALB (다코)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 신호를 당나귀 항-염소 알렉사 488 항체 및 당나귀 항-토끼 CY3 항체와 함께 인큐베이션에 의해 시각화하였다. 1차 및 2차 항체를 DPBS + 2% BSA + 0.05% 트리톤-X100 내에 희석하였다. DAPI를 사용한 프로롱(ProLong)® 골드 안디페드 (Gold Antifade) (인비트로겐)를 사용하여 핵을 대조염색하였다. 염색된 세포를 형광 현미경 (레이카 (Leica) CTR6000)을 사용하여 시각화하고, 레이카 어플리케이션 스위트 (Leica Application Suite) 소프트웨어를 사용하여 영상을 포획하였다.
정량적 실시간- PCR
총 RNA를 RNAqueous® 마이크로 키트 (Micro Kit) (암비온 (Ambion))를 사용하여 제조하고, RNase-비함유 DNase (암비온)으로 처리하였다. 500 ng 내지 1 ㎍ RNA를, 수퍼스크립트(Superscript)® III 역전사효소 (인비트로겐)를 갖는 랜덤 (random) 헥사머 및 올리고(Oligo)(dT)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. qPCR을 이전에 설명된 바와 같이45 ??티패스트 (QuentiFast) SYBR 그린 PCR 키트 (퀴아젠 (Quiagen))를 사용하여 매스터사이클러(MasterCycler)® 이피 리얼플렉스 (ep realplex) (에펜도르프 (Eppendorf)) 상에서 수행하였다. 발현 수준을 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 TATA 박스 결합 단백질 (TBP)에 정규화하였다. UGT1A1 발현을 측정하기 위해, 상대적인 유전자 발현을 8-Br-cAMP (-) 처리 세포에서의 수준에 비해 델타-델타 CT 방법을 이용하여 계산하였다. 총 인간 성인 및 태아 간 RNA를 클론테크 (Clontech)로부터 구입하였다. 2개의 1차 간세포 RNA 샘플은 스티븐 씨. 스트롬 (Dr Stephen C. Strom: 피츠버그 대학(University of Pittsburg))이 제공하였고, 제3 샘플은 젠비오 (Zenbio) (로트 (Lot); 2199)로부터 구입하였다. 2개의 1차 간세포 샘플을 2일 동안 배양하고 수거하였다. 1개 (HH1892)는 1세 백인 남아로부터 단리되고, 다른 것 (HH1901)은 담즙정체로 인해 간을 체외이식한 14월령 남아로부터 단리되었다. 제3 샘플 (젠비오: 로트 2199)는 48세 남성 백인 장기 공여자로부터 단리되었다.
간의 응집체의 인도시아닌 그린 흡수
인도시아닌 그린 (ICG, 시그마) 용액을 세포에 HCM (론자) 내의 1 mg/ml ICG의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, PBS로 3회 세척한 후, 도립 현미경 (레이카)으로 검사하였다.
HPLC에 의한 약물 대사 검정
간의 응집체를 CYP1A2 기질 페나세틴 (200 μΜ), CYP2B6 기질 부프로피온 (900 μM), NAT1/2 기질 술파메타진 (SMZ) (500 μΜ), 또는 총 UGT 기질 4-메틸움벨리페론 (4-MU) (200 μΜ)을 함유하는 HCM 내에서 24 또는 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 배지의 분취액을 수집하고, 대사물질의 수준을 개별적으로 최적화된 고성능 액체 크로마토그래피 검정을 이용하여 정량하였다. 히드록시부프로피온 수준은 로보즈(Loboz) 등46의 HPLC 방법에 기반하여 검정하였다. 4-MU 글루쿠로니드는 이전에 설명된 바와 같이47 일렬(tandem) 질량 분광기와 결합된 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 동결보존된 간세포를 해동하고, 24 또는 48시간 동안 콜라겐 배양 접시 상에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 상청액을 24 또는 48시간의 배양 이후 수거하고, CYP1A2, CYP2B6, NAT1/2 및 총 UGT에 대한 활성을 측정하였다.
마이크로어레이 프로세싱 및 데이타 분석
RNA 샘플을 유니버시티 헬쓰 네트워크 게노믹스 센터 (University Health Network Genomics Centre)에서 표준 아피메트릭스 (Affymetrix) 지침에 따라 아피메트릭스 인간 유전자 ST v1.0 칩 상에서 실행하였다. 간단히 설명하면, 각각의 샘플에 대해 300 ng의 총 RNA 출발 물질을 암비온 WT 발현 키트에 대한 입력물 (input)로 사용하였다. 이어서, 2.7 ㎍의 증폭된 cDNA를 단편화하고, 표지하고, 아피메트릭스 인간 유전자 ST v1.0 칩에 18시간 (60 RPM에서 45℃) 동안 혼성화하였다. 어레이를 젠칩 (GeneChip) 플루이딕스 스테이션 (Fluidics Station) P450 유체 스테이션을 사용하여 세척하고, 아피메트릭스 젠칩 스캐너 (Scanner) 7G를 사용하여 스캐닝하였다. 스캐닝 후에, 각각의 칩을 검토하였고, 아피메트릭스 품질 제어 지침을 통과하는 것으로 밝혀졌다. 미처리(Raw) CEL 파일을 진스프링 (Genespring) 소프트웨어 (애질런트 (Agilent), v11.5.1) 내로 불러오고, 프로브 수준 데이타를, HuGene-1_0-st0v1_na31_hg19_2010-09-03 빌드 (build)에 기반한 ExonRMA16 알고리즘을 이용하여 요약하였다. 또한, 각각의 유전자를 고려 중의 모든 샘플을 가로질러 중간 값에 정규화하였다. 모든 통계학은 로그(log)2 전환된 데이타에 대해 수행하였다. 총 28869개의 전사체를 상기 어레이 상에 나타낸다.
제1 단계로서, 전사체를 여과하여 3개의 모든 샘플군에 걸쳐 측정된 발현의 하위 20번째 백분위수에 일관되게 해당하는 것을 제거하였다. 평균 연결 규칙 (average linkage rule) 하에 피어슨 중심화 거리 측정 (Pearson centered distance metric)을 사용한 무감독 계층 클러스터링 분석을 사용하여 샘플과 군 사이의 전체 유사성 및 차이를 처리하였다. 3개의 샘플군 사이의 유도 통계 분석을 벤자미니 및 호흐버그 오류 발견률 (Benjamini and Hochberg False Discovery Rate; FDR, q < 0.05)48을 사용한 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 생물학적 의미를 갖는 차별적으로 발현된 전사체의 세트를 발견하기 위해, 유전자 온톨로지 (GO) 분석을 교정된 벤자미니 및 유케티엘리 초기하 시험 (Benjamini and Yuketieli hypergeometric test)을 q < 0.1 유의성 수준49을 사용하여 수행하였다. 2개의 선험적으로 (a priori) 규정된 세트의 특이적 전사체가 보다 상세히 조사되었다: 관심있는 특이적 간 활성과 관련된 전사체; 및 HOMER 데이타베이스50로부터 공개적으로 이용가능한 정보를 기초로 하여 발현되고 간 특이적인 것으로 밝혀진 전사체.
실시예 2
CHIR99021은 정규의 (canonical) Wnt 신호 경로를 모방하는 것으로 보고된 GSK3의 선택적 억제제이다. CHIR99021은 hPSC로부터 진정 내배엽 세포에 대한 배상체 유도 및 단일층 유도에서 wnt3a (예를 들어 악티빈과 조합하여 첨가됨)의 대체물로서 시험되었다. 도 8a 및 b에 제시된 바와 같이, Wnt3a를 대체하기 위해 CHIR99021을 사용하여 유도된 CKIT+ CXCR4+ 및 CXCR4+EPCAM+ 세포의 비율은 집단의 95% 초과이고, 악티빈/wnt3a 유도에서 관찰된 것에 대등하다.
도 8a 및 b는 CHIR99021이 진정 내배엽 세포를 유도할 수 있음을 보여준다. 도 8a는 악티빈/wnt3a를 사용한 배상체 유도의 제6일 악티빈/CHIR 99021에서 CXCR4+, CKIT+ 및 EPCAM+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. 도 8b는 제6일 악티빈/CHIR 99021에서 CXCR4+, CKIT+ 및 EPCAM+ 세포의 비율을 보여주는 유동 세포 측정 분석이다. 도 8c 및 d는 (c) 악티빈/wnt3a 또는 (d) 악티빈/CHIR 99021을 사용한 단일층 유도 제7일을 보여준다.
방법
GSK3 베타 억제제를 사용한 진정 내배엽의 유도.
EB 유도를 위해, CHIR99021 (0.3 μΜ)을 내배엽 유도를 위해 Wnt3a로부터 교체하였다.
단일층 유도를 위해, HPSC를 이전에 설명된 (Kennedy et al., 2007) 바와 같이 20% 낙-아웃 혈청 대체물 (KSR)을 보충한 DEME/F12 (50:50; 깁코)로 이루어지는 hESC 배지 내에서 방사선 조사한 마우스 배아 공급자 세포 상에서 유지하였다. 단일층 배양액에서 내배엽의 유도 전에, hESC를 매트리겔 코팅 표면 (일반적으로 12웰 플레이트) 상에 1일 동안 계대배양하였다. 제0일에, 세포를 글루타민 (2 mM), MTG (4.5 X 10-4 M: 시그마), 악티빈 A (100 ng/ml), CHIR99021 (0.3 μΜ) 또는 Wnt3a (25 ng/ml)로 보충된 RPMI 기반 배지에서 배양하였다. 제1일에서 제3일까지, 배지를 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 5 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml)을 보충한 RPMI로 매일 교체하였다. 제3-5일로부터, 세포를 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 5 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml)를 보충한 SFD 기반 배지 내에서 배양하였다. 배지를 격일로 교환하였다. 제7일에, 진정 내배엽을 상기한 바와 같이 FGF 및 BMP 경로 효능제로 처리하여 간 운명으로 특정화하였다.
실시예 3
NSG 마우스 내의 이소성 간 조직
이식되는 hESC-유래 간모세포는 이식되고, 간세포 분화 마커를 발현하는 세포를 생성한다.
도 8e, f 및 g는 GSK3 억제제 CHIR99021이 실시예 2에 설명된 바와 같이 이식되는 세포를 제조하기 위해 사용된 것을 제외하고 실시예 1에서 설명된 방법을 사용하여 제조된 ES 유래 간 세포의 이식을 보여준다.
도 8e, f, g, 및 h: NSG 마우스 내의 이소성 간 조직. 도 8e는 이식 2개월 후에 hESC-유래 간세포의 클러스터 (화살촉)를 보여주는 장간막 영역의 H&E 염색의 예시적인 현미경 사진이다. 배율은 5X이었다. 장 (화살표), 이식된 세포 (화살촉). 도 8f는 도 8e로부터의 H&E 염색 절편의 고 배율 (10X) 현미경 사진을 보여준다.
도 8 g, h: 조직화학적 염색은 이식 2개월 후에 장간막 영역에 hESC-유래 세포의 존재를 보여준다. 인간 알부민 (알렉사 488: 녹색) (화살표로 제시됨) 및 CK19 (Cy3: 적색) (화살촉으로 제시됨)의 이중 염색은 이식된 세포가 간세포 및 담관세포 계통으로 분화할 잠재력을 갖는다는 것을 보여준다. HESC-유래 간세포-유사 세포는 알부민 양성 세포 (화살표)로서 관찰된 반면, 담관세포-유사 세포는 CK19를 발현하고, 도관 유사 구조에서 발견되었다 (화살촉).
방법
NSG 마우스 내의 이소성 간 조직
6주령 NSG 마우스를 잭슨 래보러토리스 (Jackson Laboratory; 미국 메인주 바 하버)로부터 얻고, UHN 동물 시설에 수용하였다. hESC-유래 간세포 전구세포 (간모세포) 및 hESC-유래 CD34+ 내피 세포로 이루어진 응집체 (제27일)를 50 ㎕ 매트리겔 (비디 바이오사이언스 (BD Bioscience))에 현탁하고, 이식할 때까지 빙상에서 유지하였다. 수여자 마우스를 1-3% 이소플루란으로 마취하고, 개복수술을 시행하였다. 장간막 영역을 노출시키고, 매트리겔과의 세포 혼합물을 장간막 영역에 위치시키고, 흡수성 지혈제인 서지셀 (Surgicel) (에티콘 (Ethicon) 360, USA)로 덮었다. 이식 2개월 후에, 마우스를 희생시키고, 조직학적 분석에 의해 hESC-유래 세포의 존재를 평가하였다.
실시예 4
Wnt/β-카테닌 경로에 관련된 소분자는 간 전구세포를 팽창시킬 수 있다. 제27일 간 전구세포 (H9)를 분리하고, 96웰 매트리겔 코팅 접시에 웰당 1 X 104 세포의 밀도로 도말하였다. 세포를 상이한 농도의 CHIR99021 (0.3 μΜ, 1 μΜ 및 3 μΜ)로 처리하고, 9일 동안 배양하였다. 간 전구세포의 비 증가는 세포 수를 처리하지 않은 제27일 세포 수에 비교하여 계수함으로써 조사하였다 (도 9a).
Wnt 및 MEK/ErK 경로의 억제는 I상 약물 대사 효소와 연관된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
Wnt/β-카테닌 신호 (XAV 939: 1 μΜ) 및 MEK/Erk 신호 (PD0325901: 1 μΜ)의 억제에 관련된 소분자와 함께 배양한 제44일 3D 간의 응집에서 CYP3A4의 유전자 발현. 8-Br-cAMP와 함께, Wnt 및 MEK/ErK 신호의 억제는 CYP3A4의 유전자 발현을 증가시키는 영향을 갖는다 (도 9d).
Wnt/β-카테닌 신호 (XAV 939: 1 μΜ) 및 MEK/Erk 신호 (PD032590: 1 μΜ)의 억제에 관련된 소분자와 함께 배양한 제44일 3D 간의 응집에서 CYP1A2의 유전자 발현. 8-Br-cAMP와 함께, Wnt 및 MEK/ErK 신호의 억제는 CYP1A2의 유전자 발현을 증가시키는 영향을 갖는다 (도 9d).
일부 상이한 세포외 기질 (ECM) 상에서 제26일 간세포-유사 세포 배양액에서 ALB의 유전자 발현. 배상체 (EB)로부터의 내배엽 세포를 분리하고, ECM 상에 4 X 105 세포의 세포 밀도로 도말하고, 제26일까지 상기 기재된 바와 같이 간의 특정화 및 성숙 배지 내에서 배양하였다. 총 RNA를 제26일 세포로부터 추출하고, 알부민 발현의 수준을 측정하였다. 발현 수준은 젤라틴 코팅된 배양 조건에 비해 차이 배수에 의해 결정하였다 (도 9f).
방법
GSK3 베타 억제제를 사용한 진정 내배엽의 유도.
EB 유도를 위해, CHIR99021 (0.3 μΜ)로 내배엽 유도 동안 Wnt3a를 교체하였다.
단일층 유도를 위해, HPSC를 이전에 설명된 바와 같이 (Kennedy et al., 2007), 20% 낙-아웃 혈청 대체물 (KSR)로 보충한 DEME/F12 (50:50; 깁코)로 이루어진 hESC 배지 내에서 방사선 조사한 마우스 배아 공급자 세포 상에서 유지하였다. 단일층 배양액에서 내배엽의 유도 전에, hESC를 12웰 매트리겔 코팅된 플레이트 상에 1일 동안 계대배양하였다. 제0일에, 세포를 글루타민 (2 mM), MTG (4.5 X 10-4 M: 시그마), 악티빈 A (100 ng/ml), CHIR99021 (0.3 μΜ) 또는 Wnt3a (25 ng/ml)로 보충한 RPMI 기반 배지 내에서 배양하였다. 제1일에서 제3일까지, 배지를 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 5 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml)로 보충한 RPMI로 이루어진 배지로 매일 교환하였다. 제3, 5일에, 세포를 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF; 5 ng/ml), 악티빈 A (100 ng/ml)로 보충한 SFD 기반 배지 내에서 배양하였다. 배지를 격일로 교환하였다. 제7일에, 진정 내배엽 세포는 상기 기재된 바와 같이 간 특정화 배지를 사용하여 분화하기 시작하였다.
실시예 5
cAMP 처리에 의한 세포 응집체의 성숙 유도
세포 응집체를 실시예 1에서와 같이 생성하였다.
세포 응집체를 HGF, Dex 및 OSM 내에서 제32일까지 배양하였고, 이 시점에 cAMP를 첨가하였다. cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때 OSM을 제거하였다. 일부 실험에서, cAMP 유사체 및/또는 cAMP 효능제가 첨가될 때 배양액으로부터 HGF를 또한 제거하였다. 다른 실험에서, cAMP가 첨가될 때 10 ng/ml HGF (20 ng/ml로부터 감소됨)의 첨가는 응집체의 생존을 촉진하는 것으로 보였다.
이론에 매이지 않으면서, OSM을 유지하는 것은 1상 CYP 효소, 특히 CYP 3A4의 발현 유도에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 생각된다.
실시예 6
간 전구세포에서 노치 신호전달 경로는 담관세포 계통의 분화에 영향을 미친다
담관세포-유사 세포의 분화를 조사하기 위해, H9-유래 제27일 간 전구세포를 HGF 20 ng/ml 및 EGF 50 ng/ml의 존재 하에 OP 9 세포 (노치 신호전달 공여자)와 공동 배양하였다. H9-유도된 제27일 간 전구세포를 실시예 1에서처럼 유도하였다. 간 전구세포가 OP-9 세포로부터 노치 신호전달 활성화를 받을 때, 알부민 양성 세포는 완전히 감소하고, 조직화된 (organized) 분지화 외형을 갖는 CK19 양성 세포로 변하였다 (도 10a, b). 이와 대조적으로, 노치 신호전달이 감마-세크레타제 억제제 (GSI) L-685, 458 (10 μΜ; 토크리스)와 함께 공동 배양된 세포에서 억제될 때, 알부민 및 CK-19 양성 세포가 발견되었다 (도 10b).
또한, GSI의 존재 또는 부재 하에 공동 배양된 세포의 H&E 절편은 GSI의 존재 하에 키메라 응집이 유지됨을 보여주었다. GSI 처리의 부재 하에, 세포는 내강을 함유하는 상피 도관 유사 구조로 배열되었다 (도 10a).
도 10b에 도시된 바와 같이, 제36일에 GSI의 부재 하의 OP9 공동 배양에서 CK19 및 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR)의 발현은 증가하였다. 제시된 값은 GSI의 존재 하에 배양된 세포와 비교된다. 알부민의 발현은 GSI의 존재 하에 배양함으로써 노치 신호전달이 활성화될 때 관찰되고, 이것은 세포가 간모세포의 특징을 보유함을 입증한다.
마지막으로, 간 전구세포와 OP 9 세포의 3D 공동 배양은 2D 배양에 비해 제36일에 CFTR의 증가된 발현을 일으켰다 (도 10c).
상기 기재된 실험은 담관-유사 구조를 형성하는 담관세포-유사 세포가 노치 신호전달의 활성화 (예를 들어 OP9, OP9델타 및/또는 OP9Jagged1 세포와 함께 공동-배양함으로써)를 통해 H9-유래 간 전구세포로부터 유도될 수 있음을 입증한다. 기능성 담관세포의 마커인 CFTR은 2D 배양에서보다 3D 겔 공동 배양에서 더 높았고, 이것은 환경이 또한 담관세포 성숙에 영향을 줄 수 있음을 보여준다.
실시예 7
예시적인 성숙 배지 제제
제14일( EB )/제13일 단일층에서 제26일( EB )/제25일( 단일층 ) 까지의 HES2 세포주에 대해
기반 배지:
IMDM, 1% vol/vol B27 보충물, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마)
시토카인 및 성장 인자:
간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 덱사메타손 (Dex) (40 ng/ml) 및 온코스타틴 M (20 ng/ml).
제14일( EB )/제13일 단일층에서 제20일( EB )/제19일( 단일층 ) 까지의 H9 및 iPS 세포주에 대해
기반 배지:
H16/햄 F12 (75%/25%), 1% vol/vol B27 보충물, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마)
시토카인 및 성장 인자:
간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 덱사메타손 (Dex) (40 ng/ml) 및 온코스타틴 M (20 ng/ml).
제20일( EB )/제19일 단일층에서 제26일( EB )/제25일( 단일층 ) 까지
기반 배지:
H21/햄 F12 (75%/25%), 1% vol/vol B27 보충물, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마)
시토카인 및 성장 인자:
간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 덱사메타손 (Dex) (40 ng/ml) 및 온코스타틴 M (20 ng/ml).
응집 시기
제26일/제25일로부터 제32일/제31일까지.
기반 배지:
IMDM 또는 H21/햄 F12 (75%/25%), 1% vol/vol B27 보충물, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마), Rho-키나제 억제제 (10 μΜ) 및 0.1% BSA.
시토카인 및 성장 인자:
간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 덱사메타손 (Dex) (40 ng/ml) 및 온코스타틴 M (20 ng/ml).
cAMP를 사용한 응집 시기
제32일/제31일에서 제44일/제43일까지.
기반 배지:
EGF를 함유하지 않은 간세포 배양 배지 (HCM) (론자: CC-4182). 10 mM 8-Br-cAMP (바이오랩: B007), Wnt/베타.카테닌 신호 (XAV 939: 1 μΜ) 및 MEK/Erk 신호 (PD032590: 1 μΜ)의 억제에 관련된 소분자.
담관세포 성숙 배지
기반 배지:
H21/햄 F12 (75%/25%), 1% vol/vol B27 보충물, 글루타민 (2 mM), 아스코르브산 (50 ㎍/ml; 시그마), MTG (4.5 X 10-4 M; 시그마),
시토카인 및 성장 인자:
간세포 성장 인자 (HGF) (20 ng/ml), 표피 성장 인자 (EGF) (50 ng/ml)
실시예 8
hESC -유래 간 발생에 대한 내피 세포의 영향.
내피 세포가 간 발생에서 중요한 역할을 수행함을 고려하여, 상기 계통을 hESC-유래 간 세포의 성장 및/또는 성숙에 대한 그의 영향에 대해 평가하였다. 이들 연구를 위해, CD34+ 내피 세포를 hESC로부터 생성하였다. 이들 연구를 위해, 내피 세포를 추적할 수 있도록 ROSA 유전자좌로부터 적색 형광 단백질 (RFP) cDNA를 발현할 수 있도록 조작된 HES2 hESC 주를 사용하였다. 내피 세포는 6일 동안 BMP4, bFGF 및 VEGF의 조합물을 사용한 유도에 의해 생성되었고, 이때 CD34+ 세포 (또한 CD31+ 및 KDR+)는 FACS에 의해 단리하였다. 분류된 CD34+ 세포를 6일 동안 EGM2 내피 세포 성장 배지에서 배양한 후, 애그리웰™을 사용한 키메라 응집체의 생성을 위해 사용하였다. 웰의 저변을 코팅하도록 하기 위해 간 세포 2일 전에 내피 세포를 애그리웰에 첨가하였다 (도 12a). 이때, 제25일 간모세포의 단일 세포 현탁액을 내피 세포 위에 첨가하고, 혼합물을 애그리웰에서 48시간 동안 배양하였다. 응집체를 후속적으로 애그리웰로부터 제거하고, 추가로 6일 동안 배양하였고, 이때 응집체를 수거하고 분석하였다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 내피 세포와 함께 배양된 응집체는 RFP+ 세포를 함유하였고, 단독 배양된 것보다 더 컸다. 유동 세포 측정 분석은 RFP+ 세포가 집단의 30%를 나타냄을 보여주었고 (도 12c), 이것은 유의한 수가 응집체 내의 간 세포에 통합되었음을 나타낸다. qRT-PCR 분석은 추가의 12일 동안 배양된 키메라 응집체가 내피 세포가 없는 간 응집체보다 실질적으로 더 높은 수준의 CYP3A4 메시지를 발현함을 보여주었다 (도 12d). 중요하게는, 이들 수준은 cAMP를 첨가하지 않으면서 달성되었고, 이것은 내피 세포가 hPSC-유래 간 세포의 성숙을 촉진할 수 있음을 제안한다. 이들 발견은 배아 내피 세포와의 상호작용이 hESC-유래 간세포의 생존 및 성숙에 영향을 줌을 나타낸다.
콜라겐 겔에서 hESC -유래 간세포의 성숙.
3D 응집, cAMP 및 PD/XAV의 조합은 인간 다능성 줄기세포-유래 간세포의 유의한 분화를 촉진하였다 (도 9), (도 9d 및 e). 세포는 AFP 및 태아 CYP3A7의 일부의 발현을 보유하였고, 이것은 이들이 충분히 성숙하지 않을 수 있음을 나타낸다. 집단의 추가의 성숙을 촉진하기 위해, 키메라 내피/간 응집체를 cAMP, PD 및 XAV의 조합물로 처리하였다. 이들 응집체를 세포외 기질 단백질의 공급원을 제공하기 위해 액체 배양액에 또는 콜라겐 겔에 유지하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 내피 세포의 응집체에 대한 첨가 (end)는 응집체를 액체 배양액 내에 유지할 때 ALB, CYP3A4, AFP 또는 CYP3A7의 발현 수준에 유의한 영향을 주지 않았다. 이와 대조적으로, 콜라겐 겔 내에서 응집체의 배양은 둘 모두 성인 간에서 발견되는 것과 유사한, 거의 비검출가능한 수준으로 감소되었기 때문에 AFP 및 CYP3A7 발현에 대해 극적인 효과를 유도하였다. 이 발견은 신호전달 경로, 세포 상호작용 및 세포외 환경이 모두 hPSC-유래 간세포의 성숙에서 역할을 수행함을 시사한다. 이것은 AFP를 거의 발현하지 않는 세포를 생성하는 것이 가능함을 보여준다. 상기 발현 패턴은 이들 세포가 성인 간 내의 간세포와 대등한 시기로 진행되었음을 시사한다.
실시예 9
인간 배아 및 유도된 다능성 줄기세포 (다능성 줄기세포; PSC)로부터 조직 특이적 세포 종류의 효율적인 생성을 위한 프로토콜의 개발은 인간 발생 및 질환의 시험관 내 모델의 확립을 위해 및 약물 발견 및 독성 예측을 위한 새로운 플랫폼의 설계를 위해 도움을 주었다. 간을 포함하는 계통은 장기의 담도 시스템을 이루는 간세포 및 담관세포가 약물의 유해한 효과의 및 다양한 유전성 및 감염성 질환의 1차 표적이기 때문에 특히 중요하다. 약물 대사에서 간세포의 중추적인 역할을 고려할 때, 현재까지 대부분의 노력은 hPSC로부터 상기 세포 종류의 생성에 맞춰졌다. 저효율 및 대사 기능 결여에도 불구하고, 기능성 P450 효소의 발현을 포함하는 성숙 간세포의 일부 특징을 보이는 세포의 생성의 촉진하는 단계적인 분화 프로토콜을 개발하는 것이 가능하였다. 최근의 연구는 상기 전략을 환자 특이적 유도된 다능성 줄기세포 (iPSC)로, 및 간세포 기능에 영향을 주는 유전성 간 질환의 모델링까지 확장하였다.
담관을 포함하는 질환은 통상 유의한 이환율을 야기하는 만성 간 질환의 원인이고 확실한 관리를 위해 전체 장기 이식을 종종 필요로 한다. 단일유전자 담도 질환, 예컨대 낭성 섬유증 간 및 아라질 증후군의 근본적인 메카니즘은 불완전하게 이해된 상태이고, 보다 복잡한 담도 질환, 예컨대 원발성 경화성 담관염 및 담도 폐쇄는 그의 병리생리학의 이해를 위한 또는 신규 제약 물질의 스크리닝을 위한 적절한 모델이 결여되어 있다. hPSC로부터 기능성 담관세포를 생성하는 능력은 상기 미충족된 필요성을 만족시킨다.
hPSC로부터 담관세포의 성공적인 유도는 분화 배양액에서 상기 계통의 배아 발생을 정확하게 모델링하는 능력에 따라 결정될 것이다. 담관세포는 태아 시기에 일찍 발생하고, 간세포 계통을 또한 생성하는 간모세포로 알려진 이중잠재성 (bipotential) 전구세포로부터 유도된다. 마우스에서 표적화 연구는 간모세포로부터 담관세포 계통의 특정화는 전구세포에 의해 발현되는 노치 2 및 발생하는 문맥 중간엽에 존재하는 Jagged-1의 상호작용에 의해 매개되는 노치 의존성 사건임을 보여주었다. 소아 담관 질환인 아라질 증후군이 노치 2 또는 Jagged 1에서의 돌연변이에 의해 유발된다는 발견은 상기 경로가 또한 인간에서의 담관세포 발생에 관련된다는 강한 증거를 제공한다. 담관세포는 성숙하면서 조직화되어, 담관을 생성하는 발생하는 원시 도관 구조의 내벽을 이루는 극성 상피를 형성한다.
담도 질환 환자로부터의 iPSC의 조사를 위한 기초로서, hPSC로부터 기능성 담관세포의 유도 분화 및 성숙을 위한 우수한 프로토콜이 설명된다. hPSC-유래 담관세포는 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR)를 포함하는 성숙 담관에서 발견되는 마커를 발현하는 상피화된 낭성 구조를 형성하기 위해 유도될 수 있다. 상기 구조에서 CFTR 기능은 cAMP 경로를 포르스콜린으로 자극한 후 낭포 팽윤의 조절을 통해 제시되었다. 낭성 섬유증 환자 iPSC로부터 생성된 낭포는 CFTR 교정자의 첨가에 의해 구제될 수 있는, 포르스콜린-유도 팽윤 검정에서 결함을 보였다. 종합적으로, 이들 발견은 hPSC로부터 담관세포 및 담도 도관-유사 구조를 생성하고 상기 유도체 세포 종류를 시험관 내에서 낭성 섬유증 담도 질환의 측면을 모델링하기 위해 사용하는 것이 가능함을 입증한다.
결과
hPSC 분화 배양액에서 간모세포 발생 시기의 특성화
hPSC로부터 담관세포를 생성하기 위해, 분화 배양액에서 간모세포 발생 시기를 먼저 특성화하는 것이 필요하였다. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 본 발명자들이 hPSC로부터 기능성 간세포의 생성을 위해 개발한 변형된 버전의 프로토콜 (도 14a)을 사용하였다1. 본 발명자들의 이전의 방식과의 주요 차이는 내배엽 유도 단계가 3D 배상체 (EB)가 아니라 단일층에서 수행되었다는 것이었다. 상기 변화는 90% 초과의 CXCR4+ CKIT+ 및 EPCAM+ 세포로 이루어진 집단이 분화 제3일에 생성되었기 때문에 배양액에서 내배엽 발생을 촉진하였다 (도 14b). EB 분화 제5일까지 대등한 집단이 검출되지 않았다1. 내배엽을 간의 운명으로 특정화하기 위해, 배양액을 분화 제7일에 bFGF 및 BMP4의 조합물로 처리하였다.
배아에서 간 발생 개시시에, 새로 형성된 간모세포는 복측 전장 상피로부터 얇게 갈라지고, 횡중격을 침습하여 간의 버드를 형성한다. 버드의 형성은 상기 과정의 이른 시기 동안 일시적으로 발현되는 전사 인자 Tbx3에 의존적이다2 , 3. 버드가싹이팽창하면서, 전구세포는 Tbx3을 하향조절하고, 알부민 (ALB), 알파 태아단백질 (AFP), 시토케라틴 19 (CK19), Sox9, NHF6β 및 노치2를 포함하는, 간 및/또는 담관세포 계통에서 정상적으로 발현되는 유전자의 조합물의 발현을 유지하고/하거나 상향조절한다. bFGF/BMP4 처리 hESC-유래 내배엽 집단의 RT-qPCR 분석은 분화 제13일에 TBX3 발현의 일시적인 상향조절을 보여주었고, 이때를 간모세포 특정화의 시기로서 확인하였다 (도 14c). 면역염색은 제13일 집단 내의 대다수의 세포가 TBX3+임을 보여주었고, 이것은 간모세포 특정화가 효율적이었음을 나타낸다. SOX9 및 HNF6B 발현의 개시는 TBX3과 중복된다 (도 14c) . 그러나, TBX3과 달리, 상기 유전자들의 발현은 분석 마지막 날인 제25일까지 계속 증가하였다. ALB 및 AFP의 발현은 제19일에 상향조절되었고, 또한 제25일에도 증가하였다. CK19는 2상 패턴을 보였고, 최고 수준의 발현은 제13일 및 제25일에 검출되었다. 면역형광 염색 및 유동 세포 측정 분석은 분화 제25일에 대다수의 세포가 ALB+, AFP+ 및 CK19+임을 보여주었다. 이들 발견은 함께 제25일 집단 내의 세포가 생체 내 간의 버드와 동등한 팽창된 간모세포 발생 시기를 대표함을 강력하게 시사한다. 노치 1 발현은 그렇지 않지만, 노치 2 발현이 또한 제25일에 상향조절되었고, 이것은 상기 집단이 상기 경로를 통해 신호전달을 수행할 수 있는 간모세포를 함유한다는 해석을 추가로 지지한다.
노치 신호전달은 hPSC -유래 간모세포 -유사 집단으로부터 담관세포 발생을 촉진한다.
담관세포 발생에 대한 노치 신호전달의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 간모세포 집단 (제25일)을 Jagged 14, 5을 포함하는 상이한 노치 리간드를 발현하는 것으로 알려진 OP9 간질 세포와 함께 공동 배양하였다. hPSC-유래 세포는 단일 세포 현탁액으로서 간질 상에서 배양할 때 잘 생존하지 않았다. 이 문제를 극복하기 위해서, 본 발명자들은 제25일 단일층 세포로부터 3D 응집체를 생성하고, OP9 간질 세포 상에서 배양하였다. 면역염색 및 유동 세포 측정 분석은 공동 배양 전의 응집체 내의 대다수의 세포가 ALB+AFP+CD19+노치2+임을 보여주었고, 이것은 이들이 간모세포 특징을 유지함을 나타낸다. 이 응집 단계는 단지 80%의 ALB+AFP+CK19+ 세포로 이루어진 제25일 집단으로부터 생성된 응집체가 배양 48시간 후에 90% 초과의 ALB+AFP+CK19+ 세포를 함유하였기 때문에 간모세포를 선택하는 것으로 보인다. OP9 간질 (9일)에서 공동 배양될 때, 응집체는 더이상 ALB를 발현하지 않는 CK19+ 세포의 구별되는 클러스터를 형성하였고, 이것은 이들이 담관세포 특정화의 초기 시기를 거쳤음을 시사한다. 마우스에서 연구는 HGF, EGF 및 TGFβ1 신호전달이 담관 발생에서 역할을 수행함을 보여주었기 때문에6 -8, 본 발명자들은 다음으로 상기 경로의 활성화가 CK19+ 클러스터의 추가의 발생을 촉진하는지 결정하기 위해6 -8 상기 인자를 개별적으로 또는 조합하여 배양액에 첨가하였다. EGF 또는 TGFβ1 또는 이 둘의 조합물의 첨가는 CK19+ 응집체의 크기를 증가시켰다. 이와 대조적으로, HGF 단독은 거의 효과를 보이지 않았다. 흥미롭게도, EGF 및 HGF 또는 EGF, HGF 및 TGFβ1의 조합은 극적인 형태 변화를 유도하고, CK19+ 세포로 이루어진 분지형 구조의 형성을 촉진하였다. RT-qPCR (도 15a) 및 유동 세포 측정 분석 (도 21)은 면역염색 발견을 확인해 주었고, OP9와의 공동 배양 후에 ALB+ 세포의 완전한 부재를 보여주었다.
노치 경로의 길항제인 감마 세크레타제 억제제 (GSI)의 첨가는 ALB 발현의 하향조절을 차단하고, 배양액 내의 CK19+ 세포의 비율을 저하시키고, 분지형 구조의 발생을 억제하였고, 이것은 이들 효과가 노치 신호전달에 의해 매개됨을 나타낸다 (도 15a). 노치 표적 HES1, HES5 및 HEY1의 발현은 OP9 상에서 배양 9일 후에 상향조절되었다 (도 15b). 상기 발현 증가는 γ-세크레타제 억제제의 첨가에 의해 차단되었고, 이것은 OP9와의 공동 배양이 노치 경로를 효과적으로 활성화함을 보여준다 (도 15b). 2개의 다른 hPSC 주 (ESC HES2 및 iPSC Y2-1)의 분화 잠재력에 대한 분석은 TBX3 및 간모세포 마커 발현의 유사한 시간 패턴을 보여주었고, 이것은 상기 시기를 통한 전이가 시험관 내에서 간의 발생의 특징임을 나타낸다 (도 22). 두 세포주로부터 유래된 응집체는 OP9 간질 세포와 공동 배양 후에 CK19+ALB- 세포로 이루어진 분지형 구조를 생성하였다. H9-유래 집단에서 관찰된 바와 같이, ALB 발현의 하향조절 및 상기 구조의 발생은 노치 의존적 사건이다. 종합적으로, 이들 발견은 간모세포 집단에서 노치 신호전달의 활성화가 담관세포 발생의 초기 시기를 유도하고, HGF, EGF 및 TGFβ1 신호전달은 가능하게는 도관 형태 형성의 조기 시기를 반영하는, 분지형 구조의 형성을 유도하는 형태 변화를 촉진함을 나타낸다.
3차원 배양액은 담관세포 성숙을 촉진한다.
OP9 공동 배양에서 관찰된 분지화가 담관 발생의 초기 시기를 나타내는지 결정하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 3D 세포 구조의 성장을 촉진하기 위한 배양 시스템을 확립하였다. 상기 방안에서, 제25일 hESC-유래 세포 및 OP9 간질 세포 (GFP+)로 이루어진 키메라 응집체를 1.2 mg/ml 콜라겐, 40% 매트리겔 및 HGF, EGF 및 TGFβ1로 이루어진 배지 혼합물에서 배양하였다 (도 23a). 이들 조건에서 배양 2주 이내에, 응집체는 극적인 형태학적 변화를 겪고, 관형 구조, 속이 빈 낭포 또는 그의 혼합 형태를 형성하였다 (도 16a, b). 낭포는 이들 배양액에서 가장 풍부한 구조이었다 (도 16b). 노치 표적 유전자 Hes1, Hes5 및 Hey1의 발현은 OP9 세포가 없는 응집체로부터 유래된 것에 비해 키메라 응집체로부터 발생한 집단에서 상향조절되었고, 이것은노치 신호전달이 배양액에서 활성을 보임을 나타낸다 (도 23b). 조직학적 분석은 관형 및 낭성 구조가 내강을 갖는 도관 형태를 갖고 CK19+ 및 E-CADHERIN+를 발현하지만 ALB-는 발현하지 않는 상피-유사 세포를 포함함을 보여주었다. 긴밀한 연결 마커인 ZO-1 (폐쇄소대 1)가 또한 발현되었고, 구조의 정점 (apical) 측면으로 제한되는 것으로 밝혀졌고, 이것은 세포가 성숙 상피 도관의 특징인 첨부-기저부 (apicobasal) 극성을 획득함을 시사한다. 도관 내의 세포는 또한 성인 담관에서 먼저 발현된 막횡단 채널인 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자 (CFTR)를 발현하였다. ZO-1에서처럼, CFTR 단백질은 도관-유사 구조의 정점 측면에서 우세하게 검출되었다. 웨스턴 블롯 분석은 키메라 응집체로부터 생성된 집단에 단백질의 존재를 확인하였다 (도 23d). CFTR 메시지 및 단백질의 수준은 OP9 없이 배양된 응집체로부터 유래된 세포에서 상당히 더 낮았고, 이것은 그의 발현이 노치 신호전달에 의존적임을 나타낸다 (도 23d, e). ALB, AFP 및 CYP3A7을 포함하는 간 마커의 결여 및 상기 구조 내의 담관세포 마커 CK19, SOX9 및 CFTR의 발현의 상향조절이 RT-qPCR 분석에 의해 확인되었다 (도 16c). 유사한 CK19+CFTR+ 관형 및 낭성 구조는 이들 조건 하에 배양한 후 iPSC-유래 응집체로부터 발생하였다. 이들 발견은 함께, 매트리겔과 콜라겐의 혼합물에서 배양될 때, 간모세포 집단이 성숙 담관에서 발견되는 마커를 발현하는 도관-유사 구조를 생성할 수 있음을 보여준다.
GSI의 첨가는 도관-유사 구조 및 낭포의 형성을 억제하고, ALB 및 저수준의 CK19를 발현하는 조밀 응집체의 발생을 촉진하였고 (도 16a, b 구체), 이것은 노치 신호전달의 부재 하에, 간모세포 특징을 갖는 세포가 배양액에 계속 존재함을 시사한다. GSI의 첨가는 또한 간세포 마커 (ALB, AFP 및 CYP3A7)의 발현을 증가시키고, 담관세포 발생과 연관된 유전자 (CK19, Sox9 및 CFTR)의 발현을 감소시켰다 (도 16c).
hPSC -유래 담관세포는 생체 내에서 도관-유사 구조를 형성한다.
생체 내에서 hPSC-유래 담관세포의 발생 잠재력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 매트리겔 플러그 내의 담관세포 (106 세포)를 면역결핍 NOD/SCID/IL2rg -/- (NSG) 마우스의 유방 지방 패드 내로 이식하였다. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 HES2-RFP hESC로부터 유래된 제25일 간모세포 집단과 OP9 간질의 공동 배양에 의해 생성된 분지형 구조로부터 분리된 세포를 사용하였다. 이들 hESC는 ROSA 유전자좌로부터 RFP를 발현하도록 조작되었다9. 이식 6 내지 8주 후에, 다수의 도관-유사 구조가 매트리겔 플러그에서 검출되었다 (도 17a, b). 도관 내의 세포는 RFP+이었고, 이것은 이들이 인간에서 기원하고 HES2-RFP 세포로부터 유래됨을 보여준다 (도 17c,d). 추가로, 세포는 CK19 및 CFTR을 발현하였고, 이것은 이들이 담관세포의 특징을 보임을 나타낸다. 시험관 내에서 생성된 구조에서 관찰된 바와 같이, CFTR 발현은 도관의 정점 측면으로 분리되었다. 기형종은 임의의 이식된 동물에서 관찰되지 않았다.
hPSC 유래 담관세포 -유사 세포는 기능성이다.
hPSC-유래 담관세포의 기능을 평가하기 위한 제1 단계로서, 본 발명자들은 정상 담관 세포에 존재하는 MDR1 수송체의 기능적 활성을 측정하기 위해 사용된 추적 염료인 로다민123을 유출하는 그의 능력을 평가하였다. H9 hESC 또는 iPSC로부터 유래된 낭성 구조는 염료를 내강 공간으로 수송하였고 이것은 활성 수송체 활성을 나타낸다. MDR 수송체의 억제제인 20 μM 베라파밀의 존재 하에, 로다민은 구조의 내강에 축적되지 않았고, 이것은 염료의 이동이 아마도 MDR 수송체 단백질을 통한 능동 수송을 반영함을 확인해준다.
CFTR 기능적 활성을 제시하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 낭성 구조에 대한 포르스콜린-유도 팽윤 검정을 수행하였다. 이 검정에서, 포르스콜린/IBMX의 첨가에 의한 cAMP 경로의 활성화는 CFTR 기능을 향상시키고, 이것은 유체 수송 및 낭포의 팽윤을 유발하였다. 팽윤은 세포-투과성 형광 염료인 칼세인 그린을 사용한 염색 후에 시각화할 수 있다 (도 18a). 포르스콜린 및 IBMX의 배양액에 대한 첨가는 24시간 후에 측정시에 H9- 및 iPSC-유래 낭포의 크기를 각각 2.09 +/- 0.21 및 2.65 +/- 3.1배 증가를 유도하였다 (도 18b). CFTR 억제제 (CFTRinh-172)의 첨가는 포르스콜린/IBMX 유도 팽윤을 차단하였고, 이것은 낭포 크기 증가가 CFTR 의존적임을 나타낸다. 상기 검정으로부터의 발견은 hPSC-유래 낭포/도관-유사 구조 내의 세포가 간의 담관에서 발견되는 기능성 담관세포의 특성을 보임을 입증한다.
낭성 섬유증 환자 iPSC로부터 담관세포의 생성 및 기능성 분석.
시험관 내에서 질환을 모델링하기 위한 상기 시스템의 유용성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 통상적인 F508 결실 (예를 들어 델타F508)을 보유하는 2명의 상이한 낭성 섬유증 환자로부터 생성된 iPSC로부터 낭포 형성을 분석하였다. 두 hiPSC 주는 야생형 hPSC에 대해 관찰된 것과 유사한 동역학을 갖는 간모세포 집단을 생성하였다 (도 24a, b). 간모세포 발생이 변경되지 않았지만, 배양 2주 후에 겔에서 분지형 구조만이 관찰되었기 때문에 환자 iPSC로부터 낭포 형성은 분명히 손상되었다 (도 19a). 환자 세포로부터의 낭포 형성은 2주 배양 기간의 첫주 동안 포르스콜린의 첨가에 의해 유도될 수 있다 (변화) (도 19a, b). 그러나, 환자 iPSC로부터 발생한 많은 낭포는 완전히 속이 빈 것은 아니고, 분지형 도관 구조를 함유하였다 (도 19c). 정상 iPSC로부터 발생한 것에 전형적인 보다 높은 빈도의 속이 빈 낭포는 보다 긴 배양 기간 후에 검출되었고, 이것은 돌연변이체 세포의 성숙이 지연되었음을 제시한다. 정상 iPSC-유래 담관세포의 배양액에 대한 CFTR 억제제의 첨가는 또한 낭포 형성을 지연하였고, 이것은 이들 구조의 생성이 어느 정도 기능성 CFTR에 의존적임을 나타낸다 (도 19b).
본 발명자들은 다음으로 화학적 교정자 VX-809 및 Corr-4a를 사용하여 CFTR 기능성 검정 전에 2일 동안 낭성 섬유증 환자 iPSC로부터의 담관세포 유사 세포 내의 F508 del CFTR의 기능성 회복을 평가하였다. 두 분자는 돌연변이체 CFTR 단백질의 폴딩 결함을 교정하는 기능을 한다. 교정자의 첨가는 낭포 형성을 개선하지 않지만, 내강의 정점 부위에 검출가능한 수준의 CFTR의 축적을 야기한다. 그러나, 야생형 낭포 내의 CFTR의 균일한 분포와 달리, 단백질은 교정자로 처리된 환자-유래 낭포 내에 구별되는 부분 (patch)으로 나타났다. 상기 패턴은 돌연변이체 단백질의 수송 (trafficking) 결함이 불완전한 구제를 반영할 수 있다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 교정자 첨가의 효과를 보여주었다. 정상 세포 내의 대다수의 CFTR은 도 20a에서 레인 HBE의 상부 밴드 (C)에 의해 확인된 보다 큰 성숙 형태이다. 환자 유래 세포는 훨씬 더 적은 CFTR 단백질을 함유하고, 대다수는 보다 작은 미성숙 형태이었다. 교정자의 첨가는 극적으로 환자 세포에서 성숙 단백질의 비율을 극적으로 증가시켰다. 교정자가 CFTR 기능에 영향을 주는지 결정하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 처리 및 비처리된 낭포를 포르스콜린/IBMX-유도 팽윤 검정에 적용하였다 (도 20 b, c). 환자 특이적 낭포는 교정자의 부재 하에 거의 팽윤을 보이지 않았다. 그러나, 교정자 첨가시에, 포르스콜린/IBMX 및 VX770을 사용한 유도 24시간 후에 환자 C1로부터 생성된 낭포는 약 2.18 +/- 0.52배 증가한 반면, 환자 997로부터의 낭포는 1.64 +/- 0.08배 증가하였다. 함께 살펴보면, 이들 발견은 환자 특이적 iPSC-유래 담관세포에서 CFTR 기능부전의 측면을 모델링하고 상기 환자를 치료하기 위해 사용된 교정자가 결함을 구제할 수 있음을 보여준다.
논의
hPSC를 시험관 내에서 및 생체 내에서 도관-유사 구조로 자가 조직화하는 기능성 담관세포-유사 세포로 유도 분화시키기 위한 시스템이 설명된다.
뮤린 연구는 문맥 중간엽 세포와의 Jagged 1 상호작용 및 간세포 상의 노치 2를 포함하는 노치 경로가 생체 내에서 담관세포 운명 결정의 유도에 중요함을 시사하였다.
OP9 세포에 의해 제공된 노치 신호전달은 단일층뿐만 아니라 3차원 겔 배양에서도 운명 결정을 성공적으로 조작하였다. 노치 신호전달이 G 세크레타제 억제제의 첨가에 의해 영향받을 때 역전된 효과가 관찰되었다. 선행 보고서는 낮은 효율이지만 인간 ES 세포로부터 생성된 담관세포-유사 도관 구조가 극성 및 로다민 123 흡수의 기능을 제시하도록 함을 보여주었다.
OP9에 의해 제공되는 노치 신호전달은 인간 ES 유래 담관세포-유사 세포로부터의 이식을 촉진하고, 세포는 마우스 유방 지방 패드에 RFP-양성 도관-유사 구조를 형성하였다. 상기 구조는 OP9의 부재 하에 관찰되지 않았다. 함께 살펴보면, OP9 공동 배양 시스템은 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 인간 PSC 유래-간모세포로부터 담관세포-유사 세포를 유도하기 위한 노치 신호전달을 효율적으로 제공한다.
hPSC로부터 간세포 성숙은 본원의 3차원 배양 환경에 의해 향상되는 것으로 밝혀졌다. 이와 유사하게, 담관세포 계통 세포의 성숙은 또한 3차원 겔 배양 시스템에 의해 촉진되었다. 간모세포 응집체가 OP9 세포를 통한 노치 신호전달에 의해 자극될 때, 담관세포 계통과 연관된 유전자 발현 및 성숙은 유의하게 증가하였다. 또한, 담관세포로서의 기능적 활성이 시험관 내에서 검출되었다.
인간 iPS-유래 담관세포-유사 도관 구조는 기능성 CFTR 활성을 보였다. 이들 세포는 환자-특이적 방식으로 약물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 환자-특이적 담관세포-유사 도관 구조는 효율적으로 얻고, 다른 심각한 담도 질환, 예컨대 단일유전자 병태, 진행성 가족성 간내 담즙정체증 (PFIC 유형 1, 2 및 3), 및 아라질 증후군, 및 보다 통상적이고 복잡한 담도 질환, 담도 폐쇄 및 원발성 경화성 담관염에서 기존의 또는 새로운 치료 약물을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본원을 바람직한 예로 현재 고려되는 것을 참고로 하여 설명하였지만, 본원은 개시된 예로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 오히려, 본원은 첨부되는 청구범위의 취지 및 범위 내에 포함되는 다양한 변형 및 동등한 배열을 포함하는 것으로 의도된다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 간행물, 특허 및 특허 출원이 그 전부가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 예를 들어 표 또는 다른 곳에서 제시된 기탁 번호 및/또는 바이오마커 서열 (예를 들어 단백질 및/또는 핵산)을 비롯하여 본원에 제시된 각각의 기탁 번호와 연관된 서열은 그 전부가 참고로 포함된다.
참고문헌:
Figure 112015091257914-pct00001
Figure 112015091257914-pct00002
Figure 112015091257914-pct00003
Figure 112015091257914-pct00004

Claims (34)

  1. (a) 적어도 하나의 노달(nodal) 효능제 또는 베타-카테닌 효능제를 포함하는내배엽 유도 배지로 다능성 줄기세포를 배상체(EB) 또는 단일층으로 배양하여, 내배엽 세포 집단을 생산하는 단계;
    (b) 유도된 내배엽 세포 집단을 노달 효능제와 내배엽 유도 후 적어도 2일 동안 접촉시켜, 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리하여 유도된 내배엽 세포 집단을 생산하는 단계;
    (c) 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리하여 유도된 내배엽 세포 집단을 FGF 효능제 및 BMP4 효능제를 포함하는 특정화(specification) 배지와 접촉시킴으로써, 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리하여 유도된 내배엽 세포 집단을 단일층 배양액에서 특정화하여 간모세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 단계;
    (d) i. 간모세포의 단일층 배양액을 분리하고,
    ii. 분리된 간모세포의 응집체를 생성하고,
    iii. 성숙 배지에서 응집체를 배양하여 간세포 계통 세포 또는
    담관세포 계통 세포를 생산하는 것을 포함하는,
    간모세포의 성숙, 적어도 하나의 추가 계통 특정화 및 팽창을 유도하는 단계를 포함하는,
    다능성 줄기세포로부터 간세포 계통 세포 또는 담관세포 계통 세포를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 노달 효능제는 악티빈 A인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 성숙 배지는 하나 이상의 다음 성숙 인자를 포함하는 것인 방법:
    간세포 성장 인자 (HGF), 덱사메타손 (DEX) 및 온코스타틴 M (OSM).
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리되어 유도된 내배엽 집단이 하나 이상의 80%, 85%, 90%, 또는 95% CXCR4 + 및 cKIT + 양성 세포 및 70%, 75%, 또는 80% SOX17+ 세포를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, FGF 효능제가 FGF10, FGF2 또는 FGF4 또는 그의 조합인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 응집체를 생성하기 위하여 사용되는 분리된 간모세포가 하나 이상의 70%, 80%, 85%, 또는 90% 알부민 양성 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 배지가 cAMP 신호전달 경로 활성화제를 포함하는 것인 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 배지가 추가로
    a. 6 내지 12일, 8 내지 10일, 또는 9일 동안 적어도 하나의 Wnt 효능제 및 TGF베타 길항제, 또는
    b. cAMP 활성화 단계 동안 첨가되는 적어도 하나의 Wnt 길항제 및 Mek/Erk 길항제
    를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 전체 세포 배양의 적어도 27일 후 성숙 배지 내에 노치 길항제가 포함되고, 노치 길항제는 간세포 계통 특정화를 촉진하는 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제3항에 있어서,
    a) 다능성 줄기세포가 내배엽 유도 배지에서 배양되고,
    b) 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리하여 유도된 내배엽 세포 집단이 노달 효능제로 1, 2, 3, 또는 4일 동안 배양되고,
    c) 연장된 기간 동안 노달 효능제로 처리하여 유도된 내배엽 세포 집단이 특정화 배지로 4 내지 10일 동안 배양되어 간모세포를 포함하는 세포 집단을 얻고,
    d) 간모세포를 하나 이상의 HGF, Dex 및 OSM을 포함하는 성숙 배지로 10 내지 14일 동안 배양하고;
    e) 세포 집단이 적어도 70%, 80%, 85%, 또는 90%의 알부민 양성 세포를 포함할 때 또는 배양 20 내지 40일 후에 세포 집단의 응집체를 생성하고;
    f) 응집체를 Dex를 포함하는 성숙 배지에서 1 내지 10일 동안 배양하고;
    g) 1) 응집체를 하나 이상의 Dex 및 cAMP 신호전달 경로 활성화제를 포함하는 간세포 성숙 배지에서 6일 내지 10일 동안 배양하거나, 여기서, 응집체 생성 단계의 1 내지 10일 내에 cAMP 신호전달 경로 활성화제를 첨가하고; 또는
    2) 응집체를 노치 효능제, 및 cAMP 신호전달 경로 활성화제를 포함하는 담관세포 성숙/특정화 배지에서 5일 내지 90일 동안 배양하고, 여기서, 응집체 생성 단계의 1 내지 10일 내에 노치 효능제를 첨가하는 것인,
    방법.
  16. 제11항에 있어서, 생산되는 간세포 계통 세포가 기능성 간세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 기능성 간세포가 간모세포를 포함하는 집단의 세포에 비해 ALB, CPS1, G6P, TDO, CYP7A1, CYP3A7, CYP1A2, CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6, NAT2 및 UGT1A1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현 및 활성의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 기능성 간세포가 ASGPR-1+ 인 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 담관세포 운명이 성숙 배지에서 노치 효능제를 포함함으로써 특정화되는 것인 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제19항에 있어서,
    간모세포를 노치 효능제를 포함하는 성숙 배지에서 적어도 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 배양시켜,
    담관세포 전구세포의 담관세포, 또는 기능성 담관세포로의 추가의 계통 특정화 및 성숙의 하나 이상을 유도하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 생산된 담관세포의 집단이
    간모세포를 포함하는 집단의 세포 또는 노치 효능제로 처리되지 않은 응집체로부터 생산된 집단의 세포에 비해 SOX9, CK19 및 CFTR (낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자)로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2 또는 3개의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 포함하는 기능성 담관세포의 집단인 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. a. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 따라 간모세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계;
    b. 간모세포의 집단을,
    1. 키메라 응집체의 공동 배양액을 형성하여 기능성 간세포를 포함하는 세포의 집단을 생성하기 위한 CD34+ 내피 세포의 응집체 배양액, 또는
    2. 키메라 응집체의 공동 배양액을 형성하기 위한 노치 신호전달 공여자 세포의 배양액 (여기서 응집체는
    EGF,
    TGFβ1,
    EGF 및 HGF, 또는
    EGF, TGFβ1 및 HGF 와
    함께 배양되어 기능성 담관세포를 포함하는 세포의 집단을 생성함),
    과 공동 배양하는 단계
    를 포함하는, 기능성 담관세포를 생성하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 간모세포를 포함하는 세포의 집단이
    1. CD34+ 내피 세포와 적어도 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 15일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일 또는 90일 동안, 또는
    2. 노치 신호전달 공여자 세포와 적어도 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 60일 또는 90일 동안
    공동 배양되는 것인 방법.
  29. 제16항에 있어서, 응집체가 겔/매트릭스에 포매되고, 3D 배양되는 것인 방법.
  30. 제16항에 있어서, 간세포 계통 세포 집단, 담관세포 계통 세포 집단, 기능성 간세포 세포 집단, 또는 기능성 담관세포 세포 집단을 풍부화 또는 단리하여,
    적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 95%의 간세포 계통 세포, 담관세포 계통 세포, 또는 기능성 간세포를 포함하는 세포의 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 삭제
  32. 제16항에 따라 생산된 세포의 집단.
  33. 제1항 또는 제2항의 방법에 따라 생산된 세포의 집단을 포함하는, 약물 발견, 약물 대사 분석, 생체인공 간 장치의 개발을 위한 또는 간 및 담도 중 하나 이상의 질환의 치료를 위한 세포 대체 요법으로 사용되는 조성물.
  34. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 사용될 수 있는, 효능제, 길항제, 성숙 인자 중 하나 이상, 하나 이상의 배지, 및 세포 성장을 위한 용기, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 따라 팽창되거나 제조된 세포를 포함하는 키트.
KR1020157025863A 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법 KR102215508B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361766002P 2013-02-18 2013-02-18
US61/766,002 2013-02-18
PCT/CA2014/000122 WO2014124527A1 (en) 2013-02-18 2014-02-18 Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217003752A Division KR20210018540A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150119427A KR20150119427A (ko) 2015-10-23
KR102215508B1 true KR102215508B1 (ko) 2021-02-16

Family

ID=51353452

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025863A KR102215508B1 (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020247004920A KR20240024355A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020217042413A KR20220000930A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020237002630A KR20230019992A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020217003752A KR20210018540A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247004920A KR20240024355A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020217042413A KR20220000930A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020237002630A KR20230019992A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
KR1020217003752A KR20210018540A (ko) 2013-02-18 2014-02-18 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20160002595A1 (ko)
EP (1) EP2956540A4 (ko)
JP (3) JP2016517266A (ko)
KR (5) KR102215508B1 (ko)
CN (2) CN105121632B (ko)
AU (1) AU2014218290B2 (ko)
CA (1) CA2901377C (ko)
HK (1) HK1218137A1 (ko)
IL (2) IL240616B (ko)
SG (2) SG10201803131TA (ko)
WO (1) WO2014124527A1 (ko)
ZA (1) ZA201506189B (ko)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3219705T3 (da) 2005-12-28 2020-04-14 Vertex Pharma Farmaceutiske sammensætninger af den amorfe form af n-[2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-5-hydroxyphenyl]-1,4-dihydro-4-oxoquinolin-3-carboxamid
EP2393917B1 (en) 2009-02-03 2016-04-06 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells.
EP2412800A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
CN105121632B (zh) * 2013-02-18 2021-08-10 大学健康网络 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法
KR102215373B1 (ko) * 2013-08-06 2021-02-10 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 도파민 뉴런의 제조 방법
CN104694456B (zh) * 2013-12-06 2018-05-29 中国科学院上海药物研究所 体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞
US10597633B2 (en) 2014-05-16 2020-03-24 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture method for organoids
EP3194569A4 (en) * 2014-09-19 2018-03-07 Agency For Science, Technology And Research Differentiation of hepatocyte-like cells from stem cells
JP6746569B2 (ja) 2014-10-07 2020-08-26 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＶｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子のモジュレーターの共結晶
GB201421094D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium
GB201421092D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium
JP5777127B1 (ja) * 2014-12-09 2015-09-09 公立大学法人横浜市立大学 原始腸内胚葉細胞及びその作製方法
SI3059307T2 (sl) * 2015-02-20 2022-08-31 Inserm(Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Uporaba laminina za diferenciacijo pluripotentnih celic v hepatocite
US10179896B2 (en) 2015-05-12 2019-01-15 Baker Group, LLP Method and system for a bioartificial organ
GB201510950D0 (en) * 2015-06-22 2015-08-05 Cambridge Entpr Ltd In vitro Production of Cholangiocytes
KR20180055901A (ko) * 2015-10-05 2018-05-25 오리그3엔, 인코포레이티드 간 기능장애의 확인 및 개선에 기반한 파킨슨병의 진단 및 치료
JP6800987B2 (ja) * 2015-10-19 2020-12-16 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ウイルス受容性多能性幹細胞（ｐｓｃ）由来肝細胞の生産
CN106754636B (zh) * 2015-11-19 2019-08-30 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
GB201603569D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved differentiation method
GB201610748D0 (en) * 2016-06-20 2016-08-03 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved diffrentation method
US11116799B2 (en) * 2016-07-14 2021-09-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of uniform hepatocytes from human embryonic stem cells by inhibiting TGF-beta and methods of maintaining hepatic cultures
US20200010807A1 (en) * 2016-11-22 2020-01-09 Kyoto University Stepwise method for inducing cholangiocyte progenitors from hepatoblasts
CN110268056A (zh) * 2016-11-23 2019-09-20 Hsj增殖合伙人有限公司 包封的肝组织
AU2018220843B2 (en) 2017-02-14 2023-09-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue
CN108660156A (zh) * 2017-03-16 2018-10-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Cps1报告基因干细胞及其构建方法与应用
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
CN108865969B (zh) * 2017-05-11 2022-04-01 北京大学 Mapk/pkc信号通路激活剂促进人类胆管细胞分化和成熟
US10633907B2 (en) 2017-06-06 2020-04-28 Gto Access Systems, Llc Edge sensor for movable barrier
EP3681520A4 (en) * 2017-09-12 2021-07-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEPATIC DISEASE AND HEPATIC DYSFUNCTION
JP7315150B2 (ja) * 2017-10-12 2023-07-26 国立大学法人東京工業大学 多能性幹細胞から肝細胞への分化誘導方法
CN107904207A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种利用三维培养系统诱导人诱导性多能干细胞获得成熟肝细胞的方法
CN108004201B (zh) * 2017-12-07 2021-06-04 香港大学深圳医院 一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法
WO2020010311A2 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 Active Genomes Expressed Diagnostics, Inc Viral oncogene influences and gene expression patterns as indicators of early tumorigenesis
US11566229B2 (en) 2018-08-31 2023-01-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Expansion and maintenance of adult primary human hepatocytes in culture
CN109337858B (zh) * 2018-09-20 2022-03-15 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN110982776B (zh) * 2018-09-30 2023-07-04 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 肝细胞的体外扩增培养方法及应用
EP3969568A4 (en) * 2018-11-09 2022-09-07 Children's Hospital Medical Center IN VITRO CELL CULTURE SYSTEM FOR THE PRODUCTION OF HEPATOCYTE-LIKE CELLS AND THEIR USES
CN111304147A (zh) * 2018-12-11 2020-06-19 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用
KR102146932B1 (ko) * 2018-12-18 2020-08-21 한양대학교 산학협력단 간 줄기세포의 담관 세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이의 용도
CN111500525B (zh) * 2019-01-30 2023-05-02 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种组合物及其应用
EP3931305A4 (en) * 2019-02-26 2022-11-02 Peking University COMPOSITIONS AND METHODS FOR LONG TERM CULTURE OF HEPATOCYTES
CN111849859B (zh) * 2019-04-04 2023-04-07 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用
JP7556502B2 (ja) 2019-05-09 2024-09-26 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ヘパトサイトの作製方法
WO2020237141A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 The Cleveland Clinic Foundation Generating dorsal foregut, and anterior domain, endoderm cells
CA3142666A1 (en) * 2019-06-04 2020-12-10 University Health Network Methods of making and using liver cells
CN110373380B (zh) * 2019-06-14 2022-01-28 中国科学院生态环境研究中心 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用
KR102275911B1 (ko) 2019-08-27 2021-07-12 (주)유앤아이씨 모바일 앱 가상화 기술과 비콘을 이용한 가변형 매장 관리 시스템
CN111004770B (zh) * 2019-09-25 2022-08-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 功能性肝细胞诱导方法及其专用三维诱导培养基和应用
CN113151147B (zh) * 2020-01-23 2023-07-25 北京大学 功能性肝实质细胞及其制备方法
US20230383261A1 (en) * 2020-10-14 2023-11-30 Sana Biotechnology, Inc. Hepatocyte-like cells
CN115216436A (zh) * 2021-04-16 2022-10-21 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 利用多能干细胞建立具备双向分化潜能的肝干细胞系的方法及其应用
US20230014010A1 (en) 2021-06-23 2023-01-19 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
CN113667603B (zh) * 2021-08-13 2023-12-22 合肥燃音生物科技有限公司 一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用
CN114085805B (zh) * 2021-11-23 2024-05-24 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） 冬眠动物干细胞分化为肝细胞的方法、利用该肝细胞筛选人体外细胞保护的代谢产物的方法
CN114181893B (zh) * 2022-02-09 2022-09-13 天津外泌体科技有限公司 肝脏双表型细胞的成熟方法
CN114149961B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 天九再生医学(天津)科技有限公司 一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用
CN114874973B (zh) * 2022-04-24 2023-03-21 深圳市三启生物技术有限公司 获得成熟肝细胞的培养基及培养方法
CN115011550B (zh) * 2022-07-14 2024-04-26 广东乾晖生物科技有限公司 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法
CN115851578B (zh) * 2022-12-23 2023-11-21 华南理工大学 一种3d悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用
CN118667753A (zh) * 2023-03-17 2024-09-20 上海交通大学 制备成熟卵母细胞的方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010049752A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Katholieke Universiteit Leuven Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte and hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods for using the cells

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0713965A2 (pt) * 2006-06-28 2012-11-27 Univ Kansas diferenciação de tronco de matriz de cordão umbilical em células da linhagem hepatócito
AU2008280143B2 (en) * 2007-07-20 2014-04-17 Cellartis Ab A novel population of hepatocytes derived via definitive endoderm (DE-hep) from human blastocysts stem cells
JP5560270B2 (ja) * 2008-07-08 2014-07-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ結合剤およびアンタゴニストならびにその使用方法
US20100329986A1 (en) * 2009-01-06 2010-12-30 Greenbaum Linda E Adult Hepatic Progenitor Cells and Methods of Use Thereof
EP2443230B1 (en) * 2009-06-18 2017-07-26 Takara Bio Europe AB 3D CULTURING SYSTEMS FOR GROWTH AND DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM (hPS) CELLS
EP2457998A4 (en) * 2009-07-23 2013-08-21 Beijing Huayuanbochuang Technology Co Ltd METHODS FOR OBTAINING HEPATIC CELLS, HEPATIC ENDODERM CELLS, AND HEPATIC PRECURSOR CELLS BY INDUCING THE DIFFERENTIATION
US8481317B2 (en) * 2010-04-13 2013-07-09 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production by forward programming
CN103097517A (zh) * 2010-06-11 2013-05-08 塞拉帝思股份公司 用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架
AU2012272586B2 (en) * 2011-06-23 2016-07-07 The Children's Hospital Of Philadelphia Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells and methods of use thereof
CN105121632B (zh) * 2013-02-18 2021-08-10 大学健康网络 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010049752A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Katholieke Universiteit Leuven Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte and hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods for using the cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biotechnology, vol.145, pp. 284~294(2010)*

Also Published As

Publication number Publication date
CA2901377C (en) 2023-03-21
KR20240024355A (ko) 2024-02-23
JP2019213538A (ja) 2019-12-19
CN105121632A (zh) 2015-12-02
WO2014124527A1 (en) 2014-08-21
EP2956540A1 (en) 2015-12-23
IL284523A (en) 2021-08-31
KR20210018540A (ko) 2021-02-17
SG10201803131TA (en) 2018-06-28
KR20220000930A (ko) 2022-01-04
JP2016517266A (ja) 2016-06-16
AU2014218290A1 (en) 2015-09-03
AU2014218290B2 (en) 2020-03-12
US20160002595A1 (en) 2016-01-07
CN113913366A (zh) 2022-01-11
EP2956540A4 (en) 2016-08-03
IL240616A0 (en) 2015-10-29
JP7208870B2 (ja) 2023-01-19
SG11201506520TA (en) 2015-09-29
IL240616B (en) 2021-07-29
CN105121632B (zh) 2021-08-10
US20200157494A1 (en) 2020-05-21
KR20150119427A (ko) 2015-10-23
KR20230019992A (ko) 2023-02-09
CA2901377A1 (en) 2014-08-21
JP2023052251A (ja) 2023-04-11
ZA201506189B (en) 2019-11-27
HK1218137A1 (zh) 2017-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7208870B2 (ja) 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法
US20200199538A1 (en) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells
AU2021204983B2 (en) Improved culture method for organoids
JP2022050533A (ja) 改善された分化方法
JP5897543B2 (ja) Ｗｎｔシグナル経路の調節による多能性細胞から肝細胞様細胞への分化誘導と成熟
KR102245909B1 (ko) 간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 배양 방법
AU2019390669B2 (en) Hepatocyte expansion methods
CN114144514A (zh) 产生肝细胞的方法
JP2013511974A (ja) ヒト胚性幹細胞の分化のための組成物および方法
US12129490B2 (en) Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells
NZ750694A (en) Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells
NZ750694B2 (en) Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells
Sambathkumar Development of MAPC derived induced endodermal progenitors: Generation of pancreatic beta cells and hepatocytes
Moore Differentiation of human and murine embryonic stem cells: Studies on the combined roles of adhesion molecules and growth factors

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant