CN113151147B - 功能性肝实质细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能性肝实质细胞及其制备方法。本发明将潜能拓展的多能干细胞，即EPS细胞，进行定向分化，从而制备功能性肝实质细胞(或称为肝细胞)。并且，在EPS进行定向分化之前，首先将EPS细胞在iPSCs/ESCs培养基中进行预处理。本发明的制备方法可将人EPS细胞更高效地分化为功能性肝实质细胞，并且由EPS分化获得的功能性肝实质细胞EPS‑Heps在全基因转录水平上更类似于新鲜分离的原代肝细胞。

Description

功能性肝实质细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于干细胞分化技术领域，更具体地，本发明涉及诱导潜能拓展的多能干细胞向功能性肝实质细胞定向分化的新方法。
背景技术
肝脏在人体内代谢过程中起到重要的作用，包括糖原合成、尿素合成、脂肪代谢调控以及药物解毒等。肝脏细胞的损伤包括肝炎、肝癌、肝硬化等会对人体生命安全造成极大的危害。要解决这种问题，就要能在体外获得大量肝脏细胞，利用这些细胞进行移植。
在各种细胞来源中，人多能干细胞(pluripotent stem cell)具有定向分化产生多种功能细胞类型的能力，可用于再生医学，具有巨大的应用前景1。传统的始发态的多能干细胞包括诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)。然而目前仍存在多种因素限制了传统始发态人多能干细胞的应用，包括细胞的异质性，分化的偏向性，增殖缓慢以及单细胞存活率差等2。为了解决这些问题，研究人员主要从两方面进行改进，一方面优化传统人多能干细胞的培养条件3，另一方面研发新的人多能细胞类型，例如原始态多能细胞系。
本发明人于2017年通过化学小分子筛选，开发了一种全新的培养体系，能够建立具有胚内和胚外发育潜能的小鼠和人干细胞系，并将其命名为潜能拓展的多能肝细胞(extended pluripotent stem cell)4，简称为EPS细胞。其具有更高的发育潜能，可以分化胚胎和胚外组织。但是关于上述 EPS细胞，目前还没有任何将其用于定向分化的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种功能性肝实质细胞及其制备方法、
本发明涉及以下多个方面：
1.功能性肝实质细胞的制备方法，其特征在于，将潜能拓展的多能干细胞，即EPS细胞，进行定向分化，从而制备功能性肝实质细胞。
2.根据1所述的制备方法，其特征在于，将EPS细胞在iPSCs/ESCs 培养基(优选TeSRTM2培养基)中进行预处理；
优选地，所述iPSCs/ESCs培养基为商购可得的或现有技术已知的培养基，包括但不限于TeSRTM2，Essential 8Medium(Gibico)，Essential 8 Adaptation Kit(Gibico)，Essential 8Flex Medium Kit(Gibico)，TeSR-E8(STEMCELL Technologies)，mTeSR1(STEMCELL Technologies)，mTeSR Plus(STEMCELL Technologies)；或者，所述iPSCs/ESCs培养基为由 DMEM/F12+20％KSR+NEAA+GLUTAMAX+bFGF配制获得的培养基；最优选地，所述iPS/ESCs培养基为TeSRTM2培养基。
3.根据1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将EPS细胞在iPSCs/ESCs培养基中进行预处理；
S2：将预处理后的EPS细胞在内胚层诱导培养基(优选地，以MCDB 培养基为基础培养基)中培养，获得内胚层细胞，所述内胚层细胞为 FOXA2+/SOX17+的内胚层细胞；
S3：将S2获得的内胚层细胞在前肠后端细胞诱导培养基(优选地，以MCDB培养基为基础培养基)中培养，获得前肠后端细胞；
S4：将S3获得的前肠后端细胞培养，获得肝脏前体细胞；
S5：将S4获得的肝脏前体细胞在肝细胞成熟培养基中培养，获得功能性肝实质细胞。
4.根据3所述的制备方法，其中，步骤S4中具体包括以下步骤：
a.将步骤S3获得的前肠后端细胞在肝脏前体细胞诱导培养基I中进行培养，直至表达AFP蛋白；
b.将步骤S4a获得的细胞进行传代，然后切换到肝脏前体细胞诱导培养基II中进行培养，直至同时表达AFP和ALB蛋白；
c.将步骤S4b获得的细胞切换至肝脏前体细胞扩增培养基中培养，获得肝脏前体细胞EPS-HPLCs。
5.EPS细胞在制备功能性肝实质细胞中的用途。
6.根据1-4中任一项所述的制备方法所获得的功能性肝实质细胞。
7.根据6所述的功能性肝实质细胞在制备人工肝脏、药物代谢研究、药物毒性测试或药物筛选中的应用。
8.一种使EPS细胞分化为功能性肝实质细胞的试剂盒，包括iPSCs/ESCs培养基、内胚层诱导培养基、前肠后端细胞诱导培养基、肝脏前体细胞诱导培养基I、肝脏前体细胞诱导培养基II、肝脏前体细胞扩增培养基和/或肝细胞成熟培养基。
优选地，所述内胚层诱导培养基以MCDB培养基为基础培养基；更优选地，所述培养基为在MCDB培养基中加入1％B27(不含维生素A)、 100ng/mL Activin A、0.25mM 2-磷酸-L-抗坏血酸(pVc)、25ng/mL Wnt3a和0.05μM PI103得到的培养基；或者，所述培养基为在MCDB培养基中加入1％B27(不含维生素A)、100ng/mL Activin A、0.25mM 2-磷酸-L-抗坏血酸(pVc)得到的培养基。
优选地，所述前肠后端细胞诱导培养基以MCDB培养基为基础培养基；更优选地，所述培养基为在MCDB培养基中加入1％B27(不含维生素A)、50ng/mL KGF、0.25mM pVc和10μMSB431542得到的培养基。
优选地，所述肝脏前体细胞诱导培养基I以DMEM培养基为基础培养基；更优选地，所述培养基为在DMEM培养基中加入1％B27(不含维生素A)、20ng/mL KGF、10ng/mL bFGF、20ng/mL BMP2和50ng/mL BMP4得到的培养基。
优选地，所述肝脏前体细胞扩增培养基包括以下成分：49％William's E培养基、49％DMEM/F12、2％B27、0.25mM pVc、5μM SB431542、3 μM CHIR99021、0.5μMsphingosine-1-phosphate(S1P)、5μM溶血磷脂酸 (LPA)、40ng/mL EGF和10mM尼克酰胺。
优选地，所述肝细胞成熟培养基以William's E培养基为基础培养基；更优选地，所述培养基为在William's E培养基中加入2％B27、1％ GlutaMAX、10μM SB431542和50μMForskolin而获得的培养基。
在所述方法中，所述EPS细胞在iPSCs/ESCs培养基(优选TeSRTM2 培养基)中预处理1-4天，优选为2天；步骤S2中，预处理后的EPS细胞在内胚层诱导培养基中培养2-6天，优选4天，直至产生FOXA2+/SOX17+的内胚层细胞；步骤S3中，获得的内胚层细胞在前肠后端细胞诱导培养基中培养1-5天，优选3天；步骤S4a中，将S3获得的细胞在肝脏前体细胞诱导培养基I中培养2-6天，优选4天，直至产生AFP+细胞；步骤 S4b中，将步骤S4a获得的细胞进行传代后在肝脏前体细胞诱导培养基II 中培养4-14天，优选8天，直至产生AFP+/ALB+细胞；步骤S4c中，将步骤S4b获得的细胞切换至肝脏前体细胞扩增培养基中培养10天以上，使得ALB+/AFP+细胞比例为50-70％。
在所述方法中，细胞传代的方法为将细胞用Accutase消化液(美国 Millipore公司)进行消化，按照1:3的比例传代。
包含上述内胚层诱导培养基、前肠后端细胞诱导培养基、肝脏前体细胞诱导培养基I、肝脏前体细胞诱导培养基II、肝脏前体细胞扩增培养基的用于由EPS细胞制备功能性肝实质细胞的培养基也属于本发明的保护范围。
本发明的技术效果
本发明从优化多能肝细胞类型和优化培养条件两个方面进行了改进，取得了如下技术效果：
(1)本发明首次使用EPS细胞作为定向分化的细胞来源，从而进行功能性肝实质细胞的制备。与传统的始发态多能干细胞相比，EPS细胞具有体内单细胞嵌合能力强、单细胞存活率高及高增殖率等优势；并且与传统始发态的人多能干细胞分化的肝细胞相比，由EPS分化获得的功能性肝实质细胞EPS-Heps在全基因转录水平上更类似于新鲜分离的原代肝细胞。
(2)本发明人发现在诱导肝细胞分化之前添加一个预处理步骤，即先将EPS细胞诱导至早期胚胎着床后的上胚层细胞的状态，然后再进行常规的诱导分化方案，可以将人EPS细胞更高效地分化为功能性肝实质细胞 (EPS-Heps)。
定义
在本发明中，所述EPS细胞为潜能拓展的多潜能干细胞，①具有发育成胚内组织和胚外组织双重能力的，②具有类似于原始态(Naive)多潜能干细胞的属性，③具有囊胚嵌合能力，④可以产生畸胎瘤，⑤无分化偏向性，⑥具有单细胞形成克隆的能力，⑦X染色体均为激活形式。具有上述属性中至少一项的即为EPS细胞。其中，EPS细胞的制备方法参见例如CN108884436(或PCT/CN2015/086854)，其通过引用整体并入本文。
实验材料和操作方法
1.原代肝的分离
将肝组织分离，首先使用PBE Buffer(9g/L NaCl,0.42g/L KCl,2.1g/L NaHCO3,0.9g/L glucose,4.78g/L HEPES and 0.37g/L EDTA in sterilized water)灌流0.5-2小时，再使用PBCD Buffer(9g/L NaCl,0.42g/L KCl,2.1 g/L NaHCO3,0.9g/L glucose,4.78g/L HEPES,0.25g/L collagenase and 0.25g/L dispase in sterilized water)灌流，直至组织变得松散后，使用镊子分离肝脏组织。
2.人胎肝细胞的分离
在获得患者知情同意的情况下，从流产组织中获得人胎儿肝组织。切碎胎儿肝组织，并在1mg/ml胶原酶IV(Thermo Fisher Scientific公司) 中于37℃孵育20分钟。将组织碎片和细胞铺在基质胶包被的培养皿上使用人胎肝细胞培养基中，每天更换一次培养基。人胎肝细胞培养基包括50％ DMEM/F12,50％William's E培养基加入1％penicillin-streptomycin(P/S),2％ B27(without VA),5mM Nicotinamide,200μM 2-phospho-L-ascorbic acid(pVc),3μM CHIR99021,5μM SB431542,0.5μM sphingosine-1-phosphate(S1P),5μM lysophosphatidic acid(LPA),50ng/ml EGF and 20μM Forskolin。肝前体细胞从胎儿肝组织中迁出，用Accutase(Millipore公司)消化细胞和组织碎片。将组织碎片用筛子丢弃。收集人胎肝细胞用于进一步实验。
3.HepG2细胞的培养
将肝癌细胞系HepG2在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)， 1％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司)，1％P/S和1％MEM NEAA (Thermo FisherScientific公司)的DEME培养基(Thermo Fisher Scientific公司)中培养，并以2.5％的胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific公司)以 1:3的比例进行传代。
4.胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞的培养及传代
人胚胎干细胞系H1可商购，例如获自WiCell研究所。iPSCs细胞(也称为iPS细胞)使用iPSC重编程试剂盒(Invitrogen公司)自主建立。
将iPS细胞和H1胚胎干细胞在铺有Matrigel的基质的培养皿上，使用TeSRTM2培养基(STEMCELL Technologies公司)进行培养，并使用 50mM EDTA(Thermo FisherScientific公司)以1:6至1:8的比例传代。
5.EPS的培养及传代
按照专利CN108884436A的公开方法制备EPS细胞。将所制备的EPS 细胞培养在Feeder上，密度为3×104细胞每平方厘米。培养基的成份为 48.25％的DMEM/F12,48.25％的Neurobasal培养基,0.5％N2添加剂,1％ B27添加剂,1％GlutaMAX(Thermo FisherScientific公司),1％MEM NEAA(Thermo Fisher Scientific公司),1％双抗(ThermoFisher Scientific公司),10ng/mL重组的人的Lif(Peprotech公司),1μM CHIR99021,2μM(S)-(+)-dimethindene maleate(Tocris公司)和2μM Minocycline hydrochloride(SantaCruz Biotechnology公司)。每天换液。EPS细胞使用 0.05％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher Scientific公司)以1:3至1:10的比例传代EPS细胞。
其中，本文中所用的EPS细胞系是EPS1和EPS2细胞系。其中，EPS1 和EPS2是使用胚胎建系的方法建立的人EPS细胞系，具体方法参见参考文献4。
6.RT-qPCR分析
使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司)分离总RNA。使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech公司) 将RNA(500ng)反转录为cDNA。 Universal qPCR Mix (KAPA Biosystems公司)用于RT-qPCR分析，该分析在BIO-RAD CFX384TM实时系统上进行。将所有相对表达水平相对于管家基因RRN18S标准化。
7.白蛋白ELISA，尿素测定，胆汁酸分泌，PAS染色和ICG测定。
使用人白蛋白ELISA定量试剂盒(Bethyl Laboratory公司)测量细胞上清液或小鼠血清中的人白蛋白。使用QuantiChrom尿素含量测定试剂盒 (BioAssay Systems公司)和胆汁酸含量测定试剂盒(Sigma-Aldrich公司) 测量细胞上清液中的尿素和胆汁酸。收集细胞上清液样品并储存在-20℃。为了评估糖原在EPS-Heps上的存储，使用PAS染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司)进行了高碘酸-希夫(PAS)染色。EPS-Heps用4％多聚甲醛(DingGuo公司)固定，并根据说明书步骤进行染色。为了测试EPS-Heps是否可以摄取吲哚菁绿(ICG)，将EPS-Heps在HMM培养基稀释的1mg/ml ICG 中培养1小时。立即或在6小时后ICG排出时捕获图像。
8.免疫荧光染色
免疫荧光染色的操作为将细胞用4％多聚甲醛(DingGuo公司)固定 15分钟，然后用PBST(0.25％Triton X-100和5％正常驴血清的PBS)封闭。然后，将细胞与一抗在4℃孵育过夜，然后在室温下与适当的二抗孵育1小时。Hoeschst(Roche公司)用于指示核。
具体抗体信息如表1所示。其中，一抗分别为人FOXA2抗体、人SOX17 抗体、人白蛋白抗体(Albumin,ALB)、人α-胎甲球蛋白抗体 (Alpha-1-Fetoprotein,AFP)、人CYP3A4抗体、人CYP2C9抗体、人CYP2C19 抗体、人CYP2D6抗体、人CK8抗体、人HNF4A抗体、人CEBPA抗体、人HNF6A、人DLK1。二抗分别为Donkey Anti-Mouse IgG 488、Donkey Anti-Mouse IgG555、Donkey Anti-Mouse IgG 647、Donkey Anti-Goat IgG 488、Donkey Anti-Goat IgG555、Donkey Anti-Goat IgG 647、Donkey Anti-Rabbit IgG 488、Donkey Anti-RabbitIgG 555、Donkey Anti-Rabbit IgG 647。
表1抗体信息表
9.流式细胞术
对于流式细胞术分析，将细胞用Accutase释放到单细胞悬液中，并在 4℃下用固定/通透溶液(BD公司)固定20分钟。然后将细胞与在1X BD Perm/Wash缓冲液中稀释的一抗在4℃孵育2小时，然后在4℃与对应的二抗孵育1小时。最后，将细胞重悬于BD Perm/Wash缓冲液中，并在 CytoFLEX(贝克曼库尔特公司)流式细胞仪系统上进行分析。用CytExpert 软件分析数据。流式细胞仪分析中使用的抗体与免疫荧光染色中使用的抗体相同。抗体信息同上表1。
10.RNA测序(RNA Sequencing)
使用FastQC软件评估Raw RNA sequencing的数据。Raw fastq文件使用Trimmomatic软件根据以下参数处理。 ILLUMINACLIP:/path/to/adapters/TruSeq3-PE-2.fa:2:30:7:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 HEADCROP:10MINLEN:36.处理后的数据使用STAR软件，对比人的参考基因组hg19，参数选择为默认。所有样本的基因计数矩阵都是使用R package Rsubread 的featureCounts函数生成的。最后，使用Rpackage DESeq2对基因计数矩阵进行归一化和方差稳定化转化。差异表达的基因也使用DESeq2确定。
为了将本发明的整体转录组数据与单细胞RNA测序数据(GSE109555) 进行比较，本发明使用R Package Seurat重新分析了公开数据，并通过平均所有细胞的基因表达水平来模拟了整体细胞的RNA测序数据。
本发明使用R函数hclust进行了分层聚类。将两个样本之间的距离定义为一个减去基因载体z-score之间的Pearson correlation。上面的样本距离定义还用于绘制Rpackage pheatmap。
将我们的数据和一些公共RNA测序数据(GSE103078和GSE98710) 进行了CellNet分析。用R包CellNet分析RNA测序数据。遵循官方的 CellNet分析所有测序数据并可视化结果。
11.所使用的动物及移植实验
在BALB/c背景下的Tet-uPA/Rag2–/–/γc–/–(URG)小鼠购自北京生命星生物技术有限公司。移植过程为将细胞用Accutase消化为单个细胞，并以107细胞/ml的终浓度悬浮在HCMTM培养基(Lonza公司)中。将200μl 悬浮液注入URG小鼠脾脏。注射后八周，处死小鼠进行免疫荧光染色。用4％多聚甲醛固定小鼠的肝脏，并用30％蔗糖溶液脱水。然后，将肝组织包埋在OCT化合物(Sakura公司)中，并在液氮中冷冻。使用低温恒温器(Leica公司)进行冷冻切片以进行免疫荧光染色。使用6个随机冰冻切片，用Vectra Polris(PerkinElmer公司)评估人ALB阳性细胞的再增殖率。
小鼠模型实验已获得北京大学动物保护与使用委员会的批准，并根据 NIH指南进行。
12.CYP3A4和CYP1A2活性的测定
将EPS-Heps、HepG2细胞和新鲜分离的原代人肝细胞消化成单细胞并悬浮，以测量其CYP3A4和CYP1A2活性。一个500μL反应分别包含 2.5×105个细胞和200μM睾丸激素(testosterone)(Sigma-Aldrich公司)或 200μM非那西汀(phenacetin)(Sigma-Aldrich公司)作为CYP3A4或 CYP1A2的底物。使用没有细胞的反应以及没有睾丸激素或非那西汀的反应以排除反应背景。在37℃下温育15分钟后，用含同位素标记的内参代谢物的1.5mL甲醇停止反应，CYP3A4的内参代谢物为6β-羟基睾丸激素-[D7]，CYP1A2内参代谢物为乙酰苯酚-[13C2，15N]。进一步使用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC/MS/MS)分析。用于UPLC/MS/MS分析的CYP3A4和CYP1A2反应的药物代谢产物分别为6β-羟基睾丸激素和对乙酰氨基酚。
附图说明
图1显示了潜能拓展的多能干细胞分化产生功能性肝实质细胞
(a)为EPS细胞体外分化为肝细胞的分化方案。(b)使用分层聚类的方法对以下细胞的全基因表达谱进行分析：发育不同天数的上胚层细胞 (Epiblast，EPI)，iPSC，H1胚胎干细胞和预处理后的EPS细胞(EPS-S1-1 和EPS-S1-2)。(c)RT-qPCR分析肝细胞特征基因和转录因子在EPS细胞 (n＝3)，HepG2细胞(n＝3)，成熟5周的EPS-Heps(n＝3)和F-PHHs(n ＝5)的表达情况。基因表达以F-PHHs和管家基因18s进行标准化。(d) 在EPS-Heps中，对ALB与主要肝功能标志物和转录因子进行免疫荧光共染色。(e)ELISA分析在EPS细胞，HepG2细胞，成熟4周EPS-Heps细胞以及PHH细胞中ALB分泌量。PHH为体外使用夹心法培养5天的细胞。n＝3。(f)检测EPS细胞，HepG2细胞，成熟4周EPS-Heps和PHH中的尿素合成能力。PHH为体外使用夹心法培养5天的细胞。n＝3。(g)通过液相色谱和质谱联用检测CYP3A4和CYP1A2的代谢产物6β-羟基睾丸激素和对乙酰氨基酚的活性，来评估HepG2细胞，EPS-Heps和F-PHHs 细胞的药物代谢能力。n＝3。(h)免疫荧光检测移植EPS-Heps细胞8周的 URG小鼠的基因表达情况。将CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19，CYP1A2 和CK8与人ALB蛋白进行免疫荧光共染色。(i)分层聚类分析EPS细胞， F-PHHs和EPS-Heps基因的全基因转录谱。(j)使用CellNet对RNA测序数据进行肝属性特异性调控网络打分。包括EPS-Heps，F-PHHs，EPS细胞，重编程的肝细胞(hiHeps)和已报道的其他研究产生的肝细胞 (GSE103078和GSE98710)。
数据展示为平均值±SEM。对于所有测量，“n”代表生物重复的数量。比例尺代表50μM。
图2显示了体外诱导EPS细胞产生功能性肝实质细胞
(a)流式细胞术检测未经过S1预处理产生的AFP+/ALB+肝前体细胞。 (b)RT-qPCR检测上胚层特征基因在EPS细胞、EPS-S1细胞、iPSC和胚胎干细胞H1中的表达情况。n＝3。(c)流式细胞术检测S2末期 FOXA2+/SOX17+内胚层细胞的比例。(d)流式细胞术检测，TeSRTM2预处理后对接已报道的分化方案，产生的AFP+/ALB+肝前体细胞比例。(e)流式细胞术检测S4阶段AFP+/ALB+肝前体细胞比例。(f)RT-qPCR检测肝前体细胞特征基因在EPS细胞、EPS分化的肝前体细胞(EPS-HPLC)和人胎儿肝细胞(hFLC)中的表达情况。基因表达以hFLC和管家基因进行标准化。n＝3。(g)在EPS-HPLCs中ALB和AFP的免疫荧光共染色。(h) EPS细胞，hFLC和EPS-HPLC的全基因表达谱的分层聚类分析。(i) EPS-Heps的形态图。
图3显示了EPS分化的功能性肝实质细胞EPS-Heps的性质
(a)RT-qPCR分析EPS细胞(n＝3)、EPS-Heps(n＝3)和F-PHHs (n＝3)中人肝功能基因的表达情况。基因表达以F-PHHs和管家基因进行标准化。(b)RT-qPCR分析EPS-Heps(n＝3)，HepG2(n＝3)PHHs(n ＝2)在PXR配体(50μM利福平)处理3天后，CYP3A4表达的倍数变化。(c)EPS-Heps在肝成熟培养基HMM中，第0天到第36天的ALB分泌量的动态分析。n＝3。(d)在EPS细胞、EPS-Heps和PHH中的胆酸分泌能力。n＝3。(e)EPS-Heps对ICG的摄取(左)和释放(右)。比例尺代表100μm。(f)EPS-Heps的PAS染色。比例尺代表50μm。(g)移植8 周后EPS-Heps(n＝4)和PHHs(n＝5)后URG小鼠血清中人ALB的分泌量。(h)移植URG小鼠8周后，使用人ALB免疫染色确定EPS-Heps 在URG小鼠肝脏的嵌合率。每只小鼠n＝6。数据表示为平均值±SEM。 (i)2种不同的EPS细胞系来源的4个不同批次产生的EPS-Heps细胞与 F-PHHs和EPS细胞使用CellNet对全基因转录组测序数据进行了肝特征转录因子GRN分析。(j)使用CellNet对EPS-Heps、F-PHHs，EPS细胞，谱系重编程的hiHeps以及其他研究产生肝细胞(GSE103078和GSE98710) RNA测序数据进行细胞特性热图分析。数据表示为平均值±SEM。对于所有测量，“n”代表生物重复的数量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施例1功能性肝实质细胞的制备
我们首先尝试使用EPS细胞不经过预处理步骤，直接进行向肝细胞分化的方案6(即仅进行S2-S5步骤)，结果发现仅能产生少量的ALB+/AFP+肝脏前体细胞(图2a)。
本发明人经过大量的研究和试验之后发现，由于EPS细胞具有原始态多潜能干细胞的特征，类似于人胚胎发育着床前上胚层(Epiblast) 的状态4。着床前上胚层的细胞不能直接响应三胚层发育诱导信号，着床后的上胚层细胞才具有发育成胚胎各个谱系细胞的能力7。因此，我们尝试先将EPS细胞进行预处理，将其诱导至早期胚胎着床后的上胚层细胞的状态，再进一步对接优化的分化方案，具体方案参照图1a。
具体地，由EPS细胞制备功能性肝实质细胞可分为以下步骤(S1-S5 阶段)。
第一阶段S1，将EPS细胞在TeSRTM2培养基中进行预处理。具体如下：
将EPS细胞使用0.05％胰酶(Thermo Fisher Scientific公司)37℃消化 3分钟。弃胰酶，使用含有10％FBS的DMEM培养基将细胞吹散成为单细胞。离心1200rpm，3分钟，弃上清。
将细胞重悬接种于TeSRTM2培养基中进行预处理2天，每天换液，其中细胞接种密度为5×104细胞每平方厘米。
其中，TeSRTM2培养基购自Stem Cell technologies公司，是培养ESCs 和iPSCs常用的培养基，主要成分包含重组的人的bFGF细胞因子和重组人的TGFβ细胞因子等。
第二阶段S2，EPS细胞分化为内胚层细胞(definitive endoderm)，直至产生FOXA2+/SOX17+的内胚层细胞。具体如下：
弃昨日的培养基，PBS洗涤三遍，换上内胚层诱导培养基进行培养4 天。
第一天的内胚层诱导培养基为MCDB培养基中加入1％B27(不含维生素A)(ThermoFisher Scientific公司)、100ng/mL Activin A(Stemimmune LLC公司)、0.25mM 2-磷酸-L-抗坏血酸(pVc)(Sigma-Aldrich公司)、25ng/mL Wnt3a(Stemimmune LLC公司)和0.05μMPI103(Selleck公司) 得到的培养基。
第二天至第四天的内胚层诱导培养基为MCDB培养基中加入1％B27 (不含维生素A)(Thermo Fisher Scientific公司)、100ng/mL Activin A (Stemimmune LLC公司)、0.25mM 2-磷酸-L-抗坏血酸(pVc)(Sigma-Aldrich公司)。
第三阶段S3，内胚层细胞分化为前肠后端细胞。具体如下：
弃昨日的培养基，PBS洗涤三遍，换上前肠后端细胞诱导培养基，培养3天，每天换液。
其中，前肠后端细胞诱导培养基为在MCDB培养基中加入1％B27(不含维生素A)(Thermo Fisher Scientific公司)、50ng/mL KGF(Stemimmune LLC公司)、0.25mM pVc(Sigma-Aldrich公司)和10μM SB431542(Selleck公司)得到的培养基。
第四阶段S4，前肠后端细胞分化产生肝脏前体细胞EPS-HPLCs。具体如下：
a.弃昨日的培养基，PBS洗涤三遍，将S3阶段获得的细胞切换到肝脏前体细胞诱导培养基I中，培养4天，每天换液；使用流式细胞术检测 AFP+细胞产生即可。
其中，肝脏前体细胞诱导培养基I为含有1％B27(不含维生素A)、20 ng/mL KGF(Stemimmune LLC公司)、10ng/mL bFGF(Peprotech公司)、20ng/mL BMP2(Stemimmune LLC公司)和50ng/mL BMP4(Stemimmune LLC公司)的DMEM培养基；
b.将步骤S4a获得的细胞用Accutase消化液(美国Millipore公司) 进行消化，按照1:2-1:4的比例传代，然后切换到肝脏前体细胞诱导培养基II中，培养8天，每天换液；流式细胞术检测到AFP+/ALB+细胞的产生即可。
其中，肝脏前体细胞诱导培养基II为含有Modified William's E培养基 (维通达公司)；
c.将步骤S4b获得的细胞切换至肝脏前体细胞扩增培养基中，培养至少10天，每天换液，胞长满则传代，传代比例1:2，获得肝脏前体细胞 EPS-HPLCs。其中，流式细胞术检测ALB+/AFP+细胞比例为50-70％(图 2e)。Q-PCR检测TTR、DLK1、AFP、ALB、HNF1B、HHEX、FOXA2、HNF4A均表达。
其中，肝脏前体细胞扩增培养基为49％William's E培养基、49％ DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific公司)、2％B27(Thermo Fisher Scientific公司)、0.25mMpVc(Sigma-Aldrich公司)、5μM SB431542 (Selleck公司)、3μM CHIR99021(Selleck公司)、0.5μM鞘氨醇-1-磷酸(S1P)(Sigma-Aldrich公司)、5μM溶血磷脂酸(LPA)、40ng/mL EGF(Peprotech公司)和10mM尼克酰胺(Sigma-Aldrich公司)。
第五阶段S5，肝脏前体细胞EPS-HPLCs进一步分化为成熟的功能性肝实质细胞EPS-Heps。具体如下：
弃昨日的培养基，PBS洗涤三遍，换上肝细胞成熟培养基(Hepatocyte MaturationMedium,HMM)，培养14天，每天换液；
其中，肝细胞成熟培养基HMM为在William's E培养基中加入2％B27、 1％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、10μM SB431542(Selleck 公司)和50μMForskolin(Tocris公司)而获得的培养基。
其中，本实施例中鉴定细胞所使用的引物序列如下表所示：
表2
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实施例2功能性肝实质细胞分化过程中分化效率及各细胞性质的鉴定
本发明人对分化过程中产生的细胞进行了具体分析：
首先，我们发现使用TeSRTM2培养基(始发态干细胞培养基)对EPS 细胞进行预处理，可以诱导EPS细胞变为早期胚胎着床后上胚层细胞状态，这阶段为第一阶段(S1)，将S1阶段获得的细胞命名为EPS-S1细胞。
为了进一步研究EPS-S1细胞的状态，本发明使用RNA测序 (RNA-Sequencing)的方法，对EPS-S1细胞、诱导多潜能干细胞(iPSCs) 和胚胎干细胞(ESCs)进行了全基因转录组分析比较，并使用人不同发育阶段的人上胚层细胞作为对照。结果发现，EPS-S1细胞与发育第6天到第8天的上胚层细胞相似，而iPSCs/ESCs则与发育第10天到第12天的上皮细胞具有相似的转录谱8(图1b)。
进一步使用RT-qPCR的方法测试不同发育时间段上胚层细胞特征基因在EPS-S1细胞与iPSCs/ESCs中的表达情况。我们发现第6天到第8天上胚层特征基因SOX9，MSX2，PTN和TKTL1在EPS-S1细胞中也高表达，而在iPSCs/ESCs中低表达。此外，第10天到第12天上胚层细胞特征基因GALNT3，PCSK9和CSRP1在iPSCs/ESCs中高表达，但在EPS细胞或 EPS-S1细胞中却没有表达(图2b)。
以上这些结果表明，经过第一阶段的诱导，EPS细胞被成功转化为类似于早期着床后上胚层细胞的状态，并且与传统的iPSCs/ESCs状态不同。
在第二阶段，在TeSRTM2预处理后，本研究使用ActivinA/Nodal，WNT 和PI3K/AKT的信号通调节因子处理，产生了大约80％FOXA2+/SOX17+的胚内内胚层细胞(DefinitiveEndoderm)(图2c)。
在第三阶段和第四阶段，进一步诱导肝脏命运的特化，首先直接使用了现有技术已报道的iPSCs/ESCs的分化方案，获得约有13％的ALB+/AFP+肝脏前体细胞6(图2d)。为了提高前肠后端细胞向肝脏前体细胞分化的效率，我们重点优化了第4阶段的分化方案，增加了S4b或S4c扩增步骤。使用流式细胞术(FACS)分析，经过优化后产生了约70％的ALB+/AFP+肝脏前体细胞(图2e)。
进一步使用RT-qPCR的方法确认了肝脏前体细胞特征基因在EPS分化的肝脏前体细胞(EPS-HPLCs)中的表达情况(图2f)。此外，也使用了免疫荧光染色的方法验证了EPS-HPLCs中AFP和ALB的蛋白表达(图 2g)。更为重要的是，从全基因转录谱的水平上分析，EPS-HPLCs与人胎肝细胞(hFLCs)具有相似的转录谱，并且明显区别于EPS细胞的转录谱(图2h)。总而言之，这些数据表明在体外诱导EPS细胞高效的产生肝脏前体细胞。
在第五阶段，本发明使用cAMP通路激活剂和TGFβ通路的抑制剂，即用于促进肝细胞成熟并维持肝细胞功能的肝细胞成熟培养基 (Hepatocyte Maturation Medium，HMM)9，诱导EPS-HPLCs成熟，产生功能性EPS分化的肝细胞(即，EPS-Heps)。
在HMM中成熟2周后，EPS-Heps呈现出类似于人原代肝细胞的多边形形态(图2i)，这表明获得的EPS-Heps具有成熟肝细胞的特征。
实施例3 EPS分化的功能性肝实质细胞的性质和功能
本发明人对在S5阶段中在HMM培养基中成熟培养4-5周的 EPS-Heps进行分子水平检测和功能测试。
首先，RT-qPCR数据显示EPS-Heps中表达了多种肝细胞特征转录因子和功能基因，如HNF4A，PXR，CYP3A4，UGT2B7和NTCP等，且这些基因的表达水平与新鲜分离的原代人肝细胞F-PHH相当(图1c和图3a)。免疫荧光染色方法也证实EPS-Heps表达CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19， CYP3A4，CEPBA和HNF4A等蛋白(图1d)。此外，使用高效液相色谱与质谱联用(UPLC/MS/MS)检测EPS-Heps的CYP3A4和CYP1A2的活性，结果表明CYP3A4和CYP1A2酶活性水平与原代人肝细胞F-PHH相当(图1g)。进一步检测EPS-Heps响应于CYP450酶诱导剂的能力。结果表明使用PXR激动剂(利福平)处理EPS-Heps，可诱导CYP3A4的表达 (图3b)。此外，发现诱导成熟4周内，EPS-Heps分泌的白蛋白(Albumin， ALB)从4μg/天/百万细胞逐渐增加到35μg/天/百万细胞(图3c)。成熟第四周检测EPS-Heps的ALB分泌水平、尿素合成水平和胆汁酸分泌水平均与人原代成体肝细胞相当(图1e，1f和图3d)。我们还观察到EPS-Heps 可以摄取吲哚菁绿(ICG)，且经过6小时后可以将其排出(图3e)。此外，使用高碘酸-希夫(PeriodicAcid-Schiff,PAS)染色方法，观察到了EPS-Heps 具有糖原合成能力(图3f)。以上数据表明EPS-Heps具有与成体肝细胞类似的功能。
本发明还探究了EPS-Heps在肝衰小鼠模型的体内重建能力。我们将 EPS-Heps移植到Tet-uPA(尿激酶型纤溶酶原激活物)/Rag2-/-/γc-/-(URG) 肝损伤模型小鼠(北京生命星生物技术有限公司)中。通过免疫荧光染色分析移植后的小鼠组织切片，结果在小鼠肝脏成功观察到人白蛋白ALB 阳性细胞，并且发现ALB阳性的细胞也与人CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2 和CYP2C19蛋白共表达(图1h)。这表明移植后的EPS-Heps仍表达肝细胞重要的功能蛋白CYP450酶。
本发明也在移植EPS-Heps的URG小鼠血清检测到人白蛋白的分泌 (图3g)。此外，进一步检测了URG小鼠肝脏中EPS-Heps的嵌合率，约为2％(图3h)。这些数据表明，EPS-Heps可以成功的在功能受损的小鼠肝脏中重建，并维持成熟肝细胞的功能性特征。
最后，使用RNA-Sequencing的方法对EPS-Heps在全基因转录组水平上进行分析。使用F-PHHs、肝癌细胞系HepG2细胞和起始的EPS细胞作为对照。分层聚类(HierarchicalClustering)结果显示EPS-Heps与F-PHHs 聚在一起，且不同于HepG2细胞和EPS细胞(图1i)。为了进一步研究 EPS-Heps的肝细胞属性，我们使用CellNet对RNA-Sequencing的数据进行分析10。CellNet是一种可以评估了体外获得细胞与体内组织的对应细胞的差别的方法10。使用CellNet对肝细胞基因调控网络(GRN)状态进行评分和热图显示，发现EPS-Heps与F-PHH十分相似(图1j和图3j)。此外，我们对来源于2个不同的EPS细胞系的另外3个不同批次的EPS-Heps 进行分析，结果保持一致(图3i)。
我们注意到有极弱的肠属性的表达，发现这是由于EPS-Heps表达肠相关转录因子KLF5导致的，这有待于我们进一步优化。接下来我们使用 CellNet将EPS-Heps与谱系重编程获得的肝细胞(hiHeps)以及已报道 iPSCs分化的肝细胞(GSE103078和GSE98710)进行对比，结果表明， EPS-Heps更类似于F-PHH(图1j和图3j)。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (4)

1.功能性肝实质细胞的制备方法，其特征在于，将潜能拓展的多能干细胞，即EPS细胞，进行定向分化，从而制备功能性肝实质细胞；
其包括以下步骤：
S1：将EPS细胞在TeSRTM2培养基中进行预处理，将其诱导至早期胚胎着床后的上胚层细胞的状态；
S2：将预处理后的EPS细胞在内胚层诱导培养基中培养，获得内胚层细胞，所述内胚层细胞为FOXA2+/SOX17+的内胚层细胞；
S3：将S2获得的内胚层细胞在前肠后端细胞诱导培养基中培养，获得前肠后端细胞；
S4：将S3获得的前肠后端细胞培养，获得肝脏前体细胞，其包括以下步骤；
a.将步骤S3获得的前肠后端细胞在肝脏前体细胞诱导培养基I中进行培养，直至表达AFP蛋白；
b.将步骤S4a获得的细胞进行传代，然后切换到肝脏前体细胞诱导培养基II中进行培养，直至同时表达AFP和ALB蛋白；
c.将步骤S4b获得的细胞切换至肝脏前体细胞扩增培养基中培养，获得肝脏前体细胞EPS-HPLCs；
S5：将S4获得的肝脏前体细胞在肝细胞成熟培养基中培养，获得功能性肝实质细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述前肠后端细胞诱导培养基以MCDB培养基为基础培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述内胚层诱导培养基以MCDB培养基为基础培养基。
4.用于EPS细胞预处理的TeSRTM2培养基、内胚层诱导培养基、前肠后端细胞诱导培养基、肝脏前体细胞诱导培养基I、肝脏前体细胞诱导培养基II、肝脏前体细胞扩增培养基和肝细胞成熟培养基在制备用于使EPS细胞分化为功能性肝实质细胞的试剂盒中的用途。
CN202110082099.4A 2020-01-23 2021-01-21 功能性肝实质细胞及其制备方法 Active CN113151147B (zh)

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