CN114181893B - 肝脏双表型细胞的成熟方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肝脏双表型细胞的成熟方法，以人多能干细胞体外诱导分化产生的肝脏双表型细胞构成的3D类器官为起点，以“3D‑2D‑3D”的培养顺序，并配合不同阶段对应的促成熟组合物，共同实现了双表型细胞的体外成熟。并且，消化为单细胞的3D类器官和2D肝前体细胞可批量冻存，经复苏后可进一步成熟，可实现产业化。

Description

肝脏双表型细胞的成熟方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种肝脏双表型细胞的成熟方法。
背景技术
肝脏是人体内再生能力最强的器官之一。对于机械损伤，主要由肝细胞通过自身的复制达到组织修复的目的；而对于酒精性肝损、药物诱导性肝损等生活中更为常见的慢性肝损伤，肝细胞无法对修复做出贡献，肝的再生须依靠肝内胆管上皮细胞实现。近几年的一系列研究证据表明，在慢性肝损状态下，肝内胆管上皮细胞会分化为一种中间态的细胞，其关键特征为：既表达肝祖细胞的标志物，又表达成熟肝细胞的标志物，故被称为肝脏双表型细胞。这种细胞会进一步增殖并分化为肝细胞，进而实现损伤修复。因此，肝脏双表型细胞在慢性损伤修复方面具备重要的应用价值。但至今未见有方法可于体外实现肝脏双表型细胞的成熟。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种肝脏双表型细胞的成熟方法，
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种肝脏双表型细胞的成熟方法，该方法包括如下步骤：
S1、将双表型肝细胞构成的3D肝类器官消化为单细胞后将其接种在培养基A中培养得到2D肝前体细胞；
S2、将2D肝前体细胞消化为单细胞后再依次接种在培养基A和培养基B中培养得到3D成熟肝类器官；
其中，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：FH1、FPH1、MK4、OSM和MK125。
进一步，S1的具体步骤为：使用消化酶将类器官消化形成单细胞后，将双表型肝细胞接种于铺有1:50 Matrigel的细胞培养板，连续培养3天，至汇合度达80-90%左右，期间每天更换培养基。
进一步，S2的具体步骤为：
S21、将消化后的单细胞以含30% Matrigel的培养基A重悬单细胞，并接种于超低吸附培养板，连续培养3天，期间不换液；
S22、将培养基更换为含10% Matrigel的培养基B继续培养7天，期间每3天换液1次。
进一步，培养基A的添加组分中，cAMP激活剂为8-Br-cAMP，用量为0.01-1mM；SIRT1抑制剂为NIC，用量为1-10mM；TGFβ抑制剂为A83-01，用量为0.1-10μM；WNT激活剂包括2种，即100-1000ng/ml的rhRSPO1和25-500ng/ml的rhWnt3a；rhFGF10为50-500 ng/ml，rhEGF为50-500 ng/ml。
优选地，培养基A中添加组分为：1mM 8-Br-cAMP、10mM NIC、0.5μM A83-01、1μg/mlrhRSPO1、50 ng/ml rhFGF10、50 ng/ml rhEGF、100ng/ml rhWnt3a。
进一步，培养基A的基础培养基包括0.5% ITS、2% B27、50% William’s E、47.5%Ad-F12。
进一步，培养基B中添加组分为：1-20μM FH1、1-20μM FPH1、2-50μM MK4、5-100ng/ml OSM、0.05-1μM MK125。
优选地，培养基B中添加组分为：20μM FH1、20μM FPH1、10μM MK4、20ng/ml OSM、0.5μM MK125。
进一步，培养基B的基础培养基包括2%KSR、50% HepatoZYME、48% HCM。
进一步，步骤S1得到的2D肝前体细胞消化后的单细胞可冻存使用。
本发明还提供了一种用于肝脏双表型细胞成熟的试剂盒，包括培养基A和培养基B，
培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；
其中，WNT激活剂包括2种，即rhRSPO1和rhWnt3a；
cAMP激活剂为8-Br-cAMP；
SIRT1抑制剂为NIC；
TGFβ抑制剂为A83-01；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：FH1、FPH1、MK4、OSM和MK125。
本发明还提供了一种如上所述的试剂盒在诱导肝脏双表型细胞获得成熟肝类器官上的用途。
相对于现有技术，本发明所述的肝脏双表型细胞的成熟方法具有以下优势：
本专利提供一种肝脏双表型细胞的成熟方法以人多能干细胞体外诱导分化产生的肝脏双表型细胞构成的3D类器官为起点，以“3D-2D-3D”的培养顺序，并配合不同阶段对应的促成熟组合物，共同实现了双表型细胞的体外成熟。并且，消化为单细胞的3D类器官和2D肝前体细胞可批量冻存，经2D复苏后可进一步成熟，可实现产业化。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为培养方案示意图；
图2为双表型肝细胞构成的肝类器官明场图；
图3为双表型肝细胞的流式细胞术鉴定结果；
图4为S1使用培养基A培养前后的细胞明场图；其中，（a）为Day1消化为单细胞接种密度明场图；（b）为Day3细胞明场图；比例尺，200μm；（c）为图（b）的局部放大图；
图5为S21培养前后的细胞明场图；其中，（a）为将Day4单细胞明场图；（b）为Day6肝类器官明场图；（c）为Day13肝类器官明场图；
图6为S2成熟培养过程中不同时间点荧光定量PCR检测结果；3D-a，双表型肝细胞构成的类器官（Day1）；2D，肝前体细胞（Day4）；3D-b，成熟肝类器官（Day13）；AL，成年人肝脏；
图7为Day13成熟肝类器官的免疫荧光鉴定结果；比例尺，250μm；
图8为Day13成熟肝类器官流式分析结果；
图9为Day13成熟肝类器官ALB与Urea分泌水平的ELISA检测结果；
图10为Day13成熟肝类器官的关键药物代谢酶活性分析结果；
图11为Day13成熟肝类器官药物代谢酶可诱导性检测结果；3D-b，成熟肝类器官；PH（Primary hepatocytes），原代肝细胞；RIF（rifampicin），利福平，CYP3A4诱导剂；OMEP（Omeprazole），奥美拉唑，CYP1A2诱导剂；PB（Phenobarbital），苯巴比妥，CYP2B6诱导剂；*，p＜0.05；**，p＜0.01；
图12为Day1与Day3消化的单细胞冻存复苏前后细胞活性分析结果；生物学重复n=4；
图13为Day1与Day3消化的单细胞来源的Day13成熟肝类器官的肝脏成熟标志物表达水平比较；生物学重复n=4；
图14为使用10种成熟因子组合直接刺激8天后，ALB表达水平分析；3D-a，Day1双表型细胞构成的3D肝类器官；3D-b，Day9产物；AL（Adult liver），成年人肝脏；生物学重复n=3；
图15为将3D-a消化为单细胞后，再使用10种成熟因子组合进行3天的2D培养的明场图；比例尺，200μm；
图16为将3D-a消化为单细胞后，使用10种维持与增殖因子组合进行3天2D培养后肝脏成熟标志物表达水平检测结果；生物学重复n=3；
图17为分别顺序使用培养基A+A、培养基A+B条件下肝脏成熟标志物CYP3A4表达水平分析；3D-a，Day1双表型细胞构成的3D肝类器官；2D，Day13产物；AL（Adult liver），成年人肝脏；生物学重复n=3；
图18为分别顺序使用培养基A+A、培养基A+B条件下Day13明场图；比例尺，200μm；（a）为3D-a到2D顺序使用培养基A+A；（b）为3D-a到2D顺序使用培养基A+B。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明是基于申请号为CN202110940522.X的发明专利所提出的双表型肝细胞构成的肝类器官的进一步成熟化培养，以获得成熟肝类器官。发明人经过多次试验发现，传统的成熟方式不适用于双表型肝细胞的成熟，只有采用本发明的培养方法及培养基才能得到成熟的肝类器官。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例中用到的相关试剂示于表3和表4，引物序列示于表5，使用的相关抗体示于表6。
本发明提供的肝成熟化方法较为特别，既依赖于培养基组分本身，也依赖于双表型肝细胞构成的3D肝类器官（简称为3D-a）→2D肝前体细胞→3D成熟肝类器官（简称为3D-b）的培养顺序，图1为本发明培养方案示意图。
首先对准备的双表型肝细胞构成的3D肝类器官进行检测，如图2为双表型肝细胞构成的肝类器官明场图，明场下呈现典型的肝祖样细胞形态；其中含有部分双核细胞。图3为双表型肝细胞的流式细胞术鉴定结果，结果表明类器官中大部分细胞共表达成熟肝系标志物（CYP3A4、MRP2）与胎儿肝系标志物（SOX9、CK19、AFP），符合肝脏双表型细胞分子表征。
具体成熟方法包括如下步骤：
S1：双表型肝细胞构成的3D肝类器官（简称为3D-a）→2D肝前体细胞（Day 1-3）
S11、Day1：将3D-a消化为单细胞进行2D培养
使用TrypLE消化酶消化类器官5min，形成单细胞，该单细胞可以通过STEM-CELLBANKER (DMSO-free)冻存后使用，本实施例中直接用于以下步骤继续成熟化。
S12、Day1-3：使用培养基A，将上述单细胞按照1.5×105个细胞/cm2接种于铺有1:50 Matrigel（GFR）的细胞培养板，如图4（a）所示，连续培养3天，期间每天更换培养基，可形成汇合度约80%单层细胞，如图4（b）所示，与3D态相比，这些细胞边界清晰，呈鹅卵石状，双核细胞比例增加；总体呈现更成熟的形态表型。
培养基A组分如下：1mM 8-Br-cAMP、10mM NIC、0.5μM A83-01、1 μg/ml rhRSPO1、50 ng/ml rhFGF10、50 ng/ml rhEGF、100ng/ml rhWnt3a、0.5% ITS+3/2% B27 in 50%William’s E/47.5% Ad-F12。
S2：2D肝前体细胞→3D成熟肝类器官（简称为3D-b）（Day 4-13）
S21、Day 4-6 成熟化预培养
使用Accutase细胞分散酶消化2D单层细胞3min，该单细胞可以通过STEM-CELLBANKER (DMSO-free) 冻存后使用，本实施例中以含30% Matrigel（GFR）的培养基A重悬单细胞，并按照2×105-3×105个细胞/cm2的密度接种于超低吸附培养板，如图5（a）所示，连续培养3天，期间不换液，Day 6的细胞图如图5（b）所示。
S22、Day7-13 成熟化
将培养基更换为含10% Matrigel（GFR）的培养基B；期间每3天换液1次。
培养基B组分如下：20μM FH1、20μM FPH1、10μM MK4、20ng/ml OSM、0.5μM MK125、2%KSR in 50% HepatoZYME/48% HCM。
截至，Day13肝类器官实现成熟，如图5（c）所示。
为鉴定双表型细胞的成熟，对S2成熟培养过程中不同时间点做荧光定量PCR检测，结果如图6所示，在3D-a（Day1）→2D（Day3）→3D-b（Day13）过程中，肝祖细胞标志物（不成熟肝标志物）AFP与SOX9逐步下调，后达到与原代肝细胞（成年人肝脏AL）类似的表达水平；而成熟肝细胞标志物ALB、CK18、HNF4A、CYP3A4则均迅速上调，其大部分达到与原代肝细胞相当的表达量（除CYP3A4）。
图7是对Day13成熟肝类器官的免疫荧光鉴定结果，结果验证了3D-b成熟肝类器官(Day13)高表达肝成熟标志物A1AT与CYP3A4。
为进一步鉴定肝类器官的成熟，还对Day13成熟肝类器官进行了流式细胞术检测，结果如图8所示，成熟肝类器官中ALB+细胞、CYP3A4+细胞、AFP+细胞与SOX9+细胞的比例分别为89.5%、80.4%、7%以及1%，确认其完成双表型态至成熟态的转变。
另外，还对成熟的肝类器官进行了功能性方面的检测。
图9为Day13成熟肝类器官ALB与Urea分泌水平的ELISA检测结果，3D-b（Day13）产物分泌ALB与Urea的水平与原代肝细胞相当，二者无显著差异。
图10为Day13成熟肝类器官的关键药物代谢酶活性分析结果，表明其重要家族成员CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6均具备活性，且与原代肝细胞相当。
图11为Day13成熟肝类器官药物代谢酶CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6可诱导性检测结果，可见与原代肝细胞类似地，这些药物代谢酶具备功能性，可极显著地被各自的诱导剂RIF、OMEP、PB诱导，相应的如图11（a）、图11（b）、图11（c）所示3D-b的CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6诱导后分别上升9.8倍、7.7倍、8.7倍，表明该成熟化方式产生的成熟肝类器官极具药物毒性评价与筛选的应用潜力。
综上，这些结果表明肝类器官实现了由双表型态向成熟态的转换。
本实施例还对S11由双表型肝细胞构成的3D肝类器官消化后的单细胞和S212D肝前体细胞消化后的单细胞进行冻存复苏前后细胞活率对比，结果如图12和图13所示。
图12中，Day1单细胞冻存复苏前后细胞活性分别为：88.9%±7.3%、85.3%±4.9%；Day3单细胞冻存复苏前后细胞活性分别为：91.8%±3.1%、82.6%±11.2%）。
按照本实施例方法继续成熟化，与未冻存组相比，二者形成类器官的肝脏成熟基因ALB、CK18、CYP3A4、CYP2C9表达无显著差异，如图13所示，表明上述两个阶段的消化后的单细胞支持有效的冻存复苏。
对比例
由于本发明提供的肝成熟化方法较为特别，既依赖于培养基组分本身，也依赖于3D-a→2D→3D-b的培养顺序；因此，为明确该方法的意义，本发明提供研发过程中与传统肝成熟化组分/方法的对比。
1、培养基B的筛选
首先，使用几种常用的肝系成熟化因子进行组合，如表1所示a-j的10个方案，其中j是本发明培养基B的添加组分，分别对3D-a直接刺激8天后，对ALB表达水平分析。图14为Q-PCR检测结果，表明肝细胞成熟标志物ALB的表达水平远不及原代肝（AL），说明直接从3D-a→3D-b是无法直接实现3D双表型细胞构成的类器官成熟；而使用j方案的肝细胞成熟标志物ALB相比而言是最高的。
表1 使用10种成熟因子组合的成熟化方案
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2、基于上述方案，现将3D-a类器官消化为单细胞，进行2D培养，再尝试a-j成熟体系；72h后，我们发现这些条件均无法维持肝祖细胞的基本形态表型，如图15所示。
3、培养基A的筛选
鉴于上述直接使用促成熟因子的组合并不能实现细胞的成熟，转而使用维持和促增殖的因子组合，如表2所示，其中j'是本发明培养基A的添加组分。
表2使用10种维持和促增殖因子组合的成熟化方案
Figure DEST_PATH_IMAGE002
使用表2中a'-j'的10个方案分别对3D-a类器官消化的单细胞2D培养3天，之后对培养后肝脏成熟标志物表达水平进行检测，其结果如图16所示，可以发现HGF、FGF2、BMP4、EGF这几种因子中，EGF培养后肝脏成熟标志物ALB、CYP3A4表达水平最高，后续在添加EGF的基础上再添加其他因子，只有使用j'方案，即本发明的培养基A的组分，肝脏成熟标志物ALB、CYP3A4表达水平最高。经过上述筛选，确认了本发明专利中培养基A的组分为j'方案。
如上述实施例所述，该培养基A可在维持肝祖细胞形态学特征的前提下：1）一定程度地提高成熟肝脏标志物的表达水平，如图6；2）促使其增殖，如图4。
4、上述培养基A培养3天后，分别继续使用培养基A和先前筛选出的、相对最佳的成熟化组合j方案继续培养，j方案即表1中对应本发明专利中的培养基B，以促其进一步成熟化。
图17为分别顺序使用培养基A+A、培养基A+B条件下肝脏成熟标志物CYP3A4表达水平分析，可见培养基A+ B组合方式明显优于培养基A+ A组合方式，说明使用培养基A+ B组合能够其肝脏成熟基因进一步提升。
当通过图18（b）的细胞明场图可以发现，成熟基因提升的同时也造成了细胞大量死亡，剩余细胞数量低，导致了后续应用困难。
5、基于上述试验，继而将培养3天后的2D细胞再次消化为单细胞，并接种于悬浮培养板中；先继续使用培养基A处理3天，促使其适度增殖；再使用培养基B进行成熟化；即形成了本发明的3D-a→2D→3D-b的完整成熟化方法。
表3 试剂列表
试剂名称 公司（货号）
TrypLE Gibco (12605010)
Accutase Sigma (A6964)
STEM-CELLBANKER (DMSO-free) AMSBIO (11890F)
DMEM/F12 Gibco (11039021)
Ad-F12 Gibco (12634028)
William's E Gibco (A1217601)
HepatoZYME Gibco (17705021)
HCM Lonza (CC-3198)
KSR Gibco (10828028)
B27 Gibco (17504044)
ITS+3 Sigma (I2771)
A83-01 Sigma (SML0788)
NIC Sigma (N0636)
rhEGF R&D (236-EG)
rhFGF10 R&D (345-FG)
rhHGF R&D (294-HG)
rhRSPO1 R&D (4645-RS)
FH1 Sigma (SML0826)
FPH1 Sigma (SML0827)
MK4 Sigma (V9378)
rhOSM R&D (295-OM)
FBS BI (04-001-1A)
MK125 Sigma (D4902)
Matrigel Corning (354277)
Matrigel (GFR) Corning (356230)
Trizol Invitrogen (15596018)
Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR AG (AG11705)
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit AG (AG11718)
Human liver RNA Clontech (636531)
Inducing cryopreserved male Human Hepatocyte H1000.H15C+
DMSO Sigma (D2650)
RIF Sigma (R3501)
OMEP Sigma (19329)
PB Cayman (9001494)
P450-Glo™ CYP3A4 Assay Promega (V9002)
P450-Glo™ CYP2C9 Assay Promega (V8791)
P450-Glo™ CYP1C2 Assay Promega (V8771)
CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay Promega (G9683)
Human primary hepatocyte Lonza (HUCPI)
Human Albumin Elisa Kit Bethyl Laboratories (E88-129)
QuantiChrom™ Urea Assay Kit BioAssay Systems (DIUR-100)
Normal Donkey Serum Jacksonlab (017-000-121)
DAPI Sigma (D9542)
表4 试剂对应名称
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表5 引物列表
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表6 抗体列表
Figure DEST_PATH_IMAGE006
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天九再生医学（天津）科技有限公司
<120> 肝脏双表型细胞的成熟方法
<130> 2021.12.16
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
acatcgctca gacaccatg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagttgag gtcaatgaag gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaagtcgg tgaagaacgg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
cgccttgaag atggcgttg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgcaattga gaaacccact g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
ttccctcttc actttggctg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
cctgattact ctgtcgtgct g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
attctgaggc tcttccacaa g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
accagtggaa aactcaagga g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
tgatcacatc catgctgtag g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
tggacaaaga caagaggaac c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
tagcttgacc ttcgagtgc 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 13
acctggaaaa tgaactcacc c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 14
accttagtga tgcccagttg 20

Claims (8)

1.一种肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、将双表型肝细胞构成的3D肝类器官消化为单细胞后将其接种在培养基A中培养得到2D肝前体细胞；
S2、将2D肝前体细胞消化为单细胞后再依次接种在培养基A和培养基B中培养得到3D成熟肝类器官；
其中，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分为：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分为：肝细胞功能增强剂、肝细胞功能性增殖增强剂、甲萘醌4、制瘤素M和地塞米松；
培养基A的添加组分中，cAMP激活剂为8-Br-cAMP，SIRT1抑制剂为NIC，TGFβ抑制剂为A83-01，WNT激活剂包括2种，即rhRSPO1和rhWnt3a；
S1的具体步骤为：使用消化酶将类器官消化形成单细胞后，将双表型肝细胞接种于铺有1:50 Matrigel的细胞培养板，连续培养3天，至汇合度达80-90%左右，期间每天更换培养基；
S2的具体步骤为：
S21、将消化后的单细胞以含30% Matrigel的培养基A重悬单细胞，并接种于超低吸附培养板，连续培养3天，期间不换液；
S22、将培养基更换为含10% Matrigel的培养基B继续培养7天，期间每3天换液1次。
2.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：培养基A的添加组分中，cAMP激活剂为8-Br-cAMP，用量为0.01-1mM；SIRT1抑制剂为NIC，用量为1-10mM；TGFβ抑制剂为A83-01，用量为0.1-10μM；WNT激活剂包括2种，即100-1000ng/ml的rhRSPO1和25-500ng/ml的rhWnt3a；rhFGF10为50-500 ng/ml，rhEGF为50-500 ng/ml。
3.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：培养基A的基础培养基包括0.5% ITS、2% B27、50% William’s E、47.5% Ad-F12。
4.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：培养基B中添加组分为：1-20μM肝细胞功能增强剂、1-20μM肝细胞功能性增殖增强剂、2-50μM甲萘醌4、5-100ng/ml制瘤素M、0.05-1μM地塞米松。
5.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：培养基B的基础培养基包括2%KSR、50% HepatoZYME、48% HCM。
6.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：步骤S1得到的2D肝前体细胞消化后的单细胞可冻存使用。
7.一种用于肝脏双表型细胞成熟的试剂盒，其特征在于：包括培养基A和培养基B，
培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分为：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；其中，WNT激活剂包括2种，即rhRSPO1和rhWnt3a；cAMP激活剂为8-Br-cAMP，SIRT1抑制剂为NIC，TGFβ抑制剂为A83-01；
培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分为：肝细胞功能增强剂、肝细胞功能性增殖增强剂、甲萘醌4、制瘤素M和地塞米松。
8.一种如权利要求7所述的试剂盒在诱导肝脏双表型细胞获得成熟肝类器官上的用途。
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