CN111909887A

CN111909887A - 获得肝脏细胞的方法和组合物

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Publication number: CN111909887A
Application number: CN201910392377.9A
Authority: CN
Inventors: 邓宏魁; 时艳; 陈思潼
Original assignee: Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd; Peking University
Current assignee: Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd; Peking University
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2020-11-10

Abstract

本文提供获得肝脏细胞的方法和组合物。本文提供一种用于从多能干细胞诱导产生肝脏细胞的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含下述诱导剂：(1)Activin A，(2)BMP信号转导途径调节物，(3)FGF信号转导途径调节物，(4)Wnt信号途径调节物，(5)生长因子，(6)TGFβ受体/ALK5抑制剂。本文还提供通过所述试剂盒或细胞培养基组合物制备肝脏细胞的方法、通过所述的方法得到的肝脏细胞，含有所述肝脏细胞的人工肝装置和/或所述肝脏细胞用于制备人工肝装置的用途，以及肝细胞大规模培养方法。

Description

获得肝脏细胞的方法和组合物

发明领域

本发明总体上涉及获得肝脏细胞的方法和组合物。具体而言，本发明涉及用于将从诱导多能干细胞获得肝脏细胞的方法和组合物。

背景技术

(一)诱导多能干细胞

多能干细胞可以自我更新并且分化为所有体细胞类型。已经通过向卵母细胞中的核移植或通过限定因子的异位表达将体细胞重编程而成为多能性的。例如，2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地将其诱导重编程成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似。他们发现，仅转导Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4就可以诱导的多潜能干细胞(iPS细胞-Induced Pluripotent Stem Cells，即“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和Oct4promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。同时，研究发现只用Oct4，Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞，cMyc并不是体细胞重编程所必需的转录因子。

此后，采用Yamanaka的策略，一些新的用于产生诱导多能干细胞的因子被筛选出来。新加坡的Huck-Hui Ng研究组发现Nr5a2和Klf4，Sox2，cMyc一起完成重编程(Jian-Chien Dominic Heng et al.，2009)，并且Oct4，Esrrb，Klf4，和cMyc一起也可以完成重编程。同时，研究发现只用Oct4并且在特殊的细胞类型，如神经干细胞(Kim et al.，2009)，滋养外胚层细胞(Tong Wu et al.，2011)等就可以实现将体细胞重编程为诱导多能干细胞。并且，在加上小分子的情况下还能实现将小鼠成纤维细胞转变为诱导多能干细胞(YanqinLi et al.，2010)以及人的角质化细胞转变为诱导多能干细胞(Saiyong Zhu et al.，2010)。

迄今为止，不同研究组已经在许多种不同类型的细胞上尝试了重编程技术，并取得了成功。在诱导的方法学上也有了许多的改进。2008年，Hochedlinger课题组利用不整合基因组的腺病毒(Adenovirus)载体成功诱导了IPS细胞(Matthias Stadtfeld et al.，2008)；同年，Yamanaka利用质粒载体也成功诱导了IPS细胞(Keisuke Okita et al.，2008)；piggyBac转座子体系后来也证实可以切除掉外源插入基因的方法完成重编程(Woltjen K et al.，2009)；后来Ding Sheng课题组利用四因子的蛋白也成功诱导IPS细胞(Zhou H et al.，2009)；最近，用RNA(Luigi Warren et al.，2010)和小RNA(micro RNA)也能实现成功的重编程(Frederick Anokye-Danso et al.，2011and Alessandro Rosa etal.，2011)。

诱导多能干细胞的建立很好的解决了胚胎干细胞研究的伦理问题，对于生命科学以及人类的健康有着重要意义。诱导多能干细胞的研究可以帮助揭示人及动物的发育机制及影响因素；建立转基因动物或基因打靶动物，制备人类疾病模型；体外诱导分化提供各种类型的人体细胞，进行药学研究；通过形成嵌合体，在严格控制下使动物的某些器官来源于人体细胞，从而用于临床移植；最诱人的前景就是用于细胞治疗和基因治疗的靶细胞，为细胞移植提供无免疫原性的材料以及通过基因修饰改造的人体细胞移植回体内，达到治愈疾病的目的等等。

(二)生物人工肝(bioartificial liver)系统

肝脏是人体中最为重要的代谢器官之一，肝脏功能异常会影响患者的生存质量，严重的肝功能衰竭甚至会威胁患者的生命。临床患者统计数据表明，急性肝脏功能衰竭患者具有高达80％的死亡率，并且出现肝脏功能异常患者的人数仍在不断增长。目前为止，肝移植是最为有效的治愈肝脏功能衰竭的治疗手段，遗憾的是，由于肝脏供体来源有限，约20％-25％的肝衰患者因未能等到合适的供体来源而死亡。

人工肝系统是用于急性肝衰竭患者临床治疗而开发的支持系统，可以替代全部或部分肝脏的功能，从而使患者可以延长生命直至等到适宜的肝移植供体。此外由于肝脏在受到急性损伤后具有增殖再生能力，人工肝系统可以支持病人的生存状态、减轻肝脏的代谢负荷，从而促进肝脏的自我修复以缓解病情。生物人工肝系统是一种细胞型灌流装置，该装置通过分离病人的血清与生物人工肝设备中的肝种子细胞进行直接或间接的接触，进而对血清中的代谢物质通过肝种子细胞进行代谢解毒，同时肝种子细胞能够补充肝脏合成的重要代谢产物，从而提高肝脏衰竭患者的生存率。由此可见，生物人工肝装置可以将肝脏细胞的解毒功能与合成、调节功能结合起来，因此更加适宜应用于肝脏衰竭病人的临床治疗。生物人工肝系统的核心在于生物反应器，即种子细胞系及其培养方式的选择。

生物人工肝支持系统的核心在于种子细胞系的选择及制备。生物人工肝的临床治疗中，每位肝脏功能衰竭患者需要不少于10¹⁰的细胞，才能有效替代肝脏的功能。与此同时，肝脏具有诸多重要的生理功能，参与蛋白质的合成(如白蛋白、凝血因子)，胆汁合成，糖、脂肪、蛋白质的代谢，血氨的解毒作用等，因此要求细胞具有与原代肝脏细胞相比较为完善的功能。原代肝脏细胞是最为理想的细胞来源，但是冻存的细胞和新鲜分离的细胞数量均难以满足生物人工肝对于细胞数量的要求。目前用于生物人工肝系统的细胞来源主要有如下几类：

肝癌细胞系：HepG2细胞系是目前最广泛应用于生物人工肝的肝癌细胞系。但是，研究者将HepG2细胞来源的生物人工肝与分离原代肝脏细胞来源的生物人工肝进行比较，结果显示，HepG2细胞的代谢效率与原代细胞相差约两个数量级，且HepG2细胞在血氨清除的能力与原代细胞差异显著。进一步比较发现，HepG2细胞和原代细胞的代谢模式存在差异，原代肝脏细胞具有代谢乳酸产生葡萄糖的糖异生作用，而HepG2细胞则消耗葡萄糖产生乳酸，产生的乳酸进入病人体内易导致病人出现酸中毒现象。此外，HepG2细胞白蛋白合成、药物代谢等方面的功能与原代肝脏细胞存在显著差异，不是替代原代肝脏细胞的理想种子细胞来源。

原代猪肝细胞：由于猪肝细胞易于获得，并且具有原代肝脏所具有的功能，因此被认为是较为理想的生物人工肝种子细胞来源。实验表明，原代猪肝来源的生物人工肝系统对于急性肝脏功能衰竭患者具有显著的治疗效果。然而原代猪肝细胞应用于生物人工肝的临床治疗面临两个主要的问题：第一，原代猪肝细胞的功能在体外难以维持。目前生物人工肝系统的治疗时间基本不低于4小时，部分治疗时间高于24小时。而原代猪肝细胞会在几小时内迅速丧失肝脏细胞的功能，包括药物代谢活性、蛋白合成能力和血氨代谢能力，并伴随细胞存活状态的迅速下降。研究者试图将SV40-LT转入原代猪肝细胞中以建立永生化猪肝细胞系。结果表明，该方法可以某种程度上有效维持原代猪肝细胞的功能及存活状态，但是逆转录病毒的使用在临床安全角度存在重要隐患，特别是猪源性逆转录病毒增加了人畜共患病的传播风险，为其后续应用造成了局限。第二，跨物种间的血液物质交换存在潜在风险，特别是猪源细胞所导致的免疫反应及种属间病原体的传播所造成的疾病目前难以进行预测。因此，部分国家严禁将猪肝细胞应用于人类疾病的治疗。

转分化细胞来源：我们和其他科研团队证明人的成纤维细胞能够通过转导肝脏特异基因的方法向人肝脏实质细胞的命运转变。通过该方法获得的肝脏细胞具有与原代肝脏细胞相似的基因表达谱，具有分泌白蛋白、血氨代谢、药物代谢的能力。但是，通过谱系重编程来源获得的肝脏细胞也存在一些问题。首先，目前的重编程技术主要以胚胎成纤维细胞作为起始细胞，但是胚胎成纤维细胞来源不稳定且不能在体外进行稳定的扩增传代，而且转分化来源的肝脏细胞需要通过Myc、SV40等致癌基因介导其体外扩增，其次，目前的重编程技术主要通过逆转录病毒构建表达载体进而在细胞内过表达关键性转录因子，以改变细胞命运，且往往伴随肿瘤相关基因的转入以增强细胞的扩增潜能，如P53i，C-MYC，SV40等。从而长期传代会导致基因组不稳定，也可能诱导肿瘤的发生，因此在临床应用中存在潜在的风险，不适宜作为生物人工肝临床治疗的种子细胞。再次，目前获得的转分化来源的肝脏细胞在功能上与成体肝脏细胞仍然存在显著的差异，难以替代原代肝脏的功能。

发明内容

多能干细胞在体外能够稳定扩增，并且可以定向分化为多种类型的具有生理功能的组织，是生物人工肝系统的一个理想的种子细胞来源。在本发明中，发明人建立了人多能干细胞体外定向诱导分化为具有扩增能力的肝脏前体细胞的方法和组合物。在此基础上，发明人建立了人多能干细胞来源的肝脏前体大规模扩增的技术。此外，发明人还建立了一个高效大规模制备功能成熟的肝脏细胞团的新方法，最终能够获得数量充足，能够应用于生物人工肝体系的人多能干细胞分化来源的肝种子细胞库。

因此，在一些实施方案中，本发明涵盖下述各项描述的技术方案或其变形形式。

1.一种用于从多能干细胞诱导产生肝脏细胞的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含下述诱导剂：

(1)Activin A，

(2)BMP信号转导途径调节物，

(3)FGF信号转导途径调节物，

(4)Wnt信号途径调节物，

(5)生长因子，

(6)TGFβ受体/ALK5抑制剂。

2.项目1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其还包含下述一种或多种诱导剂：

(7)GSK-3β抑制剂，

(8)cAMP激动剂，和/或

(9)核受体配体，

任选地还包含一种或多种另外的诱导剂，如(10)LPA，(11)S1P，和/或(12)XMU-MP-1。

3.项目1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中：

所述(2)BMP信号转导途径调节物包括BMP蛋白如BMP2、BMP4、BMP7，GDF蛋白如GDF7和抗-BMP受体抗体中的一种或多种；

所述(3)FGF信号转导途径调节物包括FGF1、FGF2、FGF4和FGF10中的一种或多种；

所述(4)Wnt信号途径调节物包括Wnt3a，Wnt激动剂，Dkk，R-Spondin中的一种或多种；

所述(5)生长因子包括KGF、IGF、EGF、VEGF中的一种或多种；和/或

所述(6)TGFβ受体/ALK5抑制剂包括SB431542，LY-364947，SB-505，A-83-01中的一种或多种。

4.项目2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中：

所述(7)GSK-3β抑制剂包括CHIR99021，TD114-2，BIO，Kenpaullone，TWS119，CBM1078，SB216763，3F8(TOCRIS)，AR-A 014418，FRATide，Indirubin-3′-oxime，L803中的一种或多种；

所述cAMP激活剂包括Forskolin，IBMX，Rolipram，8BrcAMP，Prostaglandin E2(PGE2)，NKH 477，dibutyryl-cAMP(DBcAMP)，Sp-8-Br-cAMPs中的一种或多种；和/或

所述(9)核受体配体包括雌二醇，全反式视黄酸，13-顺式视黄酸，地塞米松，氯倍他索，雄激素，甲状腺素，曲格列酮，吡格列酮，前列腺素中的一种或多种。

5.项目1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中所述诱导剂以诱导细胞表达标志蛋白AFP、SOX9、Ki67的量存在。

6.项目2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中所述诱导剂以诱导细胞表达标志蛋白AFP和ALB的量存在。

7.一种用于从多能干细胞诱导产生肝脏细胞的方法，所述方法包括使多能干细胞与项目1-6任一项所述的试剂盒或细胞培养基组合物接触以从所述多能干细胞诱导产生肝脏细胞。

8.项目7所述的方法，其中将所述多能干细胞与项目1所述的试剂盒或细胞培养基组合物接触，以从所述多能干细胞诱导产生肝母细胞。

9.项目8所述的方法，其中将所述肝母细胞进一步与项目2所述的诱导剂接触，以诱导产生肝脏细胞。

10.一种通过项目7-9任一项所述的方法得到的肝脏细胞，含有所述肝脏细胞的人工肝装置和/或所述肝脏细胞用于制备人工肝装置的用途，例如用于治疗肝病，如需要进行细胞灌流的肝病，如肝衰竭，如急性肝衰竭。

11.一种肝细胞大规模培养方法，所述方法包括1)将肝脏前体细胞进行2D体系的传代扩增，和2)进一步进行3D体系培养和成熟，其中步骤1)包括以约1×10⁷作为起始细胞量，在培养瓶中进行稳定连续的细胞传代，直至将细胞扩增至1×10⁸量级，并转移至细胞工厂中进行继续扩增，至约1×10⁹量级，准备转移至转瓶中进行功能成熟。

12.项目11所述的方法，其中步骤2)包括将约1×10⁹细胞从细胞工厂中消化，单细胞悬液转移至转瓶中进行3D体系搅拌式培养。

13.项目11或12所述的方法，其中步骤1)中传代比例约1∶2-1∶3，传代频率约2-3天。

14.项目11-13任一项所述的方法，其中步骤2)培养基量约为1-1.5L，转速约为60rpm，细胞每天进行换液培养，直至细胞功能成熟，例如合成肝脏细胞功能蛋白ALB和/或CYP3A4。

15.项目11-14任一项所述的方法，其中所述肝脏前体细胞来源于多能干细胞，例如诱导多能干细胞，例如通过项目1-6任一项所述的试剂盒或细胞培养基组合物或项目7-9任一项所述的方法诱导产生的肝脏前体细胞。

附图说明

图1显示hiPSC细胞向肝母细胞(Hepatoblast，HB)分化形态。

图2显示肝母细胞免疫荧光染色。

图3显示肝脏前体细胞克隆的扩增。

图4显示肝脏前体细胞的流式检测。

图5显示肝脏前体细胞的QPCR鉴定。

图6显示肝脏前体细胞的免疫荧光染色。

图7显示肝脏前体细胞的RNASeq分析。

图8显示肝脏前体细胞的扩增曲线。

图9显示肝脏前体细胞的传代稳定性检测。

图10显示肝脏前体细胞的冻存复苏。

图11显示肝脏前体细胞分化为成熟肝脏细胞。

图12显示肝脏细胞转录因子相关基因的QPCR检测。

图13显示肝脏前体细胞成熟过程的检测。

图14显示肝脏细胞的PAS染色和免疫英光染色。

图15显示肝脏细胞尿素合成、凝血因子相关基因的QPCR检测。

图16显示肝脏细胞白蛋白、尿素的ELISA检测。

图17显示细胞的RNASeq分析，测序样品中hiPSC1和2为两株不同的hiPSC细胞系，hMH1-3为三株不同hiPSC细胞分化来源的肝脏细胞，PHH 1和2为两株不同的原代肝脏细胞。。

图18显示肝脏细胞大规模培养模式图。

图19显示大规模培养肝脏克隆形态及免疫荧光染色。

图20显示肝脏克隆转录因子相关基因的QPCR检测。

图21显示肝脏克隆肝脏属性相关基因的QPCR检测。

图22显示肝脏克隆药物代谢相关基因的QPCR检测。

图23显示肝脏克隆尿素合成、凝血因子相关的基因检测。

图24显示肝脏克隆白蛋白、尿素合成的ELISA检测。

图25显示生物人工肝治疗流程。

图26显示急性肝脏功能衰竭小型猪存活曲线表。

图27显示急性肝脏功能衰竭小型猪照片。

图28显示肝脏损伤相关血清生化指标检测。

图29显示肝脏切片HE染色。

图30显示诱导多能干细胞hiPSCs细胞向肝脏细胞分化示意图。

图31显示肝细胞的大规模培养及悬浮培养示意图。

具体实施方式

I.定义

如在本文中所使用的，“培养物”意指在培养基中生长并且任选传代的细胞群体。细胞培养物可以是原代培养物(例如，尚未被传代的培养物)或者可以是传代或继代培养物(例如，已经传代培养或传代一次或多次的细胞群体)。

如在本文中所使用的术语“诱导的多能干细胞”(iPSC)是通过人工方式来源于非多能细胞的多能干细胞类型。

术语“分离的”或“纯化的”多能干细胞意指至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％无污染细胞类型如非多能细胞的多能干细胞。

在本文中，当使用“约”描述数值时，可以指代本领域技术人员容易确定的合适数值浮动范围。例如，在一些实施方案中，当使用“约”描述数值时，可以指该数值±5％，10％，20％等，以本领域技术人员理解的合适数值浮动范围为准。在一些实施方案中，当使用“约”描述数值时，可以指该数值±5％，以本领域技术人员理解的合适数值浮动范围为准。在一些实施方案中，即使未使用“约”进行描述，也可以涵盖本领域技术人员理解的合适数值浮动范围。如在本文中所使用的术语“多能性”(或多能的)是指具有分化为三个胚层中的任一种的潜力的干细胞：内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)、或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)。术语“非多能的”意指细胞不具有分化为全部三个胚层的潜力。专能干细胞是较低可塑性并且更大程度分化的，并且可以成为在给定器官内的多种类型细胞中的一种。例如，专能血液干细胞可以发育为红细胞祖细胞、白细胞或血小板生成细胞。成体干细胞是专能干细胞。脂肪来源的干细胞是专能的。

如在本文中所使用的“重编程”是指将一种特定细胞类型转化为另一种。例如，可以将非多能的细胞重编程为多能细胞。

如在本文中所使用的“诱导培养基”是指包含一种或多种诱导剂的细胞培养基。

II.组合物

A.诱导剂或调节物

如在本文中所使用的诱导剂包括单独或与其它试剂组合诱导细胞分化如从多能干细胞向内胚层细胞、肝母细胞、肝脏前体细胞、成熟肝脏实质细胞等分化的试剂。

因此，已经鉴别了可以用于使诱导多能干细胞向内胚层细胞、肝母细胞、肝脏前体细胞、成熟肝脏实质细胞等分化的试剂。在一些实施方案中，诱导剂或调节物包括以下一种或多种：(1)Activin A，(2)BMP信号转导途径调节物，(3)FGF，信号转导途径调节物，(4)Wnt信号途径调节物，(5)生长因子，(6)TGFβ受体/ALK5抑制剂，(7)GSK-3β抑制剂，(8)cAMP激动剂，(9)核受体配体，(10)LPA，(11)S1P，和/或(12)XMU-MP-1，以及它们的任意组合。诱导剂或调节物可以单独提供或者作为诱导剂或调节物组合物而组合提供。一种或多种其它调节剂也可以与上述试剂一起施用。

(1)BMP信号转导途径调节物

BMP信号转导途径调节物可以包括BMP蛋白如BMP2、BMP4、BMP7等，GDF蛋白如GDF7等，抗-BMP受体抗体等。在一些实施方案中，作BMP信号转导途径调节物的浓度是可以诱导多能干细胞向内胚层细胞分化的浓度。BMP信号转导途径调节物如BMP4的浓度可以是约1ng/ml至约200ng/ml，优选地约1ng/ml至约100ng/ml，更优选地约1ng/ml至约20ng/ml。BMP信号转导途径调节物可以加入到例如诱导iPSCs向内胚层细胞转化的培养基中以及由内胚层细胞向肝母细胞转化的培养基中。

(2)FGF信号转导途径调节物

FGF信号转导途径调节物可以包括FGF1、FGF2、FGF4和FGF10。FGF信号转导途径调节物例如FGF2(bFGF)的浓度可以为约1ng/ml至约200ng/ml，优选地约5ng/ml至约100ng/ml，更优选地约10ng/ml至约50ng/ml。FGF信号转导途径调节物可以加入到例如诱导iPSCs向内胚层细胞转化的培养基中以及由内胚层细胞向肝母细胞转化的培养基中。

(3)Wnt信号途径调节物

Wnt信号途径调节物可以包括Wnt家族的蛋白(例如，Wnt1、Wnt3a、Wnt7a)、Wnt受体、Wnt受体激动剂、Dkk，R-Spondin中的一种或多种。Wnt信号途径调节物如Wnt3a的浓度可以为约1ng/ml至约200ng/ml，优选地约5ng/ml至约100ng/ml，更优选地约10ng/ml至约50ng/ml。Wnt信号途径调节物可以加入到例如诱导iPSCs向内胚层细胞转化的培养基中(例如在培养的第1天加入)。

(4)生长因子

诱导培养基中的生长因子可以包括KGF、IGF、EGF、VEGF中的一种或多种。在一些实施方案中，生长因子如KGF可以添加到诱导内胚层细胞向肝母细胞分化的培养基中(例如在培养的4-8天添加)。在一些实施方案中，生长因子如EGF可以任选地添加到诱导肝母细胞向肝前体细胞培养基中。生长因子如KGF和/或EGF的浓度可以为，例如，约1ng/ml至约100ng/ml，优选地约5ng/ml至约50ng/ml，更优选地约10ng/ml至约40ng/ml。

(5)TGFβ受体/ALK5抑制剂

诱导培养基中的TGFβ受体/ALK5抑制剂可以包括SB431542，LY-364947，SB-505，A-83-01中的一种或多种。TGFβ受体/ALK5抑制剂如SB431542的浓度可以是例如约0.1μM至约100μM，例如约1μM至约50μM，例如约1μM至约10μM。TGFβ受体/ALK5抑制剂可以加入到诱导内胚层细胞向肝母细胞转化的培养基中以及诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中，以及前体细胞向肝实质细胞转化的培养基中。

(6)GSK-3β抑制剂

诱导培养基中的GSK-3β抑制剂可以包括CHIR99021，TD114-2，BIO，Kenpaullone，TWS119，CBM1078，SB216763，3F8(TOCRIS)，AR-A 014418，FRATide，Indirubin-3′-oxime，L803中的一种或多种。GSK-3β抑制剂如CHIR99021的浓度可以是例如约0.1μM至约100μM，例如约1μM至约50μM，例如约1μM至约10μM。GSK-3β抑制剂可以加入到例如诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中。

(7)cAMP激活剂

诱导培养基中的cAMP激活剂可以包括Forskolin，IBMX，Rolipram，8BrcAMP，Prostaglandin E2(PGE2)，NKH 477，dibutyryl-cAMP(DBcAMP)，Sp-8-Br-cAMPs中的一种或多种。cAMP激活剂抑制剂如Forskolin的浓度可以是例如约0.1μM至约100μM，例如约1μM至约50μM，例如约5μM至约20μM。cAMP激活剂可以加入到例如诱导诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中，以及前体细胞向肝实质细胞转化的培养基中。

(8)核受体配体

诱导培养基中的核受体配体可以包括雌二醇，全反式视黄酸，13-顺式视黄酸，地塞米松，氯倍他索，雄激素，甲状腺素，曲格列酮，吡格列酮，前列腺素中的一种或多种。核受体配体可以在递送位点处调节局部基因表达或转录。核受体配体如地塞米松的浓度可以是例如约0.01μM至约100μM，例如约0.1μM至约50μM，例如约1μM至约20μM。核受体配体可以加入到例如诱导诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中，以及前体细胞向肝实质细胞转化的培养基中。

(9)其它试剂

本发明的培养基中可以任选地添加其它适当的试剂以诱导分化。例如可以添加适当量的LPA，S1P，和/或Hippo信号途径调节剂如XMU-MP-1。在一些实施方案中，LPA的浓度可以是例如约0.01μM至约100μM，例如约0.1μM至约50μM，例如约1μM至约20μM。LPA可以加入到例如诱导诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中。在一些实施方案中，S1P的浓度可以是例如约0.01μM至约100μM，例如约0.1μM至约50μM，例如约0.5μM至约10μM。LPA可以加入到例如诱导诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中。在一些实施方案中，Hippo信号途径调节剂如XMU-MP-1的浓度可以是例如约0.001μM至约10μM，例如约0.01μM至约10μM，例如约0.1μM至约1μM。Hippo信号途径调节剂如XMU-MP-1可以加入到例如诱导诱导肝母细胞向肝脏前体细胞转化的培养基中。本发明的基础培养基没有特别限制，可以使用任何适当的培养基例如RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、William′E培养基或其混合物。在一些实施方案中，本发明的培养基可以添加适合细胞培养的其它成分，例如无血清添加物B27、GlutaMax等。

B.诱导多能干细胞

作为肝细胞来源的诱导多能干细胞可以通过诱导获得自哺乳动物如任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)、优选人的部分或完全分化的细胞，得到诱导的多能干细胞。来源包括骨髓、成纤维细胞、胎儿组织(例如，胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。在优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自诱导的成纤维细胞、脂肪来源的干细胞、神经干细胞或来自肠上皮的细胞。在更优选的实施方案中，诱导的多能干细胞获得自诱导的新生(例如包皮)或成体成纤维细胞。然而，iPSC可以获得自其他细胞类型，包括但不限于：多能干细胞、血液来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞、和结缔组织细胞。iPSC可以获得自从哺乳动物受试者得到的样品。受试者可以是任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，包括人。细胞的样品可以获得自多种不同来源中的任一种，包括骨髓、肝脏、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。

在优选的实施方案中，诱导多能干细胞获得自成纤维细胞和脂肪来源的干细胞。在更优选的实施方案中，诱导多能干细胞获得自成纤维细胞，其可以是新生(例如包皮成纤维细胞)或成体成纤维细胞。

可以通过使用本领域技术人员已知的技术将充当细胞来源的适当的器官或组织分解来分离细胞。例如，可以将组织或器官机械分解和/或用消化酶和/或削弱相邻细胞之间连接的螯合剂处理，从而可以将组织分散以形成个体细胞的悬浮液，而没有可察觉的细胞损坏。可以通过将组织切碎并且用一种或多种酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等处理切碎的组织来完成酶解离。也可以通过多种方法完成机械破坏，包括但不限于使用粉碎机、搅拌机、筛、均化器、压力盒(pressure cell)、或声波器(insonator)。

III.方法和制备

A.诱导分化

可以通过在足够的时间段内在含有诱导培养基在中提供诱导多能干细胞(iPSCs)(例如诱导人多能干细胞(hiPSCs))以将细胞诱导为肝脏细胞。使iPSCs与含有有效诱导和/或增强iPSCs分化为肝脏细胞量的诱导剂的培养基接触足够的时间，将所述细胞诱导分化为肝脏细胞。

B.细胞的分离

通过从培养源中提取(例如，通过密度梯度离心和/或流式细胞仪)，可以得到基本上纯化的肝脏细胞群体。纯度可以通过任何适当的方法进行测量。例如，通过流式细胞仪(例如，FACS分析)，可以将肝脏细胞99％-100％纯化。例如，通过使用与肝脏细胞上的标记结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子)并且从而对结合分子的细胞进行阳性选择(即，阳性选择)，可以将肝脏细胞分离。阳性选择方法的其他实例包括优先促进在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的希望的细胞类型的生长的方法。备选地，通过使用与在希望的细胞类型上不存在、但是在不希望的细胞类型上存在的标记结合的分子，可以从希望的细胞中移除含有这样的标记的不希望的细胞(即，阴性选择)。其他阴性选择方法包括优先杀伤在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的不希望的细胞类型或抑制其生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择、或它们的组合，可以制备干细胞的富集群体。

用于分离的过程可以包括磁性分离，使用涂布有抗体的磁珠，亲和色谱，与单克隆抗体连接的细胞毒性剂，或与单克隆抗体结合使用的这样的试剂，例如补体和细胞毒素，以及使用附着至固体基质(例如，平板)的抗体的“淘选”，或其他方便的技术。提供准确分离的技术包括荧光活化的细胞分选器，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、和阻抗通道。抗体可以与标记如允许直接分离的磁珠、可以利用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白移除的生物素、或可以与荧光活化的细胞分选器一起使用的荧光染料缀合，以允许特定细胞类型的容易的分离。可以采用对诱导的多能干细胞的活力不过度地有害的任何技术。在一个实施方案中，用针对标记的抗体(例如，TRA-1-81抗体)温育细胞，并且手动选择并且传代培养对于标记来说正染色的细胞。

可以使用富集方法的组合以改善纯化或富集的时间或效率。例如，在移除具有不指示目标细胞类型的标记的细胞的富集步骤之后，可以通过荧光活化的细胞分选器(FACS)或具有高特异性的其他方法对细胞进行进一步分离或富集。可以与FACS一起使用多颜色分析。可以基于针对特定抗原的染色水平或缺乏所述染色水平将细胞分离。可以使用荧光染料标记对特定抗原特异性的抗体。这样的荧光染料包括藻胆蛋白例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素、和德克萨斯红。可以使用任何细胞类型特异性标记以对或针对特定细胞类型进行选择。

C.细胞的培养和保存

可以将细胞在培养物中储存以用于以后的回收和使用。根据已知方法，如在Doyle等，(eds.)，1995，Cell&Tissue Culture：Laboratory Procedures(细胞&组织培养：实验室操作)，John Wiley&Sons，Chichester中描述的那些，可以将细胞低温保存以进行储存。例如，可以将细胞在“冷冻培养基”中悬浮，如含有15-20％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DMSO)的培养基，其具有或不具有5-10％甘油，密度为例如约4-10x 10⁶细胞/ml。将细胞分配至玻璃或塑料瓶中，之后将其密封并且转移至可编程或被动冰箱的冷冻室。可以通过经验确定冷冻的最佳速率。例如，可以使用通过熔化热提供-1℃/min的温度变化的冷冻程序。一旦含有细胞的瓶达到-80℃，即将它们转移至液氮存储区域。可以将低温保存的细胞储存数年的时间段。

D.大规模培养方法

在一些实施方案中，本发明还提供通过本文描述的培养基培养肝细胞的方法，尤其是肝细胞大规模培养方法。在一些实施方案中，大规模培养方法可以包括1)2D体系的传代扩增，和2)3D体系培养和成熟。在一些实施方案中，步骤1)包括以约1×10⁷作为起始细胞量，在培养瓶中进行稳定连续的细胞传代，传代比例约1∶2-1∶3，传代频率约2-3天，直至将细胞扩增至1×10⁸量级，并转移至细胞工厂中进行继续扩增，至约1×10⁹量级，准备转移至转瓶中进行功能成熟。在一些实施方案中，步骤2)包括将约1×10⁹细胞从细胞工厂中消化，单细胞悬液转移至转瓶中进行3D体系搅拌式培养。在一些实施方案中，本文提供一种肝细胞大规模培养方法，所述方法包括1)将肝脏前体细胞进行2D体系的传代扩增，和2)进一步进行3D体系培养和成熟，其中步骤1)包括以约1×10⁷作为起始细胞量，在培养瓶中进行稳定连续的细胞传代，直至将细胞扩增至1×10⁸量级，并转移至细胞工厂中进行继续扩增，至约1×10⁹量级，准备转移至转瓶中进行功能成熟。在一些实施方案中，步骤2)包括将约1×10⁹细胞从细胞工厂中消化，单细胞悬液转移至转瓶中进行3D体系搅拌式培养。在一些实施方案中，步骤1)中传代比例约1∶2-1∶3，传代频率约2-3天。在一些实施方案中，步骤2)培养基量约为1-1.5L，转速约为60rpm，细胞每天进行换液培养，直至细胞功能成熟，例如合成肝脏细胞功能蛋白ALB和/或CYP3A4。在一些实施方案中，所述肝脏前体细胞可以来源于多能干细胞，例如诱导多能干细胞，例如通过本文描述的培养基和方法诱导产生的肝脏前体细胞。

IV.方法和应用

对于治疗性治疗、组织工程和研究来说，可以产生希望的细胞类型或形态的干细胞的容易获得的来源是重要的。

一旦建立，即可以使用肝细胞的培养物制备人工肝系统(装置)。在一些实施方案中，其可以用于治疗例如急性肝衰竭患者，可以替代全部或部分肝脏的功能，从而使患者可以延长生命直至等到适宜的肝移植供体。人工肝系统可以支持病人的生存状态、减轻肝脏的代谢负荷，从而促进肝脏的自我修复以缓解病情。在一些实施方案中，所述人工肝系统包含不少于10¹⁰的细胞，能够有效替代肝脏的功能。在一些实施方案中，人工肝系统是一种细胞型灌流装置，通过分离病人的血清与生物人工肝设备中的肝种子细胞进行直接或间接的接触，进而对血清中的代谢物质通过肝种子细胞进行代谢解毒，同时肝种子细胞能够补充肝脏合成的重要代谢产物，从而提高肝脏衰竭患者的生存率。在一些实施方案中，生物人工肝装置可以将肝脏细胞的解毒功能与合成、调节功能结合起来。

可以配制肝细胞以用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以促进体内或体外/离体的去分化。可以结合额外的因子，如生长因子、诱导分化或去分化的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎药、回归因子、促进神经支配、血管化或增强淋巴网络的生物活性化合物、以及药物。

在一些实施方案中，细胞设置有支持结构或者结合至支持结构上或中。支持结构可以是网状物、固体支持物、构架、管、多孔结构、和/或水凝胶。支持结构可以是整体或部分可生物降解的或生物不可降解的。支持物可以由天然或合成的聚合物、金属如钛、骨骼或羟磷灰石、或陶瓷形成。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、多糖、和糖胺聚糖。合成的聚合物包括聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸、和它们的共聚物，聚羟基链烷酸酯如聚羟基丁酸酯，聚原酸酯，聚酐，聚氨酯，聚碳酸酯，和聚酯。这些可以是植入物、管、网状物、或水凝胶的形式。支持结构可以是疏松的编织或非编织网状物，其中细胞接种在网状物中并且接种至网状物上。结构可以包括固体结构支持物。支持物可以是管，例如用于神经轴突的再生长的神经管。支持物可以是支架或阀。支持物可以是关节假体如膝盖或臀部，或其一部分，其具有允许细胞向内生长和/或j细胞接种至多孔结构中的多孔界面。许多其他类型的支持结构也是可行的。例如，支持结构可以由海绵、泡沫、珊瑚、或具有内部孔的生物相容性无机结构形成，或者可以是交错编织的聚合物纤维的网片。这些支持结构可以使用已知方法制备。

支持结构可以是具有定形并且支持水凝胶-细胞混合物孔状腔或空隙的可透过结构。例如，支持结构可以是多孔聚合物网状物、天然或合成的海绵、或由金属或如骨骼或羟磷灰石的材料形成的支持结构。支持结构的孔隙率应当使得营养物质可以扩散至结构中，从而有效地到达细胞内部，并且由细胞产生的废产物可以从结构中扩散出来。

可以使支持结构定形以符合其中需要新组织的空间。例如，可以使支持结构成形以符合已经被烧伤的皮肤的区域或已经丧失软骨或骨骼的部分的形状。根据制造其的材料，可以通过切除、模制、浇铸、或任何产生希望的形状的其他方法使支持结构成形。如以下描述的，可以在将支持结构用细胞接种或用水凝胶-细胞混合物填充之前或之后使支持物成形。

适合的聚合物的实例是聚半乳糖结合蛋白(polyglactin)，其为乙交酯和丙交酯的90∶10共聚物，并且作为VICRYL^TM编织的可吸收缝合线制造(Ethicon Co.，Somerville，N.J.)。可以将聚合物纤维(如VICRYL^TM)编织或压缩为毡状聚合物片，其之后可以被切成任何希望的形状。备选地，可以将聚合物纤维在将它们浇铸为支持结构所需的形状的模具中压缩在一起。在一些情况中，可以将额外的聚合物在它们模制时加入至聚合物纤维中，以为纤维网状物修正或赋予额外结构。例如，可以将聚乳酸溶液加入至这种聚乙醇酸纤维网状物片中，并且可以将该组合模制在一起以形成多孔支持结构。聚乳酸与聚乙醇酸纤维的交联物结合，从而涂布这些个体纤维并且固定模制的纤维的形状。聚乳酸还填充在纤维之间的空间中。因此，孔隙率可以根据引入至支持物中的聚乳酸的量而变化。将纤维网状物模制为希望的形状所需的压力可以是非常适中的。全部所需的是，将纤维固定在足够长的位置以实现聚乳酸的结合和涂布作用。

备选地，或此外，支持结构可以包括通过在本领域中已知的技术制备的其他类型的聚合物纤维或聚合物结构。例如，可以通过将溶剂从聚合物溶液中蒸发而得到细聚合物膜。如果将聚合物溶液从具有希望形状的凸纹图案(relief pattern)的模具中蒸发，可以将这些膜铸造为希望的形状。也可以使用在本领域中已知的压缩成型技术将聚合物凝胶模制为细的、可透过聚合物结构。在另一个实施方案中，将细胞与水凝胶混合以形成细胞-水凝胶混合物。可以通过注射或导管、或在植入其他支持结构时施用水凝胶。可以在施用之前、期间、或之后进行交联。

V.试剂盒

提供包含在本文中所公开的诱导剂的试剂盒。诱导剂是如上所述的。这些可以是具有限定浓度的形式以促进向细胞培养基中的添加，从而产生希望的浓度。试剂盒可以包括希望的浓度范围和施用时间的说明。试剂盒还可以包含用于培养细胞的与诱导剂预混合的细胞培养基。

参照以下非限制性实例，将会进一步理解本发明。

实施例

实验方法

1诱导多能干细胞hiPSCs细胞向肝脏细胞分化

1)诱导人多能干细胞向内胚层细胞(DE)的分化

(a)第1天：RPMI1640培养基添加无血清添加物B27(1∶50)，100ng/ml Activin A，0.5ng/ml BMP4以及10ng/ml bFGF，20ng/ml Wnt3a

(b)第2-3天：RPMI1640培养基添加无血清添加物B27(1∶50)，100ng/ml ActivinA，0.5ng/ml BMP4以及10ng/ml bFGF

2)诱导内胚层细胞向肝母细胞(Hepatoblast，HB)的分化

(a)第4-5天，RPMI1640培养基添加无血清添加物B27(1∶50)，20ng/ml KGF以及5uMSB431542，培养两天

(b)第6-8天，RPMI1640培养基添加无血清添加物B27(1∶50)，20ng/ml KGF，20ng/ml BMP4，10ng/ml BMP2以及10ng/ml bFGF

3)诱导肝母细胞向肝脏前体细胞分化和扩增(参加图30)

DMEM/F12以及William′E培养基1∶1混合，添加无血清添加物B27(1∶50)，10uMForskolin，5uM SB431542，20ng/ml EGF，3uM CHIR99021，5uM LPA，0.5uM S1P，1uM DEX。

4)诱导肝脏前体细胞向成熟肝脏实质细胞(Mature Hepatocyte，MH)分化2-3周

肝脏细胞成熟培养基：William′E培养基添加无血清添加物B27(1∶50)，50uMForskolin，10uM SB431542，2uM DEX，GlutaMax(1∶100)。

2肝细胞的大规模培养及悬浮培养(参见图31)

(1)细胞的大规模扩增起始细胞量约为1×10⁷细胞，培养于T75培养瓶中。细胞进行稳定的传代培养，传代比例为1∶2-1∶3。

(2)细胞扩增至12个T75培养瓶后，传代至T225培养瓶中继续培养。

(3)细胞扩增至12个T225培养瓶后，传代至5层细胞工厂中继续培养。

(4)将两个5层细胞工厂的细胞消化下来并计数，约1×10⁹细胞转移至磁力搅拌式细胞培养瓶中进行培养，对应培养基量约为1-1.5L，转速为60rpm。

(5)细胞每天进行换液培养，扩增培养基培养3-5天至细胞克隆形成后切换至成熟培养基中继续培养2-3周，直至细胞功能成熟。

3小型猪肝脏功能衰竭诱导及生物人工肝治疗方法

在生物人工肝治疗前一天，在所有组中的猪静脉内注射D-gal(0.4g/kg)[159]，并收集原点血液样品。通过静脉注射异丙酚(10mg/kg/h)使小猪处于持续麻醉状态，在猪的颈内静脉置入导管，并将导管另一端连接至生物人工肝装置。治疗后每天采集小猪全血样品，直至治疗后7天完成检测。

实验结果

诱导多能干细胞向肝脏谱系的分化

1诱导多能干细胞向肝前体细胞的分化

模拟胚胎在体内的发育路径及相关信号通路，参照实验室前期工作基础，本文以人诱导多能干细胞hiPSC为起始细胞，首先获得肝母细胞。hiPSC细胞向肝母细胞的分化主要分为三部分：首先是诱导hiPSC向内胚层命运分化。高浓度的Activin A可有效诱导hiPSC向内胚层命运进行转变。实验结果表明，100ng/ml Activin A+0.5ng/ml BMP4+10ng/mlbFGF+20ng/ml Wnt3a可在第一天诱导hiPSC细胞分化至Primitive Streak阶段，并抑制细胞走向外胚层命运。细胞在100ng/ml Activin A+0.5ng/ml BMP4+10ng/ml bFGF继续培养三天可有效分化为内胚层细胞，并抑制其走向中胚层命运。进一步诱导内胚层细胞向前肠进行分化，20ng/ml KGF+5uM SB431542可诱导前肠的形成。诱导的前肠阶段细胞继而在20ng/ml KGF+20ng/ml BMP4+10ng/ml BMP2+10ng/ml bFGF的条件中培养三天，分化为肝母细胞(图1)。

通过免疫荧光染色对诱导分化的肝母细胞进行蛋白水平检测。染色结果表明，分化的肝母细胞表达肝脏前体细胞的重要标志蛋白AFP和SOX9，同时也表达细胞增殖相关蛋白Ki67，但不表达白蛋白ALB(图2.)。

将肝母细胞切至肝前体细胞的扩增条件，肝母细胞可以继续扩增，分化为具有自我更新能力的肝前体细胞。免疫荧光检测结果显示，诱导形成的肝脏前体克隆呈上皮细胞克隆形态，并且表达肝脏前体细胞的重要标志基因AFP和ALB(图3)。

细胞表现为扩增上皮细胞形态，双阳性细胞的比例可达90％以上(图4)。

我们首先对获得的肝脏前体细胞的性质进行了鉴定，包括mRNA水平的检测和蛋白水平的检测。QPCR检测结果显示，hiPSC细胞来源的肝脏前体细胞表达AFP、DLK1等相关基因和HNF1B、FOXA2等转录因子。以hiPSC细胞作为阴性对照，胎肝细胞作为阳性对照，检测结果表明，hHPC细胞的基因表达与胎肝细胞处于相同水平，与hiPSC细胞则存在明显差异(图5.)。其中hiPSC为iPS细胞对照，FHH为胎肝细胞对照，hHPC分别对应不同三株hiPSC分化来源的肝脏前体细胞。

在此基础上采用免疫荧光染色的方法对细胞蛋白水平的表达进行检测。免疫荧光染色结果与QPCR检测结果基本一致，hiPSC细胞来源的肝脏前体细胞表达肝脏前体细胞的重要标志基因AFP、CK19和HNF1B(图6.)，具有肝脏前体属性。

对细胞性质的初步检测结果显示，细胞表达肝脏前体的标志基因，具有肝脏前体细胞的属性。为更全面了解分化细胞的基因表达情况，我们提取RNA样品送样检测并进行RNASeq测序及数据分析。RNASeq测序样品中hiPSC 1和2为两株不同的hiPSC细胞系，hHPC1-3为三株不同的hiPSC分化来源肝脏前体细胞系，FHH 1和2为两株不同的胎肝细胞系。测序结果显示，hHPC的基因表达情况与FHH更为相近，表达肝脏前体阶段相关的特异性基因；与hiPSC差异相对明显，不表达干性基因(图7)。上述结果说明hiPSC细胞在分化过程中逐渐走向肝脏细胞命运，并获得与胎肝细胞接近的肝脏前体细胞。

hiPSC细胞来源的肝脏前体细胞在体外具有长期传代扩增的能力。以1×10⁶为起始细胞，记录每次传代时的细胞总数和传代时间，绘制细胞扩增曲线。统计结果显示，肝脏前体细胞在P5-P9代和P20-P24代的扩增速度基本维持稳定(图8)。

后续对于不同代数细胞内肝脏前体细胞相关基因进行mRNA表达的检测。选择hiPSC细胞作为阴性对照，FHH细胞作为阳性对照。QPCR检测结果显示，肝脏前体细胞的重要标志基因在细胞传代过程中(P5代、P15代、P25代)未见显著性差异(图9)，说明细胞传代过程中早代细胞和晚代细胞的肝脏前体属性得以维持。

此外，我们对细胞进行了冻存复苏操作，实验结果表明，细胞复苏后的形态与冻存前细胞形态未见显著性差异，且肝脏前体细胞相关的标志基因的mRNA水平检测未见显著性变化(图10)。上述结果表明hiPSC细胞来源的肝脏前体细胞可以进行冻存和复苏，为后续大量制备种子细胞、建立种子细胞库提供了便利。

2肝脏前体细胞分化为成熟肝脏细胞

以hiPSC细胞作为起始细胞并通过细胞分化获得肝脏前体细胞，可在体外进一步诱导成为功能成熟的肝脏细胞。诱导分化的肝脏细胞形态与成体肝脏细胞体现出极强的相似性，细胞核清晰，细胞边界明显，呈多边形状(图11)。

细胞mRNA水平检测结果显示，细胞表达肝脏细胞的关键转录因子，并且与原代肝脏细胞处于相同水平(图12)，说明细胞具有成体肝脏细胞的某些属性。

细胞成熟过程中mRNA水平检测结果显示，肝脏前体细胞的重要标志基因AFP在培养21天左右下调至与成体肝脏细胞相近水平，标志着细胞走向成熟肝脏细胞的命运(图13)。而ELISA检测结果显示，细胞成熟过程中白蛋白的分泌未受显著影响，表明细胞的肝脏属性在一定程度维持稳定(图13)。

在确定肝脏前体细胞成熟条件的基础上，我们对分化来源的肝脏细胞进行了全面的细胞功能鉴定与分析。PAS染色结果显示细胞具有可以合成糖原，免疫荧光检测显示细胞可以合成分泌白蛋白和关键的药物代谢相关CYP450代谢酶CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4(图14)。

细胞mRNA水平检测主要分为三部分：药物代谢相关基因(图15)和生物合成相关基因，包括尿素合成相关基因以及凝血因子(图15)。选取hiPSC细胞作为阴性对照、原代成体肝脏细胞PHH作为阳性对照，hMH分别对应不同三株hiPSC分化来源的成熟肝脏细胞。QPCR检测结果显示，hiPSC细胞分化来源肝脏细胞与原代肝脏细胞的基因表达处于同一水平，与hiPSC细胞体现较大差异，具有成熟肝脏细胞的功能。

在mRNA水平检测的基础上，我们采用Bethy公司的试剂盒在蛋白水平对白蛋白的分泌情况进行了进一步检测和比较。检测结果显示，细胞白蛋白的分泌能力与原代肝脏细胞处于相同水平，与肝癌细胞HepG2具有显著差异，而hiPSC细胞基本不分泌白蛋白(图16)。继续采用ELISA对尿素的合成情况进行检测，结果与白蛋白一致。该结果进一步证明细胞具有成熟肝脏细胞所具有的功能。

RNASeq测序从细干性相关基因表达、肝脏转录因子表达、糖原合成相关基因表达、药物代谢相关基因表达等六个模块进行分析，分析结果显示，人多能干细胞分化来源的成熟肝脏细胞的基因表达情况与原代肝脏细胞更为相近，表达肝脏细胞功能模块相关的基因；与hiPSC差异明显，不表达干性基因(图17)，说明分化细胞具有成熟肝脏细胞的基因表达谱。

3.前体细胞的大规模培养及3D体系成熟

生物人工肝体系对于种子细胞有如下的需求：一方面是细胞量的问题。生物人工肝体系需要大量的细胞以满足治疗需求，小型猪模型肝脏功能衰竭治疗实验所需细胞量约为1×10⁹-1×10¹⁰，人肝脏功能衰竭治疗所需细胞量约为1×10¹⁰-1×10¹²，这就要求我们可以在有限的体积中培养大量的细胞，实现细胞的高密度培养。生物人工肝体系所需具体细胞量主要取决于治疗样本的肝脏大小和种子细胞的功能优劣。

另一方面是细胞与生物反应器设备对接的问题。出于治疗的便捷性考虑，首先要求细胞便于携带和运输，相对容易转移至生物反应器中；其次要求细胞在转移过程和治疗过程的高速灌流培养中细胞存活状态和功能水平相对维持稳定。考虑到由于2D培养体系贴壁细胞要经过消化过程后直接转入反应器中，可能影响细胞存活状态，并且在灌流体系中细胞的贴壁情况难以维持，以此我们更倾向于采用3D培养体系与生物人工肝体系进行对接。

综上所述，我们摸索并建立了如下的细胞培养体系(图18)

细胞的培养体系主要分为两部分：第一步即细胞在细胞工厂进行2D体系的传代扩增过程。以1×10⁷作为起始细胞量，在预先已包被Matrigel基质胶的T75培养瓶或T225培养瓶中进行稳定连续的细胞传代，传代比例约1∶2-1∶3，传代频率约2-3天。约15-20天左右细胞可扩增至1×10⁸量级，并转移至细胞工厂中进行继续扩增，至1×10⁹量级，并准备转移至转瓶中进行功能成熟。

第二步即细胞在转瓶中进行3D体系的搅拌式培养和成熟。将1×10⁹细胞从细胞工厂中消化下来，单细胞悬液转移至转瓶中进行3D体系搅拌式培养。培养体系为1-1.5L，搅拌速度为60rpm/min，每天更换培养基(DMEM/F12以及William′E培养基1∶1混合，添加无血清添加物B27(1∶50)，10uM Forskolin，5uM SB431542，20ng/ml EGF，3uM CHIR99021，5uMLPA，0.5uM S1P，1uM DEX)。3天后可见细胞形成大小一致、边界圆滑的克隆，并切换至成熟培养基中。继续在肝脏前体细胞成熟培养基中培养21天，可观察到细胞克隆状态良好，并且能够合成肝脏细胞功能相关的蛋白ALB和CYP3A4(图19)，初步具有成熟肝脏细胞所具有的属性。为对悬浮培养的细胞肝脏属性进行鉴定，我们首先在mRNA水平对细胞肝脏相关转录因子表达的情况进行了鉴定。结果表明，细胞表达肝脏相关的转录因子，并与原代肝脏细胞处于相近的水平，具有成熟肝脏细胞的属性(图20)。

由于生物人工肝治疗的需求，我们进一步检测细胞与肝脏属性相关基因的mRNA水平的表达情况。检测结果显示，这些基因的表达同样与原代肝脏细胞处于相近的水平，符合临床应用的要求(图21)。

细胞mRNA水平功能相关基因检测主要分为三部分：药物代谢相关基因(图22)和生物合成相关基因，包括尿素合成相关基因以及凝血因子(图23)。选取hiPSC细胞作为阴性对照、原代成体肝脏细胞PHH作为阳性对照，3D-hMH分别对应不同三株hiPSC分化来源的成熟肝脏细胞。QPCR检测结果显示，hiPSC细胞分化来源肝脏细胞与原代肝脏细胞的基因表达处于同一水平，与hiPSC细胞体现较大差异，具有成熟肝脏细胞的功能。

在mRNA水平检测的基础上，我们继续通过ELISA的方法对hiPSC细胞分化来源的、3D体系中成熟的肝脏细胞白蛋白的分泌能力和尿素的合成能力进行检测和比较。检测结果显示，分化细胞白蛋白的分泌能力和尿素的合成能力与原代肝脏细胞处于相同水平，与肝癌细胞系HepG2具有显著差异，而hiPSC细胞基本不分泌白蛋白也不具有尿素代谢的相关功能(图24)。

4急性肝脏功能衰竭小型猪模型的生物人工肝治疗

基于细胞大规模培养体积的建立，我们将hiPSC细胞分化来源的细胞转入生物人工肝设备，用于急性肝脏功能衰竭小型猪模型的治疗实验。小型猪的急性肝脏功能衰竭模型建立采用0.4-0.45g/kg D-氨基半乳糖(D-gal)进行诱导急性肝脏功能衰竭的诱导，绝大部分小型猪的存活时间约为2天。

在第0天对小型猪注射0.4g/kg D-gal进行急性肝衰竭诱导。诱导后第1天治疗组小型猪进行生物人工肝治疗，细胞量约为1×10⁹细胞，体外循环时间为4小时；对照组小型猪不进行处理。从造模前即开始每天对小猪进行取血检测肝脏衰竭的各项功能指标，至治疗后第7天或至小猪死亡停止样品采集。若小猪存活时间超过7天，则认为小型猪存活(图25)。

我们共选择12只小型猪进行急性肝损伤模型的建立，随机选取6只进行生物人工肝系统的治疗，余下6只作为对照不进行任何治疗。结果表明，经过生物人工肝治疗的小型猪均存活7天以上，而未经治疗的小型猪均在4天内死亡(图26)。

注射D-gal后的第2天，小型猪表现肝脏功能衰竭的症状，精神萎靡不振。经过生物人工肝系统治疗，小型猪次日清晨已经可以站立，精神状态良好；未经治疗的对照组小型猪精神状态未见缓解，并呈现濒死状态(图27)。

对生物人工肝治疗组和急性肝脏功能衰竭对照组的各6只小型猪持续采血并进行肝脏相关血清生化指标的检测，实验选取谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血氨(Ammonia)、直接胆红素(DBIL)、凝血时间(PT)和白蛋白(Albumin)作为检测指标。检测结果显示，两组的小型猪都在诱导衰竭的第一天出现肝脏衰竭相关指标的明显上调，治疗组的小型猪指标在生物人工肝治疗后逐渐下降，至第7天达到与原点相一致的水平；对照组的小型猪指标持续增高或稳定在较高水平。治疗组小型猪血清生化指标检测持续检测至第7天，而对照组持续检测至第4天全部6只小型猪死亡(图28)。该结果表明，生物人工肝系统可有效降低肝脏功能衰竭小型猪的肝脏衰竭指标，缓解小猪的肝脏损伤程度，有效维持小猪的存活。

我们后续取小型猪的肝脏组织，切片并进行HE染色，观察小型猪肝脏的损伤情况。生物人工肝治疗组的小型猪于第7天取样，急性肝脏功能衰竭对照组的小型猪于小猪死亡后取样(第2-4天)。HE染色结果显示，治疗组的小猪肝脏状态良好，未见明显空泡样结构，肝脏再生情况良好；对照组的小猪肝脏状态不佳，可见大量由于肝脏细胞坏死而产生的空泡样结构，肝脏组织损伤严重(图29)。该结果表明，生物人工肝治疗可有效缓解肝衰症状，促进肝脏的再生过程。

Claims

(1)Activin A，

(2)BMP信号转导途径调节物，

(3)FGF信号转导途径调节物，

(4)Wnt信号途径调节物，

(5)生长因子，

(6)TGFβ受体/ALK5抑制剂。

2.权利要求1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其还包含下述一种或多种诱导剂：

(7)GSK-3β抑制剂，

(8)cAMP激动剂，和/或

(9)核受体配体，

3.权利要求1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中：

4.权利要求2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中：

所述(7)GSK-3β抑制剂包括CHIR99021，TD114-2，BIO，Kenpaullone，TWS119，CBM1078，SB216763，3F8(TOCRIS)，AR-A014418，FRATide，Indirubin-3′-oxime，L803中的一种或多种；

5.权利要求1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中所述诱导剂以诱导细胞表达标志蛋白AFP、SOX9、Ki67的量存在。

6.权利要求2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，其中所述诱导剂以诱导细胞表达标志蛋白AFP和ALB的量存在。

7.一种用于从多能干细胞诱导产生肝脏细胞的方法，所述方法包括使多能干细胞与权利要求1-6任一项所述的试剂盒或细胞培养基组合物接触以从所述多能干细胞诱导产生肝脏细胞。

8.权利要求7所述的方法，其中将所述多能干细胞与权利要求1所述的试剂盒或细胞培养基组合物接触，以从所述多能干细胞诱导产生肝母细胞。

9.权利要求8所述的方法，其中将所述肝母细胞进一步与权利要求2所述的诱导剂接触，以诱导产生肝脏细胞。

10.一种通过权利要求7-9任一项所述的方法得到的肝脏细胞，含有所述肝脏细胞的人工肝装置和/或所述肝脏细胞用于制备人工肝装置的用途，例如用于治疗肝病，如需要进行细胞灌流的肝病，如肝衰竭，如急性肝衰竭。

12.权利要求11所述的方法，其中步骤2)包括将约1×10⁹细胞从细胞工厂中消化，单细胞悬液转移至转瓶中进行3D体系搅拌式培养。

13.权利要求11或12所述的方法，其中步骤1)中传代比例约1∶2-1∶3，传代频率约2-3天。

14.权利要求11-13任一项所述的方法，其中步骤2)培养基量约为1-1.5L，转速约为60rpm，细胞每天进行换液培养，直至细胞功能成熟，例如合成肝脏细胞功能蛋白ALB和/或CYP3A4。

15.权利要求11-14任一项所述的方法，其中所述肝脏前体细胞来源于多能干细胞，例如诱导多能干细胞，例如通过权利要求1-6任一项所述的试剂盒或细胞培养基组合物或权利要求7-9任一项所述的方法诱导产生的肝脏前体细胞。