JP2015500630A - ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞の製造方法:
(i)ヒト多能性幹細胞を、GSK-3β阻害剤、又はGSK-3β阻害剤とレチノイン酸誘導体とを含む培地で培養する工程;及び、
(ii)工程(i)において得られた細胞を、レチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程。
(2)前記GSK-3β阻害剤が、CHIR99021である、(1)に記載の方法。
(3)前記レチノイン酸誘導体が、AM580又はTTNPBである、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞又はヒトES細胞である、(1)〜(3)のいずれか1に記載の方法。
(5)前記中間中胚葉細胞がOSR1陽性細胞である、(1)〜(4)のいずれか1に記載の方法。
(6)前記工程(i)において、前記ヒト多能性幹細胞を単一細胞へ解離させることを含む、(1)〜(5)のいずれか1に記載の方法。
(7)前記工程(i)において使用する培地がROCK阻害剤をさらに含む、(6)に記載の方法。
(8)前記ROCK阻害剤がY-27632である、(7)に記載の方法。
(9)前記工程(i)の培養期間が2日以下であり、且つ、前記工程(ii)の培養期間が3日以上である、(1)〜(8)のいずれか1に記載の方法。
(10)前記工程(i)の培養期間が2日間であり、且つ、前記工程(ii)の培養期間が8日間である、(9)に記載の方法。
(11)GSK-3β阻害剤及びレチノイン酸誘導体を含むヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を製造するためのキット。
(12)前記GSK-3β阻害剤が、CHIR99021である、(11)に記載のキット。
(13)前記レチノイン酸誘導体が、AM580又はTTNPBである、(11)又は(12)に記載のキット。
(14)ヒト多能性幹細胞のための細胞解離試薬をさらに含む、(11)〜(13)のいずれか1に記載のキット。
(15)ROCK阻害剤をさらに含む、(11)〜(14)のいずれか1に記載のキット。
(16)前記ROCK阻害剤が、Y-27632である、(15)に記載のキット。
(17)(1)〜(10)のいずれか1に記載の方法でヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞へ分化誘導することを含む、後腎細胞の製造方法。
(18)前記後腎細胞が、後腎間葉細胞、後腎間質細胞、尿管芽細胞ポドサイト及び近位尿細管細胞から成る群より選択される、(17)に記載の方法。
(19)前記中間中胚葉細胞を、Wnt3a及びBMP7を含む培地で培養する工程をさらに含む、(17)又は(18)に記載の方法。
(20)(1)〜(10)のいずれか1に記載の方法で製造された中間中胚葉細胞から成るスフェアを形成する工程を含む、腎細管細胞で構成された管腔構造の製造方法。
(21)中間中胚葉細胞を後腎細胞と共に培養する工程を含む、腎細管細胞で構成された管腔構造の製造方法であって、前記中間中胚葉細胞は、(1)〜(10)のいずれか1に記載の方法で製造されたものである、前記方法。
(22)前記後腎細胞がE11.5のマウス胚から得られたものである、(21)に記載の方法。
1. シンプルな誘導法であり、煩雑さが少ない;
2. AM580やTTNPB等のレチノイン酸誘導体はレチノイン酸の核内受容体(RAR)を活性化させ、レチノイン酸経路を介し効果を発揮すると考えられるが、同様の効果のある全トランスレチノイン酸(ATRA)と比べて化合物の活性が強く、低濃度でも効果を発揮できる;
3. ATRAと比べて細胞毒性が弱いため、AM580やTTNPB等のレチノイン酸誘導体を高濃度で使用することで、中間中胚葉細胞への分化誘導効果をさらに強く発揮できる;
4. RARは、3種類のサブタイプ(例えば、α、β及びγ)を有し、AM580やTTNPB等のレチノイン酸誘導体は中間中胚葉細胞への分化に関わるRARのサブタイプを選択的に活性化できるため、不必要なシグナルを排除することで副作用を防ぐことができる;
5. 下記の実施例で示す新誘導法3によれば、分化誘導日数を短縮できる。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、且つ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。このような多能性幹細胞には、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、及びiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
生殖幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。生殖幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である。胚性生殖細胞は、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入するか、又は薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNA及びタンパク質の発現レベルを上昇させることによって作製することができる。iPS細胞は、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106; 国際公開WO 2007/069666;及び国際公開WO 2010/068955)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子又はES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子若しくはその遺伝子産物であればよい。特に限定されないが、核初期化物質として例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Esrrb, Esrrg及びGlis1が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つ若しくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
融合幹細胞は、体細胞と卵子若しくはES細胞とを融合させることにより、融合させたES細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である(Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001; Cowan C.A. et al. Science. 2005, Aug. 26, 309(5739):1369-73)。
本発明によれば、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導に際して、以下の工程を含む方法を用いることができる:
(i)ヒト多能性幹細胞等の多能性幹細胞を、GSK-3β(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β)阻害剤、又はGSK-3β阻害剤とレチノイン酸誘導体とを含む培地で培養する工程(第1工程);及び、
(ii)工程(i)後に得られた細胞を、レチノイン酸誘導体を含む培地で培養する後続の工程(第2工程)。
倫理上の観点から、好ましい多能性幹細胞はiPS細胞である。
本工程では、前述のように得られたヒト多能性幹細胞を、任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは接着培養が採用される。ここで、ヒト多能性幹細胞の解離方法としては、例えば力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液(例えば、Accutase(TM)及びAccumax(TM)が挙げられる)又はコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液(これらは、本発明におけるヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬に相当する)を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液を用いて、ヒト多能性幹細胞を解離し、解離した細胞を力学的に細かく単一細胞へ分散する方法である。ここで、用いるヒト多能性幹細胞として、使用したディッシュに対して80%コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
本工程では、前述の第1工程で得られた浮遊培養後の細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ゼラチンである。
本発明において、さらに接着培養を継続することで、誘導された中間中胚葉細胞を後腎細胞へ分化誘導させてもよい。
一実施形態においては、上記の誘導された中間中胚葉細胞から成るスフェアを形成することにより、腎細管細胞で構成された管腔構造を製造することができる。
別の実施形態においては、上記の誘導された中間中胚葉細胞を、マウス胚に由来する後腎細胞と共に培養することにより、腎細管細胞で構成された管腔構造を製造することができる。
本発明は、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を分化誘導するためのキットを提供する。本キットには、上述した分化誘導に用いる化合物、培養液、解離溶液(ヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬を含む)、及び培養皿のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
本発明は、上述した分化誘導法によって作製された中間中胚葉細胞を提供する。中間中胚葉細胞は、OSR1、PAX2、WT1、EYA1及びSIX2などの中間中胚葉細胞のマーカーによって同定されうる。
本発明において提供される腎細管細胞で構成された管腔構造を、薬物スクリーニングアッセイ又は移植治療に使用することができる。
ヒトiPS細胞(201B7)は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した(Takahashi, K. et al., Cell. 131:861-872)。続いて、BACクローン(RP11-458J18)(BACPAC RESOURCES)のOSR1の開始コドンの下流へpRed/ET(Gene Bridges GmbH)を用いてGFP-PGK-Neoカセットを挿入し、OSR1-GFP BAC導入遺伝子を作製した。この作製した改変BACクローンを上述したヒトiPS細胞へ導入し、内在性のOSR1の発現と連動してGFPを発現するOSR1-GFPレポーターiPS細胞株を樹立した。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、SNL細胞(McMahon, A.P. and Bradley, A., (1990) Cell 62;1073-1085)をフィーダー細胞として用いて10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。該細胞にCTK溶液を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去し、Accutaseを加えてiPS細胞を単一細胞へ分散させた。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、SNL細胞(McMahon, A.P. and Bradley, A., (1990) Cell 62;1073-1085)をフィーダー細胞として用いて10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。該細胞にCTK溶液を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去し、Accutaseを加えてiPS細胞を単一細胞へ分散させた。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、SNL細胞(McMahon, A.P. and Bradley, A., (1990) Cell 62;1073-1085)をフィーダー細胞として用いて10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。該細胞にCTK溶液を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去し、Accutaseを加えてiPS細胞を単一細胞へ分散させた。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、実施例2に記載の方法と同様の方法で単一細胞へ解離させた。次いで、Glutamax、2%FBS及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地にiPS細胞を懸濁し、10μM Y-27632、3μM CHIR99021及び1μM TTNPBの組み合わせを添加した。続いて、0.1%ゼラチンでコーティングしたディッシュに上記細胞懸濁液を移し、2日間培養した。2日間の培養後、培地を除去し、培養物をPBSで洗浄後、2-メルカプトエタノール、Glutamax、10%KNOCKOUT SR、0.1mM MEM NEAA及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地へ1μM TTNPBを添加した培地で、iPS細胞をさらに3日間培養した(新誘導法3)。フローサイトメーターで得られた細胞からGFP陽性細胞を単離した後、当該GFP陽性細胞を、マトリゲル(BD)でコーティングしたディッシュに移し、10μM Y-27632、100 ng/ml BMP7、100 ng/ml Wnt3a、2-メルカプトエタノール、Glutamax、10%KNOCKOUT SR、0.1mM MEM NEAA及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地で8日間培養した。この時、3日に1度培地交換を行った。得られた細胞を、RT-PCR (図7A)及び免疫染色(図7B)で分析した。結果として、得られたOSR1陽性細胞を、後腎間葉、後腎間質又は尿管芽を含む腎臓前駆細胞にさらに分化させることができた。さらに、長期間の分化後、ポドサイト、近位尿細管、上皮、中腎輸管及び集合管等の、腎臓を構築する細胞又は発生プロセスで生じる細胞が存在した。OSR1陽性細胞が腎臓細胞への発生能を有することが確認された。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、実施例2に記載の方法と同様の方法で単一細胞へ分散させた。次いで、Glutamax、2%FBS及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地にiPS細胞を懸濁し、10μM Y-27632、3μM CHIR99021及び1μM TTNPBの組み合わせを添加した。続いて、0.1%ゼラチンでコーティングしたディッシュに上記細胞懸濁液を移し、2日間培養した。2日間の培養後、培地を除去し、培養物をPBSで洗浄後、2-メルカプトエタノール、Glutamax、10%KNOCKOUT SR、0.1mM MEM NEAA及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地へ1μM TTNPBを添加した培地で、iPS細胞をさらに3日間培養した(新誘導法3)。フローサイトメーターで得られた細胞からGFP陽性細胞を単離した後、1x105個のGFP陽性細胞を、低細胞接着プレート(PrimeSurface, Sumitomo Bakelite co.)に移し、10μM Y-27632、2-メルカプトエタノール、Glutamax、10%KNOCKOUT SR、0.1mM MEM NEAA及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地で浮遊培養し、細胞スフェアを形成させた。この時、3日に1度培地交換を行った。
上述のOSR1-GFPレポーターiPS細胞を、実施例2に記載の方法と同様の方法で単一細胞へ解離させた。次いで、Glutamax、2%FBS及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地にiPS細胞を懸濁し、10μM Y-27632、3μM CHIR99021及び1μM TTNPBの組み合わせを添加した。続いて、0.1%ゼラチンでコーティングしたディッシュに上記細胞懸濁液を移し、2日間培養した。2日間の培養後、培地を除去し、培養物をPBSで洗浄後、2-メルカプトエタノール、Glutamax、10%KNOCKOUT SR、0.1mM MEM NEAA及びPenStrepを含有するDMEM/F12培地へ1μM TTNPBを添加した培地で、iPS細胞をさらに3日間培養した(新誘導法3)。フローサイトメーターで得られた細胞からGFP陽性細胞を単離した後、1x104個のGFP陽性細胞を、低細胞接着プレート(PrimeSurface)上で、E11.5のマウス胚から得られた1x105個のマウス後腎細胞と混合した。次の日に、10μM Y-27632、10%FBS及びPenStrepを含有するImprove MEM培地で浮遊したIsoporeTMメンブレンフィルター(Merck Millipore)上に、細胞スフェアを移した。この時、3日に1度培地交換を行った。得られた細胞を、浮遊培養後7日間において免疫染色で分析した(図9)。器官との混合培養により、OSR1陽性細胞から分化した腎細管細胞で、管腔構造を構築できることが確認された。
Claims (22)
- 以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞の製造方法:
(i)ヒト多能性幹細胞を、GSK-3β阻害剤、又はGSK-3β阻害剤とレチノイン酸誘導体とを含む培地で培養する工程;及び、
(ii)工程(i)において得られた細胞を、レチノイン酸を含む培地で培養する工程。 - 前記GSK-3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項1に記載の方法。
- 前記レチノイン酸誘導体が、AM580又はTTNPBである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞又はヒトES細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記中間中胚葉細胞がOSR1陽性細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)において、前記ヒト多能性幹細胞を単一細胞へ解離させることを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)において使用する培地がROCK阻害剤をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記ROCK阻害剤がY-27632である、請求項7に記載の方法。
- 前記工程(i)の培養期間が2日以下であり、且つ、前記工程(ii)の培養期間が3日以上である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)の培養期間が2日間であり、且つ、前記工程(ii)の培養期間が8日間である、請求項9に記載の方法。
- GSK-3β阻害剤及びレチノイン酸誘導体を含むヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を製造するためのキット。
- 前記GSK-3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項11に記載のキット。
- 前記レチノイン酸誘導体が、AM580又はTTNPBである、請求項11又は12に記載のキット。
- ヒト多能性幹細胞のための細胞解離試薬をさらに含む、請求項11〜13のいずれか1項に記載のキット。
- ROCK阻害剤をさらに含む、請求項11〜14のいずれか1項に記載のキット。
- 前記ROCK阻害剤が、Y-27632である、請求項15に記載のキット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法でヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞へ分化誘導することを含む、後腎細胞の製造方法。
- 前記後腎細胞が、後腎間葉細胞、後腎間質細胞、尿管芽細胞ポドサイト及び近位尿細管細胞から成る群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記中間中胚葉細胞を、Wnt3a及びBMP7を含む培地で培養する工程をさらに含む、請求項17又は18に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法で製造された中間中胚葉細胞から成るスフェアを形成する工程を含む、腎細管細胞で構成された管腔構造の製造方法。
- 中間中胚葉細胞を後腎細胞と共に培養する工程を含む、腎細管細胞で構成された管腔構造の製造方法であって、前記中間中胚葉細胞は、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法で製造されたものである、前記方法。
- 前記後腎細胞がE11.5のマウス胚から得られたものである、請求項21に記載の方法。
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