JP6455729B2 - 多能性幹細胞からの腎臓誘導法 - Google Patents
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Description
(1) 哺乳動物由来の多能性幹細胞から(後腎)ネフロン前駆細胞である後腎間葉を分化誘導する方法であって、該方法が、以下の3つの工程、
(a)多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストおよび場合によりさらにBmpを含有する培地で培養する工程、
(b)前記胚様体を、Bmpおよび中濃度(濃度B)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、および
(c)前記胚様体を、Fgfおよび低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含むことを特徴とする分化誘導方法
(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)。
(2)前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストの濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも2倍(好ましくは少なくとも3倍)であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも2倍(好ましくは少なくとも3倍)である、前記(1)に記載の分化誘導方法。
(3) 前記工程(b)において、培地がさらにアクチビンを含む、前記(1)または(2)に記載の分化誘導方法。
(4) 前記工程(b)において、培地がさらにレチノイン酸を含む、前記(3)に記載の分化誘導方法。
(6) 前記Wntアゴニストが、CHIR99021、BIO、およびSB415286からなる群より選ばれる(ただし、各工程のWntアゴニストは同じであっても異なってもよい)、前記(5)に記載の分化誘導方法。
(7) 前記Bmpが、Bmpファミリーからなる群、好ましくはBmp2、Bmp4およびBmp7からなる群より選ばれる、かつ、前記Fgfが、Fgfファミリーからなる群、好ましくはFgf2、Fgf9およびFgf20からなる群より選ばれる、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の分化誘導方法。
(8) 前記BmpがBmp4であり、かつ前記FgfがFgf9である、前記(1)〜(7)のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
(9) 前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストが、CHIR99021であり、かつ、前記濃度Aが7.5μM〜15μM、前記濃度Cが0.5μM〜2.0μMである、前記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の分化誘導方法
(10) 前記工程(a)および(b)におけるBmpがBmp4であり、工程(a)における濃度が0.1ng/ml〜3ng/mlであり、工程(b)における濃度が1ng/ml〜10ng/mlである、前記(9)に記載の分化誘導方法。
(11) 前記工程(b)において、アクチビンを2.5〜40ng/mLの濃度で含む前記(10)に記載の分化誘導方法。
(12) 前記工程(a)、(b)および(c)が、連続した工程である前記(1)〜(11)のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
(13) 前記工程(c)において、培地が、Bmp、レチノイン酸またはアクチビンのいずれも含まない培地である、前記(1)〜(12)のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
(15) 前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、前記(14)に記載の分化誘導方法。
(16) 前記多能性幹細胞がマウスES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも1日以上4日以内培養する工程(ここで、好ましくは、少なくとも1回新鮮な培地に交換を行う)である前記(14)に記載の分化誘導方法。
(17) 前記多能性幹細胞がヒトES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも3日以上11日以内培養する工程(ここで、好ましくは、少なくとも2回新鮮な培地に交換を行う)である前記(14)に記載の分化誘導方法。
(18) 転写因子である、Osr1、Wt1、Pax2、Six2、Hoxa10、Hoxa11の全てを発現する細胞集団であることを特徴とする哺乳動物由来の多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞。
(19) 前記多能性幹細胞が、マウスES細胞またはiPS細胞、またはヒトES細胞またはiPS細胞である、前記(18)に記載のネフロン前駆細胞。
(20) 前記(1)〜(17)のいずれか一つに記載の分化誘導方法により誘導されたネフロン前駆細胞。
(21) 前記(18)〜(20)のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
(22) 前記方法が、ネフロン前駆細胞を気液界面にて胚脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することを含む、前記(21)に記載の三次元腎臓を作成する方法。
(23) 前記(21)または(22)に記載の方法により形成された、糸球体および尿管を有する三次元腎臓構造。
(24) 前記(18)〜(20)のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導されたCadherin6、Megalin、およびLTLを発現する細胞集団であることを特徴とする近位尿細管細胞。
(25) 前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、前記(24)に記載の近位尿細管細胞。
(26) 前記(18)〜(20)のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、E−cadherin、Brn1、およびNCCを発現する細胞集団であることを特徴とする遠位尿細管細胞。
(27) 前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、前記(26)に記載の遠位尿細管細胞。
(28) 前記(18)〜(20)のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、Wt1、Nephrin、およびPodocinを発現する細胞集団であることを特徴とする糸球体上皮細胞。
(29) 前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、前記(28)に記載の糸球体上皮細胞。
(30) 多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための分化誘導培地キットであって、該キットは、(i)分化誘導培地、および(ii)Wntアゴニストを含み、使用時において、前記Wntアゴニストを段階的濃度で含む少なくとも3つの分化誘導培地が調整される、ここで、前記段階的濃度は、少なくとも濃度A、BおよびCからなり、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である、
ことを特徴とする培地キット、培地キット。
(31) 前記Wntアゴニストの段階的濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍であるように分化誘導培地が調整される、前記(30)に記載の培地キット。
ES細胞は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に細胞株として樹立することができる。
iPS細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス繊維芽細胞を用いて、bFGF、KSR(ノックアウト血清代替物)、非必須アミノ酸、L−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM/F12培地やPrimate ES培地(リプロセル)を用いて維持することができる。
本発明を用いて哺乳動物由来の多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を分化誘導する場合、以下の3つの工程(a)〜(c)を、その順で含むことが必要である:工程(a)多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストおよび場合によりさらにBmpを含有する培地で培養する工程;工程(b)前記胚様体を、Bmpおよび中濃度(濃度B)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程;および工程(c)前記胚様体を、Fgfおよび低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程。
工程(a)および(b)で用いられるBmpは、Bmp1、Bmp2、Bmp4、Bmp6、Bmp7、Bmp8a、Bmp8bおよびBmp10等のBmpファミリーからなる群より選ばれ、好ましくは、Bmp2、Bmp4またはBmp7から選ばれ、さらに好ましくはBmp4である。
工程(c)で用いられるFgfは、Fgf2,9,20等のFgfファミリーから選ばれ、好ましくはFgf2、Fgf9またはFgf20から選ばれ、より好ましくはFgf9である。
工程(a)〜(c)で用いられるWntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。
本発明の方法は、これらの工程を、(a)、(b)、(c)の順で含み、必要に応じて各工程の間に別の工程を含むこともできるが、好ましくは、(a)、(b)および(c)を連続で含む。これらの工程が連続することにより、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を効率よく分化誘導できる。
本発明の分化誘導方法においては、特に好ましくは、上記工程(c)において、培地がBmp、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれも含まない培地である。
上記工程(a)により、後方中胚葉が誘導され、工程(b)により後方中間中胚葉が誘導され、そして工程(c)により後腎ネフロン前駆細胞(後腎間葉)が誘導される。
一方、ヒト多能性幹細胞を用いる場合は、これに限定されないが、好ましくはヒトiPS細胞を、Bmp4およびRock阻害剤(Y27632)で(必要に応じてさらにFgfを加えて)処理した細胞を用いて胚様体が調整され、さらに好ましくは、次いで、アクチビンおよびFgfで処理された胚様体が用いられる。培地中のBmp4の濃度は、例えば、0.3〜5ng/mL、好ましくは0.5〜2ng/mLをあげることができ、培地中のRock阻害剤(Y27632)の濃度は、例えば、1〜100ng/mL、好ましくは5〜20ng/mLをあげることができ、培地中のFgfの濃度は、例えば、0〜20ng/mL、をあげることができ、培地中のアクチビンの濃度は、例えば、0.1〜5ng/mL、好ましくは0.5〜1ng/mLをあげることができる。Bmp4およびRock阻害剤(Y27632)、Fgfでの処理は、例えば、1〜2日、好ましくは1日行い、アクチビンおよびFgfの処理は、例えば、1〜4日、好ましくは2日行うことができる。
例えばCHIR99021を用いた場合、これに限定されないが、工程(a)および(c)におけるWntアゴニストの濃度AおよびCの組み合わせとして、濃度Aは、6〜20μM、好ましくは7〜15μM、より好ましくは10μMから選ばれ、濃度Cは、0.5〜2μM、好ましくは0.7〜1.5μM、より好ましくは1μMから選ばれる組合せをあげることができる。また、例えばCHIR99021を用いた場合、これに限定されないが、工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストの濃度A、BおよびCの組み合わせとして、濃度Aは、6〜20μM、好ましくは7〜15μM、より好ましくは10μMから選ばれ、濃度Bは、2〜6μM、好ましくは2〜4.5μM、より好ましくは3μMから選ばれ、濃度Cは、0.5〜2μM、好ましくは0.7〜1.5μM、より好ましくは1μMから選ばれる組合せをあげることができる。
本発明で用いることができるWntアゴニストは、上記の定義に含まれる限り、天然物または合成物のいずれも含まれ、また、タンパク質、高分子、低分子のいずれであってもよい。本発明において用いることができるWntアゴニストの例としては、これに限定されないが、例えば、好ましくは、GSK−3阻害剤、より好ましくは、CHIR99021、BIO、またはSB415286をあげることができ、特に好ましくは、CHIR99021をあげることができる。各Wntアゴニストの使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できるが、例えば、CHIR99021を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を選択することができる。
好ましい態様において、工程(b)において用いられるアクチビンは、いずれの起源のアクチビンを用いることができるが好ましくはヒトアクチビンAである。また、培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、2.5〜40ng/mL、好ましくは7.5〜15ng/mLをあげることができる。
また、別の好ましい態様において、工程(b)において用いられるレチノイン酸の培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、0.001〜1μM、好ましくは0.01〜0.3μMをあげることができる。
マウスの多能性幹細胞を用いてネフロン前駆細胞を誘導する場合は、培養は、工程(a)は、例えば、1〜4日、好ましくは2日〜3日、特に好ましくは2.5日行い、工程(b)は、好ましくは0.5日〜2日、特に好ましくは1日行い、工程(c)は、例えば、0.5〜3日、好ましくは1日〜2.5日、特に好ましくは2日行うことができる。
一方、ヒトの多能性幹細胞を用いてネフロン前駆細胞を誘導する場合は、培養は、工程(a)は、例えば、3〜11日、好ましくは4日〜10日、特に好ましくは6日行い、工程(b)は、好ましくは1日〜3日、特に好ましくは2日行い、工程(c)は、例えば、1〜5日、好ましくは2日〜4日、特に好ましくは3日行う。
また、共培養後の各構成細胞の分取は、これに限定されないが、例えば、トリプシン等を用いた細胞解離処理後に各細胞特異的な膜たんぱく質(例えば、糸球体上皮細胞であればpodocalyxin、近位尿細管であればCadherin6、遠位尿細管であればEcadherin)を抗体染色し、FACS(フローサイトメーター)を用いて分取することが可能である。
(1)変異マウスの作成
GFPはエクソン2のAgeI部位に挿入し、Osr1のN末端12アミノ酸がGFPにインフレームで結合するようにした。5’Hpa1−AgeI Osr1ゲノム断片(2.8kb)をEGFPに結合し、そしてTakasatoら(Mech Dev 121, 547-557, 2004)の方法に従い、3’BamHI−BamHI断片(5.5kb)を、loxP部位に隣接したNeoおよびタンデムなDTAを含むベクターに挿入した。標的ベクターをE14.1ES細胞にエレクトロポレーションし、次いで、3つの480G418耐性クローンを、BamHIで消化した後、5’プローブを用いたサザンブロット分析により、標的として決定した。正しく標的とされたESクローンを、C57BL/6J雌マウスと交配する生殖系列キメラを作成するために使用した。Neoを、Osr1−GFP変異マウスと遍在的にCreを発現するマウスとを交配させることにより取り除くと、表現型およびEGFP発現パターンは、元の変異マウスのものと同一であった。子孫の遺伝子型分析は、フォワードプライマー、5’−TATGTTGAGGGGGCAGTAGGTTC−3’、2つのリバースプライマー、5’−GTTGGGCAGGTGGTCCGAGGGCA−3’および5’−TAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGT−3’を用いたPCRによって行い、野性型アレルのための320塩基対の産物および変異アレルのための420bpの産物を製造した。TnEGFP-CreERT2/+(Acc. No. CDB0604K: http:// www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)、Wt1tm1(EGFP/cre)Wtpマウス、Six2tm3(EGFP/cre/ERT2)Amcマウス、およびGt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hzeマウスは、Jackson Laboratory(米国)から購入した。全ての動物実験は、施設のガイドラインおよび倫理委員会に従って行った。
インビトロコロニー形成アッセイは、Osafuneら(非特許文献4:Development 133, 151-161, 2006)の記載に従って行った。要約すれば、前駆細胞は、FACS Aria II(Becton Dickinson)を用いて選別し、Wnt4を安定に発現するNIH3T3細胞上に低密度(1,250-10,000細胞/ウェル、6ウェルプレート)で播種した。次いで、細胞を、5% ノックアウト血清代替物(Invitrogen)、10μg/mL インスリン、6.7μg/L 亜セレン酸ナトリウム、5.5μg/mL トランスフェリン、1×10-7mol/L デキサメタゾン、10mmol/L ニコチンアミド、2mmol/L L−グルタミン、50μM/L 2−メルカプトエタノール、5mmol/L HEPESおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM/F12で培養した。
検体は、10%ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して6μmの切片にカットした。免疫染色は、BlueMapまたはDABmapキットおよび自動Discovery System(Roche)を用いて自動的に行うか、または手動で免疫蛍光染色を行った。蛍光免疫組織化学のために、パラフィンで固定した切片を脱パラフィンした。クエン酸緩衝液(pH6.0)中で、5分間、121℃でオートクレーブして脱パラフィンした。室温で1時間、ブロッキング溶液中でインキュベートした後、切片を4℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした。次いで、Alexa Fluor 488、561、594、633または647と結合させた二次抗体とインキュベートした。核はDAPI(Roche)でカウンター染色した。凍結切片については、サンプルを4%パラホルムアルデヒドで固定し、最適切削温度(OCT)化合物(Tissue Tek)に包埋し、10μm厚の凍結切片とした。免疫染色のために、OCT化合物をPBSで3回洗浄することにより除去した後、切片をブロッキング溶液中でインキュベートした。以降の手順は、パラフィン切片を染色する場合と同じとした。
E8.5における胚組織培養物については、6−10体節期胚の前体節領域を採取し、T−GFP+細胞をFACSで選別した。選別した細胞を96ウェルの低細胞接着プレートに、凝集体あたり7,000細胞で凝集させて、無血清既知組成培地で培養した。E9.5での胚組織培養では、22から26体節期胚の23体節領域からの尾部領域を回収し、Osr1−GFP+またはWt1−GFP+細胞をFACSで選別した。選別された細胞を、96ウェルの低細胞接着プレート内に凝集体当たり10,000細胞で凝集させて、無血清既知組成培地で培養した
マウスES細胞(Osr1−GFP)を、15%ウシ胎児血清、0.1mMの2−メルカプトエタノール(ナカライテスク)および1,000U/mLの白血病抑制因子(ESGRO)を補充したDMEM(Invitrogen)中にてマウス胚性線維芽細胞上で維持した。EB3−DsRedの細胞は、丹羽仁史博士(理化学研究所CDB)から供与を受けた。EB3−DsRedの細胞は、Usuiら(Am J Pathol 180, 2417-2426, 2012)らの報告に従って維持した。分化を開始する前に、ES細胞を、15%ウシ胎児血清、0.1mM 2−メルカプトエタノール、1,000U/mL 白血病抑制因子、3μM CHIR99021(和光)および1μM PD0325901(和光)を補充したDMEM(Invitrogen)中にて、フィーダー細胞を含まないゼラチンコートディッシュ上で1代継代した。ES細胞の分化は、以下のようにして無血清培地中で行った。ES細胞は、Accutase(ESGRO)で解離し、75%のイスコフ改良ダルベッコ培地(Invitrogen)および25%のハムF12培地(Invitrogen)に、0.5×N2と0.5×B27(レチノイン酸なし)サプリメント(Invitrogen)、0.5×ペニシリン/ストレプトマイシン、0.05%ウシ血清アルブミン、2mM グルタミン(Invitrogen社)、0.5mM アスコルビン酸(シグマ)および4.5×10-4M 1−チオグリセロールを補充した無血清分化培地中で培養した。集めた細胞は、96ウェルの低細胞結合プレートで、凝集体あたり1,000細胞で凝集させ、胚様体(EBs)を形成した。48時間後(day2)、EBsをAccutaseで解離し、0.5ng/mL ヒトアクチビンA(R&D Systems)を加えた無血清分化培地で再凝集させた。24時間後(day3)、培地を、1ng/mL ヒトBmp4(R&D Systems)および10μM CHIR99021を含むBC10培地に切り替えた。36時間後(day4.5)、培地を新しい培地(BC10)に変えた。Day5.5で、培地を10ng/mL アクチビン、3ng/mL Bmp4、3μM CHIR99021および0.1μM レチノイン酸を含むABC3R培地に変更した。day6.5に、培地を、1μM CHIR99021および5ng/mL ヒトFgf9(R&D Systems)を含むC1F培地に変更した。
Kispertら(非特許文献8:Development 125, 4225-4234, 1998)とOsafuneら(非特許文献4:Development 133, 151-161, 2006)の報告に従い、マウス胚後腎間葉細胞または誘導したES細胞凝集体を、10%ウシ胎児血清を含むDMEMを用いて、ポリカーボネートフィルター(0.8μm、ワットマン)の上で、空気−液体界面で、E11.5またはE12.5胚から取った胚脊髄とともに、または3T3Wnt4細胞上で培養した。
胚組織またはES細胞から誘導された細胞凝集体を、5分間、0.25%トリプシンと共にインキュベーションすることによって分離した。正常マウス血清(Thermo Scientific)でブロッキングした後、細胞表面マーカー染色を1%ウシ血清アルブミン、1×HBSSおよび0.035% NaHCO3を含む緩衝液中で行った。データは、ソフトウェアFlowJo(Treestar)で分析した。
用いた抗体は以下のものである:ウサギ抗Pax2(Covance;1:800);フルオレセイン抗LTL(FL−1321;Vector Laboratories;1:100);ニワトリ抗GFP(Abcam;1:1000);ウサギ抗GFP(Invitrogen;1:400);ウサギ抗Itga8(Sigma;1:200);ウサギ抗Pdgfra(Cell Signaling Technology;1:500);マウス抗Pdgfra(Takakuraら、J Histochem Cytochem 45, 883-893, 1997)(1:500);ウサギ抗Wt1(Santa Cruz Biotechnology;1:200);マウス抗Wt1(Dako;1:100);ウサギ抗Six2(Proteintech;1:500);マウス抗Sall1(PPMX Perseus Proteomics;1:200);マウス抗E−cadherin(BD Biosciences;1:800);ウサギ抗Cdh6(Dr. Dressler(Choら、Development 125, 803-812, 1998)から供与;1:400);マウス抗Aqp1(Abcam;1:100);ウサギ抗Podocin(淺沼博士より供与(Lydiaら、 Am J Nephrol 35, 58-68., 2012);1:400);モルモット抗Nephrin(Progen;1:200);ウサギ抗CD31(Abcam;1:25);ラット抗CD34(Abcam;1:100);ウサギ抗DsRed(Clontech;1:100)。
RNAをRNeasy Plus Micro Kit(Qiagen)を用いて単離し、次にランダムプライマーおよびSuperscript III(Invitrogen)を用いて逆転写した。定量的PCRは、Real−Time PCR System(Applied Biosystems)およびThunderbird SYBR qPCR Mix(Toyobo)を用いて行った。すべてのサンプルは、相対標準曲線法を用いてβ−アクチンの発現により標準化した。
標本は、以下の7種類を比較した:E8.5胚のOsr1−GFP陽性および陰性細胞;E9.5胚の尾体幹のOsr1−GFP+/Itga8+/Pdgfra−集団、Osr1−GFP+(但しItga8+/Pdgfra−を除く)集団、およびOsr1−GFP陰性集団;E11.5にて手動操作で分離した後腎間葉のOsr1−GFP+/Itga8+/Pdgfra−集団およびOsr1−GFP+(Itga8+/Pdgfra−を除く)集団。マイクロアレイ分析は、Agilent SurePrint G3マウス遺伝子発現(8×60K)マイクロアレイを用いて行った。データは、GeneSpring GXソフトウェア(アジレント)によって標準化した。マイクロアレイデータは、Biotechnology Information Gene Expression Omnibus(GSE)のためにナショナルセンターに寄託した。
実施例1:コロニー形成前駆細胞を表すOsr1+/Integrina8+/Pdgfra-集団
後腎間葉は、転写因子Six2を発現する間葉を標識する工程を含む細胞運命分析によって示されるように、糸球体の上皮(足細胞を含む)とネフロンの主要部分を構成する細管を生じさせる。発明者らは以前、新規のコロニー形成アッセイを確立することによってネフロン前駆細胞の存在を証明した。Sall1を強発現する分離した後腎間葉系細胞を、Wnt4を安定に発現するフィーダー細胞上に播いた場合、コロニーを形成した単一の細胞群は、糸球体及び腎臓の尿細管マーカーを発現した(非特許文献9:Nishinakamuraら、Development 128, 3105-3115, 2001;非特許文献4:Osafuneら、Development 133, 151-161, 2006)。したがって、Sall1が高くSix2陽性の後腎間葉は、胚腎臓でネフロン前駆体集団を表す。
Osr1は、別の後腎間葉マーカーであり、また、中間中胚葉の最も早いマーカーの1つである。したがって、Osr1は、腎臓発生を通じて腎前駆体集団で連続的に発現される(非特許文献10:Jamesら、Development 133, 2995-3004, 2006;非特許文献1:Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008)。そこで、Osr1−GFPノックインマウスを作成し(図3)、緑色蛍光タンパク質(GFP)が、E8.5−E9.5の中間中胚葉で、そして、E11.5−E15.5の後腎間葉で発現することを確認した(図4A〜C)。
次に、ネフロン前駆細胞マーカーの発現、および初期段階のOsr1−GFP陽性細胞のコロニー形成能力を検討した。図5および表1に示すように、E8.5では、Itga8とGFPの重複は検出されず、GFP+集団によるコロニー形成もなかったが、E9.5では、GFP+集団によるコロニー形成が検出された(0.037±0.013%)。
また、Itga8+/Pdafra−であるGFP+領域を見つけ(図5)、そして、Osr1+/Itga8+/Pdgfra−集団を選別することにより、コロニー形成細胞を濃縮した(1.10±0.26%、図6、表2)。しかし濃縮後でさえ、コロニー形成頻度は、E10.5およびE11.5の後腎領域からのOsr1+/Itga8/Pdgfra−集団のそれより有意に低かった(それぞれ、30.9±1.5%及び50.9±5.2%、表2)。これとは対照的に、E10.5の中腎領域からのOsr1+/Itga8+/Pdgfra−集団のコロニー形成頻度(1.47±0.20%、表2)は、E9.5のそれと同じくらい低かった。後腎の前方に位置している中腎は、後腎より早く発展し、はるかに少ないネフロンを形成するので、E9.5でのコロニー形成細胞は、中腎ネフロン前駆細胞を表すかもしれないという仮説を立てた。
Osr1+/Itga8+/Pdgfra−であるコロニー形成が推定されるE9.5の中腎前駆細胞と、E10.5〜11.5の後腎ネフロン前駆細胞を用いて、マイクロアレイと定量PCR解析を行った。結果を図13と図14に示す。両方のタイプの前駆細胞が、例えば、Osr1、Wt1、Pax2およびSix2のような共通の転写因子、ならびにGdnf(腎臓発生に必須のサイトカイン)を発現している一方、後腎前駆細胞はHoxa10、Hoxa11およびHoxd12を含む尾部Hox遺伝子をより多く発現していた。E9.0前後で胚の後端で発現され始めるHox11ファミリー遺伝子は、中間中胚葉の前後軸に沿った後腎領域を決定づけることによって後腎の発達に不可欠であると報告されている。さらに、細胞運命マッピング研究により、E9.5のOsr1+中間中胚葉が後腎間葉に寄与していることが示されている。それゆえ、E9.5で後方に位置していた非コロニー形成Osr1+/尾部Hox+である中間中胚葉は、後腎ネフロン前駆細胞の前駆体集団となり得るという仮説を立てた(図15、図11および図13)。特に、E9.5の尾部中間中胚葉におけるPax2、Six2およびGdnfの発現レベルは、依然としてE10.5での尾部後腎前駆細胞に比べてはるかに低く、このことは、それらが異なっていることを示している(図13)。
したがって、1μM CHIRおよびFgf9の組み合わせ(C1F)は、尾部中間中胚葉から後腎ネフロン前駆細胞への誘導に最適であった。これらの観察結果は、後腎間葉の形成と維持のためのFgf受容体とFgf9/Fgf20がそれぞれ要求されることを示している先行文献と一致する(非特許文献11:Barakら、Dev Cell 22, 1191-1207., 2012、および非特許文献12:Poladiaら、Dev Biol 291, 325-339, 2006)。
次に、E9.5尾部中間中胚葉を用いて、早い段階の中胚葉を後腎間葉に分化させるインビトロでの方法で調べた。一つの報告では、中間中胚葉由来の後腎間葉と尿管芽の両方が、胎生(E)8.5前後で現れ、転写因子Osr1を発現することが示されている(非特許文献1:Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008)。他のいくつかの報告では、尿管芽は、前方中間中胚葉に由来し、そしてその原基であるウォルフ管は、前方から後方に向けて伸長することが、ニワトリ胚を直接標識することにより示されている(非特許文献13:Atsutaら、Dev Growth Differ 55, 579-590, 2013、非特許文献14:Attiaら、Development 139, 4143-4151, 2012、非特許文献15:Obara-Ishiharaら、Development 126, 1103-1108, 1999、非特許文献16:Saxen, Cell 131, 861-872, 1987)。マウス胚では、E8.5のPax2/8−陽性前中間中胚葉(前腎原基と呼ばれる)は、同等の集団と推定され、Osr1−陽性領域に含まれる。従って、最初に、選別されたE8.5のOsr1−GFP+細胞を用いて増殖因子の多くの組み合わせの効果を検討した。しかし、コロニー形成前駆細胞を誘導することができなかった。
以上をまとめると、図21に示されるように、後腎間葉の前駆体は、E8.5後の原腸形成の段階まで、T陽性状態に維持され後方化される。おそらくこれは、部分的には、尾体幹の供給源として最近認識された”体軸幹細胞(axial progenitor)”に対応すると考えられる。これらのデータはまた、後方に位置する後腎間葉組織および前方に位置する中胚葉組織、例えば心臓、の間の発生過程の違いを明らかにする。なお、これらの前方に位置する中胚葉組織は、分化初期における短期間のT陽性状態を経て多能性幹細胞からの誘導に成功している(非特許文献18:Burridge、Cell Stem Cell 10, 16-28, 2012)。
系統トレース実験に基づき、原料として選別したE8.5のT+尾部中胚葉を用いて、後腎ネフロン前駆細胞を誘導した。結果を図18に示す。選別した細胞は、再凝集させて凝集体を形成させて種々の成長因子で処理し、次いで上記のようにC1Fで処理した(図22C、工程3)。後方中間中胚葉は、Osr1、Wt1および尾部Hox遺伝子の発現によって識別されるので、まずこれらの遺伝子の発現に影響を与える可能性がある成長因子に注目した。BmpおよびWntシグナル伝達の相乗効果は、マウス胚性幹(ES)細胞分化における尾部Hox遺伝子の発現で報告されており、レチノイン酸シグナル伝達は、ゼブラフィッシュ発達におけるWt1同族の発現に重要であると報告されている。レチノイン酸、BmpおよびWntアゴニストの同時導入は、胚後腎間葉で観察されたレベルまで尾部Hox遺伝子を増加させなかった(図22DとE)ので、”後方化期”を追加した。すなわち、カノニカルなWntシグナルが体幹の伸長に重要であると報告されているので、Bmp4と組み合わせて、Wntアゴニストを高濃度(10μM CHIR)で添加した。この処理(BC10、ステップ1)は劇的に尾部Hox遺伝子の発現を増加させ、そして、腎臓遺伝子の発現レベルは胚後腎間葉に比べてまだ低かったが、誘導された細胞からのコロニー形成を検出することができた(図22DとG)。次に、様々な条件を試み、アクチビンとレチノイン酸の組み合わせを、Bmp4および3μM CHIRと一緒に用いること(ABC3R、ステップ2)が、腎臓遺伝子の発現を実質的に増加させることを見いだした(図22F)。この最適化された3段階の条件(BC10とそれに続くABC3RおよびC1F)で、細胞は、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれかの単独での添加に比べて、多数のコロニー(22.7±3.66%、n=4)を形成した(図22G)。最初の後方化工程において、標準的なWntアゴニストの濃度は極めて重要であり、レチノイン酸の添加は完全にコロニー形成前駆細胞誘導を阻害した(図23A)。第二工程において、アクチビン、レチノイン酸、Bmp、WntまたはFgfシグナリングのいずれかの阻害は、コロニー形成を減少させ(図23B)、このことは、これらのシグナルのすべてが必須であることを示唆している。
ES細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導を行った。ES細胞からの後腎間充織の誘導の全体の工程の概要を図1に示し、各段階におけるシグネチャー遺伝子の発現を図25に示す。中間中胚葉と後腎ネフロン前駆細胞の誘導を監視するために、上記したOsr1−GFPマウスから作成したOsr1−GFP ES細胞株を用いて、2日間、因子なしの無血清培地で培養して胚様体(EBs)を作成した。EBsを用いて、後腎ネフロン前駆細胞の作成を行った。次の24時間、低濃度のアクチビンを添加して、胚性外胚葉マーカーFgf5の一過性の発現を誘導した。EBsはその後、Bmp4と高濃度のCHIRで処理した(工程2)。4.5日では、尾部新生前駆体を表すT、ならびにCdx2およびTbx6の発現がアップレギュレートされた。その後、上記の胚後部中胚葉のためのプロトコルを完全に再現できた(図22C、および図1の工程3〜5)。day8.5に収穫した誘導されたEBsは、胚後腎間葉に匹敵するレベルで、後腎ネフロン前駆細胞に対する複数のシグネチャー遺伝子を発現していた(図25)。免疫染色の結果は、多くの細胞が、Osr1、Wt1、Pax2、Sall1およびSix2を含む典型的な腎性転写因子を共発現していることを示した(図26)。さらに、FACS分析の結果は、細胞の約90%近くがOsr1−GFP陽性であり、Osr1+細胞の中でItga8+/Pdgfra−前駆細胞は約65%を構成することを示した(図27)。これらの誘導された前駆細胞は、堅牢なコロニー形成を(21.3±1.69%、n=8)を示した。このことは、ES細胞から後腎ネフロン前駆細胞を生成することに成功したことを示している。
E11.5胚からの後腎間葉は、気液界面にて胚脊髄またはWnt4発現細胞と共培養したとき、間葉上皮転換し、糸球体および尿細管を形成することが十分に確立されている(非特許文献8:Kispertら、Development 125, 4225-4234, 1998)。E11.5胚を用いて作成した糸球体および尿細管を図28Aに示す。そこで、実施例6で誘導したEBsを同様の方法で培養したところ、しっかりとした尿細管形成が確認された。結果を図28CおよびDに示す。特に、day6で収穫したEBsの組織学的検査では、いずれの条件でも多くの管形成が認められ(図28CとD)、これはE−カドヘリン染色によって確認された(図28E)。管のほとんどは、Pax2とSall1陽性であり、腎尿細管であることを示している(図28E〜H、L〜P)。いくつかの尿細管は、近位尿細管のマーカーである、例えば、LTLまたはカドヘリン6、アクアポリン1、Jagged1、Megalinなどを発現していた(図28F、G、L〜N)。他の尿細管は、遠位尿細管の形成を示すE−カドヘリン、Brn1,NCCを発現していた(図28H、O、P)。さらに素晴らしいことに、多数の糸球体様構造が観察された(図28Cおよび28I〜28K)。これらの構造は、核に典型的な糸球体上皮細胞マーカーであるWt1を発現する細胞のクラスターで、ネフリンやポドシンなどの足突起タンパク質も発現していた。これらの構造は、胚後腎間葉のものと区別できなかった(図28BおよびD、n=6)。
上記のマウスES細胞に用いたプロトコルをヒトiPS細胞に適用し、インビトロで、iPS細胞を後腎ネフロン前駆細胞に向かって分化させた。iPS細胞からの後腎間葉の誘導の全体の工程の概要を図2に示した。以前の報告では、ヒト多能性幹細胞において、中胚葉系譜の細胞の初期誘導のためには、Bmp、Fgfおよびアクチビンのシグナルが重要であることが示されている(非特許文献19:Bernardら、Cell Stem Cell 9, 144-155, 2011; 非特許文献20:Kattmanら、Cell stem cell 8, 228-240, 2011; 非特許文献21:Yuら、Cell Stem Cell 8, 326-334, 2011)。したがって、ヒトiPS細胞凝集体を、最初の24時間Bmpで処理し、次いで、2日間アクチビンおよびFgfで処理した。誘導された中胚葉細胞をさらに、マウスES細胞の誘導と同様に、高濃度のWntアゴニスト(CHIR 10μM)およびBmpの存在下で、後方化しつつ未熟な中胚葉状態に維持した。ヒト胚における体幹伸長のための生理的期間を考え、これらの培養条件下で6日間EBsを培養した。その後、単に培養期間を調整することにより、マウスES細胞の分化のためのプロトコルを完全に再現した。14日目に採取した誘導EBsは、後腎ネフロン前駆細胞の複数のシグネチャー遺伝子を発現していた(図30)。免疫染色の結果、多くの細胞が、Wt1、Pax2、Sall1およびSix2を含む代表的な腎性転写因子を共発現していることが明らかなった(図31)。これらの誘導前駆細胞は、マウス胚脊髄と共培養すると、堅牢な尿細管形成および糸球体上皮細胞の形成を示した(図32DとE、n=6)。10日目での免疫組織化学的検査の結果は、十分に特定されたネフロン成分の形成を明らかにした。これらの構造は、Wt1/ネフリン(Nephrin)陽性糸球体(図32K、32J)、カドヘリン6(cdh6)陽性近位尿細管(図32H)およびE−カドヘリン陽性遠位尿細管(図32I)で構成され、それらの全てがその順で連結されており、それによってヒト胎児腎臓形成を再現していた。
以上のように、インビボでの発生過程を反復することにより、インビトロで、マウスおよびヒト多能性幹細胞の両方から真正な後腎ネフロン前駆体および三次元腎臓構造の誘導に成功した(図33)。
Claims (19)
- 哺乳動物由来の多能性幹細胞から後腎ネフロン前駆細胞を分化誘導する方法であって、該方法が、以下の3つの工程:
(a)多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストおよび場合によりさらにBmpを含有する培地で培養する工程、
(b)前記胚様体を、Bmpおよび中濃度(濃度B)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、および
(c)前記胚様体を、Fgfおよび低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含むことを特徴とする分化誘導方法、
ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。 - 前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストの濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍である、請求項1に記載の分化誘導方法。
- 前記工程(b)において、培地がさらにアクチビンを含む、請求項1または2に記載の分化誘導方法。
- 前記工程(b)において、培地がさらにレチノイン酸を含む、請求項3に記載の分化誘導方法。
- 前記WntアゴニストがGSK−3阻害剤である(ただし、各工程のWntアゴニストは同じであっても異なってもよい)、請求項1〜4のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
- 前記Wntアゴニストが、CHIR99021、BIO、およびSB415286からなる群より選ばれる(ただし、各工程のWntアゴニストは同じであっても異なってもよい)、請求項5に記載の分化誘導方法。
- 前記Bmpが、Bmp2、Bmp4およびBmp7からなる群より選ばれる、かつ、前記Fgfが、Fgf2、Fgf9およびFgf20からなる群より選ばれる、請求項1〜6のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 前記BmpがBmp4であり、かつ前記FgfがFgf9である、請求項1〜7のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストが、CHIR99021であり、かつ、前記濃度Aが7.5μM〜15μM、前記濃度Cが0.5μM〜2.0μMである、請求項1〜8のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 前記工程(a)および(b)におけるBmpがBmp4であり、工程(a)における濃度が0.1ng/ml〜3ng/mlであり、工程(b)における濃度が1ng/ml〜10ng/mlである、請求項9に記載の分化誘導方法。
- 前記工程(b)において、アクチビンを2.5〜40ng/mLの濃度で含む請求項10に記載の分化誘導方法。
- 前記工程(a)、(b)および(c)が、連続した工程である請求項1〜11のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 前記工程(c)において、培地が、Bmp、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれも含まない培地である、請求項1〜12のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 前記多能性幹細胞がマウスES細胞またはiPS細胞、またはヒトES細胞またはiPS細胞である、請求項1〜13のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項14に記載の分化誘導方法。
- 前記多能性幹細胞がマウスES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも1日以上4日以内培養する工程である請求項14に記載の分化誘導方法。
- 前記多能性幹細胞がヒトES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも3日以上11日以内培養する工程である請求項14に記載の分化誘導方法。
- 多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための分化誘導培地キットであって、該キットは、(i)分化誘導培地、および(ii)Wntアゴニストを含み、使用時において、前記Wntアゴニストを段階的濃度で含む少なくとも3つの分化誘導培地が調整される、ここで、前記段階的濃度は、少なくとも濃度A、BおよびCからなり、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である、
ことを特徴とする、培地キット。 - 前記Wntアゴニストの段階的濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍であるように分化誘導培地が調整される、請求項18に記載の培地キット。
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