JPH10505756A

JPH10505756A - 筋肉障害の治療用繊維芽細胞

Info

Publication number: JPH10505756A
Application number: JP8510668A
Authority: JP
Inventors: ワツト，ダイアナ・ジヨアン; ベテンコート・デ・メデイロス・レルバス，ジヨアオ・カルロス
Original assignee: ブリテイツシユ・テクノロジー・グループ・リミテツド
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 1998-06-09
Also published as: GB9518887D0; WO1996009373A1; GB2293604A; AU694957B2; GB9419048D0; EP0783568A1; CA2198379A1; GB2293604B; AU3481695A

Abstract

(57)【要約】デュシェンヌ型筋ジストロフィーのごとき筋肉障害を、（患者自身のものであってもよい）皮膚繊維芽細胞を筋肉に投与することによって緩和する。ドナー細胞の相互のイン・ビボ融合は、それらを筋肉細胞に変換し、これは、ジストロフィンおよび他の筋肉蛋白質のごとき筋肉特異的遺伝子の産物を産生する。ドナー繊維芽細胞は筋肉特異的ＤＮＡを含有していてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】筋肉障害の治療用繊維芽細胞発明の背景１．発明の分野本発明は、筋肉障害の治療、特に、筋ジストロフィーのごとき筋肉の退行に由来する、または例えば外傷の結果としての筋肉変性に由来する筋肉障害の治療に関する。２．関連技術の説明骨格筋細胞は、原形質膜に囲まれた、多核で直径１０−１００μｍおよび長さミリメートルもしくはセンチメートルオーダーの円筒構造からなる。この細胞は収縮可能であり、未成熟筋細胞である筋芽細胞の融合によって生じる。筋肉病の最も普通の形態の１つは、デュシェンヌ型（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。それは、ジストロフィン蛋白質の産生の欠如に導くＸ−染色体連鎖遺伝的欠陥によって引き起こされる。この欠陥は女性の両Ｘ −染色体に連鎖して起こるのではなく、また、その特性が劣性なので、欠陥Ｘ− 連鎖を通じて男性にのみ伝達される。ベッカー型（Ｂｅｃｋｅｒ）筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もＸ−連鎖遺伝的欠陥に由来する。ＤＭＤ遺伝子のクローニングの後、ＤＭＤ筋における筋病理疾患を緩和するために、筋芽細胞移植療法（ｍｙｏｂｌａｓｔｔｒａｎｓｆｅｒｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれる療法の一形態を用いることに興味が高まった。かくして、Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１１１，２４３７−２４４９（１９９０年１２月）は、放射線照射した筋ジストロフィー（ｍｄｘ）マウスで調べた。ヒトとは異なり、ｍｄｘマウスは冒された筋肉を自然に再生する。骨格筋の１領域に放射線照射すると、その領域における骨格筋の再生を不可能とする。これらの著者らは、ｍｄｘマウスの骨格筋におけるジストロフィン欠乏によって変性された筋肉が、野生型（すなわち、非病気）マウスからの新生児筋肉前駆細胞（筋芽細胞）を移植することによって再生できることを示した。これらの著者らは、培養新生児細胞の注入３日前にマウスの脚に高用量のＸ−線を限局的に照射することによって、ｍｄｘマウスにおける筋肉の自然再生を阻害した。提案されている療法は、筋芽細胞を正常ドナーから取り出し、それらをＤＭＤ少年の筋肉に挿入することである。ドナー筋芽細胞源は、免疫拒絶の問題が減少し、ジストロフィン遺伝子およびその蛋白質産物の正常なカウンターパートの存在がＤＭＤ筋肉におけるその喪失を置き換えるであろう、組織適合性の一致したドナー（しばしば父親）からのものであろう。その目的は、それ自体ジストロフィン−陰性であるＤＭＤ少年の筋肉繊維とこれらの細胞との融合を行うことにある。ジストロフィン陽性ドナー筋芽細胞とジストロフィン陰性ＤＭＤ筋肉繊維との融合は、かくして、少なくとも部分的に繊維に対してジストロフィン機能を回復させる。かくして、Ｅ，Ｇｕｓｓｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ３５６，４３５−４３８（１９９２）は、父親または冒されていない兄弟姉妹からの正常筋芽細胞を８人の少年の筋肉に移植することによって彼らを治療した。ジストロフィン遺伝子中に欠失がある３人の患者は、筋芽細胞注入後に採取した筋肉バイオプシー検体において正常ジストロフィン転写体を発現した。ポリメラーゼ連鎖反応を用い、これらの著者は、ジストロフィン遺伝子はこれらのバイオプシー検体において正常ジストロフィンを発現することを確立した。この研究においては、ＤＭＤ筋肉で産生されたジストロフィン−陽性繊維の数は少なかったが、該方法はいくらか展望を持っている。Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ３６８，４０６−４０７（１９９４年３月）は、β−ガラシトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコードするｌａｃＺ遺伝子を保有する筋芽細胞を最初の宿主ｍｄｘマウスの筋肉に注入し、引き続いて、この筋肉を第２の宿主ｍｄｘマウスに移植し、移植した筋肉を「Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ」支持培地で囲んだ。第２宿主マウスにおいて隣接する筋肉を損傷させた場合、ｌａｃＺ遺伝子を含有する筋芽細胞はＳｐｏｎｇｏｓｔａｎを通って移動して、損傷を受けた筋肉の隣でβ−ｇａｌ−陽性およびジストロフィン−陽性の筋管を生じた。対照的に、この効果は筋肉が損傷を受けていない場合には通常起こらかなった。しかしながら、損傷を受けていない筋肉の場合には、ｍｄｘマウスに典型的な、筋肉の自然再生が起こり、ここにβ−ｇａｌ／ジストロフィン−陽性繊維が周囲の筋肉で観察された。これらの結果は、移植された筋芽細胞が筋肉損傷および筋肉再生の領域に向けて移動することを示す。この運動は、損傷を受けた筋肉繊維によって付与されるある種の走化作用の結果であろう。このタイプの療法についてのさらなる進歩は、ＤＭＤ少年自身のジストロフィン−陰性の筋原性細胞を使用し、彼らに失われた遺伝子を挿入することであり、これは容易に達成できる。最近、Ｇ．Ａ．Ｃｏｘら、Ｎａｔｕｒｅ３６４，７２５−７２８（１９９３）は、マウスジストロフィンをコードする全長ｃＤＮＡを含有するトランスジェニックｍｄｘマウスにおけるジストロフィンの過発現がジストロフィー徴候を防止し、有害な副作用を有しないらしいことを示した。しかしながら、この療法は「非自己」細胞の免疫拒絶の問題を取り除くものの、非自己源のドナー細胞の使用では遭遇しなかった問題を生じる。ＤＭＤ少年の筋原性細胞は、「正常」非−ＤＭＤ筋芽細胞よりも老化経路をさらに降っており、それらは数回の変性／再生および従って有糸分裂をすでに経過している。細胞が死滅前に特定回数（５０回）分裂するというＨａｙｆｌｉｃｋ現象を仮定すると、これらの「年齢のいった（ older）」細胞を使用する戦略は理想的ではない。従って、近年、最も有望なものとしてこれらの２つのアプローチに興味が集中している。本発明の知識なくしてその意味が明瞭ではないさらなる先行技術を「発明の概要」で言及する。今回、免疫拒絶を防止するのに十分適合しないであろう細胞の使用を回避でき、また、「年齢のいった」細胞の使用を回避するので、別のアプローチが利点を供することが判明した。発明の概要本発明は、ドナー細胞として皮膚起源の繊維芽細胞を使用するかなり異なるアイデアに基づく。驚くべきことに、皮膚繊維芽細胞を筋肉障害を有する動物の筋肉に移植すると、これらのドナー繊維芽細胞は一緒に融合して筋肉細胞のように挙動する多核細胞を生じることが判明した。これらの新しく形成された細胞は、正常動物における天然筋肉細胞に特異的である（従って、とりわけドナー繊維芽細胞では見い出されない）のと同一の産物（例えば、ジストロフィン、デスミン、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ）を発現するので、それらは筋原性細胞系統に変換されたと考えられる。ドナー細胞としての筋肉および肺繊維芽細胞はいくらかの有益な利点を有するようであるが、それは少なく、他方、皮膚繊維芽細胞は大きな効果を生じる。従って、本発明の重要な態様は、皮膚繊維芽細胞を筋肉特異的遺伝子によって発現される産物を生産できる筋原性細胞に変換するのに効果的な条件下で患者の筋肉細胞またはその隣に免疫学的に適合する皮膚繊維芽細胞を投与することよりなる、患者において筋肉障害を治療する方法として定義される。治療的処置方法が保護されない国においては、前記定義方法に代えて、法的に適合するかまたは慣用的なように、上述した目的のためのドナー細胞の使用または上述した目的のための細胞調製物の製造における該ドナー細胞の使用で置き換えられるべきである。さらなる先行技術Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら（１９９０）（前掲）の研究において、移植されたドナー筋肉細胞は筋原性および非筋原性細胞の混合物であり、非筋原性細胞を分離する工程は採用されておらず、これは包括的繊維芽細胞を有していたに違いない。しかしながら、著者らは、「遺伝した筋障害の治療用の筋原性細胞の使用に関して最適の原因」に言及しており、とりわけ、異なる発生段階の筋肉から得られた筋原性細胞が、正常な筋肉組織学および機能を回復または維持できる効率の点で異なるかどうかの研究を示唆している。１０年前、Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，７５８−７６６（１９８５）は、「分化した状態の柔軟性（ＰｌａｓｔｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＳｔａｔｅ」なる表題の論文において、筋肉細胞を用いて、どの程度まで高度に特殊化した細胞が依然他の細胞型の核の遺伝子を発現できるかを判断した。マウス筋肉細胞はイン・ビトロで他の表現型の細胞と融合した。これらの融合した細胞またはヘテロカリオンにおいて、筋肉遺伝子発現は融合細胞の非筋肉核で活性化された。非筋肉細胞は４種の繊維芽細胞を含み、そのうち１つは皮膚繊維芽細胞であった。著者らは、この活性化は細胞質を通じて核に移植された分子によって媒介されているに違いないと結論した。６年前、Ｓ．Ｃｈａｕｄｈａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ３４１，４４５−４４７（１９８９）は、遺伝子的に欠陥のある（種属に悪影響のある）マウス繊維芽細胞と、とりわけラット皮膚繊維芽細胞を含めた繊維芽細胞系とのイン・ビトロ融合を記載した。種属に悪影響のある（dysgenic）筋芽細胞は収縮させることができない筋管を形成できる。筋管は筋芽細胞からさらなる分化経路を辿っている。実験は、繊維芽細胞を、培養から平板培養した筋芽細胞に添加することを含むものであった。著者らは、繊維芽細胞は、それらが筋管が十分形成された後に添加されたならば、融合するのは非常に稀のようであると注記している。彼らは、Ｂｌａｕらの論文を引用して、筋肉細胞質は繊維芽細胞核を誘導して筋肉特異的遺伝子を発現させると推定している。著者らは、「我々は、同様な融合過程がイン・ビボで起こるか否か、あるいは逆に、かかる融合を妨げる機序が存在するか否かをまだ知らない。もし繊維芽細胞がイン・ビボで発生する筋肉と融合できれば、それらはヒトの筋肉の遺伝的病気の治療で有用なドナー細胞型として使用されるだろう。」と付け加えている。著者らは、筋肉が発生中ではなく退行中である場合、どのようにかかる治療が有力であるか説明しておらず、また、繊維芽細胞の全部の間の融合が起こるであろうことを示していない。彼らの研究は繊維芽細胞の筋肉細胞へのイン・ビトロ融合に関係しているに過ぎない。Ｃｈａｕｄｈａｒｉらの研究は、恐らくは、前記理由のため、皮膚から筋原性細胞系統への変換がイン・ビボで起こるであろうことを推定する理由がなく、また、筋肉細胞に関与する他の治療がより有望と思われたので、当該分野では無視されてきた。本願の優先年の間に、本発明はＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１０８，２０７−２１４（１９９５）においてＧｉｂｓｏｎら（発明者含む）によって論文で公表されたが、発行者は論文の再印刷につき予期せぬ重大な要望であると報告している。好適実施態様の説明治療は、ドナー繊維芽細胞の相互の融合の少なくともいくらかが筋肉特異的遺伝子を発現し、従って、筋原性細胞系統、注目すべきは筋肉細胞またはそのサテライト細胞になるという知見に基づく。該効果は照射されたｍｄｘマウスで最も容易に見られる。ヒト患者に投与できるのと同一であるが恐らくはマーカーを担持するヒト繊維芽細胞を照射ｍｄｘマウスに投与すると、該効果が観察でき、マウスにおけるかかるテストは、ヒトの治療で効果的である皮膚細胞の能力のテスト（もし必要であれば）としてみなすことができる。通常、治療は、例えば、筋肉バイオプシーによって治療した患者の筋肉中に見い出されるジストロフィン− 陽性細胞の数を増加させることを狙っており、筋肉特異的蛋白質ジストロフィンの産生は正常筋肉への変換における成功の指標とみなされる。本発明は、実施例８によって特によく立証されており、そこでは、ヒトジストロフィン遺伝子−陽性トランスジェニックマウスからの皮膚繊維芽細胞を、ジストロフィン−陽性筋肉繊維を欠くｍｄｘマウスに移植した。ｍｄｘマウス筋肉繊維はジストロフィン陽性となり、この遺伝子はドナー細胞によってのみ供することができた。かくして、該遺伝子は皮膚繊維芽細胞の染色体に組み込まれ、異なる細胞型、すなわち、マウス細胞で発現された。本発明は、主として、骨格筋に関するが、心筋または平滑筋にも適用できる。それは、主として筋ジストロフィー、特にＤＭＤまたはＢＭＤに関して興味をひくところであるが、負傷または損傷した筋肉を含めた筋肉のいずれの退行する障害または変性障害にも適用できる。これは外傷を含むが、勿論、筋肉「構造」が完全に破壊された程重症の負傷は含まない。患者がジストロフィン産生またはもう１つの筋肉特異的遺伝子を欠くまたは実質的に欠く場合、あるいは正常下濃度において遺伝子を保有する場合、投与される皮膚繊維芽細胞は関連する必要なＤＮＡを含有する。皮膚細胞は、好ましくはそれが細胞核内に組み込まれるように、いずれかの常法にてこのＤＮＡでトランスフェクトできる。１つのかかる方法は、アデノウイルスまたはアデノウイルス関連ベクターのごときウイルスベクターに関連ＤＮＡを組込み、該ベクターで繊維芽細胞をトランスフェクトすることである。安全要件に従い、別法としてレトロウイルスベクターを使用することもできる。皮膚繊維芽細胞は遺伝子治療用にレトロウイルスベクターで感染されている。例えば、Ｊ．Ｈ．Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５１７３−５１７７（１９９０），Ｄ．Ｓｔ．ＬｏｕｉｓｅおよびＩ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ，同上，８５，３１５９−３１５４（１９８８），Ｔ．Ｄ．Ｐａｌｍｅｒら，Ｂｌｏｏｄ７３，４３８−４４５（１９８９）およびＲ．Ｉ．ＧａｒｖｅｒＪｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７，７６２ −７６４（１９８７）参照。かかる方法を使用し、これらの文献の第IX因子およびアルファ−１アンチトリプシン遺伝子に代えてジストロフィンまたは他の筋肉特異的ＤＮＡで置き換えることができよう。もう１つの方法は、筋肉特異的ＤＮＡの繊維芽細胞への直接注入である。関連ＤＮＡの繊維芽細胞への取り込み方法は重要でなく、他の方法は当業者に明らかであろう。関連ＤＮＡは全長遺伝子またはその一部だけでもよい。いわゆるジストロフィンミニ遺伝子のごとき部分的遺伝子（Ｍ．Ｄｕｎｃｋｌｅｙら、ＦＥＢＳ２９６，１２８−１３４（１９９２）参照）は、特にレトロウイルスベクターが使用されるべき場合に、ＢＭＤおよびＤＭＤ双方で有用である。Ｎ．Ｗｅｌｌｓら、ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎ．１，３５−４０（１９９２）によって記載されている全長ジストロフィン遺伝子は、ベクターがかかる長いＤＮＡを存在させることができないか、またはパッケージできない方法で有用である。当該分野でよく知られているように、使用される技術によって必要とされるときは、適当な調節配列を含ませる。好ましくは、本発明の治療を適用する場合、患者は筋肉細胞を全く欠くものではない。筋肉に存在する走化性因子は繊維芽細胞を筋肉細胞に変換するのを助けることができる。本発明は、特に細胞核内に筋肉特異的ＤＮＡ、特にジストロフィン蛋白質の一部または全部をコードするＤＮＡを含有する皮膚繊維芽細胞を含む。該ＤＮＡは前記したごとく全長または部分的遺伝子であってよい。かかる細胞を含有する細胞懸濁液および生物学的に純粋な、特に無血清の培養培地が本発明内に含まれる。本明細書中の何も、ヒト身体から単離された場合を除き、ヒト身体の一部に権利を請求しないと解釈されるべきである。筋肉障害が負傷に由来し、かつ患者が正常な筋肉特異的遺伝子を有する場合、ドナー繊維芽細胞はいずれの外来ＤＮＡも含有する必要がない。ドナー細胞は、それらが外来のものとして拒絶されるのを防ぐために、治療すべき患者に免疫学的に適合しなければならない。かくして、身体組織の寄付を含めた他の種類の治療におけるごとく、ＨＬＡ型を適合させるべきいくらかの試みが通常なされるであろう。好ましくは、ドナー細胞は治療されるべき患者からのものである。これらの細胞は、例えば、皮膚から組織を取り出すバイオプシーによって容易に収穫される。ドナー細胞の投与経路は、それらが患者の筋肉細胞に密着してまたはその近くに接触される限り、重要でない。（筋肉への）筋肉内注射は好ましい経路であり；（筋肉間の）筋肉間注射も可能である。他の方法は、皮膚を開き、筋肉を露出させる移植、および例えば大腿動脈への動脈内注射である。実験により、１つの筋肉へ移植された皮膚繊維芽細胞は他の近くの筋肉まで移動し、これは新しい筋肉繊維の形成に寄与し、これらの繊維内で筋肉特異的遺伝子を発現する。細胞は投与用に以下のごとくに調製できる。皮膚バイオプシーを皮膚層を含めるようにＤＭＤ患者から採取する。皮膚繊維芽細胞を培養にて増殖させ、皮膚細胞を患者に再導入するときに、動物血清蛋白質の要素がいずれかの免疫応答または汚染問題を引き起こす場合には、無血清培地で増殖させる。かくして、無血清補充を用いる培地が通常必要である。培養での皮膚細胞の増殖に続き、欠陥遺伝子の正常カウンターパートを（必要な場合）細胞に送達する。該細胞は無血清培地中の懸濁液としてまたは細胞ペレットとして処方する。ウイルス学的および細菌学的テストは再移植前に強制的に行なわれる。ドナー細胞は通常一回、冒された筋肉の１以上の部位に投与されるであろう。一般に、それらは、通常は注射によって、３０以上、特に３０−１００の部位に投与されるであろう。投与する皮膚細胞の合計量は通常ヒトにつき１０⁶〜１０¹ ⁰ の範囲であろう。本発明はヒト患者を治療するのに主として興味深いが、ペット、家畜および食料生産で使用する動物のごとき非ヒト動物の治療も含む。細胞の投与量は動物のサイズに応じた調整を要するが、これは当業者の技量の範囲内のものである。以下の実施例により本発明を説明する。「ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ」、「ＳＰＯＮＧＯＳＴＡＮ」、「ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ」および「ＴＲＩＴＯＮ」なる語は登録商標である。実施例１１．皮膚繊維芽細胞の調製前方腹部璧の長さに沿って腹側を切開し、下部組織から皮膚を取り出すことによって、株Ｃ５７Ｂ１／１０ＳｃＳｎの新生児正常マウスからの皮膚を収穫した。該皮膚を、７０％アルコールを含有するペトリ皿中に２分間入れて、組織培養で細胞の感染を引き起こす汚染物を除去した。次いで、該皮膚を取り出して、抗生物質８０ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび８０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１％「Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ」（２５０μｇ／ｍｌアンフォテリシン）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含むペトリ皿に入れた。皮膚の皮下表面からいずれの脂肪も掻き取った。次いで、該皮膚を、ペニシリンおよびストレプトマイシン（前記）を含有するＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ）を含むペトリ皿に入れ、メスの刃（ｃｒｏｓｓｅｄｓｃａｌｐｅｌｂｌａｄｅ）を用いて１ｍｍ³片に切った。該小片を取り出して、最小量の増殖培地を含有する２５ｃｍ² 領域を供する組織培養フラスコに単独で入れた。最小量の培地（２５ｃｍ²増殖領域ＴＣフラスコにつき１ｍｌ）により、皮膚片が基層に付着した。増殖培地は、２ｍＭＬ−グルタミン、８８ＩＵ／ｍｌペニシリン／８８ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄによって供給された）および１０％ウシ胎仔血清（ＬａｂｔｅｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を補充した「ＤＭＥＭ」（ダルベッコの最小イーグル培地）であった。培養容器を５％ＣＯ₂中の３７℃インキュベーターに入れた。皮膚片移植３時間後に、増殖培地をさらに１−２ｍｌ添加して、皮膚が確実に乾燥しないようにした。繊維芽細胞が外植皮膚から増殖しだすまで、皮膚を培養中に放置した。この間、３日毎に培地を交換した。十分な過剰増殖が起こると、皮膚片を取り出して、培養が密集下（subconfluency）となるようにした。密集下に到達すると、細胞を１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、０．２５％トリプシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて基層から脱着させた。１０％ウシ胎仔血清を含有する増殖培地の添加によって、細胞の脱着後に、トリプシンの作用を停止させた。１０分間の３５０ｇでの遠心によって細胞をペレット化し、増殖培地（前記）に再懸濁して２×１０⁵細胞／ｍｌの濃度とした。次いで、この懸濁液を培養容器に入れ、密集下まで前記と同一の増殖培地中で増殖させた。この操作サイクルは単一継代を構成するものであった。かくして、マウス筋肉への移植前に、細胞を少なくとも６回継代した。いくらかの細胞は、以下のごとく、１９回継代後にリング−クローン化された。細胞を前記したごとくにトリプシン処理し、増殖培地１０ｍｌ中１００細胞まで増殖培地中に希釈した。これらを１００ｍｍのペトリ皿に入れて、基層への単層細胞付着を誘導した。単細胞が検出されたら、クローニングシリンダー（「Ｐｅｒｓｐｅｘ」チューブから切断した２ｍｍ内径）をかかる単細胞上に置いて、かかる単細胞が確実にクローンとして増殖するようにした。クローンをトリプシン処理によって一度に収穫し、各々は、単離された元の１つの細胞から１２−１５細胞のコロニーを産生した。２．筋肉繊維芽細胞の調製正確にＤ．Ｊ．Ｗａｔｔら，Ｊ．ＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ５７，３１９−３３１（１９８２）によって詳細に記載されているごとくに、トリプシンおよびパンゲスチンでの解離によって、筋肉細胞を新生児マウスの筋肉組織から調製した。該細胞を平板培養し、４０分間インキュベーターに放置し、その間に繊維芽細胞はプレートに付着したが、筋原性細胞は浮遊したままであった。筋原性細胞を含有する増殖培地を取り出し、新鮮な増殖培地を、繊維芽細胞が付着した元のフラスコに添加した。繊維芽細胞以外に汚染細胞が依然これらの培養に存在したが、少なくとも６回の継代の後、繊維芽細胞は培養で支配的細胞となり、かかる繊維芽細胞を注射に使用した。それらは、標準的な微細構造法および免疫細胞化学を用いると１００％繊維芽細胞であると判断された。免疫細胞化学は、筋原性細胞の中間フィラメント蛋白質を認識する商業的に入手可能な（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．からの）抗−デスミン抗体を用いて行った。全てのクローン化細胞はデスミン−陰性であり、これは、それらが筋原性細胞を含有しないことを示す。これは、微細構造レベルでの外観によって確認され、また、これはそれらが事実繊維芽細胞であることを示した。３．皮膚繊維芽細胞の移植用のマウスの調製すべての実験において、ｍｄｘマウスを受容体（すなわちレシピエント）として使用した。無胸腺ヌードマウスは免疫学的に寛容されており、胸腺を保有せず、従って、移植された外来性組織の拒絶の恐れなくして、いずれの他の株のマウスからの組織もおよび事実異種移植された物質を許容するであろう。各宿主Ｘ−連鎖筋ジストロフィー（ｍｄｘ）マウスの右後方脚を１８００ラドのＸ−線照射に付した。この処理は、内因性筋肉前駆細胞を破壊し、ｍｄｘ筋肉を再生不可能とし、従って、ＤＭＤ筋肉に対して組織病理学的により同種とした。かかる照射の方法は、Ｗａｋｅｆｏｒｄら、Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ，１４，４２−５０（１９９１）に示されている。宿主マウスの左下方後部脚は未照射のままとし、従って、移植した外来性組織の拒絶の恐れなくして、マウスのいずれの他の株からの組織も、および事実異種移植された物質を許容するであろう。４．繊維芽細胞のｍｄｘ受容体への注射マウスの正常Ｃ５７Ｂ１／１０ＳｃＳｎ株、それからｍｄｘマウスが自然発生的に生起する正常株に由来する皮膚および筋肉繊維芽細胞双方（別々の実験）を、宿主無胸腺ヌードマウスの脛側前方（ＴＡ）筋肉に注射した（右に照射し左は照射しなかった）。マイクロリットルのマーキングがあり、火炎処理し、非常に微細なポイントまで引いた細いピペットを用いて３×１０⁵細胞を注射した。Ｄ．Ｗａｔｔら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｕｓｃｌｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＣｅｌｌＭｏｔｉｌｉｔｙ１４，１２１−１３２（１９９３）で開発されたプロトコルに従い、ほぼ１０μｌの細胞懸濁液がＴＡ筋肉の非常に表層の繊維に注射されるように、注射すべき細胞を回転させてペレットとした。５．筋肉の分析移植３および６週間後、ＴＡ筋肉を取り出し、液体窒素によって−１６５℃まで冷却した融解イソペンタン中で凍結した。注射部位に到達するまで低温切片（ cryostatsections）に切断し、その時点で、８μｍ厚低温切片に切断した。最初の切片を組織学的実験のために採取し、第２の切片はジストロフィン免疫染色のために、および第３の切片はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）特徴付けのために採取した。（ａ）組織学的実験組織学的実験のための切片を蒸留水中で２分間洗浄し、ヘマトキシリン中で２分間染色し、流水中で１分間洗浄した。１％ｖ／ｖ塩酸を含有する７０％アルコール中で５秒間分別（細胞質から核を分別）した後、それらを流れる水道水中で５分間「青色化」した（「青色化」は酸性ヘマトキシリンを中性ヘマトキシリンに変換し、これは染色にその特徴的な青色を与える）。次いで、切片をエオシン中で１−２分間逆染色し、しかる後、水中で軽くすすぎ、７０％アルコールに軽く浸漬した。次いで、それらを１００％アルコールを２回交換して少なくとも２分間（各交換）脱水し、２回交換（各々２分）のキシレンに浸漬して、キシレンをベースとするマウンタント（ｍｏｕｎｔａｎｔ）に固定する前にそれらを清澄とした。この実験は、該切片が、新しく形成された再生筋肉繊維に特徴的な核が周辺ではない所に位置した小さな変動する直径の繊維を含有することを示した。（ｂ）ジストロフィン免疫染色さらに切片を採取し、いくつかは最初のものよりも１００μｍおよび２００μ ｍ深く（８μｍ切片）採取し、ウサギ抗− ジストロフィン一次抗体と共に１時間インキュベートし、続いて第二抗体として抗−ウサギビオチン化ＩｇＧと共に１時間インキュベートし、標識としてアビジン−蛍光コンジュゲートを用いて可視化することによって、これらの異なるレベルからの３つの切片を免疫組織学的に染色した。切片を０．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで２０分間逆染色した。ジストロフィン−陽性繊維の大部分は中心に核があった。いくつかの抗−ジストロフィン抗体は商業的に入手可能であるが、このテストでは、本発明者らは、Ｐ．Ｎ．Ｓｔｒｏｎｇ博士、Ｄｅｐｔ．ｏｆＰａｅｄｉａｔｒｉｃｓａｎｄＮｅｏｎａｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＲｏｙａｌＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈＨｏｓｐｉｔａｌ，ロンドンＷ１２ＯＮＮ，英国からのＰ６抗体を使用した（Ｔ．Ｇ．Ｓｈｅｒｒａｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７，７５５−７５９（１９９２）参照）。Ｐ６はジストロフィンの−ＣＯＯＨ末端を認識する。免疫蛍光像は、オリンパスＢＨ２蛍光顕微鏡に取り付けたＰｈｏｔｏｎｉｃｓＳｃｉｅｎｃｅＬａｂｓｔａｒ増感ＣＣＤカメラを用いて得た。この後、蛍光像を光学ディスク上に保存した。免疫蛍光標識された切片の面積の定量を行い、蛍光筋肉繊維によって占められた領域を容積分率（標識フレームのパーセント）として表した。結果を表１に示す。ｍｄｘマウスはジストロフィン−陰性であり、照射された筋肉ではそのままである。照射ｍｄｘ筋肉に移植した皮膚繊維芽細胞は、２１日後に調べると、非照射筋肉と比較して、驚くほど高い割合のジストロフィン−陽性繊維を生じていた。照射筋肉における４２日後のジストロフィン陽性の低パーセンテージは、組織学的に観察して、陽性繊維の組織化および集密性を反映する。クローン化皮膚繊維芽細胞を移植した後に観察されたジストロフィン−陽性繊維の低い割合は、いくらかの多能性を喪失したかも知れない１９継代のクローン化細胞を用いた結果であろう。筋肉繊維芽細胞（非クローン化）を移植した後、復帰突然変異繊維から予測されるよりも高レベルのジストロフィン−陽性繊維が観察され、これは、移植細胞が筋肉繊維形成に何らかの関与をしたことを示す。（ｃ）ＧＰＩ特徴付けＧＰＩのイソ酵素を用いて、再生用に移植されたＴＡ筋肉に存在する筋肉繊維に対する宿主およびドナー細胞の相対的寄与を以下のごとくに評価した。ＧＰＩイソ酵素を吸収させるために、低温切片を濾紙の小片と重ねた。ＧＰＩイソ酵素が吸収された濾紙をアガロースゲルの表面に載置し、等電点電気泳動に付した。ゲル上のＧＰＩ活性の部位は、フルクトース−６−リン酸、ＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、フェナジンメトスルフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムの反応混合物を含有する寒天重層を用いて明らかとした。等電点電気泳動は、マウスにおけるＧＰＩの３つのイソ酵素タイプを分離する。最もアノード極側に位置するイソ酵素は、ＧＰＩ−１ｂ遺伝子によってコードされた２つのサブユニットからなり、ドナーマウスの１２９／ＲｅＪ株のごとき、ホモ接合性ＧＰＩ−１ｂ／ＧＰＩ−１ｂマウスに由来する組織を特徴付けた。最もカソード極側に位置するイソ酵素はＧＰＩ−１ａ遺伝子によってコードされた２つのサブユニットよりなり、宿主（受容体）マウスのＣ５７Ｂ１／１０ＳｃＳｎ株のごとき、ホモ接合性ＧＰＩ−１ａ／ＧＰＩ−１ａマウスを特徴付ける。しかしながら、筋肉移植片において、「ヘテロダイマー」イソ酵素形態が、シンシチウム骨格筋繊維の細胞質内で、ＧＰＩ−１ａ遺伝子によってコードされた１のサブユニット、およびＧＰＩ−１ｂ遺伝子によってコードされた１のサブユニットの会合によって生起する。かくして、もしモザイク筋肉繊維が宿主およびドナー単核前駆体細胞の融合によって形成されたならば、ヘテロダイマーが生じ、その結果、共通の細胞質を持つ宿主およびドナーＧＰＩ遺伝子双方が発現される。該方法のさらに詳細については、Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら、ＮｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒＤｉｓｏｒｄｅｒ１，３４５−３５５（１９９１）参照のこと。実施例２マウス皮膚繊維芽細胞を移植したｍｄｘマウスの筋肉内における筋肉特異的遺伝子の発現マウス皮膚繊維芽細胞を移植したｍｄｘ筋肉内における筋肉特異的蛋白質の発現を示すために本実施例で選択した遺伝子産物は、初期分化筋肉で発現されるカルボニックアンヒドラーゼＩＩＩであった。４匹のｍｄｘヌードマウスに、実施例１パート１におけるごとくに調製した３×１０⁵クローン化マウス皮膚繊維芽細胞を、照射したおよび非照射のｍｄｘ脛側前方筋肉内に注射した。カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩの発現を調べるために、筋肉から切断した低温切片の標準的な免疫細胞化学的染色を行った。第一抗体はウサギ抗−カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）［ＧｒａｙＣｏｕｌｔｏｎ博士、Ｄｅｐｔ．ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈａｒｉｎｇＣｒｏｓｓａｎｄＷｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ロンドンＷ６８ＲＦから入手］であり、第二次抗体はマウス抗−ウサギビオチン化ＩｇＧであった。可視化は、アジビン−蛍光コンジュゲートの第３層を要した。すべての場合、二重免疫細胞化学的染色、すなわち、ジストロフィンおよびＣＡＩＩＩ双方について行った。結果は、ジストロフィンおよびＣＡＩＩＩの共存在があることを示した。すなわち、ジストロフィン−陽性である新しく形成された筋肉細胞もＣＡＩＩＩを発現した、すなわち、同繊維はこれらの筋肉特異的遺伝子産物の双方を発現した。実施例３負傷後における筋肉再生での皮膚繊維芽細胞の筋原性細胞系統への変換本実験は、病気ではなく負傷の後に再生する筋肉、すなわち正常Ｃ５７Ｂ１／１０マウスの（例えばｍｄｘ）筋肉に皮膚繊維芽細胞を移植する効果を調べるために設定した。ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．からの蛍光マーカーＰＨＫ−２６を使用した。この物質は、細胞膜内に突き刺り、そこに止まるリン脂質である。イン・ビボでの細胞の移植１００日までの間標識された細胞の膜に止まると言われている。クローン化皮膚繊維芽細胞をＰＨＫ−２６と共にイン・ビトロでインキュベートし、その間に、細胞膜をこの化合物で安定に標識した。次いで、かかる細胞を前記したごとくに正常Ｃ５７Ｂ１／１０マウスのＴＡに注射し、３〜６週間放置した。筋肉をとりだし、凍結させた。再生した筋肉から切片を切り出した。ジストロフィンについてのアッセイは、宿主マウスがジストロフィン−陽性であったので、行わなかった。２４日後、蛍光マーカーが筋肉細胞膜と会合しているのが観察され、これは、これらの細胞は皮膚繊維芽細胞から生起したことを示した。ＰＨＫ−２６マーカーを使用することに加え、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を保有する皮膚繊維芽細胞を、正常（Ｃ５７Ｂ１／１０）マウスの再生する脛側前方筋肉への移植に使用した。２つの源のｌａｃＺ標識細胞を移植した：（ａ）新生児マウスの皮膚から収穫したＣ５７Ｂ１／１０皮膚繊維芽細胞をｌａｃＺ遺伝子を保有するマウス・モロニー白血病ウイルスレトロウイルス（ＭｏＭＬＶ）ベクターで感染させた。（ｂ）皮膚繊維芽細胞をＣ５７Ｂ１「Ｒｏｓａ」マウス、すなわちｌａｃＺトランスジェニックマウスから収穫した。この動物からのすべての細胞はβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現した。「Ｒｏｓａ」トランスジェニックマウスからの皮膚繊維芽細胞はＭ．Ｓｋｙｎｎｅｒ博士，ＢａｂｒａｈａｍＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ケンブリッジ、英国から受け取った。これらの実験からの結果は、移植２１日後における再生移植片におけるβ−ガラクトシダーゼ陽性繊維の存在を示す。これらの結果は、皮膚繊維芽細胞が新しく形成された筋肉繊維の形成で役割を演じていることを示す。実施例４筋肉のさらなる分析ＧＰＩ分析の代わりに、第３の８μｍ切片をさらなるジストロフィン免疫染色用に採取した以外は、実施例１パート５を２３匹のｍｄｘヌードマウスで反復した。該８μｍ切片および１００μｍおよび２００μｍのより深いレベルから採取したさらなる切片を、記載したごとくに、同一源から入手可能な、Ｐ６抗体で、およびもう１つのウサギ抗−ジストロフィン抗体Ｈ１２で、別々に染色した。Ｐ６はカルボキシ末端を認識するが、Ｈ１２は蛋白質のロッドドメトンを認識する。実施例１のアビジン−蛍光コンジュゲートを、Ｐ６についてはストレプトアビジン−「ＴｅｘａｓＲｅｄ」コンジュゲート、およびＨ１２についてはストレプトアビジン−蛍光コンジュゲートによって置き換えた。Ｐ６およびＨ１２で染色した場合、８０％までの個々の筋肉切片が陽性であった。Ｐ６につき陽性のすべての切片はＨ１２についても陽性であり、その結果、ジストロフィン分子の少なくとも大部分が発現されたことを示す。実施例５ｍｄｘマウス筋肉におけるヒト皮膚繊維芽細胞の新しく形成された筋肉繊維への変換療法の経路としての皮膚繊維芽細胞の使用における重要な工程は、ヒト皮膚繊維芽細胞もまたｍｄｘ筋肉でジストロフィン−陽性繊維を形成するか否かを調べることである。この目的で、実施例１と同様のプロトコルを用いて、ヒト皮膚繊維芽細胞をｍｄｘマウスＴＡ筋肉に注射した。ヒト皮膚繊維芽細胞は３つの源：（ａ）４６歳の婦人の顔の皮膚；（ｂ）９歳の少年の前腕；および（ｃ）新生児包皮の商業的に入手可能な皮膚から得た。バイオプシー（局所麻酔下）において、４６歳のドナーからの皮膚試料を、オーストラリアウシ胎仔血清（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を使用した以外は、実施例１におけるごとくに補充したＤＭＥＭ１０ｍｌに入れた。皮膚を滅菌ペトリ皿に移し、次いで、メスの刃を用いて１ｍｍ³片に切断した。小片を単独で取り出して、各々が２５ｃｍ²増殖面積を供し、各々が前記増殖培地１ｍｌを含有する組織培養フラスコに入れた。それらを転倒して逆にし、フラスコの基層への皮膚片の接着を促進する以外は実施例１におけるごとくにフラスコをインキュベートした（従って、皮膚片は、インキュベーター中で上を下にして置かれたフラスコのベースに張り付くようにされた）。さらなる増殖培地を実施例１におけるごとくに添加して、皮膚が確実に乾燥しないようにした。次いで、該手法を正確に実施例１パート１におけるごとくに継続した。９歳の少年からの皮膚細胞を、それらが皮膚から既に増殖した条件にて受け取った。マウスの調製および繊維芽細胞のマウスへの注射は実施例１パート３および４に記載されている通りである。次いで、切片のいくつかを抗−ヒトスローミオシン重鎖（ＨｕＳＭｙＨＣ）抗体で染色した。該スローミオシン重鎖はヒト筋肉特異的遺伝子産物である。筋肉全体で３、４または５の異なる工程レベルで８μｍ切片に切断した（実験間で変動した）。切断した切片を以下のごとくに処理した：１．切片を１５分間風乾した。２．切片を１０％ウシ胎仔血清、１０％ウマ血清、１０％ヤギ血清中で３０分間ブロックした。この工程を用いて、筋肉細胞表面上のいずれの空の部位への抗体の非特異的結合をも防止する。３．切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で５分間、続いて０．０５％「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」を含有するＰＢＳ中でさらに１５分間洗浄した。４．商業的に入手可能な抗体１：２を０．０５％「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」中に１：２で希釈することによって、切片を抗−ＨｕＳＭｙＨＣ抗体中、室温にて１時間インキュベートした。５．切片をすべてＰＢＳ中で５分間ずつ３回染色液中で洗浄し、続いて、最後に２０分間洗浄した。６．切片当たり５０μｌを用い、ＰＢＳ中のヤギ抗−マウスビオチン化ＩｇＧを１：１００に希釈した液中で、切片を室温でインキュベートした。７．洗浄工程５を反復した。８．ＰＢＳ中の１：１００希釈を用い、切片をストレプトアビジン／フルオレセイン中、暗所にて、３０分間インキュベートした。９．ＰＢＳ中で、切片を１０分間２回、次いでさらに２０分間洗浄した。１０．それらを「Ｅｎｔｅｌｌａｎ」固定用培地中に固定し、蛍光顕微鏡下で観察する前に４℃で保存した。他の切片は、実施例４に記載したごとくに、Ｐ６およびＨ１２で免疫染色した。３種の源の細胞すべてを用い、ｍｄｘマウスの照射筋肉への移植の結果、小さな管腔直径の新しく形成されたジストロフィン−陽性繊維が存在した。マウス細胞をマウス組織に移植した場合には観察されたのは少なかったが、マウス復帰突然変異繊維のため予測されたものよりも数は依然かなり多かった。最良の結果は、移植用にドナー細胞として新生児包皮細胞を使用して得られた。筋肉の丁度中心および注射部位の近くの筋肉切片において、６８もの多くのジストロフィン− 陽性繊維が見い出され、これは２つのグループ（一方のグループには３３繊維および他方のグループには注射部位に隣接する３５繊維）に配置される。ヌードマウス筋肉へのヒト筋原性細胞の注射後に、他の研究者によって報告されているものよりもかなり多数のジストロフィン−陽性繊維が見い出された。現在までのところ、最良の結果は、３×１０⁵細胞をマウス筋肉に移植した後における５％のジストロフィン−陽性繊維の存在である。他の研究者は、かなり多い数の筋原性細胞をヌードマウスのＴＡ筋肉に移植している。これらの宿主はｍｄｘでなく、彼らは、新しく形成されたジストロフィン−陽性繊維が宿主筋原性細胞とマウス筋肉との融合によって形成されたことを示すために、ヒトジストロフィンに特異的なジストロフィン抗体を使用した。宿主ヌードマウスを使用して、彼らの最良の結果は、３．６％のジストロフィン−陽性繊維であり、これは１０⁷細胞の移植後には、注射されたものの３３倍細胞となった。実施例６マウス皮膚繊維芽細胞への遺伝子の導入、繊維芽細胞のｍｄｘマウスへの移植、および宿主マウスの筋肉繊維における遺伝子の発現ｍｄｘマウス筋肉への移植用のマウス皮膚繊維芽細胞を、ｌａｃＺ遺伝子を担持するモウスモロニー白血病ウイルスレスロウイルスベクターで感染させた。この遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードし、これは細胞株で発現されると、β −ガラクトシダーゼの通常の基質を染色手法で使用すると、青色に染色する。レスロウイルスベクターを含有する産生細胞は、Ｊ．Ｐｒｉｃｅ博士、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ＭｉｌｌＨｉｌｌ，ロンドンから入手したが、このベクターは広く入手可能である。ｌａｃＺ遺伝子を担持するレスロウイルスに加え、それは、ネオマイシン耐性遺伝子も含有する。かくして、標的細胞をレスロウイルスベクターで感染させた場合、感染したいずれの細胞もネオマイシン−耐性遺伝子を保有する［Ｐｒｉｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，１５６−１６０（１９８７）］。これにより、レスロウイルスによって感染され、従って、ｌａｃＺおよびネオマイシン耐性について２つの挿入された遺伝子を保有する細胞の選択が可能となる。前記したごとくにペニシリンおよびストレプトマイシンを補充せず、４００μｇ／ｍｌのネオマイシン類似体であるＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を補充した増殖培地中で細胞を増殖することによって選択を行う。レスロウイルスベクターに感染した細胞のみがこの選択培地で生き残るであろう。実施例１パート１に記載したごとくに、マウス皮膚繊維芽細胞を密集下まで調製した。培養培地を取り出し、レスロウイルスベクターをパッケージする産生細胞系の増殖を維持するために使用されてきた培地３ｍｌで置き換えた。培養培地には、８ｍｇ／ｍｌの「Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ」（レスロウイルスが標的細胞、すなわちこの場合には皮膚繊維芽細胞に付着するのを助ける薬剤）を添加した。産生細胞培地を３時間後に取り出し、正常な増殖培地で置き換えた。２４時間後、増殖培地を取り出し、４００μｇ／ｍｌネオマイシンＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含有する培地で置き換えた。レスロウイルスベクターでの培養の感染の２４時間内に、レスロウイルスで感染されなかった細胞は分裂を停止し、１週間までには、それらは死滅した。従って、残存する細胞をＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含有する培地中に維持し、増殖させたそれらの数を増加させた。生き残ったすべてのこれらの細胞はｌａｃＺ遺伝子を含有していた。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有するレスロウイルスで感染させた皮膚繊維芽細胞をｍｄｘヌードマウスの筋肉に移植した。この移植の３週間後、筋肉を取り出し、実施例１切片５に記載したごとくに、切片化のために調製したが、この場合、切片を組織学的に調べ、β−ガラクトシダーゼ活性についても分析した。これは、（実施例１で報告した組織学的およびジストロフィン分析用の８μｍとは対照的に）１２μｍの低温切片に切断することを含むものであった。切片を以下のごとくに処理した。１．氷上でＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで１５分間固定した。２．氷上、ＰＢＳ＋２ｍＭ塩化マグネシウム中で軽く洗浄し、次いで、新鮮な洗液（ＰＢＳ＋２ｍＭＭｇＣｌ₂）で１０分間洗浄した。３．氷上、界面活性剤溶液中に（すなわち、ＰＢＳ＋２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％「ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０」）１０分。４．Ｘ−ｇａｌ溶液、β−ガラクトシダーゼ用の基質、すなわち、２０ｍＭフェリシアン化カリウム；２０ｍＭフェロシアン化カリウム；２ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％「ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０」、１ｍｇ／ｍｌＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−Ｄ−ガラクトシド）中、３７℃にて、暗所で一晩インキュベートした。５．室温にてＰＢＳ中で２×５分洗浄した。６．蒸留水で１回軽く洗浄した。７．アルコールによって脱水した。すなわち、５０％で５分間；７０％で５分間；１００％で５分間。８．「Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ」（洗浄剤）で２×５分処理した。９．ＤＰＸに固定した。Ｘ−ｇａｌプレート上で得られた青色の斑点は、ｌａｃＺ遺伝子が首尾よくマウス筋肉で発現されたことを示す。また、これらの同一筋肉繊維は、免疫染色によるとジストロフィン−陽性であることが判明し；再度、Ｐ６およびＨ１２抗体を共に用い（実施例４参照）、ジストロフィン染色でβ−ガラクトシダーゼ産生の局在化があった。従って、これらの結果は、エクス・ビボ（exvivo）で皮膚繊維芽細胞に導入された遺伝子は、マウスに移植された場合に照射ｍｄｘマウスの筋肉繊維内で発現され、また、これらの繊維もジストロフィン−陽性であることを示す。これはもう１つの重要な結果である。というのは、これらの繊維は、挿入されたｌａｃＺ遺伝子およびｍｄｘマウスで通常は存在しないジストロフィン遺伝子産物を発現するので明らかに復帰突然変異体ではないことを示すからである。実施例７マウス皮膚繊維芽細胞への遺伝子の導入、負傷した筋肉組織のインプラントを有する正常マウスへの該繊維芽細胞の移植、および再生する筋肉繊維における該遺伝子の発現ｌａｃＺ遺伝子が外傷後に再生する筋肉で発現されるか否かを判定するために実験を行った。Ｃ５７Ｂ１／１０株のマウスを使用した以外は手法は前記と同様であった。これらのマウスはジストロフィン遺伝子を発現するが、ｌａｃＺ遺伝子を皮膚繊維芽細胞に導入すると、新しく形成された筋肉繊維の繊維芽細胞起源であることを確認可能とする。最初の実験を行い、そこでは、宿主マウスの照射したＴＡ筋肉を細かく切り（ minced）、細切状態で宿主の脚に再挿入した。３×１０⁵個のｌａｃＺ含有マウス皮膚繊維芽細胞をこれらのマウスにおいて細切した筋肉に移植すると、筋肉の再生は観察されず、筋肉部位は繊維脂肪結合組織によって置き換えられた。また、青色の着色も観察されなかった。筋肉の正常構造は細切によって完全に破壊されたので、前記実験は非現実的に働くと感じた。従って、全筋肉移植片を用いて、この実験を反復した。これは、宿主の伸筋デイジトラム・ロンギス（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｕｍｌｏｎｇｉｓ）（ＥＤＬ）筋肉の末端腫を切断し、それを所定の位置で元に縫合することを含む。これは、筋肉が全体として変性し再生することを引き起こす。何故ならば、それは末端鍵切断の間に神経および血液供給から切り離されたからである。次いで、それを再生させ、その神経および血液供給は再生段階の間に筋肉に再侵入する。ｗａｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ３６８，４０６−４０７（１９９４）に記載されているごとく、ＥＤＬの縫合は、隣接する腓骨筋肉の末端鍵の回りに結んで、ＥＤＬ筋肉が張力下に保持されることを確実とした［より包括的には、Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら、Ｊ．Ｍｕｓ．Ｒｅｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｔｉｌ．１４，１２１−１３２（１９９３）］。［もし筋肉が張力下に保持されないならば、筋肉は萎縮し、実験は失敗する］。脱を縫合した３日後、実施例１パート４におけるごとく、細いピペットを用いる注入によって、皮膚繊維芽細胞を筋腹に導入した。３×１０⁵個のｌａｃＺ−含有マウス皮膚繊維芽細胞を、このように再生しているＥＤＬ筋肉に移植すると、実質数のβ −ガラクトシダーゼ陽性繊維が、非照射ＥＤＬ（および照射ＥＤｌ、それで？）で行うと、見い出された。実施例８ヒトジストロフィン遺伝子を保有する、トランスジェニックマウスに由来する皮膚繊維芽細胞のｍｄｘマウス筋肉への導入本実験は、ジストロフィン−陰性マウスを、ヒトジストロフィン遺伝子を移植によって導入した場合に該遺伝子を発現するようにできるか否かを示すために行った。皮膚繊維芽細胞は、全長ヒトジストロフィン遺伝子につきトランスジェニックであるｍｄｘマウスの皮膚に由来する。すなわち、それらはｍｄｘバックグラウンドを有するが、トランスジーンのためにジストロフィン−陰性である（Ｎ．Ｗｅｌｌｓら、ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎ．１，３５−４０（１９９２））。実施例１パート１におけるごとくに、ｍｄｘトランスジェニックマウスからの皮膚繊維芽細胞を増殖させ、実施例１パート４に記載したごとくに照射ｍｄｘ筋肉に注射した。移植３週間後、注射した筋肉を取り出し、低温切片を筋肉から切り出し、組織学およびジストロフィン−陽性繊維の存在について分析した。組織学的検査において、切片は、未成熟の新しく形成された筋肉繊維の多数の存在によって特徴付けられた。Ｐ６抗体で染色すると、４０％までの個々の筋肉切片の領域はジストロフィン−陽性繊維を含有していた。かくして、ジストロフィン遺伝子がトランスジェニック経路によって導入されている皮膚繊維芽細胞を移植したｍｄｘマウスにおいて、多数のジストロフィン−陽性繊維が観察された。これらの実験におけるジストロフィンの唯一の源は、ヒトジストロフィン遺伝子を保有する移植されたトランスジェニック皮膚繊維芽細胞からであった。Ｐ６抗−ジストロフィン抗体はヒトもしくはマウスジストロフィンと反応する。従って、切片はヒトジストロフィンに特異的な抗体で染色されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月２９日【補正内容】変性障害にも適用できる。これは外傷を含むが、勿論、筋肉「構造」が完全に破壊された程重症の負傷は含まない。患者がジストロフィン産生またはもう１つの筋肉特異的遺伝子を欠くまたは実質的に欠く場合、あるいは正常下濃度において遺伝子を保有する場合、投与される皮膚繊維芽細胞は関連する必要なＤＮＡを含有する。皮膚細胞は、好ましくはそれが細胞核内に組み込まれるように、いずれかの常法にてこのＤＮＡでトランスフェクトできる。１つのかかる方法は、アデノウイルスまたはアデノウイルス関連ベクターのごときウイルスベクターに関連ＤＮＡを組込み、該ベクターで繊維芽細胞をトランスフェクトすることである。安全要件に従い、別法としてレトロウイルスベクターを使用することもできる。皮膚繊維芽細胞は遺伝子治療用にレトロウイルスベクターで感染されている。例えば、Ｊ．Ｈ．Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５１７３−５１７７（１９９０），Ｄ．Ｓｔ．ＬｏｕｉｓｅおよびＩ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ，同上，８５，３１５９−３１５４（１９８８），Ｔ．Ｄ．Ｐａｌｍｅｒら，Ｂｌｏｏｄ７３，４３８−４４５（１９８９）およびＲ．Ｉ．ＧａｒｖｅｒＪｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７，７６２− ７６４（１９８７）参照。かかる方法を使用し、これらの文献の第ＩＸ因子およびアルファ−１アンチトリプシン遺伝子に代えてジストロフィンまたは他の筋肉 −特異的ＤＮＡで置き換えることができよう。もう１つの方法は、筋肉特異的ＤＮＡの繊維芽細胞への直接注入である。関連ＤＮＡの繊維芽細胞への取り込み方法は重要でなく、他の方法は当業者に明らかであろう。関連ＤＮＡは全長遺伝子またはその有効な一部だけでもよい。いわゆるジストロフィンミニ遺伝子のごとき部分的遺伝子（Ｍ．Ｄｕｎｃｋｌｅｙら、ＦＥＢＳ２９６，１２８−１３４（１９９２）参照）は、特にレトロウイルスベクターが使用されるべき場合に、ＢＭＤおよびＤＭＤ双方で有用である。Ｎ．Ｗｅｌｌｓら、ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎ．１，３５−４０（１９９２）によって記載されている全長ジストロフィン遺伝子は、ベクターがかかる長いＤＮＡを存在させることができないか、またはパッケージできない方法で有用である。当該分野でよく知られているように、使用される技術によって必要とされるときは、適当な調節配列を含ませる。好ましくは、本発明の治療を適用する場合、患者は筋肉細胞を全く欠くものではない。筋肉に存在する走化性因子は繊維芽細胞を筋肉細胞に変換するのを助けることができる。本発明は、特に細胞核内にジストロフィン蛋白質の有効な一部または全部をコードするＤＮＡが組み込まれた皮膚繊維芽細胞を特に含む。該ＤＮＡは前記したごとく全長または部分的遺伝子であってよい。かかる細胞を含有する細胞懸濁液および生物学的に純粋な、特に無血清の培養培地が本発明内に含まれる。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月１８日【補正内容】請求の範囲１．ヒトまたは動物の身体から単離され、かつ、筋ジストロフィーを治療するのに必要な関連ＤＮＡがヒト介在によって取り込まれた皮膚繊維芽細胞。２．ヒトまたは動物の身体から単離され、かつ、筋ジストロフィーを患う患者において欠くか正常下濃度で存在する種類の、筋肉特異的遺伝子の有効な一部または全部のＤＮＡがヒト介在によって繊維芽細胞に取り込まれた皮膚繊維芽細胞。３．筋ジストロフィーを治療するのに必要な関連ＤＮＡがヒト介在によって取り込まれた皮膚繊維芽細胞であって、該細胞は筋ジストロフィーを患う、免疫学的に適合する患者の治療に使用されるものである前記皮膚繊維芽細胞。４．筋ジストロフィーを患う患者において欠くかあるいは正常下濃度で存在する種類の、筋肉特異的遺伝子の有効な一部または全部のＤＮＡがヒト介在によって繊維芽細胞に取り込まれた皮膚繊維芽細胞であって、該細胞は筋ジストロフィーを患う免疫学的に適合する患者の治療に使用されるものである前記皮膚繊維芽細胞。５．ドナー皮膚繊維芽細胞が該治療において治療すべき患者から採取されたものであり、該ＤＮＡが、該治療の前に、ヒト介在によって該ドナー細胞に取り込まれる請求項３または４に記載の皮膚繊維芽細胞。６．患者への投与が、患者の筋肉内またはその近くに皮膚繊維芽細胞を移植するか、あるいは患者の筋肉またはその近くにそれを注射することによる、治療用の請求項３、４または５に記載の皮膚繊維芽細胞。７．該ＤＮＡがジストロフィン遺伝子からのものである請求項１、２、３、４、５または６記載の皮膚繊維芽細胞。８．デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療用である請求項７記載の皮膚繊維芽細胞。９．筋ジストロフィーを治療するのに必要な関連ＤＮＡがヒト介在によって取り込まれた細胞調製物の製造における皮膚繊維芽細胞の使用。１０．筋ジストロフィーを患う患者において欠くまたは正常下濃度で存在する種類の、筋肉特異的遺伝子の有効な一部または全部のＤＮＡがヒト介在によって取り込まれる、筋ジストロフィーを患う免疫学的に適合する患者の治療用の細胞調製物の製造における皮膚繊維芽細胞の使用。１１．出発皮膚繊維芽細胞が該治療で処置すべき患者から採取される請求項９または１０に記載の使用。１２．該ＤＮＡかジストロフィン遺伝子に由来する請求項９、１０または１１に記載の使用。１３．デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療用である請求項１２記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベテンコート・デ・メデイロス・レルバス，ジヨアオ・カルロスポルトガル国、ペー−3000・コインブラ、エリ・セー・エ・エシ・ケー・ア・22、ルア・マチヤド・デ・カストロ

Claims

【特許請求の範囲】１．皮膚繊維芽細胞を、筋肉特異的遺伝子によって発現される産物を産生できる筋原性細胞に変換するのに効果的な条件下で、患者の筋肉細胞にまたはその近くに免疫学的に適合する皮膚繊維芽細胞を投与することを含む、患者において筋肉障害を治療する方法。２．皮膚繊維芽細胞を非マウス患者におけるのとできる限りほぼ同じ条件下でマウスに投与すると、これらのドナー皮膚繊維芽細胞の少なくとも一部が、該ドナー細胞間の融合によって筋原性細胞に変換される請求項１記載の方法。３．ドナー皮膚繊維芽細胞がそれを投与する患者から採取される請求項１または２記載の方法。４．患者への投与が、患者の筋肉内またはその近くに皮膚繊維芽細胞を移植するか、あるいは患者の筋肉内またはその近くにそれを注射することによる請求項１、２または３記載の方法。５．該変換が、処置した患者の筋肉のバイオプシーで見い出されるジストロフィン−陽性細胞の数を増加させるのに効果的である請求項１、２、３または４記載の方法。６．投与する該皮膚繊維芽細胞が、患者の筋肉細胞において正常濃度で存在しない筋肉特異的ＤＮＡを含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．該患者が筋ジストロフィーを患い、投与する皮膚細胞がジストロフィン遺伝子またはその一部を含有する請求項６記載の方法。８．筋ジストロフィーがデュシェンヌ型である請求項７記載の方法。９．該患者が筋肉変性を結果として生じさせる負傷をしている請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。１０．筋肉特異的遺伝子によって発現される産物を産生できる筋原性細胞へ繊維芽細胞を変換するのに効果的な条件下で免疫学的に適合する患者に投与するための細胞調製物を製造するための、皮膚繊維芽細胞の使用。１１．さらに、請求項２〜９のいずれか１項に記載の特徴の１以上を含む請求項１０記載の使用。１２．請求項６または７記載の筋肉特異的ＤＮＡを含有する皮膚繊維芽細胞。