TW203627B - - Google Patents

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Description

經濟部屮央橾準局EX工消费合作社印製 〇3〇；- , ~五、發明説明（1) 本申請案為条列號07/470, 674之部份連績 案，標題為利用連接酶鏈反應放大檫的核酸之改良方法， 公告於1 990年1月26日，其享有一般的所有權，且 在此列為本案參考之用。 背署 本發明是有關放大標的核酸之方法，且特別是進行連 接酶或聚合酶鏈反應放大作用之方法，其中至少一値探針 或引子在反應起始位置上被可逆地修飾，因而其非酵素催 化反應之受質。可供示例之處理修飾包括反應基豳之化學 阻斷，添加一個以上之核酸鹸基以形成''突出物"，或缺 乏一個以上之核酸_基以形成"凹處〃。此經修飾之末端 可避免或減少樣的物依賴性偽裝訊號之發展，且後來以檫 的依賴性方式校正以使進行放大作用。 於許多例子，以核酸為基礎之診斷分析法之可行性是 依據放大由僅數分子標的物所産生訊號之能力而定。雖然 訊號放大作用是一値涫在的解決方法，標的物放大常是以 核酸為基礎之分析法中的較佳解決方法。樣的物放大作用 涉及被命名為標的物之核酸段落之重覆仿傚或後製。 於稱之為聚合酶鍵反應（PCR)之檫的物放大作用 技術中，多置使用一對引子（一値第一及一個第二），以 與檫的的核酸互補股之外側端雜交。各自引子由聚合酶伸 展，採用標的核酸為模板。伸展産物本身變成標的序列， 接著自原來的揉的股解離。新的引子再雜交並由聚合酶伸 (請先閱讀背而之注意事項洱碭寫本頁) 卜紙張尺度遑用中騙家«毕(CHS) 規格(210 X297公*) 81. 2. 20,000 3 Λ 6 Π 6 經濟部中央桴準局貞工消费合作社印製 五、發明説明（2 ) 展，重覆此循環以幾何地增加標的序列分子之數目。PC R進一步描述於美國專利第4, 683, 1 95及4，6 8 3 , 2 0 2 號中。 標的物擴大作用的另一個機制，已知為連接酶鍵反應 (LCR)。於LCR,過置使用二橱第一（一號及二號 探針）及二個第二（三號及四號）探針。一號探子與榡的 股的第一段雜交，二號探子與標的股的第二段雜交，第一 及第二段是連缠的，如此第一探針以5 —磷酸_3 羥基 之相互關係互相緊靠，且如此連接酶可共價地融合或連接 二個探針成一個融合産物。此外，三號（第二）探針與一 號探針雜交，四號（即第二）探針與二號探針以相似之緊 靠方式雜交。當然，若樣的物最初是雙股的，第二探針也 可與互補於第一例中之標的物雜交。一旦第一探針之融合 股自標的股分出來，其可與三及四號探針雜交，其連接形 成一値互補的，第二値融合的産物。為了了解LCR及此 處所述之改良方法，了解融合産物像與樣的物或其互補物 官能上相當是十分重要的。藉著雜交及連接之重覆循環， 可達成標的序列之放大作用。此技術詳述於EP_A_3 20 308中，其全部掲示已列為本案參考之用。 放大作用反應的一個大力量是其偵測極少鸡標的分子 之能力。然而，很重要的一點是放大作用過程必須具高度 •特異性，因為非標的序列加上訊號之放大，可潛在地破壊 放大過程之可倍度。PCR及LCR均可産生甚至放大非 特異性或偽裝之背景訊號。由於PCR及LCR不同的原 (請先閲讀先而之注意事項#塥窍本頁) k紙張尺度遑用+ 家«準(CHS) 規格(210 x 297公*> S1. 2. 20,000 4 經濟部屮央標準局员工消费合作社印51 五、發明説明（3 ) 則，因此互相間之背景訊號來源不同，將分別討論。 與連接酶鏈反應相關的一値潛在問題是由標的物獨立 地與探針連接所致之背景訊號。由於三號探針與二號探針 雜交，且四號探針與二號探針雜交，探針當多量加入時可 在其中很容易造成雙聯式。這些雙聯物會不顧標的物之存 在而連接形成一値融合産物，其則與欲求之放大樣的物無 可區別，然其仍可以支持進一步的放大作用。雖然這些雙 聯物不顧標的物之平齊端連接作用是極罕有事件，但足以 共通地造成診斷分析中不必要之高背景訊號。 於PCR中共同確認的偽装背景訊號來源，是引子序 列與非放大之DNA分字區域之雜交作用。通常這些雜交 之所以發生是因為樣的樣品除了樣的序列本身以外，尚含 有與標的序列具某程度相似性之其他序列。雖然引子與逭 些相似序列之雜交並不如標的序列般可能，但乃有某程度 之雜交。當此種非欲求之非特異性雜交發生時，若引子分 子的3 /末端核苷酸成功地與標的分子之互補核苷酸雜交 ,則引子伸展作用可能由聚合酶成功地啓動，造成異於樣 的序列之寡核苷酸生成。在某些狀況下，此種核苷酸甚至 可進行對數地放大作用。不論放大與否，在某些分析狀況 下，偽裝之核Μ酸序列可被當做捶的序列，且因此造成錯 誤的結果。 發明要點 雖然探針及引子在L C R及P C R中分別有顯著不同 本紙張足度遑用中騙家«準(CHS) f 4規格(210X297公*) 81. 2. 20,000 Λ 6 Π 6 經濟部中央樣準爲员工消费合作社印51 五、發明説明（4 ) 的角色，而此處所應用的 ''起始子〃及''探子/引子〃 一 詞是一般討論可應用的。本發明的第一個目的是藉著降低 偽訊號産生之發生率，以增進以核酸為基礎分析法之蚕敏 性。此目的藉著修飾Μ少一個探子/引子末端而符合於本 發明，如此由於探子/引子所造成偽訊號展開之可能性即 大大地減低。只有當經修飾之探子/引子與樣的物特異雜 交後，經修飾之末端才以一種標的物依賴的方式進行a校 正〃，以令探子/引子可參與酵素性放大反應中。 本發明的一個特色，用於LCR或PCR,係提出核 酸探子/引子，其中一個化學部份阻斷或遮蓋一個必須涉 及於放大反應中酵素催化步驟之基圃。此酵素步驟僳指.L CR中的連接作用，及PCR中之伸展或延伸作用。不論 在何種情況下，探子/引子可與標的物雜交，並起始酵素 反應（因此稱之為+起始子〃），且經連接或伸展之産物 稱之為> 放大産物〃）。選擇阻斷基園，如此只有當探子 /引子與樣的物雜交時，其才可被酵素所移去。在另一方 面，修飾探子/引子使一端含有額外驗基之突出物。之後 鹼基以一種樣的物依賴方式解離，以令放大反應可發生。 依據LCR待有的另一特色，探子在相對於連接點有 凹處，其與樣的物雜交時可造成一値裂口。此裂口再以標 的物依賴方式充填，使探子可連接。裂口充缜可由一種以 上探子伸展而完成，或使用額外的四號及五號探子，再行 連接作用。 本發明的另一方面是提出區別第一序列及第二序列的 BL尺度遑用十«家《準(CHS)f4規格(210 x 297公《) -6 - S1. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項洱堝寫本頁)
- A 經濟部屮央搮準局员工消费合作社印製 五、發明説明（5 ) 改良方法，二者的差異只在標的區域中的一値單一鹸基。 可將第一序列看做一個標的物，第二序列可被視為一個潛 在的交叉反應股而被區分出來。 簡言之，本發明是有關酵素性放大標的核酸序列之方 法以生成放大産物，其中酵素利用：一値核酸起起子；可 與其雜交而當成模板的標的序列或放大産物；及至少一値 額外的含核苷之反應物，當做建築材料以酵素性组合互補 於標的物之放大産物，放大産物本身當做進一步的模板； 其中改良方法包括： Λ (a)提出可與樣的物雜交之必要起始子，其中至少 一個起始子被修飾，如此當起始子雜交時，酵素實質上無 法作用於起始子上當其受質，如此放大産物無法被組合； (b) 樣的物若存在時，將起始子與之雜交，以形成 一個起始子一模板複合物； (c) 以一種檫的依賴方式校正修飾作用，以令起始 子一模板複合物可為酵素所作用； (d) 酵素性組合放大産物；及 (e) 自檫的物中解離放大産物，並重覆雜交，校正 及組合步驟以擴大欲求之檫的序列。 因此，所使用的"起始子〃傜指於PC R中所用的引 子或LCR中所用的一値以上的探子。當用於伸展作用/ 延伸作用内容時，含核苷之反應物包括核苷三磷酸或其類 似物。當用於連接作用内容時，起始子P包括一對配對探 子中的一値探子（即一値第一探子及/或一値第二探子） (請先間讀背而之注意事項再蜞寫本頁) 本紙ft尺度边用中家«準(CNS) Τ 4規格(210X297公;Jlr) 81. 2. 20,000 Λ 6 η 6 經濟部中央橾準局员工消费合作社印製 03〇'- ·'_ 五、發明説明（6 ) ，而含核苷之反應物包括一個第二寡核苷酸探子（即成對 之另一配對探子，其’最終與起始子連接）。 修飾之校正依據所做的修飾而定。然而，為了可完全 了解本發明的益處，校正必須在實質上經修飾之起始子與 標的或放大産物雜交時才進行，後者之放大産物由酵素性 組合而成，任一者均可當做正確的模板。因此，校正像 依賴模板的"。校正及組合用試劑以下有詳述。 附圖簡要説明 圖1為先前技蕤已知之連接酶鏈反應之過程。 圖2A及B代表突出之具體實例，其中R代表阻斷部 份，且'' rBrBrB 〃代表核糖核苷酸伸展作用。 圖3代表第二具鼸實例之單一裂口變化。 圖4代表第二具鼸實例之一般化雙重裂口變化。 圖5代表第二具鼸實例之第三種變化，利用額外的探 子以充填裂口。 詳細說明 針對本發明目的，所描述的樣的序列是單股的。然而 ,應了解此中包括樣的確實是雙股的，但在與探子/引子 雜交前先簡易地自其互補物中分離。於雙股樣的物例子中 ，第二探子（於LCR是三號及四號探子，及B—; 於PCR是額外的引子，B)藉著與檫的互補物雜交也參 與於起始步驟。於單股檩的物例子，第二探子或引子不參 氏Λ尺度遑用中家«準(CN5)T4規格(210X297公 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再艰寫本頁). -8 -
經濟部中央標準局EX工消#合作社印製 五、發明説明（7 ) 與起始雜交步驟，但可參與接缠的雜交步驟。標的序列可 包括去氣核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)。 本案前後文中，所設計之”引子"（/)用來表示互 補的鹺基或序列。一値探子或引子若與序列雜交則是"互 補〃於另一序列，且在已雜交區域中有實質上互補之鹼基 對。因此，探子A可互補於A邸使其有未與A/相連 之末端。對B與B/亦然。同樣地，短序列Xn及Ym分 別具有互補序列，命名為Xn /及Ym/。最後，一個單 一齡基，如之互補物命之為Q/。關於此處所用之序 列互補〃包括在雜交區中有未配對驗基對之序列，但 其可在分析條件下使之雜交。’ 也要了解，a 4驗基〃一詞於内容是DNA時應指B 嗦昤（G),胞嘧啶（C),腺嗦昤（A)及胸腺嘧啶（ T );而於内容是RNA時，指的是鳥嘌昤（G),胞嘧 啶（C),腺嗦昤（ot),及尿嘧啶（U)。此名詞也包 括上文命名驗基之類似物及衍生物。雖然，簡併的篇基一 肌苷（I)也可應用於本發明中，但依據本發明最好不要 在探子的經修飾部份中使用I。 I . L C R 述及LCR,其為本發明一値重要特色，其中不採用 可形成平齊端雙聯體的二對探子，探子對之一的至少一値 探子，最初包括一値★經修飾的〃末端，其使所生成的雙 聯體> 非平齊〃及/或非連接酶所催化之二探子雙聯鼸融 (請先閲讀背而之注意亊項科蜞寫本頁)
T 本紙張尺度遑用t 瞩家楳率(CNS)T4規格(210x29/公教） S1. 2. 20,000 9 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（8-) 合物中之適當受質。一個> 經修飾的末端"偽基於連接作 用點而定義，並非基於其互補之探子。一個a經修飾的末 端〃具有（1)在一基園上（如5 **磷酸或3 /羥基）有 一値阻斷部份（或額外的驗基殘基），其在一般的LCR 條件下必須參與於連接酶催化之融合作用（如圖2A及 2B中之探子A):或（2)省略掉之齡基，以在一個探 子末端及下一値探子末端之間形成一個a裂口 〃（如圖3 之探子B;圖4之探子A/及B;及圖5中之探子D及E )〇 基於本發明案方便起見，將第一種型式之經修飾末端 稱之為SN突出物"，突出物為一値額外的阻斷部份或額外 的鹹基殘基，其當與標的序列雜交可伸展在連接作用點之 外。a突出物〃一詞，並不應與其互補一値探子之伸展者 搞混，原因在於其末必是相連的事實。第二種型式之經修 飾末端，在此稱之為a凹處〃，凹處為二傾第一或第二探 於雜交至標的物後，其間之裂口。這些經修飾末端之存在 ，可減少互補探子雙聯體於標的物不存在時互相間平齊端 連接所造成之偽陽性訊號。 修飾處理之> 校正~傺實質地進行，以使探子成為可 連接的。此處所用的a校正"係指以一種樣的依賴方式， 使二個第一探子或二個第二探子可與其配對連接。因此， 只有逭些可與標的，標的互補物，或由其中形成之聚核詧 酸序列雜交之探子才可被> 校正"。> 校正〃可以許多方 法完成，依所使用之經修飾末端型式而定。 (請先閲讀背而之注意事項再碭寫本頁) k紙Λ尺度遑Λ中國家《準(CNS)f 4規格(210X297公Λ) -10 - 81. 2. 20,000 A 6 Π 6 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（9 ) 此中所用的N'連接點〃或連接欲求點〃傜指二個探子 配對間的一個特殊位置，其像以一種模板一依賴方式連接 。在此位置，經校正"之探子以5 / —磷酸一 3 /羥基 之相互關像緊靠其配對。對4値LCR探子的一毎一組而 言，有二個a連接點〃，一點給第一探子配對，一點給第 二探子配對。於傅統的LCR中，此二個連接點互相對應 ,因此當探子對互相雜交時可形成平齊端之雙聯體。於本 發明中，連接點只有在> 突出物〃具體實例中可互相對立 。其在a凹處〃具體實例中靠著裂口而被一値以上鹸基取 代。連接作用的確實點依具體實例而定，且因此此名詞於 每一具賭實例中被進一步定義。 每一探子可k括去氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。利用傅統的核苷酸胺基磷酸化學合成欲求的 探子是例常的工作，且儀器可購自Appliced Biosystems， Inc·» (Foster City. (A)； DuPont (Wilmington. DE) ，或Mil iqen，（Bedford, MA)。探子5 —端之磷酸化作用 ，雖然必須依賴連接酶之連接作用，但也可利用激酶完成 ，如技藝中已知的。 在本案前後文中，鹼基X,Y及Q,及其互補物如所 述像選自4齡基中的某些亞集（N或M)。實際上序列並 非> 選擇〃的，而是由檩的股之序列所指令。在本内容中 w選擇的〃一詞意表具有欲求持性之標的序列座落處，且 探子包圍在標的序列適當片段處構築。 一般而言，本發明的方法包括以下之重覆步驟：(a (請先閲讀背而之注意事項洱填寫本頁) k紙張尺度遑用中《家《毕(CNS)T4規格(210X297公*) 81. 2. 20,000 -11 - 經濟部中央橾準局员工消#合作杜印製 ，_ν 五、發明説明（ίο) )將經修飾之探子與標的物雜交（且，若是雙股則存在有 標的互補物，則與標的互補物雜交）；（b)以樣的依賴 方式校正修飾以使探子可連接；（c)將經校正之探子與 其配對連接以形成一個融合的或連接産物；及（d)自標 的中解離融合産物，並重覆雜交，校正及連接步驟以放大 欲求之檫的序列。步驟（a), (c)及（d)基本上在 所有具體實例中均相同，且可一起討論。其通常為可應用 於傳統LCR之相同步驟。步驟（b)依所應用的處理修 飾型式而變化，且毎一種不同型式將分別討論。 經修飾探子與標的之雜交（及任意至榡的互補物）在 先前技蓊中有足夠的解釋；如EP — 320 308。探 子長度，探子濃度及條件的迫切性均影W雜交可發生之程 度及速率。最好，探子夠長可提供欲求之特異性；即避免 與樣品中之任意序列雜交。典型而言，長15至100値 鹼基之探子可用於此目的。目前較佳者為長約15至約4 0個鹼基之探子。 探子以大約等莫耳濃度加入，因預期其可化學計置地 反應。每一探子存在的濃度範圍為約5«撖莫耳濃度（ nM)至約90nM;最好是約10nM至約30nM。 用於毎一反應中之探子最適當置也依據循環數而定，此循 環數目像指必須進行之循琛。對一般精於此技藉人士可容 易地決定出最佳濃度。 條件之迫切性對於技藉人士通常是已知的，但依溫度 ，溶劑及其他變數而定。在這些變數中最容易控制的可能 Λ 6 ΙΪ6 (請先閲讀背而之注意事項#埸寫本頁) 線- k紙張尺度逍用中諷家«毕(CNS) 1* 4規格(210 X 297公*) 81. 2. 20,000 -12 - 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 〇i5l〇 · * Λ 6 __Π6__ 五、發明説明（11) 是溫度，因此溫度通常是LCR進行中變化最迫切之變數 。由於進行本發明所需之迫切條件和一般LCR的不同， 進一步詳述確實無必要，例常之參與者可由以下之實例引 導。 於一般方法中之下一步驟是緊接著待異校正步驟，且 包括一個探子與其相鄰配對之連接作用。因此，毎一第一 探子連接至其相開之第一探子，且每一値第二探子連接至 其相開的第二探子。一個'"相鄰〃的探子為可以連鑛方向 與標的雜交的二値探子中任一値，其中一値以其經磷酸化 之5 >端與另一配對探子之3 /羥基端緊接。經修飾之末 端經由樣的依賴方式校正後可産生> 相鄰〃的探子。由於 酵素性連接為二相鄰探子共價粘附之較佳方法，因此> 連 接作用"可應用於本案全文中。然而，w連接作用〃為一 般說明，且要了解包括二探子共價粘附的任何方法。若酵 素性連接作用不同的另一方法為先一連接作用，述於EP -A - 3 2 4 616 中。 進行較佳酵素性連接作用步驟之條件及試劑，對於一 般精於此技蕤人士是已知的，且述於所述參考文獻之背景 中。可用於本發明中之連接試劑包括原核動物之連接酶， 如大腸桿菌連接海，T4連接酶及唾熱豳連接酶（如AT CC 27634),教示於 EP — 320 308。像 一種目前為較佳的連接酶，因其在LCR熱循琛中仍有保 持活性之能力。缺乏熱穩定之連接酶，則於毎次循琛重覆 時要再加連接酶。真核細胞之連接酶也可使用，包括果級 紙張尺度遑用中觸家«準(CNS)甲4規格(2丨0x297公*) 81. 2. 20,000 -13 - (請先間讀背而之注意事項#蜞寫本頁) Λ 6 η 6 經濟部屮央標準局员工消费合作社印毂 · 五、發明説明（12) 之 DNA 連接酶，由 Rabin et al.，報告於 J. Biol. Chem .261:10637-10647 (1 9 8 6) 〇 一旦經連接，融合的探子自標的解離（如熔化），且 於傳統LCR時此過程重數次。重覆循環之次數可由1變 化至約100,目前則以由約15至約70為較佳。 希望可設計探子，如此當與其互補的（第二）探子雜 交時，遠離欲求連接點之末端，但本身不會自由參與其他 要的連接反應。因此可避免可連接之不齊或平齊端。若必 須使用此種末端，則應避免或消除游離的5/末端磷酸。 此可經由合成寡核苷酸探子（其正常情況下不帶5 >末端 磷酸基）或經由磷酸酶之使用除去末端磷酸（如由DNA 限解酶水解而生成之寡核苷酸中獲得）而完成。此外，探 子a錯誤的"外側端連接作用，可藉著以> 鈎子"或標誌 部份阻斷至少一個探子之末端而予以避免，此在下文中將 詳述。 經由放大作用後，經放大的序列可由技S上已知的各 種傳統方式偵測。於一値特別佳方式中，鈎子粘附在至少 二値探子可應用的外側端（融合産物之相對末端），且最 好是所有四個探子的外側端。''鈎子〃為具有特異配位一 受髏親和力的任一部份。典型而言，位於融合産物一端之 鈎子（如A之5 /端及A /之3 <端）包括一値抗原或半 抗原，可被塗覆在固相的試劑（如抗體或抗生物素）所固 化。位於另一端之鈎子（如B之3 —端及B ~之5 /端） 含有一値不同的抗原或半抗原，可被標誌或標誌条統所確 紙張尺度遑用中國國家«率(CNS) Ή規格(210X297公龙) -14 - 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再蜞寫本頁) 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 - 五、發明説明（13) 認，如抗饈一酵素共Μ物。鈎子的實例包括：生物素，蜜 光素及異羥基洋地黃毒苷（digoxin),及其他許多技薛中 已知的。之後再加入受質，其為酵素轉化成一値可偵测的 産物。EnZo的EP-A-330 22 1號中描述寡核替 酸，在其一末端粘附有生物素分子。 A·空出的猙修倫支端 如所述的，一個第一具髏實例涉及一値經修飾的末端 ，其中阻斷部份或額外的鹼基加至至少一値探子，超過欲 求連接作用的點。阻斷部份或額外的鹼基包括> 突出處〃 ，且是無法進行平齊端連接作用之理由。於第一變化中， 突出物包括一値化學阻斷作用物，R。 熟知的，標準的DNA連接酶反應必須在受股部份， 在連接點有一値3 /羥基及一値5 /磷酸。許多處理修飾 ，待別是在3/羥基已知可引入一個R基，其可使經修飾 的末端無法參與連接反應，但當經修飾股為雙股結構中的 一部份時其可被除去。此種修飾作用包括以下示例之R基 ,粘附至3/羥基氣以取代氬原子： 0II 一 P - 0 - ZI 0 Η I紙張尺Jtii用中韻韻家«率(CKSJT4規格(210 X 297公*) -15 - 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 經濟部中央橾準局员工消t合作社印製 五、發明説明（14) 其中Ζ選自下列包括：一 H;— (CH2 ) nCHO,其 中η是由1至約3,最好是1或一2;—脱氣核糖；及一 二脱氣核糖。 探子的合成，此探子具有適於被R基修飾之末端，此 係技S中熟知的。例如，具有3/磷酸基之寡核苷酸之化 學合成，述方$Markiewicz and Wyrzykiewicz，Nucl. Ac-ids Res. 17 :7149 - 7158 (1989)。較大 的阻斷基，其具有阻斷3 <磷酸基不受非特異磷酸酶作用 的好處，其可存在於某些實例中，其可由寡核苷酸探子以 末端轉移酶及dUTP或ddUTP反應，再經尿嘧啶糖 基化酶處理而合宜地製備。尿嘧啶糖基化酶之純化教示於 Lindahl等人，J.B.C. 252 : 3286 — 3924 (1 977)。於dUTP加成作用例子中，以強齡處理再用 脲嘧啶糖基化酶處理可用來製備糖基醛衍生物。要了解， 上述所給之R基園實例只供説明而已，且一般有技藝人士 可合成許多變化型式，仍一樣可處理得很好。 酵素核酸内切藤1\^($1货61«，6七&1.，1'111〇1.八〇1€1-sRes.16 :5031-5 0 38 (1988))可除去 此種阻斷基且曝出3 '羥基，這實質上只有當含有阻斷基 之股與互補股雜交時才會如此。雖然經修飾末端之不需要 標的之校正作用極少，此校正作用像由於核酸内切酶IV 於AA<或BB<雙聯式之活性所致，若必要時，其可設 計互補於經修飾末端之探子而予以進一步減少，因如此其 篆尺度遑《 +釀B家《率(CNS) T4規格(210x297公釐) -16 * S1. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央櫺準局貝工消仰合作社印製 五、發明説明（15) 可為一種以上的核苷酸所隱藏。 於突出末端的另一變化中，突出物包括額外的核酸驗 基，一旦探子與標的雜交時其可被解離。突出物可經由其 位於連接作用欲求點之外突而可避免被連接，並立體化學 地阻斷或遮斷基園，其傜強制地參與於連接酶反應中（如 經阻斷末端中所述）。將此與上述的簡易化學阻斷區別者 ，是在於A阻斷〃基之本質及大小（即突出物）。其本來 即是由與探子分子相關之核酸殘基所組成的。然而，基圍 的大小，太大以致當與標的雜交時，令分子之經修飾末端 不能留在連接點近處。再者，由於突出物是可移動的，其 可經由設計使其根本無法參與於連接酶所催化的反應中（ 如可使其5/磷酸基缺乏）。 描述三類突出物，雖然選擇像僅供說明而已。精於此 技蕤人士可了解其他可類似地除去突出物之酵素，而以完 全類似方式使用。實例如下： 1.一個突出物基本上含有核糖核苷酸 (當標的物由DNA組成）； 2 . —個突出物含有一個降低的位置；及 3.—個突出物含有一個鹼基，其造成與標的中一個 鹼基的不配對驗基對。 然而一般而言，突出物必須互補於標的，如此其除去可如 下述之模板依賴性。突出物可含1-10個鹼基，最好長 1 一 5値齡基。 (請先閲讀背而之注意事項冉堝寫本頁) 本蜗張足度遑用中《家«準(CHS) f 4規格(210 X 297公*) -17 - S1. 2. 20,000 03b; 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（16) 1.核糖核苷酸修飾作用。含有核糖核苔酸之DNA 寡核苷酸的合成，述於Atabekov，et al，FEBS Let 2 3 2 : 96_98 (1988)。DNA探子，含有由核糖 核苷酸殘基伸展所組成之經修飾末端者，可用於本發明中 。核糖核苷酸無法呈現一個供連接酶之適當受質，且經修 飾之探子無法被連接或放大，這些伸展作用可在所選用探 子之5 /或3 /端。 v校正〃是核糖核苷酸之除去。稱之為核糖核酸酶Η 之酵素已知自然界中廣泛分佈。其中一種核糖核酸酶Η可 購自Sigma化學公司（Cat# R6501)。此種酵 素可自核酸股中將核糖核苷酸選擇性除去，其中只有當（ 且實質上也是如此）該股與DNA—股雜交時才存在。雖 然對於是否一値待殊的核糖核酸酶（RNAse)除去一 股上所有的，或是除一個核糖核Μ酸外所有的核糖核苷酸 仍有爭議，但此點通常無所諝，因為已知至少有某些連接 酶（如連接酶）可將核耱核苷酸與脱氣核糖核苷酸連 接。對任一恃殊的RNase Η而言，針對LCR目的 可很容易地決定其到底是留下零値或一個核糖核替酸殘基 。我們只需製成二値經核糖修飾的LCR探子組，依據酵 素移去所有的，或除一個以外的所有.核糖核苷酸為基準而 設計，並決定於毎一例子中LCR反應之進行。一旦設定 ，之後即如設定酵素行為。實際上，不同的RNa s e Η種類在3 或5 -處理修飾上多少是可易控制的。對任 一給定之RNase Η種類，此是可由經驗容易地決定 (請先閲讀背而之注意事項再项寫本頁) 本紙Λ尺度遑《中·家樣準(CNS)T4規格(210X297公*) 81. 2. 20,000 -18 - Λ 6 It 6 經濟部中央標準局工消费合作杜印製 五、發明説明（17) Ο 此種核糖核Μ酸經修飾探子可用於LCR反應。當二 個探子配對雜交在標的之相鄰區域，其無法由連接酶相接 » ,且除非或直到RNa s e 校正〃——即自經修飾 之探子除去核糖核苷酸為止。當核糖核苷酸是位於探子的 5 /端時，内部的磷酸基可曝出，當做連接酶反應中之受 質。此排除探子加上此種5 /磷酸之特殊步驟。 一旦連接，經融合的探子如一個新樣的物般作用，如 同在標準L C R中。 2.未配對位置之解離。各種廣泛分佈的酵素（如核 酸内切酶I V ; Simelc et al.,上文）可解離位於未配對 位置處之單股DNA,實質上只有當DNA與其互補物雜 交呈雙聯式時才如此。帶有降低位置之寡核苷酸之合成， *TakeshitaetalJBc 262:101'71 — 10179 (1987)中已有述。可合成經修飾之寡核 苷酸探子，如此可在欲貢獻其端之探子上緊鄰連接點 5 /處定出一個未配對位置，或在欲貢獻其3 /端之探子 上緊鄰連接點3 /處定出一個未配對位置。在何種情況下 ,均可設計互補股以致當一起雜交時，二掴探子將不致使 標的物之未配對位置被所使用之酵素獨立地解離。可設計 帶有二個連接點短分支之探子组，如此除了當探子與真實 之標的雜交之外，於未配對位置之緊鄰區域不致有雙股结 構生成。以此方式，校正作用屬於標的依賴性。 張尺度逍用中國家《率(CNS)甲4規格(210X297公*) -19 - 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) Λ 6 Π 6 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（18) 於與標的雜交之例子中，在未配對位置解離可曝出一 値可被連接酶連接至相鄰探子之一端（像以其位置及化學 本質而連接）。一旦連接後，融合的分子如一個新標的般 作用，如同標準C L R中一般。 3.未配合對，可能在所有> 經修飾〃的寡核苷酸中 最早的為不含特色者，不論雜交狀況如何。此種寡核苷酸 可利用標準商品化試劑，採檫準合成技術容易地製備。然 而，當與標的雜交時，此種探子獨特的處理修飾本身可明 示：在雙聯式中存在一個未配合之鹼基對。已知有許多生 物糸統可用來校正或修補此種未配合之鹺基對。雖然任一 此種糸統，事實上可適合於LCR探子組中用於校正處理 修飾，我們仍將進一步深入討論一値条統，做為一般途徑 之説明。 Karin等人已報告一種酵素（或酵素複合物），Proc Natl. Acad. Sci. USA 86： 8877-88810 ( 1 989),其可待異地確認A相對G之未配對。於此種 a A/G未配對中〃，酵素在含有A之股上，於A及鍵上 下一値殘基間解離。如此，可設計探子，其中突出物藉著 一値A殘基與探子其餘部份分別，且當探子與真實的標的 雜交時，A殘基發生在相對於G殘基處。一旦與真實標的 雜交後，突出物自探子剩餘部份中解離，包括未配對之A 殘基，曝出一末端其因著其位置及化學本質，可由連接酶 連接至位置上緊鄰之探子。一旦連接後，生成之融合分子 本紙張尺尽遑用中家榣準(CNS)甲4規格(210 x 297公*) S1. 2. 20,000 -20 - (請先閲讀背而之注意事項再蜞寫本頁) Λ 6 Η 6 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（19) 如標的物般作用，且應用於接缠的LCR循環中。 至於進一步待色，此種程序可用來決定其中呈現對偶 性之特異鹼基區域本身。例如，於一値特異的AG未配對 實例中，約5/6的此種變化可容易地分析。特殊區域之 最初本身必須為A, T, G或C。若為G,則為G以外之 突變；同樣地若為C,其互補是G,且突變之互補非G。 若為Α或1',則此種突變2/3為G或C。因此單一鹾基 突變之對偶基因的一半造成特殊G之喪失，且剩下的2/ 3造成特殊G殘基之出現。於任一例子中，將一値A殘基 策略性地置於LCR探子組其中一成員上，可強烈地影響 融合探子分子出現之速率。於喪失一値G殘基例中，無法 解離含A之探子，且LCR反應之進行將被嚴重地破壊。 於出現一値新G之例子中，解離含A之探子可使LCR反 應之速率大大加強。精於此技藉人士可容易地了解，其他 帶不同待異性之未配對修補条統，可容易地適用於於待殊 區域中鑑定其他單一鹼基變化，其方式類似於所述之AG 配對修補条统。 B ·凹處之末端修倫 於第二具體實例中，藉著減少一個以上探子中之齡基 短序列可生成經修飾之末端，如上在一探子的5/端及另 一探子之3 /端，當其與樣的（或標的互補物，或由其中 生成之聚核苷酸）雜交時，在其間可留下一値凹處或裂口 。為了使LCR可加大樣的物，探子間之裂口必須予以充 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 尺度进用中家《準(CNS)甲4規格(210X297公釐） 81. 2. 20,000 21 Λ 6 Π 6 五、發明説明（20) «(即處理修飾必須予以> 校正"）。於一個第一說法中 ，可利用聚合酶或逆轉錄酶，及多置的去氣核苷酸三磷酸 進行，後者互補於相對於裂口之標的股。另外，此可由供 應一値互補於標的之第五探子及互補於第五探子之第六探 子而完成。這些不同的說明在下文中分別描述。 然而，在詳述此具體實例之先，稍微離題做術語定論 是有用的。A組（如S)包括所有含於S组之要件。a非 S 〃组則含〜萬有〃中剩餘的要件，其不見於S。針對本 案目的之a萬有〃包括四種鹼基G, C, A及T,或G, C, A及U,如上述。S組及其他組（如R)之交點包括 只見於S及R中之要件。因此，如本案中所應用的，> 非 N及非Μ 〃組包括存在於非裂口 Xn及裂口 Ym中之鹾基 。依據本發明，a非N及非Μ 〃組不可是空的組，即在此 組中至少要有一個_基存在以指導合成> 停止齡基"。 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 經濟部中央櫺準局工消费合作社印製 1.以伸展作用充缜裂口 依據此第一種説法， (a )探子與標的之雜交 物，則與檫的互補物雜交 充熵至少一個裂口，命名 連接至相鄰探子以形成一 )自標的中解離融合産物 以放大欲求的樣的序列。 於此説法中，"裂口 本發明是有關下列之重覆步驟： (且若是雙股則存在有檫的互補 );(b)伸展至少一個探子以 為Xn; (c)將已伸展的探子 個融合的或連接的産物；及（d ，並重覆雜交，伸展及連接步驟 "Xn其破壊a經修飾之末端〃 k紙張尺度遑用+ 家《率(CNS) T4規格(21&X297公*) S1. 2. 20,000 22 ^〇3b<1 * Λ 6 η 6 經濟部屮央橾準局IS：工消费合作社印製 五、發明説1V〗（21) 可藉箸以聚合酶或逆轉錄酶伸展一値以上的探子而予以A 校正〃。通常，雜交至DNA標的之探子伸展作用，可由 技藝中己知之DNA聚合酶或克林諾片段完成。於RNA 標的例子中，伸展作用可由逆轉錄酶完成。供示例之逆轉 錄酶包括得自禽骨饉母細胞瘤病毒（AMV)及Moloney 鼠白血病病毒（Μ — MuLV)者，通常可為精於此技薛 人士所應用。當然，最好是利用伸展試劑，如T a q聚合 酶，其像熱穩定的，且LCR所須的高溫循環中可經得起 。若伸展試劑非熱穩定的，其在毎一値LCR循環中通常 必須再加入。 以此方式藉伸展作用而校正，必須在裂口區有互補於 檫的鹾基之去氣核苷酸三磷酸（dNTP)之反應混合物 之存在。更特言之，對於Xn序列之裂口，將必須供應的 dNTP命之為dX^TP,其中X'代表裂口Xn中毎 一鹼基之互補物。d NT P可普遍購自各種來源，包括P-hermacia (Piscataway， NJ)及Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg， MD)〇 連接作用必須在連接點處精細地終止，如此伸展探子 緊靠相鄰的探子，且可與之連接。於本目的中應用'\停止 _基"（見圖3及4),命名為Q /之''停止絵基，像基 於其互補物Q而定義，且僳將反應混合物中互補於Q之 dNTP省去而完成，卽自反應混合物中省去dQ<TP 。因此可了解到如何自由4傾齡基中其中三値组成之N组 中針對裂口序列選擇鹼基，如此4個dNTP中互補的3 (請先閲讀背而之注意事項洱项窵本頁) k紙張尺度逍用中困家《準(CNS)甲4規格(210x297公；Jt) -23 81. 2. 20,000 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 〇難々 五、發明説明（22) 個被加至反應混合物中。當第4個dNTP—dQ/TP 不存在於反應混合物中，則伸展作用可於欲求之連接點處 終止。可了解到Q/為相鄰探子中的第一値敵基，且位於 標的中指導合成停止鹼基之齡基為鄰近裂口的第一値齡基 (於圖3中其5 /端上）。可注意到，停止驗基本身 (非互補的Q)必須是在鄰近Xn裂口之3 —端。此乃因 為Q/停止_基必須存在，以避免探子B/不必要的3/ 端伸展作用。（見圖3 )。 由於掌握其較簡易之特殊例子是最早的觀念，故先描 述單一裂口方法。然而要了解，單一裂口變化僅是後述雙 重裂口變化中的一個特殊例子。圖3示出一個稱之為單一 裂口之具體實例，因為只有一個探子（即B)在其5/端 有一値裂口。第一値探子一 A,與標的股T之第一片段雜 交。第二値探子一 B,與標的股的第二片段雜交，留下第 一片段5 /端及第二片段3 /端之間，一個以上_基之裂 口。此裂口命名為Xn。第三値探子一 A / ,與第一探子 A雜交；且第四個探子B/與第二探子雜交。如圖3中所 示，標的股T可為雙股，有一値樣的互補物，τ /。於此 例子中，A/及探子將藉著與標的互補物第一及第二 片段雜交，而參與於最初的雜交反應。 由聚合酶或逆轉錄酶進行之伸展作用，偽依循5/至 3 ~的方向。囟此，A及B /的3端於不存有任何阻止伸 展之作用物存在下可為聚合酶所伸展。若探子A /雜交於 標的互補物上，其可位阻地避免B z之伸展。然而若A , t紙張尺摩遑用中家《毕(CNS)T 4規格(210 x297公釐) -24 - Λ 6 η 6 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 裝- 線. S1. 2. 20,000 Λ 6 Π6 經濟部中央標準局貞工消t合作社印製
五、發明説明（23) 非與標的互補物雜交，且若β/伸展中所需要的下一個鹼 基（在此為Q/)不存在於反應混合物中，則伸展作用仍 會終止。相反地，探子Α谢續伸展，直到探子Β或停止驗 基互補物（Q)遇到標的股。由於A /不酋做A伸展用之 模板，只有當與樣的雜交時探子A才伸展。 如上文中所提及的，在裂口末端（即在連接點）終止 A之伸展作用是十分重要的，如此伸展的探子可連接至相 鄰探子B之5 >端。因此，反應混合物中省去互補於裂口 Xn5/端緊鄰齡基之脱氣核替酸三磷酸。因此，Xn可 為任何數目之驗基長，即η可為大於或等於1的任何整數 。對於_基又的唯一限制是其係選自Ν組，其中4値餘基 中1至任3個所組成。至少一値驗基必須保留以指導合成 停止鹼基Q/。要了解，當於Χη序列中使用3値以下的 鹼基，則剩下的任一鹼基可當做停止齡基。因此，Q像選 自、、非Ν 〃組，> 〃组由4値鹺基组成（萬有的）， 少於Ν組中所含的任何要件。 目前很明顯地，於此具體實例中的連接黏始終是A/ 及B探子的5/端。其並非僅是巧合，此也是停止鹼基Q 一之座落。 雖然於本申請案末了提出更詳細之實例，現在描述一 個一般實例。假設於圖3中，裂口 Xri代表序列GA。因 此_基選自N組中（N = {G, A)),其由4値鹼基中 2値所組成。於探子伸展中必須加入之dNTP為 dCTP及dTTP。於此實例中，停止ϋ基可為G (1先閲讀背而之注意亊項#项寫本頁) 本紙張尺度遍用中國·家採準(CNS)甲4規格(2丨0x297公；¢) 81. 2. 20,000 -25 - ,〇όΌ> Λ 6 Π 6 經濟部中央標準局貝工消件合作社印製 五、發明説明（24) 或A,且其互補物Q必須是C或T。因此，可了解到一即 Q選自 ''非N "組之要求是如何地達成。 於適當的聚合酶存在下，探子A經由C及T添加至其 3 /端而伸展，並以標的股為模板。然而，當聚合酶在模 板Q位置上遇到C或T時，則無法進一步伸展探子A,因 G及A均非如dNTP般供應至反應混合物中。伸展作用 在連接點精確地終止，而探子A之經伸展3 >端緊靠著探 子B之5 —端。 接下來，應用連接酶以將經伸展之A探子3/羥基端 連接至探子B的5/磷酸端，形成融合的或連接的第一探 子及樣的股之雙股複合體。若標的物為雙股，且具有互補 物T則連接酶仍可於最初循環中連接探子A/及B/ ，此僳當其與標的互補物雜交時。若其與多量的探子A及 B而非標的互補物雜交，則由於末端即非平齊也非不齊， 且此中無可供連接之受質，則連接作用受阻。 接下來，分開雙股複合體，且令新探子A, A B 及與標的，標的互補物，及自第一循環中獲得的經融 合的聚核苷酸雜交。伸展作用及連接作用如前般發生，且 重覆此過程。 Xn, Q及鹼基之組合實例示於表I可了解， 本發明並不限於這些特殊组合，但其選擇只為許多可能组 合之說明而已。表I示出Q由非N组驗基中選出之需求 。此意味停止鹹基Q/必須具有一傾鹺基為其互補物，此 驗基不見於Xn序列中。- (請先閲讀背而之注意事項再项寫本頁) 本紙張尺度遑Λ中國家楳準(CNS)T4規格(210x297公釐） 81. 2. 20,000 26 - 五、發明説明（25)表 I 供說明之裂口序列，所須的dNTPs 乃於單一裂口變化中可能的Q及Q/組合 X n / N X ^ TP s 非N * 停j LmM. A T T， C , G A , C，G G T c， A C， A G , T G c G , C A , T A , T A A T T , G , C A , c , G G C A C， G , T T， A G C A G C , G , T T A A A A T T T , A G , C C， G G C A G A C， G , 丁 T A 空的 ，因無 _基 停止 (請先間誚背而之注意事項再填寫本頁) 裝- 線· 级渍#中失^萆扃負工湞#合作社印製 米非N組對停止鹼基提供可能的互補物（Q)。確實 停止鹼基（Q/)之可能性示於下槲中。 如先前所示，單一裂口變化為更一般化雙重裂口變化 中的一値特例，其中m = 0。雙重裂口變化也應用4種探 子：A, A<, B及B/。於此變化中，如同先前的變化 ，探子Β/在5/端被縮短，而在第一探子Α及Β雜交之 ΜΛ張又度边用+困家樣準(CNS) τ4規格(210x297公龙） 81. 2. 20,000 27 - ο Λ 6 Π 6 經濟部屮央櫺準局β工消伢合作杜印製 五、發明説明（26) 標的第一及第二片段間生成一個Χη鹼基之裂口。裂口 Χη之鹼基，接受如單一裂口變化中相同的限制。 此外，3號探子A /也在其5 ζ端被縮短（見圖4) ，關於檫的互補物及1號探子A，而在第二（3及4號） 探子間生成一値Ym驗基之第二裂口。裂口Ym可為任何 數目之驗基長，且勿需與Χη為相同長度，即m未必與η 相等。確實，m可為零，此時雙重裂口變化退化成單一裂 口之特例。 於本發明的較佳方法中，4號探子包括一個Χη 之3 /末端序列，和標的中Χη序列裂口相同。然而，此 安排對本發明並非必要，因為裂口只在探子間形成。因此 ,4號探子β/之末端可停止缺乏序列Χη之端 ，但關於2號探子Β此中無3 >凹處端。由於伸展以5 / 至方向發生，且dX<TP必須供應，探子Β-可穿 過裂口伸展（Χη及Ym),如同1號探子A穿過Χη裂 口伸展一般。 本發明應用雙重裂口具體實例之方法，極相似於應用 單一裂口之具體實例。雜交、伸展及連接步驟基本上保持 相同。在促進伸展之條件下，八及8>探子均自其3 /端 伸展，以分別充«裂口 Χη及Ym。停止驗基在連接點終 止二種探子之伸展，且探子與其目前相接之探子連接。 然而，對於Ym本列中所含之_基殘基有一些限制。 因為至少要保持一個停止驗基,代表X及Y可能驗基 之N及Μ之混合組，必須不超過4個驗基中3個。因此， 張尺度遑用中β國家«準（CNS) 1Μ規格(210 x297公*) -28 - 81. 2. 20,000 (請先閲請背而之注意事項办填寫本頁) Λ (5 Ιί 6 經濟部中央標準局E3：工消费合作杜印製 五、發明説明（27) Y可由零至4個鹼基中任3値，但至少一個鹸基保持於〜 非N及非Μ 〃組中。若N組之組成少於4個鹺基中3値， 則Υ可於非Ν内之鹸基，只要其中留有一個鹾基，其互補 物可當做停止齡基以終止探子之伸展作用。一個單一 停止鹼基可用來終止Xn及Ym裂口之伸展作用。 對於序列Ym的第二種限制只發生在當m等於η時。 若裂口為相同長度，序列Ym應非互補於序列Xn,或探 子之A及B 之3 /端可構成$不齊端> 不齊端〃可 令形成一種標的物獨立性雙股複合體，次中探子A與探子 B雜交，如此連接作用及放大可進行。反而當m等於η時 ，最好Ym不互補於Xn。換言之：Α及Β —探子之末端 應至少是—整齊的末端〃，其可為相同長度，但非互補。 然而，即使發生檫的獨立地連接作用及放大，例如利 用不齊端（或較不像整齊端），這些融合産物可與放大標 的有所分別。於m等於η之例子中，有一値小但有限的機 會，即A:A/之雙股複合物可連接至B:Β/之雙股複 合物，而與標的無關。這些複合物較欲求之標的序列短m 個（或η)齡基，且可在長度上有所分別。此外，若末端 是 > 平滑的〃，可利用許多試劑偵測未配對之鹼基，此試 劑像可偵測及/或破壊未配對之篇基。例如，齡基末配對 可由羥胺一四氣化餓技術化學地決定，其掲示於Cotton, et al. Proc. Natl- Acad· Sci· 85 ： 4397-44 01(1988);且可由如S1核酸酶及菜豆核酸酶一 類之試劑酵素性決定。 先 閲 讀 背- 而 之 注· 意 事 項 % 本 裝 η 線 本紙張尺度遑用中國家«準(CNS) Τ4規格(210X297公;St) S1. 2. 20,000 29 - ο Λ 6 Ιί 6 五、發明説明（28) χζ S及Ys ζ的某些組合實例，其dNTP相對部 份及Q及Q #之生成可能性示於表I I中。 表 II 供説明之裂口序列，所須之dNTP及 於雙裂口變化中Q及可能之组合 X„/N Ym/M X 'TPs Y，TPs 非N及 停Ih鹼 非M* 0_! A A T T T,C,G, A » C * G G T C A C, A G,T AT AT T, A T, A C,G C.G AC GA T.G C.T T A ATG AAA T, A,C T C G GGCC AAACG C,G T，G，C T A ATTGA AGGT T. A,C T，C，A C G CGC GCG 互補 (請先Μ讀背而之注意事項孙媾寫本頁) 裝. -線， 經濟部中央榀準局貝工消费合作社印Μ 未 許多 来非N及非Μ組提供停止鹼基可能之互補物（Q)。 確實之停止鐘基（Q/)可能性示於下槲。 裂口 Χϋ及Ym之長度可為零（只有Y m ) , 1或任 "81.1~20,000 紙ft尺度遑《中國家《準（CNS)甲4規格(210x297公;ft) 30 Λ 6 η 6 五、發明説明（29) 何大於1之整數。例如，由1至20値驗基之裂口是可能 的。然而實際上，以較短長度之裂口為較佳，例如由1至 3或5個_基。目前最佳的為只有一個_基之裂口。頃發 現，單一_基之裂口可大大增加真實訊號對背景值之比率 ,且留下對停止鹼基及dXTP最大的選擇機會。由於探 子探子傜在即存標的之四週確實設計，而非a選擇〃停止 鹼基，因此在大多數例子中以箪一齡基裂口為較有用。 淮一步特袢 (請先閲請背而之注意事項再填窍本頁) 經濟部屮央橾準局貞工消#合作社印製 於任一 '' 凹處的〃具體實例變化中，用以充填裂口之 脱氣核苷酸三磷酸可經修飾以含有標誌部份。標誌之實例 包括直接的標誌，如放射同位素，或鈎子如生物素，異羥 基洋地黄毒M,或其他可為固相或産生標誌条統所確認之 半載饈。同位素標誌包括〃p,及m等。 將樣誌納入dNTP中，通常是傳統的有機化學。可 使用連接子及空間子，但非必要，很重要的是經修飾之 dNTP可纳入標的股上相對其互補物之裂口内，且可與 相鄰龄基共價鍵結。 再者，任一具體實例可用來分別差異僅一値單一鹼基 Z之第一（或標的）序列及第二（非標的）序列，此傜當 齡基差異於第二股的二儲座落上。在坊二種例子中，可使 用只具一値鹺基（集合詞，非長度）之裂口來分別單一鹼 基差異。 首先，發生於非揉的區裂口中之一値不同的齡基Z, ^紙張又度遑用中國家樣準(CHS) T 4規格(210x297公*) -31 - S1. 2. 20,000 經濟部中央橾準局员工消费合作杜印製 五、發明説明（30) 可藉著省略反應混合物中之d NT P而予以分別。因此， 可謂Z必須也是屬於非N及非Μ组中。不同的股無法為聚 合酶所伸展，因未供應適當的核苷酸三磷酸。可看出，分 別不同齡基Ζ之最大能力，只當單一裂口為一個鹺基長時 ,留下非Ν及非Μ組最大的可能性。 其次，若不同的驗基Ζ存在於Q位置，則股可被分別 因為伸展作用不會正確地终止，且所生成的伸展産物將太 長以致無法沿著標的股與其相開探子連接。於此變化中， 當只有一値停止鹼基可能性時可有最大的分別能力，其他 所有的會使産物太長。 雙重裂口具體實例可相似地用於分別在一値或另一掴 裂口處有單一齡基差異之序列。也可用來分別在停止_基 或Q /位置上有一値差異鹸基之序列。 2.以額外的探子充《裂口 依據凹處具體實例之此說法，本發明涉及下列步驟之 重覆：（a )將經處理修飾之探子與標的雜交（且，若是 雙股則存在有檫的互補物，則與樣的互補物雜交）；（b )提出5號及6號充填裂口之探子，以充《介於第一及第 二探子間之裂口； （c)將充缜裂口探子的二末端連接至 相鄰的探子，以形成一値融合的或連接産物；及（d)自 標的解離融合産物，並重覆雜交，裂口充填及連接步驟以 放大欲求之標的序列。於此具臞實例中，使用探子D, D /，E及取代4値探子A, A>, B及β / (見圖5 (請先閲讀背而之注意事項/f艰寫本頁^ 裝- 訂_ 線- 本紙張尺度逍用中家《準(CNS)甲4規格(210X297公《：) -32 - 81. 2. 20,000
Λ 6 η 6 { 經濟部中央橾準局A工消费合作杜印製 五、發明説明（31) )。5及6號''裂口充填"探子？及1^ >取代聚合酶及d NT P以充填二値探子間之凹處或裂口。 於此具體實例中應用三對探子。1號及2號探子D及 D / ,分別互相雜交，分別如3及4號探子在E及E —。 (注意，此實例中探子的命名和先前實例有異；即此中的 2號探子為1號的互補物，而非其相關之配對。因此，1 及3號探子變成第一探子）。當第一探子D及E與標的股 雜交，此處有一個至少一鹼基之裂口，最好是數個鹼基， 介於D之3羥基端及E 5 -磷酸末端之間。相似地，當探 子D /及Ε β與檫的互補物T /雜交，則在其間也有1個 至數個鹸基之裂口，雖然裂口並不排一列。因此，探子D 及Ε,及探子Ο”及Ε：/經修飾為非相鄰的且非平齊端（ 當與其互補物呈雙聯體）。於本說法中之裂口藉著供應5 及6號探子F及F /而''校正〃，其分別與介於第一及第 二探子間之榡的及標的互補物雜交（及與互相雜交）以充 缜裂13。 如圖5中所見，最好其中一値裂口充熵探子較另一値 在二末端均短些。換言之，二個第二探子D —及Ε /均伸 展通過個別的第一探子，或任擇其一地，二値第一探子均 伸展通過其値別的第二探子。此外，如實例13中所述， 一個第一探子（D)可伸展通過其第二互補物（D<), 而另一第一探子（E)中斷其互補物（E >)。然而在此 不同的結構中，很重要的是經修飾之末端在關於> 錯誤〃 的探子時並非a不齊的"。例如，D之3 /端其伸展超過 本紙ft尺度遑用中国國家《準(CHS)甲4規格(210X297公*> -33 - 81. 2. 20,000 广请先pillft背.>ro之法意事項#堝寫本頁) 訂' 線< Λ 6 Π 6 經濟部中央櫺準局员工消t合作社印製 Y&trr^-—--- 五、發明説明（32) D /，只有當F /之3 /端伸展超過F時才互補。其不應 互補於F之3 —端，其伸展超過F /，或互補於E /之3 /端，後者則伸展超過E。若此黏未予留意，探子雙聯體 可於真實標的不存在下再重新组鐵而迪成高的背景訊號。 依據本具體實例之探子，可如先前具體實例之探子般 以相同方式製作。典型而言，探子應具有如先前具體實例 中之可相容之長度。最後，可用於上述具體實例中之反應 條件也可用於本具體實例，除了在此具饑實例中伸展作用 及聚合酶是非必要的。 一旦介於第一及第二探子的裂口已被裂口充熵探子所 充填，則裂口充缜探子以其二端與値別的第二或第一探子 連接，形成連續的聚核苷酸股。第一探子及1號裂口充填 探子F形成一個第一聚核苷酸股且互補於標的股，而第二 探子及2號裂口充嫫探子F/形成一値第二聚核苷酸股， 且互補於檫的互補股。當然，第一聚核砮酸及第二聚核苷 酸也是互相互補。因此，重覆的雜交及連接循環可産生標 的序列之放大，就如同傳統的LCR—般。然而相反地， 由於平齊端連接作用所致之偽陽性訊號，在此具體實例中 顯著地減低，此乃因為雙股複合體D及I)/無法與雙股複 合醱E及E/平齊端相連之故。此乃因為一個以上的齡基 已自二値第二探子，或是二値第一探子中省去之故。 當然要了解，除了欲求之聚核苷酸之外也可能産生其 他産物。例如，可預期到可形成較短的片段（a二聚匾〃 ),包括.D:F 及 D** :F^ 或 E:F 及 F** :E^。要 •^紙Λ尺度遑用中《國家樣準(CNS)甲4規格(210X297公*) ' -34 - S1. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再碭寫本頁) 裝- 訂- 線- Λ 6 It 6 經濟部屮央櫺準局员工消#合作社印製 五、發明説明（33) 進一步了解，這些副産物或不完全産物會傾向利用欲求之 試劑。然而，藉著添加多置的試劑及自不完金産物中俐落 地分出欲求之聚核苷酸，此具體實例目前雖非較佳但仍是 有用的。 依據此説法，已連接探子之分離及偵測可以技藝中已 知之任何方式完成。較佳之偵測方法應用粘附至第一或第 二探子之標誌。最好，可為固相補獲之鈎子粘附至探子D 之5/端，而可補獲標誌之鈎子或樣誌粘附至探子E/之 5 >端。再以固相捕捉第一鈎子使欲求的聚核苷酸股為可 偵測的，自溶液中分出固相，偵測與固相相關之標誌。於 反應中所形成的不完全產物將無法為固相所捕獲，或無法 做榡誌之偵測。因此，一旦分離及偵測，於標的不存在時 根本無訊號或極少訊號會産生，因為平齊端之連接無法將 捕獲鈎子與標誌鈎子相接。 I P C R P C R之原理在文獻上已有充份描述（見美國專利4 .6 8 3, 195 及4，683，202 號），·在此不再 詳述。基本上，引子與標的雜交，且聚合酶伸展或加長引 子，以核苷酸三磷酸為建築材料。伸展産物（及其互補物 )進一步酋做模板以供雜交。通常而言，欲進行伸展作用 ，引子之3 β端必須與標的正好互補。許多聚合酶包括熱 穩定聚合酶均是已知的。 依據本發明，PCR引子的3/端經修飾，如此引子 (請先閲讀背而之注意事項孙碼寫本頁) 裝· 線· 本紙»足度遑用+ 國家«罕(CKS>T4規格(210x297公; 81. 2. 20,000 35
經濟部+央標準局β工消贽合作社印製 五、發明説明（34) 無法以聚合酶伸展。當這些處理修飾可以楔板依賴方式移 去時，另一層次之迫切性加至雜交要求中，以供聚合酶酵 素之引子伸展。此加入之迫切性水平，特別是當第一及第 二引子均帶有經修飾末端時，可有效地減低PCR中偽訊 號之産生。 關於阻斷基園之選擇，及校正方法，許多LCR有用 的相同一般策略，也可應用於PCR。然而在LCR中， 處理修飾必須阻斷偽連接，於PCR處理修飾必須阻斷偽 加長作用（伸展作用）。因此，經處理修飾或阻斷的3 / 端，當與標的序列雜交，必須無法支持聚合酶之加長作用 。欲應用上述LCR經修飾末端具體實例之說明，〜連接 點"或''欲連接點"應以a加長起始點〃取代之。 A.突出的經修飾端 突出的末端僳指上述LC R狀況下互補探子之相互開 像。於PCR例子中，所諝a突出端〃不具可比較之意義 。於PCR，這些經修飾的末端可較適切地描述成”模板 依賴性阻斷基"。然而，L C R中 > 突出端〃之處理修飾 及校正，可大體地應用至PCR。 於化學阻斷處理修飾時，LCR所用的R基中所有可 能的部份（除了一去氣核耱之外），也可用於PC R中阻斷聚合作用。此外，應用核酸内切酶IV之相同的 校正機制也可用於P C R。 LCR中"突出〃的處理修飾（包括超過欲求連接點 本紙ft尺度遑用中«家«準(CNS)T4規格（210x297公Λ：) 81. 2. 20,000 36 Λ 6 η 6 經濟部中央標準局员工消费合作此印31 五、發明説明（35) 之額外的核酸）在此示出，其為： 1. 基本上核糖核《酸突出物， 2. 降低位置突出物，及 3. 帶未配對鹼基之突出物。 然這些處理修飾似乎不為PCR所喜用，經處理修飾末端 的每一突出物種類，也可以類似方法應用於PCR,只要 欲校正（解離）之突出物本身可呈失活性而笛做伸展酵素 (如聚合酶）之受質。若突出物非失活性，則其當解離時 可當做引子用於接續不要的伸展作用。使突出物失活的典 型方法是使其3 ·*末端不適於為伸展酵素所確認。上述與 引子有鼸之處理修飾，通常也可使突出物的3/端失活。 然而，和引子之處理修飾不同的，突出物3/端之處理修 飾應不為相同的機制所校正，其係用來校正引子處理修飾 。另外二者也可相趙校正。適當的處理修飾但不易被校正 者包括一個末端二去氣核苷酸，3/—去氧腺苷，或其他 任何化學處理修飾，不論是已知的或是將被發現的，可相 當持久性地避免引子自3/末端之伸展作用。 於LCR例子中，這些處理修飾可以模板依賴方式校 正。校正方法及試劑和LCR相同。 Β.末端之凹處處理修飾 目前我們尚不知凹處端處理修飾如何應用於PCR中 本紙張尺度遑用+ «家«率(CHS)T4規格(210X297公*) 81. 2. 20,000 -37 - (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) Λ 6 ΙΪ6 五、發明説明（36) 減低偽訊號之發展。 一旦選擇一値修飾處理的策略，可製備末端有經修飾 之適當的引子。引子與檫的DNA雜交之條件和標準PC R中相同，且可見於文獻中。接下來的加長作用，變性及 再雜交循環，也和標準PCR相同，差別只在包括酵素或 其他作用物以利用樣的依頼方式校正經修飾之末端。 實例 本發明經由實例予以説明。實例僅供説明不欲予以限 制。除非另有所示，實例中之探子之標的序列由5/端向 左寫。 奮例 (請先閲讀背而之注意事項#塥寫本頁) 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 呈現以下的雙聯式檫的DNA序列，但為簡易起見只 示出單股。> 一 〃符號代表LCR探子欲求之連接點。 3 / -…TTAAGCTCGAGCCATGGG-CC CCTAGGAGATCTCAGCTGGAC G Τ …一 5 / 以下探子用以利用LCR偵測以上之標的序列，而有減低 的背景水平。 t紙Λ尺度逍用中家«準（CNS)甲4規格(210x297公*) 81. 2. 20,000 38 B 6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印褽 五、發明説明（37) A 5 ^ - AATTCGAGCTCGGTACC C p A^3"-GCTCGAGCCATGGG B 5 ^ - GGGGATCCTCTAGAGTCGAC C T G C A B " 3 ^ - p C C CCTAGGAGATCTCAGCT G 探子組的特色在二個探子（A及B<)含有末端磷酸 阻斷基匾（底下割線）。 利用各種劑量之檫的（PUC19)進行LCR反應 (基本上如EP — A — 320 308中所述）。在毎一 循琛雜交步驟之後，將純化自大腸桿菌之核酸内切酶IV 加至反應中，此可在揉準LCR條件下進行，因為大腸桿 菌核酸内切酶IV多少是耐熱的。至於對照組，進行LC R,採用相同數目之標的分子但不加核酸内切酶IV。於 這些對照組中，使用類似上示之探子組，只是在探子A及 上不包括一値末端核苷酸（含磷酸）。 於實驗及對照反應中，連接産物出現之速率以所加之 檫的分子最初數目校正之。此二個策略之區別處在於第二 個例子中，不含標的分子的一個> 空白〃管中所生成的訊 號和含1000個樣的分子之管速率相同，而於使用經修 飾之探子及核酸内切酶I V例子時，不含揉的分子之a空 白"管所生成的訊號顯然較含1 000値樣的分子之管慢 (請先閲讀背而之注意事項#塥寫本頁) f紙張尺度遑用中家«毕(CHS)T4規格(2丨0父297公激） -39 - S1. 2. 20,000 經濟部中央標準局β工消费合作社印31 五、發明説明（38) 許多。此背景之颳抑提供一個優點，即增加分析蚕敏度之 可用範圍。 精於此技蕤人士可立即了解應用高度耐熱的核酸内切 酶IV之企求性，基於相同理由，高度耐熱的連接酶及聚 合酶是有用的，且分別於LCR及PCR是企求的。精於 此技藝人士可了解，其他酵素不論是已知的或尚未知的， 可以模板依賴方式除去DNA股5 或3 /端處理修飾作 用，而留下先前完整的經阻斷5/磷酸或3/羥基之其他 酵素，也可以如上述完全類似核酸内切酶I V之方式而應 用。 奮例2 以下探子組可用來偵测實例1之檫的DNA,而具減 低的背景值。 A5 z-AATTCGAGCTCGGTACCC A^3"*-GCTCGAGCCATGGG r C r C C C B 5 ^ - TACrCrCG GGGATCCTCTAGA GTCGACCTGCA B e 3 / - CCCCTAGGAGATCTCAGCTG 探子及B含嵌合的核糖/去氧核糖核苷酸伸展作用（ 粗字及底下割線）。核糖核苷酸齡基前加有> r 〃字母。 LCR反應如實例1中所述進行，而以核糖核苷酸Η取代 (請先閲ii背.vru之?±*意事項#项寫本 本紙Λ尺度遑用中明國家华(CNS)Y4規格(210x297公*) 81. 2. 20,000 -40 - ο 經濟部屮央楳準局工消費合作社印製 v) * 五、發明説明（39) 核酸内切酶IV。至於對照組，可使用如實例1之相同的 對照用探子。 結果及說明和實例1相同。 窨例3 可使用以下探子組來偵测實例1的標的DNA,而具 減低的背景值。 A5 ^ - AATTCGAGCTCGGTACCC J G 3 ^-GCTCGAGCCATGGG B5 ^ - GGGGATCCTCTAGAGTCGACC T G C A B ^ 3 ^ - G J C CCCTAGGAGATCTCAGC T G 探子A及B#含伸展作用（底下割線，粗線式）持色在於 一個未配對的位置J ")接著是一個標準的核苷酸。 L C R反應如實例1所述進行。結果及說明和實例1相同 奮例4 以下探子組可用來偵測實例1之檫的DNA,而帶減 低之背景值。 本紙張尺度遑用中國家«毕(CHS) ΤΜ規格(210x297公釐） S1. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁> 41 ο 66 ΛΠ 經濟部屮央橾準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（40) A5 z-AATTCGAGCTCGGTACCC A > 3 ~ - GCTCGAGCCATGGG AC B 5 ^ - C A G GGGATCCTCTAGAGTCGA C C T G C A B - 3 ^ - CCCCTAGGAGATCTCAGCTG 探子A及β/含二値核苷酸伸展作用（底下劃線，粗線式 ),其當與模板DNA雜交時特色在於一個第一核苷酸， A/G未配對及一個可雜交的第二核苷酸。LCR反應如 實例1般進行，而以A/G未配對修飾酵素（複合物）取 代核酸内切酶IV。結果及説明如同實例1。 奮例5 在一個丹麥研究小組中，單套3苯丙酮酸尿症（ΡΚ U)在所有PKU對偶基因的約38%。此乃因於编碼苯 丙胺酸羥化酶（DAH)之基因序列上，於12號插入子 5/剪接供予位置有一個單一鹼基之突變所致（G>A) 。如實例4所示，用於減低背的未配對修補方法，也可當 做一種蚕敏的分析法，用以決定於疑似帶有此傾向之個體 血樣或其他饈液中偵測此遣傳缺陷之存在與否。 製備探子，其末端部份有下示之待色，且互補於PA Η基因筚1 2號插入子中的以下標的DNA : (請先閲請背而之注意事項再填寫本i 裝· 訂_ 本紙张凡度遑用中家槔毕(CHS) ΤΜ規格(210X297公*) -42 81. 2. 20,000 Λ 6 Ιλ 6 經濟部中央標準局貝工消#合作社印製 -- 五、發明説明（41) 3 - -TTTAATGAATGACAATTACCT .........5 / 正常的P A H D N A 3 - -......... TTTAATGAAT Α_Α C A A Τ Τ A C C T ......... _ 5 / P K U D N A A 5 ^ - AAATTACTTA A " 3-TTTAATGAATAAC B 5 - Q_T GTTAATGGA ......... B / 3 - CLA CAATTAGCT ......... 依據標準的LCR考廉設計探子（卽15 — 30成員）， 在B及β/添加單一的核苷酸伸展作用。這些伸展作用（ 關於標的DNA)包括第一個未配對的核苷酸，接著是二 個可雜交之核苷酸。 人類DNA純化自欲進行PKU存在與否測試値醱之 血液。可將DNA剪成平均各1Okb之大小。樣品接受 LCR,採用以上探子，並在每一循環的雜交步驟後（見 實例4)加入AG未配對修補条統酵素。若樣品不含野生 型對偶基因，若有任何LCR反應産物之出現，則利用未 修飾之探子可顯著地延缓與樣準LCR反應之比較。而若 在另一方面，存在有野生型對偶基因時，可發生融合探子 自LCR反應中快速的出現。 奮例6 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 本紙Λ又度逡用中國國家«毕(CNS)T4規格(2)0x297公釐） -43 - 81-2. 20,000 Λ 6 Π6 五、發明説明（42) 請 閲 讀 背* 而 之 注· 意 事 項 再 填 本 頁 進行80個循環的單一裂口LCR伸展作用，每一循 環包括在85Τ下培育30秒，及在50C下培育20秒 ，利用C 〇 y熱循環器（Key Scientific)。選擇循環數目 以加大平齊端連接作用之背景值。反應由〇或1値檫 的DNA分子組成。標的DNA為經S c r F 1水解的Η PV16基因體DNA，選殖至一値pGEM載體中。每 一反應也含有1 0毫撤克的人類胎盤背景DNA。以檫準 的平齊端寡核苷酸進行二*反應，另二値反應以單一製口 之寡核苷酸組進行。標準平齊端LCR反應所進行之缓衝 液含有 50mM EPPS pH7. 8, 100m Μ K C i? , 1 0 m Μ M g C ί 2 , 1 in M D T T , 10 m M NH.Ci, 10〇AtM NAD,l〇Aig/m 9. B S A , 5 x 1 0 分子的每一寡核苷酸A及B / ( 表6a), 7. 5X10〃分子的每一寡核苷酸B及A" (表6 a)及lx喃熱菌DNA連接酶。於相同缓衝液中 進行有裂口之LCR反應，除了以寡核苷酸A ~取代A 〃 ，且加上25mM —脱氣腺苷—璘酸及丄.2 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 5單位的T a q DNA聚合酶。此寡核苷酸與HPV 1 6基因髅上5695-5744之輿圖位置具待異性。於 所有例子中，反應體積均為5◦微升，且反應於循琛前均 覆上2 5撤升之礦油。 本紙張尺度遑用中《國家«準(CNS)T4規格(210x297公Λ) 81. 2. 20,000 -44 - .V ;Λ ί ο 66 ΛΒ 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（43) 表 6 a 萁梭益酸 A FL-AAGTTGTAAGCACGGATG A A T A T G T A ^ CATATTCATCCGTGCTT A C A A C T A" ACATATTCATCCGTGCTT A C A A C T B TGCACGCACAAACATATA TTATCA-B 1 0 B ^ B 1 O-ATGATAATATATGT TTGTGCGTGCA C FL-ATTTATACATTAAAG GCTCTGGGTC C ^ ACCCAGAGCCTTTAA TGTATAAA-FL D ACTGCAAATTTAGCC AGTTCAA-B 1 〇 D ^ B 1 O-TTTGAACTGGCTA AATTTGCAGTA 經過放大作用後，反應以無菌的蒸餾水以1:1稀釋 ，且經雙重標記之LCR放大産物利用三明治式免疫分析 (請先閲讀背而之注意事項抖蜞寫本頁) 裝· 訂_ 線- 本紙張反度遑用中《 β家«準(CHS) T4規格(210x297公；!t) -45 81. 2. 20,000
C 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（44)偵测，僳於A b b o t t 果如下。
Mx条统之原型上進行，結
分子數目 0 標準L C R 1 0 6 標準L C R 0 經修飾的LCR 1 0 6 經修飾的LCR 涑率（C / S / S ) 9 11.3 9 2 5.9 6 2 . 0 9 8 5.4 窨例7 進行35個循琛的雙重裂口LCR伸展作用，利用C 0Y熱循環器（Key Scientific)。培育時間和上述相同。 反應由Ο, 103或1〇6値樣的分子組成。檫的DNA 為經ScrFl水解的HPV16基因髏DNA,選殖至 一値PGEM載鱧中。每一反應也含有10毫微克的人類 胎盤背景DNA。反應條件和上述實例6之單一裂口伸展 實驗相同，除了每一反應含有5X10〃分子的各値寡核 苷酸C及E) / (見上表6 a) , 7. 5Χΐ〇υ分子的各 値寡核苷酸D及C / ,及各25mM的2 — -脱氣胸苷磷 酸及2 / —脱氣馬瞟昤核苷5 — —三磷酸。寡核苷酸傈與 HPV16基因鳢上6457—6505之輿圖位置具特 異性。 經過放大作用後，反應産物以無菌的dH2 0 1 ： 1稀釋，且經雙重樣記之L C R放大産物利用三明治式免 本紙張尺度逍用中國明家«準(CNS) T4規格(210x297公*) S1. 2. 20,000 (請先間讀背而之注意事項再填寫本頁) -46 - 03〇 Λ 6 Π 6 經濟部屮央標準局员工消#合作社印製 五、發明説明（45) 疫分析偵测，係於Abbot t IMx条統之原型上進 行，結果如下。 分芊教目 0 1 0 3 1 0 6 窨例8 大於1個驗基之裂口可用於L C R伸展作用中。例如 ，可以募核苷酸，TATTCATCCGTGCTTAC AACT (在此稱為寡E)取代表6a中HPV16特異 的寡核Μ酸A/,於LCR組（A, A>, B及β/)用 於HPV1 6序列之放大，如實例6所述。當雜交至適當 的單股HPV16標的序列，寡核苷酸Β及Ε可以3個核 苷酸之裂口而分離。放大反應條件和上述相同，除了2/ 一脱氣胞苷5/—三磷酸除了dATP外也應包括在内， 以完金充缜3個核苷酸之裂口。不同大小之裂口，也可以 單一及雙重裂口模式之相似方式檢査之。 審例9 於囊睡性纖維化基因中約有70¾的突變對偶基因於 表現子10中呈現一値單一三核苷酸之缺失（Riordaw, J. R. et al. Science 245 ： 1066, 1989, Ker- 涑率（c / s / s ) 15.44 4 2.47 1 3 7 5. 1 9 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝· 訂_ 線- 本紙張尺度遑用中《家《準(CHS)甲4規格(210X297公《) 81. 2. 20,000 -47 - 經濟部中央標準局员工消费合作社印91 五、發明説明（46) em B. et al Science 245： 1073 (1989) 〇 示於下表9 a中之寡核M酸，可用於正常（寡核苷酸A, A>，B及B#)及突變型（寡核苷酸C, C>, B及B /) CF基因對偶基因中之單一裂口LCR放大作用。 表9 a A F 1 - CACCATTAAAGAAAATAT C A T C T T A AAGATGATATTTTCTTTAA TGGTGC-F 1 B GGTGTTTCCTATGATGAAT ATAGA-B 1 0 B ^ B 1 O-CTATATTCATCATAGGAA A C A C C A C FL-TGGCACCATTAAAGAAAA T A T C A T C ^ ATGATATTTTCTTTAATGGT GCCAG-FL 使用LCR寡核苷酸A,A<, B及以放大人類 胎盤DNA中囊腫性纖維化基因之野生型序列。反應由無 標的/背景DNA,或1. 5撤克人類胎盤DNA所組成 。於如實例6所述之相同缓衝液中進行一式二樣反應，含 有5X10〃分子的各個寡核苷酸A及β/, 7. 5X1 本紙Λ尺度遑用中家«率(CNS)T4規格(210x297公釐) 81. 2. 20,000 -48 - (請先閲讀背而之注意事項再碣寫本頁) 〇3ό<·' Λ 6 η 6 五、發明説明（47) ◦〃分子的各個寡核替酸及Β, 25mM 2'—脱 氧胸替 5>—三璘酸，及1.25單位的Taq DN A聚合酶，共進行30個循環。經雙重檫記的放大産物如 所述般偵測。 撞_&L __ 無檫的 9.3 胎盤DNA 738.5 奮例1 0 寡核苷酸A, A>, B及(表6a)可在17 — 3 5個核苷酸長度中變化。最初的實驗集中在表1 0 a所 示之19個成貝及30個成員之寡核苷酸組中。寡核苷酸 大小之確實上及下限可由經驗決定。重覆實例6步驟，利 用表1 0 a之探子做簞一裂口 LCR伸展作用。可以雙重 裂口寡核苷酸組進行相似的研究。 涑率（c / s / s (請先閲請背而之注意事項洱填寫本頁) 裝* -1·"- 線· 經濟部屮央檁準局κχ工消费合作杜印製 k紙»•尺度遑用中國家«华(CNS) T 4規格(210X297公釐） -49 - 81. 2. 20,000 經濟部中央標準局员工消费合作社印製
五、發明説明（48) 表1 0 a 1 9 — m e r 組： A： F 1-TAAGCACGGATGAA T A T G T ：CATATTCATCCGTGCT T A C B : TGCACGCACAAACATAT A T - B 1 0 B' :B10-ATATATGTTTGT 3 0 — m e r 組： 奮例1 (請先間讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝-
G C G T G C A
A ： F 1 - TATCTAAGTTGTAA GCACGGATGAATAT G T :CATATTCATCCGTGCT TACAACTTAGATAC B ： TGCACGCACAAACATAT ATTATCATGCAGG-B 1 O B Bi o-CCTGCATGATAA TATATGTTTGTG C G T G C A 於單一及雙重裂口 LC R伸展作用中可使用較多之循 尺度逍《中BIBI家樣毕(CNS)T4規格(2】0x297公龙） S1. 2. 20,000 _ 線- -50 - Λ 6 η 6 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（49) 環數目，因為平齊端連接作用之背景被大大地減低。背景 之減低以及使用額外的LCR循環，預期可大大加強LC R技術之鋈敏度。寡核苷酸A, A**, A", B及β / ( 表6a)可用於各種循環數目之平齊端及單一裂口LCR 中，以決定靈敏度加強之程度。反應條件可和實例6所述 相同，除了可於20, 25, 30， 35, 40,45及 5 0値循環後檢査重複的陽性及陰性反應。必要時利用更 多循環數目，及/或示於實例7之雙重裂口LCR伸展作 用也可進行相似的實驗。 奮例1 2 單一裂口LCR伸展作用以區別單一絵基未配對之能 力，可利用合成的HPV 1 6寡核苷酸檫的序列檢査之。 用於放大作用之寡核替酸（A, A>, B及B>)示於實 例6之表6 a中。所使用之合成的標的序列示於下表1 2 a中。標的序列A (表12a),代表野生型HPV序列 ，與HPV1 6基因體中5695—.5 744之輿圖位置 具特異性。標的序列B與序列A相同，除了25位置之胸 S鹸基當做裂口充填之模板，以dATP交換腺嗦呤上。 因此，寡核苷酸(表6a,實例6)在實例6所述條 件下，當雜交至此檫的序列時無法伸展。標的序列C和序 列A相同，除了在終止_基（檫的鹺基第24號位置）上 有G至T之單一變化。當雜交至此標的序列，寡核苷酸B '可伸展3個驗基。因此，伸展作用可超過裂口區。 本紙張尺度遑用中«家《準(CNS)IM規格(210x297公*) $1. 2. 20,000 * 51 ~ (請先閲讀背而之注意事項再项寫本頁) 裝· 線· Λ 6 Π6 經濟部中央橾準局C5：工消费合作社印製 五、發明説明（50) 合成的樺的 A AAGTTGTAAGCACGGATGAATA TGTTGCACGCACAAACATATAT T A T C A B AAGTTGTAAGCACGGATGAATA TGATGCACGCACAAACATATAT T A T C A C AAGTTGTAAGCACGGATGAATA TTTTGCACGCACAAACATATAT T A T C A 反應重覆三次，由人類胎盤背景DNA (無標的之對照組 )及含ΙΟ5分子來自一定合成標的之胎盤DMA組成。 反應條件和實例6所述相同。單一裂口LCR伸展作用進 行50個循瓖。經過放大作用後，反應産物以無菌的dΗ 2 Ο 1:1 稀釋，且經雙重標記之LCR反應産物利 用三明治式免疫分析偵測，僳於A b b 〇 t t I M x条 統之原型上進行，有以下結果。 (請先閲讀背而之注意事項再項寫本頁) 本紙ft尺度逍用中國家«毕(CNS)甲4規格(210x297公*) -52 - 81. 2. 20,000 ..Λ 6 i C ' ΙΪ6 V "* 1 ' — ....... __ __丨丨 11 1 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（51) 棲 6¾ 涑率（ 〇 / S 無標的 1 5 .2 檫的 A 16 7 .7 檫的 B 8 .2 標的 C 1 2 .5 菁例 13 於裂口充謓技術的另一具體實例中，可使用額外的探 子充填裂口，取代dNTPs及DNA聚合酶之使用。可 用的探子示於下表13a,且與HPV16基因體上56 70—5743之輿圖位置具特異性。依本内容設計寡核 替酸。 本紙張凡度遑用中家樣华(CNS)T4規格(210X297公麓} S1. 2. 20,000 (請先間讀背而之注意事項再填寫本頁) -S3 - Λ G η 6 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（52) 丟1 3 a D F 1 - TACCTGCCTCCTGTACC TGTATCTA D ^ AGATACAGGTACAGGAGG CAGGTA-F 1 F AAGTTGTAAGCACGGATG A A T A T G F ·* ATATTCATCCGTGCTTAC A A C T T T E TTGCACGCACAAACATA TATTATCA-B i o E ^ B i o-TGATAATATATGTTTG TGCGTGCAAC LCR可進行各種循琛數目，利用如實例6所述之相同的 培育時間及反應條件，除了dATP及DNA聚合酶不再 霹要。要注意，也可使用不同長度之寡核苷酸（如1 7_ 3 5値核苷酸）。所有的寡核苷酸在反應中各存在5. 0 一7. 5X1〇w。經過放大作用後，反應産物如先前實 例所述般稀釋及偵測。 奮例1 4 製備以下合成的寡核苷酸，並當做PCR反應之引子 (請先閲讀背而之注意事項#项寫本頁) 各紙張及度遑用+ 國家«竿(CHS) T4規格(2丨0X297公Λ) S1. 2. 20,000 54 Γ>2^ν·' Λ 6 Π 6 五、發明説明（53) ，以PUC18為欲求之檫的DNA。 引 子 互補於PCU18 (nt 此外製備含有未配對位置之經修飾引子Amo d及 Bmod。使用這些引子分別取代引子A及B。經修飾引 子之序列，及其互補於PCU18 DNA者示於下： 引子 互補於PCU18 (nt) ※核苷酸（NT)命名条統傺指由DNA Star Inc所發表的 ,(Mad i son， WI)。 (請先閲讀背而之注意事項再塡寫本頁) 裝· 訂- 線. 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 實驗的寡核M酸含有原來的序列（A或B,上述）經 修飾包括一値單一的降低的殘基（J)及互補於PUC1 8標的之額外的核苷酸。製備含有未配對殘基之方法，示 於Takeshita，et al.，上文中。處理修飾之3 末端（. "突出處〃）藉箸含有一個二去氣腺苷（X)殘基而被失 活性，如利用末端轉移酶，如Berger，et al·，Guide to SI. 2. 20,000 k紙度进用中國國家《準(CNS)T4規格(210x2i)7公;^ -55 - 經濟部中央橾準局员工消费合作社印製 五、發明説明（54) Molecular Cloning Techniques， ρ· 1 〇 4 (1987 )ο依據Mullis et. ai.(見美國專利第4，683，1 95及4，683, 202號）的方法進行PCR，而在 核苷酸混合物中存在有32P — dCTP。如下所述，在每 一循琢之雜交步驟後，加核酸内切酶IV (Endo I V)至反應混合物中。 經PCR之後，放大産物以三氣醋酸（TCA)沈澱 ，洗滌，並偵測訊號。下表示出各種反應流程下的預期相 對訊號強度引孑湄合物 有樺的D N A _捶的D N A A+B +++ ++ Amod+Bmod+EndoIV +++ - Amod + Bmod_Endo IV - 一 A + B，無聚合酶 - - (請先間讀背而之注意事項洱填寫木頁) 本紙張凡度遑用t β «家«半(CHS)規格(210x297公釐） 81. 2. 20,000 -56 -

Claims (1)

  1. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製
    03ο
    I Η & j. Α7 Β7 C7 D7 六、申請專利範園 附件1A: 第80100655號專利申請案 中文申請專利範圍修Λ正本 民國82年1月修正 1種藉由連接酶鏈反應而放|標的核酸序列之方 、.+ 法，其中於探針雜交至標的物一模板,將一對互補探 針連接至一對相鄰互補探針，以形成互補於標的物之放大 産物，該放大産物本身作為進一步模板；其改良處包括： (a) 提供可與標的雜交的所需探針，其中至少一値 探針經修飾處理，如此當探針雜交時，酵素實質上無法辨 識探針作為其受質，如此無法形成放大産物，其中該修飾 處理像選自： (i )化學阻斷基團，其遮蓋或保護於連接步驟所需 之化學基圃； (i i)含有不配對位置之核酸突出物；或 (i i i)當經修飾探針與其它探針雜交至標的物時 ,於此兩種探針之間所形成之一個或多個核苷大小的裂口 f (b) 若有檫的物存在時，將經修飾探針與其雜交以 形成經修飾探針一模板複合物； (c) 以標的物依賴的方式校正修飾，以令經修飾探 針一模板複合物可為連接酶酵素辨識而將其它探針對緊接 在該探針； 其中該校正包括使用選自下列之試劑： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) T 丨裝_ 訂_ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） 1 81.9.10,000 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (i )核酸内切酶；或 (i i)用以填補裂口之聚合酶及核苷三磷酸； (d) 將經校正之探針連接至相鄰接之探針，以形成 放大産物，及 (e) 自標的物解離放大産物，並重覆雜交，校正及 連接步驟以放大所欲之檫的序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中阻斷部份 具以下型式： 0 II 一 P - 0 - Z I Ο Η 其中Ζ選自包括一 H;_ (CH2) nCHO之基圃，其 中η是由1至約3 ; —去氧核糖；及一二去氧核糖。 經濟部中央標準扃R工消費合作社印製 3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（a )中經處理修飾之起始子包括一個可與標的的第一片段雜 交的1號探子，一個可與標的的第二片段雜交的2號探子 ，一個可與1號探子雜交的3號探子及可與2號探子雜交 的4號探子，其中當修飾時； (i)標的第一Η段之5-端與第二Η段3-端有X η齡基之間隔，每個X獨立地選自1至4個鹼基中任3値 本紙張夂度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公缝） ~ 2 - 81.9.10,000 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 所組成的N組中，且η為大於或等於1之任何整數； (i i) 3號探子雜交至1號探子，如此位於1號探 子上互補於3號探子端之鹼基，以Ym個驗基與1號 探子3 /端相隔，每個Y獨立地選自◦至4値鹼基中任3 個所組成的Μ組中，且m為0或任何大於或等於1之整數 ，但至少保持一個鹸基未被應用於Xn及Ym序列中，以 包括非N及非Μ組，且Xn鹼基之序列不互補於Ym鹼基 之序列；且 (i i i)鄰近Xn5^·端及鄰近¥„15>端之驗基 選自Q組，其由非Ν及非Μ組成； 且其中該步驟（c)包括伸展1號探子以充填χη裂 口，及4號探子任意地充填Ym裂口，利用多量的去氧基 三磷酸及去氧基γ/三磷酸，其中χ/及分別代 表X及Υ之互補物。 4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中η等於1 至3 〇 5. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中m等於〇 經濟部中央標準局R工消費合作社印繫 〇 6. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中於步驟c 中加入的去氧基X >三璘酸包括經含有一値標誌所修飾的 齡基，選自標誌，鈎子及半抗原所組成之基團。 7. 根據申請專利範圍第3項之方法，且包括偵測放 大標的序列存在之進一步步驟，像利用粘附至2號及3號 探子5/端之半抗原標誌。 81.9.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公楚） w〆 I-- 經濟部中央標準局BK工消費合作社印製 A7 ‘ B7 如： C7 ___ D7 _ 六、申請專利範困 8. —種診斷套組，包括下列組合·· (a) —種起始子，含有可與檫的雜交的二對探子， 如此其可於LCR中連接，其中至少一個探子僳經修飾處 理的，如此當起始子雜交時，連接酶實質上無法作用於作 為其受質之起始子上；其中該修飾處理係選自： (i)化學阻斷基團，其遮蓋或保護於連接步驟所需 之化學基圍； (i i)含有不配對位置之核酸突出物；或 (i i i)當經修飾探針與其它探針雜交至標的物時 ，於此兩種探針之間所形成之一個或多個核苷大小的裂口 9 (b) —種組合連接酶試劑，其用以組合放大産物； 及 (c) 一種校正試劑，可以標的物依賴之方式校正經 修飾之探子，以令探子一模板複合物可為連接酶所作用； 其中該校正試劑包括選自下列之作用物 (i )核酸内切酶；或 (i i)用以填補裂口之聚合酶及核苷三磷酸。 9. 根據申請專利範圍第8項之套組，其中校正試劑 包括一種聚合酶。 1◦.一種方法，其僳用以自一個第二非標的序列中 區別第一標的核酸序列，前者與標的差別在於至少一個鹼 基，該方法包括： a.提出多量的四種不同探子，1號探子互補於標的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)肀4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·—裝· 訂· 81.9,10,000 經濟部中央標準局兵工消費合作杜印製 A7 0辦？ ζ ____D7__ 六、申請專利範团 的第一片段，2號探子互補於檫的的第二片段，3號探子 互補於1號探子且4號探子互補於2號探子， (i )其中檫的第一片段之5 /端與第二片段3 -端 間隔Xn個鹼基，每値X獨立地選自1至4個齡基中任3 個所組成的N組中，且η為大於或等於1之任何整數； (i i)其中3號探子與1號探子雑交，如此位於1 號探子上且互補於3號探子5 -端之驗基與1號探子之3 /端間隔Ym個鹼基，每個Y獨立地選自0至4個鹼基中 任3個所組成的Μ組中，m為0或任何大於或等於1之整 數，但於Xn及Ym序列中至少保留1個驗基未應用，且 Xn鹼基序列未與Ym鹼基序列互補； (i i i)其中緊鄰Xn5"端及Ym5"端之驗基 僳選自Q組，其由非N及非Μ組成；且 (i ν )其中非標的序列與標的序列差別至少一個驗 基，Z,位於Xn區或Ym區； b. 將該4種探子在雜交條件下與單股標的或雙股標 的或自其互補股分開之雙股標的混合； c. 當與標的雜交，伸展1號探子以充填Xn裂口， 及視所需的，以4號探子充琪Ym裂口，利用多量的去氧 基χ/三磷酸及去氧基γ/三磷酸，其中χ/及Y**分別 代表X及Υ之互補物，其位於標的股但缺少去氧基三 磷酸，互補於非標的裂口中之單一差異鹼基； d. 當與標的雜交時，經伸展之1鱗探子與2號探子 連接，且視所需的將伸展出的4號探子與3號探子連接， (請先閲讀背面之注意事項再璜寫本頁) •—裝. 訂· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -5 - 81.9.10,000 A7 B7 C7 D7 r 六、申請專利範团 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以形成至少一個經連接探子雜交至標的序列的雙股複合體 ;及 e.將適當伸展且連接的探子與未適當伸展且未連接 的探子分離及偵測。 1 1 . 一種方法，其係用以自一個第二非標的序列中 區別第一標的核酸序列，前者與標的差別在於至少一値齡 基，該方法包括： a.提出多量的四種不同探子，1號探子互補於標的 的第一片段，2號探子互補於標的的第二片段，3號探子 互補於1號探子且4號探子互補於2號探子， (i )其中標的第一片段之5 /端與第二片段3 >端 間隔Xn鹼基，每個X镯立地選自1至4値鹼基中任3値 所組成的N組中，且η為大於或等於1之任何整數； 經濟部中央標準局工消費合作杜印製 (i i)其中3號探子與1號探子雜交，如此位於1 號探子上且互補於3號探子5/端之鹼基與1號探子之3 /端間隔Ym個鹼基，每値Y獨立地選自0至4個鹼基中 任3個所組成的Μ組中，m為0或任何大於或等於1之整 數，但於Xn及Ym序列中至少保留1個驗基未應用，且 Xn鹼基序列未與Ym鹼基序列互補； (i i i)其中緊鄰Xn5<端及鄰近Ym. 端之 齡基僳選自Q組，其由非N及非Μ組成；且 (i ν)其中非標的序列與標的序列差別至少一個鹼 基，Z,於Q區，如此Z為含於N組，Μ組或二者的鹸基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 一 6 一 81.9-10,000 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 b. 將該4種探子在雜交條件下與單股標的或雙股標 的或自其互補股分開之雙股標的混合； c. 當與標的雜交，令1號探子伸展以充填χη裂口 ，及視情況所需的，令4號探子充填Ym裂口，利用多量 的去氧基三磷酸及去氧基γ/三磷酸，其中χ/及γ /分別代表X及Υ之互補物，然而Ζ無法終止1號及視情 況所需4號探子之伸展作用； d. 當與標的雜交時，將適當伸展之1號探子與2號 探子連接，且視所需的將適當伸展的4號探子與3號探子 連接，形成至少一個經連接探子雑交至標的序列的雙股複 合體；及 e. 將適當伸展且連接的探子與未適當伸展且未連接 的探子分離及偵測。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝. 訂· 經濟部中央標竿局具工消費合作社印製 81.9.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）
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