JPH05244952A

JPH05244952A - リボ核酸の特異的生産方法

Info

Publication number: JPH05244952A
Application number: JP4254548A
Authority: JP
Inventors: Udo Reischl; ウード・ライシュル; Ruediger Rueger; リューディガー・リューガー; Christoph Kessler; クリストフ・ケスラー; Rudolf Seibl; ルドルフ・ザイブル
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1991-09-26
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1993-09-24
Also published as: US5369003A; CA2078906A1; EP0534345A2; EP0534345A3; DE4132133A1

Abstract

(57)【要約】【目的】従来技術の欠点を回避する、転写反応に基づ
く簡単な増幅方法を提供すること。【構成】２つのオリゴヌクレオチドを連結せずに鋳型
核酸上で隣接した領域にハイブリダイズすることができ
るこれら２つのオリゴヌクレオチドを使用する転写技術
に基づくリボ核酸の生産方法または鋳型核酸の検出方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リボ核酸の特異的生産
方法および核酸の特異的検出方法ならびにこれらの両方
法を行うための試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】情報担体として供される核酸は現在まで
に知られている全ての微生物に関する特異的生活形式の
基礎である。それらは蛋白をコードする；しかし、いく
つかの核酸はおそらく触媒的または構造的効果も有する
であろう。それらの特異性のために、核酸を使用して微
生物を識別および検出することもできる。しかしなが
ら、個々の核酸は非常に制限された量が、微生物に存在
するだけである。したがって、in vivo(クローニング)
またはin vitro(増幅)でこれらの核酸の多くのコピーを
生じさせることが核酸の実用的な取り扱いのために好都
合であることが判明した。前者の方法は時間がかかり、
かつ困難であるが、in vitro増幅は、近年、実用的な別
法に発達した。

【０００３】ＥＰ−Ａ−２００３６２には、サイクルで
進行する出発核酸の一部分の増幅に関する方法が開示さ
れている。各サイクルでは、存在する核酸の各々に対し
て対向鎖が形成される。しかしながら、該反応方法はサ
イクル数が比較的多くなる。

【０００４】ＥＰ−Ａ−０３２０３０８には、いわゆる
リガーゼ連鎖反応が開示されている。ここでは、いわゆ
るニックによってハイブリダイズされた状態で単に分離
されるオリゴヌクレオチドがリガーゼ反応によって連結
される。この方法で生産された核酸は、次いで、対向鎖
オリゴヌクレオチドなどの連結のための鋳型として供さ
れる。この反応はＰＣＲと同一の欠点、すなわち、各サ
イクルで二本鎖を再度分離しなければならないという欠
点を有する。

【０００５】この等温サイクルで複数のコピーをもたら
す転写工程に基づく方法の欠点を解決しようとする試み
がある。このような方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０３１
０２２９に開示されている。この方法では、鋳型特異的
領域ならびにＴ７プロモーター配列を含有するオリゴヌ
クレオチド(プロモータープライマー)がモノヌクレオチ
ドによって鋳型核酸上で伸長される。次いで、対向鎖が
第２プライマーによって形成される。この間に、予め一
本鎖にされたプロモーター領域に対して対向鎖が形成さ
れ、したがって、これが該プロモーターの機能性を修復
する。その後、形成されたハイブリッドのプロモーター
調節転写が起こる。形成された転写産物ＲＮＡに対応す
るｃＤＮＡが対向鎖プライマーによって生産される。該
ハイブリッドは変性され、該ｃＤＮＡはプロモータープ
ライマーと再度反応する。ｃＤＮＡ上でのこのプライマ
ーの伸長によって機能的プロモーターを含有するハイブ
リッドが再度得られる。この分子も転写サイクルに導入
され得る。この反応シーケンスの欠点は転写可能な分子
を生産するのに２つの伸長反応が必要であるという点で
ある。ＷＯ８８／１０３１５およびＥＰ−Ａ−０３２９
８２２ならびにＥＰ−Ａ−０３７３９６０の方法でも同
一の問題が生じる。

【０００６】ＥＰ−Ａ−０４２７０７４には、鋳型核酸
がプロモーターを含有する鋳型特異的プライマーと直接
反応して転写可能な分子を直接形成する方法が提案され
ている。次の転写によって、一部分が鋳型核酸の一部分
に対応し、他の部分がプライマー上にあるさらなる配列
と相補的であるＲＮＡが得られる。この方法の欠点は、
該反応が鋳型核酸の存在下では主産物として形成される
と同一の分子を鋳型核酸の不在下では副産物として生産
するという点である。かくして、比較的特異的ではない
方法である。当該特許出願には、ハイブリダイズされた
状態で鋳型核酸上で連結される２種類のプライマーを使
用し、これによって伸長された転写可能な分子が形成さ
れるという方法も開示されている。この場合の欠点はリ
ガーゼの使用である。というのは、該リガーゼは、通
常、次の転写を生じるＲＮＡポリメラーゼ以外の反応条
件を必要とするさらなる酵素だからである。

【０００７】ＥＰ−Ａ−０４２７０７３には、転写可能
な核酸の合成に関する別の反応が開示されている。この
方法では、鋳型核酸の３'末端がプロモータープライマ
ーの５'末端に連結される。該鋳型は張出している３'末
端の鋳型特異的配列とのハイブリダイゼーションによっ
て該プロモータープライマーに連結される。したがっ
て、この反応も転写可能な分子の生産のために酵素的反
応(リガーゼ)を必要とする。さらにまた、定義された
３'末端を有する鋳型核酸だけしか検出することができ
ないという欠点を有する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、従来技術の欠点を回避する、転写反応に基づく
簡単な増幅方法を提供することである。詳細には、それ
は、２、３の工程でＲＮＡ産物を生産し、プロモーター
プライマーを使用する場合に転写で生じるバックグラウ
ンドシグナルを減少させるであろう。

【０００９】この目的は以下に記載の本発明発明によっ
て達成される。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、鋳型特異的プ
ロモーターオリゴヌクレオチドＰ１およびさらなる鋳型
特異的オリゴヌクレオチドＰ２を鋳型核酸Ｔと直接ハイ
ブリダイズして複合体Ｋを形成し、次いで、Ｐ１および
Ｐ２由来の鋳型特異的配列情報を含有する転写産物Ｒを
プロモーター調節生産することからなり、使用するオリ
ゴヌクレオチドＰ１およびＰ２が当該方法のいずれの工
程でも一緒に酵素的に連結されないことを特徴とする、
鋳型核酸を使用する複数のリボ核酸の特異的生産方法を
提供するものである。さらに、本発明は、該本発明の生
産方法に基づく核酸の特異的検出方法およびこれらの方
法を行うのに適している試薬を提供するものである。

【００１１】本発明の方法では、反応の出発およびある
程度までの反応生産物の検出は、いわゆるハイブリダイ
ゼーション試験のある特定の具体例であり、その実質的
な特徴は核酸診断学の分野の当業者には知られている。
実験的な詳細が以下に説明されていない範囲について、
充分に詳細には、１９８６年、ＩＲＬプレス(ＩＲＬＰr
ess)、ビー・ディー・ヘイムズ(Ｂ.Ｄ.Ｈames)およびエ
ス・ジェイ・ヒギンズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)によって発行さ
れた「核酸ハイブリダイゼーション」(“Ｎucleic acid
hybridisation")、特に第１章(ハイブリダイゼーショ
ン戦略)、第３章(溶液ハイブリダイゼーションの定量分
析)、および第４章(定量用濾過器ハイブリダイゼーショ
ン)、分子生物学における最近のプロトコル(Ｃurrent
Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology)、エフ・エム・ア
ウスベル(Ｆ.Ｍ.Ａusubel)ら編、ジェイ・ウィリー・ア
ンド・サン(Ｊ.Ｗiley and Ｓon)、１９８７、特に２.
９.１.〜２.９.１０および分子クローニング(Ｍolecula
r Ｃloning)、ジェイ・サムブルーク(Ｊ.Ｓambrook)ら
編、ＣＳＨ、１９８９、特に９.４.７.〜９.５.８.を引
用記載する。これらは、特に、ＥＰ−Ａ−０３２４４７
４にも開示されている標識ヌクレオシド三リン酸の公知
生産方法、修飾および非修飾オリゴヌクレオチドの化学
的合成、制限酵素による核酸の切断、ハイブリダイズさ
れるべき核酸間の相同性の程度に依存する特異性を達成
し得るハイブリダイゼーション条件の選択、それらのＧ
Ｃ含量およびそれらの長さ、ならびにいわゆるプライマ
ーまたはプロモーター配列を使用するポリメラーゼの助
けをかりる核酸のデオキシヌクレオシド三リン酸または
リボヌクレオチド三リン酸からの形成を含む。

【００１２】本発明の範囲内の標識は、直接的にまたは
間接的に検出可能な基Ｌからなる。直接的に検出可能な
基の例は放射性(³²Ｐ)、着色もしくは蛍光性基または金
属原子である。間接的に検出可能な基は、例えば、抗
体、抗原、ハプテンまたは酵素のような免疫学的または
酵素的に活性な化合物あるいは酵素の酵素的に活性な部
分である。これらは次の反応または反応シーケンスで検
出される。ハプテンは、それらで標識されたヌクレオシ
ド三リン酸が一般にポリメラーゼに対する基質として特
によく使用され、ハプテンまたはハプテン化ヌクレオシ
ドに対する標識抗体との次なる反応を行うのが容易であ
るので、特に好ましい。このようなヌクレオシド三リン
酸は、例えば、ブロモヌクレオシド三リン酸またはジゴ
キシゲニン−、ジゴキシン−またはフルオレセイン−結
合ヌクレオシド三リン酸である。ＥＰ−Ａ−０３２４４
７４に記載されているステロイド類およびそれらの検出
は特に好適であることが判明した。それらの核酸への取
込みに関しては、ＥＰ−Ａ−０３２４４７４を引用記載
する。

【００１３】特異的生産方法または試験は、ある核酸
を、所望により他の核酸の存在下でも、選択的に生産ま
たは検出し得る方法と解される。しかしながら、該方法
の目的を、他の核酸の存在下で、部分的に同一もしくは
類似のヌクレオチド配列を有する数個の核酸または核酸
の群、あるいは核酸の数個の断片の生産または検出とす
ることもできる。二本鎖核酸の検出のために２つの相補
鎖のいずれかを使用することができる。実質的に相補的
な核酸または核酸配列は、対応する核酸とハイブリダイ
ズし得、かつ、他の核酸と正確に相補的であるかまたは
正確に相補的な核酸と２、３の塩基だけ異なるヌクレオ
チド配列をハイブリダイジング領域に有する核酸または
配列と解される。この場合、特異性は、相補性の程度お
よびハイブリダイゼーション条件に依存する。鋳型核酸
の一部分と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド
を、以下、鋳型特異的と称する。

【００１４】本発明の方法の基礎は、精製したかまたは
他の成分、特に他の核酸と合わせた核酸を含有する試料
である。該試料は蛋白、塩などのようなさらなる成分を
含有することができる。核酸配列が試料中の核酸に存在
する場合に本発明の方法を使用してこれらの核酸配列を
増幅することが可能である。リボ核酸の生産のための基
礎を形成しようとする核酸を、以下、鋳型核酸(または
鋳型)と称する。

【００１５】本発明の方法で、鋳型核酸の全ヌクレオチ
ド配列情報を含有するが、好ましくはそれらの一部分だ
けを含有する核酸を生産し得る。鋳型核酸の部分配列を
増幅するために、該方法を行う前に鋳型核酸を断片にす
る必要はないが可能である。

【００１６】該方法を行うためには、鋳型核酸は一本鎖
として存在しなければならない。これは、通常、さらな
る予備処理を伴わないＲＮＡに関する場合である。ＤＮ
Ａの場合は、簡単な公知の方法で変性によって二本鎖鋳
型核酸を一本鎖にすることができる。

【００１７】本発明の範囲内のプロモーターオリゴヌク
レオチドは、ＲＮＡポリメラーゼを認識および結合する
ことによってＲＮＡの合成を開始する二本鎖領域ＰＲＯ
を含有する核酸である。このＰＲＯ領域は、ＲＮＡポリ
メラーゼによって下流方向にこの配列を接続した核酸領
域の転写を開始する配列を含有する。二本鎖ＰＲＯ配列
は、好ましくは１７〜１００塩基、特に好ましくは１７
〜５０塩基を有する。ＲＮＡポリメラーゼを結合するこ
とができる好適な二本鎖配列は、例えば、ヌークリイッ
ク・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)
１２、第７０３５〜７０５６頁(１９８４)およびプロテ
イン・シーケンシズ・アンド・ディエヌエイ・アナリシ
ス(Ｐrotein Ｓequences and ＤＮＡＡnalysis)１、第
２６９〜２８０頁(１９８８)、バイオフィジカル・ケミ
ストリー(Ｂiophysical Ｃhemistry)、パートIII、第１
１８３〜１２１１頁、フリーマン・アンド・カンパニー
(Ｆreeman ＆Ｃo.)、サンフランシスコ、１９８０；ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂacteriol)１
７０、第５２４８〜５２５６頁(１９８８)；バイオケミ
カル・ジャーナル(Ｂiochem.Ｊ.)２２４、第７９９〜８
１５頁(１９８４)；Ｇene Ａcal.Ｔechn.６、第２９〜
３２頁(１９８９)、ＥＰ−Ａ−０２９２８０２ならびに
ヌークリイック・アジッド・プローブズ(Ｎucleic acid
probes)、サイモンズ(Ｓymons)編(ＣＲＣプレス、ボカ
・レイトン、１９８９)に開示されている。二本鎖部分
の２つの鎖は、いずれも開放形で存在することができる
か、またはヘアピン構造の形態で上流に連結され得る。
相補的な一本鎖と連結しているヘアピン領域(ループと
も称される)は好ましく５〜５０ヌクレオチド長、特に
好ましくは５〜１０ヌクレオチド長であり、１種類だけ
のヌクレオチドからなるのが好ましい。プロモーターオ
リゴヌクレオチドＰ１は下流の５'末端に一本鎖鋳型特
異的領域ＴＥＭ１'を有する。該ＴＥＭ１'領域は好ま
しくは６〜５０ｎｔ長、特に好ましくは１２〜３０ｎｔ
長である。

【００１８】二本鎖プロモーター領域ＰＲＯはさらなる
ヌクレオチドの配列によって鋳型特異的配列ＴＥＭ１'
から離れていてよい。

【００１９】プロモーターオリゴヌクレオチドＰ１の
３'末端はリン酸化されていないのが好ましいが、一
方、５'末端はリン酸化されていてもリン酸化されてい
なくてもよい。Ｐ１の下流の３'末端は、例えばジデオ
キシヌクレオチドによって、伸長に対してブロックされ
得る。さらに、プロモーターオリゴヌクレオチドＰ１
は、下流領域で配列ＰＲＯと隣接しているさらなる一本
鎖または二本鎖ヌクレオチド配列を含有することができ
る。転写を促進する配列が好ましい[ヌークリイック・
アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)１５、第８７
８３〜８７９８頁(１９８７)]。ジェイ・エフ・ミリガ
ン(Ｊ.Ｆ.Ｍilligan)ら(１９８７)、ヌークリイック・
アシッズ・リサーチ、１５、第８７８３〜８７９８頁に
開示されているように転写を促進する、自己−相補的で
はあるが鋳型−相補的ではない転写可能なさらなる配列
を含有するプライマー１の領域は１〜２０ヌクレオチド
長であり得る；好ましくは５ヌクレオチド(ＣＣＧＣＧ)
長である。しかしながら、ＰＲＯおよびＴＥＭ１'間に
さらなる反応工程を可能にさせるさらなるヌクレオチド
配列があってもよい(複製のための開始配列(ori配列)、
制限切断部位、複製可能な配列、プライマーを配列決定
するための結合部位、蛋白結合部位)。

【００２０】転写開始およびＴＥＭ１'間の領域は０〜
１５０ｎｔ長であり得る。鋳型特異的オリゴヌクレオチ
ドＰ２は、鋳型核酸のさらなるヌクレオチド配列と実質
的に相補的であり、したがって、この配列とハイブリダ
イズすることができるヌクレオチド配列ＴＥＭ２'を含
有する。この配列は好ましくは６〜５０ｎｔ長、特に好
ましくは１２〜３０ｎｔ長である。本発明の生産方法の
特異性は、その長さおよび相補性によって調節され得
る。例えば、この配列の好適な選択によって、試料中で
数個の鋳型核酸(例えば、混合物中の種々の細菌の属ま
たは細菌の種の核酸)の１つだけを特異的に本発明の方
法の対象にすること、およびそれらの配列を増幅するこ
とが可能である。

【００２１】核酸の特異的生産に関する本発明の方法の
第１工程において、ハイブリダイゼーション条件下、鋳
型核酸を含有する試料をプロモーター試薬Ｐ１および鋳
型特異的オリゴヌクレオチドＰ２と反応させる。この方
法では、該鋳型核酸が二本鎖領域ＴＥＭ１／ＴＥＭ
１'を介してオリゴヌクレオチドＰ１に、および二本鎖
領域ＴＥＭ２／ＴＥＭ２'を介してオリゴヌクレオチ
ドＰ２にハイブリダイズする転写可能な核酸複合体Ｋが
形成される。下流方向では、さらなるオリゴヌクレオチ
ドＰ３・・・ＰＮがさらなる領域ＴＥＭ３・・・ＴＥＭＮを
介して鋳型核酸にハイブリダイズされ得る。ＴＥＭ１
領域は該核酸のＴＥＭ２領域とは異なる。該領域ＴＥ
Ｍ１'およびＴＥＭ２'はそれらが単にニックによって
分離されるように鋳型核酸上で直接隣接しているのが好
ましい。ハイブリダイズされた状態では、オリゴヌクレ
オチドＰ１の５'末端およびプライマーＰ２の３'末端は
お互いに直接隣接しているか、１〜１０、好ましくは１
〜５ヌクレオチド離れているのが好ましいが、しかし、
お互いに共有的には連結していない。しかしながら、そ
れらは１〜１５０、好ましくは１〜１０００ｎｔ離れて
いることもできる。次いで、まず、ニックが残るよう
に、このギャップをギャップ充填反応(ＤＮＡポリメラ
ーゼまたは逆トランスクリプターゼ、ｄＮＴＰs)によっ
て充填するのが好ましい。下流領域において結合するプ
ライマーＰ２またはプライマーＰＮは、鋳型核酸にハイ
ブリダイズしない配列ＴＥＭ２'またはＴＥＭＮ'に加
えてその５'領域にさらなるヌクレオチドを含有し得
る。このような配列は、例えば、ori配列(複製のための
開始領域)、複製可能な配列、ＲＥ部位、核酸結合蛋白
を結合するための配列、ホモポリマー配列またはさらな
るプロモーター配列であり得る。Ｐ２・・・ＰＮはその５'
および３'末端にＯＨを有するのが好ましい。ハイブリ
ダイゼーション領域ＴＥＭ１およびＴＥＭ２の各々
は、好ましくは６〜５０ｎｔ、特に好ましくは１２〜３
０ｎｔ長である。

【００２２】公知の方法と対比して、本発明の実質的な
特徴および長所は、オリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２
がＴ、Ｐ１およびＰ２のハイブリダイゼーション反応後
に酵素的に連結(リゲーション)されないということであ
る。これは、リガーゼ反応のための反応条件の調節、特
に結合酵素の使用を除去する。しかしながら、予め必要
なことは、鋳型核酸の(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３・・・ＰＮの)
「対向鎖」が１または数個のニックもしくはギャップを
有するか否かにかかわらず、プロモーターの転写開始位
置からオリゴヌクレオチドＰ２の、所望によりオリゴヌ
クレオチドＰＮの５'末端までの二本鎖の全長にわたっ
て転写産物を形成する次なる転写反応でトランスクリプ
ターゼを使用することである。当業者は簡単な方法で好
適なトランスクリプターゼを見いだすことができる。適
当な実験を実施例３に記載する。本発明の方法に適して
いる酵素のうちの１つはＴ７ＲＮＡポリメラーゼであ
る。

【００２３】核酸複合体Ｋの形成後、それをプロモータ
ー調節酵素転写させる。プロモーター調節転写が生じ得
る反応条件は、この複合体に関しては、従来技術の転写
反応に関するものと同一である。それらは、選択された
プロモーター／ポリメラーゼシステムに依存する。プロ
モーターシステムの例は、ファージＴ７、ＳＰ６および
Ｔ３から知られている。基本的には、ＲＮＡポリメラー
ゼおよびリボヌクレオシド三リン酸(ＮＴＰs)を必要と
する。Ｔ７の転写システム(Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼお
よびＴ７プロモーター)は、特に好ましい転写システム
であることが判明した。使用するポリメラーゼは熱安定
性でもあってもよい。

【００２４】プロモーターオリゴヌクレオチドＰ１の二
本鎖領域内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ−プロモーター
−特異的相補的配列領域は、１２〜２０ヌクレオチド長
(ミリガンら(１９８７)、ヌークリイック・アシッズ・
リサーチ、１５、第８７８３〜８７９８頁によって開示
されている最短および最長の機能性プロモーター配列)
であり得る。該二本鎖領域は１７ヌクレオチドの長さを
有するのが好ましい。

【００２５】転写の産物は５'末端が転写開始位置によ
って定義され、３'末端がＴＥＭ２領域の５'末端位置
によって定義されるＲＮＡ転写産物Ｒである。さらなる
オリゴヌクレオチドＰ３・・・ＰＮを使用する場合、該転
写産物は最も遠いオリゴヌクレオチドの５'末端位置と
相補的なリボヌクレオチドで終わるのが好ましい。この
ＲＮＡは特にＴＥＭ１およびＴＥＭ２と相同である配
列を含有する。

【００２６】プライマー１だけのハイブリダイゼーショ
ンの場合、プライマー１の５'末端まで伸長する鋳型へ
の結合とは無関係に、より短い転写産物が形成される。

【００２７】形成する転写産物Ｒはリボ核酸の生産のた
めの本発明方法の最終生産物であり得る。しかしなが
ら、サイクル反応方法でこの転写産物をさらに増幅する
のが好ましい。

【００２８】転写産物ＲがＴと相同であり、ＴＥＭ１
およびＴＥＭ２の配列情報を含有するので、次いで、
それらは、好ましくは、次に再度転写され得るＲ、Ｐ１
およびＰ２による転写可能な複合体Ｋ'の形成のための
鋳型核酸であり得る。かくして、増幅はＫ'の形成およ
び転写からなる反応シーケンスで該転写産物を繰り返し
使用することによって行うことができる。

【００２９】この方法の非常に優れた点はいずれの相で
もリガーゼを使用する必要がないということである。

【００３０】転写産物をまずｃＤＮＡに転写しなければ
ならず、次いで、これらをプロモータープライマーで、
次に転写される転写可能な複合体に転換しなければなら
ない方法よりも優れている点は、ｃＤＮＡの形成を省略
できることである；これはさらなる酵素の使用を省く。

【００３１】かくして、本発明方法では、原則的には、
酵素反応工程間で変性工程を用いずに唯一の酵素(プロ
モーター調節ポリメラーゼ)を使用して、一本鎖鋳型核
酸からリボ核酸を形成し得る。温度サイクルおよび反応
条件におけるサイクル的変化は必要ではない。反応工程
の数は非常に少ない。

【００３２】所望の数の核酸を形成するまで前記サイク
ルを続けることができる。

【００３３】形成されたリボ核酸を公知の方法でさらに
精製または／および処理し得る。例えば、プライマーＰ
２・・・ＰＮを使用することによって、例えば、該転写産
物ＲからcＤＮＡを生産することができる。

【００３４】適当な数の核酸が形成されたかどうかを試
験するために、例えば、所望の産物とハイブリダイズす
ることができる検出可能に標識した検出プローブを添加
し、該ハイブリッドを検出するか、または形成された核
酸を検出可能に標識したモノヌクレオチドの取込みによ
って直接検出し得る。

【００３５】本発明の方法の優れている点は、等温的に
行い得ること、すなわち１つの温度で行われ得ることで
ある。

【００３６】さらにまた、鋳型特異的増幅であり、シグ
ナル増幅だけではない。１組のモノヌクレオチド(リボ
ヌクレオチド)が必要なだけである。これは、低い生産
コストであることおよびポリメラーゼの相互抑制がない
ことを意味する。該オリゴヌクレオチドは生産が容易で
あり、ＤＮＡポリメラーゼが存在しないのでそれらの
３'末端をブロックする必要がない。本発明の方法で
は、鋳型核酸に関する定義された末端は必要ではなく、
したがって、対応する予備反応工程を省略することがで
きる。対向鎖オリゴヌクレオチドが特異的オリゴヌクレ
オチドと交差反応する修復連鎖反応またはＬＣＲの欠点
は、対向鎖オリゴヌクレオチドが必要ではないのであて
はまらない。それにもかかわらず、転写産物の各々が次
に鋳型として供され得るので、該反応は実質的に指数的
である。

【００３７】本発明の方法のある具体例において、鋳型
核酸の配列ＴＥＭ１およびＴＥＭ２の領域において一
本鎖形状を安定化するために、ブロッキングオリゴヌク
レオチドＢＬＯ１およびＢＬＯ２を、ＴＥＭ１およ
びＴＥＭ２と隣接する領域ＢＬＯ１'およびＢＬＯ２'
においてハイブリダイズする。ＢＬＯ１'領域はＴＥＭ
１の２〜１０ヌクレオチド上流にあるのが好ましい。
ＢＬＯ２'領域は結合部位ＴＥＭ２の１０ヌクレオチ
ドを超える下流にあるべきである。オリゴヌクレオチド
ＢＬＯ１およびＢＬＯ２は、伸長を防止するために、
例えば、ジデオキシリボヌクレオチドによって、３'末
端でポリメラーゼ活性をブロックする修飾を含有するの
が好ましい。さらなるブロッキングオリゴヌクレオチド
の使用が可能である。

【００３８】さらなる具体例においては、ＴＥＭ２は
ＴＥＭ１領域の５'末端から１〜１５０、好ましくは１
〜１０００ｎｔ離れている(「図４」のａ)。Ｐ１および
Ｐ２間のこのギャップは反応混合物中のＲＮＡ依存性ま
たはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで
充填され得る。この場合、３'−ブロックオリゴヌクレ
オチドＰ１を使用するのが好ましい。

【００３９】この「ギャップ」が１〜１０ヌクレオチド、
特に好ましくは１〜５ヌクレオチドからなる場合(「図
７」のプライマーＰ３〜Ｐ６およびプライマーＰ７〜Ｐ
１１)、これは前記ギャップ充填反応なしでＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼによって読み取られ得る。この方法で生産
した転写産物の長さはプライマー１の転写可能な配列の
長さおよび使用したプライマー２の長さの合計と一致す
る。

【００４０】かくして、さらに好ましい具体例におい
て、プライマー２の配列は、鋳型へのハイブリダイゼー
ションの後、プライマー１の５'末端とプライマー２の
３'末端との間に１〜１０、特に好ましくは１〜５ヌク
レオチドの「ギャップ」(上記参照)があるように選択され
る。ＤＮＡポリメラーゼ活性の不在下では、このギャッ
プは転写の間にＲＮＡポリメラーゼによって読み取られ
得る。すなわち、生産された転写産物においてプライマ
ー１の５'末端と相補的なヌクレオチドおよびプライマ
ー２の３'末端と相補的なヌクレオチドが直接隣接して
いる。次いで、転写産物の配列はＫ中に二本鎖形態で存
在する鋳型の転写可能な領域に対応するヌクレオチドを
含有するだけである。

【００４１】数種類のプライマーの、転写の方向でプロ
モーターオリゴヌクレオチド１で開始する鋳型へのハイ
ブリダイゼーションは、個々のプライマー間のギャップ
による突然変異の並行導入による万能遺伝子合成を可能
にする。

【００４２】したがって、本発明は、鋳型特異的領域が
鋳型核酸上で１〜１０ヌクレオチド離れている鋳型核酸
の領域と実質的に相補的である鋳型特異的領域を各々有
する少なくとも１つのプロモータープライマーおよび１
つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、プロモー
ター調節転写することからなる鋳型核酸を使用する欠失
突然変異核酸の生産方法に関するものでもある。

【００４３】この方法は、ＲＮＡポリメラーゼの、特に
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの性質を利用して読み取る。
これに関連して、欠失突然変異核酸は、特定の鋳型核酸
と実質的に相補的であるが１または数個のヌクレオチド
が欠損する完全な転写産物とは異なる核酸と解される。
欠損領域は完全な転写産物の３'または５'末端に直接あ
るものではない。

【００４４】本発明の方法でまず形成される欠失突然変
異リボ核酸を、公知の方法でさらなる反応に付すことが
できる(ギャップなしで次に核酸とハイブリダイズする
ことができるＰ１およびＰ２によるｃＤＮＡ形成または
新しい反応)。

【００４５】さらに、本発明は、核酸の特異的な生産の
ための本発明の方法を含む核酸の特異的な検出のための
方法および転写産物Ｒまたはそれらの二次的産物を検出
するその具体例に関する。これに関連して、二次的産物
は、特に、次に形成され得るｃＤＮＡと解される。これ
らの産物の検出は、原則的には、公知の方法で、例えば
標識プローブ核酸とのハイブリダイゼーションおよび標
識ハイブリッドの検出によって行われ得る。もう１つの
簡単な方法は、転写反応の間の標識モノヌクレオチドの
取込みまたは／およびゲル電気泳動による反応産物の分
離である。

【００４６】本発明の特に好ましい具体例は、転写反応
の間の検出可能に標識されたモノリボヌクレオチドの取
込み、および固相に直接結合されるかまたは好ましくは
例えばビオチンのような化学基に結合することによって
固定可能にされる捕獲プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを利用する。固定可能なプローブの場合、次いで、
化学基に対して結合親和性を有する固相上に固定するの
が可能である。検出可能に標識されたモノヌクレオチド
を分離した後、固相上の標識を検出するのが好ましい。
検出可能な基としてジゴキシゲニン−ＵＴＰ(ＥＰ−Ａ
−０３２４７４４)またはフルオレセイン−ＵＴＰを使
用するのが好ましい。次いで、ジゴキシゲニンに対する
酵素標識抗体によって、固相上のこの基の存在を検出す
る。

【００４７】捕獲または検出プローブについて、Ｐ２
(または、所望によりＰＮ)の部分配列または全配列と相
同であるかまたはＰ１の５'領域およびＰ２の３'領域と
相同である配列を選択するのが好ましい(各々の場合、
約１０ｎｔ)。それらは、好ましくは６〜５０００ｎ
ｔ、特に好ましくは１２〜５０ｎｔ長である。充填反応
では、それらはＰ１とＰ２との間の領域(充填領域)にあ
るのが好ましい；この結果、検出の特異性がさらに優れ
る。

【００４８】さらなる具体例において、Ｐ２を、５'末
端にあるのが好ましい固定可能な基で標識する。混合物
から複合体ＫおよびＫ'を単離するために、この基を介
して該複合体ＫおよびＫ'を固相に結合することができ
る。

【００４９】さらに、固定可能なＰ２を転写産物Ｒにハ
イブリダイズすることができ、この方法では、取込まれ
た検出可能に標識されたモノヌクレオチドを、例えば、
転写の間の検出によって検出することができる。この方
法の長所は、Ｐ２がそのまま供され得るのでさらなる捕
獲プローブが必要ではないという点である。

【００５０】さらなる具体例において、Ｐ１を固定可能
に修飾する。次いで、転写複合体Ｋを例えば固相に結合
し得、かくして核酸の混合物から分離することができ
る。

【００５１】本発明の検出方法は、本発明の核酸の生産
方法の長所のすべてを有する。

【００５２】各図において検出方法の例を示す。しかし
ながら、これらは検出工程が省略される場合には本発明
の生産方法でもある。

【００５３】本発明は、二本鎖プロモーター配列ＰＲＯ
に加えて鋳型特異的配列ＴＥＭ１'を含有する鋳型特異
的プロモーターオリゴヌクレオチドＰ１、および少なく
とも１つの鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰ２を含有す
る試薬に関する。

【００５４】該試薬は、さらに、前記オリゴヌクレオチ
ドＢＬＯ１およびＢＬＯ２のうち少なくとも１つまた
は他のものを含有するのが好ましい。非修飾または検出
可能もしくは固定可能に修飾された４つのタイプのモノ
ヌクレオシド三リン酸を含有するのも好ましい。さらに
また、pＨ緩衝液および補助剤、例えば安定化剤、特に
転写反応に適しているこれらの薬剤を含有することがで
きる。しかしながら、それはリガーゼを含有しない。

【００５５】さらに、本発明は、別々の容器に１)プロモーターオリゴヌクレオチドＰ１および鋳型特
異的オリゴヌクレオチドＰ２およびモノリボヌクレオシ
ド三リン酸；ならびに２)プロモーターに関して適している転写酵素を含有し
ており、３)リガーゼを含まない試薬キットに関する。

【００５６】該試薬キットはお互いに分離した１)に記
載した成分を含有することもできる。

【００５７】さらに、該試薬キットは、対照核酸および
／または試料調製用試薬を含有することができる。

【００５８】該試薬キットが核酸またはヌクレオチド配
列の検出のために使用される場合、別々の容器中にこれ
に必要な試薬、例えば捕獲または／および検出プローブ
を含有するのが好ましい。

【００５９】「図１」は、本発明の検出方法の流れ図を
示す。オリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２は別々にまた
は一緒に添加され得る。それらの量および濃度は同一で
あるのが好ましい。充分量のＰ１およびＰ２を開始時に
添加すると、Ｐ１およびＰ２の次なる添加は必要ではな
い。同一のものは他の試薬、特に酵素およびモノヌクレ
オチドに適する。

【００６０】「図２」は、検出可能に標識されたモノリ
ボヌクレオシド三リン酸を取込み、次いで、転写産物を
ビオチン化した捕獲プローブによって捕捉する本発明の
検出方法の具体例を示す。

【００６１】「図３」は、保護オリゴヌクレオチドＢＬ
Ｏ１およびＢＬＯ２ならびに固定可能に置換されたオ
リゴヌクレオチドＰ２を使用する具体例を示す。この具
体例では、検出可能かつ固定可能に標識されたＰ２およ
びＲのハイブリッドが検出される。

【００６２】「図４」には、核酸複合体Ｋの形成後、転
写が行われる前に、まず、オリゴヌクレオチドＰ１とオ
リゴヌクレオチドＰ２との間の一本鎖領域をＤＮＡポリ
メラーゼによって充填する具体例を説明する。捕獲プロ
ーブは充填領域ａにおいてハイブリダイズするのが好ま
しい。

【００６３】「図５」は、鋳型核酸の関連部分を示す。
プラスミドpＳＰＴ１８neo x ＥcoＲＩである。オリゴ
ヌクレオチドＰ１およびオリゴヌクレオチドＰ２がハイ
ブリダイズすることができる領域を示す。

【００６４】「図６」は、化学的に合成された鋳型、Ｐ
１およびＰ２のヌクレオチド配列がいかに配列され得る
かを示す。

【００６５】「図７」は、１組のオリゴヌクレオチドＰ
３〜Ｐ６(またはＰ７〜Ｐ１２)が、(プライマー１およ
びプライマー２の間の種々の長さのギャップ領域によっ
て)鋳型と比較して、あるオリゴヌクレオチドを欠失す
る転写産物を生産するのにいかに供され得るかを示す。

【００６６】略語のリストＴ鋳型核酸。ＫＰ１、Ｐ２およびＴからなる転写可能な核酸複合
体。Ｋ' Ｐ１、Ｐ２およびＲからなる転写可能な核酸複合
体。Ｒ転写産物(ＲＮＡ)。Ｐ１鋳型特異的プロモーターオリゴヌクレオチド。Ｐ２鋳型特異的オリゴヌクレオチド。Ｐプロモーター領域(二本鎖)(ＰＲＯと同一)。ＴＥＭ１転写開始位置に最も近い鋳型核酸上の配
列。ＴＥＭ２転写開始位置から最も遠い鋳型核酸上の配
列。ＴＥＭ１' Ｐ１の鋳型特異的領域。ＴＥＭ２' Ｐ２の鋳型特異的領域。Ｂio ビオチン。ＢＬＯ１' ＴＥＭ１の上流のヌクレオチド領域。ＢＬＯ２' ＴＥＭ２の下流のヌクレオチド領域。ＢＬＯ１ＢＬＯ１'と相補的なオリゴヌクレオチ
ド。ＢＬＯ２ＢＬＯ２'と相補的なオリゴヌクレオチ
ド。Ｄジゴキシゲニン(Ｄigと同一)。ａ充填領域。ＮＴＰリボヌクレオシド三リン酸。 dＮＴＰデオキシリボヌクレオシド三リン酸。Ｎ転写単位中のニック。

【００６７】

【実施例】以下の実施例によって本発明をさらに詳細に
説明する。

【００６８】実施例１ＲＮＡ鋳型の生産プラスミドpＳＰＴ１８ neo(ＷＯ８９／０６６９８の配
列参照)ネオマイシン耐性遺伝子(neo)の転写産物の生産
のために使用する。ベック(Ｂeck)ら(１９８２)、ジー
ン(Ｇene)、１９、３２７〜３３６の記載に従って、該
ネオマイシン遺伝子(アミノグリコシド−３'−ホスホト
ランスフェラーゼII)をpＳＰＴ１８に挿入する。ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼを使用して、得られたプラスミドp
ＳＰＴ１８neoからセンス配向(sense orientation)の遺
伝子の転写産物を生産することができる。プラスミドp
ＳＰＴ１８neoを制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩによ
って直鎖化する。バイオケミカルズ・フォー・モレキュ
ラー・バイオロジー(Ｂiochemicals for Ｍolecular Ｂ
iology)、ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍan
nheim)(１９９０)、第１５８頁の記載に従って、in vit
ro転写によってこの直鎖状プラスミドから長さ１０２８
ヌクレオチドのＲＮＡ転写産物を生産する。転写産物の
位置１はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写開始位置また
は転写産物の第１ヌクレオチドを示す。フェノール抽出
して酵素成分を除去し、エタノール沈殿の後、この方法
で精製された転写産物を鋳型として以下の実施例で使用
することができる。

【００６９】実施例２Ｐ１(ループ構造を有するプロモーター構築物)上での転
写ａ）Ｐ１の生産Ｐ１は、その５'末端の２５ｎｔが実施例１に記載のＲ
ＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位置４３０〜４５４
と、またはneo遺伝子を含有するベックら(上記参照)に
よって記載された配列のヌクレオチド位置１９３３〜１
９５７と相補的である７７ｎｔの核酸鎖からなる。さら
に、Ｐ１はバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラー
ゼに関するプロモーターの最小必要な自己−相補的配列
を含有する(「図６」のＰ１の配列参照)[ジェイ・エフ
・ミリガン(Ｊ.Ｆ.Ｍilligan)ら、(１９８７)、ヌーク
リイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)、
第１５巻、第２１号、８７８３−８７９８]。溶液中で
部分的二本鎖の形成を促進するＡＴリッチ領域によっ
て、これらの自己−相補的配列はお互いに離れている。
さらに、Ｐ１は、ジェイ・エフ・ミリガンら(１９８
７)、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１５、第
８７８3〜８７９８頁の記載に従って、転写を促進す
る、自己−相補的であるが鋳型−相補的ではない転写可
能なさらなる配列を含有することができる。

【００７０】モレキュラー・クローニング(Ｍolecular
Ｃloning)(１９８９)、編集者サムブルーク、フリッ
ツ、マニアティス、ＣＳＨ、第６.３９〜６.４８頁の記
載に従って、自動ＤＮＡシンセサイザーにおける合成の
後、Ｐ１と同一の７７ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌク
レオチドを２０％変性ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動によって精製する。Ｐ１の自己−相補的配列のでき
る限り完全なアニーリングを可能にするために、該精製
の後、反応容器中、このＤＮＡオリゴヌクレオチドを９
０℃に１０分間加熱し、次いで、氷上で１０分間冷却す
る。以下に記載の実験条件下、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼの存在下でＲＮＡ転写産物を生産する能力についてＰ
１を試験する。

【００７１】ｂ）転写反応該反応混合物は最終容量２５マイクロリットル中に以下
の成分を含有する：４０ミリモル／リットルＴris−Ｈ
Ｃl(３７℃でpＨ８.０)、６ミリモル／リットルＭgＣ
l₂、１０ミリモル／リットルＮaＣl、１０ミリモル／リ
ットルジチオトレイトール(ＤＴＴ)、２ミリモル／リ
ットルスペルミジン−ＨＣl、５％(v／v)ポリエチレン
グリコール(ＭＷ６０００)、０.０１％(ｖ/v)Ｔriton
Ｘ−１００、２ミリモル／リットルＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇ
ＴＰ、ＣＴＰの各々(３７℃でpＨ８.０)、５μＣi [³²
Ｐ]−ＣＴＰ(４００Ｃi／ミリモル、アマーシャム(Ａme
rsham))、５００ナノモル／リットルプライマー１、１
５Ｕ／マイクロリットルＴ７ＲＮＡポリメラーゼ(ベー
リンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim))、１Ｕ
／マイクロリットルＲＮＡseインヒビター(ベーリンガ
ー・マンハイム)。

【００７２】モレキュラー・クローニング(上記参照)第
７.３〜７.４頁の記載に従って、使用する非酵素物質
を、使用する前に、０.０１％ジエチルピロカーボネー
トで処理する。

【００７３】容量１００マイクロリットルの反応容器中
で個々の成分を混合し、調製物を３７℃で１時間インキ
ュベートする。

【００７４】ｃ）検出次いで、同量のホルムアミド停止緩衝液(９５％ホルム
アミド、２５mＭＥＤＴＡ、０.０１％キシレンシアノ
ール、０.０１％ブロモフェノール・ブルー)を添加し、
６８℃に３分間加熱し、氷上で該反応混合物を冷却する
ことによって該反応を停止する。次いで、変性反応調製
物の微量試料を、層の厚さ０.８mmの７Ｍ尿素、１２％
ポリアクリルアミドゲルに適用する。ユー・ケイ・レム
リ(Ｕ.Ｋ.Ｌaemmli)(１９７０)、ネイチャー(Ｎatur
e)、２７７、第６８０〜６８５頁の記載に従ってゲル電
気泳動を行う。次いで、該ゲルをオートラジオグラフィ
ーに付し、放射性産物を分析する。

【００７５】１０ミリモル／リットルＥＤＴＡおよび
０.１％ＳＤＳの添加によって該反応を停止することも
できる。次いで、検出のために、モレキュラー・クロー
ニング(上記参照)第７.４３〜７.４５頁の記載に従っ
て、該転写産物を１.５％変性アガロースゲル中で分離
し、該反応産物をアクリジニウム・オレンジ溶液(５μg
／ミリリットル)中で染色することによって可視化す
る。

【００７６】該反応混合物に[³²Ｐ]−ＣＴＰを添加しな
い場合、ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動の
後、特異的反応生産物をノーザンブロッティングによっ
てナイロン膜に移動させ、ＵＶによって固定し、相補的
な、放射活性または非放射活性に標識された[バイオケ
ミカルズ・フォー・モレキュラー・バイオロジー(Ｂioc
hemicals for Ｍolecular Ｂiology)、上記参照、第１
１２〜１１５頁]ＤＮＡオリゴヌクレオチドとのin-situ
ハイブリダイゼーションによって検出され得る。このタ
イプのハイブリダイゼーションは、ジェイ・メインコス
(Ｊ.Ｍeinkoth)およびジー・ワール(Ｇ.Ｗahl)(１９８
４)、アナリティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂio
chem.)、１３８、第２６７〜２８４頁ならびにヌークリ
イック・アシッド・ハイブリダイゼーション(Ｎucleic
Ａcid Ｈybridisation)(１９８５)編集者ビー・ディー
・ヘイムズ(Ｂ.Ｄ.Ｈames)およびエス・ジェイ・ヒギン
ズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)、ＩＲＬプレス、オクスフォード、
第１３９〜１５９頁に開示されている。

【００７７】セファデックス(Ｓephadex) Ｇ−５０カラ
ム上でゲル濾過によって取り込まれていない[³²Ｐ]−Ｃ
ＴＰから分離した後、エタノール沈殿による濃縮、ナイ
ロン膜上への滴下、ＵＶ固定化、Ｘ線フィルムの乾燥膜
への暴露および得られたフィルムの黒色化の測定によっ
て該反応生産物を検出することもできる。

【００７８】[³²Ｐ]−ＣＴＰの代わりに非放射活性標識
ＮＴＰsの取込みによって、ＤＯＴ、ＳＬＯＴまたはノ
ーザンブロットで該生産物を直接可視化することができ
る。抗−ジゴキシゲニン−ＡＰコンジュゲートまたはス
トレプトアビジン−ＡＰコンジュゲートによる直接検出
のためにジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰまたはビオチン
−１６−ＵＴＰの取込み(ＷＯ８９／０６６９８参照)を
使用することができる。

【００７９】該検出は、バイオケミカルズ・フォー・モ
レキュラー・バイオロジー(上記参照)第１０９〜１１５
頁の記載に従って、反応溶液の色の変化を介するアルカ
リホスファターゼの対応する基質５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェート(Ｘ−ホスフェート)お
よびニトロブルー・テトラゾリウム塩(ＮＢＴ)との反応
によって、あるいはアイ・ブロンスタイン(Ｉ.Ｂronste
in)およびピー・マクグレイス(Ｐ.ＭcＧrath)(１９８
９)、ネイチャー、３３８、第５９９〜６００頁の記載
に従って、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メト
キシ−４−(３"−ホスホリルオキシ)−フェニル−１,２
−ジオキセタン(ＡＭＰＰＤ、ベーリンガー・マンハイ
ム)を使用するアルカリホスファターゼによって媒介さ
れるケミルミネッセンス反応によって促進される。

【００８０】エム・ムサニ(Ｍ.Ｍusani)ら(１９９１)ア
ナリティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂioche
m.)、１９４、第３９４〜３９８頁の記載に従って、０.
７５モル／リットル２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール緩衝液(pＨ９.６)中の５.６マイクロモル／
リットル５−Ｎ−テトラデシアノイルアミノフルオレ
セイン(蛍光増強剤)の添加によってケミルミネッセンス
反応の感度をさらに増大させることができる。ケミルミ
ネッセンスによって生じた発光にポラロイドまたはＸ線
フィルムを暴露することによって証拠とする。プロモー
ター上の転写開始からＰ１の５'末端まで伸長するＲＮ
Ａを生産する。

【００８１】実施例３Ｐ１、Ｐ２およびＲＮＡ鋳型またはオリゴヌクレオチド
鋳型のハイブリッドの転写ａ）Ｐ２およびオリゴヌクレオチド鋳型の製造Ｐ２の配列(３０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオ
チド；「図６」の配列参照)は、実施例１に記載のＲＮ
Ａ転写産物のリボヌクレオチド位置４５６〜４８５と、
またはneo遺伝子を含有するベックら(上記参照)によっ
て記載された配列のヌクレオチド位置１９５８〜１９８
７と相補的である。この相補的配列は、プライマー２の
３'末端がＰ１の５'末端と直接隣接してＲＮＡ鋳型とハ
イブリダイズすることができるように選択される。実施
例２の記載に従って、合成の後、Ｐ２に対応する３０ヌ
クレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドを精製する。

【００８２】オリゴヌクレオチド鋳型の配列(５１ヌク
レオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図６」の配列
参照)は実施例１に記載のＲＮＡ転写のリボヌクレオチ
ド位置４３０〜４８１と相同である。このＲＮＡ鋳型に
対する相同的配列は、Ｐ１およびＰ２の鋳型相補的領域
がオリゴヌクレオチド鋳型上でお互いに直接隣接してハ
イブリダイズするように選択される。

【００８３】ｂ）転写反応鋳型核酸上のＰ１およびＰ２の相補的配列のできる限り
完全なアニーリングを可能にするために、他の反応成分
の添加前に、反応容器中で等モル量のこれらのＤＮＡオ
リゴヌクレオチドおよび鋳型核酸を９０℃に１０分間加
熱し、次いで、氷上で１０分間冷却する。次いで、Ｐ１
のヘアピン構造を形成するために、変性ＤＮＡオリゴヌ
クレオチドを３７℃で１０分間インキュベートする。転
写緩衝液および酵素成分(実施例２を参照)を反応容器中
で混合し、予備インキュベートしたオリゴヌクレオチド
Ｐ１およびＰ２を各々最終濃度５００ナノモル／リット
ルで添加する。反応混合物を３７℃で１時間インキュベ
ートする。

【００８４】実施例２と同様に転写反応を行う。次い
で、実施例２の記載に従って、反応生産物を検出し、Ｒ
ＮＡ産物を分析する。

【００８５】Ｐ１内のプロモーター上の転写開始からＰ
２の５'末端まで伸長するＲＮＡを生産する。

【００８６】実施例４プライマーＰ１、プライマーＰ２〜Ｐ６のうちの１つお
よびＲＮＡ鋳型またはオリゴヌクレオチド鋳型のハイブ
リッドの転写ａ）プライマー３〜６(一本鎖、直鎖状)の生産プライマーＰ３の配列(２９ヌクレオチドのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は実施例１に記
載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位置４５７−４
８５またはベックら(上記参照)によって記載された配列
のヌクレオチド位置１９５９−１９８７と相補的であ
る。

【００８７】プライマーＰ４の配列(２７ヌクレオチド
のＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は
実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位
置４５９−４８５またはベックら(上記参照)によって記
載された配列のヌクレオチド位置１９６１−１９８７と
相補的である。

【００８８】プライマーＰ５の配列(２６ヌクレオチド
のＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は
実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位
置４６０−４８５またはベックら(上記参照)によって記
載された配列のヌクレオチド位置１９６２−１９８７と
相補的である。

【００８９】プライマーＰ６の配列(２５ヌクレオチド
のＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は
実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位
置４６１−４８５またはベックら(上記参照)によって記
載された配列のヌクレオチド位置１９６３−１９８７と
相補的である。

【００９０】これらの相補的配列は、プライマーＰ３〜
Ｐ６の３'末端がプライマーＰ１の５'末端と直接隣接せ
ずにＲＮＡ鋳型とハイブリダイズすることができるよう
に選択される。実施例２の記載に従って、合成の後、プ
ライマーＰ３〜Ｐ６と同一のＤＮＡオリゴヌクレオチド
を精製する。

【００９１】プライマーＰ１、プライマーＰ３〜Ｐ６お
よびＲＮＡ鋳型またはオリゴヌクレオチド鋳型のハイブ
リダイゼーション産物を、転写の間、コード化核酸鎖に
おいてプライマーＰ１とプライマーＰ３〜Ｐ６との間に
形成される「ギャップ」を読み取ることができるＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの能力について試験する。

【００９２】ｂ）転写反応実施例２と同様に転写反応を行う。プライマーＰ１およ
びＰ３〜Ｐ６の相補的配列の鋳型核酸へのできる限り完
全なアニーリングを可能にするために、等モル量のこれ
らのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、他の反応成分の添加
前に反応容器中で９０℃に１０分間加熱し、次いで、氷
上で１０分間冷却する。次いで、変性ＤＮＡオリゴヌク
レオチドを３７℃で１０分間ハイブリダイズする。

【００９３】転写緩衝液および酵素成分(実施例２参照)
を反応容器中で混合し、オリゴヌクレオチドＰ１および
Ｐ３〜Ｐ６を各々最終濃度５００ナノモル／リットルで
添加する。該反応調製物を３７℃で１時間インキュベー
トする。

【００９４】次いで、実施例２の記載に従って、該反応
産物を検出し、ＲＮＡ産物を分析する。

【００９５】プライマーＰ１内のプロモーター上の転写
開始からブライマーＰ３〜Ｐ６の５'末端まで伸長する
ＲＮＡを生産する。該調製物において、生産された転写
産物の長さは、プライマーＰ３に関して５４ｎｔ、プラ
イマーＰ４に関して５２ｎｔ、プライマーＰ５に関して
５１ｎｔおよびプライマーＰ６に関して５０ｎｔであ
る。

【００９６】「ギャップ」領域の欠損ヌクレオチドが読
み取られ、転写可能な複合物Ｋにおける二本鎖領域の長
さを有するＲＮＡ転写産物が生産される。

【００９７】実施例５プライマーＰ１、Ｐ７〜Ｐ１２およびＲＮＡ鋳型または
オリゴヌクレオチド鋳型からのハイブリッドの転写ａ）プライマーＰ７〜Ｐ１２(一本鎖、直鎖状)の生産プライマーＰ７の配列(３０ヌクレオチドのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は実施例１に記
載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位置４５７〜４
８６またはベックら(上記参照)によって記載された配列
のヌクレオチド位置１９５９−１９８８と相補的であ
る。

【００９８】プライマーＰ８の配列(３０ヌクレオチド
のＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は
実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位
置４８５〜４８７またはベックら(上記参照)によって記
載された配列のヌクレオチド位置１９６０〜１９８９と
相補的である。

【００９９】プライマーＰ９の配列(３０ヌクレオチド
のＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)は
実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド位
置４５９〜４８８またはベックら(上記参照)によって記
載された配列のヌクレオチド位置１９６１〜１９９０と
相補的である。

【０１００】プライマーＰ１０の配列(３０ヌクレオチ
ドのＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)
は実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド
位置４６０〜４８９またはベックら(上記参照)によって
記載された配列のヌクレオチド位置１９６２〜１９９１
と相補的である。

【０１０１】プライマーＰ１１の配列(３０ヌクレオチ
ドのＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)
は実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド
位置４６１〜４９０またはベックら(上記参照)によって
記載された配列のヌクレオチド位置１９６３〜１９９２
と相補的である。

【０１０２】プライマーＰ１２の配列(３０ヌクレオチ
ドのＤＮＡオリゴヌクレオチド；「図７」の配列参照)
は実施例１に記載のＲＮＡ転写産物のリボヌクレオチド
位置４６２〜４９１またはベックら(上記参照)によって
記載された配列のヌクレオチド位置１９６４〜１９９３
と相補的である。

【０１０３】これらの相補的配列は、プライマーＰ７〜
Ｐ１２の３'末端がプライマーＰ１の５'末端と直接隣接
せずにＲＮＡ鋳型とハイブリダイズすることができるよ
うに選択される。実施例２の記載に従って、合成の後、
プライマーＰ７〜Ｐ１２と同一のＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを精製する。

【０１０４】プライマーＰ１、プライマーＰ７〜Ｐ１２
およびＲＮＡ鋳型またはオリゴヌクレオチド鋳型のハイ
ブリダイゼーション産物を、転写の間、コード化核酸鎖
においてプライマーＰ１とプライマーＰ７〜Ｐ１２との
間に形成される「ギャップ」を読み取ることができ、か
つ転写可能な複合体Ｋにおける二本鎖領域の長さを有す
るＲＮＡ転写産物を生産できるＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼの能力について試験する。

【０１０５】ｂ）転写反応実施例２と同様に転写反応を行う。プライマーＰ１およ
びＰ７〜Ｐ１２の相補的配列の鋳型核酸へのできる限り
完全なアニーリングを可能にするために、等モル量のこ
れらのＤＮＡを鋳型核酸と一緒に、他の反応成分の添加
前に反応容器中で９０℃に１０分間加熱し、次いで、氷
上で１０分間冷却する。次いで、ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを３７℃で１０分間インキュベートする。

【０１０６】転写緩衝液および酵素成分(実施例２参照)
を反応容器中で混合し、オリゴヌクレオチドプライマー
Ｐ１およびプライマーＰ７〜Ｐ１２を各々最終濃度５０
０ナノモル／リットルで添加する。該反応混合物を３７
℃で１時間インキュベートする。

【０１０７】次いで、実施例２の記載に従って、該反応
産物を検出し、ＲＮＡ産物を分析する。

【０１０８】プライマー１内のプロモーター上の転写開
始からプライマーＰ７〜Ｐ１２の５'末端まで伸長する
ＲＮＡを生産する。生産された転写産物の長さは、該調
製物全てにおいて(プライマー７〜１２に関して)５５ｎ
ｔである。

【０１０９】単一の「ギャップ」領域の欠損ヌクレオチ
ドが読み取られ、この領域で転写は停止または開始しな
い。

【０１１０】実施例６反応の変化範囲本発明の方法を成功裏に行うことができる反応条件を以
下に示す。しかしながら、これを使用して、当業者は
２、３の実験に基づいてこれとは異なる条件を決定する
こともできる。

【０１１１】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の検出方法を示す流れ図。

【図２】本発明の検出方法を示す流れ図。

【図３】本発明の検出方法を示す流れ図。

【図４】本発明の検出方法を示す流れ図。

【図５】鋳型核酸の関連部分の配列を示す模式図。

【図６】化学的に合成された鋳型、Ｐ１およびＰ２の
ヌクレオチド配列がいかに配列され得るかを示す模式
図。

【図７】１組のオリゴヌクレオチドＰ３〜Ｐ６(また
はＰ７〜Ｐ１２)が、(プライマー１およびプライマー２
の間の種々の長さのギャップ領域によって)鋳型と比較
して、あるオリゴヌクレオチドを欠失する転写産物を生
産するのにいかに供され得るかを示す模式図。

【符号の説明】

Ｔ鋳型核酸。ＫＰ１、Ｐ２およびＴからなる転写可能な核酸複合
体。Ｋ' Ｐ１、Ｐ２およびＲからなる転写可能な核酸複合
体。Ｒ転写産物(ＲＮＡ)。Ｐ１鋳型特異的プロモーターオリゴヌクレオチド。Ｐ２鋳型特異的オリゴヌクレオチド。Ｐプロモーター領域(二本鎖)(ＰＲＯと同一)。ＴＥＭ１転写開始位置に最も近い鋳型核酸上の配
列。ＴＥＭ２転写開始位置から最も遠い鋳型核酸上の配
列。ＴＥＭ１' Ｐ１の鋳型特異的領域。ＴＥＭ２' Ｐ２の鋳型特異的領域。Ｂio ビオチン。ＢＬＯ１' ＴＥＭ１の上流のヌクレオチド領域。ＢＬＯ２' ＴＥＭ２の下流のヌクレオチド領域。ＢＬＯ１ＢＬＯ１'と相補的なオリゴヌクレオチ
ド。ＢＬＯ２ＢＬＯ２'と相補的なオリゴヌクレオチ
ド。Ｄジゴキシゲニン(Ｄigと同一)。ａ充填領域。ＮＴＰリボヌクレオシド三リン酸。 dＮＴＰデオキシリボヌクレオシド三リン酸。Ｎ転写単位中のニック。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リューディガー・リューガードイツ連邦共和国デー−8124ゼースハウプト、トゥーツィンガー・シュトラーセ２番 (72)発明者クリストフ・ケスラードイツ連邦共和国デー−8021ドルフェン、シュロスベルクヴェーク11番 (72)発明者ルドルフ・ザイブルドイツ連邦共和国デー−8122ペンツベルク、サーランガーシュトラーセ46番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鋳型特異的プロモーターオリゴヌクレオ
チドＰ１およびさらなる鋳型特異的オリゴヌクレオチド
Ｐ２を鋳型核酸Ｔと直接ハイブリダイズして複合体Ｋを
形成し、次いで、少なくともＰ１およびＰ２由来の鋳型特異的配列情報を
含有する転写産物Ｒをプロモーター調節生産することか
らなり、使用するオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２が
当該方法のいずれの工程でも一緒に酵素的に連結されな
いことを特徴とする、鋳型核酸Ｔを使用する複数のリボ
核酸の特異的生産方法。
【請求項２】鋳型特異的領域が鋳型核酸上で１〜１０
ヌクレオチド離れている鋳型核酸の領域と実質的に相補
的である鋳型特異的領域を各々有する少なくとも１つの
プロモータープライマーおよびオリゴヌクレオチドをハ
イブリダイズし、プロモーター調節転写することからなる鋳型核酸を使用
する欠失突然変異核酸の生産方法。
【請求項３】鋳型特異的プロモーターオリゴヌクレオ
チドＰ１およびさらなる鋳型特異的オリゴヌクレオチド
Ｐ２を鋳型核酸Ｔと直接ハイブリダイズして複合体Ｋを
形成し、少なくともＰ１およびＰ２由来の鋳型特異的配列情報を
含有する転写産物Ｒをプロモーター調節生産し、次い
で、該転写産物Ｒを検出することからなり、使用するオリゴ
ヌクレオチドＰ１およびＰ２が当該方法のいずれの工程
でも一緒に酵素的に連結されないことを特徴とする、鋳
型核酸の特異的検出方法。
【請求項４】転写産物ＲがＰ１およびＰ２とハイブリ
ダイズされて複合体Ｋ'を形成し、次いで、Ｋ'もプロモーター調節下で転写される請求項１〜３い
ずれか１項記載の方法。
【請求項５】二本鎖プロモーター配列ＰＲＯに加えて
鋳型特異的配列ＴＥＭ１'を含有する鋳型特異的プロモ
ーターオリゴヌクレオチドＰ１、および少なくとも１つ
の鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰ２を含有しており、リガーゼを含まないことを特徴とする鋳型核酸からリボ
核酸を生産するための試薬。
【請求項６】別々の容器にプロモーターオリゴヌクレ
オチドＰ１および鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰ２お
よびモノリボヌクレオシド三リン酸；ならびにプロモー
ターに関して適している転写酵素を含有しており、リガーゼを含まないことを特徴とするリボ核酸の生産用
試薬キット。