WO2006088126A1 - 遺伝子検知方法 - Google Patents

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WO2006088126A1
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rna
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rnazdna
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Masahiro Goto
Hirofumi Ichinose
Momoko Kitaoka
Nobuko Okamura
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Definitions

  • the present invention relates to a gene detection method for determining a mutation of a specific base (position) in a gene and the presence or absence of a base for various purposes.
  • the technology that has been mainly used for gene detection for the above purpose is to amplify the target gene by PCR reaction and analyze it by direct sequencing electrophoresis to determine the presence of mutations. To do. Furthermore, there are also known real-time PCR methods that quantify target genes and analyze polymorphisms and mutations by monitoring the PCR reaction using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye as a primer [for example, JP 2002-275 (Patent Document 1), JP 2002-119291 (Patent Document 2)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-275
  • Patent Document 2 JP 2002-119291 A
  • An object of the present invention is to provide a novel genetic system that enables high-precision analysis with a small amount of sample and can easily determine the mutation of a specific base in a gene and the presence (presence / absence) of a specific base. It is to provide child detection technology.
  • the present inventor transcribes the target gene into RNA, hybridizes this RNA with a fluorescently labeled probe, and further preferably treats the obtained noblebrid with ribonuclease. It has been found that the above purpose can be achieved.
  • the present invention relates to a gene detection method for determining a mutation of a specific base in a target gene or the presence / absence of a specific base, comprising: a sample of the target gene; A sample of a control gene having a type or standard type base sequence is amplified by subjecting it to a PCR reaction using a primer pair containing a primer having an RNA polymerase promoter sequence at the 05 'end (ii) The double-stranded DNA obtained in (1) is subjected to an in vitro transcription reaction to form single-stranded RNA, and (iii) a sequence ability complementary to at least part of the base sequence of the control gene to the single-stranded RNA After hybridizing a fluorescently labeled probe in which a fluorescent dye is bound to the single-stranded DNA to form an RNAZDNA hybrid, (iv) RNAZD NA from the target gene sample, hybrid and The present invention provides a method comprising comparing the fluorescence intensities of RNA
  • RNAZDNA hybridization step (iii) in the RNAZDNA hybridization step (iii), a single strand comprising a sequence complementary to at least a part of the base sequence of the control gene.
  • a fluorescence quenching probe in which a quenching dye having a function of quenching the fluorescent dye is bound to a strand DNA is hybridized to the single-stranded RNA.
  • the RNAZDNA hybrid obtained in the step (iii) is subjected to an RNA degradation reaction using RNase, and then the fluorescence intensity in the step (iv) is compared. .
  • a gene sample can be prepared as a single-stranded RNA at a concentration 100 times or more that of the conventional method by subjecting the PCR product of the gene sample to an in vitro transcription reaction.
  • the method of the invention is a technique that avoids the operation of electrophoresis, and can greatly reduce the analysis time compared to the conventional method.
  • the series of operations in the method of the present invention can be performed easily and quickly without the need for special knowledge or skill.
  • the present invention is an analytical technique that can be applied to a wide variety of research facilities in that it does not require specialized analytical equipment such as a gene sequencer.
  • FIG. 1 shows each step constituting the gene detection method of the present invention.
  • FIG. 2 shows an HBV gene sequence (A) and an RNAZDNA hybrid as an application example of the present invention (Example 1).
  • FIG. 3 shows that HBV gene mutation is detected by fluorescence quenching rate according to the present invention (Example 1).
  • FIG. 4 As an application example of the present invention, an aldehyde rhohydrogenase gene sequence and a fluorescently labeled probe used for detecting the mutation are shown (Example 2).
  • FIG. 5 shows that according to the present invention, mutations in the HBV gene and ADRB2 gene are simultaneously detected by the fluorescence quenching rate (Example 3).
  • FIG. 6 As an application example of the present invention, a hybrid is shown in which a fluorescence quenching probe coexists in addition to a fluorescently labeled probe in the HBV gene (Example 1).
  • FIG. 7 when detecting mutations in the HBV gene, The coexistence of a light quenching probe increases the quenching rate and shows that mutation can be detected with higher sensitivity (Example 1).
  • FIG. 8 shows various tuna gene sequences in examples of tuna variety discrimination according to the present invention, and fluorescent and quenching labeled probes used (Example 4).
  • FIG. 9 illustrates the result of discriminating tuna varieties by measuring the fluorescence quenching rate according to the present invention (Example 4).
  • a target gene sample sample of a test gene
  • a control gene sample of a gene having a wild-type or standard nucleotide sequence with respect to the target gene described above
  • the sample is first subjected to a PCR (polymerase 'chain' reaction) reaction.
  • the feature of the present invention is that, in a later step, a large amount of single-stranded RNA is synthesized by converting the PCR product into a saddle shape. The sample volume can be increased dramatically. Therefore, when amplifying each gene sample by PCR reaction, a primer having an RNA polymerase promoter sequence at the 5 'end is used in addition to a primer specific to each gene as in a normal PCR reaction. Yes.
  • PCR reaction of the present invention except that a primer having an RNA polymerase promoter sequence is used, is applied to each of the sample of the target gene or the sample of the control gene that has a double-stranded DNA strength that is not exceptional.
  • dNTP and thermostable DNA polymerase are used, and as is well known, the thermal degradation of double-stranded DNA, primer annealing, and extension reaction with polymerase are repeated (usually 30-- 40 cycles).
  • the RNA polymerase promoter sequence attached to the 5 'end of the primer is a promoter sequence of a DNA-dependent RNA polymerase (transcriptase).
  • RNA polymerase promoter configuration examples include T7 RNA polymerase recognition sequence [5,-TAATACG ACTC ACTATA
  • GGG (SEQ ID NO: 1) 3 '] is mentioned in addition to this.
  • thermostable DNA polymerase used in the PCR step of the method of the present invention those generally used in the art can be used, for example, commercially available from Takara Shuzo Co., Ltd. under the trade name Pyrobest. However, this is not the only one! /
  • the double-stranded DNA obtained by the above PCR reaction is subjected to an in vitro transcription reaction.
  • the double-stranded DNA which is a PCR product, has an RNA polymerase promoter motor sequence on the 5 ′ end side, and therefore undergoes a transcription reaction by the action of RNA polymerase.
  • This in vitro transcription reaction can be carried out using a commercially available in vitro transcription reaction kit.
  • an in vitro transcription reaction kit suitable for use in the present invention for example, “T7 RiboMAX TM Express Large
  • DNA amplification may be limited by PCR reaction alone.
  • the amount of gene sample (target gene sample and control gene sample) is increased by subjecting the PCR product to in vitro transcription reaction.
  • RNAZDNA hybrid (Dablex).
  • a fluorescently labeled probe is a probe in which a fluorescent dye is bound to a single-stranded DNA having a sequence ability complementary to at least a part of the base sequence of a control gene.
  • the fluorescent dye is covalently bonded to the base at the end of the probe (5 'end or 3' end), and the base to be detected is as much as possible to the base to which the fluorescent dye is bound. Close to, i.e. the key or end present at its end It is preferable to design the fluorescently labeled probe so that it is located within 3 bases from the base.
  • FIG. 2 (B) shows a fluorescently labeled probe designed to detect such a single nucleotide polymorphism according to the present invention.
  • the probe (5′—CAT ATA ACT GAA AGC CA A AC—3 ′) (SEQ ID NO: 4) is labeled with a fluorescent dye attached to the 5 ′ terminal base (labeled ⁇ ).
  • the target gene (RNA—as a strand) to be detected exists at the site corresponding to the terminal base! /.
  • RNAZDNA nodules derived from the target gene sample shown below in Fig. 2 (B)
  • RNAZDNA nodules derived from the control gene sample upper in Fig. 2 (B)
  • fluorescence intensities gene mutations can be detected.
  • RNAZDN A-NOB-derived from the wild type (control gene) whose detection target is G is more quenched than the RNAZDNA hybrid derived from the mutant type (indicated by X). The degree is large! (See examples below).
  • fluorescent dyes that are covalently bonded to single-stranded DNA are used.
  • preferred fluorescent dyes are FITC (fluorescein isothiocyanate), TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), FAM (5-carboxyfluorescein), HEX (6 carboxy 2 ', 4,4' , 5 ', 7,7' monohexachlorofluorescein), rhodamine, Cy3 [indodicarboyanine 3-1-1-O- (2-cyanoanoethyl) -1 (N, N, 1 diisopropane)], etc. A certain force is not limited to these.
  • the fluorescent dye and the quenching dye are bound to the ends of the fluorescently labeled probe and the quenching label, respectively. If the fluorescent dye is attached to the 5 'end of the fluorescently labeled probe, the quencher dye should be attached to the 3' end of the quenched labeled probe, or vice versa. In either case, the base to be detected should be as close as possible to the base to which the fluorescent and quenching dyes are bound, ie, from the force present at the end, or from the terminal base. Be within the base position (see Figure 6 and Figure 9).
  • the combination of the fluorescent dye and the quenching dye that can be used is not particularly limited, but it is preferable!
  • quenching dye BHQ-1 [4 '-(2-tro 4-toluyl diazo) 2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene 4' '-(N ethyl) N ethyl for fluorescent dye FITC —2-Cyanoethyl- (N, N-diisopropane))
  • quenching dye BHQ-2 [4 '(4-12 trophenyl diazo) 2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene 4', 1 (for fluorescent dyes rhodamine, TAMRA, or Cy3 etc. N-ethyl 2-O- (4,4, -dimethoxytrityl))-N-ethyl-2-O glycolate] can also be used.
  • RNA sample 15 ⁇ L was added thereto to obtain an RNAZDNA hybrid.
  • the extinction rate (Qr) was calculated by performing a correction operation using the above-described equation 1. The results are shown in Fig. 4. As shown in the figure, a high extinction rate (55%) was given to an RNA sample (wild type homozygote) that also had wild type power. On the other hand, the quenching rate was significantly reduced (2%) in the RNA sample (mutant homozygote), which only had the mutant type. In addition, the heterozygote including wild type and mutant gave a quenching rate of 28%.
  • the fluorescence intensity values before and after hybridization are measured, and the mutation of each allele can be detected by calculating and correcting this.
  • RNA products were collected through ethanol precipitation and redissolved in sterilized water as RNA samples. The reaction conditions are shown below.
  • Reaction composition (20 ⁇ 1): PCR reaction solution (2 L), Enzyme Mix, T7 Express (2 L), 1 ⁇ Ribo MAX TM Express T7 buffer

Abstract

　標的遺伝子中の特定の塩基の変異または存否を判定する遺伝子検知方法が開示されている。標的遺伝子のサンプル、および該標的遺伝子に対して野生型または標準型の塩基配列を有する対照遺伝子のサンプルのそれぞれを、(i)５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを含むプライマー対を用いるＰＣＲ反応に供して増幅し、(ii)前記ＰＣＲ反応で得られた二本鎖ＤＮＡをインビトロ転写反応に供して一本鎖ＲＮＡを形成し、(iii)前記一本鎖ＲＮＡに、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖ＤＮＡに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブをハイブリダイゼーションさせてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させた後、(iv)標的遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと対照遺伝子サンプル由来のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの蛍光強度を比較する。  

Description

明 細 書
遺伝子検知方法
技術分野
[0001] 本発明は、各種の目的から、遺伝子中の特定の (位置の）塩基の変異や塩基の存 否を判定する遺伝子検知方法に関する。
背景技術
[0002] ヒトゲノムプロジェクトの終了により、ヒトの全塩基配列が決定され各種遺伝子の存 在とその機能が明らかにされるに従い、それぞれの遺伝子の変異ないしは異常を検 出することは、所謂ポストゲノムの薬剤や治療'診断法等の開発における手段としても 重要性を増している。例えば、ヒトにおける 1塩基レベルの変異、すなわち一塩基多 型（SNP)を検出し、この SNP情報を基にして患者の個人差に合わせたオーダーメ ード (テーラーメード）医療が可能になるものと期待されている。
[0003] また、近年は、食品の偽装表示を防止し、安全で消費者の要求に応じた農産物、 水産物、畜産物などを確保する点からそれらの食品の原材料を DNA分析する必要 性も高まっている。
さらに、自然または人為的な環境の変化に応じて、地中、水中、大気中などに存在 する微生物などの有害性や無毒化や確認する手段として、当該微生物の遺伝子の 変化 (例えば、有害性に関与する特定の塩基の存否）を知ることも重要になっている
[0004] 如上の目的で遺伝子検知に従来より主として行なわれてきた技術は、 PCR反応に より標的遺伝子を増幅し、これをダイレクトシークェンシングゃキヤピラリー電気泳動 法により解析して変異の存在を判別するものである。さら〖こ、蛍光色素で標識された 核酸プローブをプライマーとして用いて PCR反応をモニタリングすることにより標的遺 伝子を定量して多型 ·変異を解析するリアルタイム PCR法も知られている〔例えば、 特開 2002— 275号公報 (特許文献 1)、特開 2002— 119291号公報 (特許文献 2)
L
[0005] しかしながら、これらの従来技術においては、 PCRにより得られる DNA量には限界 があり、再現性および信頼性の高い結果を得るためには、高度な知識と熟練された 技術を必要とする。また、 DNAシークェンサ一などの高額な分析機器を必要とし、解 祈に長時間を有するなどの問題点も有して 、る。電気泳動操作を行なう場合には、 分析に更なる手間を要することになる。
特許文献 1：特開 2002— 275号公報
特許文献 2：特開 2002— 119291号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、少量のサンプルで高精度の分析を可能とし、遺伝子中の特定の 塩基の変異や特定の塩基の存否 (有無)を簡便に判定することのできる新し 、遺伝 子検知技術を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、検討を重ねた結果、標的遺伝子を RNAに転写し、この RNAを蛍光 標識プローブとハイブリダィゼーシヨンさせ、さらに、好ましくは、得られたノヽイブリツド をリボヌクレアーゼで処理することによる如上の目的が達成され得ることを見出した。
[0008] 力べして、本発明は、標的遺伝子中の特定の塩基の変異または特定の塩基の存否 を判定する遺伝子検知方法であって、前記標的遺伝子のサンプル、および該標的 遺伝子に対して野生型または標準型の塩基配列を有する対照遺伝子のサンプルの それぞれを、（05'末端に RNAポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを含 むプライマー対を用いる PCR反応に供して増幅し、（ii)前記 PCR反応で得られた二 本鎖 DNAをインビトロ転写反応に供して一本鎖 RNAを形成し、（iii)前記一本鎖 RN Aに、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列力 成る一本鎖 DNAに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせて R NAZDNAハイブリッドを形成させた後、（iv)標的遺伝子サンプル由来の RNAZD NAノ、イブリツドと対照遺伝子サンプル由来の RNAZDNAハイブリッドの蛍光強度 を比較する、以上の諸工程を含むことを特徴とする方法を提供するものである。
[0009] 本発明の好ましい態様に従えば、前記 (iii)の RNAZDNAハイブリッド形成工程に おいて、前記対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本 鎖 DNAに、前記蛍光色素を消光する機能を有する消光色素が結合された蛍光消光 プローブを、前記一本鎖 RNAにハイブリダィゼーシヨンさせる。
[0010] 本発明の別の好ましい態様に従えば、前記工程 (iii)で得られた RNAZDNAハイ ブリツドを RNァーゼを用いる RNA分解反応に供した後、工程 (iv)の蛍光強度の比較 を行なう。
発明の効果
[0011] 本発明に従えば、遺伝子サンプルの PCR産物をインビトロ転写反応に供することに より、従来法の 100倍以上の濃度で一本鎖 RNAとして遺伝子サンプルを調製するこ とができる。すなわち、 PCRのみによる従来法において問題であったサンプル量の 制限による信頼性の低下が克服される。また、発明の方法は電気泳動の操作を回避 した技法であり、従来法と比べ分析時間を大幅に短縮することができる。本発明の方 法における一連の操作は、特に専門的な知識や熟練された技術を必要とせずに簡 便かつ迅速に行なうことが可能である。さらに、本発明は、遺伝子シークェンサ一な どの特化された分析機器を必要としな 、点からも、多岐の研究施設で適応しうる分析 技術である。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]本発明の遺伝子検知方法を構成する各工程を示す。
[図 2]本発明の適用例として HBVの遺伝子配列 (A)と、 RNAZDNAハイブリッドを 示す (実施例 1)。
[図 3]本発明に従 、、 HBVの遺伝子変異が蛍光消光率により検出されることを示す（ 実施例 1)。
[図 4]本発明の適用例として、アルデヒドロヒドロゲナーゼの遺伝子配列と、その変異 検出に用いられる蛍光標識プローブを示す (実施例 2)。
[図 5]本発明に従 ヽ、 HBV遺伝子および ADRB2遺伝子の変異が蛍光消光率により 同時に検出されることを示す (実施例 3)。
[図 6]本発明の適用例として HBVの遺伝子に蛍光標識プローブに加えて、蛍光消光 プローブを併存させた場合のハイブリッドを示す (実施例 1)。
[図 7]本発明に従 ヽ HBV遺伝子の変異を検出するに際して、蛍光標識プローブと蛍 光消光プローブを併存させることにより、消光率が大きくなり、より高感度に変異検出 ができることを示す (実施例 1)。
[図 8]本発明に従うマグロの品種判別の実施例における各種マグロの遺伝子配列と、 使用した蛍光標識プローブと消光標識プローブを示す (実施例 4)。
[図 9]本発明に従い、蛍光消光率を測定することによりマグロの品種判別を行った結 果を例示する（実施例 4)。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、図 1に示す本発明の遺伝子検知方法を構成する各工程に沿って本発明の 実施の形態を詳述する。
PCR反]^
本発明に従う遺伝子検知にお 、ても、標的遺伝子のサンプル (被検遺伝子のサン プル)、および対照遺伝子のサンプル (上記の標的遺伝子に対して野生型または標 準型の塩基配列を有する遺伝子のサンプル）は、先ず、 PCR (ポリメラーゼ 'チェイン 'リアクション)反応に供されるが、本発明の特徴は、後の工程で、 PCR産物を铸型に して一本鎖 RNAを大量に合成してサンプル量を飛躍的の増大させることができるこ とにある。このため、それぞれの遺伝子サンプルの PCR反応による増幅に際して、プ ライマーとして通常の PCR反応におけるようにそれぞれの遺伝子に特異的なプライ マーの他に、 5'末端に RNAポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを用 いる。
[0014] 本発明における PCR反応は、 RNAポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマ 一を用いること以外は、格別のものではなぐ二本鎖 DNA力も成る標的遺伝子のサ ンプルまたは対照遺伝子のサンプルのそれぞれに、如上のプライマーの他、 dNTP 、耐熱性の DNAポリメラーゼをカ卩えて、よく知られているように、二本鎖 DNAの熱変 性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長反応を繰り返す (通常、 3 0〜40サイクル）ことによって行なわれる。
[0015] 本発明に従う遺伝子検知方法の PCR工程において、プライマーの 5'末端に付カロ する RNAポリメラーゼプロモーター配列は、 DNA依存性 RNAポリメラーゼ（トランス クリプターゼ）のプロモーター配列である。好ましい RNAポリメラーゼプロモーター配 列の例としては T7RNAポリメラーゼ認識配列〔5， - TAATACG ACTC ACTATA
GGG (配列番号： 1) 3 '〕が挙げられる力 これに限られるものではなぐこの他に、
SP3RNAポリメラーゼなども使用できる。
[0016] 本発明の方法の PCR工程において使用される耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 当該分野で一般的に用いられているものが使用でき、例えば、商品名 Pyrobestで宝 酒造 (株)から市販されて 、るものが挙げられるが、これに限られるものではな!/、。
[0017] インビトロ転写反応
本発明に従えば、如上の PCR反応で得られた二本鎖 DNAはインビトロ転写反応 に供される。ここで、 PCR産物である二本鎖 DNAは 5'末端側に RNAポリメラーゼプ 口モーター配列を有して 、るので、 RNAポリメラーゼの作用により転写反応を受けて
、 PCR産物を铸型とする一本鎖 RNAになる。
[0018] このインビトロ転写反応は、市販のインビトロ転写反応キットを用いて実施することが できる。本発明において使用されるのに好適なインビトロ転写反応キットとしては、例 えば、「T7 RiboMAX™ Express Large
Scale RNA Production System」（Promega社）が挙げられるが、これに限られるもので はない。
[0019] PCR反応のみでは DNAの増幅に限界があり得られる DNAは微量である力 本発 明では PCR産物をインビトロ転写反応に供することにより遺伝子サンプル (標的遺伝 子サンプルおよび対照遺伝子サンプル）の量を一本鎖 RNAとして大幅に増加させる (一般的には 100倍以上の濃度に)ことができる。
[0020] ノヽイブリダィゼーシヨン
本発明に従う遺伝子検知方法にぉ ヽては、如上のインビトロ転写反応で得られた 一本鎖 RNAを、次に、蛍光標識プローブとハイブリダィゼーシヨンさせて、 RNAZD NAハイブリッド (ダブレックス）を形成させる。蛍光標識プローブは、対照遺伝子の塩 基配列の少なくとも一部に相補的な配列力 成る一本鎖 DNAに蛍光色素が結合さ れたものである。ここで、蛍光色素は、当該プローブの末端（5'末端または 3 '末端） の塩基と共有結合しており、そして、検出対象となる塩基はその蛍光色素の結合して いる塩基に可及的に近接するように、すなわち、その末端に存在するカゝまたは末端 塩基から 3塩基以内の位置にあるように蛍光標識プローブを設計するのが好ましい。
[0021] 図 2は、以上のような標的遺伝子の塩基配列と蛍光標識プローブの関係を例示す るものである。図 2の (A)は、テーラーメード医療を目指す一塩基多型の例として、ラ ミブジン療法が効果的な野生型のヒト肝炎ウィルス (HBV)遺伝子の塩基配列 (配列 番号: 2)と、ラミブジン療法が非効果的な変異型のヒト HBVの塩基配列 (配列番号： 3)を示しており、野性型における塩基 G力 に変異することに応じて野性型における アミノ酸 M (リジン）力 (イソロイシン）に変異してラミブジン耐性になるものと考えられ ている。図 2の（B)は、そのような一塩基多型を本発明に従い検出するために設計し た蛍光標識プローブを示す。プローブ（5 '—CAT ATA ACT GAA AGC CA A AC— 3' ) (配列番号 :4)は、 5'末端塩基に蛍光色素が結合されて標識 (ラベル ィ匕)されており、図の例では、該末端塩基に対応する部位に標的遺伝子 (RNA—本 鎖として）の検出対象の塩基が存在して!/、る。
[0022] 力べして、被検標的遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツド（図 2の（B)で は下方に示す）と対照遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツド（図 2の（B) では上方）の蛍光強度を比較することにより遺伝子の変異を検出することができる。 図 2の例では、検出対象の塩基が Gである野性型 (対照遺伝子）由来の RNAZDN Aノヽイブリツドは、当該部位が変異した (Xで示す)変異型由来の RNAZDNAハイブ リツドよりも蛍光の消光の程度が大き!ヽ (後述の実施例参照)。
[0023] 本発明にお 、て一本鎖 DNAに共有結合される蛍光色素としては、従来より知られ た各種のものが使用される。好ましい蛍光色素の例は、 FITC (フルォレセインイソチ オシァネート）、 TAMRA (5—カルボキシテトラメチルローダミン）、 FAM (5—カルボ キシフルォレセイン）、 HEX(6 カルボキシ 2' ,4,4' ,5' , 7,7' 一へキサクロロフルォ レセイン）、ローダミン（Rhodamine)、 Cy3〔インドジカルボシァニン一 3— 1— O— (2 —シァノエチル）一（N, N，一ジイソプロパン）〕などである力 これらに限られるもので はない。
[0024] 本発明の好ましい態様に従えば、既述のインビトロ転写反応で得られた一本鎖 RN Aに、蛍光標識プローブに加えて、さらに、消光標識プローブをハイブリダィゼーショ ンさせる。消光標識プローブは、対照遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に相補的 な配列から成る一本鎖 DNAに、蛍光色素を消光する機能を有する消光色素 (蛍光 色素の蛍光放射領域に重なる吸収帯を有する分子力 成る）が結合されたものから 成る。
[0025] 一般に、蛍光色素および消光色素は、それぞれ、蛍光標識プローブおよび消光標 識の末端に結合される。蛍光色素を蛍光標識プローブの 5 '末端に結合させた場合 は、消光色素を消光標識プローブの 3'末端に結合させ、あるいはその逆とする。い ずれの場合においても、検出対象となる塩基は、蛍光色素および消光色素の結合し ている塩基に可及的に近接するように、すなわち、その末端に存在する力、または末 端塩基から 3塩基以内の位置にあるようにする（図 6および図 9参照)。
[0026] 使用できる蛍光色素と消光色素の組合せは特に限定されるものではないが、好ま し！、例として、蛍光色素 FITCに対して消光色素 BHQ— 1〔4'一（2 -トロー 4ート ルイルジァゾ） 2'—メトキシー 5'—メチルーァゾベンゼン 4' '一（N ェチル） N ェチル—2—シァノエチル—（N, N—ジイソプロパン））〕が挙げられる。この他に 、蛍光色素ローダミン、 TAMRA、または Cy3などに対して消光色素 BHQ— 2〔4' ( 4一二トローフエニルジァゾ） 2'—メトキシー 5'—メトキシーアゾベンゼン 4'，一 ( N ェチル 2— O— (4, 4，—ジメトキシトリチル））—N—ェチル—2— O グリコレ ート〕なども使用できる。
[0027] 以上のように、 RNAに蛍光標識プローブおよび消光標識プローブをハイブリダィズ させたハイブリッドを用いる蛍光測定系では、著しく大きな消光率が達成され、標的 遺伝子中の特定の塩基の変異や存否をより高い精度で検出することができる。
[0028] 一本鎖 DNAに蛍光色素が結合された蛍光標識プローブは、既述のように PCR反 応をモニタリングするリアルタイム PCR法におけるプライマーとして従来も用いられて いたが（特許文献 1および 2)、本発明のように、遺伝子サンプルを一本鎖 RNAにし、 これに蛍光標識プローブをハイブリダィズさせ、さらに、好ましくは、消光標識プロ一 ブもノ、イブリダィズさせ、遺伝子検知のために蛍光強度を比較するのに使用される例 はなかった。
[0029] 本発明の遺伝子検知方法は、 1塩基レベルの遺伝子変異、すなわち一塩基多型を 検出するのに適して 、る。図 1や図 2は単一個の 1塩基変異が存在する場合を示して いるが、本発明の方法は、複数個の 1塩基変異が存在する標的遺伝子サンプルにつ いても同様に適用できる。そのような場合、検出対象となる 1塩基間は互いに少なくと も約 30塩基離れていることが好ましぐそれらの検出対象塩基のそれぞれに可及的 に近接するように蛍光色素を結合させ、該蛍光色素を互いに別異のものとすることが 好ましい。さらに、本発明は、 1塩基変異を有する複数の標的遺伝子について、それ らの変異を同時に検出する場合にも適用できる。
[0030] RNA分解
本発明に従えば、上記のようにして得られた標的遺伝子サンプル由来の RNAZD NAノ、イブリツドと対照遺伝子サンプル由来の RNAZDNAハイブリッドの蛍光強度 を比較することにより遺伝子変異を検出することができるが、本発明の特に好ましい 態様にぉ 、ては、それらの RNAZDNAノヽイブリツドを RNァーゼ（RNase：リボヌタレ ァーゼ)を用いる RNA分解反応に供した後に、蛍光強度の比較を行なう。これによつ て、蛍光標識プローブとハイブリダィズして ヽな ヽ RNAの部分が分解除去される結 果、蛍光強度 (蛍光消光率)の差がより顕著になり、その比較による変異の検出が容 易になり精度よく行なわれる。さらに、既述のように、蛍光標識プローブの蛍光放出領 域と重複する吸収帯を有する分子を結合させた蛍光消光プローブを近接するように 併存させることで、著しく大きな消光率が達成され、より高い精度での変異検出を可 能とする。
以下、本発明の特徴を更に具体的に説明するため実施例を示すが、本発明はこれ らの実施例によって制限されるものではない。
実施例 1
[0031] < B型肝炎ウィルスに見られる遺伝子変異の検出 >
1.1 DNAサンプルの調製（PCR)
検知遺伝子として図 2の (A)に示す B型肝炎ウィルス遺伝子〔野性型 (対照遺伝子) および変異型 (標的遺伝子)〕を含むプラスミド遺伝子 (pUC18の Smalサイトに連結さ れた B型肝炎ウィルス遺伝子)を铸型としてそれぞれ PCR反応を行 ヽ、解析対象 (検 出対象)部位を含む遺伝子断片を得た。 PCRプライマーには 5'末端に T7 RNAポリメ ラーゼプロモーター配列を付加したプライマー 1 (配列番号： 5)および遺伝子特異的 なプライマー 2 (配列番号： 6)を用い、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラーゼ（TaKaR a)により行った。反応条件を以下に示す。
PCR反応組成（100 μ 1)：铸型 DNA (く 1 g)、 Pyrobest (登録商標） DN Aポリメラー ゼ（2.5 unit)、プライマー 1 (1 M)ゝプライマー 2 (1 μ Μ)、 dNTP(200 M)、 1 x Pyro best
Buffer II。
PCR条件：熱変性（95°C、 5min) lサイクルを行った後、 [熱変性（95°C、 15sec)—ァニ 一リング（55°C、 30sec)一伸長反応（72°C、 30sec) ]35サイクルを行った。
プライマー 1 : 3，
プライマー 2 :
5' - GGTACCCCAACTTCCAATTACATAT - 3 '
[0032] 1.2 RNAサンプルの調製 (インビトロ転写反]^)
1.1に示す工程により得られた PCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖 RNAを 調製した。転写反応は、 T7 RiboMAX™ Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。 RNA産物はエタノール沈殿 を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものを RNAサンプルとした。反応条件を以 下に示す。
反応組成 (20 μ 1)： PCR反応液（2 L)、 Enzyme Mix, T7 Express (2 L)、 1 χ RiboM AX Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30。C、 30min)の後、 Dr. GenTLE™ Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いて RNAサンプルを回収した。
[0033] 1.3.1 ハイブリダィゼーシヨンおよび RNA分解
図 2 (B)に示すように、 5'末端に各種の蛍光色素を結合したオリゴ DNA (5'— CA TATAACTGAAAGCCAAAC 3 ' )を蛍光標識プローブとして用いた。
蛍光標識プローブ（40pmol)を lmLのハイブリダィゼーシヨン緩衝液（10mM Tris— H Cl、 10mM MgCl、 pH7.0)に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値を F0と した。これに RNAサンプル（15 μ L)を添カ卩し RNAZDNAのハイブリッドを得た。こ れに、リボヌクレアーゼ A (0.5 g)を作用させた後の蛍光強度値を測定し F1とした。 下記の演算式 1を用いて補正演算し消光率 (Qr)を算出した。
その結果を図 3に示す。一連の結果より、 RNAサンプルと蛍光標識プローブが完 全相補的であるときにお 、て〔すなわち、検出対象部位の塩基が Gである対照（野性 型）遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノ、イブリツドにお!/、ては〕高!、消光率を与え 、末端部位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩基が G以外である標的（変異型)遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツドにお ヽ ては〕消光率を著しく減少させることが示された。このように、ハイブリダィゼーシヨン前 後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで遺伝子の変異を検出す ることがでさる。
[0034] 1.3.2 プローブ^^ プローブ 併存させた 屮,
また、図 6に示すように、 5，末端に蛍光色素 (FITC)を結合したオリゴ DNA (5，一 CC
ATATAACTGAAAGCCAAA- 3 ' )および 3 '末端に消光分子（BHQ— 1)を結合した オリゴ DNA (5， - GGCCCCCAATACCACATCAT— 3，）をそれぞれ蛍光標識プロ ーブおよび蛍光消光プローブとして用いた。
[0035] 蛍光標識プローブ（20pmol)および蛍光消光プローブ（lOOpmol)を lmLのハイブリ ダイゼーシヨン緩衝液（10mM Tris— HC1、 10mM MgCl 、 pH7.0)に溶解し蛍光強度を
2
測定した。得られた蛍光強度値を F0とした。これに RNAサンプル（15 L)を添カ卩し R NAZDNAのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼ A (0.5 μ g)を作用させた 後の蛍光強度値を測定し F1とした。下記の演算式 1を用いて補正演算し消光率 (Qr )を算出した。
[0036] その結果を図 7に示す。一連の結果より、 RNAサンプルと蛍光標識プローブが完 全相補的であるときにおいて〔すなわち、検出対象部位の塩基力 である正常（野性 型)標的遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツドにお 、ては〕高 、消光率を 与え、末端部位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩 基が G以外である被検 (変異型)標的遺伝子サンプル由来の RNAZDNAハイブリツ ドにおいては〕消光率を著しく減少させることが示された。このように、ハイブリダィゼ ーシヨン前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで遺伝子の変 異を検出することができる。
[0037] 〔数 1〕
演算式 1 Qr= (FO—Fl) ZFO X 100 (%)
実施例 2
[0038] <アルデヒドヒドロゲナーゼ遺伝子に見られる変異の検出 >
2.1 DNAサンプルの調製（PCR)
検知遺伝子として図 4に示すヒトアルデヒドヒドロゲナーゼ（野性型および変異型)遺 伝子を含むプラスミド遺伝子 (PUC18の Smalサイトに連結されたアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ遺伝子)を铸型としてそれぞれ PCR反応を行、、検出対象部位を含む遺伝 子断片を得た。 PCRプライマーには 5'末端に T7 RNAポリメラーゼプロモーター配 列を付加したプライマー 1 (配列番号: 7)および遺伝子特異的なプライマー 2 (配列番 号： 8)を用い、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラーゼ (TaKaRa)により行った。反応 条件を以下に示す。
PCR反応組成（100 μ 1)：铸型 DNA (く 1 g)、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラー ゼ（2.5 unit)、プライマー 1 (1 M)ゝプライマー 2 (1 μ Μ)、 dNTP(200 M)、 1 x Pyro best
Buffer II。
PCR条件：熱変性（95°C、 5min) lサイクルを行った後、 [熱変性（95°C、 15sec)—了二 一リング（55°C、 30sec)一伸長反応（72°C、 30sec)]35サイクルを行った。
プライマー 1 :
プライマー 2 :
5 CCACACTCACAGTTTTCACTT 3 '
[0039] 2.2 RNAサンプルの調製 (インビトロ転写反]^)
2.1に示す工程より得られた PCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖 RNAを調 製した。転写反応は、 T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System (Promega)により行った。 RNA産物はエタノール沈殿を通じて回 収し、滅菌水に再溶解させたものを RNAサンプルとした。反応条件を以下に示す。 反応組成 (20 μ 1)： PCR反応液（1 μ L)、 Enzyme Mix, T7 Express (2 L)、 lx RiboM AXTM
Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30。C、 30min)の後、 Dr. GenTLE™ Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いて RNAサンプルを回収した。
[0040] 2.3 ハイブリダィゼーシヨンおよび RNA分解
図 4に示すように、 3，末端を蛍光色素 TAMRAを結合したオリゴ DNA(5， -AC A CTCACAGTTTTCACTTC 3 ' ) (配列番号 9)を蛍光標識プローブとして用いた。 蛍光標識プローブ（40pmol)を lmLのハイブリダィゼーシヨン緩衝液（10mM Tris- H Cl、 10mM MgCl、 pH7.0)に溶解し蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値を F0と
2
した。これに RNAサンプル（15 μ L)を添カ卩し RNAZDNAのハイブリッドを得た。こ れに、リボヌクレアーゼ A (0.5 g)を作用させた後の蛍光強度値を測定し F1とした。 既述の演算式 1を用いて補正演算し消光率 (Qr)を算出した。結果を図 4に示す。図 に示されるように、野性型のみ力もなる RNAサンプル（野性型ホモ接合体）において 高い消光率 (55%)を与えた。一方、変異型のみ力 なる RNAサンプル (変異型ホモ 接合体）においては消光率を著しく減少させた (2%)。また、野性型および変異型を含 むへテロ接合体においては 28%の消光率を与えた。このように、ハイブリダィゼーショ ン前後における蛍光強度値を測定し、これを演算補正することで各アレルの変異を 検出することができる。
実施例 3
[0041] < ADRB2および HBV遺伝子に見られる変異の同時検出 >
3.1 DNAサンプルの調製（PCR)
検知遺伝子としてヒトの β 2—アドレナリンレセプター ( β 2 -Adrenergic Receptor: ADRB2)遺伝子 (野性型および変異型)を含むプラスミド遺伝子を铸型としてそれぞ れ PCR反応を行い、検出対象部位を含む遺伝子断片を得た。 PCRプライマーには 5'末端に T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー 1 (配列番号： 9)および遺伝子特異的なプライマー 2 (配列番号： 10)を用い、 Pyrobest (登録商標）
DNAポリメラーゼ (TaKaRa)により行った。反応条件を以下に示す。
PCR反応組成（100 μ 1)：铸型 DNA (く 1 g)、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラー ゼ（2.5 unit)、プライマー 1 (1 M)ゝプライマー 2 (1 μ Μ)、 dNTP(200 M)、 lx Pyrob est Buffer
II
PCR条件：熱変性（95°C、 5min) lサイクルを行った後、 [熱変性（95°C、 15sec)—ァニ 一リング（55°C、 30se)一伸長反応（72°C、 30sec) ]35サイクルを行った。
プライマー 1 :
プライマー 2 :
5' - ATTGCCAAACACGATGGCCA- 3 '
HBV遺伝子についても、既述の実施例 1の 1.1の場合と同様に PCR反応を行なつ た。
[0042] 3.2 RNAサンプルの調製 (インビトロ転写反]^)
3.2に示す工程より得られた 2種類の PCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖 R NAを調製した。転写反応は、 T7 RiboMAX™ Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。 RNA産物はエタノール沈殿 を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものを RNAサンプルとした。反応条件を以 下に示す。
反応組成 (20 μ 1)： PCR反応液（各 1 L)、 Enzyme Mix, T7 Express (2 L)、 lx Ribo MAX™
Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30。C、 30min)の後、 Dr. GenTLE™ Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いて RNAサンプルを回収した。
[0043] 3.3 ハイブリダィゼーシヨンおよび RNA分解
5，末端に蛍光色素 FITCを結合した HBV用オリゴ DNA(5'—CCATATAACTGA AAGCCAAAC 3 ' ) (配列番号：11)および 3，末端に蛍光色素 TAMRAを結合した A DRB2用オリゴ DNA (5'— ACCCACACCTCGTCCCTTTC— 3，）（配列番号： 12)を 蛍光標識プローブとして用いた。
各蛍光標識プローブ（40pmol)を lmLのハイブリダィゼーシヨン緩衝液（10mM Tris- HC1、 10mM MgCl、 pH7.0)に溶解し FITCおよび TAMRAに由来する蛍光強度を測
2
定した。得られた蛍光強度値を F0とした。これに RNAサンプル（15 /z L)を添カ卩し RN AZDNAのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼ A (0.5 g)を作用させた後 の蛍光強度値を測定し F1とした。既述の演算式 1を用いて補正演算し消光率 (Qr)を 算出し、これを演算補正した。結果を図 5に示す。それぞれの Qrは各蛍光プローブ の相補性に応答した値を与え、異なる複数の SNPs部位を同時に検出することができ た。これらの結果は、本発明の方法により、異なる遺伝子鎖または同一遺伝子鎖内 に存在する複数箇所の SNPsを同時に検出可能であることを示している。
実施例 4
<遺伝子変異によるマグロの品種判別 >
4.1 DNAサンプルの調製（PCR)
検知遺伝子としてマグロ魚種ミトコンドリア DNAを铸型としてそれぞれ PCR反応を 行い、解析対象 (検出対象)部位を含む遺伝子断片を得た。 PCRプライマーには 5' 末端に T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を付加したプライマー 1 (配列番号： 1 3)および遺伝子特異的なプライマー 2 (配列番号： 14)を用い、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラーゼ (TaKaRa)により行った。反応条件を以下に示す。
PCR反応組成（100 μ 1)：铸型 DNA (く 1 g)、 Pyrobest (登録商標） DNAポリメラ ーゼ（2.5 unit)、プライマー 1 (1 M)ゝプライマー 2 (1 μ Μ)、 dNTP (200 M)、 1 x P yrooest
Buffer II。
PCR条件：熱変性（95°C、 5min) lサイクルを行った後、 [熱変性（95°C、 15sec)—ァ ニーリング（55°C、 30sec)一伸長反応（72°C、 30sec) ]35サイクルを行った。
プライマー 1 : 3,
プライマー 2 :
5' - TTAGAAGGAAAAGTAGGGTTGCTGTTAG - 3 '
[0045] 4.2 RNAサンプルの調製 (インビトロ転写反応)
4.1に示す工程により得られた PCR産物をインビトロ転写反応に供し一本鎖 RNAを 調製した。転写反応は、 T7 RiboMAX™ Express Large
Scale RNA Production System (Promega)により行った。 RNA産物はエタノール沈殿 を通じて回収し、滅菌水に再溶解させたものを RNAサンプルとした。反応条件を以 下に示す。
反応組成 (20 μ 1)： PCR反応液（2 L)、 Enzyme Mix, T7 Express (2 L)、 1 χ Ribo MAX™ Express T7 buffer
反応条件：合成反応（30。C、 30min)の後、 Dr. GenTLE™ Precipitation
Carrier (TaKaRa)を用いて RNAサンプルを回収した。
[0046] 4.3 プローブ^^ プローブ 併存させた 屮,
図 8に示すように、 5，末端に蛍光色素 (FITC)を結合したオリゴ DNA(5， 一 GAAGG ACAGTTGCTGCTGTA— 3， ) (配列番号： 15)および 3，末端に消光分子（BHQ— 1 )を結合したオリゴ DNA (5， - TAC AGTTGGC ATTAGTGGTA - 3， ) (配列番号： 16 )をそれぞれ蛍光標識プローブおよび蛍光消光プローブとして用いた。
蛍光標識プローブ（20pmol)および蛍光消光プローブ（lOOpmol)を lmLのハイブリ ダイゼーシヨン緩衝液（10mM Tris— HC1、 10mM MgCl 、 pH7.0)に溶解し蛍光強度を
2
測定した。得られた蛍光強度値を F0とした。これに RNAサンプル（15 L)を添カ卩し R NAZDNAのハイブリッドを得た。これに、リボヌクレアーゼ A (0.5 μ g)を作用させた 後の蛍光強度値を測定し F1とした。既述の演算式 1を用いて補正演算し消光率 (Qr )を算出した。この例では、太平洋産クロマグロを判別することを目的とし、その遺伝 子を標的遺伝子 (配列番号： 17)とした。
その結果を図 9に示す。一連の結果より、 RNAサンプルと蛍光標識プローブが完 全相補的であるときにおいて〔すなわち、検出対象部位の塩基力^である対照遺伝 子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツドにお!/、ては〕高!、消光率を与え、末端部 位において相補性を有さない場合には〔すなわち、検出対象部位の塩基力 ST以外で ある標的遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツドにお ヽては〕消光率を著し く減少させることが示された。このように、ノ、イブリダィゼーシヨン前後における蛍光強 度値を測定し、これを演算補正することで太平洋マグロ魚種を判別することができた 産業上の利用可能性
本発明の方法は、少量のサンプルから、特化された分析機器を必要とせずに簡便 に遺伝子中の特定の塩基の変異や存否の判定を可能にするので、遺伝子解析に基 づく疾病の診断、予防または治療のための手段や薬剤の開発、あるいは農水畜産物 の品種同定や品種改良、環境変化の評価など産業の多くの分野における利用が期 待される。

Claims

請求の範囲
[1] 標的遺伝子中の特定の塩基の変異または特定の塩基の存否を判定する遺伝子検 知方法であって、前記標的遺伝子のサンプル、および該標的遺伝子に対して野生 型または標準型の塩基配列を有する対照遺伝子のサンプルのそれぞれを、 (05 '末 端に RNAポリメラーゼプロモーター配列を有するプライマーを含むプライマー対を用 V、る PCR反応に供して増幅し、（ii)前記 PCR反応で得られた二本鎖 DNAをインビト 口転写反応に供して一本鎖 RNAを形成し、（iii)前記一本鎖 RNAに、前記対照遺伝 子の塩基配列の少なくとも一部に相補的な配列から成る一本鎖 DNAに蛍光色素が 結合された蛍光標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせて RNAZDNAノ、イブリ ッドを形成させた後、（iv)標的遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノヽイブリツドと対照 遺伝子サンプル由来の RNAZDNAノ、イブリツドの蛍光強度を比較する、 以上の諸工程を含むことを特徴とする方法。
[2] 前記 (iii)の RNAZDNAハイブリッド形成工程において、前記対照遺伝子の塩基配 列の少なくとも一部に相補的な配列力 成る一本鎖 DNAに、前記蛍光色素を消光 する機能を有する消光色素が結合された蛍光消光プローブを、前記一本鎖 RNAに ノ、イブリダィゼーシヨンさせることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] 前記工程 (iii)で得られた RNAZDNAノヽイブリツドを RNァーゼを用いる RNA分解 反応に供した後、工程 (iv)の蛍光強度の比較を行なうことを特徴とする請求項 1また は請求項 2に記載の方法。
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