CN115725723A

CN115725723A - 一种ace基因分型的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN115725723A
Application number: CN202211347977.1A
Authority: CN
Inventors: 乔志宏; 霍笑笑; 方忠海; 宋立洁; 孙隽; 石超男
Original assignee: Tianjin Medical Laboratory Bgi
Current assignee: Tianjin Medical Laboratory Bgi
Priority date: 2022-10-31
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-03-03

Abstract

一种ACE基因分型的方法及试剂盒，基于Ct值进行ACE基因分型的方法包括：扩增步骤，包括将待测样本、引物、探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得扩增曲线；预测步骤，包括根据扩增曲线，预测待测样本的ACE基因型别。基于Tm值进行ACE基因分型的方法，包括：熔解步骤，包括将待测样本、用于扩增目标位点的引物、用于靶向结合至目标位点的探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得熔解曲线；预测步骤，包括根据熔解曲线的Tm值，预测待测样本的ACE基因型别。本发明设计的探针可特异性检测目标突变，实现信号方法检测目标突变和抑制非特异性信号干扰的目的。

Description

一种ACE基因分型的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种ACE基因分型的方法及试剂盒。

背景技术

血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)，又称激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶，属血管内皮细胞膜的结合酶，广泛分布于人体组织，以附睾、睾丸及肺的含量较丰富，其中肺毛细血管内皮细胞ACE活性最高，它附着于内皮细胞表面，可被分解释放入血循环。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是一种调节血压的重要内分泌系统，ACE是RAS的重要组成部分。ACE的主要作用是将不活跃的血管紧张素I(AngⅠ)转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，以及水解缓激肽使其失去活性。AngⅡ是一种强效的血管收缩剂和醛固酮刺激剂，能够使血管收缩，迅速引起升压反应。缓激肽是一种具有血管舒张功能的多肽，能够通过舒缓血管增加血管壁的通透性，促使血压下降。研究发现，ACE基因多态性与血浆AngⅡ水平有关,抑制ACE活性对降压有积极影响。

ACE的水平是由ACE基因决定的，该基因是高度多态的，在NCBI中记录中，共发现160多种ACE基因多态性，其中大多数为单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)，但是目前研究最多的是位于17号染色体第16号内含子的Alu重复序列的插入/缺失(Insertion/Deletion，I/D)多态性(rs1799752)，插入型(I)等位基因包括额外的287bp碱基。因此，ACE基因在此多态位点可分为：DD型(纯合子)、DI型(杂合子)和II型(纯合子)。家系研究显示，I/D多态性为显性遗传，多态性频率分布在不同的种族有明显的差异。

ACE基因的I/D多态性与高血压存在一定的联系。多项研究表明，ACE缺失型(D)等位基因可以使血液循环和心脏组织及细胞内ACE水平增加，DD型个体的ACE水平最高。高血压受试者更常见的DD和DI基因型，而血压正常的受试者常见II基因型。与具有I等位基因的受试者相比，具有D等位基因的受试者的维生素D和蛋白质摄入量较低，而碳水化合物和铜的摄入量较高。ACE基因的I/D多态性对心血管也有很大影响，ACE水平增加，能把更多的AngI转化Ang II，Ang II可能对心肌细胞有直接毒性作用，诱导非梗死区心肌肥厚、刺激成纤维细胞增殖等，影响心血管稳态，从而导致冠心病的发生。同时，AngII能够刺激醛固酮释放，促进血小板衍生生长因子表达，导致血栓形成，进而使血管堵塞，形成卒中。AC E基因的I/D多态性不仅与冠心病早发、心肌梗塞发病率增加相关联，而且是诸多心血管疾病的独立危险因素。最新的研究发现ACE基因的I/D多态性与COVID-19易感性和死亡率也存在一定关联性。SARS-CoV-2棘突蛋白能有效地与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合，促进病毒侵入宿主细胞。因ACE与ACE2具有40％的同源性，推测与COVID-19与ACE多态性也存在一定关联性。研究证实D等位基因频率与亚洲人群中SARS-CoV-2感染病例数、死亡率之间存在显著的正相关性。

ACE基因的I/D多态性分型，对高血压、冠心病、脑卒中及新冠的预防和治疗中都具有非常重要的意义，为临床预测药物疗效提供了一定的遗传学基础。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术是一种成熟的荧光探针技术，基于该技术可以实现核酸基因突变的检测。但目前针对ACE基因多态性的PCR扩增技术存在系统偏向，优先扩增缺失的片段，导致对插入序列存在明显的灵敏度下降情况。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种ACE基因分型的方法，包括：

扩增步骤，包括将待测样本、引物、探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得扩增曲线；

预测步骤，包括根据所述扩增曲线的Ct值，预测所述待测样本的ACE基因型别。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种基于Tm值进行ACE基因分型的方法，包括：

熔解步骤，包括将待测样本、引物、探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得熔解曲线；

预测步骤，包括根据所述熔解曲线的Tm值，预测所述待测样本的ACE基因型别。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种基于Ct值进行ACE基因分型的试剂盒，包含上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针；

所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ IDNo.2所示核苷酸序列；

所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列，所述纯合突变型探针包含如SE Q ID No.6所示核苷酸序列。

在一实施例中，试剂盒中还含有内参基因的引物以及探针。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种基于Tm值进行ACE基因分型的试剂盒，包含1)上游引物以及下游引物；以及2)野生型探针；

所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

在一实施例中，试剂盒中还含有内参基因的引物以及探针。

依据上述实施例的一种ACE基因分型的方法及试剂盒，本发明设计的探针可特异性检测目标突变，实现ACE基因分型检测。

在一实施例中，本发明的反应体系中采用了非对称扩增的方式，通过调整上下游引物的浓度和配比，实现在有效扩增的前提下，更优势的扩增探针结合的目标链，从而实现信号方法检测目标位点和抑制非特异性信号干扰的目的。

附图说明

图1为ACE-4341/42引物在不同退火温度时扩增电泳图；

图2为Group1-野生型探针对不同型别样本的扩增曲线图；

图3为Group 1-突变型探针针对不同型别样本的扩增曲线图；

图4.1为Group final-野生型样本的扩增曲线图；

图4.2为Group final-杂合突变型样本的扩增曲线图；

图4.3为Group final-纯合突变型样本的扩增曲线图；

图5为Group1-野生型探针针对不同型别样本的熔解曲线图；

图6为Group1-突变型探针针对不同型别样本的熔解曲线图；

图7.1为Group final-野生型的样本熔解曲线图；

图7.2为Group final-杂合突变型的样本熔解曲线图；

图7.3为Group final-纯合突变型的样本熔解曲线图；

图8.1为实施例中样本S1、S4的QPCR检测扩增曲线图；

图8.2为实施例中样本S2、S5的QPCR检测扩增曲线图；

图8.3为实施例中样本S3、S6的QPCR检测扩增曲线图；

图9为实施例中样本S1-S6的QPCR检测熔解曲线图；

图10为经典Right法的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

如本文所用，“Ct值”是指在实时荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

如本文所用，“Tm值”是指DNA的熔解温度(melting temperature)，具体是指吸光值增加到最大值的一半时的温度称为DNA的解链温度或熔点。具体地，Tm值是DNA变性过程中紫外吸收达到最大值一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。

如本文所用，“杂合突变”是指等位基因中只有其中一个等位基因出现突变，即一对等位基因，一条未发生突变，一条发生突变。

如本文所用，“纯合突变”是指一对等位基因都存在突变。

目前，对ACE基因I/D多态性分型的检测和筛查，主要有经典Right法(限制性片段长度多态性分析，RFLP)、Sanger测序法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法等。1990年Right团队首次发现ACE I/D多态性并使用RFLP分型方法，因为Alu酶可以识别插入型(I)等位基因中的Alu限制性内切酶特异位点，切割目标区域，产生不同大小片段的产物，最后根据电泳片段大小进行基因分型。但是该方法操作较繁琐，通量较低，且扩展应用存在一定局限性；Sanger法虽然是基因多态性检测的金标准，但是价格昂贵，不适合高通量样本的分型。目前市面出现很多QPCR平台定性或定量进行分型的方法，这些方法的引物一般设计在包含插入片段的两端，该方法优先扩增更短的片段(D)等位基因，具有无法避免的系统倾向，容易导致(I)基因的漏判。

扩增步骤，包括将待测样本、用于扩增目标位点的引物、用于靶向结合至目标位点的探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得扩增曲线；

在一实施例中，扩增步骤中，所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至野生型rs4341位点和野生型rs4342位点的野生型探针、可通过反向互补配对的方式结合至突变型rs4341位点和突变型rs4342位点的突变型探针。

在一实施例中，扩增步骤中，所述反应体系中DNA的投入量＞1ng/μL。

在一实施例中，扩增步骤中，所述反应体系中DNA的投入量为2～120ng/20μL。

在一实施例中，扩增步骤中，所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列，所述突变型探针包含如SEQ ID No.6所示核苷酸序列。

在一实施例中，扩增步骤中，所述突变型rs4341位点包含G>A突变位点。

在一实施例中，扩增步骤中，所述突变型rs4342位点包含A>C突变位点。

扩增步骤中，反应体系中各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；

优选地，扩增步骤中，反应体系中野生型探针上修饰的荧光报告基团的发射光波长不同于突变型探针上修饰的荧光报告基团的发射光波长。通常，不同的荧光报告基团，具有不同的激发波长和发射波长。

在一实施例中，所述荧光报告基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一种。

在一实施例中，所述荧光淬灭基团包括但不限于MGB。

在一实施例中，扩增步骤中，所述引物包含上游引物以及下游引物。

在一实施例中，扩增步骤中，所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列。

在一实施例中，扩增步骤中，反应体系中上游引物的终浓度为1～3μM，下游引物的终浓度为0.5～1.5μM。

在一实施例中，扩增步骤中，反应体系中，各探针的终浓度独立地为0.5～1.5μM。

在一实施例中，扩增步骤中，反应体系中还含有内参基因及其上游引物、下游引物、内参探针，反应体系中内参基因的上游引物、下游引物、内参探针的终浓度独立地为0.2～0.5μM。

在一实施例中，扩增步骤中，反应程序如下：95℃预变性2～5min；第一步扩增，95℃变性15～30s，60℃退火、延伸30～50s，循环5～8次；第二步扩增，95℃变性15～30s，56℃退火、延伸30～50s，循环40～45次，收集荧光信号。

在一实施例中，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果扩增曲线呈单扩增曲线“S”峰，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因，如果无扩增曲线，同时无相应的Ct值，则预测待测样本不含有ACE基因的野生型等位基因。

在一实施例中，预测步骤中，当使用突变型探针检测时，如果扩增曲线呈单扩增曲线“S”峰，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因，如果无扩增曲线，同时无相应的Ct值，则预测待测样本不含有ACE基因的突变型等位基因。

在一实施例中，扩增步骤中，所述待测样本来源于人。

在一实施例中，扩增步骤中，所述待测样本为DNA样本。初始样本可以是组织样本或体液样本。

在一实施例中，待测样本为人类基因组DNA。

熔解步骤，包括将待测样本、用于扩增目标位点的引物、用于靶向结合至目标位点的探针加入反应体系中，进行荧光定量PCR反应，获得熔解曲线；

在一实施例中，熔解步骤中，熔解步骤所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至野生型rs4341位点和野生型rs4342位点的野生型探针，或，所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至突变型rs4341位点和突变型rs4342位点的突变型探针。

在一实施例中，熔解步骤中，所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

在一实施例中，熔解步骤中，反应体系中各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。

在一实施例中，所述荧光淬灭基团包括但不限于MGB、BHQ中的至少一种。

在一实施例中，熔解步骤中，所述引物包含上游引物以及下游引物。

在一实施例中，熔解步骤中，所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列。

在一实施例中，熔解步骤中，反应体系中上游引物的终浓度为0.1～0.2μM，下游引物的终浓度为1～1.5μM。

在一实施例中，熔解步骤中，反应体系中，各探针的终浓度独立地为0.2～0.4μM。

在一实施例中，熔解步骤中，反应体系中还含有内参基因及其上游引物、下游引物、内参探针，反应体系中内参基因的上游引物的终浓度为0.1～0.2μM，内参基因的下游引物的终浓度为1～1.5μM，内参探针的终浓度地为0.3～0.5μM。

在一实施例中，熔解步骤中，反应程序如下：

预变性过程：95℃2～5min。扩增过程：95℃变性15～30s，55～65℃退火20～50s，72℃延伸20～30s，循环50次，收集荧光信号。熔解过程：95℃变性1～2min，35℃2～5min，从35℃升温至90℃，收集荧光信号。

在一实施例中，熔解过程的升温方式为Continuous。

在一实施例中，熔解过程的升温速率为0.04～0.06℃/s。

在一实施例中，预测步骤中，同一探针针对不同型别样本进行检测时，产生两条不同的熔解峰图，且对应两个熔解温度Tm。

在一实施例中，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果熔解曲线显示在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因；如果熔解曲线显示在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因。

在一实施例中，预测步骤中，当使用突变型探针检测时，如果熔解曲线显示在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因；如果熔解曲线显示在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因。

在一实施例中，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果熔解曲线显示只在65±2℃的退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本只含有ACE基因的野生型等位基因，即ACE基因DD型；如果熔解曲线显示在65±2℃和54±2℃的退火温度处分别出现一条熔解峰，并对应产生两个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因和突变型等位基因，即ACE基因DI型，如果熔解曲线显示只在54±2℃的退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本只含有ACE基因的突变型等位基因，即ACE基因II型。

在一实施例中，熔解步骤中，所述待测样本来源于人。

在一实施例中，熔解步骤中，所述待测样本为人类基因组DNA。

所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列，所述突变型探针包含如SEQIDNo.6所示核苷酸序列。

在一实施例中，试剂盒中还含有内参基因的引物以及探针。

所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

在一实施例中，试剂盒中还含有内参基因的引物以及探针。

在一实施例中，本发明提供一种ACE基因I/D多态性分型方法，该方法主要应用于AC E基因I/D多态性(rs1799752)的分型。文献指出，ACE通过肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统两个通路影响机体的病理生理状态。而ACE水平主要是由ACE基因I/D多态性决定的。目前已知的ACE基因多态性的研究涉及较多领域，其中关系最为密切的为心血管疾病，例如有研究支持ACE水平和ACE基因的I/D多态性与高血压发病相关，也有研究证明D等位基因是冠心病和心肌梗死的危险因素。最近的研究也指出，ACE基因的I/D多态性与COVID-19易感性和死亡率也存在一定的关联，且证实D等位基因与亚洲人群中SARS-CoV-2感染病例数、死亡率之间存在显著的正相关性。

在一实施例中，本发明提供的ACE基因的I/D多态性检测方法操作简便，成本低，适合大量样本筛查，稳定性和特异性好，可为相关疾病患者提供分子诊断和更为精确的基因用药指导。

在一实施例中，本发明依据专利CN 114220477 A通过提取比对到参考基因组的待测样本测序数据中单核苷酸多态性位点snp ratio的特征值，经过IGV图核实和sanger验证等方法，确定离目标区域较近的rs4341、rs4342两个点为ACE基因的连锁位点，且发现rs4341和rs4342的突变型allele与ACE insertion allele完全连锁。本发明的方法以ACE基因完全连锁位点rs4341、rs4342这两个点作为目标位点，在rs4341、rs4342两个位点附近设计特异性引物和探针，根据相应的荧光曲线峰图、Ct值、Tm值，推测相应的ACE的I/D多态性型别。

实时荧光定量PCR平台结合Taqman-MGB探针法可以精准地对两个连锁位点分型，且设计引物和探针已避开高频位点，可实现99％的准确性及特异性。该方法是一种成熟的基因位点突变检测的技术，主要用于药物基因组单基因位点突变检测，具有高敏感性、高特异性、高重复性、操作简单、交付时间短等特点，适用于临床样本的常规检测及筛查。在一实施例中，本发明的方法可规避RFLP和Sanger的繁琐操作，避免PCR扩增法对缺失型(D)的偏倚，操作方便，易于筛查分型，促进ACE I/D多态性与相关表型的群体研究。

在一实施例中，本发明的引物探针组合设计方法如下：根据ACE(rs4341、rs4342)(野生位点)/ACE(rs4341、rs4342)(突变位点)的序列特点，设计特异性引物，对目标位点区域进行扩增，并设计两位点同时野生型及同时突变型探针，使用不同荧光基团进行标记；针对内参ACTB基因的目标区域设计特异性引物与探针。3条探针的5’端标记荧光基团(FA M\HEX\ROX\CY5)，3’端标记猝灭基团(MGB)。本发明经过引物/探针序列的优化设计和筛选，结合反应体系和反应程序的优化，通过标记了不同荧光的特异性探针分别对目标位点进行扩增信号的标记和报告，实现在单个反应孔中完成ACE(rs4341、rs4342)型别的检测，同时完成内参基因ACTB的检测。因为该发明基于实时荧光PCR平台，灵敏度高，可达到样本投入量极少(>1ng/μL)即可正确分型的目的。同时该技术可适配多种样本类型：全血、干血片、口腔拭子、唾液等，提取方式多样：免提取、煮沸法粗提、磁珠纯化提取。可批量操作，具有广泛的推广价值。

在一实施例中，本发明提供的引物探针序列如下表所示。其荧光基团和淬灭基团可根据实际情况进行调整优化。

表1引物探针序列

序列编号	Seq NAME	Seq	Reporter
				SEQ ID No.1	ACE-4341/42_F	TTCTCTGAGCTCCCCTTACAAGC	-
SEQ ID No.2	ACE-4341/42_R	CCTCCCATGCCCATAACAGGT	-
				SEQ ID No.5	ACE-4341/42_Pw	CTCAAGGCATTCAAACC	FAM/VIC/ROX/CY5
SEQ ID No.6	ACE-4341/42_Pm	CTCAAGCCATTCAACCC	FAM/VIC/ROX/CY5
				SEQ ID No.7	ACTB_F	TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA	-
SEQ ID No.8	ACTB_R	GCCGACCAACACCTAATAATG	-
				SEQ ID No.12	ACTB_P	AAGAGATCCCTCAGAGTGTTCCTGG	FAM/VIC/ROX/CY5

在一实施例中，该发明主要提供引物探针组合的设计思路、引物探针组合及其他反应液组分以及适配的反应程序。

在一实施例中，本发明结合检测目的和引物/探针的序列特点，反应体系中采用了非对称扩增的方式，通过调整上下游引物的浓度和配比，实现在有效扩增的前提下，更优势的扩增探针结合的目标链，从而实现信号方法和抑制非特异性信号干扰的目的。

经过优化筛选，确定其中引物的终浓度优选为：上游目的引物的终浓度为0.5～4μM；下游目的引物的终浓度为0.5～1.5μM，目的荧光探针的终浓度均为0.5～1.5μM，内参的上下游引物及探针的终浓度为0.2～0.5μM，反应酶选择武汉华大智造科技有限公司的Multiplex PCR Readymix(2x)，可以根据实际情况对体系进行优化。

反应程序优化为：95℃，2～5min预变性；第一步扩增，95℃变性15～30s，60℃退火、延伸30～50s，循环5～10次；第二步，95℃变性15～30s，56℃退火、延伸30～50s，循环40～50次，收集荧光信号。

在一实施例中，本发明提供的ACE基因I/D多态性分型检测方法的待测样本包括但不限于全血、干血片、口腔拭子、唾液，可实现直接加入待测样本进行检测，即免提取，直扩进行型别分析；也可采用煮沸法、磁珠法等DNA提取方式对上述样本进行提取后再进行检测。

在一实施例中，提供一种基于Taqman探针多色荧光PCR法的ACE基因分型方法-Ct值法，检测步骤如下：

1、提供样本，样本类型包括：外周血gDNA、口腔拭子gDNA、唾液gDNA。

2、提取方式：免提取、煮沸法粗提取、磁珠法纯化提取。

3、配制QPCR反应液，如表2所示。

表2反应体系

4、设置QPCR反应程序，具体如表3所示。

表3反应程序

5、结果判读

反应体系扩增完成后，根据扩增曲线呈S型或类似S型及Ct值判断待检测样本ACE位点检测结果，具体详见下表4。

表4结果判读

6、适用仪器

适用常见的荧光定量PCR仪，包括但不限于宏石SLAN-96S、博日96A、ABI 7500、雅睿MA-6000等。

在另一实施例中，提供一种基于Taqman探针多色荧光PCR法的ACE基因分型方法-Tm值法，检测步骤如下：

2、提取方式：免提取、煮沸法粗提取、磁珠法纯化提取。

3、参照表5配制QPCR反应液。

表5反应体系

4、设置QPCR反应程序:

表6反应程序

5、结果判读

反应体系熔解完成后，根据熔解曲线呈平滑的曲线及最高峰对应的Tm值判断待检测样本ACE位点检测结果，具体详见表7。

表7

6、适用仪器：

适用国内常见的荧光定量PCR仪，包括但不限于宏石SLAN-96S(上海宏石SLAN-96S全自动荧光定量PCR仪)。

探针法实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)，其5’端带有荧光物质(如：FAM、ROX等)，3’端带有淬灭物质(如:MGB、BHQ等)。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。当Taq Man探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当PCR反应过程中，退火时荧光探针会和模板杂交，延伸过程时，DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光，通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的，即所谓的实时荧光定量Ct值法。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，是指在荧光PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。因此对于已知突变位点的基因分型，需要设计两条特异性探针(野生型和突变型)，与待测样本结合，通过达到荧光阈值时所经历的Ct值进行SNP类型的判断。因为市面上大多数仪器都可以对特异性探针的荧光强度进行收集，因此，该Ct值的方法可以适配多种实时荧光PCR扩增仪。

当调节体系中引物探针的配比，并在PCR扩增后建立熔解过程，即可采集相应的熔解温度。熔解过程为：首先将产物在95℃变性1～2min，PCR产物的双链解开，在35℃退火2～5min，使得探针链与部分PCR产物发生互补配对，此时荧光基团与淬灭基团彼此互相原理，发出荧光。从35℃升温至90℃进行连续升温，进行荧光信号检测。探针与突变型的PCR产物之间有错配，会优先解离下来，而探针与野生型的PCR产物时完全互补配对的，在更高的温度下才解离下来。因此以温度做横坐标，荧光的变化速率的负数为纵坐标(荧光信号的导数)，可以得到探针与不同类型PCR产物的Tm值，来判断待测位点的SNP类型。Tm值法是结合染料法熔解曲线分型技术以及多重荧光PCR技术的双重优点，该方法最大的特点是对基因每个突变位置只需要设计一条探针，大大降低成本，通过不同的荧光标记，单个反应孔/反应管即可实现多通道多靶点的定性检测。

实施例1

本实施例提供一种基于Taqman探针多色荧光PCR法的ACE基因分型方法。

1.引物/探针序列的设计筛选和优化

本实施例首先对引物/探针序列进行了优化设计和筛选，最终确定最优的探针序列，实现预期检测目的。本实施例中，考虑到该两个检测位点在基因组序列上位置距离较近，可以通过同一对引物进行目标区域的扩增。

1.1.引物的筛选与优化

图1所示为ACE-4341/42引物在不同退火温度时扩增电泳图，经验证，设计的特异性引物在不同退火温度时，DNA扩增是特异的。图1中的ACE-4341/42_F、ACE-4341/42_R序列如表1所示。

1.2 Ct值法探针的筛选与优化

针对待检测位点的序列特点，本实施例的Ct值法分型方法拟通过设计两条特异性探针，分别命名为野生型序列(ACE-4341/42_Pw)和rs4341、rs4342突变序列(ACE-4341/42_Pm)。这两条修饰探针分别标记不同荧光基团，即通过两条不同荧光标记探针的信号，识别判断待检测样本是否存在rs4341(G>A)和rs4342(A>C)突变，并判断突变的杂合性(野生序列/杂合突变/纯合突变)。同时，在该体系中通过一对引物和一条探针对内参基因ACTB进行扩增和信号标记，用于检测体系的质控。

ACE基因Ct值法分型最优的结果如下：a.当野生型探针测试时，野生型样本应表现为单扩增曲线“S”峰；杂合突变型样本应表现为单扩增曲线“S”峰；纯合突变型样本应表现为无扩增曲线，同时无相应的Ct值。b.当突变型探针测试时，野生型样本应表现为无扩增曲线，同时无相应的Ct值；杂合突变型样本应表现为单扩增曲线“S”峰；纯合突变型样本应表现为单扩增曲线“S”峰。

基于上述设计开发原理，针对目标位点设计引物探针进行测试和优化，序列如表8所示。

表8

探针中加粗的碱基即为与突变位点反向互补配对的碱基，后续序列中加粗碱基的含义与此类似。

Group 1的测试结果具体如下：

图2所示为Group 1-野生型探针对不同型别样本的扩增曲线图，可见，当野生型探针ACE-4341/42_Pw1进行测试时，野生型样本表现为单扩增曲线“S”峰；杂合突变样本表现为单扩增曲线“S”峰；纯合突变的样本表现为单扩增曲线“S”峰。该探针信号在纯合突变样本中出现非特异的“S”峰，探针不特异，无法区分野生型和突变型样本。

图3所示Group 1-突变型探针针对不同型别样本的扩增曲线图，可见，当突变型探针ACE-4341/42_Pm1进行测试时，野生型样本表现为单扩增曲线“S”峰；杂合突变样本表现为单扩增曲线“S”峰；纯合突变的样本表现为单扩增曲线“S”峰。该探针信号在野生型样本中出现非特异的“S”峰，探针不特异，无法区分野生型和突变型样本。

经过测试，Group 1无法达到良好的检测目的。对体系中的两条探针进行多轮的序列优化和测试筛选，最终获得优选的引物探针序列如下表所示。

表9

以优化后的探针序列进行已知型别的样本测试，结果如图4.1、图4.2、图4.3所示的Gr oup final-不同型别样本的扩增曲线图。其中ACE-4341/42_Pw探针、ACE-4341/42_Pm探针、ACTB_P探针均可得到良好的扩增信号，且三条探针均无非特异性扩增，因此，该组引物/探针序列可以更好的实现检测目的。

1.3 Tm值法探针的筛选与优化

针对待检测位点的序列特点，本实施例的Tm值法分型方法拟通过设计一条特异性探针，命名为野生型序列(ACE-4341/42_Pw)或rs4341、rs4342突变序列(ACE-4341/42_Pm)。该条修饰探针利用野生型和突变型DNA模板与探针匹配的碱基数不同，进而得到不同的熔解温度Tm值这一原理，对待检测样本是否存在rs4341(G>A)和rs4342(A>C)突变进行判断，并得出杂合性(野生序列/杂合突变/纯合突变)。同时，在该体系中也通过一对引物和一条探针对内参基因ACTB进行扩增和熔解信号标记，用于检测体系的质控。

ACE基因Tm值法分型方法的最优的结果如下：a.当野生型探针测试时，野生型样本应在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值；杂合突变样本应在较高和较低的退火温度处分别出现一条熔解峰，并对应产生两个Tm值；纯合突变的样本应在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值。b.当突变型探针测试时，野生型样本应在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值；杂合突变样本应在较高和较低的退火温度处分别出现一条熔解峰，并对应产生两个Tm值；纯合突变的样本应在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值。

基于上述设计开发原理，针对目标位点设计引物探针进行测试和优化，序列如下表所示。

表10

Group 1的测试结果具体如下：

图5所示为Group1-野生型探针针对不同型别样本的熔解曲线图，当野生型探针ACE-4341/42_Pw2进行测试时，三种不同型别的样本通过熔解曲线无法产生相应的Tm值，故Tm值法无法分型。

图6所示为Group1-突变型探针针对不同型别样本的熔解曲线图，当突变型探针ACE-4341/42_Pm2进行测试时，三种不同型别的样本通过熔解曲线无法进行正确分型，且无相应的Tm值。

经过测试，Group 1无法达到良好的检测目的。对体系中的探针进行多轮的序列优化和测试筛选，最终获得良好的引物探针序列，具有序列如下表所示。

表11

以优化后的探针序列进行已知型别的样本测试，图7.1、7.2、7.3所示为Groupfinal-不同型别的样本熔解曲线图。其中ACE-4341/42_Pw探针、ACTB_P探针均可得到良好的熔解信号，且探针均无非特异性熔解峰，因此，该组引物/探针序列可以更好的实现检测目的。

本实施例通过针对待检测的目标序列特点进行引物探针的优化设计和筛选，确定了满足检测预期要求的引物探针序列，如下表所示。其荧光基团和淬灭基团可根据实际情况进行调整优化。

表12

2.反应体系的引物/探针配比

本实施例中，结合检测目的和引物/探针的序列特点，反应体系中采用了非对称扩增的方式，通过调整上下游引物的浓度和配比，实现在有效扩增的前提下，更优势地扩增探针结合的目标链，从而实现信号方法和抑制非特异性信号干扰的目的。

经过优化筛选，确定Ct值法的引物探针终浓度优选为：上游目的引物的终浓度为1～3μM；下游目的引物的终浓度为0.5～1.5μM，目的荧光探针的终浓度均为0.5～1.5μM，内参的上下游引物及探针的终浓度为0.2～0.5μM。

经过优化筛选，确定Tm值法的引物探针终浓度优选为：上游目的引物的终浓度为0.1～0.2μM；下游目的引物的终浓度为1～1.5μM，目的荧光探针的终浓度均为0.2～0.4μM，内参的上游引物的终浓度为0.1～0.2μM；下游引物的终浓度为1～1.5μM，内参探针的终浓度为0.3～0.5μM。

体系中的反应酶选择武汉华大智造科技有限公司的Multiplex PCR Readymix(2x)，可以根据实际情况对体系进行优化。

3.反应体系的程序优化

多重PCR因其靶点较多，不仅容易产生非特异，还对退火温度和循环数非常敏感。因此在优化的过程中，需根据足够量的已知型别的样本去优化其反应程序，使其满足不同的样本类型、不同的提取方式及降低投入量等，在保证分型准确的基础上，尽可能优化便捷，增加应用的广泛性。

经优化筛选，确定Ct值法的反应程序优选为：95℃，2～5min预变性；第一步扩增，95℃，变性15～30s，60℃退火、延伸30～50s，循环5～8次；第二步，95℃变性15～30s，56℃退火、延伸30～50s，循环40～45次，收集荧光信号。

经优化筛选，确定Tm值法的反应程序优选为：预变性过程：95℃2～5min；扩增过程：95℃变性15～30s，55～65℃退火20～50s，72℃延伸20～30s，循环50次，收集荧光信号；熔解过程：95℃变性1～2min，35℃2～5min，从35℃逐渐升温至90℃，升温方式Continuous，升温速率0.04℃/s，收集荧光信号。

下面结合具体实施例对本发明作出进一步的详述,以更好地理解本发明的内容，使用已知ACE位点突变信息的样本进行检测，样本已知变异信息如表13所示，本发明并不限于以下6个实施例。

实施例2

本实施例中采用了两种样本形式：

(1)对待测者直接采用口腔拭子，无需进行DNA提取。口腔拭子无创，且操作简单，待测者接受度高。

(2)对应的，对上述(1)的待测者同时采集外周血，并通过经典Right法对待测目标位点进行PCR，电泳。

表13待测样本已知型别信息

本实施例的引物探针组成如表14所示。

表14引物探针组合

具体检测方法如下：

1)按照下表配制反应体系。

表15反应体系

2)荧光定量PCR检测：

将待检测样本加入反应体系中，按照下列反应程序进行扩增检测：

表16反应程序

3)结果判读：

将6个样本的检测数据导出，根据Ct值判断检测结果，具体结果如下表所示。

表17检测结果

实施例

样本编号

Ct-VIC

Ct-ROX

Ct-CY5

检测结果

已知变异信息

实施例1-1

S1

22.2

NoCt

24.32

DD

实施例1-2

S2

23.09

24.03

25.52

DI

实施例1-3

S3

22.13

23.01

NoCt

II

实施例2-1

S4

22.83

NoCt

24.49

DD

实施例2-2

S5

22.88

24.31

26.04

DI

实施例2-3

S6

22.01

22.95

NoCt

II

4)结论：通过6个实施例证明，该试剂盒可以准确检测ACE基因I/D多态性分型位点的突变情况。

对应的，对上述(1)的待测者的样本通过Tm值法进行测试。

检测方法如下：

1)按照下表配制反应体系。

表18反应体系

2)荧光定量PCR检测：

将待检测样本加入反应体系中，按照下表所示反应程序进行扩增检测。

表19反应程序

3)结果判读：

将6个样本检测数据导出，根据Tm值判断检测结果，如下表所示。

表20检测结果

4)结论：通过6个实施例证明，该方法可以准确检测ACE基因I/D多态性分型位点的突变情况。

如图8.1所示为样本S1、S4的QPCR检测扩增曲线图，可见，内参为单一的“S”峰图，且无非特异扩增，质控合格；已知DD型别的口腔拭子和全血样本，只扩增出一条野生型“S”峰图，且特异性良好，分型正确。

如图8.2所示为样本S2、S5的QPCR检测扩增曲线图，可见，内参为单一的“S”峰图，且无非特异扩增，质控合格；已知DI型别的口腔拭子和全血样本，扩增出一条野生型“S”峰图和一条突变型的“S”峰图，且特异性良好，分型正确。

如图8.3所示为样本S3、S6的QPCR检测扩增曲线图，可见，内参为单一的“S”峰图，且无非特异扩增，质控合格；已知II型别的口腔拭子和全血样本，只扩增出一条突变型“S”峰图，且特异性良好，分型正确。

如图9所示为样本S1-S6的QPCR检测熔解曲线图，可见，内参为单一平滑的熔解峰图，熔解温度Tm为71℃±2℃，质控合格；已知DD型别的S1、S4样本在较高的退火温度(65℃±2℃)处有且只有一条熔解峰，分型正确；已知DI型别的S2、S5样本在较高温度(65℃±2℃)和较低温度(54℃±2℃)处各有一条熔解峰，分型正确；已知DD型别的S3、S6样本在较低温度(54℃±2℃)处有且只有一条熔解峰，分型正确。

如图10所示为经典Right法的结果图，可见，S1样本在250bp处有一条单一条带，为ACE基因的DD型，S2样本在250bp和500bp处各有一条单一条带，为ACE基因型的DI型，S3样本在500bp处有一条单一条带，为ACE基因型的II型。

在一实施例中，提供一种基于Taqman探针多色荧光PCR法的ACE基因分型试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，QPCR平台ACE连锁区域rs4341和rs4342位点的设计思路，1对特异性扩增ACE连锁区域rs4341和rs4342位点的特异性引物，2条特异性检测ACE连锁区域rs4341和rs4342位点型别的荧光探针；包括其他组分及整体反应体系(2X mix)及体系配比；包括反应程序及整体结果判读逻辑；包括通过内参基因ACTB引物和探针建立的质控体系。

在一实施例中，引物探针序列的轻微改变，荧光基团和淬灭基团的调整和改变，反应体系的适度调整，试剂品牌型号的调整，反应程序的适度调整等，可以达到相同效果，均在本发明的保护范围内。

在一实施例中，可拓展为单条探针检测两个位点的检测体系，即PCR荧光探针-熔解曲线法分型等。

对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在本发明的构思下，直接或者间接运用该技术进行的相关领域基因的检测，均在该发明的保护范围内。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims

1.一种基于Ct值进行ACE基因分型的方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增步骤中，所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至野生型rs4341位点和野生型rs4342位点的野生型探针、可通过反向互补配对的方式结合至突变型rs4341位点和突变型rs4342位点的突变型探针；

优选地，扩增步骤中，所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列，所述突变型探针包含如SEQ ID No.6所示核苷酸序列；

优选地，扩增步骤中，反应体系中各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；

优选地，扩增步骤中，反应体系中野生型探针上修饰的荧光报告基团的发射光波长不同于突变型探针上修饰的荧光报告基团的发射光波长；

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一种；

优选地，所述荧光淬灭基团选自MGB。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增步骤中，所述引物包含上游引物以及下游引物；

优选地，扩增步骤中，所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

优选地，扩增步骤中，反应体系中上游引物的终浓度为1～3μM，下游引物的终浓度为0.5～1.5μM；

优选地，扩增步骤中，反应体系中，各探针的终浓度独立地为0.5～1.5μM；

优选地，扩增步骤中，反应体系中还含有内参基因及其上游引物、下游引物、内参探针，反应体系中内参基因的上游引物、下游引物、内参探针的终浓度独立地为0.2～0.5μM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增步骤中，反应程序如下：95℃预变性2～5min；第一步扩增，95℃变性15～30s，60℃退火、延伸30～50s，循环5～8次；第二步扩增，95℃变性15～30s，56℃退火、延伸30～50s，循环40～45次，收集荧光信号。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果扩增曲线呈单扩增曲线“S”峰，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因，如果无扩增曲线，同时无相应的Ct值，则预测待测样本不含有ACE基因的野生型等位基因；

优选地，预测步骤中，当使用突变型探针检测时，如果扩增曲线呈单扩增曲线“S”峰，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因，如果无扩增曲线，同时无相应的Ct值，则预测待测样本不含有ACE基因的突变型等位基因。

6.一种基于Tm值进行ACE基因分型的方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，熔解步骤中，所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至野生型rs4341位点和野生型rs4342位点的野生型探针，或，所述探针包含可通过反向互补配对的方式结合至突变型rs4341位点和突变型rs4342位点的突变型探针；

优选地，熔解步骤中，所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列；

优选地，熔解步骤中，反应体系中各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ中的至少一种；

优选地，熔解步骤中，所述引物包含上游引物以及下游引物；

优选地，熔解步骤中，所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

优选地，熔解步骤中，反应体系中上游引物的终浓度为0.1～0.2μM，下游引物的终浓度为1～1.5μM；

优选地，熔解步骤中，反应体系中，各探针的终浓度独立地为0.2～0.4μM；

优选地，熔解步骤中，反应体系中还含有内参基因及其上游引物、下游引物、内参探针，反应体系中内参基因的上游引物的终浓度为0.1～0.2μM，内参基因的下游引物的终浓度为1～1.5μM，内参探针的终浓度地为0.3～0.5μM。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，熔解步骤中，反应程序如下：

预变性过程：95℃2～5min；扩增过程：95℃变性15～30s，55～65℃退火20～50s，72℃延伸20～30s，循环50次，收集荧光信号；熔解过程：95℃变性1～2min，35℃2～5min，从35℃升温至90℃，收集荧光信号；

优选地，熔解步骤中，熔解过程的升温方式为Continuous；

优选地，熔解步骤中，熔解过程的升温速率为0.04～0.06℃/s；

优选地，预测步骤中，同一探针针对不同型别样本进行检测时，产生两条不同的熔解峰图，且对应两个熔解温度Tm；

优选地，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果熔解曲线显示在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因；如果熔解曲线显示在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因；

优选地，预测步骤中，当使用突变型探针检测时，如果熔解曲线显示在较高退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的突变型等位基因；如果熔解曲线显示在较低退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因；

优选地，预测步骤中，当使用野生型探针检测时，如果熔解曲线显示只在65±2℃的退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本只含有ACE基因的野生型等位基因，即ACE基因DD型；如果熔解曲线显示在65±2℃和54±2℃的退火温度处分别出现一条熔解峰，并对应产生两个Tm值，则预测待测样本含有ACE基因的野生型等位基因和突变型等位基因，即ACE基因DI型，如果熔解曲线显示只在54±2℃的退火温度处出现单熔解峰且产生单个Tm值，则预测待测样本只含有ACE基因的突变型等位基因，即ACE基因II型。

9.一种基于Ct值进行ACE基因分型的试剂盒，其特征在于，包含上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针；

所述上游引物包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述下游引物包含如SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

10.一种基于Tm值进行ACE基因分型的试剂盒，其特征在于，包含1)上游引物以及下游引物；以及2)野生型探针；

所述野生型探针包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列。