JP2004248556A - 塩基変異の検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ターゲット核酸と、該ターゲット核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とをハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸を形成させ、次いで、該二本鎖核酸中にミスマッチ部位が存在する場合に該ミスマッチ部位を特異的に分解する核酸分解酵素を付与し、その後、核酸分解酵素の付与前後の核酸同士を対比することを特徴とする、塩基変異の検出法、並びにこれを用いた検出装置及び検出システムを提供することにより、前記目的を達成したものである。
【選択図】 図1
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基変異の検出法に関し、詳細には、DNA等の核酸の塩基配列における特定位置にある塩基種(SNPs、複数塩基ミスマッチ、塩基欠損変異、塩基挿入変異等)を、低コストで、迅速、簡便且つ高感度に検出する方法及び装置その他のシステムに関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来用いられきたSNPs(一塩基変異等)の検出にはいくつかの方法がある。代表的な方法としては、インベーダ法、即ちインベーダー・オリゴがターゲットDNAとプローブ間の二重鎖に少なくとも1塩基の侵入(インベージョン)を起こして部分的な三重鎖構造を形成すると、構造特異的な5´−ヌクレアーゼがプローブの5´末端部分を切断する。目標とするSNP箇所の核酸配列に対応してインベージョンを発生させるインベーダー・オリゴを利用することで特定のSNPの塩基を同定し、SNPゲノタイプを判定することができる方法(非特許文献1)や、アフィメトリックス社製のDNAチップを用いた方法、即ち各アリールと完全相補性を有するオリゴプローブを固定化し、ビオチン標識したプライマーを利用して増幅されたPCR産物がどのプローブとハイブリするか検出する方法(非特許文献2)等が挙げられる。
【0003】
しかし、前者では一本のチューブに一種類の変異しか検出できず、後者は同時に複数の変異を検出することは可能であるがコストは高く、臨床診断用に適していない。このため、簡便性に優れ、低コストで行える塩基変異の検出法が要望されている。また、DNAやRNA等の核酸の塩基配列において、SNPs等の特定位置の単数又は複数の塩基種を、迅速で高感度に検出する方法やそれを実現し得る検出装置、検出システムも広く要望されている。
【0004】
ところで、米国特許第5869245号明細書には、非変異一本鎖ポリヌクレオタイドとハイブリする一本鎖ポリヌクレオタイドに存在する変異を検出する方法が開示されている(特許文献1)。この方法では、ポリヌクレオタイドは増幅され、検出が可能な修飾を受け、互いにハイブリし、特定pH(5〜9)の範囲で活性を示す植物由来エンドヌクレアーゼ(Endonuclease)酵素の活性を受けて変異の有無を解析するもので、該酵素の活性は、ハイブリしたポリヌクレオタイドに存在する未規と新規ミスマッチのpH5〜9での検出、ミスマッチを有する標的ポリヌクレオタイド配列内に一本鎖ニック(切断)を行うこと、及び標的ポリヌクレオタイド配列内に存在するミスマッチをその周辺塩基の影響を受けずに認識することを含むものである。そして、このような酵素活性の有用性は、種々の塩基変異の検出法に応用できる可能性が考えられる。
【0005】
【非特許文献1】
村松正明 (2001)Bioベンチャー Vol 1, No 01. SNPsが変える疾患研究と新薬開発
【非特許文献2】
一石英一郎、吉川敏一、吉田安彦、Affymetrix GeneChip HuSNP Mapping Assayを用いたジェノタイピングとその臨床応用、遺伝子医学、Vol 4. No 2, 119−123, 2000
【特許文献1】
米国特許第5869245号明細書
【0006】
【本発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、DNA等の核酸の塩基配列における特定位置にある塩基種を、低コストで、迅速、簡便且つ高感度に検出する方法及び装置その他のシステムを提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ターゲット核酸と、該ターゲット核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とをハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸を形成させ、次いで、該二本鎖核酸中にミスマッチ部位が存在する場合に該ミスマッチ部位を特異的に分解する核酸分解酵素を付与し、更に変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とし、その後、該核酸分解酵素の付与前後の核酸同士を対比することを特徴とする、塩基変異の検出法を提供することにより、前記目的を達成したものである。
【0008】
また、本発明は、前記の核酸同士の対比を、(1)前記核酸分解酵素の付与後、更に変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とし、その後、前記ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸と前記残存プローブ核酸とを比較することにより行うか、又は、(2)前記核酸分解酵素の付与前の二本鎖核酸と付与後の残存二本鎖核酸とを比較することにより行う、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0009】
また、本発明は、前記核酸分解酵素がCELヌクレアーゼである、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0010】
また、本発明は、前記の核酸同士の対比を定量測定による量の比較により行う、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0011】
また、本発明は、前記定量測定を電気化学測定法又は蛍光測定法により行う、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0012】
また、本発明は、前記プローブ核酸が固相に固定されてなる、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0013】
また、本発明は、前記プローブ核酸がチオール結合又はアミノ結合を介して固定される、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0014】
また、本発明は、前記プローブ核酸の配列長が30〜100merである、前記塩基変異の検出法を好適に提供するものである。
【0015】
また、本発明は、前記ターゲット核酸が、PCR産物、A−PCR産物、cDNA及びゲノムDNAからなる群より選択される1種以上の核酸である、前記塩基変異の検出法を提供するものである。
【0016】
また、本発明は、前記塩基変異の検出法を使用することを特徴とする塩基変異の検出装置を提供するものである。
【0017】
また、本発明は、前記塩基変異の検出法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システムを提供するものである。
【0018】
【発明の実施の形態】
〔塩基変異の検出法〕
以下、本発明の塩基変異の検出法を、その好ましい実施形態に基づいて詳細に説明する。
【0019】
本発明の塩基変異の検出法は、下記の各工程を備える方法を好適な実施形態とする。
(1)電極上に、ターゲット核酸(標的となる核酸)の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を固定化させて、固定化プローブを形成する工程。
(2)固定化させたプローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸を形成させる工程。
(3)形成した二本鎖核酸に、CELヌクレアーゼを付与する工程。
(4)上記核酸分解酵素付与後の二本鎖核酸を、変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とする工程。
(5)ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸と残存プローブ核酸とを、電気化学測定法による定量測定により対比する工程。
【0020】
以下、これらの工程を、各工程毎に図面を参照しつつ詳述する。尚、前記(1)の工程を「第1工程」、前記(2)の工程を「第2工程」、前記(3)の工程を「第3工程」、前記(4)の工程を「第4工程」、前記(5)の工程を「第5工程」、とそれぞれいうこともある。また、図1は、本実施形態に係る塩基変異の検出法の基本原理を各工程毎に一連に示す概略モデル図である。
【0021】
〔第1工程〕
本実施形態における第1工程は、電極上に、プローブ核酸を固定化させて、固定化プローブを形成する工程である。電極に固定化させるこのプローブ核酸は、ターゲット核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを有するものである。
【0022】
プローブ核酸としては、後述するターゲット核酸の好適な態様に対応して、PCR産物、A−PCR産物、cDNA及びゲノムDNAからなる群より選択される1種以上の核酸であることが好ましい。
【0023】
プローブ核酸は、その目的の認識部位を特異的に認識できるだけの配列長の範囲内で適宜選択可能であるが、特に特異的に認識できる観点から、配列長が30〜100mer、特に30〜60merからなるオリゴヌクレオチドを有するものが好ましい。
【0024】
本実施形態では、プローブ核酸を固定化させるための固相として、電極が用いられる。これは、本実施形態における第5工程(後述)で、電気化学的測定法による定量測定を行うことに伴うためである。従って、電極としては、第5工程での電気化学的測定法における定量測定が可能なものであれば特に制限されず、電極として機能する種々の固相を使用することが可能である。例えば、少なくとも表面が金から構成される電極等が好適に挙げられる。
【0025】
少なくとも表面が金から構成される電極の具体例としては、電極全体が金からなる金電極や、金以外の材質からなる基材の表面周囲を金でメッキしたものや、金の蒸着法等により製造された基材が挙げられる。
【0026】
電極の形態は特に制限されないが、特に複数の塩基変異を同時に検出できる点から、μm単位の大きさの複数の電極からなるアレイ状のもの等が好適に挙げられる。
【0027】
プローブ核酸を電極に固定化する際には、一の電極に対して一のプローブ核酸が対応するように配設させ、そして、このようにして得られた電極を複数個用いることにより、多くの塩基種を同時に検出することが可能となる。
【0028】
電極として例えば少なくとも表面が金から構成される電極を使用する場合には、プローブ核酸は、その固着部(固定化部位)が例えばチオール結合したチオール基を介することで好適に該金電極に固定される。
【0029】
また、プローブ核酸は、そのオリゴヌクレオチド部が、炭化水素鎖等のリンカー部を介してチオール基等の固着部と結合していることが好ましい。これは、ハイブリダイゼーションの反応性向上、後述の第3工程で使用するCELヌクレアーゼ活性向上、及び高検出感度が得られる点によるためである。
【0030】
図1(a)に示すように、形成した固定化プローブは、一本鎖核酸として電極に固定された状態となっている。尚、図1(a)は、第1工程で形成された固定化プローブを示す概略モデル図及びこの固定化プローブの電気化学的測定によるDPV(ディファレンシャルパルスボルタンメトリー)レスポンスを示すグラフである。また、図1(a)中の固定化プローブにおける白抜部(□)は、変異塩基を有するターゲット核酸における当該変異部分と相補的でない塩基を示す。
【0031】
また、第1工程における固定化プローブを形成した後、第2工程のハイブリダイゼーションに供する前に、この固定化プローブを「ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸」として、電気化学測定法による定量測定を行う。これは、後述の第5工程において初期のプローブ核酸と残存プローブ核酸との対比を行うためである。
【0032】
ここで、電気化学的測定法としては、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー(以下、「DPV」ともいう。)や、サイクリックボルタンメトリー等による方法が挙げられる。本実施形態においては、DPVによる方法で、DPVレスポンスを観察することにより定量測定を行っている(図1(a)参照)。測定装置としては、例えば、ECAリーダー(株式会社TUMジーン製)等を用いることができる。
【0033】
〔第2工程〕
本実施形態における第2工程は、前述の工程で固定化させたプローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸を形成させる工程である。
【0034】
ターゲット核酸としては、その種類に特に制限されないが、例えば、PCR産物、A−PCR産物、cDNA及びゲノムDNAからなる群より選択される1種以上の核酸は、全て一本鎖状態にすることが可能であり、効率的にプローブとハイブリダイゼーションを行うことができる点で好ましく使用される。中でも、A−PCR産物は、精製した際に予め一本鎖になっており、工程が簡便で、より高い効率でハイブリダイゼーションを行うことができる点で、更に好ましい。
ハイブリダイゼーションは、その反応に適したバッファーで行うことが好ましい。例えば、SSC(塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムを混合した緩衝溶液)を挙げることができる。
【0035】
図1(b)は、かかるハイブリダイゼーションにより得られる二本鎖核酸の概略モデル図である。図1(b)に示すように、ターゲット核酸と、該ターゲット核酸の塩基配列と相補配列を有するプローブ核酸の塩基配列部位との間で二本鎖核酸が形成される。
【0036】
この際、ターゲット核酸として塩基変異を有さないターゲット核酸(以下、「フルマッチ・ターゲット」ともいう。)を用いた場合には、二本鎖を形成した核酸の塩基対が完全に相補的である状態(以下、この状態を「フルマッチ」ともいう。)にある。一方、ターゲット核酸として塩基変異を有するターゲット核酸(以下、「ミスマッチ・ターゲット」ともいう。)を用いた場合には、二本鎖を形成した核酸の塩基対に相補的でない塩基対が一つ以上存在する状態(以下、この状態を「ミスマッチ」ともいう。)にある。尚、図1(b)中のミスマッチ・ターゲットにおける黒色部(■)は、変異塩基部位を示す。また、図1(b)中のフルマッチ・ターゲットにおける白抜部(□)は、プローブ核酸とフルマッチの状態を形成し得る正常塩基部位を示す。
【0037】
〔第3工程〕
本実施形態における第3工程は、形成した二本鎖核酸に、CELヌクレアーゼ(CEL nuclease)を付与する工程である。ここで用いられるCELヌクレアーゼは、二本鎖核酸中にミスマッチ部位が存在する場合に該ミスマッチ部位を特異的に分解する核酸分解酵素の一種である。CELヌクレアーゼは、例えば、セロリから抽出、精製することにより得ることができる。
【0038】
図1(c)は、フルマッチ・ターゲットとミスマッチ・ターゲットとを用いて形成した二本鎖核酸夫々にCELヌクレアーゼを付与した場合の状態を比較して示す概略モデル図である。図1(c)左図に示すように、ターゲット核酸が塩基変異を有さない場合、即ちフルマッチ・ターゲットを用いてフルマッチの状態にある二本鎖核酸を形成した場合には、CELヌクレアーゼを付与しても二本鎖の切断は起こらない。一方、同右図に示すように、ターゲット核酸が塩基変異を有する場合、即ちミスマッチ・ターゲットを用いてミスマッチの状態にある二本鎖核酸を形成した場合には、CELヌクレアーゼを付与すると、ミスマッチ部位に切断(二本鎖の切断)が生じる。このとき、ミスマッチ・ターゲットの切断と同時に、プローブ核酸も、該プローブ核酸中の当該ミスマッチ部位の塩基(一つ又はそれ以上)とそれに上流側(3’末端側)で隣接する塩基との間で切断される。
【0039】
CELヌクレアーゼを二本鎖核酸に付与する際には、緩衝溶液に溶解して使用することが好ましく、該緩衝溶液としては、例えば、Dバッファー(トリス塩化水素と塩化カリウムと塩化マグネシウムとを混合した緩衝溶液)等が挙げられる。
【0040】
また、CELヌクレアーゼを二本鎖核酸に付与する際の条件としては、温度を好ましくは25〜42℃とし、また30〜180分間作用させることが好ましい。
【0041】
〔第4工程〕
本実施形態における第4工程は、前記第3工程で前記核酸分解酵素を付与した後の二本鎖核酸を、変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とする工程である。
【0042】
二本鎖核酸のハイブリッドの変性は、一本鎖核酸としての残存プローブ核酸(電極表面に固定されたプローブ核酸)にできる方法である限り特に制限されることなく、種々の方法を採用できる。例えば、高温(95℃程度)にする方法や、変性剤(ホルムアミドやアルカリ液)による方法等が採用できる。
【0043】
図1(d)は、前述の第3工程でのCELヌクレアーゼ付与後の二本鎖核酸(フルマッチ・ターゲット及びミスマッチ・ターゲットを用いて形成したもの)に、本第4工程に係る変性を行った後の残存プローブ核酸夫々を比較して示す概略モデル図、及びこれらの残存プローブ核酸の電気化学的測定によるDPVレスポンスを示すグラフである。図1(d)に示すように、二本鎖核酸を変性反応させることで、一本鎖核酸としての残存プローブ核酸が得られる。このとき、図1(d)左図に示すように、ターゲット核酸が塩基変異を有さない場合、即ちフルマッチ・ターゲットによりフルマッチの状態にある二本鎖核酸の方を変性した場合には、前記第3工程で二本鎖の切断がなかったことに起因して、初期のプローブ核酸(第1工程で形成した固定化プローブ)と変化がない残存プローブ核酸が得られる。一方、同右図に示すように、ターゲット核酸が塩基変異を有する場合、即ちミスマッチ・ターゲットによりミスマッチの状態にあった二本鎖核酸の方を変性した場合には、前記第3工程においてミスマッチ部位で二本鎖が切断されたことに起因して、初期のプローブ核酸よりも、塩基配列長の短い残存プローブ核酸が得られることになる。
【0044】
また、第4工程において、残存プローブ核酸を得た後、前述の第1工程における初期のプローブ核酸と同様に、該残存プローブ核酸について電気化学測定法による定量測定を同様にして行う。即ち、DPVにより、DPVレスポンスを観察することにより定量測定を行う(図1(d)参照)。これも、後述の第5工程において初期のプローブ核酸と残存プローブ核酸との対比を行うためである。
【0045】
〔第5工程〕
本実施形態における第5工程は、ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸と残存プローブ核酸とを、電気化学測定法による定量測定により対比する工程である。
【0046】
電気化学測定法での定量測定による対比は、初期のプローブ核酸が固定化された電極に流れる電流値と、残存プローブ核酸が固定化された電極に流れる電流値とを比較することにより行う。つまり、第3工程で二本鎖核酸の切断があった場合にはこれらの電流値が変化することを利用するものであり、残存プローブ核酸の程度が二本鎖核酸切断の程度として定量検出されるものである。従って、この電流値を検出することにより、一本鎖核酸量が測定できる。
【0047】
本実施形態における定量測定は、予め第1工程で得られた初期のプローブ核酸(一本鎖核酸)のDPVレスポンス(この値を「I1」とする。)と、第4工程において得られた電極表面上の残存プローブ核酸(一本鎖)のDPVレスポンス(この値を「I2」とする。)との比較により行う。そして、I1,I2の値から、下記算式によって算出される電流値の減少率:ΔI(%)を得ることにより、これをCELヌクレアーゼ活性によるプローブの切断率として判断することが可能となる。
ΔI =(I2−I1)/I1 × 100 (%)
【0048】
このΔIの値の高低によって、酵素による二本鎖核酸の切断の有無やミスマッチ部位を認識することが可能となり、ターゲット核酸における塩基変異を検出することが可能となる。
【0049】
以上、本発明の好適な実施形態により本発明を詳述したが、本発明は、この実施形態に限られず、他の種々の変更形態とすることが可能である。具体的に、変更形態を以下に示す。
【0050】
本発明においては、核酸同士を対比する方法として、前記核酸分解酵素の付与後、更に変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とし、その後、前記ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸と前記残存プローブ核酸とを比較することにより行う方法を好適な実施形態とするが、その他に、前記核酸分解酵素の付与前の二本鎖核酸と付与後の残存二本鎖核酸とを比較することにより行う方法も好適に採用可能である。尚、これらに限られるものではない。
【0051】
本発明においては、前記核酸分解酵素として、CELヌクレアーゼを使用することを好適な実施形態とするが、該CELヌクレアーゼと同様に、二本鎖核酸中にミスマッチ部位が存在する場合に該ミスマッチ部位を特異的に分解する機能を有するものである限り、それ以外の核酸分解酵素を使用することも可能である。
【0052】
また、本発明においては、核酸同士の対比を定量測定による量の比較により行うことを好適な実施形態とするが、これに限らず、その他の比較、例えば、定性測定法による特性の比較等により行うことも可能である。また、例えば、野生型と標的塩基変異の他に、もう一つ異なる変異型プローブ(コントロール・プローブ:CP)を同アレイに設け、CPのI2がI1より必ず減少することを利用して、このCPのレスポンスと比較することによりサンプルの型を検出する方法等も採用できる。
【0053】
このような定量測定による量の比較を行う方法としては、電気化学測定法により行うことを好適な実施形態とするが、蛍光測定法により行うことも好適な実施形態とする。蛍光測定法による場合には、DNA等核酸の蛍光染色剤(エチジウムブロマイドやSYBR−Green(市販商品名))やDNA等核酸の蛍光染修飾剤(Cy3,Cy5(市販商品名))などを使えば蛍光検出器での検出・定量が可能である。
尚、定量測定法としては、これらに限らず、その他の方法、例えば、電気泳動法を用いて分離定量することも可能である。また、検出DNA等核酸量が多い場合には、吸光度にて定量することも可能である。
【0054】
また、本発明においては、プローブ核酸が電極等の固相に固定されてなる固定化プローブを用いることを好適な実施形態とするが、本発明の効果を達成し得る限り、固相に固定されていないプローブ核酸を用いて検出することも可能である。
【0055】
固定化プローブを用いる場合においては、プローブ核酸がチオール結合を介して固定される形態を好適な実施形態とするが、プローブ核酸がアミノ結合を介して固定される形態も同様に好適な実施形態とする。尚、本発明においては、これらの実施形態に限られるものではなく、その他の形態(例えば、ビオジン残基等を介する形態)で固定されるものを用いることも可能である。
【0056】
プローブ核酸を固相に固定化する場合の該固相としては、プローブ核酸における固着部が反応や化学的結合等により固着し得るものを用いることが好ましい。特に、プローブ核酸がチオール結合を介して固定される形態では、固相として少なくとも表面が金から構成される固相を使用するのが好ましく、一方、プローブ核酸がアミノ結合を介して固定される形態(プローブ核酸における固着部にアミノ基;−NH2を含む)では、固相として少なくとも表面がカルボキシル基(−COOH)を有する固相を使用するのが好ましい。また、プローブ核酸がビオジン残基を介して固定される形態では、固相として少なくとも表面がアビジン又はストレプトアビジンから構成される固相を使用するのが好ましい。また、ガラス(ガラス板、ガラスビーズなど)を固相として使用することもできる。
【0057】
また、固相として、樹脂(樹脂ビーズ、メンブレン、糸など)、ゲル等を使用することもできる。このような樹脂、ゲルなどであれば、DNA等核酸に反応基がなくても、物理的性質で吸着固定できる。特に樹脂などではUV光を照射することでDNAとの強固な固定化を図ることも可能である。このような固定化法を用いることで電極以外の固相にプローブを固定化することができる。
【0058】
また、本発明においては、配列長が30〜100merであるプローブ核酸を使用することを好適な実施形態とするが、本発明の効果を達成し得る限りプローブ核酸の配列長には限定されず、30〜100merの範囲外の配列長のプローブ核酸を用いて検出することも可能である。
【0059】
また、本発明においては、ターゲット核酸として、PCR産物、A−PCR産物、cDNA、ゲノムDNA等を使用することを好適な実施形態とするが、その他のターゲット核酸を使用することも可能である。
【0060】
本発明の検出法によれば、塩基配列の変異を有するターゲット核酸から、塩基配列の変異を高感度に検出することが可能になる。具体的には、SNPs、複数塩基ミスマッチ、塩基欠損変異(野生型に比べて変異型の本鎖に塩基が少ない場合)、塩基挿入変異(野生型に比べて変異型の本鎖に塩基が多い場合)等を、迅速かつ高感度の検出が実現される。そして、本発明の検出法による検出結果に基づいて、生物学、医学分野での遺伝子、表現形質との相関の解析が可能となる。
【0061】
また、本発明の検出法によって、薬剤代謝酵素、癌抑制遺伝子などの特定の遺伝子を検出・解析することにより、遺伝子診断の分野にも利用できる。さらに、癌、高血圧等の成人病の予防等に役立てることもできる。
【0062】
〔塩基変異の検出装置、検出システム等〕
本発明によれば、前述した塩基変異の検出法を使用する、塩基変異の検出チップ、検出装置、その他検出システムが提供される。具体的には、例えば、前述した塩基変異の検出法を使用し得る、一の固相(電極等)に一種類のプローブ核酸が対応するように固定される複数の固相を集積させた基板又はチップ、及びこれを用いたコンピュータ検出装置やコンピュータ検出システム等が挙げられ、これらを用いることで、複数種の塩基変異の同時検出を実現できる。
【0063】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明の検出法について、更に具体的に説明する。しかしながら、本発明は、これらの実施例により何等限定されるものではない。
【0064】
1.(プローブDNAの固定化)
ECAチップ(株式会社TUMジーン製)の電極(ピンアレイ状の金電極)上に、下記の4種類のプローブDNAをそれぞれチオール結合の介在により固定化させた。
【0065】
フル・マッチ(S−40:配列AAT GCT TCG ACC AGG GGA CTC TCT GGT GAA TGT GTG TAA G)、シングル・ミスマッチ2種(W−40:配列AAT GCT TCG ACC AGG GGA CCC TCT GGT GAA TGT GTG TAA G; ,S2−40:配列AAT GCT TCG ACC AGG GGA GTC TCT GGT GAA TGT GTG TAA G)、ダブル・ミスマッチ(S2−40G:配列AAT GCT TCG ACC AGG GGA GTG TCT GGT GAA TGT GTG TAA G)尚、配列中の下線部は、ミスマッチ部位を示す。
【0066】
2.(ターゲットDNAとのハイブリダイゼーション反応)
プローブDNAを固定化させた電極に、ターゲットDNA(配列CTT ACA CAC ATT CAC CAG AGA GTC CCC TGG TCG AAG CATTT)10 pmol/lを、2xSSCバッファー(組成:300mM NaCl, 33mMクエン酸ナトリウム, pH 7.0 )の存在下に付与し、1 μL/ピン、室温、30分ハイブリダイゼーション反応をさせた。
【0067】
3.(酵素処理)
セロリよりP−11カラムを利用して得られたCELヌクレアーゼフラクッション32を最終的Dバッファーと同組成(20mM Tris−HCl, pH 7.4, 25mM KCl, 10 mM MgCl2)になる様に調整し、これを電極に、1μL/ピン、25℃、120分間作用させた。
また、同様にフル・マッチ(S−40)固定化電極とターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応したあと、CELヌクレアーゼフラクッションの代わりにDバッファーを用いて、これを電極に1μL/ピン25℃、120分間作用させた(図2中のS−40−buff)。
【0068】
4.(変性)
ハイブリッドの変性を行い、電極表面に固定されたプローブDNAのみにした。
【0069】
5.(測定)
電極表面上に残存する一本鎖DNAのDPVレスポンス(I2)と最初の一本鎖DNAのDPVレスポンス(I1)をECAリーダー(株式会社TUMジーン製)による電気化学測定法によって測定し比較した。
【0070】
6.(結果)
CELヌクレアーゼ活性によりプローブの切断率(電流値の減少率:ΔI(%))を下記算式によって算出した。その結果を図2のグラフに示す。
(I2−I1)/I1 × 100 (%)
【0071】
フル・マッチ(S−40)とシングル・ミスマッチ2種(W−40、S2−40)およびダブル・ミスマッチ(S2−40G)との比較では、S−40は、酵素切断の合った場合に比べ明らかに減少率が低い。また、S−40に対しバッファーを反応させた(S−40−buff)場合とS−40では同じ値を示していることから、CELヌクレアーゼフラクッションのミスマッチ箇所認識能が高いことが分かる。
以上の結果より、CELヌクレアーゼは、電極上でもミスマッチを認識し、切断することが分かった。
【0072】
【発明の効果】
本発明の検出法によれば、DNA等の核酸の塩基配列における特定位置にある塩基種(SNPs、複数塩基ミスマッチ、塩基欠損変異、塩基挿入変異等)を、低コストで、迅速、簡便且つ高感度に検出する方法及び装置その他のシステムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明の一実施形態に係る塩基変異の検出法の基本原理を各工程毎に一連に示す概略モデル図である。
(図1(a)は、第1工程で形成された固定化プローブを示す概略モデル図及びこの固定化プローブの電気化学的測定によるDPVレスポンスを示すグラフである。
図1(b)は、第2工程のハイブリダイゼーションにより得られる二本鎖核酸として、ターゲット核酸にフルマッチ・ターゲット及びミスマッチ・ターゲットを夫々用いた場合を示す概略モデル図である。
図1(c)は、第3工程においてフルマッチ・ターゲットとミスマッチ・ターゲットとを用いて形成した二本鎖核酸夫々にCELヌクレアーゼを付与した場合の状態を比較して示す概略モデル図である。
図1(d)は、第3工程でのCELヌクレアーゼ付与後の二本鎖核酸(フルマッチ・ターゲット及びミスマッチ・ターゲットを用いて形成したもの)に、第4工程での変性を行った後の残存プローブ核酸夫々を比較して示す概略モデル図、及びこれらの残存プローブ核酸の電気化学的測定によるDPVレスポンスを示すグラフである。)
【図2】図2は、実施例の検出法により得られる、各プローブ核酸を使用した場合のミスマッチの検出を電流値の減少率:ΔIとして示すグラフである。
Claims (11)
- ターゲット核酸と、該ターゲット核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とをハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸を形成させ、次いで、該二本鎖核酸中にミスマッチ部位が存在する場合に該ミスマッチ部位を特異的に分解する核酸分解酵素を付与し、その後、該核酸分解酵素の付与前後の核酸同士を対比することを特徴とする、塩基変異の検出法。
- 前記の核酸同士の対比は、(1)前記核酸分解酵素の付与後、更に変性反応により一本鎖核酸としての残存プローブ核酸とし、その後、前記ハイブリダイゼーション前の初期のプローブ核酸と前記残存プローブ核酸とを比較することにより行うか、又は、(2)前記核酸分解酵素の付与前の二本鎖核酸と付与後の残存二本鎖核酸とを比較することにより行う、請求項1記載の塩基変異の検出法。
- 前記核酸分解酵素が、CELヌクレアーゼである、請求項1又は2記載の塩基変異の検出法。
- 前記の核酸同士の対比を、定量測定による量の比較により行う、請求項1〜3の何れかに記載の塩基変異の検出法。
- 前記定量測定を、電気化学測定法又は蛍光測定法により行う、請求項4記載の塩基変異の検出法。
- 前記プローブ核酸が、固相に固定されてなる、請求項1〜5の何れかに記載の塩基変異の検出法。
- 前記プローブ核酸が、チオール結合又はアミノ結合を介して固定される、請求項6記載の塩基変異の検出法。
- 前記プローブ核酸は、その配列長が、30〜100merである、請求項1〜7の何れかに記載の塩基変異の検出法。
- 前記ターゲット核酸が、PCR産物、A−PCR産物、cDNA及びゲノムDNAからなる群より選択される1種以上の核酸である、請求項1〜8の何れかに記載の塩基変異の検出法。
- 請求項1〜9の何れかに記載の検出法を使用することを特徴とする塩基変異の検出装置。
- 請求項1〜9の何れかに記載の検出法を使用することを特徴とする塩基変異の検出システム。
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