TW200413527A - Amplification of nucleic acid - Google Patents

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TW200413527A
TW200413527A TW092130165A TW92130165A TW200413527A TW 200413527 A TW200413527 A TW 200413527A TW 092130165 A TW092130165 A TW 092130165A TW 92130165 A TW92130165 A TW 92130165A TW 200413527 A TW200413527 A TW 200413527A
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nucleic acid
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TW092130165A
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Yasumasa Mitani
Akio Yamane
Yuko Shibata
Yoshihide Hayashizaki
Original Assignee
Riken
Danformk K
Wakunaga Pharma Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description

200413527 玖、發明說明： C發明戶斤屬之技術領域】 發明領域 本發明係有關於一種於基因工程領域中甚為有用之核 5 酸序列的合成法及擴增法；若更詳而言之，則係有關於一 種利用鏈置換反應之核酸序列之合成法及擴增法。 L先前技術3 背景技術
於基因工程領域中，作為可直接分析遺傳性特徵之方 ίο 法，基於核酸序列互補性之分析已為人知。就此種分析而 言，若試料中存在之目標基因量甚少時，一般而言不易進 行檢測，故需預先使目標基因本身擴增。
目標基因之擴增（核酸擴增）主要係以利用DNA聚合酶 之酶性方法進行。此種酶性方法之主要者可列舉如聚合酶 15 連鎖反應法(PCR法；美國專利第4683195號說明書、美國專 利第4683202號說明書），且更有將PCR法與逆轉錄酶反應組 合而成之逆轉錄PCR法(RT-PCR法；Trends in Biotechnology 10, ppl46-152，1992)。該等方法係使由三階段構成之反應 反覆進行，藉此可使來自DNA或RNA之目標基因擴增；該 2〇 三階段分別為：使模板之雙股核酸解離為單股核酸、使引 子煉合至單股核酸、以及來自引子之互補鏈合成（延伸）。該 等方法中，需使合計共三程序（用以將反應溶液調節為各適 於前述三階段之溫度）反覆實施。 使前述核酸擴增法中之程序數減為二之改良方法已知 5 200413527 有往返(Shuttle)PCR法（「pcR法最前線」，蛋白質核酸酵素 別冊’共立出版，第41卷第5號，425頁〜428頁（1996))。Shuttle PCR法係使PCR法之三階段反應中之引子煉合及延伸等二 階段於相同溫度下進行，故可藉2程序之反應使目標基因擴 5增。而歐洲專利公開案第0320308號說明書中已揭示連接酶 連鎖反應法(LCR法），該方法係使用耐熱性之DNA連接酶以 進行二程序之溫度循環反應（反覆進行加熱及冷卻之反 應），藉此使已知之基因序列擴增。
以上所載方法均需使用高價之加熱循環器，以便能經 10時性地進行廣泛溫度範圍下之嚴密溫度控制。此外，該反 應係以2至3種之溫度條件進行，因此需要調整至各反應溫 度之時間，且循環數越是增加，所須之時間越長。
為解決前述問題，可於等溫狀態下實施之核酸擴增法 正進行開發。該種方法可列舉如：記載於特公平7-114718 15 號公報之鍵置換型擴增（SDA ; strand displacement amplification)法；自立複製（3SR ; self-sustainedsequence replication)法；載於日本專利第2650159號公報之核酸序列 擴增(NASBA ; nucleic acid sequence based amplification) 法；TMA(transcription-mediated amplification)法；載於曰 2〇 本專利第2710159號公報之Q冷複製酶法；載於美國專利第 5824517號說明書、國際公開第99/09211號手冊或國際公開 第95/25180號手冊之各種改良SDA法；載於國際公開第 00/28082 號手冊之 LAMP 法（Loop-Mediated Isothermal Amplification);以及載於國際公開第02/16639號手冊之 6 ICAN 法（Isothermal and Chimeric prime卜initiated
Amplification 〇f Nucleic acid)等。該等等溫核酸擴增法中相 關之全1¾ #又反應係同日守於保持在一定溫度之反應混合物中 進行。 SDA法係於DNA最後擴增之系統中，藉著透過DNa聚 合酶與限制核酸内切酶之雙股置換，使試料中之目標核酸 (及其互補鏈)得以擴增。該方法需要4種引子，其中2種必須 設計成含有限制核酸内切酶之識別部分。此外，該方法需 以經修飾之去氧核苔三磷酸（如三磷酸部分中α位磷酸基 之氧原子被取代為硫原子（S)之去氧核苷三碟酸）作為用以 合成核酸之基質。因此，該方法需要甚高之實施成本。另， 該方法因經擴增之核酸片段中含有修飾核苔酸(如α s取代 去氧核苷酸），舉例言之，於將該核酸片段供予限制酶片段 長多型（RFLP ; restriction enzyme fragment length polymorphism)解析時，將有無法以限制酶切斷該擴增片段 而無法實施此種解析之情形。
美國專利第5824517號說明書中所載之改良Sda法必 須使用由RNA與DNA構成且3,端側為DNA之嵌合引子。此 種由RNA與DNA構成之嵌合引子之合成所需費用甚高，且 處理含RNA之引子必須具高度專業知識。另，載於國際公 開第99/09211號手冊之改良SDA法需有用以產生5,突出端 之限制酶，而載於國際公開第95/25180號手冊之改良SDA 法則需至少2組之引子對，因此該等方法均需甚高之實施成 本。 ICAN法必須使用由DNA與rna構成且3,端側為rna 之嵌合引子，更需要用以將該引子3,端側之RNa部分切斷 之RnaseH，故所須之試劑費用不貲。因此，該方法於對大 置樣本進行基因檢測時亦需高昂之實施成本。 LAMP法需要4種引子，以藉該等引子識別6個領域而可 使目標基因擴增。意即，該方法係先使第-引子煉合至模 板鏈而引起延伸反應，且@該第_引子之結構，迴圈結構 形成在延長鏈之5,端部分。其次，藉著被設計於較第一引 子更上游側之第二引子所引起之鏈置換反應，第一引子之 延長鏈自模板鏈分離。亦對雙股核酸之另一股進行與其相 同之反應，再反覆進行該等反應，以使目標核酸擴增。因 此，LAMP法中擴增反應之作用機制複雜，且必須選出6個 領域，而使引子之設計更為困難。再者，4種引子中需有2 種為相對長鏈之引子，而使引子之合成及純化需耗費時間 與費用。 因此，現今正迫切需要一種低實施成本且可使所得核 酸片段更能用於基因工程處理上之核酸擴增法。尤其更需 要一種可藉一對引子便可快速擴增之等溫核酸擴增法。 【發明内容】 發明概要 本案發明人發現，於利用鏈置換反應之核酸擴增法 中，可將該方法採用之引子（可藉引子之延伸而形成迴圈者) 設計成符合特定條件，藉此可使用一種引子合成出目標核 酸序列與互補核酸序列，進而可使用2種引子並有效率地使 目標核酸擴增。本案發明即係基於此種真知％見而完成者。 口此，本I明之目的在於提供_種可使含目標核酸序 歹】之核酸⑤效率地合成或擴增之方法，以及用於此方法之 弓丨子或引子組。 十、^ π心松队兮成法係一種用以合成出與模板核酸中 之目標核酸序列互補之核酸；财法含有以下各程序： ⑷準備引子’該引子係於3,端部分含有-序列(Ac，）， ^可與目標滅相之3,端部分之序列(A)雜交，且該序列 之5’側含有—序列(B’)，其可與目標核酸序列中存在於 乂^序列(，偏5’側之序列⑼的互補序列(Be)雜交；且 序列右引子相Μ與前述序_’)間不存有插入 前述序= 序：I'之驗基數為X而目標核酸序列中 ㈣2=：=^姆數叫， 序二子=:r)與前述序列_存有插入 數為Y，時，_=_=者相_插人序列之驗基 _備模板核酸㈣於抓丨.00之範圍内； (C)使前述引子煉合至前述模板 應，以合成出含有前述 進仃引子延伸反 酸； *x酸相之互補相的互補核 酸之5’側的序列 ’藉此使模板核 :存在於藉程序⑷合成出之互補核 二補核酸上之序·)雜交 h心相⑷成為單股； (e)使具有與前述引子相同序列之其他引子煉合至藉程 序（d)成為單股之模板核酸上前述序列（A)之部分而進行鍵 置換反應，以便可用藉前述其他引子新合成出之互補核酸 來置換程序(c)合成出之互補核酸。 再者，本發明之核酸擴增法係一種使由雙股構成之模 板核酸中之目標核酸序列擴增之方法，含有以下各程序： (a) 準備第一引子，該第一引子係於3,端部分含有一序 列（Ac )，其可與雙股模板核酸第一股中之目標核酸序列之 3’端部分的序列（A)雜交，且該序列(Ac，)之5,側含有一序列 (B )其可與目標核酸序列中存在於較前述序列(a)更偏5, 側之序列（B)的互補序列（Be)雜交；且 若引子中前述序列(Ac，)與前述序列(B，）間不存有插入 序列，且令前述序列（Ac，)之鹼基數為χ而目標核酸序列中 前述序列(Α)與前料列(聊所挾領域之驗基數為γ時， {χ-00}/χ係於-ι·00〜1〇〇之範圍内； 而右引子中岫述序列（Ac，)與前述序列（Β，）間存有插入 序歹1且7x、γ之定義與前述者相同而該插入序列之鹼基 數為Y，時，{χ_(γ_γ，)}/χ係於梢〜丨观之範圍内； (b) 準備第二；|子，該第三引子係於 一序 列（Cc，），直可彻他 、刀 -、又月又模板核酸第二股中之目標核酸序列之 =)部^的序列(C)雜交，且該序列⑹，)之5,側含有-序列 其可與目標核酸序列中存在於較前述 偏5, 則之^_的互補相_雜交；且 右引子中前述序列（Cc，)與前述序列(D，）間不存有插入 序列 前述序咖H㈣(Ce，)之驗絲為x而目標核酸序列中 、別述序列(D)間所挾領域之鹼基數為¥時， ()}/x係於]抓1.00之範圍内； 序列而中前述序列(Ce，)與前述序列(d，)間存有插入 數為γ，時^ΙΓ定義與前述者㈣而該插人序列之驗基 {X-(Y，Y，)VX係於-1.00〜1.00之範圍内； )準備由第一模板核酸與第二模板核酸構成之雙 ⑷使W述第―、第二引子各煉合至前述第_、第二模 板再各自進行引子延伸反應，以合成出含有前述目桿核 酸序列之互補序列的第_、第二互翻酸； ^ ()使存在於藉程序（d)合成出之互補核酸之5,側的序列 (B )及序列(D，)與存在於同互補核酸上之序列(Be)及序列 (Dc)雜父，藉此使第一及第二模板核酸上之部分前述序列 (A)及序列(C)成為單股； ⑴使具有與前述引子相同序列之其他引子煉合至藉程 序（e)成為單股之第一及第二模板核酸上的前述序列（A)及 序列（C)之部分而進行鏈置換反應，以便可用藉前述其他引 子新合成出之互補核酸來置換程序（d)所合成出之互補核 酸0 而本發明之引子係用以合成與模板核酸中之目標核酸 序列互補之核酸者；且該引子係於3,端部分含有一序列 (Ac’）’其可與目標核酸序列之3,端部分之序列(A)雜交，且 该序列(Ac’)之5’側含有一序列(B，），其可與目標核酸序列中 =前述序列㈧更偏5,側之序列⑼的互補〜 对述序列(Ac ’)與前述序列(B，）間不存右 :列’且令前述序列(Ac，)之鹼基數為χ而目標核#入 則述序列⑷與前述序卵）間所挾領域之鹼基 ^中 {X柳X係於切〜_之範圍内； ^ 而右引子巾可述序列(Ac，)與前述序列(Β，）間存有插入 J且7 X γ之定義與前述者相同而該插入序列之鹼基 數為Y’時，{X_(Y_Y，)}/X係於_1·0()〜1鞭範圍内。 本七明之引子組係用以使由雙股構成之模板核酸中之 目標核酸序列擴增者，含有： 雔（）第引子，係於3’端部分含有一序列(Ac，），其可與 雙股模板核酸第—股中之目標核酸序列之3,端部分的序列 15 Κ隹又亥序列(Ac，)之5,側含有一序列(B，），其可與目 標核酸序财存在純前料列(敬偏5,狀序列⑻的 互補序列（Be)雜交；且 —引子中A述序列（Ac’)與前述序列(B，）間不存有插入 二 7引述序列（Ac’)之鹼基數為X而目標核酸序列中 前述序列(A)與前料_)間馳領域线基數為Y時， 〇 {χ-(γ)}/χ係於丄〇〇〜1.00之範圍内； 序列(Ae’)與前述序列(Β，）間存有插入 /且γ之疋義與前述者相同而該插入序列之驗基 欠為¥日守，{Χ-(Υ_Υ，)}/Χ係於-1.00〜1·00之範圍内； ()第引子係、於3’端部分含有-序列(Cc，），其可與 12 5 雙股模板核酸第-H/L + —月又中之目標核酸序列之3,端部分的戽 (c)雜交，且該序列^ ^ )側含有一序列(D，），其可與目 ‘慨序财存在於較前述相(〇更偏5,側之相 互補序列(Dc)雜交；且 ）的 右引子中岫述序列(Cc，)與前述序列(D，）間不存有插入 义i且7岫述序列（Cc’)之鹼基數為X而目標核酸序列 則述序列(C)與前述序列⑼間所挾領域之驗基數為丫時， d〇〇}/X係於]·〇〇〜1〇〇之範圍内； 而右引子中前述序列（Cc，)與前述序列①，）間存有插入 、 々X γ之疋義與前述者相同而該插入序列之驗義 數為γ’時，（χ-(γ-Υ，）}/χ係於-1.00〜1.00之範圍内。土 15 若依本發明，則可以DNA或RNA為模板並使用一個募 核苷酸引子，而於等溫條件下連續合成出目標DNA。此外， 右據本發明，則可以DNA或RNA為模板並使用一對塞 fihn 孩甘 5丨子’而於等溫條件下連續使目標〇]^^擴增。因此，本 發明之方法不需加熱循環器等特殊裝置，亦無須溫度設定 所花費之時間，而可達到短時間内獲得擴增產物之優異效 果。此外，依本發明而擴增之DNA片段可施予限制酶處理， 20 故可用於限制酶片段長多型及變異檢測等基因檢查領域 上。 圖式簡單說明 第1圖係用以模式性地顯示本發明之核酸擴増法者。 第2圖係用以顯示使人類STS DYS237基因擴增時所採 用之引子之5,側序列與3,側序列在該基因上之位置者。 13 200413527 第3圖係用以顯示使sYi60基因擴增時所採用之引子之 5’側序列與3,側序列在該基因上之位置者。 第4圖係用以顯示使M13mpl8RT DNA擴增時所採用之 引子之5’側序列與3,側序列在該基因上之位置者。 5 第5圖係用以顯示各種條件下人類STS DY237基因之 擴增結果者。 第6圖係用以顯示各種條件下人類8丁8 DY237基因之 擴增結果者。 第7圖係用以顯示各種條件下人類STS DY237基因之 10 擴增結果者。 第8圖係用以顯示各種條件下sY16〇基因之擴增結果者。 第9圖係用以顯示各種條件下M13mpl8RT DNA之擴增 結果者。 第11圖係用以顯示將人類STS DY237基因之擴增產物 15施以限制酶處理後所得之電泳圖案者。 第12圖係用以顯示將s γ丨6 〇基因之擴增產物施以限制 酶處理後所得之電泳圖案者。 第13圖係用以顯示將]^1311113181^ DNA之擴增產物施 以限制酶處理後所得之電泳圖案者。 20 第14圖係用以顯示於各種熔解溫度調整劑存在下人類 STSDY237基因之擴增結果者。 L實方式】 發明之具體說明 兹模式性地將本發明之核酸合成之作用機制示於第i 14 200413527 圖。首先，決定將成為模板之核酸中之目標核酸序列，再 決定出該目標核酸序列之3’端部分之序列(A)以及存在於較 序列（A)更偏5,側之序列（B)。本發明之引子含有序列 (Ac’），更於其5’側含有序列(b，）。序列(Ac，)係用以與序列 5 (A)雜交者。而序列(B，)則係用以與序列(B)之互補序列(Bc) 雜交者。於此，本發明之引子於前述序列(Ac，)與序列（B，) 間可含有不對反應造成影響之插入序列。一旦使此種引子 煉合至模板核酸，引子中之序列(Ac，)將呈與目標核酸序列 之序列（A)雜交之狀態（第l(a)圖）。若於此狀態下發生引子延 10伸反應，便可合成出含有目標核酸序列之互補序列的核 酸。接著，使存在於所合成出之核酸之5,端側的序列（B，） 與存在於同核酸中之序列（BC)雜交，藉此，合成出之核酸 之5’端部分形成有迴圈結構。結果，模板核酸上之序列（A) 成為單股，此部份將與具有與前述引子相同序列之其他引 15子雜交（第圖）。之後，藉鏈置換反應，於發生來自新雜 交之引子的延伸反應時，先合成之核酸將同時自模板核酸 分離（第1(c)圖）。 於前述作用機制中，序列(B，)雜交至序列(Be)之現象係 因於同一鏈上存有互補領域而發生者。一般而言，雙股核 2 0 分 酉楚解離為單股時，將從其末端或其他較不安定之部分開始 解離。藉前述引子之延伸反應而產生之雙股核酸於相對高 处下’末端之鹼基對係處於解離與結合呈平衡之狀態，整 體維持雙股狀。於此狀態下，末端解離之部分中若互補序 歹u存在於同一鏈上，則可形成迴圈結構而呈準安定狀態。 15 200413527 該迴圈結構雖並未安定地存在，但因形成該結構而露出之 互補鏈部分(模板核酸上之序列（A))將與同一引子結合而使 聚合酶即刻進行延伸反應，藉此，可於先前合成出之鏈被 置換而游離之同時，產生新的雙股核酸。 重複操作如上反應，可大量合成出與模板核酸中之目 標核酸序列互補之核酸。此外，亦可以前述模板核酸之互 補鏈為模板進行相同之核酸反應。因此，若依本發明，亦 可使雙股之模板核酸中之目標核酸序列擴增。 10 本發明之核酸合成法包含以下程序： (a)準備引子，該引子係於3,端部分含有一序列 (Ac’），其可與目標核酸序列之3,端部分之序列（八)雜 交，且該序列(Ac，)之5,側含有一序列(B，），其可與目標 核酸序列中存在於較前述序列⑷更偏5，側之序列⑻的 互補序列（Be)雜交；且
15 — 間不, t入序列，且令前述序列(Ac，)之鹼基數為χ而目標 序列中前述序列(Α)與前述序歹|J(B)間所挾領域之I 數為γ時，{χ-(γ)}/Χ係於]·〇〇〜1.00之範園内j 1
20 而若引子中前 插入序列，且令X 列之驗基數為Y，時 圍内； 述序列（Ac，)與前述序列（B，）間存有 、γ之定義與前述者相同而該插入序 ’ {Χ-(Υ-Υ，)}/Χ係於十00〜i 〇〇之範 (b)準備模板核酸； ⑷使前述5丨子煉合至前賴板，再進㈣子延伸反 16 200413527 應’以合成出含有前述目標核酸序列之互補彳列的互補 核酸； ⑷使存在於藉程序（c)合成出之互補核酸之5，側的 序列(B，)與存在於同互補核酸上之序列(Bc)雜交，藉此 5 使模板核酸上之部分前述序列(A)成為單股； ⑷使具有與可述引子相同序列之其他引子煉合至藉程 序（d)成為單股之模板核酸上前述序列（A)之部分而進行鏈 置換反應，以便可用藉前述其他引子新合成出之互補核酸 來置換程序(c)合成出之互補核酸。 10 本發明中，所謂之『雜交』係指：使本發明之引子之 -部份於嚴苛條件下雜交至目標核酸，而不雜交至目標核 酸以外之核酸分子。而嚴苛條件係可依本發明之引子與其 互補鏈之雙鏈融解溫度了<〇及雜交溶液之鹽濃度加以決 定，舉例言之，可參考L Sambrook，E F Frisch，T Maniatis; 15 Molecular Cloning edition, Cold Spring Harbor
Lab—⑽9)等。例如，若於較所用引子之融解溫度略 低之溫度下進行雜交，可使引子專一性地結合至目標核酸 上。此種引子可使用市售之引子建立軟體如
Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research^t) 20等加以設計。若依本發明之較佳實施型態則用以與某一 目標核酸雜交之引子係包含全部或部分之與該核酸互補之 核酸分子序列。 前述程序(a)中準備之本發明引子係構成為一種可提供 早股序列(A)者，該單股制⑷可於程序⑷巾煉合至模板 17 200413527 =可於程序⑷中供序列(B，)與序列(Bc)雜交，且具有相 二 =子可進行煉合。兹針對可良好進行該等程 、-構更相地加以說明。於前述程序⑷中 新引子能有效地進行煉合，需藉程序⑷所合成出之互補校 :在程序⑷中形成迴圈結構’以使部分之模板核酸之前述 為單股。因此，序列(Ae，)之驗基歓與目標核酸 序列中則逃序列(A)與序列(B)所挟領域之驗基數γ之差 阶)相對於Χ之比例(χ_γ)/χ甚為重要。但，存在於較模板 核酉夂上之序列⑷更偏5,側且與引子之雜交無關的部分則無 10須一併化為單股。此外，於前述程序⑷中為使新引子有效 率地煉合，必須使程序⑷所合成出之互補核酸在程序⑷’中 有效率地形成迴圈結構。而，就有效形成迴圈結構(即，效 率良好地進行序列(Β，)與序列(Bc)之雜交）而言，該序列⑽ 與(Be)間之距離(X+Y)甚為重要。一般而言，引子延伸反應 15之最適溫度最高亦僅止於饥左右，而此種低溫下難以使 延伸鏈之長領域全部解離。因此，為使序列(Β，)有效地雜交 至序列（Be)上，兩序列間之鹼基數宜少。另一方面，為使 序列（B’)與序列（Bc)雜交而使模板核酸上之前述序列（a)之 部分成為單股，序列(B，)與序列(Be)間之鹼基數宜多。 -攸以上觀點看來’構成引子之序列（Ac’）與序列（b，）之 門不存有插入序列時’就本發明之引子而言，係設計成 (X-Y)/X為00以上且宜為〇 〇〇以上，更宜為〇 〇5以上而尤 宜為〇·10以上；於丨.00以下且宜於〇75以下，更宜於〇5〇以 下而尤宜於〇·25以下。更進一步地說，（χ+γ)係宜於15以上 18 且更宜於20以上’尤宜為20以上而最宜為30以上；並宜於 50以下，更宜於48以下，而最宜於42以下。 再者’構成引子之序列(Ac，)與序列(B，)之間存有插入 序列（鹼基數為Y’）時，就本發明之引子而言，係設計成 5 {Χ_(γ-γ’）}/Χ為-1·00以上且宜為0·00以上，更宜為0.05以上 而尤宜為0.10以上；於1·〇〇以下且宜於〇 75以下，更宜於〇 5〇 以下而尤宜於0.25以下。更進一步地說，（χ+γ+γ，）係宜於 15以上且更宜於20以上，尤宜為2〇以上而最宜為3〇以上； 並宜於100以下，更宜於75以下，而最宜於5〇以下。 〇 本發明之引子係由去氧核醣核苔酸及/或核醣核苷酸 所構成’其所具有之鏈長程度恰為可在被賦予之條件下維 持所必須專一性並可進行與目標核酸間之鹼基對結合者。 本發明之引子鏈長宜為15〜100個核苷酸，且更宜為3〇〜6〇 個核苷酸。其次，用以構成本發明引子之序列(Ac，)與序列 (B )的長度各宜為5〜5〇個核苷酸，且更宜為1〇〜3〇個核苷 酸。此外，亦可依需要而於序列(Ac，)與序列（B，）間插入不 致影響反應之插入序列。 本發明中，「核醣核苷酸」（亦僅稱為rN」）係指核醣 核誓三碟酸，如ATP、UTP、CTP、GTP等。核醣核苔酸亦 2〇包含該等之衍生物，如α位磷酸基之氧原子被硫原子取代 而成之核醣核苔酸（α-硫代-核醣核誓酸）等。 再者，本發明之引子亦包含：未修飾去氧核苷酸及/或 修飾去氧核苔酸所構成之寡核苔酸引子；未修飾核醣核苷 酸及/或修飾核醣核菩酸所構成之募核答酸引子；以及含有 19 ΐΓ錦去氧料酸及/或修飾錢核㈣及祕飾核酿核 甘西欠及/或修都核醋核苔酸之嵌合寡核苔酸引子等。 、、本發明之引子可藉用係運用於合成寡核誓酸之任意方 、套:加以合成，如破酸三酿法、化膦酸鹽法及硫代膦酸鹽 5法寺。舉例言之，本發明之引子若藉一使用細社⑽_ Bi〇syStem Inc.)之DNA合成儀别型的——ami—法進 行合成，則可輕易取得之。 本發明之核酸合成法所用之DNA聚合酶僅需為具有鏈 置換(strand displacement)活性(鏈取代能）者即可，可使用具 10長溫性、中溫性或耐熱性者。此外，該DNA聚合酶可為天 然體或施加人造變異之變異體。更詳言之，該DNA聚合酶 宜為貫質上不具5’->3’外切酶活性者。此種DNA聚合酶可 列舉如來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（BaciUus stearothermophilus，以下稱為「β· st」）、Bacillus 15 caldotenax(以下稱為「Β· ca」）等嗜熱性桿菌屬菌株之DNA 聚合酶的欠缺5’—3’外切酶活性之變異體，以及來自大腸桿 ^I(E· coli)之DNA聚合酶I之克萊諾片段(Klenow fragment) 等。本發明之核酸合成法所用之DNA聚合酶更可列舉如 Vent DNA聚合酶、Vent (Exo-) DNA聚合酶、DeepVent DNA 20 聚合酶、DeepVent (Exo-) DNA聚合酶、φ29嗤菌體DNA聚 合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-Tag DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pfu turbo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、9 。Nm DNA聚合酶及Therminater DNA聚合酶等。 本發明之核酸合成方法中所採用之其他試劑，舉例言 20 200413527 之’可使用如氣化鎂、乙酸鎂及硫酸鎂等催化劑；dNTP混 合物等基質；以及三鹽酸緩衝液、酪胺酸緩衝液、磷酸鈉 緩衝液及磷酸鎂緩衝液等緩衝液。更可使用二甲亞颯 (dimethyl suifoxide)及甜菜鹼(N，N，N-trimethylglycine)等 5 添加物及載於國際公開第99/54455號手冊之酸性物質及陽 離子錯體。
本發明之核酸合成方法中，作為模板之核酸可為DNA 或RNA。舉例言之，該等核酸可由下述試料離析取得，即： 取自血液、組織、細胞或動植物等活體之試料；或，從食 10 品、土壤及排水等分離出之取自微生物之試料。 模板核酸之離析可藉任意方法進行，舉例言之，可採 用界面活性劑之溶劑處理、音波處理、使用玻璃珠之振盪 攪拌及高壓破碎(Franch press)等。此外，存有内在性核酸 酶時’宜將已離析之核酸純化。舉例言之，核酸之純化可 15 猎本紛抽提、柱色層分析法、離子交換、凝膠電泳及按照
密度之離心分離等方法實施。更具體言之，本發明之核酸 合成方法中之模板核酸可使用藉前述方法離析出之基因 DNA及PCR片段等之雙股核酸，或使用藉逆轉錄反應而由 全RNA或mRNA調製出之cDNA等單股核酸。於使用前述雙 20 股核酸時，可藉變性程序(denaturing)令其為單股，而可更 適於利用。 用於别述逆轉錄反應之酶僅需為以RNA為模板且具有 cDNA合成活性者即可’可列舉如來自鳥類骨髓母細胞症病 毒之逆轉錄酶(ATV RTase)、Raus關連病毒2逆轉錄病毒 21 200413527 (RAV-2 RTase)、來自Molonery鼠白血病病毒之逆轉錄酶 (MMLV RTaes)等各種來源之逆轉錄酶。此外，亦可使用一 併具有逆轉錄活性之DNA聚合酶。另，為達成本發明之目 的，於高溫下具有逆轉錄活性之酶最為適合，可使用如來 5 自嗜熱屬菌株之DNA聚合酶(TthDNA聚合酶等）以及來自 桿菌屬菌株之DNA聚合酶等。若例示較理想之酶，舉例言 之，來自嗜熱性桿菌屬菌株之DNA聚合酶可列舉如取自b. st之DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶），及取自B· ca之DNA聚合 酶（Bca DNA聚合酶）（如BcaBEST DNA聚合酶與 10 Bca(exo-)DNA聚合酶）等。如，BcaDNA聚合酶於反應時不 需猛離子而可於南溫條件下抑制模板DNA之二次結構形成 並合成出cDNA。 本發明之核酸合成方法更可使用同時具有逆轉錄活性 之DNA聚合酶(如BcaBEST DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚 15合酶等），而可藉單種聚合酶進行全RNA或mRNA之逆轉錄 反應以及以cDNA為模板之DNA聚合酶反應。此外，可將 DNA聚合酶與MMLV逆轉錄酶等之逆轉錄酶組合使用。 即使於模板核酸為雙股核酸時，本發明之核酸合成方 法亦可將其直接用於反應中，但亦可依需要使其等變性成 20單股，藉此使引子有效率地煉合至模板核酸。使溫度上升 至約95度為理想之核酸變性法。其他方法中，亦可使pH上 升以進行變性，但此時為使引子雜交至目標核酸而需使pH 值降低。 若依本發明之較佳實施樣態，則程序(e)所得雙股核酸 22 200413527 "序⑷中反覆使用。藉此，可使與模板核酸中之目標 核酸互補的核酸量產。 〜本發日种碰合成方法之特徵之―為可於等溫下進行 貫施。因此，若據本發明，可提供—種用以合成互補核酸 5之方法’該核酸係與模板核酸中之目標核酸互補，且該方 法^含-準備核酸合成用溶液之程序及一培養該核酸合成 用岭液之程序，而可述核酸合成溶液含有模板核酸與本發 月之引子。於此，所謂『等溫』係指保持在一種可使酶與 引子於實質上可運作之大致固定的溫度條件下。 1〇 可保持在一可維持所用晦之活性的溫度而實施本發明 之核酸合成方法。此外，本發明之核酸合成方法中，為使 引子煉合至目標核酸上，舉例言之，宜將反應溫度設定在 該引子之熔解溫度(Tm)左右，或設定為較其更低之溫度， 更了考里引子之溶解，皿度來5又疋嚴苛條件之程度。因此， 15該溫度宜為約2〇°C〜約75°C，更宜為約35t：至約65艽。 本發明之核酸合成方法中，可令雙股核酸為模板，再 使用係針對各股加以設計之由2種本發明之引子所構成之 引子組，而使前述核酸中之目標核酸序列擴增。因此，若 據本發明，可提供一種用以使雙股模板核酸中之目標核酸 20 序列擴增之方法，而該核酸擴增方法包含下列程序： (a)準備第一引子，該第一引子係於3,端部分含有一序 歹|J(Ac’），其可與雙股模板核酸第一股中之目標核酸序列之 3’端部分的序列(A)雜交，且該序列(Ac，)之5,側含有一序列 (B’），其可與目標核酸序列中存在於較前述序列(a)更偏5, 23 5 側之序列（B)的互補序列（Bc)雜交；且 序列右1丨1請述相(Ae，)與前述相(b，)卩林存有插入 前述序續錢為x而目標核酸序列中 仏⑽可述序列⑻間所挾領域之驗基數為γ時， )} X係於丄0〇〜ι·〇〇之範圍内； 序列=、=(::述序 數為丫，時，{Χ(Υ ν __人序列之驗基 {Χ_(Υ-γ，)}/χ係於摘〜1〇〇之範圍内，· 10 列(=準Γ二引子，該第二引子係於3,端部分含有一序 3，^八二與雙股模板核酸第二股中之目標核酸序列之 雜交，且該序略，)之5，側含有一序列 側之 15 序列若1 丨II前述相(Ce，)與前料_，财存有插入 前过 ,述序列(Cc)之驗基數為X而目標核酸序列中 ⑺列W與前述序列剛所挾領域之 {x卿x係於-ι.〇(Μ·〇〇之範圍内； 序列而與前料帅，別存有插入 20 數為V，時相同而該插人序列之驗基 : y )》/X係於-1·00〜1〇〇之範圍内。 板核(Γ備由第—模板核酸與第二模板核酸構成之雙股模 板，(rm第―、第二引子各煉合至前述第一、第二模 弓1子延伸反應，以合成出含有前述目標核 24 200413527 酸序列之互補序列的第一、第二互補核酸； (e)使存在於藉程序（d)合成出之互補核酸之5，側的序列 (B’）及序列（D’）與存在於同互補核酸上之序列（Bc)及序列 (Dc)雜交，藉此使第一及第二模板核酸上之部分前述序列 5 (A)及序列（C)成為單股； ⑴使具有與前述引子相同序列之其他引子煉合至藉程 序0)成為單股之第一及第二模板核酸上的前述序列（A)及 序列（C)之部分而進行鏈置換反應，以便可用藉前述其他引 子新a成出之互補核酸來置換程序（d)所合成出之互補核 10 酸。 此外’引子之設計及反應條件等詳細内容，則如前述 本發明之核酸合成方法中所載者。 若依本發明之較佳實施樣態，則本發明之核酸擴增法 中，程序（f)所製得且係單股核酸之第 一及第二互補核酸玎 15於程序（e)中反覆使用。即，程序（f)製得之第一互補核酸玎 作為轾序（d)之第二模板核酸而加以利用 ，而程序（f)所得之 第一互補核酸則可作為程序（d)之第一模板核酸而加以利 用0 本發明之核酸擴增方法與本發明之核酸合成方法同樣 可於等/JHL下貫施。因此，若依本發明，可供一種可使雙股 模板核酸中之目標核酸序列擴增之方法，其含有一準備核 酉欠擴增用溶液之程序及一以等溫培養該核酸擴增用溶液之 耘序，且該核酸擴增用溶液含有雙股模板核酸及本發明之 引子對。於此，所謂『等溫』係指保持在一種可使酶與引 25 200413527 子於貫質上可運作之大致固定的溫度條件。而其溫度條件 之詳情則如前述本發明之核酸合成方法中所載者。 本發明之核酸擴增方法更可使用具有逆轉錄活性之 DNA聚合酶，舉例言之，若使用BcaBESTDNA聚合酶，則 5即使於S#RNA作為模板時，亦可含有自該RNA調製CDNA 之程序，而為最適宜實施之核酸擴增方法。此外，亦可使 自RNA調製cDNA之程序獨立實行，再將其生成物用於本發 明之核酸擴增方法。
本發明之核酸合成法及核酸擴增法中，為使核酸之合 10成效率或擴增效率提高，亦可將熔解溫度調整劑添加至反 應溶液中。一般而言，核酸之熔解溫度(Tm)係以核酸中形 成雙鏈部分之具體核苔酸序列來決定。可於反應溶液中添 加熔解溫度調整劑而使熔解溫度變化，因此而可於一定溫 度下調整核酸中雙鏈形成之強度。通常之熔解溫度調整劑 15具有使熔解溫度下降之效果。可添加此種熔解溫度調整劑 藉此使二個核酸間之雙鏈形成部分的溶解溫度下降，換言 之，即可使該雙鏈之形成強度下降。因此，若於本發明之 核酸合成方法及核酸擴增方法中添加此種熔解溫度調整 劑’則可於形成堅固雙鏈之GC豐富之核酸領域及形成複雜 20二次結構的領域中有效地使雙鏈部分化為單鏈，藉此可於 引子延伸反應結束後使後續之引子容易地雜交至目標領 域’進而提高核酸之合成效率及擴增效率。熟習相關技術 者自可考量影響雜交條件之其他反應條件而選擇本發明中 採用之熔解溫度調整劑及其於反應溶液中之濃度。因此， 26 200413527 炫解溫度調整劑雖無特別限制，但宜為二甲亞颯_so)、 甜菜鹼、甲賴或甘油’或細等之任意組合，且更宜為 二甲亞颯(DMSO)。 本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法中，亦可將酶 安定化劑添加至反應溶液中。藉此，可使反應中之酶更為 安化，而提高《之合成效率及擴增效率。本發明中採用 之酶安定化劑可為甘料之於相_域中已為人知者，並 未特別受到限制。 本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法中，亦可於反 1〇應溶射添加㈣㈣DNA聚合喊逆轉騎料之耐熱 性之試劑’藉此可反應液中之峰安定化而提高核酸之合成 效率及擴增效率。此種試劑可為海藻糖(trehal〇se)等之相關 領域中已為人所知者，並未特別受到限制。 本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法中，合成反應 15或擴增反應係反覆進行至用以使酶失去活性或用以啟動引 子之試劑中之任一者用盡為止。 本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法中，亦可以含 有非天然核膽核甘&C之核酸作為模板核酸。本發明說明書 中，『非天然核醣核苷酸』係指：含有天然核苷酸所含鹼基 2〇 (腺嗓呤、鳥σ票呤、胞°密°定、胸腺°票呤或尿嘴唆）外之鹼基的 核醣核苷酸，並將其置於核酸序列中者；舉例言之，如黃 嘌呤類、二胺基嘧啶類、isoG、is〇C(Proc，Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333, 1995)等。一般而言，含非天然核苷酸 之目標核酸之擴增係使用不具耐熱性之核酸擴增酵素。另 27 200413527 一方面，舉例言之’本發明之核酸合成方法及核酸擴增方 法可於50°C左右之等溫下進行，因此，與習知之PCR法相 車父下’核酸擴增酶(如DNA聚合酶等）失去活性之可能性較 低。因此，本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法對於係 5使用不具耐熱性之核酸擴增酶且含非天然核醣核苔酸之目 標核酸之擴增而言亦有效果。用於使含非天然核醣核苷酸 I、U之酶僅系為可使此種目標核酸擴增者即可，並未受到 特別限制，若特別從置入效率之觀點看來，則y188l/E478q 變異型HIV I逆轉錄酶、AMV逆轉錄晦、DNA聚合酶之克 10萊諾片段、9°C DNA聚合酶及HotTubDNA聚合酶等甚為理 想（參照Michael Sismour 1 et al·，Biochemistry 42, Νο·28， 8598, 2003/美國專利第 6617106號說明書、Michael j· Lutz et al·，Bioorganic & Medical Chemistry letters 8, 1149-1152， 1998等）。更可於反應溶液中添加用以提高核酸擴增酶之耐 15 熱性之物吳（如海澡糖寺）’精此可更有效率地進行含非天然 核醣核苔酸之目標核酸之擴增。 使用本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法可簡便且 迅速地製出用以固疋於DNA晶片之單股核酸、用以決定驗 基序列之單股核酸探針或用於長鏈PCR法之巨引子。舉例 2〇 g之’可使用本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法並依 所欲目的而僅選擇出表現序列或反表現序列後使其擴增。 因此，本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法亦可作為某 一目標核酸之表現序列或反表現序列之擴增方法而甚為有 用0 28 200413527 以本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法獲得之擴增 產物可It各種方法檢測出其存在。其中一種方法為藉通常 之凝膠電泳法測出特定尺寸之擴增產物。舉例言之，該方 法可藉溴化乙錠(ethidium bromide)及Cybergreen等勞光物 5質進行檢測。至於其他方法則亦有使用具生物素等標幟之 標幟探針，使其與擴增產物雜交以進行檢測者。可藉生物 素與已螢光標幟之抗生物素蛋白以及已結合至過氧化酶等 酶之抗生物素蛋白的結合而檢測出結果。 此外本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法所得之 10擴增產物亦可使用免疫色層分析法檢測。該方法係使用柱 色譜媒介(利用可藉肉眼檢測之標幟)者（免疫色層分析 法>。若使前述擴增片段與標幟探針雜交，再使該擴增片段 之可與不同序列雜交之捕捉用探針固定在柱媒介上則可 以該狀之部分進拥捉，而可於㈣介進行檢測。結果， 15便可以肉眼進行簡易之檢測。 本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法中，可使用已 固疋化於小珠上之引子’而可藉著確認因核酸合成或核酸 擴增引起之小珠凝集檢測出合成產物或擴增產物。此外， 以多數目標核酸為合成或擴增之對象時，可將針對各目標 核酸設計之引子固定化於可互相識別之小珠（如顏色形狀 等相異之小珠），再使用含有該等之單種反應溶液來進行核 酸合成反應或核酸擴增反應。此時，可藉確認各珠有無凝 集而得知是否存有各目標核酸。 此卜本I明之核I合成方法或核酸擴增方法更可使 29 用固定化於陣列（如讓八晶片）之引子，藉此確認因核酸合 成或核酸擴增而產生於陣列上之核酸凝集物，進而測出合 成產物或擴增產物。再者，以多數目標核酸作為合成或擴 增之對象時，可將針對各目標核酸設計之引子固定化於陣 5列上可識別之位置，再使用含有該陣列之反應溶液進行核 酉文合成反應或核酸擴增反應。此時，可確認陣列上之對應 位置有無核酸凝集物，以得知是否存有各目標核酸。亦可 利用内校正劑（inter-corrector)來取代核酸凝集物之確認。 本發明之核酸擴增方法所得之擴增片段係由一般之鹼 10基所構成，因此，擴增後可使用擴增片段内部之限制酶部 分而於適當之載體内選殖。甚至可使ffiRFLp等限制酶進行 處理，而亦可廣泛利用於基因檢測領域中。此外，因本發 明之核酸擴增方法所得之擴增片段係由一般之鹼基構成， 若預先於擴增片段中編入RNA聚合酶之啟動序列，則可由 15 擴增片段直接合成RNA，且該RNA亦可作為RNA探針。 此外，本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法中，亦 可使用已藉生物素或螢光物質標幟之鹼基來取代一般之 dNTP，藉此可製得業經生物素及螢光物質標幟2DNA探 針。 20 本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法所製得之單股 核酸可作為用以固定於DNA晶片上之DNA片段加以使用。 即’本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法亦可應用在製 成DNA鏈之方法上，該DNA鏈係於製作DNA晶片時固定化 者。再者，亦可預先將引子之5’端固定於DNA晶片上，再 30 200413527 於該晶片上進行核酸合成或核酸擴增，以製作DNA晶片。 另’若於進行該核酸合成或核酸擴增前預先添加螢光標幟 探針’則可於DNA晶片上進行核酸合成或核酸擴增之同 日守’進行實時(real-time)之檢測。 5 為實施本發明之核酸合成方法或核酸擴增方法，可整
理必須之試劑而令其成套組。因此，本發明之套組含有本 發明之引子或本發明之引子組。此外，本發明之核酸合成 方法或核酸擴增方法具有無須本發明之引子或引子對以外 之其他引子的優點。因此，若據本發明之較佳實施型態， 10則本發明之套組未含本發明之引子或引子組以外的引子成 分。而本發明之套組更可含有前述試劑、反應容器及說明 書等。 [實施例] 以下，以實施例將本發明作更具體之說明，但該等内 15 容非為用以限定本發明者。
例1 本例中，使用HumanDNA(Clontech社）為模板，嘗試人 類STS DYS237基因之擴增。所用引子係如下所示。該等引 子之合成係委託ESPEC-OLIGO SERVICE株式會社。 20 實驗所用之引子特徵係記載如下。此外，相對於模板 之各引子領域之位置關係則如第2圖所示。再者，下述序列 中，劃線部分表示各表現引子及反表現引子中共通之3’端 領域。 引子組1 :僅由煉合至模板之序列（20mer)構成之引子 31 200413527 組合； SY153L ： GCATCCTCATTTTATGTCCA(序列編號 1)； SY153R ： CAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號2) 〇
引子組2 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3, 5 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端侧之序列（13mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游1個鹼基處開始的領域； SY153LP13-0 ： AAGTCTCTGATGTGCATCCTCATTTTATGTCCA(序列编; SY153RP13-0 : AG A ACTCGCTTT ACAACCCAAAAGCACTGAGTA (序列编號…。 10 引子組3 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3’ 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（13mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游6個鹼基處開始的領域； SY153LP13-5 : GTATTAAGTCTCTGCATCCTCATTTTATGTCCA(序列編號5)； 15 SY153RP13-5 ： rACTAAGAACTCGCAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號6)。
引子組4 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3’ 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（13mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游11個鹼基處開始的領域； 20 SY153LP13-10：mTrAfiTATTAAGGCATCCTCATTTTATGTCCAi 序列編號7); SY153RP13-10： AGrATCACTAAGACAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號8)。 引子組5 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3’ 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（13mer)係雜交至該引子延 32 200413527 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游16個鹼基處開始的領域； SY153LP13 -15 ·· CATTTGTTCAGTAGCATCCTCATTTTATGTCCAi 序列編號9); SY153RP13-15 ： CTTGCAGCATCACCAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號 1 m 〇 引子組6 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3, 5 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（lOmer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； SY153LP10 ： GGCATITGTTGCATCCTCATTTTATGTCCA(序列編號 11 ^ ; SY153RP10 ： ATCTTGCAGCCAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號 1 ^。 10 引子組7 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3, 端側之序列（20mer :與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（13mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； SY153LP13 ： TGTGGCATTTGTTGCATCCTCATTTTATGT(TA(序列逅_η)； 15 SY153RP13 ： AACATCTTGCAGCCAACCCAAAAGCACTGAfiTAf 序列逅_ 1 ζ}。 引子組8 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3, 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（16mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； 20 SY153LP16： TTATGTGGCATTTGTTGCATCCTCATTTTATGTrrA(5); SY153RP16： CTTAACATCTTGCAGCCAACCCAAAAGCACTGAGTA(6)。 引子組9 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3， 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（22mer)係雜交至該引子延 33 200413527 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； SY153LP22 ： mTCnTATGTGGCAnTGTTGCATCCrCATnTATCTCCA(序列編號 17、; SY153RP22 ： AnTMaTMCATCTTGCAGCCMCCCMAAGCACTGAGTA(序列只、〇 引子組10 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3, 5 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（25mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； SY153LP25 :TCAmCCnTATGTGGCATTTGTTGCATCCrCATnTATGTCCA(序列編號19、； SY153 ㈣:MGAmMCITMCATCTTGCAGCCMOCmAAGCACTGAGTA(序列編_、〇 10 引子組11 :如下所述般之引子組合，即，位於各引子3’ 端側之序列（20mer:與引子組1相同之序列）煉合至模板上， 延伸反應後，位於5’端側之序列（28mer)係雜交至該引子延 伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的領域； SY153LP28 ： CAGTCATTAOCnTATGTGGCATnmTGCATOCrCATnTATGTCCA(序列臟 15 21)； SY153RP28 ： MGAAGATnMCITMCATCITGCAGCCAAOCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號 22)。 調製含有如下組成之反應液（25μ1): Tris-HCL(20mM，pH8.8)、KCL(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、 20 MgS04(2mM)、Triton X-l00(0.1 %)、dNTP(0.4mM)，其等 各含有lOOpmol之前述引子對及lOOng之模板DNA以及8U 之BstDNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，再使反應液 以60°C培養20、40或60分鐘。 以 3% NuSieve GTG Agarose(BioWhittaker Molecular 34 200413527
Applications(BMA)社製；自 TakaraBio社購入；「NuSieve」 為BMA社之登錄商標）對各反應液5μ1進行電泳。結果如第 5、6及7圖所示。該等圖中各行(lane)之樣本則如以下表1〜3 所示。 5 表1 :第5圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 引子 模板 反應時間（分） 1 DNA size marker (20bp ladder) 2 引子組1 有 20 3 引子組1 有 40 4 引子組1 有 60 5 引子組1 無 60 6 引子組2 有 20 7 引子組2 有 40 8 引子組2 有 60 9 引子組2 無 60 10 引子組3 有 20 11 引子組3 有 40 12 引子組3 有 60 13 引子組3 無 60 14 引子組4 有 20 15 引子組4 有 40 16 引子組4 有 60 17 引子組4 無 60 18 引子組5 有 20 19 引子組5 有 40 20 引子組5 有 60 21 引子組5 無 60 200413527 表2 :第6圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 引子 模板 反應時間（分） 1 DNA size marker (20bp ladder) 2 引子組6 有 20 3 引子組6 有 40 4 引子組6 有 60 5 引子組6 無 60 6 引子組7 有 20 7 引子組7 有 40 8 引子組7 有 60 9 引子組7 無 60 10 引子組8 有 20 11 引子組8 有 40 12 引子組8 有 60 13 引子組8 無 60 14 引子組9 有 20 15 引子組9 有 40 16 引子組9 有 60 17 引子組9 無 60 18 引子組10 有 20 19 引子組10 有 40 20 引子組10 有 60 21 引子組10 無 60 表3 :第7圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 引子 模板 反應時間（分） 1 DNA size marker (20bp ladder) 2 引子組11 有 20 3 引子組11 有 40 4 引子組11 有 60 5 引子組11 無 60 5 各圖中之行5、9、13、17及21未添加模板，因此，並 未發現未反應之引子有被染色者以外之帶(band)。 第5圖之行2及3添加有模板，因此可發現未反應之引子 與高分子規模之模板的帶。但因反應時間不足，並未發現 36 200413527 擴增產物。由第5圖之行4可知，添加模板且反應時間為⑼ 分鐘之樣本可獲得擴增產物，但其等為低規模領域呈艇狀 且同規核領域呈抹片狀之擴增產物。第5圖之行2〜5係使用 僅由與模板鏈合之募核醣核誓酸(2〇mer)所構成之弓I子組 5卜並未發生本發明之合成反應，&而未獲得所欲之擴增產 物0 第5圖之行6以後則為使用以下引子組進行擴增之結 果；該引子組為：位於各引子3,端側之序列（2〇mer :與引子 組1相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於5,端側之 10序列係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游開 始的領域。 由第5圖之行8及行12可知，使用引子組2或3時，可以 60分4里之反應時間製得目的擴增產物。低規模之帶中，約 160bp附近之帶為可從本發明之合成反應預先思及的產物。 15 亦可由第5圖之行15及16、第6圖之行3、4、7 ' 8、11、 12、15、16、19及20以及第7圖之行3及行4得知，使用引子 對4、6、7、8、9、10及11時，可以4〇分鐘以上之反應時間 製得目標擴增產物。低規模之帶中，約16〇bp附近之帶為可 從本發明之合成反應預先思及的產物。 20 更可由第5圖之行18〜20得知，使用引子組5時，可以約 20分鐘以上之反應時間製得目標擴增產物。低規模之帶 中，約160bp附近之帶為可從本發明之合成反應預先思及的 產物。 如引子組2及3般，其引子延伸鏈上相當於引子3,端側 37 200413527 序列之領域以及5’端側序列將進行雜交之領域間之間隔較 小時，具有相同序列之下一引子所應鏈合之模板上之序列 大部分將呈雙鏈’而使得次一引子難以進行鏈合，因此需 要較長之反應時間。 5 此外，如引子組6〜11般，其引子延伸鏈上相當於引子3, 端側序列之領域以及5’端側序列將進行雜交之領域間之間 隔較大時，各引子5’端側之序列反覆效率降低，而需要較 長之反應時間。 另一方面，若如引子組5般，其引子延伸鏈上相當於引 10 子3’端側序列之領域以及5’端側序列將進行雜交之領域間 之間隔恰於既非過大亦不過小之距離時，則可完成本發明 中效率最佳之擴增。 例2 本例中，使用HumanDNA(Clontech社）為模板，嘗試人 15 類sY160基因之擴增。所用引子係如下所示。該等引子之合 成係委託ESPEC-OLIGO SERVICE株式會社。 實驗所用之引子特徵係記載如下。此外，相對於模板 之各引子領域之位置關係則如第3圖所示。再者，下述序列 中’劃線部分表示各表現引子及反表現引子中共通之端 20 領域。 引子組12 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合，其中’表現引子為：位於引子3,端側之序列（2〇mer)煉 合至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（13mer)係雜 父至该引子延伸鏈上從各引子3’端殘基之下游27個鹼基處 38 200413527 開始的領域；反表現引子則為：位於引子3,端側之序列 (20mer)煉合至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列 (13mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游 21個鹼基處開始的領域； 5 SY160LP13 : AnmATOCGTTO〇GGGTCTOGMTCGAATA_丨褊，)； SY160RP13 : CTMATCGAATGGimmrmimir(序列編號24) 〇
引子組13 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合，其中’表現引子為：位於引子3’端側之序列（2〇mer ;與 引子12相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於5，端 10 側之序列（16mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘 基之下游27個鹼基處開始的領域；反表現引子則為：位於 引子3’端側之序列（20mer ;與引子12相同之序列）煉合至模 板上，延伸反應後，位於5’端側之序列（16mer)係雜交至該 引子延伸鏈上從各引子3’端殘基之下游21個鹼基處開始的 15 領域；
SY160LP16 ： GACATTCGATrCCGTITACGGGTCTCGMTGGMTA(序列乃、; SY160RP16 ： GMCTAAATOGMTGGTCAITGCAlTCCnTGCATr(序列編號26、〇 調製含有如下組成之反應液（25μ1): Tris-HCL(20mM，pH8.8)、KCL(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、 20 MgS04(2mM)、Triton X-l00(0.1 %)、dNTP(0.4mM)，其等 各含有lOOpmol之前述引子對及lOOng之模板DNA以及8U 之BstDNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，再使反應液 以60°C培養60或90分鐘。 以3% NuSieve GTG Agarose(BMA社製；自 TakaraBio 39 社購入；「NuSieve」為BMA社之登錄商標）對各反應液5μ1 進行電泳。結果如第8圖所示。該等圖中各行之樣本則如以 下表4所示。 表4 :第8圖之電泳照片中各泳動行之說明 <行 引子 模板 反應時間（分、 一 1 DNA size marker (2Ubp ladder) 一 2 引子組12 有 60 _ 3 引子組12 有 90 一 4 引子組12 無 90 一 5 引子組13 有 60 一 6 引子組13 有 90 一 7 引子組13 無 90 行4及行7並未添加模板，因此未反應之引子並未發現 除染色者以外之帶。 行2及行5添加有模板，因此可發現未反應之引子與高 分子規模之模板的帶。但因反應時間不足，並未發現擴增 產物。由行3及行6可知，添加模板且反應時間為90分鐘之 樣本可充分獲得目的之擴增產物。低規模之帶中，約260bp 左右之帶為可從本發明合成反應預先思及的產物。
Ml 本例中，使用M13mpl8RF DNA(噬菌體載體：TakamBio 社)為模板，嘗試其擴增。所用引子係如下所示。該等引子 之合成係委託ESPEC-OLIGO SERVICE株式會社。 實驗所用之引子特徵係記載如下。此外，相對於模板 之各引子領域之位置關係則如第2圖所示。再者，下述序列 中，劃線部分表示各表現引子及反表現引子中共通之3,端 領域。 引子組14 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 a，其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer)煉 合至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（24mer)係雜 交至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游51個鹼基處 開始的領域；反表現引子則為：位於引子3,端側之序列 (22mer)煉合至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列 (15mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3，端殘基之下游 54個鹼基處開始的領域；
MnnPiACMCGTmrcACrGGGAAMCGCimSQQQmSimim^序列編號28) 〇 引子組15 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合，其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列(24mer ;與 引子組14相同之序列）練合至模板上，延伸反應後，位於5, ^側之序列（13 mer)係雜父至該引子延伸鍵上從各引子3，端 殘基之下游1個驗基處開始的領域；反表現引子則為··位於 引子3’端側之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合至 模板上，延伸反應後，位於5’端側之序列（i3mer)係雜交至 該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游丨個鹼基處開始 的領域； M13F2L13-〇 : GTCTCAMTKHT腿mmSSAAmOAfiCnGATV初丨褊―); M13R2L13-0 : nCGCCAGCTGGC^迎0〇αΠΠΤαΤΤΑΤΤΑΓ7献丨丨褊妒η) 〇 引子組16 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合；其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer ;與 引子組14相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於5， 端側之序列（13mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端 200413527 殘基之下游7個鹼基處開始的領域；反表現引子則為：位於 引子3’端側之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合至 模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（13mer)係雜交至 該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游7個鹼基處開始 5 的領域； M13F2L13-6 : ^〇α^ϋΚΜΚΠΤΟΤΟΤΟΟΜΊΤΟΤΓτΑΓΠΓτΑΤ__—、； M13R2L13-6 : CCCCCmamGTGamXTCTTOGCTAma_励9、〇 引子組17 ··如下所述之表現引子與反表現引子的組 合，其中’表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer ;與 10引子組Η相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於5, 端側之序列（13mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端 殘基之下游13個驗基處開始的領域；反表現引子則為：位 於引子3’端側之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合 至杈板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（13mer)係雜交 15至该引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游13個鹼基處開 始的領域； M13F2L13-12 : TAGnrcTITCCrcMim®MIimM^咖編號33); M13R2U3-12 ·· A㈣(序列編號34) 〇 引子組18 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 2〇合；其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer;與 引子、、且14相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於 ^側之序列（13mer)係雜父至該引子延伸鏈上從各引子3，端 殘基之下游19個鹼基處開始的領域；反表現引子則為：位 於引子3’端侧之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合 42 200413527 至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（I3mer)係雜交 至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游19個鹼基處開 始的領域； M13F2L13-18： TGGTCATAGCrGTrGTTGTGTGGMTrGTCAfiCnGATY_丨臟％、; 5 M13R2L13-18 : CCTTGCAGCACATGTGOGGGCCrCTTOGCTAmrY_丨護％、〇
引子組19 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合；其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer ;與 引子組14相同之序列）煉合至模板上，延伸反應後，位於5, 端側之序列（13mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端 10殘基之下游25個驗基處開始的領域；反表現引子則為··位 於引子3’端側之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合 至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（13mer)係雜交 至該引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游23個鹼基處開 始的領域； 15 M13F2L13 : TMTCATCCMWTGTGTGGAATTOTCArmAT咖丨褊_”、； M13R3L13 : ΤΡ〇αΤΤ〇α〇0·ΠΠΙΠΠΤαΓΓΑΤΤΑΓΥ 献丨編g，、〇
引子組20 :如下所述之表現引子與反表現引子的組 合；其中，表現引子為：位於引子3,端側之序列（24mer;與 引子組14相同之序列)煉合至模板上，延伸反應後，位於5, 20端側之序列（23mer)係雜交至該引子延伸鏈上從各引子3,端 殘基之下游25個鹼基處開始的領域；反表現引子則為：位 於引子3端側之序列（22mer ;與引子組14相同之序列）煉合 至模板上，延伸反應後，位於5,端側之序列（23mer)係雜交 至该引子延伸鏈上從各引子3,端殘基之下游23個鹼基處開 43 200413527 始的領域； M13F2L23 ： CTCGMITCGTMTCATGGTCAnGTrGTGTGGMTTGTGAGOGGAT(序列編號 39)； M13R3L23 : CCCMOTMTCXmTOAGCAGTGCGGGOCraTCGCTAmC(序列編號40)。 5 調製含有如下組成之反應液（25μ1):
Tds-HCL(20mM，pH8.8)、KCL(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、 MgS04(2mM)、Triton Χ-100(0·1%)、dNTP(0.4mM)，其等 各含有lOOpmol之前述引子對及〇.〇5pg之模板DNA以及8U 之BstDNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，再使反應液 10 以65°C培養20至120分鐘。 以3% NuSieve GTG Agarose(BMA社製；自 TakaraBio 社購入；「NuSieve」為BMA社之登錄商標）對各反應液5μ1 進行電泳。結果如第9及10圖所示。該等圖中各行之樣本則 如以下表5及表6所示。 15
44 200413527 表5 :第9圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 引子 模板 反應時間（分） 1 DNA size marker (20bp ladder) 2 引子組14 有 60 3 引子組14 有 90 4 引子組14 有 120 5 引子組14 無 120 6 引子組15 有 60 7 引子組15 有 90 8 引子組15 有 120 9 引子組15 無 120 10 引子組16 有 60 11 引子組16 有 90 12 引子組16 有 120 13 引子組16 無 120 14 引子組17 有 60 15 引子組17 有 90 16 引子組17 有 120 17 引子組17 無 120 18 引子組18 有 60 19 引子組18 有 90 20 引子組18 有 120 21 引子組18 無 120 表6 :第10圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 引子 模板 反應時間（分） 1 DNA size marker (20bp ladder) 2 引子組19 有 20 3 引子組19 有 40 4 引子組19 有 60 5 引子組19 無 60 6 引子組20 有 20 7 引子組20 有 40 8 引子組20 有 60 9 引子組20 無 60 45 200413527 各圖中行5、9、13、17及21並未添加模板，因此未反 應之引子並未發現除染色者以外之帶。
第9圖之行3及4添加有模板’反應時間90分以上可獲得 擴增產物。但此為與目的規模不同之低規模舵狀之擴增產 5 物。該等行於擴增反應時係使用引子組14。其引子延伸鍊 上，相當於引子3,端側序列之領域與5’端側序列進行雜交之 領域間之間隔如下：若為表現引子則為50個核醣核苷酸； 但若為反表現引子則為53個核醣核苔酸。由此可知，若引 子延伸鏈上相當於引子3’端側序列之領域與5,端側序列進 1〇 行雜交之領域的間隔過大，則各引子5,端側之序列反覆效 率明顯降低，難以發生本發明之合成反應，而無法獲得目 的之擴增產物。 由第9圖之行7可知，使用引子組15時，可藉9〇分鐘以 上之時間獲得目標擴增產物。低規模之帶中，約240bp左右 15之帶為可從本發明合成反應預先思及的產物。
更可從第9圖之行12及行6以及第1〇圖之行4及行8得 知，使用引子組16、17、19及20時，可以60分鐘之反應時 間獲得目標擴增產物。低規模之帶中，約24〇bp左右之帶為 可從本發明合成反應預先思及的產物。 20 可從第9圖之行19得知，使用引子組18時可獲得4〇分以 上之反應時間獲得目標擴增產物。低規模之帶中，約24〇bp 左右之帶為可從本發明合成反應預先思及的產物。 右如引子組15般，其引子延伸鏈上相當於引子]端側序 列之領域與5,端側序列進行雜交之領域間之間隔較小時， 46 200413527 具有相同序列之下一引子所應鏈合之模板上之序列大部分 將呈雙鏈，而使得次一引子難以進行鏈合，因此需要較長 之反應時間。 此外，如引子組19及20般’其引子延伸鏈上相當於引 5 子3端側序列之領域以及5端側序列將進行雜交之領域間 之間隔較大時，各引子5,端側之序列反覆效率降低，而需 要較長之反應時間。
另一方面，若如引子組18般’其引子延伸鏈上相當於 引子3’端側序列之領域以及5’端側序列將進行雜交之領域 10 間之間隔恰於既非過大亦不過小之距離時，則可完成本發 明中效率最佳之擴增。
例1至例3所得擴增產物中，對各標的採用被認為最具 有擴增效果之擴增產物，再以限制晦消化之。藉限制酶Mb〇 15 π將使用例1所載之引子對5而獲得之擴增產物之反應液 1 μι消化，並以限制酶BstXI將使用例1所載之引子對12而獲 得之擴增產物之反應液1μΙ>消化，再以限制酶PstI將使用例 3所載之引子對18而獲得之擴增產物之反應液1μ]ί消化。限 制酶消化之條件為以37°C進行3小時。 20 使用 3% NuSieve GTG Agarose(BMA社製；自 TakaraBio 社購入；「NuSieve」為BMA社之登錄商標）對各消化物5μ1 進行電泳。結果如第11、12及13圖所示。從各個鹼基序列 推測得知之各限制酶消化片段之規模係如電泳照片旁所載 示者。因幾乎所有處於未消化狀態之帶均轉變為所推定之 47 200413527 消化後之規模，而可確認已製得目標擴增產物。 例5 對擴增反應溶液添加各種炼解溫度調整劑以進行擴增 反應，並檢討熔解溫度調整劑對於擴增效率之效果。與例i
5 相同地使用Human DNA(Clontech社製），嘗試人類STS DYS237基因之擴增。所用引子為例1中顯示最佳擴增效率 之引子對5(序列編號9及序列編號1〇)。 調製含有如下組成之反應液（25μ1):
Tris-HCL(20mM，pH8.8)、KCL(lOmM)、（NH4)2S04(l〇mM)、 10 MgS04(8mM)、Triton Χ-100(0·1〇/〇)、dNTP(1.4mM),其等 各含有1600nM之前述引子對、模板DNA以及16U之Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)。模板DNA之濃度為 100ng、10ng、lng或Ong。再對反應液進行添加，使其最終 濃度呈6%之DMSO、0.5M甜菜驗、4%曱酸胺或甘油。 15 最後以60°C將其培養90分鐘。
擴增反應後’與實施例1相同地進行電泳。結果如第14 圖所示。第14圖中各行之樣本如以下表7戶斤示。 48 200413527 表7 :第14圖之電泳照片中各泳動行之說明 行 熔解溫度調整劑 模板量 1 DNA size marker (20 b| p ladder) 2 6%DMSO 100ns 3 0.5M甜菜驗 lOOng 4 4%曱醯胺 lOOng 5 10%甘油 lOOng 6 無 lOOng 7 6%DMSO lOng 8 0.5M甜菜鹼 lOng 9 4%曱醯胺 lOng 10 10%甘油 lOng 11 無 lOng 12 6%DMSO lng 13 0.5M甜菜驗 lng 14 4%甲醯胺 lng 15 10%甘油 lng 16 無 lng 17 6%DMSO 益 18 0.5M甜菜驗 益 19 4%甲醯胺 20 10%甘油 it 21 無 益 22 DNA size marker (2l 3 bp ladder) 於第14圖中，約160bp左右之帶為可從本發明之合成反 應預先思及之擴增產物。由第14圖可清楚得知，使用i〇〇ng 之模板DNA時，無論有無溶解溫度調整劑，均可獲得擴增 5 產物。另一方面，使用l〇ng之模板DNA時，則僅於添加熔 解溫度調整劑時可獲得擴增產物。且於使用lng之模板DNA 時，亦僅有添加熔解溫度調整劑之時可確認擴增產物之 f ’特別係於添加DMSO(6%)作為炫解溫度調整劑時，確 認到最明確之擴增產物之帶。 〇 由以上結果可知，本發明之核酸擴增方法中，可於反 應液中添加DMSO、甜菜鹼、甲醯胺及甘油等熔解溫度調 49 200413527 整劑而提高效率，特別係於添加DMSO時可獲得良好之擴 增效率。 【圓式簡單說明】 第1圖係用以模式性地顯示本發明之核酸擴增法者。 5 第2圖係用以顯示使人類STS DYS237基因擴增時所採 用之引子之5,側序列與3,側序列在該基因上之位置者。 第3圖係用以顯示使sY160基因擴增時所採用之引子之 5’側序列與3’側序列在該基因上之位置者。
第4圖係用以顯示使M13mpl8RT DNA擴增時所採用之 10 引子之5,側序列與3,側序列在該基因上之位置者。 第5圖係用以顯示各種條件下人類STS DY237基因之 擴增結果者。 第6圖係用以顯示各種條件下人類STS DY237基因之 擴增結果者。 15 第7圖係用以顯示各種條件下人類STS DY237基因之 擴增結果者。
第8圖係用以顯示各種條件下SY160基因之擴增結果者。 第9圖係用以顯示各種條件下M13mpl8RT DNA之擴增 結果者。 20 第11圖係用以顯示將人類STS DY237基因之擴增產物 施以限制酶處理後所得之電泳圖案者。 第12圖係用以顯示將SY160基因之擴增產物施以限制 酶處理後所得之電泳圖案者。 第13圖係用以顯示將M13mpl8RT DNA之擴增產物施 50 200413527 以限制酶處理後所得之電泳圖案者。 第14圖係用以顯示於各種熔解溫度調整劑存在下人類 STSDY237基因之擴增結果者。 【圖式之主要元件代表符號表】 (無）
51 200413527 1/18
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN K.K. Dnaform
Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. <12〇> Method for Amplification of Nucleic Acids <13〇> 145062 <15〇> JP 2002-314776 <151> 2002-10-29 <16〇> 43 <170> Patent In Ver. 2.0
<21〇> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 1 20 gcatcctcat tttatgtcca <21〇> 2 52 200413527 2/18
<211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <4〇〇> 2 caacccaaaa gcactgagta 20
<210〉 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <4〇〇> 3 aagtctctga tgtgcatcct cattttatgt cca 33
<21〇> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 53 200413527 3/18 <4〇〇> 4 agaactcgct ttacaaccca aaagcactga gta 33
<210> 5 <211〉 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 5 gtattaagtc tctgcatcct cattttatgt cca 33
<21〇> 6 <211〉 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 6 cactaagaac tcgcaaccca aaagcactga gta 33
<210> 7 <Z11) 33 <212> DNA <213) Artificial Sequence 54 200413527 4/18 <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 7 gttcagtatt aaggcatcct cattttatgt cca 33
<21〇> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 8 agcatcacta agacaaccca aaagcactga gta 33
<21〇> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 9 catttgttca gtagcatcct cattttatgt cca 33 55 200413527 5/18
<21〇> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <4〇〇> 10 cttgcagcat caccaaccca aaagcactga gta 33
<210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 11 ggcatttgtt gcatcctcat tttatgtcca 30 <21〇> 12
<211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 56 200413527 6/18 <4〇〇> 12 atcttgcagc caacccaaaa gcactgagta 30
<21〇> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 13 tgtggcattt gttgcatcct cattttatgt cca 33
<210〉 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 14 aacatcttgc agccaaccca aaagcactga gta 33
<21〇> 15 <211> 36 <212> DNA 57 200413527 7/18 <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 15 ttatgtggca tttgttgcat cctcatttta tgtcca 36
<21〇> 16 <211〉 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 cttaacatct tgcagccaac ccaaaagcac tgagta 36
<21〇> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 17 ttacctttat gtggcatttg ttgcatcctc attttatgtc ca 42 58 200413527 8/18
<210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400〉 18 atttaactta acatcttgca gccaacccaa aagcactgag ta 42
<21〇> 19 <211> 45 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 19 tcattacctt tatgtggcat ttgttgcatc ctcrattttat gtcca 45
<21〇> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> 59 200413527 9/18 <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400〉 20 aagatttaac ttaacatctt gcagccaacc caaaagcact gagta 45
<210〉 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 21 cagtcattac ctttatgtgg catttgttgc atcctcattt tatgtcca 48
<210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 22 aagaagattt aacttaacat cttgcagcca ac〜：caaaagc actgagta 48 <21〇> 23 <211> 33 60 200413527 10/18
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 23 attcgattcc gtttacgggt ctcgaatgga ata 33
<21〇> 24 <211〉 33 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 24 ctaaatcgaa tggtcattgc attcctttcc att 33
<21〇> 25 <211〉 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 25 61 200413527 11/18 gacattcgat tccgtttacg ggtctcgaat ggaata 36
<21〇> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 26 36 gaactaaatc gaatggtcat tgcattcctt tccatt
<210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Seqlllence: Primer <4〇〇> 27 cgactctaga ggatccccgg gtactgttgt gtggaattgt gagcggat 48
<21〇> 28 <211〉 47 <212> DNA <213) Artificial Sequence 62 200413527 12/18 <22〇> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <4〇〇> 28 acaacgtcgt gactgggaaa accctgtgcg ggcctcttcg ctattac 47
<21〇> 29 <211〉 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial SequeDce:Primer <4〇〇> 29 gtgtgaaatt gtttgttgtg tggaattgtg agcggat 37
<210> 30 <211〉 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 3〇 ttcgccagct ggcgtgcggg cctcttcgct attac 35 <21〇> 31 63 200413527 13/18
<211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <4〇〇> 31 tttcctgtgt gaatgttgtg tggaattgtg agcggat 37
<210〉 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Seqtlence: Primer <4〇〇> 32 ccccctttcg ccagtgcggg cctcttcgct attac 35
<21〇> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 64 200413527 14/18 <4〇〇> 33 37 35 tagctgtttc ctgtgttgtg tggaattgtg agcggat
<21〇> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 34 agcacatccc cctgtgcggg cctcttcgct attac
<21〇> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 35 tggtcatagc tgttgttgtg tggaattgtg agcggat 37
<210> 36 <211〉 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence 65 200413527 15/18 <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 36 ccttgcagca catgtgcggg cctcttcgct attac 35
<21〇> 37 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 37 taatcatggt cattgttgtg tggaattgtg agcggat 37
<210> 38 <211〉 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇〇> 38 tcgccttgca gcagtgcggg cctcttcgct attac 35 66 200413527 16/18
<21〇> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <4〇0> 39 ctcgaattcg taatcatggt cattgttgtg tggaattgtg agcggat 47
<21〇> 40 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 40 cccaacttaa tcgccttgca gcagtgcggg cctcttcgct attac 45 <210> 41 <211> 140
<212> DNA <213> Homo sapiens <4〇〇> 41 agcatcctca ttttatgtcc aacatcagag acttaatact gaacaaatgc cacataaagg 60 67 200413527 17/18 taatgactgt tgaagaagat ttaacttaac atcttgcagc atcactaaga actcgcttta 120 tactcagtgc ttttgggttg 140 <21〇> 42 <211> 240
<212> DNA <213> Homo sapiens <22〇> <221> unsure <222> (48) <223> n is unknown <4〇0> 42 gctacgggtc tcgaatggaa taaaaatata tggaatggaa tgcaatgnaa cggaatcgaa 60 tgtcatagaa tgtaatgcaa tgcaaaaaca tggaatccaa aatcattgac tggaaaggct 120 gggtgtcgaa aggaattgac tccaatggaa tggaatcgaa tggaatggaa gtgaatagaa 180 tcgaactaaa tcgaatggaa tggaattgat aggaacggaa tggaaaggaa tgcaatgatt 240
<210> 43 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <223> Description of Artificial Sequence: Phage vector <400〉 43 cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 60 68 200413527 18/18 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 120 cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 180 ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcl-ttaccca acttaatcgc cttgcagcac 240 atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 300 69

Claims (1)

  1. 200413527 拾、申請專利範圍： 1· 一種合成核酸之方法，該核酸係與模板核酸中之目標核 酸序列互補；該方法含有以下各程序： 不" ⑷準備引子，該引子係於3,端部分含有一序列 5 ㈣’其可與目標核酸序列之3，端部分之序列（a )雜 交’且該序列(心’)之5，側含有一序列(B，），其可與目標 核酸序列中存在於較前述序列(A)更偏5,側之序列⑻的 互補序列（Be)雜交；且 若引子中前述序列（Ac，)與前述序列(B，）間不存冑 % 1〇 歓序列，且令前述序列（Μ之鹼基數為X而目標核酸 序列中前述序列⑷與前述序列(B)間所挾領域之驗基 數為γ時，{Χ_(γ)}/Χ係於_100〜100之範圍内； 而若引子中前述序列（Ac，)與前述序列（Β，）間存有 插入序列，且令χ、γ之定義與前述者相同而該插入序 15 列之鹼基數為Υ，時，{χ-(Υ_Υ，）}/Χ係於-l.ooq.oo之範 圍内； (b) 準備模板核酸； · (c) 使别述引子煉合至前述模板，再進行引子延伸反 應’以合成出含有前述目標核酸序列之互補序列的互補 20 核酸； ⑷使存在於藉程序⑷合成出之互補核酸之5,側的 ' 序列(B，)與存在於同互補核酸上之序列(Be)雜交，藉此 使核板核酸上之部分前述序列成為單股； ⑷使具有與前述引子相同序列之其他引子煉合至 70 200413527 錯紅序⑷成為早股之模板核酸上前述序列(A)之部分而 =賴反應，以便可用藉前述其他引子新合成出之 互補核酸來置換程序（c)合成出之互補核酸。 5 10 15 2. 如申請專利範㈣丨項之方法，其係使程序⑷所得之雙 股核酸反覆使用於程序（d)中。 3. 如申請專利範圍第！項之方法，其中程序⑷、程序⑷及 程序（e)係於等溫下進行者。 4. 如申請專利項之方法，其係使料有鏈置換能 之DNA聚合酶。 5·如申請專利範圍第丨項之方法，其於模板核酸為rna %，更含有一使用逆轉錄酶以合成cDNA之程序。 6·如申請專利範圍第丨項之方法，其中程序(c)、程序(幻及 程序（e)係於熔解溫度調整劑存在下進行者。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該熔解溫度調整劑 為二甲亞颯、甜菜鹼、甲醯胺或甘油，或者為該等之混 合物。 8·如申請專利範圍第1項之方法，其中前述模板核酸中之 目標核酸序列含有非天然核苷酸。 9. 一種使由雙股構成之模板核酸中之目標核酸序列擴增 20 之方法，含有以下各程序： (a)準備第一引子，該第一引子係於3’端部分含有一 序列(Ac，），其可與雙股模板核酸第一股中之目標核酸序 列之3,端部分的序列（A)雜交，且該序列（Ac，）之5,側含 有一序列(B，），其可與目標核酸序列中存在於較前述序 71 若1側之序列⑻的互補序列(Be)雜交；且 插入序歹^子中序列Μ)與前述序列(B，）間不存有 序列中前H〗述序列(A。）之驗基數為⑭目標核酸 數為Y時，^列⑷與前述序列(酬所挾領域之驗基 {X_(Y)}/X係於_1·00〜1.00之範圍内· 而若弓丨 二 ’ 插入序列，Α前述序列(Ac，)與前述序列(Β，)間存有 列之鹼基數t;!:，Y广定義與前述者相同而該插入序 園内； τ ’ X-(Y-Y’h/X係於-loo〜1.00之範 10 序列(ΖΛ第二引子’該第二引子係於3,端部分含有― 列之、_可與雙股模板核酸第二股中之目標核酸序 —序歹他序列(C)雜交’且該序列(CC，)之5,側含有 15 (C)更偏與目標㈣軸中存在於較前述序列 若1之序列（D)的互補序列(Dc)雜交；且 插入序^子中4序列(CV)與前述序帅，)間不存有 序列卜且令前述序列(Cc，)之驗基數為X而目標核酸 數為化 與前述序列⑼間所挾領域之驗基 而二{Χ-(Υ)}/χ係於]〇(M 〇〇之範圍内； 20 極入序丨子巾W料列(C e，)與前述相(D，)間存有 列之且令Χ、Υ1義與前述者相同而該插入序 圍内數扑時，{Χ_(Υ·Υ，)胸於W0之範 股模板核:由# ^板核酸與第二模板核酸構成之雙 72 200413527 ⑷使前述第-、第二奸各煉合至前述第一、第二 雜，再各自進柯子延伸反應，以合成出含有前❹ w酸序狀互鱗_第…第二互補核酸； ⑷使存在於魏序⑷合成出之互補減之5,側的 序列㈤及序列(D，)與存在於同互補核酸上之序· 聽列㈣雜交，藉此使第—及第二模板核酸上之部分 河述序列⑷及相(C)成為單股； ⑴使具有與w述引子相同序列之其 藉程序（e)成為單股之第一 口 & ίο 及弟一核板核酸上的前述序 2(A)甘及序列(〇之部分而進行戦換反應，时可用藉 <、引子新°成出之互補核酸來置換程序(d)所合 成出之互補核酸。 1〇.如申請專利_第9項之方法，祕使程序⑴所得之雙 股核酸反覆使用於程序（e)中。 15 11. 如申明專利耽圍第9項之方法其係使程得之呈 單股核酸的第_及楚一 一 ^ 罘—互補核酸於程序（e)中各作為第 一及第-之模板核酸而反覆使用。 12. 如申#專利關第9項之方法，其中程序⑷、程序⑷及 程序（f)係於等溫下進行者。 20
    13·如申料利範咖項之方法，其係❹具有鏈置換能 之DNA聚合崎。 1 士士申#專#!乾圍第9項之方法，其於模板核酸為R爾 才更3有使用逆轉錄梅以合成cDNA之程序。 15·如申#專利執圍第9項之方法，其中程序⑷、程序⑷及 73 V 200413527 程序⑴係於熔解溫度調整劑存在下進行者。 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中魏解溫度調整劑 為二甲亞礙、甜菜驗、甲醯胺或甘油，或者為該等之混 合物。 5 17.如中請專利範圍第9項之方法，其中前述模板核酸中之 目標核酸序列含有非天然核苷酸。 18.=種引子，係用以合成與模板核酸中之目標核酸序列互 補之核酸者；且該引子係於3,端部分含有-序列(Ac，）， 其可與目標核酸序列之3,端部分之序列(A)雜交，且該 序列(Ac )之5側含有一序列(B，），其可與目標核酸序列 子在於車又月述序列(A)更偏5，側之序列⑻的互補序列 (Be)雜交；且 别述序列（Ac’)與前述序列(B，）間不存有 插入序列，且人— 7月，』返序列（Ac，)之鹼基數為X而目標核酸 序列中士月』述序列⑷與前述序列⑻間所挟領域之鹼基 數為¥$ d(Y)}/x係於]·00〜1.00之範圍内； 右弓I子中前述序列（Ac，)與前述序列（B，）間存有 插入序列’且令χ、γ之定義與前述者相同而該插入序 歹J之驗基數為γ’時，{χ·(γ_Υ，)沖係於-講〜1⑼之範 20 圍内。 口 兴衩板核酸中之目標核酸序 之核有中請專利範圍第Μ項之引子者。 之 20· —種引子組，作 $用以使由雙股構成之模板核酸中 核酸序列擴增者，含有·· 74 ⑷第弓I子，係於3,端部分含有一序列(Ac，），其可 與雙股模板核酸第—股中之目標核酸序狀3,端部分 的序歹j(A)4 乂’且該序列(心，)之5,側含有一序列⑽， 其可與目標核酸序列中存在於較前述序列(A)更偏5,側 之序列(B)的互補序列(Bc)雜交；且 丨卞甲1T 地斤列（Ac，）與前述序列（B，）間不存有 入序歹卜且令别述序列(Ac，)之驗基數為X而目標核酸
    /中月〕述序列(A)與前述序列(B)間所挾領域之驗基 數為料，{Χ_(Υ)}/χ係於]观〜丨⑽之範圍内； 右引子中岫述序列（Ac，)與前述序列（B，）間存有 插入序列，且令χ、 Υ之疋義與前述者相同而該插入序 列之驗基數為γ，時 十 守{χ-(Υ·Υ’）}/χ係於-1.00 〜ι·〇〇 之範 圍内； (b)第二引子，係於3,端部分含有一序列（Cc，），其可 又月又核板核酸第二股中之目標核酸序列之端部分
    直相⑹雜乂’且該序列心’⑹，側含有—序列(〇，）， /、σ &核^序列中存在於較前述序列（C)更偏5,側 之序列(D)的互補序列(Dc)雜交·，且 則述序列（Cc’）與前述序列（D，）間 :入序1且令前述序列(CV)之驗基數為χ而目 ^中⑴料邮)與前料列⑼間所挟領減 為叫，（X卿X係於请LOG之範圍内； 右引子中W述序列(Ce’)與前述序列(D， 入序列，且令X、Y之定義與前述者相同而言 75 200413527 列之鹼基數為Y’時，{X-(Y-Y’）}/X係於-1.00〜1·〇〇之範 圍内。 21. —種套組，用以使由雙股構成之模板核酸中之目標核酸 序列擴增，且含有申請專利範圍第20項之引子組。
    76
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