TWI332987B - - Google Patents

Description

1332987 九、發明說明： C ^^明戶斤屬軒々貝】 相關申請案之參照 本件專利申請案係基於先前業已申請之曰本專利申枝 案特願2〇〇3-棚〇3號（申請日：勒年丨2月25日）及特: 2004-3139H)號（申請日：2004年10月28日），並一併主張其 等之優先權。此等專利前案之全部揭示内容係、透過引用= 成為本案發明說明書之一部分。 發明領域 本發明係關於-種在基因工程領域中甚為有用之核酸 序列擴增法，更_言之，則係、關於—種利用鏈置換反應 之核酸序列擴增法，以及利用該等方法之突變檢測法。 背景技術 於基因工程領域中，可直接分析遺傳性特徵之方法， 已知有基於核酸序列互補性之分析。就此種分析而言，若 試料中存在之目標基因量甚少時，一般而言不易進行檢 測，故需預先使目標基因本身擴增。 目標基因之擴增（核酸擴增）主要係以利用DNA聚合酶 之酶性方法進行。此種酶性方法之主要者可列舉如聚合酶 連鎖反應法(PCR法；美國專利第4683195號說明書、美國專 利第4683202號說明書及美國專利第4800159號說明書），且 更有將PCR法與逆轉錄酶反應組合而成之逆轉錄PCR法 (RT-PCR 法，Trends in Biotechnology 1〇，Ppl46-152, 5 1332987 1992)。該等方法係使由三階段構成之反應反覆進行，藉此 可使來自DNA或RNA之目標基因擴增；該三階段分別為： 使模板之雙股核酸解離為單股核酸、使引子煉合至單股核 酸、以及來自引子之互補鏈合成（延伸）。該等方法中，需使 合計共三步驟（用以將反應溶液調節為各適於前述三階段 之溫度）反覆實施。 歐洲專利公開案第0320308號說明書中更揭示連接酶 連鎖反應法(LCR法），該方法係使用耐熱性之dnA連接酶以 進行一步驟之溫度循環反應（反覆進行加熱及冷卻之反 應），藉此使已知之基因序列擴增。 然而，以上所載方法均需使用高價之加熱循環器，以 便能經時性地進行廣泛溫度範圍下之嚴密溫度控制。此 外，該反應係以2至3種之溫度條件進行，因此需要調整至 各反應溫度之時間，且循環數越是增加，所須之時間越長。 為解決前述問題’可於等溫狀態下實施之核酸擴增法 正於進行開發中。該種方法可列舉如：記載於特公平 7-114718號公報之鏈置換型擴增（sdA ; strand displacement amplification)法；自立複製（3SR ; self_sustainedsequence replication)法；載於日本專利第2650159號公報之核酸序列 擴增（NASBA，nucleic acid sequence based amplification) 法，TMA(transcription-mediated amplification)法；載於曰 本專利第2710159號公報之。々複製酶法；載於美國專利第 5824517號說明書、國際公開第99/09211號手冊或國際公開 第95/25180號手冊之各種改良SDA法；載於國際公開第 6 1332987 00/28082 號手冊之 LAMP 法（Loop-Mediated Isothermal Amplification);以及載於國際公開第02/16639號手冊之 ICAN 法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acid)等。該等等溫核酸擴增法中相 關之全階段反應係同時於保持在一定溫度之反應混合物中 進行。 SDA法係於DNA最後擴增之系統中，藉著透過DNA聚 合酶與限制核酸内切酶之雙股置換，使試料中之目標核酸 (及其互補鏈)得以擴增。該方法需要4種引子，其中2種必須 設計成含有限制核酸内切酶之識別部分。此外，該方法需 以經修飾之去氧核苷三磷酸（如三磷酸部分中α位碟酸基 之氧原子被置換為硫原子（S)之去氧核苷三磷酸)作為用以 合成核酸之基質。因此，該方法需要甚高之實施成本。另， 該方法因經擴增之核酸片段中含有修飾核苷酸(如a；s置換 去氧核苷酸）’舉例言之’於將該核酸片段供予限制酶片段 長多型（RFLP ； restriction enzyme fragment length polymorphism)解析時，將有無法以限制酶切斷該擴增片段 而無法實施此種解析之情形。 美國專利第5824517號說明書中所載之改良SDA法必 須使用由RNA與DNA構成且3’端側為DNA之嵌合引子。此 種由RNA與DNA構成之嵌合引子之合成甚為困難，且處理 含RNA之引子必須具高度專業知識。另，載於國際公開第 99/09211號手冊之改良SDA法需有用以產生5,突出端之限 制酶，而載於國際公開第95/25180號手冊之改良SDA法則需 7 1332987 至少2組之引子對，因此該等方法均需甚高之實施成本。 ICAN法必須使用由DNA與RNA構成且3 ’端側為RNA 之巍合引子，更需要用以將該引子3,端側之RNA部分切斷 之RnaseH ’因此，試劑數量增加且處理時間亦增長，故不 適宜處理大量樣本。 LAMP法需要4種引子’以藉該等引子識別6個領域而可 使目標基因擴増。意即，該方法係先使第一引子煉合至模 板鏈而引起延伸反應，其次，藉著被設計於較第一引子更 上私側之第一引子所弓丨起之鏈置換反應，第一弓丨子之延長 鏈自模板鏈分離。此時，因被剝除之第一弓丨子延伸產物之 結構’迴圈結構形成在延長鏈之5,端部分。亦對雙股核酸 之另一股，或被剝除之第-引子延伸產物之3，端^進^ 其相同之反應，再反覆進行該等反應，以使目標核酸擴增。 因此，LAMP法中擴增反應之作用機制複雜，且必須選出& 個區域，而使引子之設計更為困難。再者，4種弓丨子中♦有 2種為較長鏈之引子，而使引子之合成及純化變得繁雜而試 劑調製困難。 … ° 因此，現今正迫切需要一種低實施成本、 且可使所得 核酸片段更能用於基因工程處理上之核酸擴増法。尤其更 需要一種可藉一對引子便可快速擴增之等溫核酸擴增法'。 此外，欲使用該等擴增法檢測出存在於目樑核^中之 一鹼基突變時，則產生各種問題。舉例言

私應用PCR 法之PCR-SSP法進行突變檢測時，係採用使突變之杪苷酸 含於3,端之引子，並藉擴增產物之有無以檢測突變。然而， 8 1332987 於藉此種引子之擴增反應中，突變之核苷酸與引子3,端之 核苷酸不為互補時，亦有發生錯誤而引起延伸反應之狀 況。採用PCR法時’藉引子之延伸反應而合成之雙股核酸 將作為新模板使，此時，下—個新引子所鏈合之序列並非 一開始便包含在樣本中之核苷酸序列，而是轉錄引子序列 而成者。因此，即使只進行一次錯誤的區域互補鏈合成， 該錯誤之區域便會漸次擴増，而容易產生目的以外之擴增 產物’因此難以正確地檢測一驗基突變。 再者’於PCR-SSO法中’係使可與含突變部位之區域 雜交之探針DNA與經PCR法擴增之目標擴增產物接觸，再 確認有無發生雜交，以判定目標擴增產物中有無突變。然 而，若採用此種方法，不僅雜交反應甚為耗時，且依反應 溶液之嚴苛度（stringency)而有可能引起非專一性之雜交 等’其專一性有問題而不易正確地檢查1鹼基之突變。 係應用ICAN法之突變檢測法—UCAN法中，係使用於 RNA部分中包含突變之核苷酸的dnA-RNA-DNA嵌合引 子。此種嵌合引子3’端之DNA受到化學修飾而不致引起來 自該端之延伸反應。一旦於含有此種嵌合引子及RnaseIi之 反應液中進行擴增反應，僅有嵌合引子與模板間之序列完 全相配時RnaseH引起RNA部分之截斷，而由新產生之引子 3’端開始延伸反應，模板DNA將擴增。另一方面，嵌合引 子與模板DNA間之序列不相配時，意即存有突變時，RnaseH 不引起RNA部分之截斷，嵌合引子之3’端維持化學修飾狀 態’而不引起DNA擴增。然而，ICAN法及UCAN法係與習 9 1332987 知之PCR法相同’係基於對模板中2個區域之專—性雜交而 起之擴增’其專一性仍有問題。因此，必須於擴增後更確 認所得之擴增產物是否為目標者，全反應時間増長，而至 檢查結果出現為止需要長時間。此外，修飾引子及於八弓丨 子等之合成甚為煩雜。 採LAMP法時，需要4種類以上之引子，因此容易產生 引子二聚體(primer dimer)等，更何況其需要6個專一性領 域’而使引子之設計變得非常困難。因此，必須在如何提 高核酸擴增之專一性的條件研討上花費長時間。再者，^己 載於國際公開第01/034838號手冊中以LAMP法施行之突變 檢測中，於擴增過程中產生之擴增產物_啞鈴結構之3，端中 識別出突變。於此方法中，啞鈴結構之3’端存有突變時， 來自該端之延伸反應即停止，因此而不發生目標領域之擴 增，但與PCR-SSP法相同，因3,端之〗鹼基錯配，延長反應 未必停止。此外，即使不引起來自啞鈐結構3’端之擴増， 擴增產物本身業已形成啞鈴結構，因此而形成本身之迴圈 (stem loop)結構，引子則煉合至其迴圈(1〇〇p)結構部分，因 此常有來自引子3 之延伸反應β故而非常難以有無其擴 增來識別一鹼基突變。 近年來’非常重視快速檢測基因插入及缺損等基因資 訊的診斷技術’特別是專一性地表現在癌細胞等上的 mRNA及基因標誌等的專一性檢測等，能夠簡易、迅速且 正確地解析目標基因之技術更是受到重視。

欲檢測僅專一性表現在癌細胞等特定細胞型之mRNA 10 1332987 時，一般使用之核酸試料中不僅只有目的之mRNA，而亦 混有基因組(genome)DNA。MRNA之核苷酸序列係由基因 組DNA之核普酸序列除去若干個插入(intr〇n)部分之序列 者。一般而言’ 1個intron具有數個鹼基~數百個鹼基之鏈 長。若以此種核酸試料為模板，並使用PCR法中所用之引 子’ mRNA與基因組DNA雙方都可成為模板，而自兩種模 板發生擴增。即便作使mRNA專一性擴增之引子設計，一 般而言，因mRNA之序列為基因組DNA序列之一部分，於 混有基因組DNA之核酸試料中，不僅自mRNA，連基因組 DNA亦將引起擴增。因此，無法作mRNA之專一性擴增， 使該mRNA正確後再定量出存在於試料中之mRNA量更是 困難重重。再者，欲使存有數鹼基〜數百鹼基插入或缺損之 目的核酸擴增，再確認有無其擴增產物存在時，欲以迄今 為止所用之電泳法確認目的擴增產物之帶(band)時，甚難識 別出些微之大小差異。因於臨床現場進行基因診斷時，必 須能夠簡單地於短時間内以高效率處理眾多樣本，以習知 方法並無法充分應付。 【發明内容;J 發明概要 本案發明人發現到，於利用鏈置換反應之核酸擴增法 中’將可僅於目標核酸受到擴增時形成迴圈之引子設計成 滿足特定條件，再將該引子與一5’端部分具有摺疊序列之 引子組合使用，可藉此使目標核酸具專一性地有效擴增。 本發明係本於此種真知灼見而完成者。 11 1332987 法 因此，本發明之目的在於提供—種可使目標核酸具專 性地有效擴增之引子組，以及採用該引子組之核酸擴増 故而本發明之引子組係含有可擴增目標核酸序列之至 引子而構成者；該引子組所含之第—引子係於端部 ^含有—序列(心’）’該序列(AO係與目標核酸序列3’端部 分之序列(A)雜交’且該引子組係於該序雜〇之5，側含有 -序列(B，），該序列(B，)係與序列(B)的互補序__交， 而邊序列(B)係存在於前述目標核酸序列中較該序列⑷更 偏5’側處；且則丨子组所含之第二引子係於3,端部分含有一 )忒序列（Cc’)係與該目標核酸序列之互補序列3, 知。P刀的序列(〇雜交，且該序列叹⑴，側含有一摺最序 列(d-dc，），該摺叠序列(D_Dc，)係於同一鍵上含有相互^ 之2個核酸序列。 再者，本發明之核酸擴增法係一種使模板核酸中之目 ^核^序列擴增之方法其係包含以下步驟而構成者：⑷ 準，^有目標㈣序狀模板核酸：⑼準備巾請專利範圍 第項中任項之引子組；及⑷於該模板核酸存在 該引^且進行核酸擴增反應。 糟 右依本發明，則可以DURNA作為模板，並於等溫 條件下連續合成目標核酸。因此，本發明之引子組及採用 其之核酸擴增法不需要加熱循環器等特殊 ;調=費之時間，而可於短時間内製得擴增產::再 月之弓丨子組可進行高度專一性之核酸擴增，故藉 12 1332987 著使用該引子組，可透過檢測擴增產物來判定基因中有無 突變（特减4基錢）減料《序财有無序列缺 損或插入等。 本案發明人更發現到’於利用等溫下之核酸擴增反應 (以模板中存有或不存有突變而與模板之間產生錯配之核 酸試劑施行者）的突變檢測法之中，可使該核酸擴增反應於 具有錯配識別能之物質存在下進行，可進行更正確之突變 檢測。 因此，若按照本發明之第二樣態，則可提供一種判定 核酸試料中之核酸序列有無突變之方法，其係於錯配結合 蛋白質等具有錯配識別能之物質存在下，使用可藉模板中 存有或不存有突變而與模板間產生錯配之核酸試劑，且於 等溫下進行核酸擴增反應，藉此判定核酸試料之核酸序列 中有無突變者。 【實方包冷式】 較佳實施例之詳細說明 發明之具體說明 本發明之弓丨子組ii係包含可使目標核酸序列擴增之至 夕一種引子而成者。該引子組所含第一引子係於3,端部分 3有序列(Ac’）’該序列(Ac’)係與目標核酸序列3,端部分 ^序列(八)雜$，且於該序列(Ac，)之5,側含有-序列(B，）， =序歹j(B )係與序列⑻的互補序列⑽雜交，而該序列(B) 外子在於則述目標核酸序列中較該序列(A)更偏5’側處。此 I引子、、且所含之第二引子係於3，端部分含有一序列 13 1332987 (Cc )轉列(Cc )係與該目標核酸序列之互補序列3,端部 分的序列（〇雜交，且該序列似，)之5,側含有-摺疊序列 ⑴-岭該_列(術)係於同_鏈上含有相互雜交之 2個核酸序列。 本發明中，所謂「目標核酸」或「目標㈣序列」並 非僅指欲擴増之核酸或其序列本身，也意指其互補序列或 具有該互補序列之核酸。 本發月中所明之『雜交』係指：使本發明之引子之 -部份於嚴苛條件下雜交至目標核酸，而不雜交至目標核 酸以外之核酸分子。*嚴苛條件射依本發明之引子與其 互補鏈之雙鏈融解溫灯<〇及雜交溶液之鹽濃度而加以 決定，舉例言之，可參考j. Sambr〇〇k，E f邮仇τ Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor

Lab〇rat〇ry(1989)等。例如，若於較所用引子之融解溫度略 低之溫度下進行雜交，即可使引子專一性地結合至目標核 酸上。此種引子可使用市售之引子建立軟體如

Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research社製） 等加以設計。若依本發明之較佳實施型態，則用以與某一 目標核酸雜交之引子係包含與該核酸互補之核酸分子序列 的全部或一部分。 茲將第一引子之核酸合成作用機制模式性地顯示於第 1圖。首先，決定即將成為模板的核酸中之目標核酸序列， 並決定該目標核酸序列3’端部分之序列(A)以及存於較序列 (A)更靠5’側之序列（B)。第一引子含有序列（Ac，），且更於 14 1332987 其5’側含有序列(B，）。序列(Ae，)係用以與序列㈧雜交，而 序列(B，)則係用以與序列(B)之互補序列⑽雜交。於此， 第-引子亦可於該序列(Ae’)與該序列(B，)之間含有不致影 響反應之插人序列。若使此種引子與模板核酸煉合，則引 ^中之序列（Ac’）呈現與目標核酸序列之序列（A)雜交之狀 態（第1(a)圖）。一旦於此狀態下發生？丨子延伸反應即合成 出含有目標核酸序狀互補相_1接著，存在於被 合成出之核酸5,端側的序列（B，)與存在於同才嫌中之序列 (Be)雜交’藉此而於被合成出之核酸5，端部分形成迴圈結 構。結果，模板核酸上之序列(A)成為單鏈，此部分係與具 有與先前之第-引子相同序列之其他引子雜交（第【(b) 圖）之後透過鏈置換反應，而由新雜交之第一引子發生 延伸反應，同時’先前合成出之核酸則由模板核酸分離出 (第 1(c)圖）。 於刖述作用機制中，典型上，序列(B，)與序列(Bc)雜交 之現象係因同—鏈上存有互補領域而發生。-般而言，雙 股核酸解離為單股時，將從其末端或其他較不安定之部分 開始解離。藉前述第—引子之延伸反應而產生之雙股核酸 ;才ί南ja下，末端之驗基對係處於解離與結合呈平衡之 狀態’整體維持雙股狀。於錄態下，末端解離之部分中 右互補序列存在於同—鏈上則可形成迴圈結構而呈準安 疋狀〜°亥迴圈結構並未安定地存在，但因形成該結構而 路出之互補鍵部分(模板核酸上之序列(A))將與同一引子結 °而使聚合酶即刻進行延伸反應，藉此，可於先前合成出 15 1332987 之鏈被置換而游離之同時，產生新的雙股核酸。 本發明之較佳樣態中，第一引子之設計基準係如下所 示。首先，藉由引子延伸而合成出模板核酸之互補鏈後， 為使新引子能夠高效率地煉合至同模板核酸上，必須使合 成出之互補鏈5’端形成迴圈結構而使模板核酸上之該序列 (A)的一部分成為單股。 因此’序列(Ac，)之鹼基數X與目標核酸序列中前述序 列（A)與序列（B)所挾領域之鹼基數γ之差（χ γ)相對於χ之 比例(X- Υ)/Χ甚為重要。但，存在於較模板核酸上之序列（Α) 更偏5’側且與引子雜交無關的部分則無須一併化為單股。 此外，為使新引子能高效率地煉合，必須有效率地形成迴 圈結構，即，為效率良好地進行序列(Β，)與序列（Bc)之雜 交，該序列(B，)與(Be)間之距離(X+Y)甚為重要。一般而言， 引子延伸反應之最適溫度最高亦僅止於72〇c左右，而於此 種低溫下難以使延伸鏈之長領域全部解離。因此，為使序 列（B )有效地雜交至序列(Bc)上，兩序列間之鹼基數宜少。 另—方面，為使序列(B’)與序列(Be)雜交而使模板核酸上之 則述序列（A)之部分成為單股，序列(B，)與序列間之鹼 基數宜多。 從以上觀點看來，就本發明較佳實施樣態之第一引子 而s，於構成引子之序列（Ac’)與序列⑴，）之間不存有插入 序列時，係設計成(X-Y)/X為_1〇〇以上（宜為〇 〇〇以上，更宜 為0.05以上而尤宜為01〇以上）且於1〇〇以下（宜於〇 以 下，更宜於0.50以下而尤宜於〇 25以下）。此外，（χ+γ)宜於 16 1332987 15以上（且更宜於20以上，尤宜為2〇以上而最宜為30以上） 且宜於50以下（更宜於48以下，而最宜於42以下）。 再者’構成引子之序列(Ac，)與序列（B，)之間存有插入 序列（驗基數為Y’）時’本發明較佳實施型態之第一引子係設 計成{X-(Y-Y’）}/X為-1.00以上（宜〇.〇〇以上，更宜〇 〇5以上而 尤宜0.10以上）且於1.00以下（宜於0.75以下，更宜於〇.5〇以 下而尤宜於0.25以下）。此外’（χ+γ+γ’）宜於15以上（更宜2〇 以上’尤宜30以上）且宜於1〇〇以下（更宜75以下，而最宜5〇 以下）。 該第一引子所具有之鏈長程度恰為在被賦予之條件下 可維持所必須之專一性並可進行與目標核酸間之鹼基對結 合者。此引子之鏈長宜為15〜1〇〇個核苷酸，且更宜為2〇〜6〇 個核苦酸。再者，用以構成該第一引子之序列(Ac，)與序列 (B’）的長度各宜為5〜50個核苷酸，且更宜為7~30個核芽 酸。此外，亦可依需要而於序列（Ac，)與序列（B，）間插入不 致影響反應之插入序列。 如前所述’本發明引子組所含之第二引子係於3,端部 分含有一序列(Cc’）’該序列(Cc’)係與前述目標核酸序列之 互補序列（位於第一引子所雜交之鏈之相反側的鏈)3,端部 分的序列（C)雜父’且於該序列（Cc，）之5’側上含有指疊序列 (D-Dc ’）’該摺疊序列（D-Dc，)係於同一鏈上含有相互雜交之 2個核酸序列。此種第二引子之結構係如第2圖所示，但並 不限於第2圖所示之序列及核苷酸數。構成第二引子之序列 (Cc，）長度宜為5〜50核苷酸，更宜為1〇〜3〇核苷酸。此外，該 17 序列（D4V)之長度則宜扑漏核㈣且較寬為 0核苷酸，更宜為4〜60核苷酸，而尤宜為6〜4〇枝苷酸； 於摺疊序列内部藉雜交而形成之驗基㈣核#酸數宣為 2〜5_Ρ ’且較宜為2〜5〇bp，更宜為2〜30bp而最宣為 3~2, °摺疊序列(D-Dc’)之核皆酸序列可為佐何形式之序 列，並未受到特別限制，但宜為不與目標核酸序列雜交之 序列。此外，亦可依需要而於序列(Cc，)與摺疊序歹仰必，) 之間插入不影響反應之插入序列。 茲使用第3圖（第3a、3b圖）’針對以該等第—引子及第 引子貫苑之核酸擴增反應，將其可慮及的作用機序說明 於后。此外，第3圖中，為簡化說明而令雜交之2個序列為 補序歹j但本發明並不受限於此。首先，第一引子雜交 至目枯核醆之正意鏈而發生該引子之延伸反應（第3(a) 圖）。接著，於延伸鏈(-)上形成迴圈結構，藉此，新的第一 引子雜交至呈單股之目標核酸正意鏈上的序列（A)(第3(b) 圖）並發生該引子之延伸反應，先前合成之延伸鏈(-)則脫 離。其次’第二引子雜交至已脫離之延伸鏈（-)上的序列 第3(c)圖）’並發生該引子之延伸反應，而合成出延伸鏈 ( + )(第3(d)圖）。已產生之延伸鏈（+ )之3,端與延伸鏈(-)之5, 知形成迴圈結構（第3(e)圖），而由係游離型之3’端的延伸鏈 (+ )之迴圈前端發生延伸反應，同時，該延伸鏈㈠脫離（第 3(f)圖）。因來自迴圈前端之該延伸反應，而產生髮夾型之 雙股核酸，該雙股核酸係延伸鏈㈠透過序列(A)及序列(Bc) 結合至延伸鏈（+ )3’側而成者，第—引子雜交至該序列（A)

18 1332987 及序列(Be)(第3(g)圖），並藉其延伸反應而產生延伸鍵(_)(第 3(h)及3(1)圖）。此外’透過存在於該髮夾型雙股核酸端之 摺疊序列而提供—遊離型之3,端（第3(h)圖），再透過來自該 處之延伸反應（第3⑴圖），而產生―於兩端具有摺疊序列: 且透過來自第-及第二引子之序列而交互地含有延伸鍵 (+ )與延伸鏈㈠的單股核酸（第3⑴圖）。為使該單股核酸藉 著存在於其3’端之摺疊序列而提供遊離型之3，端（互補鏈合 成起點）（第3(k)圖），反覆同樣之延伸反應，且每次延伸反應 後鏈長成為2倍（第3(1)及3(m)圖）。此外，第3(i)圖中，已呈 脫離之來自第一引子之延伸鏈㈠上，為藉存在於其3，端之 摺疊序列而提供遊離型之3,端（互補鏈合成起點）（第3(n) 圖），而以來自該處之延伸反應，於兩端形成迴圈結構，並 透過來自引子之序列而產生一交互地含有延伸鏈（+)與延 伸鏈(-)的單股核酸（第3(〇)圖）。該單股核酸亦於3,端形成迴 圈而依次提供互補鏈合成起點，而依序地發生來自該等起 點之延伸反應。如前述般自動延長之單股核酸上，因於延 伸鏈（+ )與延伸鏈(-)之間含有來自第一引子及第二引子之 序列，可使各引子雜交而引起延伸反應，藉此，目標核酸 之正意鏈及反意鏈可顯著地擴增。 本發明之引子組除第一引子及第二引子以外，更可含 有第三引子。第三引子係用以與該目標核酸序列或其互補 序列雜交者，且對目標核酸序列或其互補序列雜交時不與 其他引子競爭。 本發明_，所謂「不競等」係指，該引子不因與目標 19 1332987 核酸雜交而妨礙其他引子產生互補鏈合成起點。 藉第一引子及第二引子使目標核酸擴增時，如前述 般，擴增產物為交互地含有目標核酸序列與其互補序列 者。該擴增產物之3’端存有摺疊序列或迴圈結構，且由該 等所提供之互補鏈合成起點依序發生延伸反應。第三引子 係於此種擴增產物有一部分成為單股狀態時，煉合至存在 於該單股部分之目標序列。藉此，擴增產物中之目標核酸 序列内可提供新的互補鏈合成起點，並由此處發生延伸反 應，而可使核酸擴增反應更迅速地進行。 第三引子並不限定僅有1種，為使核酸擴增反應之迅速 性及專一性提高，亦可同時使用2種以上之第三引子。該等 第三引子於典型上係由與第一引子及第二引子不同之序列 所構成，但於不與該等引子競爭之前提下，亦可為雜交至 部分重疊領域者。第三引子之鏈長宜為2~100核苷酸，更宜 為5~50核苷酸，而最宜為7〜30核苷酸。 第三引子係使第一引子及第二引子之核酸擴增反應更 迅速進行，而以辅助作用為其主要目的。因此，第三引子 宜具有較第一引子及第二引子之各3’端更低之Tm。此外， 第三引子對擴增反應液之添加量宜較第一引子及第二引子 各自的添加量少。 第三引子可列舉如國際公開第02/24902號手冊所記載 般，以具有可形成迴圈之結構者為模板，再以其迴圈部分 賦予互補鏈合成之起點者，但並不限於此。意即，可於目 標核酸序列内之任何部位提供互補鏈合成起點者均可。 20 本發明之引子組中所含好係*去氧核㈣及/或核 騎核芽酸所構成。本發明中，「核_酸」(亦可僅稱為 「N」）係指核醣核苷三磷酸，如atp、utp、ctp gti^。 此外，核醋核《更包含該等之衍生物，如α位磷酸基之 乳原子被硫原子喊而成之核㈣㈣（α _硫代·核骑核苦 酸）等。 再者，前述引子亦包含：未修飾去氧核苷酸及/或修飾 去氧核#酸所構狀寡核*酸引子；未修飾制核普酸及/ 或修飾核醣核苷酸所構成之寡核苷酸引子；以及含有未修 飾去氧核苷酸及/或修飾去氧核苷酸及未修飾核醣核苷酸 及/或修飾核醣核苷酸之嵌合寡核苷酸引子等。 本發明之引子組所含引子可藉任何可運用於合成寡核 苷酸之方法而合成出，如磷酸三酯法、沁膦酸鹽法及硫代 膦酸鹽法等。舉例言之，本發明之引子若藉一使用ΑΒΙ社 (Applied Biosystem Inc.)之 DNA 合成儀 394 型的 phosphoramidite法進行合成’則可輕易取得。 用於核酸擴增反應之含有目標核酸序列的模板核酸或 核酸試料可為DNA或RNA。DNA包含cDNA'基因組DNA 及合成DNA中之任一者。RNA則包含全rna、mRNA、 rRNA、siRNA、hnRNA及合成RNA中之任一者。舉例言之， 該等核酸可由下述試料離析取得，即：取自企液、組織、 細胞或動植物專活體之試料，或’從食品、土壤及排水等 分離出之取自微生物之試料。 模板核酸或核酸試料之離析可藉任意方法進行，舉例 21 1332987 言之，可採用藉界面活性劑之溶劑處理、音波處理、使用 玻璃珠之振盪攪拌及高壓破碎(Franch press)等。此外，存 有内在性核酸酶時，宜將已離析之核酸純化。舉例言之， 核酸之純化可藉苯酚抽提、柱色層分析法、離子交換、凝 膠電泳及按照禮度之離心分離等方法實施。 更具體言之’前述模板核酸或核酸試料可使用藉前述 方法離析出之基因組DNA及PCR片段等雙股核酸，或使用 藉逆轉錄反應由全RNA或mRNA調製出之cDNA等單股核 酸。於使用前述雙股核酸時，可藉變性步驟(denaturing)令 其為單股而更適於利用。 用於前述逆轉錄反應之酶僅需為以RNA為模板且具有 cDNA合成活性者即可，可列舉如來自烏類骨髓母細胞症病 毒之逆轉錄酶（ATV RTase)、Raus關連病毒2逆轉錄病毒 (RAV-2 RTase)、來自Molonery鼠白血病病毒之逆轉錄酶 ，(MMLV RTaes)等各種來源之逆轉錄酶。此外，亦可使用一 併具有逆轉錄活性之DNA聚合酶。另，為達成本發明之目 的，於尚溫下具有逆轉錄活性之酶最為適合，可使用如來 自嗜熱屬菌株之DNA聚合酶(TthDNA聚合酶等）以及來自 桿菌屬菌株之DNA聚合酶等。若例示最理想之酶，則來自 嗜熱性桿菌屬菌株之DNA聚合酶可列舉如取自B. st之DNA 聚合酶(Bst DNA聚合酶），及取自B_ ca之DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶）(如BcaBEST DNA聚合酶與Bca(exo-)DNA聚 合酶）等。舉例來說，Bca DNA聚合酶於反應時不需錳離子 而可於高溫條件下抑制模板DN A形成二次結構並合成出 22 1332987 cDNA。 於核酸擴增反應中’即使於模板核酸為雙股核酸時， 亦可將其直制岐射，但亦可依需要使料變性成單 股，藉此使引子有效率地煉合至模板核酸。使溫度上升至 約95度為理想之核酸變性法。其他方法中，亦可使pH上升

以進行變性’但此時為侍引手雜交5 B π句1定引卞雜又至目才示核酸，需使pH值 降低。 用於核酸擴增反應之聚合酶僅需為具有鍵置換⑽㈣ displacement)活性(鏈取代能）者即可，可使用具長溫性中 溫性或耐熱性者。此外，該聚合酶可為天然體或施加人造 大變之突變體。此種聚合酶可列舉如Dna聚合酶。更詳言 之，该DNA聚合酶宜為實質上不具5，__^3’外切酶活性者。 此種DNA聚合酶可列舉如來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacmus stearothermophilus，以下稱為「Β· st」）、Bacillus

caldotenax(以下稱為「b. ca」）等嗜熱性桿菌屬菌株之DNA 聚合酶的欠缺5’—3’外切酶活性之變異體，以及來自大腸桿 囷（E. coli)之DNA聚合酶I之克來諾片段（Klenow fragment) 等。核酸擴增反應所用之DNA聚合酶更可列舉如Vent DNA 聚合酶、Vent (Exo-) DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、 Deep Vent (Exo-) DNA聚合酶、Φ 29嗟菌體DNA聚合酶、 MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-Tag DNA聚合酶、Pfu DNA聚 合酶、Pfu turbo DNA 聚合酶、KOD DNA 聚合酶、9°Nm DNA 聚合酶及TherminaterDNA聚合酶等。 此外，前述核酸擴增反應中，更可使用同時具有逆轉 23 1332987 錄活性之DNA聚合酶（如BcaBEST DNA聚合酶、 Bca(exo-)DNA聚合酶等），而可藉單種聚合酶進行全rna或 mRNA之逆轉錄反應及以cDNA為模板之DNA聚合酶反 應。此外，可將DNA聚合酶與MMLV逆轉錄酶等前述逆轉 錄酶組合使用。 核酸擴增反應中所採用之其他試劑可列舉如：氣化 鎂、乙酸鎂及硫酸鎂等催化劑；dNTP混合物等基質；以及 三鹽酸緩衝液、酪胺酸緩衝液、磷酸鈉緩衝液及磷酸鎂緩 衝液等緩衝液。更可使用二甲亞颯(dimethyl sulfoxide)及甜 菜鹼(N，N，N-trimethylglycine)等添加物及載於國際公開第 99/54455號手冊之酸性物質及陽離子錯體。 於核酸擴增反應中，為使核酸之擴增效率提高，亦可 將熔解溫度調整劑添加至反應溶液中。一般而言，核酸之 ’熔解溫度（Tm)係以核酸中形成雙股部分之具體核苷酸序列 來決定。可於反應溶液中添加熔解溫度調整劑而使熔解溫 度變化，因此而可於一定溫度下調整核酸中形成雙股之強 度。通常之溶解溫度調整劑具有使炫解溫度下降之效果。 可添加此種熔解溫度調整劑以使二個核酸間之雙股形成部 分的熔解溫度下降，換言之，即可使形成該雙股之強度下 降。因此，若於該核酸擴增反應中添加此種溶解溫度調整 劑，則可於形成堅固雙鏈之GC豐富的核酸領域、及形成複 雜二次結構的領域中使雙股部分有效地化為單股，藉此， 可於引子延伸反應結束後，使後續之引子容易地雜交至目 標領域，進而提高核酸之合成效率及擴增效率。熟習相關 24 技術者自可考量影響雜交條件之其他反應條件，如鹽濃度 及反應溫度等，而選擇本發明中採用之炫解溫度調整劍及 其於反應溶液中之濃度。因此，炼解溫度調整劑雖無特別 限制，但宜為二甲亞颯(DMSO)、甜菜鹼、甲醯胺或甘油， 或者該等之任意組合，且更宜為二甲亞颯⑴MS〇)。 再者，於核酸擴增反應中，亦可將酶安定化劑添加至 反應溶液。藉此，可使反應中之酶更為安化，而提高核酸 之合成效率及擴增效率。本發明中採用之酶安定化劑可為 甘油、牛血清白蛋白及糖類等，可為相關領域中任何已為 人知者，並未特別受到限制。 此外’核酸擴增反應中，亦可於反應溶液中添加用以 增強DNA聚合酶及逆轉賴等酶之耐熱性之試劑。藉此， 因反應液中之酶安定化，可提高核酸之合成料賴增效 率。此種試劑可為相關技術領域中贿已為人所知者， 切別受職制，但线_，且較宜為料或寡糖， 更宜為海藻糖、山梨糖醇或甘露糖醇，或者是該等之2種 並 而 上混合物 探用本發明引子組之核酸擴增反應可於等溫下實施。 =下=τ之較佳實施樣態，則該核酸擴增反應包 叮㈣’即：準備—核酸擴增用溶液 ，酸或核酸試料及本發明之引子組;及，4= 而前述核酸合成溶液含有模板核酸與本發明: 於實質等溫』係指保持在—種可使酶與引子 、、、作用之大致固定的溫度條件下。而，「大致固定 25 之皿度條件」不僅只意指正確地保持所設定之溫度，亦意 味著其容許不損及酶與引子之實質機能程度的溫度變化。 可藉著保持一可維持所用酶活性的溫度而實施於一定 派度條件下的核酸擴增反應。此外，於該核酸擴增反應中， 為使引子煉合至目標核酸上，舉例言之，宜將反應溫度設 定在该引子之熔解溫度(Tm)左右，或設定為較其更低之溫 度；更可考量引子之熔解溫度來設定嚴苛條件之程度。因 此，该溫度宜為約2〇。〇〜約75°C，更宜為約35°C至約65°C。 於前述核酸擴增反應中，擴增反應係反覆進行至酶失 去活性、或以引子為首之試劑之任一者用盡為止。 於前述核酸擴增反應中，亦可以含有非天然核醣核苷 酸之核酸作為模板核酸。本發明說明書中，『非天然核醣核 苷酸』係指：含有天然核苷酸所含鹼基(腺嘌吟、鳥嗓吟、 胞嘧啶、胸腺嘌呤或尿嘧啶）以外之鹼基的核醣核普酸，並 將其置於核酸序列中者；舉例言之，如黃°票吟類、二胺基 嘴咬類、isoG、isoC(Proc，Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333，1995)等。一般而言，擴增含非天然核苷酸之目 標核酸係使用不具耐熱性之核酸擴增酶。另—方面，舉例 言之，本發明之核酸合成方法及核酸擴增方法可於5〇°C左 右之等溫下進行，因此，與習知之PCR法相較^，核酸擴 增酶（如DNA聚合酶等）失去活性之可能性較低。因此，本 發明之引子組核酸擴增反應對於使用不具耐熱性之核酸擴 增酶且含非天然核醣核苷酸之目標核酸擴增而言亦有效 果。用於使含非天然核醣核苷酸擴增之酶僅需為可使此種 26 1332987 目標核酸擴增者即可，並未受到特別限制，若特別從置入 效率之觀點看來，則Y188L/E478Q變異型HIV I逆轉錄酶、 AMV逆轉錄酶、DNA聚合酶之克萊諾片段、9亡dna聚合 酶及HotTub DNA聚合酶等甚為理想（參照Michael Sism〇ur 1 et al.’ Biochemistry 42, Νο·28, 8598, 2003/美國專利第 6617106號說明書、Michael j. Lutz et al.，Bi00rganic & Medical Chemistry letters 8, 1149-1152, 1998等）。更可於反 應溶液中添加用以提高核酸擴增酶之耐熱性之物質（如海 藻糖等）’藉此可更有效率地進行含非天然核醣核苷酸之目 標核酸擴增。 以本發明之核酸擴增法獲得之擴增產物可藉各種方法 檢測出其存在。其中一種方法為藉通常之凝膠電泳法測出 特定尺寸之擴增產物。舉例言之，該方法可藉溴化乙錠 (ethidium bromide)及Cybergreen等螢光物質進行檢測。至於 其他方法則亦有使用具生物素等標誌之標誌探針，使其與 擴增產物雜交以進行檢測者^可藉生物素與已螢光標誌之 抗生物素蛋白以及已結合至過氧化酶等檢測出生物素。此 外，其他方法亦有使用免疫色層圖譜之方法。該方法係使 用枉色譜媒介(利用可以肉眼檢測之標誌)者（免疫色層分析 法）。若使該擴增片段與標誌探針雜交，再使該擴增片段之 更可與不同序列雜交之捕捉用探針固定在柱媒介上，則可 以該固定之部分進行補捉，而可於柱媒介中進行檢測。結 果，便可以肉眼進行簡易之檢測。 此外，若採用本發明之核酸擴增法，因核酸擴增反應 27 1332987 之擴增效率非常咼’而可利用擴增時產生之副產物β比哈 琳，間接地檢測出擴增產物。此種方法可列舉如：β比哈淋 酸將與反應溶液中之鎂結合而產生π比略啭酸鎮之白色沉 澱，利用其此點並以目測觀察反應溶液之白濁程度。此外， 其他方法另有：η比咯啉酸將與鎂等金屬離子強固結合而形 成不溶性鹽，因此反應溶液中之鎂濃度將顯著減少，再利 用此一性質之方法。於此方法中，可於反應溶液中預先添 加—隨鎂離子之濃度而色調發生變化之金屬指示藥（如

Enochrome Black Τ、Hydroxy Naphthol Blue 等）’再以目測 觀察反應溶夜之顏色變化，藉此檢測出擴增之有無。另外， 亦可利用Calcein等而以目測觀察到伴隨擴增反應之螢光增 大，而可實時(real time)地檢測擴增產物。 若依本發明之較佳實施樣態，則亦可觀察因擴增產物 之產生而起的固態載體凝集來檢測出以本發明之核酸擴增 法製得之擴增產物的存在。進行此種檢測時，則令本發明 之引子組中所含之至少i種引子係包含一固態載體或可與 固態載體結合之部位。固態載體或可與固態載體結合之部 位可導入至引子之3’端部分、5,端部分及中央領域等任何部 位，但較宜導入5’端部分。或者，亦可使用於核酸擴增反 應之基質含有固態載體或可與固態載體結合之部位。 用於本發明之固態載體可使用不溶於核酸擴增反應所 用反應溶液之載體，或者於擴增前後性狀由液態轉變為固 態（凝膠相）或由固態（凝膠相）轉變為液態的態轉移性載 體。較佳之固態載體載體可列舉如非水溶性有機高分子载

D 28 1332987 體、非水溶性無機高分子載體、合成高分子載體、態轉移 性載體、金屬膠體及磁性粒子等。更可列舉如溶劑不溶性 有機高分子載體、溶劑不溶性無機高分子載體、溶媒可溶 性高分子載體及凝膠高分子載體等。另外，非水溶性有機 高分子可列舉如多孔質二氧财、多孔f玻璃、石夕藻土及 铈矽石（cerite)等含矽物質、硝基纖維素、羥基磷灰石、瓊 脂糖、糊精、纖維素及羧甲基纖維素等多糖類交聯體、甲 基化白蛋白、明膠、膠原蛋白及酪蛋白等蛋白質交聯體、 凝膠狀粒子以及染料轉等。非水雜無機高分子可列舉 如氧化鋁、氧化鈦及陶瓷粒子等。合成高分子可列舉如聚 苯乙稀、聚（甲基)丙稀酸醋、聚乙烯醇、聚丙稀猜或該等之 共聚合物、笨乙稀-苯乙稀項酸共聚合物、乙酸乙稀醋丙稀 酸醋共聚合物等。金屬膠體可列舉如金膠體等。磁性粒子 可列舉如磁性氧化鐵之小球、料面具有觀氧化鐵之微 粉碎粒子的單分散超常磁性粒子（特表平Μ義9號公 報）、具有崎合性魏⑦覆膜包覆之超常魏氧化鐵的磁 反應粒子（特公平7.6986號公報）以及被封入有機聚合物中 之微粉末狀可磁化粒子等。經磁化之固態载體可利用磁力 而簡單地進行固體與液體之分離。固態載體之形狀可列舉 如粒子、膜、纖維狀及過料等。固態載體之形狀特別宜 為粒子’其表面可為纽質或非多孔f 1卿想之固態 載體可列舉如，使合成高分子載體均勻分散於水等中而成 之乳膠、金膠體等之金屬膠體粒子以及磁性小球等磁性粒 子等。 29 1332987 引子或基質對固態載體之固定化可藉當業者習知之方 法進行，可為物理性結合或化學結合之方法。舉例來說， 一般係使引子或探針等可將寡核苷酸標記化之物質以及業 已結合有可與該物質結合之固態載體相互組合，而可進行 引子或基質對固態載體之固定化。用於此種目的之物質組 合可採用該技術領域所周知者，例如，生物素與卵白素或 鏈卵白素之組合、抗原與可與其結合之抗體的組合、配體 與可與其結合之受體的組合以及相互雜交之2個核酸的組 合等。具體言之，例如，可使經生物素標誌之引子或基質 與表面經卵白素或鏈卵白素包覆之固態載體結合，而使引 子或基質固定於固態載體上。前述抗原可列舉如FITC、DIG 及DNP等半抗原（hapten)，而可與該等結合之抗體可列舉如 抗FITC抗體、抗DIG抗體及抗DNP抗體等抗體。此外，該 等抗體可為單株抗體或多株抗體。為了使生物素與鏈卵白 素之結合的專一性高且結合效率良好，該等之組合特別理 想。生物素、半抗原及配體等標誌物質均可以單獨或依需 要而組合多數，以習知手段（參照特開昭59-93099號公報、 特開昭59-148798號公報及特開昭59-204200號公報）而導入 至引子之5’端。 可與本發明所用固態載體結合之部位（或基）係可依前 述用以使引子或基質對固態載體固定化之方法加以選擇， 因此，僅需為可與固態載體作物理結合或化學結合者即 可，且宜可專一性結合。此種可與固態載體結合之部位可 列舉如上述之生物素、卵白素、鏈卵白素、抗原、抗體、

30 1332987 配體又體、核醆及蛋白質等，且較宜為生物素或鏈卵白 素’而更宜為生物素。藉著採用含有此種部位之引子或基 貝’而可於進行核醆擴增反應後使前述固態載體結合至擴 增產物。可依需要而令此時所用之m態載體為包含與引子 或基質所含該部位之結合對象者。此種結合對象係以可與 引子或基質所含之該部位結合的形式存在，且較宜為存在 於固態載體之表面上者，而更宜為塗佈於固態載體之表面 上者。 若依本發明之一實施態樣，則針對多數之各目標核酸 來準備本發明之引子組，並使該等多數之引子組以可相互 識別之形式固定於固態載體，再使用該等固定化引子組進 行核酸擴增反應。藉此，可使多數目標核酸同時擴增，並 以可識別各擴增產物之形式進行檢測。可使用内校正劑 (inter-corrector)等以進行擴增產物之檢測。舉例言之，於平 面狀之固態載體上，預先使多數引子各自固定於特定位 置’藉此於核酸擴增反應及檢測擴增產物後，透過檢測出 之擴增產物位置特定出受到擴增之目標核酸。此外，可用 於此種目的之固態載體不僅有前述平面狀之固態載體，亦 可為可相互識別之小球狀表面（美國專利第6046807號說明 書及美國專利第6057107號說明書），及使各引子組固態化 於纖維狀載體再成束後截斷成薄片而製出準平板載體（曰 本特開2000-245460號公報）等，製為該技術領域中之已習用 公知者。 本發明之核酸擴增法所獲得之擴增片段係由一般之鹼 31 1332987 基構成，因此，於擴增後，亦可使用擴增片段内部之制限 酶部位而分殖(subcloning)至適當之載體。再者，前述擴增 片段亦如RFLP般可採制限酶處理，也可廣泛利用於基因檢 測之領域中。此外’前述擴增片段亦可作為含有rNa聚合 酶之啟動子序列者而使其產生，藉此，可由擴增片段直接 合成RNA。如前述般合成之rNa亦可用作rna探針及 siRNA 等。 此外’本發明之核酸擴增法中，亦可使用經藉生物素 或螢光物質標誌之鹼基取代一般之dNTP而作為基質，藉此 可製得業經生物素及螢光物質標幟之DNA探針。再者，可 透過該等生物素或標誌物質等之某種結構來確認有無擴增 產物。 本發明之引子組所含引子可製為含有制限酶識別部位 者’可藉此提高核酸擴增效率。即，藉者與引子内之制限 酶識別部位對應之制限酶而於擴增產物產生缺口（nick)，因 此可以該缺口作為合成起點而產生鏈置換型之互補鏈合成 反應。基本上，此方法係依先行技術所記載之SDA法原理， 但本發明中作為模板之核酸係如第3(m)及3(0)圖所示，係呈 使互補核酸交互連結而成之結構，此點則有所不同。此方 法中’成為放有缺口之逆轉引子之互補鏈的部分必須設計 成不因制限酶而產生雙股截斷，且攝有(1]^11>衍生物而具有 水解酶（nuclease)財性。 此外’本發明引子組所含引子可製為含有rna聚合酶 之啟動子序列者’可藉此提高核酸擴增效率。基本上，此

32 1332987 方法係依先行技術所記載之NASBA法原理，但本發明係由 第3(m)圖所示般之長鏈擴增產物開始進行可識別該啟動子 之RNA聚合酶所引起之轉錄，引子容易與轉錄產物之單股 RN A結合’故而可提高擴增效率。 再者，本發明之引子組可為包含用於LAMP法或SDA 法之「外引子(outer primer)」，藉此以提高核酸擴增效率。 外引子可使用一可於模板核酸上且位在目標核酸序列外側 之部分提供互補鏈合成起點之引子。 藉本發明之核酸擴增法，可簡便且迅速地製作用以固 定於DNA晶片之單股核酸、用以決定鹼基序列之單股DNA 探針 '用在長鍵PCR法之巨引子(megaprimer)等。另外，若 以本發明之核酸擴增法，亦可依目的而選擇性地僅使目標 核酸之正意序列或反意序列擴增。 本發明之核酸擴增方法所製得之單股核酸可作為用以 固定於DNA晶片上之DNA片段加以使用。即，本發明之核 酸擴增方法亦可應用在製成DNA鏈之方法上，該DNA鏈係 於製作DNA晶片時用以固定化者。再者，亦可預先將引子 之5’端固定於DNA晶片上’再於該晶片上進行核酸擴增製 作DNA晶片。另，若於進行該核酸擴增前預先於反應液中 添加用以與擴增產物雜交之螢光標誌探針，則可於DNA晶 片上進行核酸擴增之同時，實時(real-time)地檢測擴增產 物。 可利用採用本發明引子組之核酸擴增反應，而判定出 核酸試料中之核酸序列有無突變。為了達成此目的，可將 33 1332987 引子組設計成突變部位係包含在該序列(A)、序列（B)或序列 (C)中，藉此以確認有無擴增產物來判定有無前述突變。因 此’若依本發明，則可提供一種一種用以判定核酸試料中 之核酸序列有無突變之方法，係包含以下步驟而構成者： (a)準備核酸試料；（b)準備本發明之引子組’該引子組被設 計成：以具有該突變或不具該突變之核酸序列為目標核酸 序列，且使與該突變相關之核苷酸殘基包含在序列(A)、序 列（B)或序列（C)中者；（c)於該核酸試料存在下以該引子組 進行核酸擴增反應。 本發明之突變檢測法中，使用一係設計成以具有目標 突變之核酸序列作為目標核酸序列的引子組時，核酸擴增 反應後存在擴增產物即表示該突變存在，擴增產物不存在 或減少則表示該變異不存在。另一方面，使用一係設計成 以不具有目標突變之核酸序列作為目標核酸序列的引子組 時，核酸擴增反應後存在擴增產物表示該突變不存在，而 擴增產物不存在或減少則表示該突變存在。於此，所謂「擴 增產物減少」係指，所得擴增產物之量較核酸試料中存有 目標核酸序列時所得之擴增產物量更少。 本發明中之「突變」係指，核酸序列令存有與對照核 酸^列不同之鹼基（雙股核酸時為鹼基對）。此外，本發明中 之「對照核酸」係指’有關某特定之驗基序列，具有標準 ^基序列(如標準基因型）之野生型(wild type ;亦稱為正常 尘（no^mal type))序列的核酸。相對於此，「被測核酸」係指， 於本心月之突變檢測法中，成為調查有無與對照核酸相異 34 1332987 鹼基（突變）之對象核酸，換言之，意指著係存在於核酸試料 中、且具有突變鹼基除外之與對照核酸相同序列的核酸。 再者，本發明中之「突變鹼基」或「突變核苷酸殘基」係 指存在於核酸中之突變部位的驗基或核苷酸殘基，因此， 亦意味著包含在對照核酸突變部位之驗基或核苷酸殘基以 及包含在突變型核酸之突變部位的鹼基或核苷酸殘基。舉 例言之，欲檢測出疑似有遺傳疾病之患者的基因中之突變 時’疑似有突變之患者基因即是被測核酸，而與該基因對 應之健康正常人之基因為對照核酸。 前述被測核酸及對照核酸可為取自天然物之核酸，亦 可為人工合成之核酸。本發明中所用之「核酸」一語係指 含有任意未修飾核苷酸及/或修飾核苷酸之聚核苷酸。被測 核酸及對照核酸典型上為cDNA、基因組DNA及合成DNA 等DNA，或是mRNA、全RNA、hnRNA、siRNA及合成RNA 等RNA。此外，本發明所用之「聚核苷酸」一語，為方便 起見而令其包括聚核苷酸及寡核苷酸以及胜肽核酸、嗎啉 核酸、膦酸鹽核酸及5_寡核酸等人工合成核酸。試驗實施 者可自由選擇被測核酸及對照核酸。此外，進行檢測時， 該等核酸亦可混合存在。 若依本發明之一實施樣態，則本發明之突變檢測法之 步驟(b)中’係準備一被設計成突變之核苷酸殘基係包含於 前述序列（A)的引子組。該實施樣態中，核酸試料中包含有 目標核酸序列時，因核酸擴增反應中第一引子係煉合至序 列(A)而可獲得擴增產物。核酸試料中於突變部位含有與 35 目標核酸序列不同之核酸序列時，因核酸擴增反應中第一 α難以煉。至序列(A)，不是無法獲得擴増產物就是所 2之擴增產物量縣減少。突變㈣酸聽宜包含於前述 列⑷之5’端（與第-引子之3,端對應）。此外，第-引子 所含序列(Ae’）宜為與該序列(A)互補之序列。 ，若依本發明之其他貫施樣態’本發明之突變檢測法之 步驟附，鱗備_設計成使突變之核苦酸殘基包含於前 述序列(C)中之引子組^該實施樣態中，核酸試料中含有目 標核酸序列時’因核酸擴增反應中第二引子煉合至序列(C) 而可獲得擴增產物。核酸試料中，突變部位包含與目標核 酸序列不同之核酸序列時，核酸擴增反應中第二引子難以 煉合至序列（C) ’不是無法獲得擴增產物，就是所得擴增產 物之量顯著減少。突變之核苷酸殘基宜包含於該序列（c)之 5’端（與第二引子之3,端對應）。另外，第二引子所含序列（CC，) 宜為與該序列（C)互補之序列。 若依本發明之其他實施樣態，本發明之突變檢測法之 步驟(b)中’係準備一設計成使突變之核苷酸殘基包含於前 述序列(B)中之引子組。該實施樣態中，核酸試料中含有目 標核酸序列時，於核酸擴增反應中，第一引子煉合至序列 (A)並進行延伸反應後，該引子所含之序列(B，)將與延伸鏈 上之序列(Be)雜交，而有效率地形成迴圈結構。藉著此種 有效率的迴圈結構形成，其他第一引子可煉合至模板上， 而有效率地進行第1圖所示之作用機制’因而可獲得擴增產 物。另一方面，核酸試料中，突變部位含有與目標核酸序 36 1332987 列不同核酸序列時，核酸擴增反應中難以形成前述迴圈結 構，第1圖所示之作用機制受到妨礙’故而不是無法獲得擴 增產物，就是所得擴增產物之量顯著減少。此外，第一引 子所含序列(B’）宜與該序列(B)為相同序列。 茲針對前述序列（B)中之突變檢測更詳細地說明如 下。第1圖所示作用機制中，序列（B，）與序列（Bc)雜交之現 象係因同一鏈上存有互補領域而引起者。一般而言，雙股 核酸解離為單股時，係由其末端或除此以外之較不安定部 分開始部分解離。因第一引子之延伸反應而產生之雙股核 酸於較尚溫下其末端部分之驗基對係呈解離與結合之平衡 狀態，而整體上保持雙股。於此種狀態下，若與末端解離 部分互補之序列存在於同一鏈上，則可形成一呈準安定狀 態之迴圈結構。然而，該迴圈結構無法安定存在，特別是 在形成該迴圈之序列（B’)與序列（Bc)部分間存有非互補核 苦酸時’將變得非常不安定’甚或完全無法形成迴圈。此 時，模板上之序列(A)與引子中之序列(Ac，）的雜交成為優先 者，序列(A)之部分無法成為單股，而使下一個第一引子變 得無法煉合。因此，欲引起第1圖所示之連續反應變得極為 困難。 含有被測核酸之核酸試料可由被測體（如人類或非人 類）之動物取得。此時，可藉該技術領域中之習知方法，由 取自該被測體之所需組織、臟器及細胞等樣本中粹取核 酸，亦可依需要而於進行粹取後將核酸片段之大小及純化 純度等條件調整到適度狀態。之後，更可以一般之聚合酶 37 1332987 連鎖反應(PCR)等進行擴增反應，藉此使核酸試料中之被測 核酸擴增。 被測核酸及對照核酸可為單股或雙股者。本發明中所 用之「雙股核酸」一語係表示雙股DNA、雙股RNA及 DNA/RNA中之任一者。雙股核酸可直接用作為核酸試料， 亦可採用經噬菌體或質體等載體而擴增者。 若依本發明之較佳實施樣態，則本發明之突變檢測法 中之核酸擴增反應係於錯配識別蛋白質存在下進行，可藉 此而更正確地檢測出突變。 於DNA之雙股上產生有部份無法對合（錯配）之鹼基對 時，已知細菌及酵母等具有用以將其修復之機構。此種修 復係透過一稱為「錯配結合蛋白質」（亦稱為「錯配識別蛋 白質」）之蛋白質進行者，已有報告使用MutS蛋白質（曰本 特表平9-504699號公報）、MutM蛋白質（曰本特開 2000-300265 號公報）以及結合至 GFP(Green Fluorescence Protein)之MutS蛋白質（國際公開第99/06591號手冊）等各種 錯配結合蛋白。此外，近年來正致力開發利用錯配結合蛋 白質來檢測錯配之基因診斷法(M. Gotoh et al., Genet. Anal.， 14, 47-50，1997)。舉例言之，檢測核酸中之特定核苷酸之 多型（polymorphisms)及突然突變（mutation)的方法已知有： 使無突變之對照核酸與疑似有突變之被測核酸雜交，再導 入錯配認識蛋白質以檢測錯配之方法。 本發明中之「錯配」係指，由腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)及胸線嘧啶(T)(RNA時為尿嘧啶(U))選出之一組 38 1332987 驗基對並非正常驗基對(A與T之組合，或〇與c之組合）。此 處之錯配不僅限於1個錯配’而係包含多數連續之錯配 '因 1或多數驗基之插入及/或缺4貝而產生之錯配以及該等錯配 之組合。 本發明之突變檢測法中，亦可利用該等錯配結合蛋白 質以提高其專一性(正確性）。本發明之突變檢出法中，含於 核酸試料中之被測核酸於突變部位具有與目標核酸序列不 同之核苷酸時，第一引子所含序列(Ac，)或第二引子所含序 列（Cc，)對被測核酸之雜交將受到妨礙，或是第一引子所含 序列(B，)之形成迴圈結構將受到妨礙，而無法獲得擴增產物 或是擴增產物之量減少。然而’該等雜交或迴圈結構之形 成亦有不完全受到妨礙之情況，此種情形下，該等序列中 將產生少量之雜雙股結構。本發明中所謂之「雜雙股結構」 係指實質上係互補之雙股結構，但因具有1或多數錯配而包 含非互補領域的雙股結構。因該種雜雙股結構，而導致本 來不應產生之錯誤擴增產物。因此，若預先於用以核酸擴 増反應之反應液中添加錯配結合蛋白質，則該錯配結合蛋 白質將與前述之雜雙股結構結合，進而妨礙之後的擴增反 應。因此，可利用錯配結合蛋白質來防止錯誤擴增產物產 生。 本發明所用之錯配結合蛋白質僅需為可識別雙股核酸 中之錯配並結合至該錯配部位之蛋白質即可，舉例來說， 可為任一對當業者而言係習用公知者。此外，本發明所用 之錯配結合蛋白質於可識別雙股核酸中之錯配的前提下， 39 1332987 亦可為：於野生型蛋白質之胺基酸序列中置換、缺損、附 加及/或插入有1或多數胺基酸之胺基酸序列所構成之蛋白 質（突變體）。此種突變體亦有產生於自然界中者，但亦可人 為製作。已知許多可於蛋白質中導入胺基酸突變之方法。 例如，部位專一性突變導入法已知有W.P. Deng與J.A. Nickoloff 之方法（Anal. Biochem.，200，81，1992)、K.L. Makamaye 與 F. Eckstein 之方法（Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698, 1986)等；而隨機突變導入法則已知有：採用缺 損基本修復系之大腸菌XLl-Red株(Stratagene社)之方法、使 用亞确酸鈉等而化學性地修飾驗基的方法(J.-J. Diaz et al.， BioTechnique, 11，204-211，1991)等。此種錯配結合蛋白質 已知有MutM、MutS及該等之類似體等各種(Radman，M. et al., Annu. Rev. Genet. 20: 523-538 (1986); Radaman, M. et al., Sci. Amer., August 1988, pp40-46; Modrich, P., J. Biol. Chem. 264: 6597-6600 (1989) ； Lahue, R. S. et al., Science 245: 160-164 (1988); Jiricny, J. et al,. Nucl. Acids Res.16: 7843-7853 (1988); Su, S. S. et al., J. Biol. Chem. 263; 6829 -6835 (1988); Lahue, R. S. et al., Mutat. Res. 198: 37-43 (1988); Dohet, C. et al., Mol. Gen. Gent. 206: 181-184 (1987) ; Jones, M. et al., Gentics 115: 605-610 (1987)； Salmonella typhimurium之Muts (Lu, A.L., Genetics 118: 593-600 (1988); Haber L. T. et al., J. Bacteriol. 170: 197-202 (1988) ; Pang, P. P. et al., J. Bacteriol. 163: 1007-1015 (1985));以及Priebe S. D. et al.，J_ Bacterilo. 170: 190-196 40 ⑤ 1332987 (1988))。本發明所用之錯配結合蛋白質宜為MutS、MutH、

MutL或取自酵母者，更宜為MutS、MutH或MutL·。 錯配結合蛋白質亦與單股核酸結合， 而此種錯配結合 蛋白質與單股核酸之結合則已知可被單股結合蛋白質阻 礙。因此’本發明之突變檢測法中，於採用錯配結合蛋白 質時宜併用單股結合蛋白質。此外，錯配結合蛋白質亦可 能與不含錯配之雙股核酸結合，而此種錯配結合蛋白質之 錯誤結合’則已知可使用活性劑使錯配結合蛋白質預先活 性化以藉此阻礙之。因此，本發明之突變檢測法中，於使 用錯配結合蛋白質時，宜使用藉活性劑而預先活性化者。 為阻礙錯配結合蛋白質與單股核酸結合而使用之單股 結合蛋白質（SSB)可為本技術領域中習知之任意SSB。較佳 之SSB可列舉如.來自埃希氏大腸桿菌（EScherichia c〇ii)、 果蠅及非洲爪蟾之單股結合蛋白質 '來自T4噬菌體 (bacteriophage Τ4)之基因32蛋白質以及來自其他物種之該 等相當物。此時使用之錯配結合蛋白質可列舉如MutS、 MutH、MutL、HexA、MSH1 〜6、Rep3、RNaseA、尿嘧啶 -DNA醣解酶(uracil-DNA glyC0Sidase)、T4内切酶 VII以及分 解酶(Resolvase)等’較宜為MutS、MSH2、MSH6或該等之2 種以上混合物，而更宜為MutS。 若為當業者即可適當挑選出用以使錯配結合蛋白質活 性化之活性劑’故而不受特別限制，但宜為ATP(腺苷5，-三 磷酸）、ADP(腺苦5’-二磷酸）、ΑΤΡ-γ-S(腺苦5，-0-(3-硫代三 磷酸））及AMP-PNP(腺苷5’-[β，γ_醯亞胺]三磷酸）等化合 41 1332987 物，或者為一種可與錯配結合蛋白質結合之核苷酸。錯配 結合蛋白質之活性化可藉使錯配結合蛋白質與活性劑於室 温下培養數秒至數分鐘而進行。 若依本發明之較佳實施樣態，則為調查疑似羅患基因 疾病之被測體是否有特定基因發生突變，本發明之突變檢 測法可利用在魅-取自患者之基因與正常人之基因是否 具有相同鹼基序列。本發明之突變檢測法中，無論是存在 於被測基因任何位置之突變均可檢測出。 再者，若依採用本發明引子纪之核酸擴增反應，則可 判定核酸試料中之核酸序列有無相之缺損或插入。為達 此目的，可將引子組設計成··缺損或插入之相關部位係配 置於序列⑷、序列⑻或序雜）中，或配置於㈣(A)與序 列W之間’或是配置於序列(A)與序列(〇之間；藉此，可 藉確認有無擴增產物來判定有無序列之缺損或插入。因 此，若依本發明，可提供—细㈣定核酸試料之核酸序 列中有無序列缺損或插入之方法，係包含以下步驟而構成 者：⑷準備核酸試料；（b)準備—本發明之引子組，該引子 組被設計成：以含有缺損或插人之序列或不含該序列之核 酸序列為目標核酸序列’且缺損或插人之部位係包含在序 列(A)序列(B)或序列(c)中，或被配置在序列⑷與序列⑻ 之間或者是配置在序列(A)與序列(〇之間者；及⑷於該核 酸試料存在下，以該引子組進行核酸擴增反應。 本毛月之缺#/插人判定法中，於使用之引子組係設計 成以”有目I缺知或插人序列之核酸序列作為目標核酸序 3 42 列時，核_增反錢存在㈣絲係表轉有缺損或插 入序列，而擴增錢不存在或減少時職料有缺損或插 入序列存在。另—方面，於使用之引子組係設計成以不具 有目標缺損或插人序列之核酸序列為目標核酸序列時，核 酸擴增反雜存在擴增產物係麵不存在缺損或插入之^ 列，而擴增產㈣存在或減少職种有缺損或插入之序 列。於此，所謂「擴增產物減少」係指：所得擴增產物之 量較核酸試料巾射目標減㈣_得之㈣產物 少。 若依本發明之一實施樣態，則本發明之缺損/插入判定 法之步驟⑻中’係準備―設計成缺損或插人部位係含於前 述序列㈧中之引子組。該實施型態中’核酸試料中包含目 標核酸序列時’於核酸擴增反應中H丨子將煉合至序 列(A)而可得擴增產物。而核酸試料中若因缺損/插入而含有 2目標核酸序列不同之核酸序列時，則核酸擴增反應中第 弓丨子將難赠合至序列(A)，；}；是無法獲得㈣產物就是 所得擴增絲之量顯著減少。第-引子所含相(Ac，)宜為 該序列（A)之互補序列。 若依本發明之其他實施樣態，則本發明之缺損/插入判 =法之步驟(b)中，係準備-設計成缺損或插入之部位係包 二於則述相(c)之引子組。該實施樣態巾，於核酸試料中 包含目標核酸序列時，核酸擴增反應中第二引子將煉合至 序列(C)而獲得擴增產若核酸試料中因缺損/插入而含有 與目標核酸序列不同之核酸序列時，於核酸擴增反應中， 43 1332987 第二引子難以煉合至該序列（c)，因此不是無法獲得擴增產 物就是所得擴增產物量顯著減少。第二引子所含序列（Cc，) 宜為該序列（C)之互補序列。 若依本發明之其他實施樣態，則本發明之缺損/插入判 定法之步驟(b)中，係準備一設計成使缺損或插入部位係包 含於前述序列(B)的引子組。此實施樣態中，核酸試料中含 有目標核酸序列時，於核酸擴增反應中，第一引子係煉合 至序列（A)並進行延伸反應後，因該引子所含序列（B，）係與 延伸鏈上之序列（Be)雜交，而可有效率地形成迴圈結構。 藉著此種高效率之迴圈結構形成，其他第—引子可練合至 模板’而可有效率地進行如第1圖所示之作用機制，因此可 獲得擴增產物。另一方面，核酸試料中因缺損/插入而含有 與目標核酸序列相異之核酸序列時，因核酸擴增反應中難 以形成前述迴圈結構，第1圖所示之作用機制受到妨礙，故 而不是無法獲得擴增產物就是所得擴增產物之量顯著減 少。其詳情正如本發明之突變檢測法中所述。此外，第一 引子所含序列(B，）宜與前記序列(B)為相同序列。 若依本發明之較佳實施樣態，則本㈣之缺損/插入判 定法之步_)中’引子組宜準備係設計成缺損或插入部被 配置於該序列(A)與該序列⑻之間者。此實施樣態中，核酸 試料中含有目標核酸序列時，於核酸擴增反應中，第一引 子煉合至序mA)並進行延伸反應後，則子所含序列⑽ 將與，伸鏈上之序列（Be)雜交，而可有效地形成迴圈結 構。藉著此種高效率之迴圈結構形成，其他第一引子可煉 ⑤ 44 圖所示作用機制有效進行，故可獲得擴增 酸序列不π /核竣試料中因缺損/插入而含有與目標核 ==酸序列時，因第—引子所含序列(Β，)與延伸 «形=:未構 ，核酸擴增反應難 顯著得擴增錢，就是鄉物之量 法之==明之其他實施樣態，本發明之缺損/插入判定 俜配’所4備之引子組係設計錢損或插入部位 係配置於該序列(Α)與序 試料中含:實施樣態中，核酸 子^ 序列時，於核酸擴增反應中，第一引 ^至相⑻麵行㈣反驗，則子所含序列㈣ '延伸鏈上之序列(Bc)雜交，故可有效地形成迴圈結 1者此種㈣率之迴圈結構形成’其他第—引子可煉 二=板’使第!圖所示之作用機序有效進行，故可 ^產物。另:方面’核酸試料中因缺損/插入而含有與目標 ^序列不同之核k序列時，不是無法獲得擴增產物就是 斤得擴增產物之量顯著減少。例如，序列(a)與序列(〇之間 因插入長序列而3有與目標核酸序列不同之核酸序列時， 因核酸擴增之速度(效率)顯著降低，不是無法或得擴增產物 就是所得擴增產物之量顯著減少。此外，若序列(A)與序列 (C)之間因序列缺損而使核酸試料中含有與目標核酸序列 不同之核酸序列，且因該缺損而使序列(B)部分或全部喪失 時，因第-引子所含序列(B，)無法於延伸鏈上雜交，迴圈結 45 而使第1圖所示作用機制受到妨礙，

氏’不是無法獲得擴增產物就是所得擴增產物之量顯著減 少。 構係無法或難則彡成，岐S1圖所示彳 故不是無法獲得擴增產物就是所得擴 本發明之缺損/插人狀法巾，DNA及RNA均可作為目 標核酸序列。RNA可例舉如 mRNA、Splieed RNA、Unspliced 職等，此外，亦可列舉如存在於核、細胞質等之rna、 來自經感染之病毒、細料的驅等以及可自活體取得之 所有種類的RNA。DNA則不限於自然存在之DNA，亦可列 舉如經人X重組之DNA序列。現今，已可將各種基因或核 酸片段之序列重組，若依本發明之缺損/插入判定法，亦可 檢測出非自然存在的重組序列。 若依本發明之較佳實施樣態，前述缺損或插入之序列 係一插入(intron)序列，其包含在真核生物之基因組上的基 因中。藉此’於使用同時包含抓心及基因組DNA之核酸 試料時，可判斷目標基因之序列中是否存在intnm，結果， 於判定intron不存在時，可判定目標基因存，即， 目標之基因呈表現。若依本發明之更佳實施樣態，則該目 標核酸序列為mRNA。 兹針對使用下述引子組之實施樣態詳細說明如後，該 弓丨子組係设si"成.以目標基因之mRNA(有intron缺損）作為 46 1332987 目標核酸序列，且插入(intron)序列之缺損部位係配置於前 j序列⑷與相(B)之間，實施樣態中，首先，存在於第 —引子3’端之序列（心’)煉合至模板而引起延伸反應再 者，僅有來自該引子之延伸反應產物合成出目的領域時， 存在於該引子5,端之糊(B，)可雜交至與本身延伸產物上 之相鄰表現序列(exon)對應的序列(Bc)。意即於合成出 mRNA之目的領域(該mRNA具有一序列係延伸反應產物 使2個exon依序連結者）時，首先形成如以圖所示之迴圈結 構’新的第—引子可煉合至呈單股之模板上的序列⑷上。 該第-引子5’端部分起之迴圈結構形成係如前述般， 於模板上之相(A)與序雜)以適切_麵時可高效率 地反覆，而僅独不含插人序狀灿财為模板時引起擴 增，而於含有插入序列之基因組DNA時不引起擴增。可於 等溫下反覆操作該反應，藉此正確地進行目的核酸之擴 增，此外，因該迴圈結構之形成係每一循環正確地反覆， 故可僅使目的核酸正確地擴增。另，以pCR法等常引起非 專一性擴增，非常難以僅使目的mRNA擴增並將其定量， 但本發明之缺損/插入判定法之專一性非常高，不引起非專 一性擴增，而可僅使目標之mRNA專一性擴增，故而亦可 提尚其定量性。另外，依此原理，則可省略煩雜且費時之 DNase處理等以及破壞檢體中之dna以獲得RNA的步驟， 可減少mRNA之自然崩壞，而可迅速地進行定性或定量診 斷。 為實施本發明之核酸擴增法、突變檢測法或缺損/插入 47 1332987 判定法，亦可統整出必須之試藥並製為套組。因此，本發 明之套組包含本發明之引子卜此外，本發明之核酸擴増 法、突變檢測法或缺損/插入判定法具有無需本發明弓丨子組 以外之引子的優點。因此，若依本發明之較佳實施樣態， 本發明之套組未含本發明引子組以外的引子成分。再者， 本發明引子組所含之至少丨種引子包含可與固態載體結合 之部位時，本發明之套組宜更包含該固態載體。此外，用 於核酸擴増反應之基質含有可與固態載體結合之部位時， 本發明之套組宜更含有該固態載體。本發明之套組可更包 含DNA聚合酶、dNTP及緩衝液等前述之試藥類以及反應容 器、說明書等。 若依本發明之較佳實施樣態，前述套組亦可包含一反 應容器，該反應容器含有本發明引子組及核酸擴增反應所 必須之其他試藥類。其他之試藥類可列舉如DNA聚合酶、 dNTP及緩衝液等之前述試藥類。藉著採用此種套組，僅需 將模板核酸或核酸試料添加至前述反應容器中，並使該反 應容器維持一定溫度，便可進行核酸擴增反應。另外，引 子組所含之至少1種引子含有固態載體時，該固態載體將於 產生擴增產物之同時發生凝集，因此可採用透明或半透明 之反應谷器’藉此由反應容器外部觀察此一凝集。因此， 此時無需將反應容器開封即可檢測擴增產物而操作簡便， 更可一併防止與其他樣本間發生核酸擴增物之污染 (contamination) 〇 若依本發明之第二樣態，則可提供一種判定核酸試料

48 1332987 中之核酸序列有無突變之方法，其係於錯配結合蛋白質等 具有錯配識別能之物質存在下，採用係透過模板中存在或 不存在突變而與模板產生錯配之核酸試藥，進而進行核酸 擴增反應者。此樣態中，所用之「突變」一語亦包含丨以上 核苷酸之置換、缺損及插入中之任一者。 本發明說明書中，所謂「具有錯配識別能之物質」係 指，於雙股核酸中含有錯配時，將結合至該錯配部位或將 該部位切斷之物質。於採用引子與DNA聚合媒之核酸擴增 反應中，模板之目標核酸序列上若存有已與具錯配識別能 之物質結合的雙股部分，則即使來自引子之延伸鏈到達該 部分亦無法解除其雙股結構，引子延伸反應在此停止，因 此無法獲得擴增產物《此外，核酸擴增反應中，模板之目 標核酸序列被切斷時亦無法獲得擴增產物。具有錯配識別 能之物質宜為與錯配部分結合之物質，其可為有機化合 物、無機化合物或蛋白質或是該等之複合體，而特別宜為 可與錯配部分結合之錯配結合蛋白質。錯配結合蛋白質之 詳情係如上述，但宜為MutS、MSH2或MSH6或者是該等之 2種以上混合物，而更宜為MutS(J Smith and P Modrich， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4374-4379, 1996 ； Au KG, Welsh K, Modrich P., J. Biol. Chem. 267, 12142-12148, 1992 ； Alan B. Clark, Frank Valle, Karin Drotschmann, Ronald K. Gary, and Thomas A. Kunkel, J. Biol. Chem. 275, 36498-36501,2000)。此外，錯配結合蛋白質因其起源生物 而於耐熱性上有差異。若為當業者，即可因應核酸擴增反 49 1332987 應中設定之溫度而選擇適當之錯配結合蛋白質。例如，來 自嗜熱菌之MutS即可適切地應用於本發明。 前述核酸擴增反應可採用本技術領域中所習知之往― 方法，此外，亦可為本發明之核酸擴增法。等溫下進行之 核酸擴增反應特別適於使用，此種核酸擴增反應並不僅限 於前述之本發明核酸擴增法，而亦可依已知係等溫核酸擴 增法之方法如SDA法（日本特公平7-114718號公報）、改良 SDA法（美國專利第5824517號說明書；國際公開第99/09211 號手冊；國際公開第95/25180號手冊）、NASBA法（日本專 利第2650159號公報）、LAMP法（國際公開第00/28082號手 冊）、ICAN法（國際公開第02/16639號手冊）等而進行之。 若依一實施樣態，則本發明第二樣態之突變檢測法包 含以下步驟： (a) 準備核酸試料； (b) 準備一可使含突變部位之目標核酸序列擴增之引子 組’該引子組所含至少1種引子係設計成：與前述核酸試料 中之核酸序列或其互補序列雜交時，藉該突變之存在或不 存在’使該引子與該核酸序列或其互補序列之間產生1以上 之錯配；以及 (c) 於具有錯配識別能之物質存在下，以該核酸試料為 模板並以該引子組進行核酸擴增反應。 可使目標核酸序列擴增之前述引子組可因應所利用之 核酸擴增法而加以適當設計。該引子組特別宜為可使目標 核酸序列於等溫下擴增者，此時，核酸擴增反應可於等溫

50 1332987 下進行。 前述之1以上錯配可為1鹼基錯配、連續之多數錯配或 非連續之夕數錯配。此外，該錯配之數量上限僅需為可使 應雜交之2條核酸維持雙股狀態之程度者即可因此，依雜 交而對合之核純<數量而異，但宜為5驗基且較宜為3驗 基，而更宜為2鹼基。 透過比較係檢剛對象之具有突變的目標核酸序列與不 具有該突變之目標㈣序列，#業者即可適當地設計出因 突變之存在或不存在而產生錯配之前述引子。意即，將該 引子設計成可與前述2個目標《序列間含相異核普酸之 領域雜父即可。此時，若將該引子設計成含有—與具突變 之目標核酸序列互_序列，職為因突變轉在而產生 另方面，去·設計成含有一與不具突變之目標核 酸序列相補的序列，則成為因突變存在而產生錯配者。 右依較佳之實施樣態，則令前述引子組所含之第一引 :為前述之本發明弓丨子組所含的第一引子。此第一引子可 &十成.透㈣突變之存在或不存在*於前述序列(A)與 =序列(Ae，)之間產si以上之錯配者。或者，該第一引子 ^可設計成：錢料變之存在或特在，㈣前述序列 C)與前述序列(B，)之間產生1以上之錯配者。 若依其他較佳之實施樣態，則令該引子組所含之第二 係=述:本發Γ引子組所含之第二引子。該第二心 與前述序變之存在或不存在，而於前述序列(C) κ列(Cc’)之間產生1以上之錯配者。 51 1332987 若依其他較佳實施樣態，則令該引子組更包含前述之 本發明引子組可包含之第三引子。該第三引子可設計成： 與前述核酸試料中之核酸序列或其互補序列雜交時，透過 前述突變之存在或不存在，而於該核酸序列或其互補序列 之間產生1以上之錯配者。 前述核酸擴增反應之其他條件可設定成與本發明之核 酸擴增法相同。舉例言之，前述核酸擴增反應中，宜使用 前述之具有鏈置換能之聚合酶。此外，亦可依需要而使用 前述之熔解溫度調整劑及酶安定化劑等。 依該實施樣態進行突變檢測法之結果，使用因突變存 在而產生錯配之引子而獲得擴增產物時，可判定核酸試料 中不存有前述突變，相反地，無法獲得擴增產物時則可判 定係存有前述突變。另一方面，使用因不存在突變而產生 錯配之引子而獲得擴增產物時，可判定該核酸試料中存有 該突變，相反地，無法獲得擴增產物時則可判定不存有該 突變。 為依該實施樣態而實施本發明第二樣態之突變檢測 法，亦可統整出必須之試藥並製為套組。因此，本發明之 套組包含前述具有錯配識別能之物質以及本發明之引子 組。此外，宜令該套組為更含有具前述鏈取代能之聚合酶 者。此外，該套組可更包含前述之熔解溫度調整劑、酶安 定化劑、dNTP及緩衝液等前述之試藥類以及反應容器、說 明書等。 若依另一實施樣態，則本發明第二樣態之突變檢測法 52 具有下述步驟： (a) 準備核酸試料； (b) 準備一可使含有突變部位之目標核酸序列擴增的引 子組； (c)準備—係與目標核酸序列雜交之核酸片段，其係設 D十成.與前述核酸試料中之核酸序列或其互補序列雜交 時藉忒突變之存在或不存在，使該核酸片段與該核酸序 列或其互補序列之間產生1以上之錯配者；及 人（d)於具有錯配識別能之物質及該核酸片段存在下，以 令該核酸試料為模板之前述引子組進行核酸擴增反應。 =述之UX上錯配可為1驗基錯配、連續之多數錯配或 ^連續之多數錯配。此外，該錯配讀 應雜交之2條核酸維持雙股《之程度者即可，ΞΓ，依雜 乂而對合之核㈣之數量而異，但宜為5驗基且較 宜為3驗 基，而更宜為2鹼基。 透過比較係檢測對象之具有突變的目標核酸序列與不 具有該犬變之目標核酸序列’當業者即可適當地設計出因 犬變存在或不存在而產生錯配之前述引子。章即，將該 引子設計成可與前述2個目標核酸序列間含相異核苷酸之 領域雜交即可。此時，若將該引子設計成含有〆與具突變 之目標核酸序列互補的序列’則成為因突變不存在而產生 錯配者，另一方面，若設計成含有一與不具突變之目標核 酸序列相補的序列，則成為因突變存在而產生錯配者。 此外，前述核酸片段僅需為可於核酸擴增反應所用溫 53 1332987 度下（如，20。〇80。(：範圍内之溫度）、雜交至目標核醆序列 者即可。該核酸片段之鏈長並未受到特別限制，但宜為5〜4〇 核苦酸，而更宜為15〜25核苷酸。該核酸片段亦可依需要而 含有修飾鹼基(非自然存在之鹼基）。此外，該核酸片段亦可 於其一側或雙側之端部上含有標誌或胺基等活性基。 可使目標核酸序列擴増之前述引子組可依所利用之核 酸擴增法而加以適當設計。特別是，該引子組宜為可使目 標核酸序列於等溫下擴增者，此時，核酸擴增反應即可於 專溫下進行。 右依較佳之實施樣態，則令前述引子組所含之第—引 子為前述之本發明引子組所含之第一引子。若依其他較佳 實施樣態，則令前述引子組所含第二引子為前述本發明引 子組含之第二引子。若更依其他較佳實施樣態，則令該引 子組更含有前述之本發明引子組可含之第三引子者。 則述核酸擴增反應之其他條件可設定成與本發明之核 酸擴増法相同。舉齡之，前述__反應中，宜使用 前述之具有鏈置換能之聚㈣。此外，亦可㈣要而使用 前述之熔解溫度調整劑及酶安定化劑等。 依該實施樣態進行突變檢剛法之結果，使用因突變存 在而產生錯配之核酸片段㈣得擴增產物時，可判定核酸 試料中不存有前述突變，相反地，紐獲得擴增產物時則 可判定係存有前述突變。另__ 士 t 负 I方方面，使用因不存在突變而 產生錯配之核酸片段而獲得擴増產物時，可狀該核酸試 料中存有②突變，減地，無法獲得擴增產物時則可判定 54 1332987 不存有該突變。 為依該實施樣態而實施本發明第二樣態之突變檢測 法’亦可統整出必須之試藥並製為套組。因此，本發明之 套組包含前述具有錯配識別能之物質、前述引子組以及該 核酸片段。此外，宜令該套組為更含有具前述鏈取代能之 聚合酶者。此外，該套組可更包含前述之熔解溫度調整劑、 酶安定化劑、dNTP及緩衝液等前述之試藥類以及反應容 器、說明書等。 【實施例】 以下，藉實施例以具體說明本發明，但本發明之範圍 並不受限於該等實施例。 例1 :人類STS DYS237基因中之目標核酸庠列;f磨增 本例中，模板係使用Human Genomic DNA(Clontech社 製），而進行其中所含之人類STS DYS237基因中之目標核 酸序列擴增。引子係使用具有下述序列之引子對。此外， 相對於模板之各引子區的位置關係係如第4圖所示（序列編 號6)。前置引子fi係設計成第2圖所示結構，即位於其3,端 側的序列（22mer :劃底線處）係煉合至模板，而位於5,端側 之序列（16mer :劃底線處以外）則於該區域内摺疊。反置引 子R1則設計成：位於其3’端側之序列(20mer :劃底線處)係 煉合至模板，於延伸反應後，位於5,端側之序列（1〇mer :劃 底線處以外）則雜交至該引子延伸鏈上之從該引子3,端殘基 的16鹼基下游處開始的區域。 引子對： 55 1332987 FI ： GGATATATATATATCCACTGMCAAATGCCACATAAAG(序列編號 1)； R1 : GCAGCATCACCAACCCAAAAGCACTGAGTA(序列編號2) 〇 調製具有下列組成之反應液(25μί) : Tris-HCl(20mM， ρΗ8·8)、KCl(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM) ' MgS04(8mM)、 DMSO(3%)、Triton X-100(l%)、dNTP(1.4mM)、各2000nM 之上記引子對及模板（lOOng)，更含有16U之BstDNA聚合酶 (NEW ENGLAND BioLabs)，將其以60°C培養1小時。使模 板直接以雙股反應。此外，亦針對添加滅菌水來取代模板 之溶液同樣進行實驗。 對各反應液5μ1使用3% NuSieve 3:1 Agarose(BioWhittaker Molecular Applications (BMA)社製； 自TakaraBio社購入；「NuSieve」為BMA社之註冊商標），以 80分鐘、100V進行電泳。以溴化乙錠(Ethidium Bromide, EtBr)將電泳後之凝膠染色，藉此檢測出核酸。結果如第5 圖所示。第5圖中，各行(Lane)之樣本如下所示：Lane 1 : 20bpDNA Ladder size marker ; Lane 2 :含模板之反應液； Lane 3 :添加滅菌水以取代模板之反應液。 第5圖之Lane3中，除未反應之引子受到染色以外，並未確 認有帶（Band)。Lane 2中，低尺寸之帶中，約120bp左右之 帶係預想為目的核酸之擴增產物。因此，含模板之反應液 中已確認有擴增產物。Lane 2中，更於較該擴增產物上方 處確認到帶’此即為本發明之擴增反應中反覆具有預測之 目標核酸序列的擴增產物。因藉本發明擴增反應而獲得之 擴增產物呈現複雜之結構，而獲得此種梯狀之電泳結果。 56 1332987 例2 :以制限酶進扞切斷 例1所得之擴增產物顯示出其係來自目標核酸序列 者，故而進行該擴增產物之制限酶消化。具體言之，使用 例1所得之擴增反應後之反應液〇 3μΐ ,再以制限酶MboII 進行消化(37°C、3小時）。 使用 3% NuSieve 3:1 Agarose(BioWhittaker Molecular Applications (BMA)社製；自 Takara Bi〇購入；「NuSieve」

為BMA社之註冊商標），使消化產物電泳。結果如第6圖所 示。第6圖中，各Lane之樣本係如下所示：Lane 1 : 2〇bpDNA

Ladder size marker ; Lane 2 :使擴增產物〇.3pL直接電泳者；

Lane 3 :使擴增產物〇.3pL之消化產物電泳者。 第6圖中，從核苷酸序列推測出之各制限酶消化片段之 尺寸係記載於電泳照片右側。未消化樣本之帶於消化後係 移動到推測尺寸之帶，由此而確認目標核酸序列受到擴增。 Mg :添加熔解溫唐調整劑以侣進擴增反應 於擴增反應溶液中添加熔解溫度調整劑，並檢討其對 擴增效率之效果。與例！相同，模板係使用Human DNA(Clontech社製），而進行人類STS DYS237基因中之目 標核酸序列擴增。擴增反應溶液之組成除添加作為熔解溫 度調整劑之最終濃度為〇%、2%、5%或10%之DMSO外，係 與例1相同。此外，反應條件及反應後之電泳條件係與例丄 所載者相同。 結果係如第7圖所示。第7圖中，各Lane之樣本係如下 所示.Lane 1 : 20bpDNA Ladder size marker ; Lane 2 : 57 1332987 0%DMSO(不含 DMSO) ; Lane 3 : 2%DMS0 ; Lane 4 : 5%DMSO ; Lane 5 : 10%DMSO。 如第7圖所明示般，DMSO之濃度為2%及5%時可獲得 充分之擴增產物，而〇%時亦可獲得少許之擴增產物。相對 於此，DMSO之濃度為10%時則無法獲得擴增產物。這是因 為熔解溫度調整劑之濃度過高而使Tm(熔解溫度）過於降低 之故。 例4 : 一驗基突變之檢測 本例中，係使用本發明之引子組進行一鹼基突變之檢 測。首先，為製作一驗基突變之模型，而將人類STS DYS237 基因之特疋領域中含有一驗基突變之長鍵合成寡核苦·酸、 與不含一鹼基突變之長鎖合成寡核苷酸進行合成。再者， 以PCR法將該等長鎖合成寡核苷酸各自擴增，而製得不含 一驗基突變之野生型DNA與含一驗基突變之突變型DNA的 擴增產物。將該等擴增產物定序而確認突變部分之核苷酸 殘基後，於下述實驗中作為模組使用。茲將該等擴增產物 之核苷酸序列示於第8圖（序列編號7及序列編號8)。如第8 圖所明不般，野生型DNA中係被c殘基之箭頭殘基取代，突 變型DNA中則是被G殘基取代。

引子係使用具有下述序列之野生SDNA檢測用引子對 及突變型DNA檢測用引子對。野生型dna檢測用引子對係 令例1所用之引子F1及引子R1各為前置引子及反置引子。突 變型DNA檢測用引子對係以該引子ρι為前置引子，而以新 設計之引子R1G為反置彳丨子。除了從5，端算起第5位具有G 58 1332987 殘基外，引子RIG與引子R1具有相同之核苷酸序列。此外’ 相對於模板DNA之各引子區域的位置關係如第8圖所示。 野生型DNA檢測用引子對： FI ： GGATATATATATATTTAnrTAArAAATCOCACATAAAG(序列編號 1); R1 : GCAGCATCAOCMOOCAMAGCACTGAGTA(序列編號2)。 突變型DNA檢測用引子對： FI : GGATATATATATATCTAninAACAAATGOCACATAAAG(序列編號 1); RIG ： GCAGGATCAOCAACGCMAAGCACTGAGTA(序列編號3) 〇 以上述野生型DNA或突變型DNA為模板，針對各自的 情況而使用野生型DNA檢出測引子對或突變型DNA檢測用 引子對，進行核酸擴增反應。具體言之，調製出具有如下 組成之反應液（25μί) : Tris-HCl(20mM，pH8.8)、 KCl(lOmM) 、 （NH4)2SO4(10mM) 、 MgS04(8mM)、

DMSO(3%)、Triton X-100(l%)、dNTP(1.4mM)、各2000nM 之上述引子對及模板（1019mol/tube(約60000分子)），更含有 16U之Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，將其以 60°C培養1小時。使模板直接雙股反應。 對各反應液5μ1使用3% NuSieve 3:1 Agarose(BioWhittaker Molecular Applications (BMA)杜製； 自TakaraBio社購入；「NuSieve」為BMA社之註冊商標），以 80分鐘、100V進行電泳。以溴化乙錠（Ethidium Bromide, EtBr)將電泳後之凝膠染色，藉此檢測出核酸。結果如第9 圖所示。第9圖中，各Lane之樣本係如下所示：Lane 1 : 20bpDNA Ladder size marker ; Lane 2 :以野生型DNA作模 59 1332987 板，並使用野生型DNA檢測用引子對之反應液；Lane 3 : 以突變型DN A作模板，並使用野生型DN A檢測用引子對之 反應液；Lane 4 :以野生型DNA作模板，並使用突變型DNA 檢出測引子對之反應液；Lane 5 :以突變型DNA作模板， 並使用突變型DNA檢測用引子對之反應液。 如第9圖所明示，Lane 2及Lane 5卞可得擴增產物。該 等Lane中’低尺寸之帶中，約i2〇bp左右之帶係預想為目的 核酸之擴增產物。相對於此，Lane 3及Lane 4無法獲得擴增 產物。因此’以確認野生型DNA檢測用引子對僅能檢測出 野生型DNA，而突變型DNA檢出測引子對則僅能檢測出突 變型DNA。此結果顯示出，利用本發明之擴增反應，可有 效地檢測出一鹼基突變。 例5 :添加第三引子以促進楯增i亲唐 除例1中所用之引子對以外，並使用第三引子以進行核 酸擴增反應。第三引子係使用具有下述序列之2種引子。該 等第三引子係設計成：可煉合至藉前述引子對而擴增之目 標核酸序列上的與該引子對相異之位置。相對於模板之引 子區域的位置關係係顯示如第10圖（序列編號6)。 第三引子： 引子 3F : TAAGAACTCGCTTTATAC(序列編號4); 引子3R : TCTTCAACAGTCATTACC(序列編號5)。 與例1相同，模板係使用Human DNA(Clontech社製）而 進行人類STS DYS237基因中之目標核酸序列擴增。擴增反 應溶液之組成除含有引子3F(800nM)及引子3R(800nM)中 60 1332987 之一者或兩者以作為第三引子以外，係與例1相同。將該反 應溶液以60°C培養30分鐘或60分鐘。 對各反應液5μ1使用3% NuSieve 3：1 Agarose(BioWhittaker Molecular Applications (BMA)杜製； 自TakaraBio社購入；「NuSieve」為BMA社之註冊商標），以 80分鐘、100V進行電泳。以溴化乙錠（Ethidium Bromide, EtBr)將電泳後之凝膠染色，藉此檢測出核酸。結果如第u 圖所示。第11圖中，各Lane之樣本係如以下表1所示。 61 表1 .弟11圖所示電泳照片中各Lane的樣本

Lane 第三引子 模板DNA 擴增反應時間（分） 1 無 有 30 2 3F 有 30 3 3R 有 30 4 3F+3R 有 30 5 無 無 30 6 3F 無 30 7 3R 無 30 8 3F+3R 無 30 9 無 有 60 10 3F 有 60 11 3R 有 60 12 3F+3R 有 60 13 無 無 60 14 3F 無 60 15 3R 無 60 16 3F+3R 無 60 17 20bpDNA Ladder size marker 1332987 於第11圖所示電泳照片中，低尺寸之帶中，約12〇bp左 右之帶係預想為目的核酸之擴增產物。如第11圖所明示 般，添加1種或2種第三引子之樣本可藉3〇分鐘或6〇分鐘之 反應而獲得充分之擴增產物（Lane 2〜4及Lane 10~12)。相對 於此，未添加第三引子之樣本無法以3〇分鐘之反應獲得擴 增產物（Lane 1)，而以60分鐘之反應獲得擴增產物（Lane 9)。未添加模板之樣本無法獲得擴增產物（Lane 5〜8及Lane 13~16)。該等結果顯示出’本發明之擴增反應中藉由添加 第三引子而提高擴增效率。 例6 :確認1擴增係具模板澧府佑_丨4 除含有 lOOng、l〇ng、ing 或 〇ng 之 Human Genomic DNA(Clontech社製)作為模板，並含有8〇〇nM之引子3F(序列 62 1332987 編號4)作為第三引子外，與例1同樣地調製反應溶液。將該 反應溶液以60°C培養20分鐘、40分鐘或6〇分鐘。 對各反應液5μ1使用3% NuSieve 3:1 Agarose(BioWhittaker Molecular Applications (BMA)社製； 自TakaraBio社購入；「NuSieve」為BMA社之註冊商標），以 80分鐘、100V進行電泳。以溴化乙錠（Ethidium Br〇mide， EtBr)將電泳後之凝膠染色，藉此檢測出核酸。結果如第12 圖所示。第12圖中，各Lane之樣本係如下述表2所示。 表2 :第12圖所示電泳照片之各Lane樣本

Lane 模板(ng) 擴增反應時間（分） 1 100 20 2 10 20 3 1 20 4 0 20 5 100 40 6 10 40 7 1 40 8 0 40 9 100 60 10 10 60 11 1 60 12 0 60 13 20bpDNA Ladder size marker 第12圖所示電泳照片中，低尺寸之帶中，約12〇bp左右 的帶係預想為目的核酸之擴增產物。如第12圖所明示，添 加100ng模板時，藉20分鐘以上之反應可獲得擴增產物 (Lanel、5及9)。添加l〇ng模板時，藉40分鐘以上之反應可 獲得擴增產物（Lane6及10)。添加lng模板時，藉60分以上之 反應可獲得擴增產物(Lane 11)。未添加模板時，所有反應 時間均無法獲得擴增產物(Lane4、8及12)。由該等結果可確 63 1332987 認，透過延長反應時間，即使模板為低濃度時亦可獲得擴 增產物。 例7 :檢測ALDH2基因之一驗基突轡時之MutS效果 於本例中，模板係使用Human Genomic DNA(Clontech 社製）’以檢測係存在於搭脫氣酶_2(aldehyde dehydrogenase-2)基因（ALDH2 基因）之表現序列（exon) 12 中 之一鹼基突變，作為模板之該DNA係包含野生型ALDH2基 因。 引子係使用具有下述序列之引子組。此外，相對於模 板之各引子區域的位置關係如第13圖所示（序列編號9)。前 置引子ALDH2F係設計成第2圖所示結構，即，位於其3’端 側的序列（16mer :劃底線處）係煉合至模板，而位於5’端側 之序列（16mer :劃底線處以外）則於該區域内摺疊。反置引 子ALDH2R則設計成：位於其3’端側之序列（20mer :劃底線 處）係煉合至模板，於延伸反應後，位於5’端側之序列 (llmer :劃底線處以外）則雜交至該引子延伸鏈上之從該引 子3’端殘基的18鹼基下游處開始的區域。引子ALDH20F及 ALDH20R係設計成：煉合至模板上各較ALDH2F及 ALDH2R更外側（5,側）處。此外’ ALDH2SNPg及 ALDH2SNPa為含有與突變相關之核苷酸殘基(劃底線處)的 引子。ALDH2SNPg含有野生型序列’ ALDH2SNPa(i則含 有突變型序列。 所使用引子之序列： ALDH2F : TTTATATATATATAAArmrTAGTTGGGCGAQ(序列編號 1〇); 64 1332987 ALDH2R ： OGAGTAOGGGOOCACACTCACAGmTCAC(序列編號 11)； ALDH20F : ACMGATGTGGGGGAGTG(序列編號 12): ALDH20R : CCTGAGCCCCCAGCAGGT(序列編號 13); ALDH2SNPg : GCAGGCATACACTQA(序列編號 14); ALDH2SNPa : GCAGGCATACACTM(序列編號 15)。 調製含有下述組成之反應液(25μί) : Tris-HCl(20mM， ρΗ8·8)、KCl(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、MgS04(6mM)、 DMSO(6%)、Triton X-l〇〇(l%)、dNTP(0.4mM)、8U之Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)、SYBR GREEN I(Molecule Probe社)(最後稀釋成l〇〇,〇〇〇倍之濃度）、模板 (40ng)，各 3200nM 之 ALDH2F 及 ALDH2R、各 400nM 之 ALDH20F 及 ALDH20R、ALDH2SNPg(野性型引子）與 ALDH2SNPa(突變型引子）之任一者（i6〇〇nM)，更含有 MutS(0.8pg)’將其以60°C培養180分鐘。使模板直接雙股反 應。此外，亦針對不含MutS之反應液同樣地進行實驗。使 用實時(Real time)螢光檢測裝置Mx3〇〇〇p(STRATAGENE社 製）監視擴增產物之產生。 茲將實驗結果示於第14圖。該實驗中’因模板係使用 不含突變之人類基因組DNA，故使用上述野生型引子時應 可獲得擴增產物，而使用突變型引子時則應無法獲得擴增 產物。若依第14圖，則可知使用野性型引子時，無論有無 MutS，於約25分之時間點上可確認擴增產物產生。另一方 面’使用突變型引子時，在MutS不存在下，於約35分之時 間點上可確認擴增產物產生；相對於此，於MutS存在下， 65 1332987 即使反應3小時也不見擴增產物產生。因此，顯示出可藉使 用MutS而進行正確之SNP定型（SNPtyping)。 ：[歹化：檢測人類CYP2C19*3基因之一鹼基突轡時之MutS效果 於本例中，模板係使用Human Genomic DNA(Clontech 社製），以檢測係存在於藥物代謝酶細胞色素P450家族之 CYP2C19*3基因之表現序列4中的一鹼基突變。此外，本 例中，核酸擴增法係使用LAMP法。另，作為模板之上述 DNA為包含野生型CYP2C19*3基因者。 引子係使用具有下述序列之LAMP法用引子組。此外， 相對於模板之各引子區域的位置關係如第丨5圖所示（序列 編號16)。各内引子(inner primer)所含之前置引子FW及FM 係設計成：位於其3,端側的序列（20 mer ·劃底線處）係合 至模板，於延伸反應後，位於5,端侧之序列（8mer)則雜交至 該引子延伸鏈上之從該引子3,端殘基的29鹼基下游處開始 的區域。此外，各内引子所含反置引子RW及RM則設計成： 位於其3’端側之序列（I8mer:劃底線處)係煉合至模板，於 延伸反應後，位於5 ’端側之序列(9mer)則雜交至該引子延伸 鏈上之從該引子3’端殘基的36鹼基下游處開始的區域。 從前述各内引子之5’端起數第2個核苷酸殘基係對應 於與突變相關之核苷酸殘基。 野性型内引子： FW ： TCCAGGGGTCTTAACTTGATGGAAAAAIY序列編號 17)； RW : GGATCCAGGCCCAGAAAAAAAGACTGTT序列編號 18)； 突變型内引子： 66 1332987 FM ： TTTAnGGGTCTTAACTTGATGGAAAAAT(序列編號 19)； RM ： GAATCCAGGCCCAGAAAAAAAGACTGT(序列編號20)； 外引子： F3 : TCCAGAAACGTTTCG(序列編號21); R3 : AGGGCTTGGTCAATAT(序列編號22); 迴圈引子：

LoopF : GCTTACAATCCTGATGTT(序列編號23);

LoopR : GTAAGGCCAAGmTTTG(序列編號24) 〇 作為含有野性型内引子之反應液，則調製出具有下述 組成之反應液（25μΙ〇 : Tris-HCl(20mM，pH8.8)、 KCl(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、MgS04(4mM)、甜菜鹼 (1M)、Tween20(0.1%)、dNTP(0.5mM)、8U之BstDNA聚合 酶(NEW ENGLAND BioLabs)、SYBR GREEN I(Molecule Probe社)(最後成為稀釋l〇〇,〇〇〇倍之濃度）、模板(40ng)、各 400nM之F3及R3 ' 各800nM之LoopF及LoopR、各 1600nM之 FW及RW，以及含有MutS(0.8pg)。 此外，作為含有突變型内引子之反應液，則調製具有 下述組成之反應液（25μΙ〇 : Tris-HCl(20mM，ρΗ8·8)、 KCl(lOmM)、（NH4)2SO4(10mM)、MgS04(4mM)、甜菜鹼 (0.8M)、Tween20(0.1%)、dNTP(0.5mM)、8U之Bst DNA聚 合酶(NEW ENGLAND BioLabs)、SYBR GREEN I(Molecule Probe社)(最後成為稀釋loo,〇〇〇倍之濃度）、模板(4〇ng)、各 400nM之F3及 R3、各800nM之LoopF及 LoopR、各 1600nM之 FM及RM，以及含有MutS(0.8pg)。 67 1332987 將前述各反應液以6(TC培養180分鐘。使模板直接雙股 反應。此外’亦針對不含MutS之反應液同樣地進行實驗。 使用實時螢光檢测裝置Mx3〇〇〇p(STRATAGENE社製）以監 視擴增產物之產生 茲將實驗結果示於第16圖。該實驗中，因使用不含突 變之人類基因組DNA作為模板，故而使用上述野生型内引 子時應可獲得擴增產物，使用突變型内引子時應無法獲得 擴增產物。若依第16圖，則可知使用野性型内引子時，無 論有無MutS，於約25分之時間點上可確認擴增產物產生。 另一方面，使用突變型内引子時，在MutS不存在下，於約 35分之時間點上可確認擴增產物產生；相對於此，於MutS 存在下’即使反應3小時也不見擴增產物產生。因此，顯示 出可藉使用MutS而進行正確之SNP定型（SNP typing)。 【圖式簡單說明3 第1圖係用以模式性地顯示出使用本發明之第一引子 之核酸擴增反應的作用機制者。 第2圖係用以例示本發明之第二引子之結構者。 第3a圖係用以模式性地顯示出一使用本發明之第一引 子及第二引子之核酸擴增反應的作用機制者。 第3b圖係用以模式性地顯示出一使用本發明之第一引 子及第二引子之核酸擴增反應的作用機制者。 第4圖係顯示出用於擴增人類STS DYS237基因之第一 及第二引子於該基因上之位置者。 第5圖係顯示以含第一引子及第二引子之引子組擴增 68 1332987 人類STS DYS237基因的結果者。 第6圖係顯示以含第一引子及第二引子之引子組擴增 人類STS DYS237基因後藉限制酶處理其擴增產物之結果 者。 第7圖係顯示以含第一引子及第二引子之引子組擴增 人類STS DYS237基因時熔解溫度調整劑之影響者。 第8圖係顯示針對人類STS DYS237基因中之特定領域 而製作之含一鹼基突變的序列以及不含該突變之序列者。 第9圖係顯示以含第一引子及第二引子之引子組針對 人類STS DYS237基因中之特定領域檢測一鹼基突變的結 果者。 第10圖係顯示用於人類STS DYS237基因擴增之第 一、第二及第三引子於該基因上之位置者。 第11圖係顯示以含第一引子、第二引子及第三引子之 引子組擴增人類STS DYS237基因之結果者。 第12圖係顯示以含第一引子、第二引子及第三引子之 引子組擴增人類STS DYS237基因時模板濃度之影響者。 第13圖係顯示用於檢測人類ALDH2基因突變之引子組 中所含各引子於該基因上之位置者。 第14A、14B圖係顯示利用等溫下之核酸擴增反應來檢 測人類ALDH2基因之一鹼基突變時MutS之效果者。 第15圖係顯示檢測人類CYP2C19* 3基因突變時所採 用之引子組中所含各引子於該基因上之位置者。 第16A、16B圖係顯示利用等溫下之核酸擴增反應來檢 a 69 1332987 測人類CYP2C19 * 3基因之一鹼基突變時MutS之效果者。 【主要元件符號說明】 (無） 70 1332987 序歹表 <110>獨立行此去W里化妙斤 達納福股份有限公司 湧永製藥朋^分有限公司 <120>核酸之搬曾法及利用其^突變核酸檢則法

<130> 151569PX <15Q> JP2003431003 <151> 2003-12-25 <150>JP2004-313910 <151> 2004-10-28 <160>24 <17Q> PaCentln \fer. 2.0 <210> 1 <211>38

<^12>DNA <213>>^η·序歹 ij <220> <223>>^π·序歹ij之描述：引子 <4〇0>1 ggatataiat atatccactg aacaaatgcc acataaag

<21Q>2 <211〉30 <^12>DNA 1332987 <213> 序歹ij <22Q> <223>人工序歹〇之描述：引子 <40Q>2 gcagcatcac caacccaaaa gcactgagta <210>3 <211〉30 <212>DNA <213〉序歹 30 <220> <223>人工·序列之描述：引子 <4O0>3 gcaggatcac caacccaaaa gcactgagta <210>4 <^11>18 <212>DNA <213〉序歹 ij 30 <220> <223> 序歹之描述：引子 <4〇Q>4 taagaactcg ctttatac 18 <210>5 <211>18 <212>DNA <213>>^1序歹|』

2 <220> 1332987 <223> :弓丨-了-<4〇0>5 tcttcaacag tcattacc 18

<210>6 <211> 156 d2>DNA <213>人類 <4O0>6

60 120 156 <210>7 <211> 108

^12>DNA <213> 員 <400>7

<210>8 <211> 108 <212>E>NA aaatgccaca taaaggtaat gactgttgaa gaagatltaa cttaacatct

60 108 <213〉人類

tgcaggalca ctaagaactc gctttatact cagtgctttt gggttggg 60 108

<210>9 <211> 100 <212>E)NA <213>人類 3 1332987 <400>9

acaagatgtc ggggagtggc cgggagttgg gcgagtacgg gctgcaggca tacactgaag 60 tgaaaactgt gagtgtggga cctgctgggg gctscagggcc lOO

<210> lO <211>32 <212>DNA <213〉人工序歹 <^20> <223> 序歹之描述：引子 <4〇α>ιο tttatatata taiaaaccgg gagttgggcg ag 32

<210> 11 <211〉30 <212>DNA <213> 序歹ij <22Q> <223> 序歹》J之描述：引子 <40Q>11 cgagtacggg cccacactca cagttttcac 30

<210> 12 <211> 18 <212>DNA <213〉人序歹'J <220> <223> 序歹之描述：引子 <40Q> 12 4 1332987 acaagatgtc ggggagtg

<21Q>13 <211> 18 <212>DNA <213〉人工·序歹ij <22Q> <223>人工_序列之描述：引子 <40Q>13 cctgagcccc cagcaggt

<21Q> 14 <211> 15 <212>DNA <213〉序歹ij <220> <223>人工·序列之描述：寡^亥普g复 <4〇0> 14 gcaggcatac ac^a

<21Q> 15 <211> 15 <212>DNA <213〉序歹ij <220> <223>人工~序歹，』之描述：寡核芽酸 <4〇0> 15 gcaggcatac actaa <21Q> 16 1332987

<211> 187 <212>DNA <213> <4O0>16

cctgagaaac cacttacagt cttdtttct gggaaatcca aaattctatattgaccaagc cclgaag 60 120 180187

<210> 17 <211>28 <212>DNA <213〉序歹ij <a2〇> <223>人工序列之据述··引子 <400> 17 28 tccaggggtc ttaacttgal ggaaaaat <210>18 <211>27

<212>DNA <21序歹 <220> <223>人工序列之描述：弓丨子 <4O0>18 ggatccaggc ccagaaaaaa agac^t 27

<210> 19 <211>28 <212>DNA <213〉序歹 6 1332987 <220> <223>人工序列之描述：引子 <4〇0>19 ttcaggggtc ttaacttgat ggaaaaat <210>20 <211>27

<212>DNA <213〉序列 <220> <223>人工·序列之描述：引子 <400>20 gaatsccaggc ccagaaaaaa agac^t

<210>21 <211> 15 ^12>DNA <213>^11序歹|』 <22Q> 序歹之描述：引子

<210>22 <211> 16 <212>DNA <213〉序歹ij <220> 1332987 <223> 序歹α之描述：引子 <400>22 agggcttggt caalat 16

<21Q>23 <211>18 <212>DNA <213〉序歹 <220> <223»^·序歹之描述：引子 <4〇0>23 gcttacaalc ctgaigtt 18

<21Q>24 <211> 18 <212>DNA <213〉序歹ij <220> <223>人工序列之描述：引子 <400>24 gtaaggccaa gttttttg 18 8

Claims (1)

1332987 99年5月，〇日 第93140528號專利申請案申請專利範圍替換本 十、申請專利範圍： 1. 一種引子組，係含有可擴增目標核酸序列之至少2種引 子而成者； 該引子組所含之第一引子係於3’端部分含有一序 列（Ac’），該序列（Ac’)係與目標核酸序列3’端部分之序 列（A)雜交，且於該序列（Ac’）之5’側含有一序列（B，），該 序列(B’)係與序列(B)的互補序列(Be)雜交，而該序列（B) 係存在於前述目標核酸序列中較該序列（A)更偏5’側 處；且 該引子組所含之第二引子係於3’端部分含有一序 列（Cc’），該序列（Cc’）係與該目標核酸序列之互補序列3’ 端部分的序列（C)雜交，且該序列（Cc’）之5’側含有一摺 疊序列(D-Dc’），該摺疊序列（D-Dc’)係於同一鏈上含有 相互雜交之2個核酸序列。 2. 如申請專利範圍第1項之引子組，其更包含第三引子， 該第三引子係與前述目標核酸序列或其互補序列雜交 且對目標核酸序列或其互補序列雜交時不與其他引子 競爭者；該第三引子於前述第一引子或第二引子之擴增 產物的一部份成為單鏈狀態時，可與存在於該單鏈部分 之目標核酸序列鏈合，藉此於前述擴增產物中之目標核 酸序列提供新的互補鏈合成起點。 3. 如申請專利範圍第1或2項之引子組，其中該第一引子中 該序列(Ac’)與該序列(B’)之間未存有插入序列時，令該 序列（Ac’)之驗基數為X，且令目標核酸序列中之該序列 1 1332987 (A)與該序列（B)所挾領域之鹼基數為Υ，則（Χ-Υ)/Χ係於 -1.00〜1.00之範圍内；而引子中該序列（Ac’）與該序列 (B’)之間存有插入序列時，令X及Y如前述定義，且令該 插入序列之鹼基數為Y’，貝|J{X-(Y-Y’）}/X係於-1.00〜 1.00之範圍内。 4. 如申請專利範圍第1或2項之引子组，其中該第二引子中 之該摺疊序列（D-Dc，）為2〜1000核苷酸長。 5. 如申請專利範圍第1或2項之引子組，其中該引子組所含 之至少1種引子係具有固態載體或可與固態載體結合之 部位者。 6. 如申請專利範圍第5項之引子組，其中該固態載體係選 自於由非水溶性有機高分子載體、非水溶性無機高分子 載體、合成高分子載體、態轉移性載體、金屬膠體及磁 性粒子所構成之群組者。 7. 如申請專利範圍第5項之引子組，其中該可與固態載體 結合之部位係選自於由生物素、卵白素（avidin)、鏈卵 白素(Streptavidin)、抗原、抗體、配體、受體、核酸及 蛋白質所構成之群組者。 8. —種使模板核酸中之目標核酸序列擴增之方法，係包含 以下步驟而成者： (a) 準備含有目標核酸序列之模板核酸； (b) 準備如申請專利範圍第1〜7項中任一項之引子 組；及 (c) 於該模板核酸存在下，藉該引子組進行核酸擴增

2 1332987 反應。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該核酸擴增反應係 於等溫下進行者。 10. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其係使用具有鏈置換 能之聚合酶。 11. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其中該核酸擴增反應 係於熔解溫度調整劑存在下進行。 12. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其中該核酸擴增反應 係於酶安定化劑之存在下進行。 13. —種判定核酸試料中之核酸序列有無突變的方法，係包 含以下步驟而成者： (a) 準備核酸試料； (b) 準備如申請專利範圍第1〜7項中任一項之引子 組，該引子組被設計成：係以具有該突變或不具該突變 之核酸序列作為目標核酸序列，且使與該突變相關之核 苷酸殘基包含在序列(A)、序列(B)或序列(C)中者； (c) 於該核酸試料存在下，以該引子組進行核酸擴增 反應。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該核酸擴增反應係 於錯配(mismatch)結合蛋白質之存在下進行。 15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該錯配結合蛋白質 為MutS、MSH2或MSH6,或者是該等之2種以上混合物。 16. 如申請專利範圍第13~15項中任一項之方法，其中該核 酸擴增反應係於等溫下進行。 3 17. 如申請專利範圍第13〜15項中任一 具有鏈置換能之聚合酶。 項之方法，其係使用 18. 如申請專利範圍第13〜15項中任一 酸擴增反應係於熔解溫度調整方法’其中該核 19. 如申請專利範圍第13〜15項中任—項子^F進行。 酸擴增反應係於酶安定化劑項之方法’其中該核 2〇.-種判定核酸試料之核酸序^有"^= 之方法，係包含以下步驟而成者： 陶貝或插入 (a)準備核酸試料； ⑼準備如巾請專利範圍第Μ射任—項 組’该引子組被設計成··以含有缺 含該序列之核酸序狀目㈣之序列或不 更斤歹j為目松核酸序列’且缺損或插入之 部位會被包含在序列⑷、序列⑼或序列(C)中，或會被 配置在序列⑷與序列(B)之間或者是配置 序列(C)之間者；及 UA)與 反應 ⑷於該核酸試料存在下，以刻子組進行核酸擴增 〇 21·如申請專利範圍第2〇項之方法’其於步驟⑼中所準備之 引子、，且係成.缺損或插人之部位係配置於該序列(a) 與該序列(B)之間。 22. 如申请專利範圍第2〇或21項之方法其中該缺損或插入 之序列係一包含於基因組（gen〇me)上之基因的插入序 列（intron)。 23. 如申請專利範圍第戰21項之方法，其中該目標核酸序 1332987 列為mRNA。 24. 如申請專利範圍第20或21項之方法，其中該核酸擴增反 應係於等溫下進行。 25. 如申請專利範圍第20或21項之方法，其係使用具有鏈置 換能之聚合酶。 26. 如申請專利範圍第20或21項之方法，其中該核酸擴增反 應係於熔解溫度調整劑之存在下進行。 27. 如申請專利範圍第20或21項之方法，其中該核酸擴增反 應係於酶安定化劑之存在下進行。 28. —種判定核酸試料中之核酸序列有無突變之方法，係包 含以下步驟而成者： (a) 準備核酸試料； (b) 準備可擴增一包含突變部位之目標核酸序列的 如申請專利範圍第1至7項中任一項之引子組，該引子組 所含之至少1種引子係設計成：與該核酸試料中之核酸 序列或其互補序列雜交時，藉著該突變之存在或不存在 而使該引子與該核酸序列或其互補序列之間產生1以上 之錯配； (c) 於錯配結合蛋白質之存在下，以該核酸試料為模 板的該引子組進行核酸擴增反應。 29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該引子組為可使該 目標核酸序列於等溫下擴增者，且該核酸擴增反應係於 等溫下進行。 30. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該錯配結合蛋 5 1332987 白質為MutS、MSH2或MSH6，或者是該等之2種以上混 合物。 31. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該第一引子係 設計成：藉該突變之存在或不存在，而於該序列（A)與 該序列（Ac，）之間產生1以上之錯配者；或是，藉該突變 之存在或不存在，而於該序列（Be)與該序列（B’）之間產 生1以上之錯配者。 32. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該第二引子係 設計成：藉該突變之存在或不存在，而使該序列（C)與 該序列（Cc，）之間產生1以上之錯配。 33. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該引子組係如 申請專利範圍第2項之引子組，且第三引子係設計成： 與該核酸試料中之核酸序列或其互補序列雜交時，可藉 該突變之存在或不存在，而於該核酸序列上或與其互補 序列之間產生1以上之錯配。 34. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其係使用具有鏈置 換能之聚合酶。 35. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該核酸擴增反 應係於熔解溫度調整劑之存在下進行。 36. 如申請專利範圍第28或29項之方法，其中該核酸擴增反 應係於酶安定化劑之存在下進行。 37. —種判定核酸試料中之核酸序列有無突變之套組，包 含： (a)錯配結合蛋白質；及 6 1332987 (b)可擴增包含突變部位之目標核酸序列的如申請 專利範圍第1至7項中任一項之引子組，該引子組所含之 至少1種引子係設計成：與該核酸試料中之核酸序列或 其互補序列雜交時，可藉該突變之存在或不存在，而使 該引子與該核酸序列或其互補序列之間產生1以上之錯 配。 38. 如申請專利範圍第37項之套組，其中該引子組為可使該 目標核酸序列於等溫下擴增者。 39. 如申請專利範圍第37或38項之套組，其中該錯配結合蛋 白質為MutS、MSH2或MSH6，或者是該等之2種以上混 合物。 40. 如申請專利範圍第37或38項之套組，其中該第一引子係 設計成：可藉該突變之存在或不存在，而於該序列（A) 與該序列（Ac’）之間產生1以上之錯配者；或是，可藉該 突變之存在或不存在，而於該序列（Be)與該序列（B’)之 間產生1以上之錯配者。 41. 如申請專利範圍第37或38項之套組，其中該第二引子係 設計成：可藉該突變之存在或不存在，而於該序列（C) 與該序列（Cc，）之間產生1以上之錯配。 42. 如申請專利範圍第37或38項之套組，其中該引子組係如 申請專利範圍第2項之引子組，且該第三引子係設計 成：與該核酸試料中之核酸序列或其互補序列雜交時， 可藉該突變之存在或不存在，而於該核酸序列上或與其 互補序列之間產生1以上之錯配。 7 1332987 43. 如申請專利範圍第37或38項之套組，其更包含具有鏈置 換能之聚合酶。 44. 一種判定核酸試料中之核酸序列有無突變之方法，係包 含以下步驟而成者： (a) 準備核酸試料； (b) 準備如申請專利範圍第1〜7項中任一項之引子 組，其係可使包含突變部位之目標核酸序列擴增者； (c) 準備一與目標核酸序列雜交之核酸片段，該核酸 片段係設計成：與該核酸試料中之核酸序列或其互補序 列雜交時，藉該突變之存在或不存在，而使該核酸片段 與該核酸序列或與其互補序列之間產生1以上之錯配； 及 (d) 於錯配結合蛋白質及該核酸片段存在下，以該核 酸試料作為模板之該引子組進行核酸擴增反應。 45. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該引子組為可使目 標核酸序列於等溫下擴增者，且該核酸擴增反應係於等 溫下進行。 46. 如申請專利範圍第44或45項之方法，其中該錯配結合蛋 白質為MutS、MSH2或MSH6，或者是該等之2種以上混 合物。 47. 如申請專利範圍第44或45項之方法，其係使用具有鏈置 換能之聚合酶。 48. 如申請專利範圍第44或45項之方法，其中該核酸擴增反 應係於熔解溫度調整劑之存在下進行。 8 1332987 49. 如申請專利範圍第44或45項之方法，其中該核酸擴增反 應係於酶安定化劑之存在下進行。 50. —種判定核酸試料中之核酸序列有無突變之套組，包 含： (a) 錯配結合蛋白質； (b) 如申請專利範圍第1〜7項中任一項之引子組，其 係可使包含突變部位之目標核酸序列擴增者；及 (c) 與目標核酸序列雜交之核酸片段，該核酸片段係 設計成：與該核酸試料中之核酸序列或其互補序列雜交 時，藉該突變之存在或不存在，而使該核酸片段與該核 酸序列或與其互補序列之間產生1以上之錯配者。 51. 如申請專利範圍第50項之套組，其中該引子組為可使該 目標核酸序列於等溫下擴增者。 52. 如申請專利範圍第50或51項之套組，其中該錯配結合蛋 白質為MutS、MSH2或MSH6，或者是該等之2種以上混 合物。 53. 如申請專利範圍第50或51項之套組，其係更包含具有鏈 置換能之聚合酶而成者。 9