JPH10257900A - ミスマッチを含む核酸を分離する方法およびそのための試薬 - Google Patents
ミスマッチを含む核酸を分離する方法およびそのための試薬Info
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- JPH10257900A JPH10257900A JP8337026A JP33702696A JPH10257900A JP H10257900 A JPH10257900 A JP H10257900A JP 8337026 A JP8337026 A JP 8337026A JP 33702696 A JP33702696 A JP 33702696A JP H10257900 A JPH10257900 A JP H10257900A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】２本鎖ＤＮＡ集団中に含まれるミスマッチを含
む２本鎖ＤＮＡを分離する方法及び該方法に使用する試
薬の提供。 【解決手段】２本鎖核酸集団に、捕捉可能な物質、例え
ばビオチンを結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的
に結合する物質、例えばサーマス・サーモフィラス(The
rmus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触させ、
ミスマッチを含む２本鎖核酸と結合させ、該結合した物
質を、捕捉可能な物質と結合し得る物質、例えばストレ
プトアビジンを結合した固相担体と反応させ、該核酸集
団からミスマッチを含む核酸を分離することを特徴とす
るミスマッチを含む核酸を分離する方法及びそのための
試薬。
む２本鎖ＤＮＡを分離する方法及び該方法に使用する試
薬の提供。 【解決手段】２本鎖核酸集団に、捕捉可能な物質、例え
ばビオチンを結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的
に結合する物質、例えばサーマス・サーモフィラス(The
rmus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触させ、
ミスマッチを含む２本鎖核酸と結合させ、該結合した物
質を、捕捉可能な物質と結合し得る物質、例えばストレ
プトアビジンを結合した固相担体と反応させ、該核酸集
団からミスマッチを含む核酸を分離することを特徴とす
るミスマッチを含む核酸を分離する方法及びそのための
試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は２本鎖核酸、特に２
本鎖ＤＮＡ集団中に含まれるミスマッチを含む２本鎖Ｄ
ＮＡを分離する方法および該方法に使用する試薬に関す
る。
本鎖ＤＮＡ集団中に含まれるミスマッチを含む２本鎖Ｄ
ＮＡを分離する方法および該方法に使用する試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖相補的にＤ
ＮＡを合成していく際に、ある頻度で複製の誤りを起こ
すことが知られている。これらは、間違ったヌクレオチ
ドを取り込む挿入（ミスインコーポレーション）、欠
失、付加からなる。ＤＮＡ増幅反応によく用いられるｐ
ｏｌＩファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼにおけ
る、これらの複製の誤りの頻度がMathurらによって測定
されたことが開示される(Gene 108, 1-6,1991)。これに
よれば、Taq ＤＮＡポリメラーゼを用いて約100,000塩
基対を合成する度に、１．４〜２．５回の割合で複製の
誤りが起こることが示されている。また、3'-5' エキソ
ヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）をもつ
ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ
では、これよりも頻度が低く、約 1,000,000塩基対を合
成する度に、１．２〜２．０回の割合で複製の誤りが起
こるとされている。
ＮＡを合成していく際に、ある頻度で複製の誤りを起こ
すことが知られている。これらは、間違ったヌクレオチ
ドを取り込む挿入（ミスインコーポレーション）、欠
失、付加からなる。ＤＮＡ増幅反応によく用いられるｐ
ｏｌＩファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼにおけ
る、これらの複製の誤りの頻度がMathurらによって測定
されたことが開示される(Gene 108, 1-6,1991)。これに
よれば、Taq ＤＮＡポリメラーゼを用いて約100,000塩
基対を合成する度に、１．４〜２．５回の割合で複製の
誤りが起こることが示されている。また、3'-5' エキソ
ヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）をもつ
ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ
では、これよりも頻度が低く、約 1,000,000塩基対を合
成する度に、１．２〜２．０回の割合で複製の誤りが起
こるとされている。
【０００３】これらのＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｄ
ＮＡ増幅反応を行った場合、複製の誤りが起こった断片
を鋳型として、さらに増幅が進むため、得られた増幅産
物には鋳型とは異なる配列を持つ断片が多数存在するこ
とになる。従って、これらのＤＮＡポリメラーゼを用い
て増幅反応を行い、得られた遺伝子断片を取得し解析し
ようとする場合、その信頼性が常に問題となっていた。
ＮＡ増幅反応を行った場合、複製の誤りが起こった断片
を鋳型として、さらに増幅が進むため、得られた増幅産
物には鋳型とは異なる配列を持つ断片が多数存在するこ
とになる。従って、これらのＤＮＡポリメラーゼを用い
て増幅反応を行い、得られた遺伝子断片を取得し解析し
ようとする場合、その信頼性が常に問題となっていた。
【０００４】Wagnerらはグルコカイネースのエクソン３
領域の増幅反応を行い、得られたＤＮＡ断片を変性し、
再結合して、鋳型とは異なる配列をもつ断片にミスマッ
チを形成させ、固相化した大腸菌由来のミスマッチＤＮ
Ａ結合蛋白質、ＭｕｔＳを用いて、それを分離する方法
を提案した（WO 95/12689)。しかしながら、この方法で
は大腸菌由来のＭｕｔＳを固相支持担体に結合させると
いう煩雑な工程を必要とする。また、固相上でミスマッ
チＤＮＡ結合反応を行うため、少量のサンプルを用いる
場合、反応液の回収効率が悪く不向きである。さらに大
腸菌由来のＭｕｔＳは非常に不安定であり、ＤＮＡ増幅
反応中の温度では使えないうえに保存が難しいという問
題点を抱えていた。
領域の増幅反応を行い、得られたＤＮＡ断片を変性し、
再結合して、鋳型とは異なる配列をもつ断片にミスマッ
チを形成させ、固相化した大腸菌由来のミスマッチＤＮ
Ａ結合蛋白質、ＭｕｔＳを用いて、それを分離する方法
を提案した（WO 95/12689)。しかしながら、この方法で
は大腸菌由来のＭｕｔＳを固相支持担体に結合させると
いう煩雑な工程を必要とする。また、固相上でミスマッ
チＤＮＡ結合反応を行うため、少量のサンプルを用いる
場合、反応液の回収効率が悪く不向きである。さらに大
腸菌由来のＭｕｔＳは非常に不安定であり、ＤＮＡ増幅
反応中の温度では使えないうえに保存が難しいという問
題点を抱えていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、２本鎖核酸、
特にＤＮＡの集団からミスマッチを持つ核酸断片を分離
する簡便な方法の開発が望まれていた。
特にＤＮＡの集団からミスマッチを持つ核酸断片を分離
する簡便な方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは種々鋭意検
討した結果、捕捉可能な物質、例えばビオチンと結合し
た２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物質を
用いることによって、２本鎖ＤＮＡ集団からミスマッチ
配列を含む断片を簡便に分離できる方法を構築した。さ
らに、２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物
質として、高度好熱菌由来の２本鎖ＤＮＡのミスマッチ
に特異的に結合するＭｕｔＳ蛋白質を用いることによっ
て、高温のＤＮＡ増幅反応液中で２本鎖ＤＮＡ集団から
ミスマッチ配列を含むＤＮＡ断片を簡便に分離できる方
法を見い出し本発明に到達した。
討した結果、捕捉可能な物質、例えばビオチンと結合し
た２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物質を
用いることによって、２本鎖ＤＮＡ集団からミスマッチ
配列を含む断片を簡便に分離できる方法を構築した。さ
らに、２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物
質として、高度好熱菌由来の２本鎖ＤＮＡのミスマッチ
に特異的に結合するＭｕｔＳ蛋白質を用いることによっ
て、高温のＤＮＡ増幅反応液中で２本鎖ＤＮＡ集団から
ミスマッチ配列を含むＤＮＡ断片を簡便に分離できる方
法を見い出し本発明に到達した。
【０００７】すなわち本発明は２本鎖核酸集団（Ａ）
に、捕捉可能な物質（Ｂ）を結合した２本鎖核酸のミス
マッチに特異的に結合する物質（Ｃ）を接触させ、該２
本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質（Ｃ）と
２本鎖核酸集団（Ａ）中のミスマッチを含む２本鎖核酸
（Ｄ）を結合させ、該結合した物質（Ｅ）の捕捉可能な
物質（Ｂ）を、該物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物
質（Ｆ）と結合させ、該核酸集団（Ａ）からミスマッチ
を含む核酸（Ｄ）を分離することを特徴とするミスマッ
チを含む核酸を分離する方法である。
に、捕捉可能な物質（Ｂ）を結合した２本鎖核酸のミス
マッチに特異的に結合する物質（Ｃ）を接触させ、該２
本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質（Ｃ）と
２本鎖核酸集団（Ａ）中のミスマッチを含む２本鎖核酸
（Ｄ）を結合させ、該結合した物質（Ｅ）の捕捉可能な
物質（Ｂ）を、該物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物
質（Ｆ）と結合させ、該核酸集団（Ａ）からミスマッチ
を含む核酸（Ｄ）を分離することを特徴とするミスマッ
チを含む核酸を分離する方法である。
【０００８】また、本発明は捕捉可能な物質（Ｂ）を結
合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質
（Ｃ）および該物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物質
（Ｆ）を含むことを特徴とするミスマッチを含むＤＮＡ
を分離するための試薬キットである。
合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質
（Ｃ）および該物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物質
（Ｆ）を含むことを特徴とするミスマッチを含むＤＮＡ
を分離するための試薬キットである。
【０００９】
【発明の実施態様】本発明において、２本鎖核酸集団
（Ａ）とは２本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ／
ＲＮＡハイブリッドなどがあり、ミスマッチ配列を含む
核酸断片を含む。本発明において、ミスマッチ配列を含
む核酸（Ｄ）とはＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ以外の塩基対が含まれ
るもの、あるいは５塩基対以内の相補鎖をもたない部分
（ループ構造）が含まれるものをいう。
（Ａ）とは２本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ／
ＲＮＡハイブリッドなどがあり、ミスマッチ配列を含む
核酸断片を含む。本発明において、ミスマッチ配列を含
む核酸（Ｄ）とはＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ以外の塩基対が含まれ
るもの、あるいは５塩基対以内の相補鎖をもたない部分
（ループ構造）が含まれるものをいう。
【００１０】本発明において、捕捉可能な物質（Ｂ）と
しては、例えばビオチン、アビジン、ジゴキシゲニンま
たは抗ジゴキシゲニン抗体などが挙げられる。また、該
捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる物質（Ｆ）として
は、ビオチンではアビジン、アビジンではビオチン、ジ
ゴキシゲニンでは抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジゴキシゲ
ニン抗体ではジゴキシゲニンまたはＭｕｔＳでは抗Ｍｕ
ｔＳ抗体が挙げられる。アビジンとしてはストレプトア
ビジンなども使用できる。該捕捉しうる物質（Ｆ）は担
体に結合されて固相化されている。
しては、例えばビオチン、アビジン、ジゴキシゲニンま
たは抗ジゴキシゲニン抗体などが挙げられる。また、該
捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる物質（Ｆ）として
は、ビオチンではアビジン、アビジンではビオチン、ジ
ゴキシゲニンでは抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジゴキシゲ
ニン抗体ではジゴキシゲニンまたはＭｕｔＳでは抗Ｍｕ
ｔＳ抗体が挙げられる。アビジンとしてはストレプトア
ビジンなども使用できる。該捕捉しうる物質（Ｆ）は担
体に結合されて固相化されている。
【００１１】本発明において使用する担体としては、水
不溶性有機高分子材料、例えば多孔質シリカ、多孔質ガ
ラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、ニトロセ
ルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキス
トラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなど
の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コ
ラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体などが例
示される。また、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレ
ート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルま
たはこれらの共重合体なども例示される。また、水不溶
性無機高分子材料、例えば酸化アルミニウム、酸化チタ
ンなどがある。固相としては、その形状は粒子、膜、フ
ィルターなどがある。固相としては粒子が特に好まし
く、その表面は多孔質または非多孔質であってもよい。
粒子の平均的な粒径は、遠心分離などの簡便な操作で粒
子を回収するために、０．０１μｍ以上、好ましくは
０．０５μｍ以上である。一方、粒子の単位沈降体積当
たりの表面積を大きくし、かつハイブリッド形成に適当
な条件下で固相が均一に分散する状態を保つことによっ
て、高いハイブリッド形成効率を達成するためには、２
０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下である。磁性化さ
れた固相としては、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の
微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子（特表
平4-501959) 、重合性シラン被膜によって覆われた超常
磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子 (特公平7-6986) 、有
機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子な
どが例示される。磁性化された固相は、固体および液体
の分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。
不溶性有機高分子材料、例えば多孔質シリカ、多孔質ガ
ラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、ニトロセ
ルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキス
トラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなど
の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コ
ラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体などが例
示される。また、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレ
ート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルま
たはこれらの共重合体なども例示される。また、水不溶
性無機高分子材料、例えば酸化アルミニウム、酸化チタ
ンなどがある。固相としては、その形状は粒子、膜、フ
ィルターなどがある。固相としては粒子が特に好まし
く、その表面は多孔質または非多孔質であってもよい。
粒子の平均的な粒径は、遠心分離などの簡便な操作で粒
子を回収するために、０．０１μｍ以上、好ましくは
０．０５μｍ以上である。一方、粒子の単位沈降体積当
たりの表面積を大きくし、かつハイブリッド形成に適当
な条件下で固相が均一に分散する状態を保つことによっ
て、高いハイブリッド形成効率を達成するためには、２
０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下である。磁性化さ
れた固相としては、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の
微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子（特表
平4-501959) 、重合性シラン被膜によって覆われた超常
磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子 (特公平7-6986) 、有
機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子な
どが例示される。磁性化された固相は、固体および液体
の分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。
【００１２】本発明において使用する２本鎖核酸のミス
マッチに特異的に結合する物質（Ｃ）とは、ミスマッチ
を含む核酸、特にＤＮＡを認識し、かつ結合する蛋白質
であり、ミスマッチ結合蛋白質（ＭｕｔＳ蛋白質）と称
する。このＭｕｔＳ蛋白質としては、E.coliミスマッチ
修復系の成分などが確認されている。また、サルモネラ
・チフムリウム (Salmonella typhimurim)のＭｕｔＳ、
ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pne
umoniae)のｈｅｘＡなどを含む他の微生物由来のものも
知られている。さらに、高度好熱菌、例えばサーマス・
サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ
蛋白質がある。該蛋白質は、本発明者らによってクロー
ニングされ、大量発現に成功しており、その性質が解析
され、60℃においてもミスマッチＤＮＡ結合能が保持さ
れており、熱安定性に優れる(Nucleic Acids Research
24, 640-647 (1996)) 。
マッチに特異的に結合する物質（Ｃ）とは、ミスマッチ
を含む核酸、特にＤＮＡを認識し、かつ結合する蛋白質
であり、ミスマッチ結合蛋白質（ＭｕｔＳ蛋白質）と称
する。このＭｕｔＳ蛋白質としては、E.coliミスマッチ
修復系の成分などが確認されている。また、サルモネラ
・チフムリウム (Salmonella typhimurim)のＭｕｔＳ、
ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pne
umoniae)のｈｅｘＡなどを含む他の微生物由来のものも
知られている。さらに、高度好熱菌、例えばサーマス・
サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ
蛋白質がある。該蛋白質は、本発明者らによってクロー
ニングされ、大量発現に成功しており、その性質が解析
され、60℃においてもミスマッチＤＮＡ結合能が保持さ
れており、熱安定性に優れる(Nucleic Acids Research
24, 640-647 (1996)) 。
【００１３】高度好熱菌、サーマス・サーモフィラス(T
hermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質が熱安定性
に優れることは、以下の点で大きな効果をもたらす。す
なわち、従来より使用されていた大腸菌由来のＭｕｔｓ
蛋白質は、特に不安定で−８０℃で保存しなければなら
ない。また、上記のミスマッチを含むＤＮＡを分離する
ために、固相化あるいはビオチン化する場合などは回収
率が悪いことが予想される。これに対し、高度好熱菌、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来
のＭｕｔＳ蛋白質は４℃で６ヶ月以上安定で、かつ固相
化あるいはビオチン化する場合などでも回収率が良い。
hermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質が熱安定性
に優れることは、以下の点で大きな効果をもたらす。す
なわち、従来より使用されていた大腸菌由来のＭｕｔｓ
蛋白質は、特に不安定で−８０℃で保存しなければなら
ない。また、上記のミスマッチを含むＤＮＡを分離する
ために、固相化あるいはビオチン化する場合などは回収
率が悪いことが予想される。これに対し、高度好熱菌、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来
のＭｕｔＳ蛋白質は４℃で６ヶ月以上安定で、かつ固相
化あるいはビオチン化する場合などでも回収率が良い。
【００１４】さらには、高度好熱菌、サーマス・サーモ
フィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質
は６０℃でもミスマッチＤＮＡ結合能が保持されている
ため、増幅反応中の高温下でも作用させることが可能と
なる。ＤＮＡ増幅反応の任意のサイクルにおけるプライ
マーと鋳型のアニーリング、またはプライマーの伸長反
応、またはその両方の反応を行い、それらの反応終了
後、捕捉可能な物質、例えばビオチンを固相化した、捕
捉可能な物質と結合し得る物質、例えばストレプトアビ
ジンと結合させ、増幅中のＤＮＡ集団からミスマッチを
含むＤＮＡを分離することができる。
フィラス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質
は６０℃でもミスマッチＤＮＡ結合能が保持されている
ため、増幅反応中の高温下でも作用させることが可能と
なる。ＤＮＡ増幅反応の任意のサイクルにおけるプライ
マーと鋳型のアニーリング、またはプライマーの伸長反
応、またはその両方の反応を行い、それらの反応終了
後、捕捉可能な物質、例えばビオチンを固相化した、捕
捉可能な物質と結合し得る物質、例えばストレプトアビ
ジンと結合させ、増幅中のＤＮＡ集団からミスマッチを
含むＤＮＡを分離することができる。
【００１５】精製されたＭｕｔＳ蛋白質はミスマッチ結
合対の塩基を含むＤＮＡと結合するが、ミスマッチを有
しないＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡとは結合しない。この
ＭｕｔＳ−ＤＮＡの相互作用は、ＤＮＡの分解(degrada
tion) や変性(modification)を生じえない。
合対の塩基を含むＤＮＡと結合するが、ミスマッチを有
しないＤＮＡまたは１本鎖ＤＮＡとは結合しない。この
ＭｕｔＳ−ＤＮＡの相互作用は、ＤＮＡの分解(degrada
tion) や変性(modification)を生じえない。
【００１６】本発明ではミスマッチを含むＤＮＡ断片の
分離をさらに簡便に行うために、ＭｕｔＳ蛋白質を捕捉
可能な物質、例えばビオチンと結合する。これにより液
相中でミスマッチを含む核酸を該Ｍｕｓ蛋白質と結合し
た後、結合した物質のビオチンを固相化されたストレプ
トアビジンと結合させ、ミスマッチを含む核酸を液相か
ら分離することができる。
分離をさらに簡便に行うために、ＭｕｔＳ蛋白質を捕捉
可能な物質、例えばビオチンと結合する。これにより液
相中でミスマッチを含む核酸を該Ｍｕｓ蛋白質と結合し
た後、結合した物質のビオチンを固相化されたストレプ
トアビジンと結合させ、ミスマッチを含む核酸を液相か
ら分離することができる。
【００１７】ＭｕｔＳ蛋白質と捕捉可能な物質、例えば
ビオチンとの結合は、以下のように簡単に行うことがで
きる。例えばビオチンアミドカプロエート−Ｎ−ヒドロ
キシサルフォスクシニミドエステル(BAC-SulfoNHS)を用
いて、室温でＭｕｓ蛋白質と３０分間反応するだけで、
容易にビオチン結合Ｍｕｓ蛋白質を合成することができ
る。ＭｕｔＳ蛋白質１分子あたりのビオチン分子の結合
数は、好ましくは１から３分子である。これは反応時の
ＭｕｔＳ蛋白質とBAC-SulfoNHSのモル比を１：８から
１：１６にすることで合成される。ＭｕｔＳ蛋白質１分
子あたりのビオチン分子の結合数が５分子を超えると、
ＭｕｔＳ蛋白質の結合能が阻害されるので好ましくな
い。
ビオチンとの結合は、以下のように簡単に行うことがで
きる。例えばビオチンアミドカプロエート−Ｎ−ヒドロ
キシサルフォスクシニミドエステル(BAC-SulfoNHS)を用
いて、室温でＭｕｓ蛋白質と３０分間反応するだけで、
容易にビオチン結合Ｍｕｓ蛋白質を合成することができ
る。ＭｕｔＳ蛋白質１分子あたりのビオチン分子の結合
数は、好ましくは１から３分子である。これは反応時の
ＭｕｔＳ蛋白質とBAC-SulfoNHSのモル比を１：８から
１：１６にすることで合成される。ＭｕｔＳ蛋白質１分
子あたりのビオチン分子の結合数が５分子を超えると、
ＭｕｔＳ蛋白質の結合能が阻害されるので好ましくな
い。
【００１８】このようにあらかじめ、捕捉可能な物質、
例えばビオチンと結合されたＭｕｔＳ蛋白質を用いるこ
とにより、比較的少量の溶液（１００μｌ以下）でミス
マッチを含むＤＮＡとの結合反応を行い、固相化された
捕捉可能な物質と結合し得る物質、例えばアビジンと捕
捉可能な物質、例えばビオチンを結合させることによ
り、ミスマッチを含むＤＮＡを液相中から除くことがで
きる。固相化された、捕捉可能な物質と結合し得る物質
（Ｆ）、例えば固相化されたアビジンは、例えば磁気ビ
ーズに結合されたアビジンである。この場合は磁石を接
近させてビーズを集合させ、液相のみを効率よく回収で
きる。また、固相化されたストレプトアビジンは、例え
ばビーズに結合されたストレプトアビジンがある。この
場合は遠心分離によりビーズを集合させて、液相のみを
効率よく回収できる。回収された反応液はそのまま次の
反応に供することができる。
例えばビオチンと結合されたＭｕｔＳ蛋白質を用いるこ
とにより、比較的少量の溶液（１００μｌ以下）でミス
マッチを含むＤＮＡとの結合反応を行い、固相化された
捕捉可能な物質と結合し得る物質、例えばアビジンと捕
捉可能な物質、例えばビオチンを結合させることによ
り、ミスマッチを含むＤＮＡを液相中から除くことがで
きる。固相化された、捕捉可能な物質と結合し得る物質
（Ｆ）、例えば固相化されたアビジンは、例えば磁気ビ
ーズに結合されたアビジンである。この場合は磁石を接
近させてビーズを集合させ、液相のみを効率よく回収で
きる。また、固相化されたストレプトアビジンは、例え
ばビーズに結合されたストレプトアビジンがある。この
場合は遠心分離によりビーズを集合させて、液相のみを
効率よく回収できる。回収された反応液はそのまま次の
反応に供することができる。
【００１９】本発明において回収された反応液はそのま
ま、次の増幅サイクルに供することができる。上記分離
操作はアニーリング、伸長反応、２本鎖分離の各サイク
ル毎に行っても良いし、ある間隔を置いたサイクル毎に
行っても良い。また、任意のサイクルのあとに１回行っ
ても良い。このように増幅サイクルの途中でミスマッチ
を含むＤＮＡを分離すると、これが鋳型となって増幅す
ることを防止することができ、従って、本来の鋳型とは
異なる配列を含むがミスマッチを含まない断片の生成を
抑制することができる。
ま、次の増幅サイクルに供することができる。上記分離
操作はアニーリング、伸長反応、２本鎖分離の各サイク
ル毎に行っても良いし、ある間隔を置いたサイクル毎に
行っても良い。また、任意のサイクルのあとに１回行っ
ても良い。このように増幅サイクルの途中でミスマッチ
を含むＤＮＡを分離すると、これが鋳型となって増幅す
ることを防止することができ、従って、本来の鋳型とは
異なる配列を含むがミスマッチを含まない断片の生成を
抑制することができる。
【００２０】ミスマッチ配列を含むＤＮＡ断片を分離さ
れるべき２本鎖ＤＮＡ集団（Ａ）はどのような由来のも
のであってもよいが、例えばＤＮＡ増幅反応の任意のサ
イクル終了後に得られる集団、または、ＤＮＡ増幅反応
の任意のサイクル終了後に変性し、再結合を行った集団
が含まれる。ある増幅サイクルの伸長反応で複製の誤り
が起こると、その後、それが鋳型として使用されるため
に、本来の鋳型とは異なる配列を含むがミスマッチを含
まない断片が生じる。この断片を一旦変性し、他の本来
の鋳型と同じ配列を持つ断片と再結合させることによ
り、任意のサイクルで複製の誤りが起こった部位にミス
マッチ配列を形成させることができる（図２参照）。
れるべき２本鎖ＤＮＡ集団（Ａ）はどのような由来のも
のであってもよいが、例えばＤＮＡ増幅反応の任意のサ
イクル終了後に得られる集団、または、ＤＮＡ増幅反応
の任意のサイクル終了後に変性し、再結合を行った集団
が含まれる。ある増幅サイクルの伸長反応で複製の誤り
が起こると、その後、それが鋳型として使用されるため
に、本来の鋳型とは異なる配列を含むがミスマッチを含
まない断片が生じる。この断片を一旦変性し、他の本来
の鋳型と同じ配列を持つ断片と再結合させることによ
り、任意のサイクルで複製の誤りが起こった部位にミス
マッチ配列を形成させることができる（図２参照）。
【００２１】このようにして得られた核酸集団に対し、
本発明の方法でミスマッチ配列を含む核酸断片を分離す
ることにより、本来の鋳型とは異なる配列を含む断片を
除去することができる。上記分離操作は増幅の各サイク
ル毎に行っても良いし、ある間隔を置いたサイクル毎に
行っても良い。また、任意のサイクルのあとに１回行っ
ても良い。このように増幅サイクルの途中でミスマッチ
を含むＤＮＡを分離すると、これが鋳型となって増幅す
ることを防止することができ、従って、本来の鋳型とは
異なる配列を含むがミスマッチを含まない断片の生成を
抑制することができる。ＤＮＡ増幅反応はＰＣＲ、ＮＡ
ＳＢＡ、鎖置換増幅、３ＳＲなどが含まれる。
本発明の方法でミスマッチ配列を含む核酸断片を分離す
ることにより、本来の鋳型とは異なる配列を含む断片を
除去することができる。上記分離操作は増幅の各サイク
ル毎に行っても良いし、ある間隔を置いたサイクル毎に
行っても良い。また、任意のサイクルのあとに１回行っ
ても良い。このように増幅サイクルの途中でミスマッチ
を含むＤＮＡを分離すると、これが鋳型となって増幅す
ることを防止することができ、従って、本来の鋳型とは
異なる配列を含むがミスマッチを含まない断片の生成を
抑制することができる。ＤＮＡ増幅反応はＰＣＲ、ＮＡ
ＳＢＡ、鎖置換増幅、３ＳＲなどが含まれる。
【００２２】ＰＣＲとは、下記工程を含む核酸配列の増
幅方法である。 工程Ａ．必要により標的核酸を熱変性して、１本鎖核酸
とする： 工程Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を
有する正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮ
ＴＰを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で
反応させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさ
せ、プライマー伸長反応を行う： 工程Ｃ．プライマー伸長物を部売りして、１本鎖とす
る： 工程Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す。
幅方法である。 工程Ａ．必要により標的核酸を熱変性して、１本鎖核酸
とする： 工程Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を
有する正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮ
ＴＰを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で
反応させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさ
せ、プライマー伸長反応を行う： 工程Ｃ．プライマー伸長物を部売りして、１本鎖とす
る： 工程Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す。
【００２３】ＮＡＳＢＡおよび３ＳＲとは、下記工程を
含む核酸配列の増幅方法である。 工程Ａ．標的核酸を必要により変性処理した１本鎖の第
１鋳型に、第１鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して充分
に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配
列を有する第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第１鋳型
ＲＮＡに相補的な第２鋳型である第１プライマー伸長物
（ＤＮＡ）を得る： 工程Ｂ．第１鋳型ＤＮＡから第２鋳型ＤＮＡを分離し
て、１本鎖の第２鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る： 工程Ｃ．１本鎖の第２鋳型ＤＮＡに、第２鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第
２プライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼにより伸長し、第２鋳型ＤＮＡに相補的な
第２プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして
標的核酸配列に上流にプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡ中間体を生成させ： 工程Ｄ．前記プロモーター配列を認識することができる
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記２本鎖Ｄ
ＮＡ中間体から前記標的核酸の多数のＲＮＡコピーを増
加させ： 工程Ｅ．必要により、前記ＲＮＡコピーを用いて、下記
工程１〜４を必要な回数繰り返す。
含む核酸配列の増幅方法である。 工程Ａ．標的核酸を必要により変性処理した１本鎖の第
１鋳型に、第１鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して充分
に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配
列を有する第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第１鋳型
ＲＮＡに相補的な第２鋳型である第１プライマー伸長物
（ＤＮＡ）を得る： 工程Ｂ．第１鋳型ＤＮＡから第２鋳型ＤＮＡを分離し
て、１本鎖の第２鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る： 工程Ｃ．１本鎖の第２鋳型ＤＮＡに、第２鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第
２プライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼにより伸長し、第２鋳型ＤＮＡに相補的な
第２プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして
標的核酸配列に上流にプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡ中間体を生成させ： 工程Ｄ．前記プロモーター配列を認識することができる
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記２本鎖Ｄ
ＮＡ中間体から前記標的核酸の多数のＲＮＡコピーを増
加させ： 工程Ｅ．必要により、前記ＲＮＡコピーを用いて、下記
工程１〜４を必要な回数繰り返す。
【００２４】ＮＡＳＢＡは工程Ｂ．においてＲＮａｓｅ
Ｈを使用し、３ＳＲは熱変性により第１鋳型ＤＮＡから
第２鋳型ＤＮＡを分離する。
Ｈを使用し、３ＳＲは熱変性により第１鋳型ＤＮＡから
第２鋳型ＤＮＡを分離する。
【００２５】鎖置換増幅とは、下記工程を含む核酸配列
の増幅方法である。 工程Ａ．少なくとも１つが置換された過剰量のデオキシ
ヌクレオシド３リン酸、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、標的配列の１本鎖に相
補的で、５’末端にエンドヌクレアーゼのための認識配
列を有する複数のプライマー、および前記認識配列から
なる２本鎖の一方の鎖が置換塩基対を含む場合にいずれ
か一方の鎖を切断できるエンドヌクレアーゼからなる反
応混合物を標的核酸配列に添加し： 工程Ｂ．反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合
物と１本鎖断片を反応させる。
の増幅方法である。 工程Ａ．少なくとも１つが置換された過剰量のデオキシ
ヌクレオシド３リン酸、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、標的配列の１本鎖に相
補的で、５’末端にエンドヌクレアーゼのための認識配
列を有する複数のプライマー、および前記認識配列から
なる２本鎖の一方の鎖が置換塩基対を含む場合にいずれ
か一方の鎖を切断できるエンドヌクレアーゼからなる反
応混合物を標的核酸配列に添加し： 工程Ｂ．反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合
物と１本鎖断片を反応させる。
【００２６】本発明の具体的な実施態様としては、２本
鎖ＤＮＡ集団にビオチン化したミスマッチ結合物質（高
度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質）を接触さ
せ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該
結合した物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団からミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮ
Ａを分離することよりなる方法がある（図１参照）。
鎖ＤＮＡ集団にビオチン化したミスマッチ結合物質（高
度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質）を接触さ
せ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該
結合した物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団からミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮ
Ａを分離することよりなる方法がある（図１参照）。
【００２７】さらに具体的な実施態様としては、２本鎖
ＤＮＡ集団に、ビオチン化したサーマス・サーモフィラ
ス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触
させ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片と結合さ
せ、該結合した物質を固相化したストレプトアビジンと
結合させ、該ＤＮＡ集団からミスマッチ配列を含むＤＮ
Ａを分離する方法がある。
ＤＮＡ集団に、ビオチン化したサーマス・サーモフィラ
ス(Thermus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触
させ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片と結合さ
せ、該結合した物質を固相化したストレプトアビジンと
結合させ、該ＤＮＡ集団からミスマッチ配列を含むＤＮ
Ａを分離する方法がある。
【００２８】本発明の別な実施態様としては、ＤＮＡ増
幅反応の任意のサイクル終了後に得られる２本鎖ＤＮＡ
集団に、ビオチン化した２本鎖ＤＮＡのミスマッチ配列
に特異的に結合する物質を接触させ、ミスマッチ配列を
含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該結合した物質を固相化
したストレプトアビジンと結合させ、該ＤＮＡ集団から
ミスマッチ配列を含むＤＮＡを分離する方法がある。
幅反応の任意のサイクル終了後に得られる２本鎖ＤＮＡ
集団に、ビオチン化した２本鎖ＤＮＡのミスマッチ配列
に特異的に結合する物質を接触させ、ミスマッチ配列を
含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該結合した物質を固相化
したストレプトアビジンと結合させ、該ＤＮＡ集団から
ミスマッチ配列を含むＤＮＡを分離する方法がある。
【００２９】本発明のさらに別な実施態様としては、Ｄ
ＮＡ増幅反応の任意のサイクル終了後に変性し、再結合
して得られる２本鎖ＤＮＡ集団に、ビオチン化した２本
鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物質を接触さ
せ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該
結合した物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離す
る方法もある。
ＮＡ増幅反応の任意のサイクル終了後に変性し、再結合
して得られる２本鎖ＤＮＡ集団に、ビオチン化した２本
鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物質を接触さ
せ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させ、該
結合した物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離す
る方法もある。
【００３０】本発明としては、ＤＮＡ増幅反応の任意の
サイクル終了後に得られる２本鎖ＤＮＡ集団とビオチン
化した高度好熱菌由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触させる工
程を、ＤＮＡ増幅反応の任意のサイクルにおけるプライ
マーと鋳型のアニーリングまたはプライマーの伸長反応
またはその両方の反応で行い、それらの反応終了後、該
物質を固相化したストレプトアビジンと結合させ、該Ｄ
ＮＡ集団からミスマッチ配列を含むＤＮＡ断片を分離す
る方法もある。
サイクル終了後に得られる２本鎖ＤＮＡ集団とビオチン
化した高度好熱菌由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触させる工
程を、ＤＮＡ増幅反応の任意のサイクルにおけるプライ
マーと鋳型のアニーリングまたはプライマーの伸長反応
またはその両方の反応で行い、それらの反応終了後、該
物質を固相化したストレプトアビジンと結合させ、該Ｄ
ＮＡ集団からミスマッチ配列を含むＤＮＡ断片を分離す
る方法もある。
【００３１】本発明は、捕捉可能な物質（Ｂ）を結合し
た２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質
（Ｃ）および該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相
化した物質（Ｆ）を含むことを特徴とするミスマッチを
含むＤＮＡ断片を分離するための試薬であり、その一実
施態様としてはビオチン化した２本鎖ＤＮＡのミスマッ
チに特異的に結合する物質および固相化したアビジン類
を含む。２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物
質１分子あたりに結合された捕捉可能な物質（Ｂ）の分
子数は、１〜１０、好ましくは１〜２である。捕捉可能
な物質（Ｂ）を結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異
的に結合する物質（Ｃ）を含む試薬は、他に蒸留水、バ
ッファーを含む。また、該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉
しうる固相化した物質（Ｆ）は、捕捉可能な物質（Ｂ）
を結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する
物質（Ｃ）を含む試薬と別個な試薬とすることが好まし
い。該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物
質（Ｆ）は捕捉可能な物質（Ｂ）より多いことが好まし
い。
た２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質
（Ｃ）および該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相
化した物質（Ｆ）を含むことを特徴とするミスマッチを
含むＤＮＡ断片を分離するための試薬であり、その一実
施態様としてはビオチン化した２本鎖ＤＮＡのミスマッ
チに特異的に結合する物質および固相化したアビジン類
を含む。２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物
質１分子あたりに結合された捕捉可能な物質（Ｂ）の分
子数は、１〜１０、好ましくは１〜２である。捕捉可能
な物質（Ｂ）を結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異
的に結合する物質（Ｃ）を含む試薬は、他に蒸留水、バ
ッファーを含む。また、該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉
しうる固相化した物質（Ｆ）は、捕捉可能な物質（Ｂ）
を結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する
物質（Ｃ）を含む試薬と別個な試薬とすることが好まし
い。該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物
質（Ｆ）は捕捉可能な物質（Ｂ）より多いことが好まし
い。
【００３２】
【実施例】次に本発明を実施例を用いて説明する。実施例１ サーマス・サーモフィラス(Thermus thermop
hilus)ＨＢ８株由来のＭｕｔＳ蛋白質のビオチン化反応 サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ＨＢ
８株由来のＭｕｔＳ蛋白質（以下、TthMutSと記す）の
調製は、高松らによって開示された方法(Nucleic Acids
Research, 24 640-647, 1996)に従った。ビオチン化反
応はイムノプローブＴＭビオチニレーションキット（シ
グマ社製）を使用した。精製されたTthMutS ２５０μｇ
とビオチンアミドカプロエート−Ｎ−ヒドロキシサルフ
ォスクシニミドエステル(BAC-SulfoNHS)１０μｇとを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5) １００ｍｌ中
で室温で３０分間反応した。反応液を１０ｍＭリン酸ナ
トリウム液で緩衝化したセファクリルＧ−２５カラム(1
cmφX 5cm)にかけ、未反応の BAC-SulfoNHS と TthMutS
を分離した。TthMutS １分子あたりに結合されたビオチ
ン分子の数を、上記キットに添付された試薬を用いて、
アビジンーＨＡＢＡアッセイによって測定した。その結
果、TthMuts １分子あたり２．５個のビオチン分子が結
合されていた。
hilus)ＨＢ８株由来のＭｕｔＳ蛋白質のビオチン化反応 サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ＨＢ
８株由来のＭｕｔＳ蛋白質（以下、TthMutSと記す）の
調製は、高松らによって開示された方法(Nucleic Acids
Research, 24 640-647, 1996)に従った。ビオチン化反
応はイムノプローブＴＭビオチニレーションキット（シ
グマ社製）を使用した。精製されたTthMutS ２５０μｇ
とビオチンアミドカプロエート−Ｎ−ヒドロキシサルフ
ォスクシニミドエステル(BAC-SulfoNHS)１０μｇとを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5) １００ｍｌ中
で室温で３０分間反応した。反応液を１０ｍＭリン酸ナ
トリウム液で緩衝化したセファクリルＧ−２５カラム(1
cmφX 5cm)にかけ、未反応の BAC-SulfoNHS と TthMutS
を分離した。TthMutS １分子あたりに結合されたビオチ
ン分子の数を、上記キットに添付された試薬を用いて、
アビジンーＨＡＢＡアッセイによって測定した。その結
果、TthMuts １分子あたり２．５個のビオチン分子が結
合されていた。
【００３３】実施例２ ｐＭＯＬ２１のＰＣＲによる増
幅 プラスミド、ｐＭＯＬ２１（奈良先端大学 真木教授よ
り入手）はその分子中にアンピシリン耐性遺伝子及びｒ
ｐｓＬ遺伝子を有する。ｒｐｓＬ遺伝子の産物は大腸菌
細胞内１２ＳｒＲＮＡに結合することにより、その細胞
をストレプトマイシン感受性とする。従って、この遺伝
子に変異が生じ産物が機能しなくなったとき、その細胞
はストレプトマイシン耐性となる。ＤＮＡ増幅産物中に
含まれる複製の誤りの有無を評価するため、このプラス
ミドをＰＣＲにより増幅し、自己環状化した後、このプ
ラスドでもって大腸菌を形質転換し、ストレプトマイシ
ンを含む培地または含まない培地にて形成されたコロニ
ー数の比をもって、その変異率を算出した。
幅 プラスミド、ｐＭＯＬ２１（奈良先端大学 真木教授よ
り入手）はその分子中にアンピシリン耐性遺伝子及びｒ
ｐｓＬ遺伝子を有する。ｒｐｓＬ遺伝子の産物は大腸菌
細胞内１２ＳｒＲＮＡに結合することにより、その細胞
をストレプトマイシン感受性とする。従って、この遺伝
子に変異が生じ産物が機能しなくなったとき、その細胞
はストレプトマイシン耐性となる。ＤＮＡ増幅産物中に
含まれる複製の誤りの有無を評価するため、このプラス
ミドをＰＣＲにより増幅し、自己環状化した後、このプ
ラスドでもって大腸菌を形質転換し、ストレプトマイシ
ンを含む培地または含まない培地にて形成されたコロニ
ー数の比をもって、その変異率を算出した。
【００３４】以下に、ＰＣＲの条件を記す。ＰＣＲ反応液の調製 制限酵素ＥｃｏＲＩで消化されたｐＭＯＬ２１ １ｎｇ 増幅プライマーＰ１（配列番号１） １０ｐｍｏｌｅｓ 増幅プライマーＰ２（配列番号２） １０ｐｍｏｌｅｓ Pfu用１０×バッファー（Stratagene製） ５μｌ Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene製） ２．５単位 ２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μｌ 全量 ５０μｌ反応温度条件 ９４℃、３０秒 ５５℃、３０秒 ７２℃、３分サイクル数 ２５回
【００３５】得られた反応液に、以下の物質を添加し
た。 ５ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン（ベーリンガーマンハイム） ５μｌ ５Ｍ 酢酸アンモニウム ５０μｌ イソプロパノール １００μｌ
た。 ５ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン（ベーリンガーマンハイム） ５μｌ ５Ｍ 酢酸アンモニウム ５０μｌ イソプロパノール １００μｌ
【００３６】室温で上記反応液を１０分間放置した後、
15000ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収
した。７５％エタノール５０μｌで洗浄し、乾燥した
後、蒸留水４５μｌに溶解した。これに１０×Ｈバッフ
ァー（東洋紡）５μｌ、ＥｃｏＲＩ（東洋紡）１０単位
を加え、３７℃で１６時間反応した。反応終了後、フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、５０μｌのＴＥバッファーに溶解して、ｐＭＯＬ２
１増幅産物を得た。
15000ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収
した。７５％エタノール５０μｌで洗浄し、乾燥した
後、蒸留水４５μｌに溶解した。これに１０×Ｈバッフ
ァー（東洋紡）５μｌ、ＥｃｏＲＩ（東洋紡）１０単位
を加え、３７℃で１６時間反応した。反応終了後、フェ
ノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、５０μｌのＴＥバッファーに溶解して、ｐＭＯＬ２
１増幅産物を得た。
【００３７】実施例３ ビオチン化TthMutSによるミス
マッチを含むＤＮＡ断片の分離変性および再結合 実施例２で得られたｐＭＯＬ２１増幅産物を変性し、再
結合させ、複製の誤りが起こった部分にミスマッチを形
成させた。変性および再結合の条件は以下の通りであ
る。 反応液 ｐＭＯＬ２１増幅産物 ３１μｌ ２０％ＰＥＧ２００００ ５μｌ １０×Ｈバッファー（東洋紡） ４μｌ 上記反応液を９４℃、２分加熱した後、約２℃毎分で３
７℃まで冷却した。
マッチを含むＤＮＡ断片の分離変性および再結合 実施例２で得られたｐＭＯＬ２１増幅産物を変性し、再
結合させ、複製の誤りが起こった部分にミスマッチを形
成させた。変性および再結合の条件は以下の通りであ
る。 反応液 ｐＭＯＬ２１増幅産物 ３１μｌ ２０％ＰＥＧ２００００ ５μｌ １０×Ｈバッファー（東洋紡） ４μｌ 上記反応液を９４℃、２分加熱した後、約２℃毎分で３
７℃まで冷却した。
【００３８】ビオチン化TthMutSによるミスマッチを含
むＤＮＡ断片の分離のために、下記反応液を用意した。 蒸留水 １２μｌ 変性再結合したＤＮＡ ４μｌ １０×TthMutSバッファー ２μｌ （５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７ｍＭ２メルカプトエタノール） ビオチン化TthMutS ２μｌ
むＤＮＡ断片の分離のために、下記反応液を用意した。 蒸留水 １２μｌ 変性再結合したＤＮＡ ４μｌ １０×TthMutSバッファー ２μｌ （５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７ｍＭ２メルカプトエタノール） ビオチン化TthMutS ２μｌ
【００３９】上記反応液を６０℃、３０分保温したの
ち、あらかじめ１×TthMutS バッファー５０μｌで３回
洗浄したストレプトアビジン磁気ビーズ（ダイナル）
０．５ｍｇを懸濁した。室温で５分間放置したのち、磁
気スタンドでビーズを寄せ、上清を回収した。回収した
反応液のうち２μｌをとり、ライゲーションハイ（東洋
紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した後、大腸菌
ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに加えた。氷
上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間保温し、直
後に氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌを加え、３
７℃で１時間保温した。このうち、１００μｌをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート上で、
他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび
ストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プ
レート上で２０時間培養した。アンピシリンを含む培地
で形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシリン及びス
トレプトマイシンを含む培地で形成されたコロニー数
（Ｃｂ）をそれぞれ計数し、下記式により変異率（ｍ．
ｆ．）を算出した。 ｍ．ｆ．＝Ｃｂ＊１００／（Ｃａ＊９）
ち、あらかじめ１×TthMutS バッファー５０μｌで３回
洗浄したストレプトアビジン磁気ビーズ（ダイナル）
０．５ｍｇを懸濁した。室温で５分間放置したのち、磁
気スタンドでビーズを寄せ、上清を回収した。回収した
反応液のうち２μｌをとり、ライゲーションハイ（東洋
紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した後、大腸菌
ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに加えた。氷
上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間保温し、直
後に氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌを加え、３
７℃で１時間保温した。このうち、１００μｌをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート上で、
他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび
ストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プ
レート上で２０時間培養した。アンピシリンを含む培地
で形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシリン及びス
トレプトマイシンを含む培地で形成されたコロニー数
（Ｃｂ）をそれぞれ計数し、下記式により変異率（ｍ．
ｆ．）を算出した。 ｍ．ｆ．＝Ｃｂ＊１００／（Ｃａ＊９）
【００４０】図３に示されるように、TthMutSを加えて
いない試料に比して、TthMutSを加えた試料は有意に変
異率が低下し、従って、変性および再結合により複製の
誤りが起こった部分にミスマッチを形成させたＤＮＡが
分離されたことを示す。
いない試料に比して、TthMutSを加えた試料は有意に変
異率が低下し、従って、変性および再結合により複製の
誤りが起こった部分にミスマッチを形成させたＤＮＡが
分離されたことを示す。
【００４１】実施例４ ＤＮＡ増幅反応中のビオチン化
TthMutS によるミスマッチを含むＤＮＡ断片の分離ＰＣＲ反応液の調製 制限酵素ＥｃｏＲＩで消化されたｐＭＯＬ２１ １ｎｇ （ｐＭＯＬ２１は奈良先端大 真木教授より入手） 増幅プライマーＰ１ １０ｐｍｏｌｅｓ 増幅プライマーＰ２ １０ｐｍｏｌｅｓ Pfu用１０×バッファー（Stratagene製） ５μｌ Pfu DNA ポリメラーゼ （Stratagene製） ２．５単位 ２ｍＭｄＮＴＰｓ ５μｌ 全量 ５０μｌ反応温度条件 ９４℃、３０秒 ５５℃、３０秒 ７２℃、３分
TthMutS によるミスマッチを含むＤＮＡ断片の分離ＰＣＲ反応液の調製 制限酵素ＥｃｏＲＩで消化されたｐＭＯＬ２１ １ｎｇ （ｐＭＯＬ２１は奈良先端大 真木教授より入手） 増幅プライマーＰ１ １０ｐｍｏｌｅｓ 増幅プライマーＰ２ １０ｐｍｏｌｅｓ Pfu用１０×バッファー（Stratagene製） ５μｌ Pfu DNA ポリメラーゼ （Stratagene製） ２．５単位 ２ｍＭｄＮＴＰｓ ５μｌ 全量 ５０μｌ反応温度条件 ９４℃、３０秒 ５５℃、３０秒 ７２℃、３分
【００４２】反応サイクル５回目のアニーリング開始時
（５５℃、３０秒開始時）にビオチン化TthMutS １μ
ｇ、または１０回目のアニーリング開始時（５５℃、３
０秒開始時）にビオチン化TthMutS ２μｇを反応液に添
加した。それぞれ伸長反応終了時（７２℃、３分終了
時）にあらかじめ１×TthMutS バッファー５０μｌで３
回洗浄したストレプトアビジン磁気ビーズ（ダイナル）
０．２ｍｇ（反応サイクル５回目の場合）または０．４
ｍｇ（反応サイクル１０回目の場合）を懸濁した。室温
で５分間放置したのち、磁気スタンドでビーズを寄せ、
上清を回収した。回収した反応液は引き続いて増幅反応
に供した。
（５５℃、３０秒開始時）にビオチン化TthMutS １μ
ｇ、または１０回目のアニーリング開始時（５５℃、３
０秒開始時）にビオチン化TthMutS ２μｇを反応液に添
加した。それぞれ伸長反応終了時（７２℃、３分終了
時）にあらかじめ１×TthMutS バッファー５０μｌで３
回洗浄したストレプトアビジン磁気ビーズ（ダイナル）
０．２ｍｇ（反応サイクル５回目の場合）または０．４
ｍｇ（反応サイクル１０回目の場合）を懸濁した。室温
で５分間放置したのち、磁気スタンドでビーズを寄せ、
上清を回収した。回収した反応液は引き続いて増幅反応
に供した。
【００４３】２５回サイクルが終了した反応液につい
て、以下の物質を添加した。 ５ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム） ５μｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム ５０μｌ イソプロパノール １００μｌ 室温で１０分間放置した後、15000 ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収した。７５％エタノール５
０μｌで洗浄し、乾燥した後、蒸留水４５μｌに溶解し
た。これに１０×Ｈバッファー（東洋紡）５μｌ、Ｅｃ
ｏＲＩ（東洋紡）１０単位を加え、３７℃で１６時間反
応した。反応終了後、フェノール抽出、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿を行い、５０μｌのＴＥバッファー
に溶解した。このうち、２μｌをとり、ライゲーション
ハイ（東洋紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した
後、大腸菌ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに
加えた。氷上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間
保温し、直後に氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌ
を加え、３７℃で１時間保温した。このうち、１００μ
ｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレ
ート上で、他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／
ｍｌおよびストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ培地プレート上で２０時間培養した。アンピシリン
を含む培地で形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシ
リンおよびストレプトマイシンを含む培地で形成された
コロニー数（Ｃｂ）をそれぞれ計数し、下記式により変
異率（ｍ．ｆ．）を算出した。 ｍ．ｆ．＝Ｃｂ＊１００／（Ｃａ＊９）
て、以下の物質を添加した。 ５ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム） ５μｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム ５０μｌ イソプロパノール １００μｌ 室温で１０分間放置した後、15000 ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収した。７５％エタノール５
０μｌで洗浄し、乾燥した後、蒸留水４５μｌに溶解し
た。これに１０×Ｈバッファー（東洋紡）５μｌ、Ｅｃ
ｏＲＩ（東洋紡）１０単位を加え、３７℃で１６時間反
応した。反応終了後、フェノール抽出、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿を行い、５０μｌのＴＥバッファー
に溶解した。このうち、２μｌをとり、ライゲーション
ハイ（東洋紡）２μｌと混合し、室温で２時間反応した
後、大腸菌ＭＦ１０１のコンピテントセル２００μｌに
加えた。氷上で３０分間放置した後、４２℃で３０秒間
保温し、直後に氷上に戻した後、ＳＯＣ培地８００μｌ
を加え、３７℃で１時間保温した。このうち、１００μ
ｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレ
ート上で、他の９００μｌをアンピシリン１００μｇ／
ｍｌおよびストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ培地プレート上で２０時間培養した。アンピシリン
を含む培地で形成されたコロニー数（Ｃａ）、アンピシ
リンおよびストレプトマイシンを含む培地で形成された
コロニー数（Ｃｂ）をそれぞれ計数し、下記式により変
異率（ｍ．ｆ．）を算出した。 ｍ．ｆ．＝Ｃｂ＊１００／（Ｃａ＊９）
【００４４】図４に示されるように、TthMutS を加えて
いない試料に比して、TthMutS を加えた試料は有意に変
異率が低下し、従って、ＤＮＡ増幅反応中に複製の誤り
が起こった部分のミスマッチを含むＤＮＡが分離された
ことを示す。
いない試料に比して、TthMutS を加えた試料は有意に変
異率が低下し、従って、ＤＮＡ増幅反応中に複製の誤り
が起こった部分のミスマッチを含むＤＮＡが分離された
ことを示す。
【００４５】
【発明の効果】本発明は２本鎖核酸、特にＤＮＡ集団に
捕捉可能な物質、例えばビオチンと結合したした２本鎖
ＤＮＡのミスマッチ配列に特異的に結合する物質を接触
させ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させた
後、該物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団から簡便に分離することができる。
捕捉可能な物質、例えばビオチンと結合したした２本鎖
ＤＮＡのミスマッチ配列に特異的に結合する物質を接触
させ、ミスマッチ配列を含む２本鎖ＤＮＡと結合させた
後、該物質を固相化したストレプトアビジンと結合さ
せ、該ＤＮＡ集団から簡便に分離することができる。
【００４６】また、熱安定性に優れる高度好熱菌、サー
マス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭ
ｕｔＳ蛋白質を用いることで、固相化あるいはビオチン
化する場合でも回収率が良くなり、かつ、その長期保存
安定性も改善される。さらには、増幅反応中の高温下で
もＭｕｓ蛋白質を作用させることが可能となり、ＤＮＡ
増幅反応の任意のサイクルにおけるプライマーと鋳型の
アニーリング、またはプライマーの伸長反応、またはそ
の両方の反応で行い、それらの反応終了後、ビオチンを
固相化したストレプトアビジンと結合させ、増幅中のＤ
ＮＡ集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離することも
可能となる。
マス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＭ
ｕｔＳ蛋白質を用いることで、固相化あるいはビオチン
化する場合でも回収率が良くなり、かつ、その長期保存
安定性も改善される。さらには、増幅反応中の高温下で
もＭｕｓ蛋白質を作用させることが可能となり、ＤＮＡ
増幅反応の任意のサイクルにおけるプライマーと鋳型の
アニーリング、またはプライマーの伸長反応、またはそ
の両方の反応で行い、それらの反応終了後、ビオチンを
固相化したストレプトアビジンと結合させ、増幅中のＤ
ＮＡ集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離することも
可能となる。
【００４７】従来から、大腸菌由来のＭｕｔＳ蛋白質を
固相化してミスマッチを含むＤＮＡ断片を分離する方法
が知られている（WO 95/12689, Wagner R. Nucleic Aci
ds Research 23, 3944-3948 (1995)) が、この方法では
該蛋白質を固相支持担体に結合せねばならず、非常に煩
雑な工程を要し、またこれら支持担体に結合したＭｕｔ
Ｓ蛋白質を用いるため、例えばＤＮＡ増幅反応液中で、
そのまま用いるには不向きであった。しかしながら、本
発明ではＭｕｔＳ蛋白質に捕捉可能な物質を結合し、該
物質を捕捉しうる固相化した物質を用いて、固相にＭｕ
ｔＳ蛋白質に結合したミスマッチ配列を有する核酸を液
相から容易に分離することが可能となる。
固相化してミスマッチを含むＤＮＡ断片を分離する方法
が知られている（WO 95/12689, Wagner R. Nucleic Aci
ds Research 23, 3944-3948 (1995)) が、この方法では
該蛋白質を固相支持担体に結合せねばならず、非常に煩
雑な工程を要し、またこれら支持担体に結合したＭｕｔ
Ｓ蛋白質を用いるため、例えばＤＮＡ増幅反応液中で、
そのまま用いるには不向きであった。しかしながら、本
発明ではＭｕｔＳ蛋白質に捕捉可能な物質を結合し、該
物質を捕捉しうる固相化した物質を用いて、固相にＭｕ
ｔＳ蛋白質に結合したミスマッチ配列を有する核酸を液
相から容易に分離することが可能となる。
【００４８】
配列番号: 1 配列の長さ: 30 配列の型: 核酸 鎖の数: 1 本鎖 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 GGGGAATTCA GTTTGTAGAA ACGCAAAAAG 30
【００４９】配列番号1: 2 配列の長さ: 28 配列の型: 核酸 鎖の数: 1 本鎖 配列の種類: 他の核酸 合成DNA 配列 GGGGAATTCT TGAAGACGAA AGGGCCTC 28
【図１】本発明のミスマッチを含む核酸を分離する過程
を示す図である。
を示す図である。
【図２】ＤＮＡ増幅反応により得られたミスマッチを有
する２本鎖核酸を変性し、増幅前の鋳型と同じ配列をも
つ断片を再結合して、ミスマッチを有する２本鎖核酸を
得る過程を示す図である。
する２本鎖核酸を変性し、増幅前の鋳型と同じ配列をも
つ断片を再結合して、ミスマッチを有する２本鎖核酸を
得る過程を示す図である。
【図３】ｐＭＯＬ２１増幅産物を変性し、再結合させ、
複製の誤りが起こった部分にミスマッチを形成させたＤ
ＮＡ集団からビオチン化TthMutSによりミスマッチを含
むＤＮＡ断片の分離する前後でのｒｐｓＬ遺伝子の変異
率を比較した図である。
複製の誤りが起こった部分にミスマッチを形成させたＤ
ＮＡ集団からビオチン化TthMutSによりミスマッチを含
むＤＮＡ断片の分離する前後でのｒｐｓＬ遺伝子の変異
率を比較した図である。
【図４】ｐＭＯＬ２１増幅反応中にビオチン化TthMutS
によりミスマッチを含むＤＮＡ断片を分離した増幅産物
のｒｐｓＬ遺伝子の変異率を比較した図である。
によりミスマッチを含むＤＮＡ断片を分離した増幅産物
のｒｐｓＬ遺伝子の変異率を比較した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 倉光 成紀 大阪府豊中市宮山町２丁目16番41号
Claims (19)
- 【請求項１】 ２本鎖核酸集団（Ａ）に、捕捉可能な物
質（Ｂ）を結合した２本鎖核酸のミスマッチに特異的に
結合する物質（Ｃ）を接触させ、該２本鎖核酸のミスマ
ッチに特異的に結合する物質（Ｃ）と２本鎖核酸集団
（Ａ）中のミスマッチを含む２本鎖核酸（Ｄ）を結合さ
せ、該結合した物質（Ｅ）の捕捉可能な物質（Ｂ）を、
該物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物質（Ｆ）と結合
させ、２本鎖核酸集団（Ａ）からミスマッチを含む核酸
（Ｄ）を分離することを特徴とするミスマッチを含む核
酸を分離する方法。 - 【請求項２】 ２本鎖核酸集団（Ａ）が、２本鎖ＤＮ
Ａ、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドで
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 捕捉可能な物質（Ｂ）がビオチン、アビ
ジン、ジゴキシゲニンまたは抗ジゴキシゲニン抗体であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相
化した物質（Ｆ）が、固相に結合したアビジン、ビオチ
ン、抗ジゴキシゲニン抗体、ジゴキシゲニンまたは抗Ｍ
ｕｔＳ抗体である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 固相が有機高分子材料、無機高分子材料
または磁性化された、これらの物質である請求項４記載
の方法。 - 【請求項６】 ２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合
する物質（Ｃ）が、高度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関与
する蛋白質、大腸菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白
質、枯草菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質またはヒ
ト由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質である請求項１記
載の方法。 - 【請求項７】 ２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結合
する物質（Ｃ）が、高度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関与
する蛋白質である請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 ２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結
合する物質（Ｃ）が、サーマス・サーモフィラス(Therm
us thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質である請求項１
記載の方法。 - 【請求項９】 ２本鎖ＤＮＡ集団に、ビオチンが結合し
た２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合する物質を
接触させ、該物質と２本鎖ＤＮＡ集団中のミスマッチを
含む２本鎖ＤＮＡを結合させ、該結合した物質のビオチ
ンを固相化したアビジン類と結合させ、該２本鎖ＤＮＡ
集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離することを特徴
とするミスマッチを含むＤＮＡを分離する方法。 - 【請求項１０】 核酸増幅反応の任意のサイクル終了後
に得られる２本鎖ＤＮＡ集団に、ビオチン化した高度好
熱菌由来のＭｕｔＳ蛋白質を接触させて、該蛋白質とミ
スマッチを含む２本鎖ＤＮＡを結合させ、次いで、ＤＮ
Ａ増幅反応の任意のサイクルにおけるプライマーと鋳型
のアニーリングまたはプライマーの伸長反応またはその
両方を行い、それらの終了後、結合した前記物質のビオ
チンを固相化したアビジン類と結合させ、該２本鎖ＤＮ
Ａ集団からミスマッチを含むＤＮＡを分離することを特
徴とするミスマッチを含むＤＮＡを分離する方法。 - 【請求項１１】 核酸増幅反応が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢ
Ａ、鎖置換増幅および３ＳＲよりなる群から選択される
反応である請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 捕捉可能な物質（Ｂ）を結合した２本
鎖核酸のミスマッチに特異的に結合する物質（Ｃ）およ
び該捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固相化した物質
（Ｆ）を含むことを特徴とするミスマッチを含む核酸を
分離するための試薬。 - 【請求項１３】 捕捉可能な物質（Ｂ）がビオチン、ア
ビジン、ジゴキシゲニンまたは抗ジゴキシゲニン抗体で
ある請求項１２記載の試薬。 - 【請求項１４】 捕捉可能な物質（Ｂ）を捕捉しうる固
相化した物質（Ｆ）が、固相に結合したアビジン、ビオ
チン、抗ジゴキシゲニン抗体、ジゴキシゲニンまたは抗
ＭｕｔＳ抗体である請求項１２記載の試薬。 - 【請求項１５】 固相が有機高分子材料、無機高分子材
料または磁性化された、これらの物質である請求項１２
記載の試薬。 - 【請求項１６】 ２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結
合する物質（Ｃ）が、高度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関
与する蛋白質、大腸菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白
質、枯草菌由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質またはヒ
ト由来のＤＮＡ修復に関与する蛋白質である請求項１２
記載の試薬。 - 【請求項１７】 ２本鎖核酸のミスマッチに特異的に結
合する物質（Ｃ）が、高度好熱菌由来のＤＮＡ修復に関
与する蛋白質である請求項１２記載の試薬。 - 【請求項１８】 ２本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に
結合する物質（Ｃ）が、サーマス・サーモフィラス(The
rmus thermophilus)由来のＭｕｔＳ蛋白質である請求項
１２記載の試薬。 - 【請求項１９】 ビオチン化した２本鎖ＤＮＡのミスマ
ッチに特異的に結合する物質および固相化したアビジン
類を含むことを特徴とするミスマッチを含むＤＮＡを分
離するための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8337026A JPH10257900A (ja) | 1996-12-17 | 1996-12-17 | ミスマッチを含む核酸を分離する方法およびそのための試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8337026A JPH10257900A (ja) | 1996-12-17 | 1996-12-17 | ミスマッチを含む核酸を分離する方法およびそのための試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10257900A true JPH10257900A (ja) | 1998-09-29 |
Family
ID=18304765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8337026A Pending JPH10257900A (ja) | 1996-12-17 | 1996-12-17 | ミスマッチを含む核酸を分離する方法およびそのための試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10257900A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063977A1 (ja) * | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Riken | 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 |
-
1996
- 1996-12-17 JP JP8337026A patent/JPH10257900A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063977A1 (ja) * | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Riken | 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 |
| JP3897805B2 (ja) * | 2003-12-25 | 2007-03-28 | 独立行政法人理化学研究所 | 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 |
| US8206902B2 (en) | 2003-12-25 | 2012-06-26 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
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