CN103805507B - 热对流聚合酶连锁反应之方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供以聚合酶连锁反应(PCR)扩增核酸序列之方法及装置。该方法包含将PCR样本置于容器内,该容器仅以单一热源加热,俾于PCR样本底部提供变性反应用之高温,且由PCR样本底部至PCR样本表面渐减之温度梯度诱发热对流,致使炼合反应及延伸反应系于PCR样本之不同区域自动发生。
Description
本申请是发明创造名称为热对流聚合酶连锁反应之方法及装置,国际申请号为PCT/US2009/032008,进入中国国家阶段的国家申请号为200980102901.9,申请日为2009年01月26日的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明系属以聚合酶连锁反应(PCR)扩增核酸序列之领域。更特定而言,本发明系关于热对流PCR之方法及其装置。
背景技术
以聚合酶连锁反应(PCR)扩增特定核酸序列已为成熟技术,且为医学及生物学研究之有力工具。此生化反应过程需要三个主要步骤:「变性反应」、「炼合反应」及「延伸反应」,其各需不同之反应温度。现今商业化之PCR扩增技术所需样本包含欲扩增之模板DNA、与模板DNA各股上特定序列互补之寡核苷酸引子对、热安定性DNA聚合酶、以及脱氧核苷三磷酸(dNTP)。随后藉由反复加热与冷却样本,使样本在三种不同温度间循环,藉以扩增模板DNA核酸序列之特定部分。
PCR之第一步骤为变性反应,其系将样本加热至高温,俾使双股之模板DNA分离成为单股DNA。第二步骤为炼合反应,其系将样本冷却至较低温度,俾使引子与第一步骤所形成之单股DNA结合,形成DNA与引子之复合物。最后步骤为聚合(延伸)反应,其系将样本维持于适当温度,藉由DNA聚合酶之作用,使DNA与引子之复合物中之引子得以延伸,从而产生与模板DNA各股互补之新单股DNA。每一次由上述三步骤组成之循环可复制两份引子结合位置间之DNA序列。典型地,将包含变性反应、炼合反应及延伸反应等三个温度各异之步骤的PCR循环重复约20至40次,可生产出数百万个标的核酸序列之复制物。
变性反应之温度典型地系介于90至94℃之范围。炼合反应之温度系依据所用引子之解链温度(meltingtemperature;Tm)而选择,典型地系介于35至65℃之范围。聚合反应之典型温度为72℃,这是由于最常用之DNA聚合酶,即TaqDNA聚合酶(一种萃取自Thermusaquaticus之热安定性DNA聚合酶),在该温度下活性最佳。由于TaqDNA聚合酶具有广泛之温度范围,因此其亦可使用仅有两个步骤之温度循环,其中聚合温度与炼合温度几乎相同。
在传统之市售PCR仪器(亦即热循环仪器)中,样本之温度系以热传导方式控制。简言之,令含有PCR样本之反应容器与具有高导热性之固体金属块接触。该金属块与加热及冷却装置相连,使其可改变温度,以达到所需温度。采用该方法之传统PCR仪器通常使用具极高导热性之镀金银块及/或珀耳帖(Peltier)冷却方法,以达成迅速之温度改变。然而,传统之热循环PCR并非有效率之程序,因其尚需花费额外的时间及能源去加热及冷却PCR样本本身以外的物质。此外,由于机器本身精密的特性,因此热循环仪器通常十分昂贵。
热对流PCR方法系于具有两个温度控制组件之装置上进行PCR(Krishnan,M.等人,2002,Science298:793)。Benett等人在美国专利第6,586,233号(2003年7月1日核准)中揭示了热对流PCR(CPCR)之方法及装置,其中由热对流驱动之样本溶液在一侧加热之封闭O形槽内循环流动。Hwang等人在美国专利申请案第10/801,342号(2004年3月15日公开,公开号2004/0152122)中揭示了热对流PCR之方法及装置,其使用复数个热源,以在样本溶液中维持不同温度之区域,使得当样本在各区域间循环时,PCR的三个步骤可依序并重复地发生。
虽然已经提供一些热循环PCR之方法,但其所需之装置包含复杂的结构且十分昂贵,因而阻碍其在商业上的应用。目前仍需更方便且实用之热对流PCR(CPCR)方法及装置。
发明内容
本发明提供可方便、有效率且经济地进行热对流PCR(CPCR)之新颖方法及装置。
因此,在第一方面,本发明提供一种以聚合酶连锁反应(PCR)扩增标的核酸序列之方法,包含步骤:
(1)提供管状容器;
(2)将PCR样本置于该管状容器内,其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸序列的模板DNA、脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种具有互补于标的核酸序列之3’端的序列之寡核苷酸引子,其中该等引子系经设计为具有介于40℃至约90℃间之解链温度(Tm);
(3)将该容器之底部埋置于热源中,然后加热该PCR样本,使引子解链,并于稳定维持PCR样本表面温度(Ts)低于引子之解链温度(Tm)至少约2℃,因而造成由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度,该梯度诱发热对流并致使下列事件依序并重复地在样本之不同区域中发生:(i)变性反应,其中双股之模板DNA分离成为两条单股DNA,(ii)炼合反应,其中引子与单股DNA杂交形成DNA与引子之复合物,及(iii)聚合(延伸)反应,其中DNA与引子之复合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。
在第二方面,本发明提供一种藉由本发明方法以聚合酶连锁反应(PCR)进行核酸序列扩增之装置,包含:(i)单一热源;(ii)在其中进行PCR之一或多个管状容器;及(iii)支持物,其具有使累积于多个容器间之热量均匀化之构件。
附图说明
上述发明内容及以下具体实施方式与所附图式一并阅读将更增了解。为达阐明本发明之目的,图式中所示具体实例为目前较佳者。然而,应了解本发明并不限于所示之特定排列及结构。
在图式中:
图1为根据本发明之CPCR的理想单一循环热对流图解,其中X轴代表时间尺度,Y轴代表温度尺度,10、20及30表示PCR中所发生的三个事件(分别为变性、炼合及延伸)之温度范围;图1A显示根据本发明之CPCR的PCR样本之温度变化,图1B显示传统PCR的PCR样本之温度变化,以供比较。
图2为显示实例1之PCR结果之影像,其中第1道及第2道代表使用相同样本及程序的两次重复实验结果,而第3道则代表负对照组之结果。
图3为显示实例2之PCR结果之影像,其中标示为「CPCR」之各道为依据本发明方法之PCR样本之结果,所使用引子对之解链温度(Tm)如各道上端标示之数字,PCR样本之表面温度则为68℃;而标示为「传统PCR」之各道则为相同样本但使用传统PCR方法之结果,以供比较。
图4为依据本发明之装置(具有均热器)之具体实例的图像。
图5显示实例3之CPCR结果,使用本发明之CPCR方法及具有或不具有均热器之装置;其中图5A显示样本位置之编号;图5B显示无均热器之装置的CPCR结果;图5C显示有均热器之装置的CPCR结果。
图6显示实施依据本发明之CPCR方法的PCR样本之表面温度(Ts)变化,样本位置如图5A中位置编号1-8所示,分为二组,分别为使用具有或不具有均热器之装置;其中曲线A(-◆-)代表使用无均热器之装置之组别的变化,曲线B(-■-)代表使用有均热器之装置之组别的变化。
具体实施方式
本发明提供进行热对流PCR之新颖方法及装置。
本发明之具体实例为一种以PCR扩增标的核酸序列之方法,包含步骤:
(1)提供管状容器;
(2)将PCR样本置于该管状容器内,其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种互补于标的核酸序列之3’端之序列的寡核苷酸引子,其中该等引子系经设计为具有介于40℃至约90℃间之解链温度(Tm);
(3)将该容器之底部埋置于热源中,然后加热该PCR样本,使引子解链,并稳定维持PCR样本表面温度(Ts)低于引子之解链温度(Tm)至少约2℃,因而造成由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度,该梯度诱发热对流并使下列事件依序并重复地在样本之不同区域发生:(i)变性反应,其中双股之模板DNA分离成为两条单股DNA,(ii)炼合反应,其中引子与单股DNA杂交形成DNA与引子之复合物,及(iii)聚合(延伸)反应,其中DNA与引子之复合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。
欲实施本发明之热对流PCR(CPCR),需将PCR样本中随机且混乱之自然热对流转变为稳定之单一热对流循环,俾使模板DNA在各个不同事件所需之不同温度间循环而逐步扩增。如图1A及1B所示,PCR包含三个事件的发生:(i)藉由加热达到高温之变性反应,(ii)炼合反应,及(iii)于低于变性温度之温度下的延伸(聚合)反应。特定而言,在热对流PCR中,应使低温维持足够时间,以进行PCR样本之炼合。
在本发明中意外发现,当PCR样本表面温度(Ts)稳定地维持低于引子之解链温度(Tm)至少约2℃时,造成由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度,此温度梯度会诱发热对流并使事件依序并重复地在PCR样本的不同区域发生,如实例2所示。
在本发明之方法中,该管状容器可以油封闭,以避免样本在反应过程中蒸发。在本发明之具体实例中,该油可为矿物油。依据本发明,可于PCR样本上面添加一滴矿物油,使样本表面为油所覆盖。
欲实施本发明之热对流PCR,必须维持由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度。该温度梯度可藉由加热管状容器之底部,同时维持PCR样本表面温度低于引子解链温度(Tm)至少约2℃之稳定温度(Ts)达成。上述目标可藉由设计具有特定解链温度之适当引子及控制PCR之各个参数达成。
为达成单一循环之热对流,进行了本发明CPCR之计算机仿真,以得知各个PCR参数间之关联性,该等参数包括:PCR样本之总体积(V,单位为μl)、PCR溶液之黏度(μ,单位为Ns/m2),容器之内直径(d,单位为mm),以及PCR样本之表面温度(Ts,单位为℃),此单一循环之热对流的达成可由下列公式决定:
V=(A×Ts+B-500μ+0.7)×e(1.86+100μ)d
其中A值介于-0.019与-0.016之间,且B值介于1.85与2.27之间。在本发明之较佳具体实例中,A值为-0.01812而B值为2.1。
在本发明之具体实例中,Ts系介于约40℃与约80℃之间;μ系介于0.001Ns/m2与0.0018Ns/m2之间;且d系介于0.6mm与5.0mm之间。在较佳具体实例中,Ts系介于约55℃与约70℃之间;μ系介于0.001Ns/m2与0.0016Ns/m2之间;且d系介于0.8mm与4.0mm之间。在最佳具体实例中,Ts系介于约65℃与约68℃之间;μ系介于0.001Ns/m2与0.0014Ns/m2之间;且d系介于0.8mm与2.5mm之间。
欲增加PCR样本之黏度,可于样本添加非反应性液态物质。适当之物质为任何非反应性之有机或无机物质,包括但不限于甘油、NP-40、Tween20、EDTA、DMSO、甲酰胺、甜菜碱及明胶。较佳之物质为甘油、NP-40、Tween20及EDTA。最佳之物质为甘油。增加黏度物质之添加量应为任何可达成所需黏度之量。在本发明之具体实例中,PCR样本中添加4%至8%v/v之甘油。
本发明提供一种以聚合酶连锁反应(PCR)藉由本发明之方法进行核酸序列扩增之装置,包含:(i)单一热源;(ii)在其中进行PCR之一或多个管状容器;及(iii)支持物,其具有使累积于多个容器间之热量均匀化之构件。
本发明中所使用之热源可为具有控温构件之简单加热装置。适当热源包括但不限于干浴加热器、水浴加热器及油浴加热器。在本发明之具体实例中,热源为沸腾中之水。
本发明之管状容器可以任何材料制成,只要该材料为生物可兼容性且具有至少120℃之抗热性即可。适当之材料包括聚合物材料如聚丙烯(PP)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚砜(PSF)及聚醚砜(PES),以及玻璃。
在本发明之具体实例中,采用累积于多个容器之热量均匀化的构件为均热器,其可为金属板制成,俾使复数试验之PCR中多个容器之表面温度均匀化。本文中所用之「均热器」乙词系指通常由铝或铜制成之外壳,其系设计用以覆盖电子装置并散热,通常用于计算机之CPU(中央处理器)。例如,用于进行复数试验CPCR之装置可包含具有均热器之配备之支持物。在依据本发明之装置中,均热器系用于驱散累积于复数试验CPCR容器之间隙的热量。在本发明之具体实例中,支持物系设计用于支持排列成长方矩阵之多个容器。在本发明之较佳具体实例中,该支持物系设计为可支持排列成8:12之长方矩阵之96个容器。
本发明之装置亦可包含测量PCR样本表面温度之构件。该构件之实例为温度计。
本发明进一步以下列实例阐明。该等实例系供例示之目的,在任何方面均不应视为限制本发明范畴。
实例
在以下实例中,下列缩写具有下列意义:℃=摄氏度数;hr=小时;min=分钟;sec=秒;M=莫耳浓度;mM=毫莫耳浓度;μM=微莫耳浓度;L或1=升;ml=毫升;μl=微升;G或g=克;mg=毫克;μg=微克;pg=毫微克。未定义之缩写具有一般所接受之意义。
实例1
1.材料与方法
1.1样本
PCR样本包含下列反应试剂:3.32pg之模板DNA(pHBV-48,GenBank编号NC003977,其插入于pGEM-3Z载体(PromegaCorporation,Madison,WI)中)、1.5pmol之F118引子(5’-CCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCG-3’)、1.5pmol之R145引子(5’-TCCAGTTGGCAGCACAGCCTAGCAGC-3’)、7.5μl之LightCyclerFastStartDNAMasterHybProbe热起始反应混合物(RoscheAppliedScience,Indianapolis,IN)及5%v/v之甘油。
进行仿真本发明CPCR抽象模型之计算机仿真,获得如下式之参数公式:
V=(A×Ts+B-500μ+0.7)×e(1.86+100μ)d
其中A=-0.01812,B=2.1,Ts=68℃,μ=0.0012Ns/m2,且d=2.2mm。
基于以上公式,可算出PCR样本之总体基为75.44μl。
1.2装置
用于进行本发明热对流PCR之装置系由下列组件构成:具控温功能之加热槽、用作反应容器之复数个玻璃毛细管(内直径为2.2mm)、及具均热器之支持物,如图4所示。
1.3流程
在整个实验中,加热槽中之硅油温度均维持于95℃。将PCR样本及一负对照组(与样本之成分相同,但以相同体积,即30λ之ddH2O取代模板DNA)分别注入玻璃毛细管中,并以10μl之矿物油密封。然后将该等毛细管置于加热槽之站架上,使各毛细管之下半部埋置于加热之硅油中,达25分钟。在整个反应过程中,周围环境温度系维持于室温。时间到时,由站架取出毛细管并取各毛细管中2μl之所得混合物,进行电泳分析。
2.结果
于2%洋菜胶上分析所得PCR反应产物,结果示于图2。如图2所示,第1道及第2道中之明亮条带显示本发明之热对流PCR方法在少于半小时内即正确地扩增了122bp之标的序列。当使用传统式热循环机台时,整个反应需花费超过一个半小时,且造成之产品复制数仍然较少(数据未显示)。因此,本发明之方法在效率及经济层面均较传统之PCR方法优异。
实例2
设计如下表1所示之七对引子对,解链温度(Tm)介于58℃至80℃,其中各引子之Tm系使用LightcyclerProbeDesign2.0(Roche,Germany)程序计算。
使用表1所示各对引子,依据实例1所述方法及程序分别进行CPCR,PCR样本之Ts温度为68℃。CPCR之结果示于图3,使用Tm为70或高于70之引子之组别产生122bp条带。鉴于上述发现,结论为当Ts值少于Tm值至少约2℃时可成功进行CPCR。
表1经设计之引子序列及Tm值
实例3
分别使用具有或不具有支持物(含均热器)之装置进行CPCR。支持物系经设计为可支持96个容器,容器排列方式为8(栏A-H):12(列1-12)的长方矩阵,参见图4。选择此矩阵中10个不同位置的样本,如图5A所示予以编号。图5B(无均热器)及5C(有均热器)显示CPCR结果。如图5B及5C所示,使用无均热器之装置时,位于矩阵中心附近的位置3、4及5均无结果;然而,使用有均热器的装置时,所有位置的CPCR结果均十分良好。
图6显示具有或不具有均热器之装置的进一步比较结果。测量并记录编号1-10之各PCR样本在加热后30分钟内之表面温度,图6显示各样本在30分钟期间内之表面温度(Ts)变化,其中曲线A代表使用无均热器之装置之组别的变化,曲线B代表使用有均热器之装置之组别的变化。结果显示,使用有均热器之装置之组别的Ts值变化在1℃以内,但使用无均热器之装置之组别的变化则在2~3℃内。这表示具有均热器之装置可为实验中之各位置提供稳定的表面温度,以及CPCR所需的稳定热量条件。
熟习本技艺者应了解,可针对上述具体实例加以改变而不背离其广泛之发明概念。因此,应了解本发明并不限于所揭示之特定具体实例,而是要涵盖下附申请专利范围所定义之本发明精神及范畴内的修饰。
Claims (3)
1.一种用于以聚合酶连锁反应(PCR)进行核酸序列扩增的方法的装置,其特征是包含:
(i)用于盛装PCR样本之一或多个管状容器;及
(ii)用于加热该PCR样本之单一热源;其中该管状容器的底部埋置于该单一热源中,
其中,该以聚合酶连锁反应(PCR)进行核酸序列扩增的方法包括步骤︰
(1)将该PCR样本置于该管状容器内,其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种具有互补于标的核酸序列之3’端之序列的寡核苷酸引子,其中该等引子系经设计为具有介于40℃至90℃间之解链温度(Tm);及
(2)加热该PCR样本,使引子解链,并于容器中之PCR样本的上表面维持稳定的表面温度(Ts),该表面温度低于该引子之解链温度(Tm)至少2℃,并控制PCR参数,包括PCR样本之总体积、PCR样本之黏度、容器之内直径及前述容器中之PCR样本之表面温度,因而造成由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度,藉此诱发热对流并使下列事件在PCR样本之不同区域依序并重复地发生︰(i)变性反应,其中双股之模板DNA分离成为两条单股DNA,(ii)炼合反应,其中引子与单股DNA杂交形成DNA与引子之复合物,及(iii)聚合反应,其中DNA与引子之复合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸,
其中,PCR之各参数:PCR样本之总体积,以V表示,单位为μl;PCR样本之黏度,以μ表示,单位为Ns/m2;容器之内直径,以d表示,单位为mm;以及容器中之PCR样本之表面温度,以Ts表示,单位为℃;其由下列公式决定:
V=(A×Ts+B-500μ+0.7)×e(1.86+100μ)d
其中A值介于-0.019与-0.016之间,且B值介于1.85与2.27之间。
2.如权利要求1所述的装置,其特征是A值为-0.01812而B值为2.1。
3.如权利要求1所述的装置,其特征是该热源是干浴加热器、水浴加热器或油浴加热器。
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AU2011206360A1 (en) * | 2010-01-12 | 2012-08-23 | Ahram Biosystems, Inc. | Two-stage thermal convection apparatus and uses thereof |
WO2012055073A1 (zh) * | 2010-10-29 | 2012-05-03 | 瑞基海洋生物科技股份有限公司 | 聚合酶连锁反应的温度设定方法及装置 |
CN103687960A (zh) * | 2011-07-21 | 2014-03-26 | 瑞基海洋生物科技股份有限公司 | 反转录聚合酶链式反应的方法 |
CN103103118B (zh) * | 2011-11-15 | 2015-04-08 | 厦门万泰沧海生物技术有限公司 | 一种核酸扩增与检测反应管 |
USD735881S1 (en) | 2012-10-22 | 2015-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Tube strip holder for automated processing systems |
US9180461B2 (en) | 2012-10-22 | 2015-11-10 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Condensation-reducing incubation cover |
WO2015096063A1 (en) | 2013-12-25 | 2015-07-02 | Coyote Bioscience Co., Ltd. | Methods and systems for nucleic acid amplification |
CL2015000980A1 (es) | 2014-04-18 | 2016-07-01 | Upstartdna Co Ltd Standard Entity | Métodos para detectar patógenos en peces de agua fría. |
TWI521197B (zh) | 2014-11-14 | 2016-02-11 | 財團法人工業技術研究院 | 手持式即時檢測裝置 |
CN105985946A (zh) * | 2015-02-11 | 2016-10-05 | 瑞基海洋生物科技股份有限公司 | 稳定热对流聚合酶连锁反应流场的方法及其热对流聚合酶连锁反应装置 |
KR102389800B1 (ko) | 2015-05-12 | 2022-04-22 | 시아먼 유니버시티 | 액체 순환 경로를 조절할 수 있는 핵산 증폭 반응 튜브 |
CN105670924A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-06-15 | 上海理工大学 | 自然对流聚合酶链反应微系统 |
PT3436198T (pt) | 2016-03-29 | 2022-07-13 | Univ Rice William M | Deteção de ácido nucleico baseada em superfícies num dispositivo fluídico de fluxo de convecção |
CN107541507A (zh) | 2016-06-29 | 2018-01-05 | 厦门大学 | 一种rna反转录扩增方法 |
CN107964507B (zh) | 2016-10-18 | 2022-09-27 | 财团法人工业技术研究院 | 热对流聚合酶连锁反应装置及其光学检测方法 |
CN106635785B (zh) * | 2016-12-29 | 2019-04-19 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种pcr荧光检测仪 |
CN111004864A (zh) | 2018-10-05 | 2020-04-14 | 福又达生物科技股份有限公司 | 虾病原体检测方法 |
CN109401948A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-03-01 | 福建省博凯科技有限公司 | 一段式热对流pcr仪 |
CN109207645A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-01-15 | 福建省博凯科技有限公司 | 一段式热对流仪的控制方法 |
CN109536368A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-29 | 北京化工大学 | 一种便携式对流pcr扩增检测装置 |
US11938485B2 (en) | 2021-12-07 | 2024-03-26 | Industrial Technology Research Institute | Heating device for convective polymerase chain reaction |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1571849A (zh) * | 2001-09-15 | 2005-01-26 | 阿赫姆生物系统公司 | 应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置 |
US7537890B2 (en) * | 2003-10-03 | 2009-05-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of performing biochemical reactions in a convective flow field |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60007636T2 (de) * | 1999-07-09 | 2004-11-18 | Genevac Ltd., Ipswich | Zentrifugalverdampfer für Proben mit Abschirmung der direkten Heizungswärme und homogener Heizwirkung |
US6586233B2 (en) * | 2001-03-09 | 2003-07-01 | The Regents Of The University Of California | Convectively driven PCR thermal-cycling |
NZ519371A (en) * | 2002-06-04 | 2004-11-26 | Auckland Uniservices Ltd | Immunomodulatory constructs and their uses |
TW201037080A (en) * | 2003-12-25 | 2010-10-16 | Danform Kk | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
US8314220B2 (en) * | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods compositions, and kits for detection of microRNA |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1571849A (zh) * | 2001-09-15 | 2005-01-26 | 阿赫姆生物系统公司 | 应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置 |
US7537890B2 (en) * | 2003-10-03 | 2009-05-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of performing biochemical reactions in a convective flow field |
Also Published As
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