CN115698327A - Pcr样品区块温度一致性 - Google Patents
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Abstract
一种适用于执行聚合酶链式反应(PCR)程序热循环仪的样品板,包含基板和从基板向上延伸的多个反应容器。样品板进一步包含围绕着由反应容器限定的外周的垂直壁。垂直壁可以是连续垂直壁、间歇垂直壁或穿孔垂直壁。间歇垂直壁可以包含多个壁部分,多个壁部分中的每个壁部分通过多个间隙与其他壁部分隔开。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请号63/039,090的优先权,其题为“PCR样品区块温度一致性(PCR SAMPLE BLOCK TEMPERATURE UNIFORMITY)”,于2020年6月15日提交,其全部内容通过引用纳入本文。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)提供了一种复制或“放大”少量DNA的方法,以便有足够的数量可用于进一步研究。可以在几个小时内制作出数百万或数十亿份DNA样品的拷贝。自1983年发明以来,PCR彻底改变了分子生物学领域,并在疾病诊断、法医学、研究等领域得到广泛应用。
为进行PCR,通常将少量试剂混合物放入反应容器中,例如每个反应容器10-200μL。虽然可以仅使用单个反应容器,但通常使用一排反应容器,包含数十个甚至数百个容器。试剂混合物可包含待复制的DNA、DNA聚合酶、与DNA靶链末端互补的两个DNA引物、缓冲溶液和其他材料。在一些初始化步骤之后,试剂混合物经历重复的温度循环。例如,在每个热循环中,试剂混合物在第一段时间保持在约94-96℃以将DNA“解链”成两个单链DNA分子,然后在第二段时间保持在约68℃的温度使引物与每个单链DNA模板退火,然后在第三段时间保持在约72℃的温度以“延伸”DNA链,产生新的双链DNA分子。每个热循环名义上使存在的标靶DNA的量加倍。
在典型的PCR过程中,可能会进行大约20-40次热循环,总共需要几分钟到几小时。已开发出用于自动执行热循环的设备,并且通常基于热电效应(thermoelectric effect)。
理想地,各种反应容器经历尽可能相同的温度分布。然而,先前的系统并没有达到期望的的温度一致性水平。
发明内容
根据一个方面,用于热循环仪的样品板包含底板和从底板向上延伸的多个反应容器。反应容器限定外周,并且样品板还包含围绕反应容器的垂直壁。
根据另一方面,用于执行聚合酶链式反应(PCR)过程的热循环装置包括散热器和与散热器热接触的一个或多个热电装置。热电装置被配置为响应流经热电装置的电流以产生温差。热循环装置进一步包含与一个或多个热电装置热接触的样品板。样品板包含底板和从基板向上延伸的多个反应容器。反应容器限定外周,并且样品板还包含围绕反应容器外周的垂直壁。
根据另一方面,方法包括提供PCR热循环仪,将试剂混合物接收到反应容器中,以及控制热电装置使样品板达到95℃的标称温度。当样品区块保持在95℃的标称温度时,样品板反应容器之间的温度变化达到小于1℃的值。
附图简要说明
图1显示了PCR热循环仪的简化示意图。
图2显示了图1的PCR热循环仪一些部件的分解图。
图3显示了图1的热循环仪的样品区块,包含反应容器。
图4显示了根据本发明实施方式的样品区块。
图5显示了没有垂直壁的样品区块的热建模结果。
图6显示了根据本发明实施方式,具有垂直壁的样品区块的热建模结果。
图7显示了根据本发明实施方式构造的实验样品区块。
图8显示了根据本发明的实施方式用于测量样品区块性能的系统。
图9说明了图4的样品区块,其中根据本发明的实施方式,增加了绝缘体901。
图10显示了图9排列的分解图。
图11显示了根据本发明的实施方式对具有垂直壁和添加了绝缘体的样品区块的性能进行热建模分析的结果。
图12显示了根据本发明其他实施方式的样品区块。
图13显示了根据本发明其他实施方式的样品区块。
图14显示了根据本发明其他实施方式的样品区块。
具体实施方式
本发明的实施方式提供了PCR热循环仪中反应容器之间改进的温度一致性。
图1显示了通用PCR热循环仪100的简化示意图。反应容器101阵列容纳在外壳102中。提供活动盖体103以在PCR程序期间覆盖反应容器101。盖体103可在程序期间被加热,例如加热到大约98℃,以减少或防止热循环仪100内的冷凝。热循环仪100可包含各种控件和指示器,例如触摸屏显示器104。
图2显示了PCR热循环仪100的一些部件的分解图,显示了进一步的细节。反应容器101由导热材料整体形成为样品区块201。多个热电装置202电连接到印刷电路板203,并且热耦合到样品区块201和散热器204。
图3更详细地显示了样品区块201,包含反应容器101。
在操作中,控制器(例如应用于印刷电路板203上)以变化的电流驱动热电装置202以实现PCR的热循环,根据执行PCR程序的需要,将样品区块201加热到不同温度并持续合适的时间。在一个具体的实验中,所有的反应容器101可包含相同的试剂混合物,或不同的反应容器可包含不同的试剂混合物,这样就可以平行进行两个或更多个不同的检测。
尽管热电装置202可相对均匀地分布在样品区块201下方,并且样品区块201由导热材料(例如铝)制成,但是反应容器101彼此之间的温度仍可能存在一定程度的差异。
图4显示了根据本发明实施方式的样品区块401。样品区块401包含反应容器402,其类似于上述讨论的反应容器101,从基板404向上延伸。样品区块401还包含围绕反应容器402的垂直壁403。示例样品区块401包含在X和Y方向上测量约106×148毫米的基板404。样品区块401包含96个反应容器402,每个反应容器的外径约为6.3mm,顶端内径约为5.5mm,底部逐渐变细至内径约为2.4mm。优选地,反应容器402在X和Y方向上中心到中心间隔开9mm,类似于微流体应用中常用的样品板,尽管这不是必需的。反应容器402可以是大约10.4mm高,但是也可以使用其他尺寸。在其他实施方式中,可以使用任何可用尺寸,任何可用数量的反应容器。例如,可以有更多或更少的反应容器。在一些实施方式中,可以存在多达384个更多的反应容器,其小于反应容器402,并且在X和Y方向上间隔4.5mm。
在图4的实施方式中,垂直壁403高约10.4mm,从样品区块401的底板404的顶表面测量,垂直壁403的内表面405位于距反应容器402的外周约3.0mm的位置,这是由反应容器402最外侧的行和列的外表面定义的。在图4的示例中壁403与反应容器402高度相同,这不是必需的,并且根据本发明的实施方式,壁可以比反应容器更高或更短。垂直壁403可以是约0.5至3.0mm厚,或其他可加工的厚度。在图4的示例中,垂直壁厚1.0mm,X、Y方向围合面积约为75×111mm。在其他实施方式中,这些尺寸可变。
样品区块401优选地是一块一体式导热材料,如铝或其他合适的材料。样品区块401可以通过任何合适的工艺制成,例如压铸、烧结、3D打印、机械加工或类似工艺,或通过各种工艺的组合。
外壁403用于在PCR程序期间提高反应容器402的温度一致性。在没有垂直壁403的情况下,认为外排和外列的反应容器有更多机会向外流动热量,无论是通过辐射到放置样品区块的PCR循环装置的周围结构,还是通过样品区块周围空间的小气流造成的对流,或者通过基板404向外传导。例如,内孔表面的自然对流系数可能在0到1W/m2-K之间,而周边孔外表面的自然对流系数可能为5-10W/m2-K。垂直壁403可影响这些热流机制中的任何一个或所有。
例如,周边壁403将与样品区块上的孔一起被被动加热和冷却。靠近外孔的加热壁减少了自然对流及其在孔上的相关热损失,并且对流系数与内孔周围的对流系数相似。此外,壁还充当了气流的物理屏障,可以冷却周边的孔。在任何样品区块上,块周围的空气都比靠近块的空气冷。温差会在外围孔周围产生气流。壁403充当围绕周边孔的气流的物理屏障并改进温度一致性。
图5和6显示了具有和不具有垂直壁403的样品区块的性能的热模型分析的结果,样品区块保持在95℃的稳定标称温度。
图5显示了没有垂直壁403的建模结果。温度带501-509对应于表1中给出的温度范围:
表1
在点510,模拟平均温度为95.06℃,以及在点511,模拟平均温度为94.18℃,温度变化为95.06-94.18=0.88℃。
图6显示了没有垂直壁403的建模结果。温度带601-609对应于表2中给出的温度范围:
条带 | 温度范围℃ |
601 | 95.14–95.33 |
602 | 94.94–95.14 |
603 | 94.75–94.94 |
604 | 94.55–94.75 |
605 | 94.36–94.55 |
606 | 94.16–94.36 |
607 | 93.97–94.16 |
608 | 93.77–93.97 |
609 | 93.58–93.77 |
表2
在点610,模拟平均温度为95.27℃,以及在点611,模拟平均温度为94.66℃,温度变化为95.27-94.66=0.61℃。
因此模型表明,与缺少垂直壁403的样品区块相比,样品区块401的温度变化可减少约30%。
为了进一步验证,通过用金属板形成壁并用导热粘合剂将其粘合到现有的样品区块来构建具有垂直壁的样品区块的原型。根据本发明的实施方式,在图7中显示了得到的样品区块701,包含垂直壁壁702。如图8所示,对三个样品区块进行了测试,包括有垂直壁和无垂直壁。对于测量,将实验样品区块安装在改良的Bio-Rad T100热循环仪中,其可从美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad公司获得。如图8所示,使用温度探针801测量所选反应容器的温度。得到的测量结果表明,与没有垂直壁的样品区块相比,具有垂直壁702的样品区块的温度变化减少了约20%。对于缺少垂直壁的样品区块,测得的温度变化约为1.12℃,而对于具有垂直壁的样品区块,测得的温度变化约为0.9℃。测量是在样品区块保持在95℃的稳定标称温度下进行的。
在其他实施方式中,可以在样品区块上提供附加的绝缘体。例如,根据本发明的实施方式,图9说明了样品区块401,其包含垂直壁403,具有添加的绝缘体901。图10显示了样品区块401和绝缘体901的分解图。
图11显示了根据本发明的实施方式对具有垂直壁和添加了绝缘体的样品区块的性能进行热建模分析的结果,其中样品区块保持在95℃的稳定标称温度。绝缘体901可以由任何合适的材料制成,例如聚合物,如聚碳酸酯或ABS或聚合物的混合物。绝缘体901可以是固体材料,或者可以包含空隙。绝缘体901可以是刚性的或柔性的。例如,绝缘体901可以是泡沫材料,例如聚氨酯或聚异氰脲酸酯泡沫。出于建模的目的,假设绝缘体901与垂直壁403有良好的热接触,并且被指定为具有0.2W/m-K的热导率,类似于聚碳酸酯的特性。图11中所示的温度带1101-1109对应于表3中给出的温度范围:
条带 | 温度范围℃ |
1101 | 95.05–95.25 |
1102 | 94.86–95.05 |
1103 | 94.66–94.86 |
1104 | 94.47–94.66 |
1105 | 94.28–94.47 |
1106 | 94.08–94.28 |
1107 | 93.89–94.08 |
1108 | 93.69–93.89 |
1109 | 93.50–93.69 |
表3
在点1110,模拟平均温度为95.19℃,以及在点1111,模拟平均温度为94.67℃,温度变化为95.19-94.67=0.52℃。
因此建模表明,与缺少垂直壁403和缺少额外绝缘体901的样品区块相比,具有附加绝缘体901的样品区块401的温度变化可以减少约40%(100x(1-0.52/0.88)=40.9),并且与具有垂直壁403但没有添加绝缘体的样品区块401相比减少约15%(100×(1-0.52/0.61)=14.75)。
在本发明所示的样品区块中,其他变化是可能的。例如,根据其他实施方式,图12说明了样品区块1201。样品区块1201类似于上述样品区块401,因为它包含从基板1204向上延伸的多个反应容器1202。然而,反应容器1202不具有连续的垂直壁,而是被间断的垂直壁1203包围,具有间隙1205(仅其中一些被标记)。间隙1205的数量和尺寸可以不同于图12所示的示例。
与样品板401相比,这样的壁可以减少样品板1201的质量。质量的减少可能是有益的,因为较低的质量需要更少的加热和冷却功率,因此包含样品板1201的PCR热循环仪可能能够更快地循环反应容器的温度,从而减少完成PCR程序所需的时间量。或者,与使用具有连续壁的样品板相比,较低的质量可以在不牺牲循环速度的情况下使用较低功率的热电装置。
根据本发明的其他实施方式,减少样品板质量的其他方式也是可能的。例如,图13说明了样品板1301,其中垂直壁1302已被打上孔1303。孔1303的数量、尺寸和分布可以是变化的。
在另一个示例中,图14说明了样品板1401,其仅在角部处具有垂直壁1402,靠近角部反应容器1403。角部反应容器1403可能趋向于具有最极端的温度变化,因此将壁1402仅放置在角部处能解决可能最需要改进之处的温度一致性,同时相对较少地增加样品板1401的质量。
许多其他减重技术也是可能的,例如改变垂直壁的高度或厚度。
根据本发明实施方式的样品板可纳入在其他方面类似于如上所述的热循环仪100的热循环仪装置中,或者可用于其他应用中。
对于本领域的技术人员来说显而易见的是,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,可以对本发明的方法和系统进行各种修改和变动。因此,本发明旨在包括在所附权利要求及其等同内容的范围内的修改和变化。应当理解,本文公开的特征和性能的任何可行组合也被认为是公开的。
Claims (20)
1.一种用于热循环仪的样品板,所述样品板包含:
基板;
从基板向上延伸的多个反应容器,所述反应容器限定了外周;以及
围绕反应容器的垂直壁。
2.根据权利要求错误!未找到引用源。所述的样品板,其中样品板是一体式的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的样品板,其中样品板包含铝。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的样品板,进一步包含围绕所述垂直壁并与之接触的热绝缘体。
5.根据权利要求4所述的样品板,其中热绝缘体包含聚合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的样品板,其中垂直壁与所述反应容器具有相同的高度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的样品板,其中垂直壁是连续的。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的样品板,其中垂直壁是间歇的。
9.根据权利要求8所述的样品板,其中间歇垂直壁包括由多个间隙隔开的多个壁部分。
10.根据权利要求8所述的样品板,其中反应容器被排列以产生多个角部,并且其中竖直壁的壁部分围绕所述多个角部中的每一个角部延伸。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的样品板,其中垂直壁是穿孔的。
12.根据权利要求11所述的样品板,其中反应容器被排列以产生多个角部,并且其中穿孔远离所述角部。
13.一种用于执行聚合酶链式反应(PCR)过程的热循环装置,该热循环装置包括:
散热器;
一个或多个热电装置,其被配置为响应于经过所述热电装置的电流而产生温度差,其中所述一个或多个热电装置与所述散热器热接触;以及
与所述一个或多个热电装置热接触的样品板,其中所述样品板包含基板;从基板向上延伸的多个反应容器,反应容器限定外周;以及围绕反应容器外周的垂直壁。
14.根据权利要求13所述的热循环装置,进一步包括控制器,所述控制器配置为通过控制流经所述热电装置的电流根据预定时间表使所述反应容器的温度循环。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的热循环装置,进一步包括容纳所述散热器的基座。
16.根据权利要求15所述的热循环装置,进一步包括可打开和可关闭的盖体以提供进入反应容器的入口。
17.根据权利要求16所述的热循环装置,其中盖体在PCR过程中被加热。
18.根据权利要求13-17任一项所述的热循环装置,其中控制热电装置使所述样品板保持在95℃的标称温度时,样品板的反应容器之间的温度变化小于1℃。
19.一种方法,其包括:
提供如权利要求6所述的PCR热循环仪装置;
将试剂混合物接收到反应容器中;以及
控制热电装置使样品板达到95℃的标称温度,其中当样品区块保持在95℃的标称温度时,样品板的反应容器之间的温度变化达到小于1℃的值。
20.根据权利要求19所述的方法,进一步包括根据PCR程序,按需控制热电装置以循环样品区块的温度。
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