CN114561493A - 一种快速新冠病毒n501y突变变体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方法，通过引物设计，引物SL1和SL2可以完全与正常型H1N1的DNA，而引物SL1和SL2与突变型DNA存在一个碱基差异。当高温连接酶的催化下，只有SL1和SL2连接成一条完整的茎环状结构时，才是后续LAMP基因扩增循环的起始结构。连接反应的产物（茎环状结构产物），用LAMP方法进行核酸扩增，根据LAMP反应产生颜色变化进行结果判读。本发明基于RNA连接酶技术，无需反转录技术，且反应时间短，连接时间（15分钟）和LAMP反应（15分钟）合计30分钟；能够精准识别一个碱基的差异；设备要求简单，无需荧光定量PCR仪，反应只需金属浴；LAMP结果可视化，终点判定简单。
Description
技术领域
本发明属于新冠病毒技术领域，具体的说涉及一种快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方法。
背景技术
新冠病毒为RNA病毒，变异快，因此突变体进行快速检查，有利于临床后期治疗。目前我们国家对新冠突变体检测最常规方法是NGS测序技术和荧光PCR技术，虽然该方法检测方法准确，但是耗时耗力。
发明内容
本发明提出了一种快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方法，能够特异性区分新冠病毒及变异株N501Y突变。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：
一种新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系，所述反应体系包括引物、置换引物和扩增引物，
引物SL1：
AGTGGGTTGGAAACCATATCGACAGCAGAGGATCCGCTCACACTTCCACACAACAAATCCTCTGCTGTCG(SEQ ID NO:1)；
引物SL2：
ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGTTGGTAACCAACACCATA(SEQ ID NO:2)；
置换引物FIP：CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGG(SEQ ID NO:3)；
置换引物BIP：ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC(SEQ ID NO:4)；
扩增引物FL：CCAGTCACGACGATGTTG(SEQ ID NO:5)；
扩增引物BL：CAGCAGAGGATTTGTTGTG(SEQ ID NO:6)。
优选地，所述N501Y突变体包括野生型和突变型序列，野生型和突变型序列序列分别为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。
所述方法包括以下步骤：
第一步连接酶链反应(LCR)：
连接酶链反应(LCR)基本原理为：DNA/RNA连接酶介导的反应因其对突变位点优异识别，能够识别仅仅一个碱基的差异。本实验设计一对专门环形引物(SL1和SL2)；
利用DNA/RNA连接酶特异地将设计引物与之N501Y模板RNA结合，形成一个哑铃结构模板。而正常新冠病毒因为序列与引物无法完全互补，所以无法连接成一条模版。见图1。
第二步环介导等温扩增：
根据第一步连接反应的产物(茎环状结构产物)，我们用LAMP方法进行核酸扩增和根据LAMP会导致颜色变化进行结果判断。具体而言如下：
首先，为了减少模板可能引起的非特异性扩增，我们只在SL1和SL2区域上设计引物置换引物FIP和BIP。引物位置和序列如下。同时为了加速扩增效率，增加了2条增加快速扩增引物(LF和BF)。环介导等温扩增是针对哑铃结构靶基因区域设计FIP，BIP，FL,BL引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109倍的扩增，反应能大量的扩增H+离子，改变反应体系中PH值。因此在反应体系中添加pH指示剂，可以通过肉眼观察反应体系中颜色有无变化来判断靶基因是否存在。
其中图2-3表示，N501Y突变型中反应体系中，以哑铃结构为扩增模板，与FIP和BIP引物发生链置换扩增反应，产生大量扩增产物。
观察反应液体颜色变化；N501Y突变型反应颜色从粉红色变成黄色；N501Y野生型或者NTC依旧是粉红色。
随着LAMP反应的进行，正常型H1N1的反应管中核酸扩增会引起的pH变化，最终引起来变色的(由粉红变成黄色)。见图4。
进一步优选地，第一步是依赖连接酶的链接反应：
1.1链接酶：HiFi Taq DNA Ligase(NEB,M0647)；
1.2 DNA模板：根据公布新冠病毒N501Y的序列，将野生型新冠病毒N501Y-W和突变型新冠病毒N501Y-M的序列构入到质粒中，作为后续实验模板，质粒浓度为1*103copies/ul；
1.3SL1引物和SL2引物生工合成，用去离子水稀释成10μM的工作液；
1.4链接反应体系的温度和引物浓度：浓度为20nM，
10X HiFi Taq DNA Ligase Buffer:N501Y野生型取5μl，N501Y突变型取5μl，NTC取5μl；
HiFi Taq DNA Ligase：野生型取1μl，N501Y突变型取1μl，NTC取0μl，
DNA：野生型取1ul，N501Y突变型取1ul，NTC取1ul，
SL1：野生型取0.1μl，N501Y突变型取0.1μl，NTC取0.1μl，
SL2：野生型取0.1μl，N501Y突变型取0.1μl，NTC取0.1μl，
H2O：野生型取42.8μl，N501Y突变型取42.8μl，NTC取43.8μl，
Total：野生型取50μl，N501Y突变型取50μl，NTC取50μl，
链接反应温度58℃；反应时间15min，得到连接反应产物；
第二步环介导等温扩增：
2.1 WarmStart LAMP Kit(NEB,E1700)，天根恒温金属浴；
2.2取上述1.0μL的连接反应产物作为LAMP反应的核酸模板，其中NTC用去离子水代替，具体反应体系为：
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix：正常型DNA 12.5μl，突变型DNA12.5μl，去离子水12.5μl
FIP和BIP：正常型DNA 1μl，突变型DNA 1μl，去离子水1μl，
FL和BL：正常型DNA 1μl，突变型DNA 1μl，去离子水1μl，
Target DNA：正常型DNA 1μl，突变型DNA 1μl，去离子水0μl，
dH2O：正常型DNA 9.5μl，突变型DNA 9.5μl，去离子水10.5μl，
Total Volume：正常型DNA 25μl，突变型DNA 25μl，去离子水25μl；
FIP和BIP反应终浓度为160nM,FL和·BL反应终浓度为40nM；
2.3 LAMP反应条件，上述25μl放置在金属浴中，65℃恒温加热，反应15分钟后结束；观察反应液体颜色变化；N501Y突变型反应颜色从粉红色变成黄色；N501Y野生型或者NTC依旧是粉红色。
所述新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系的检测产品。
所述检测方法的检测产品。
本发明的有益效果：
1、本方法能够特异性区分新冠病毒(2019-nCoV)及变异株N501Y突变，并且检测时间短，特异性强，特别适用于一些基层检测或者突发情况检测。
2、检测结果采用可视化判读(红黄颜色变化)，结果判读方式简单，反应设备需求简单。
3、基于连接酶链反应(LCR)和环介导等温扩增技术快速检测新冠变异株N501Y的新技术。连接酶链反应(LCR)保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特异性高于PCR(高特异性，能够识别一个碱基的差异)；环介导等温扩增确保扩增速度和可视化检测(反应速度快+检测结果可视化)。
相对于qPCR检测技术有以下优势：
1.时间短：本实验基于RNA连接酶技术，无需反转录技术。并且连接时间(15分钟)，LAMP反应(15分钟)，总共30分钟。而反转录+qPCR需要2.5小时。
2.高特异性，能够识别一个碱基的差异。
3.设备简单，无需PCR仪器，只需要金属浴。
4.LAMP结果可视化，终点判定简单。
附图说明
图1是连接酶链反应原理图；
图2是环介导等温扩增原理图；
图3是实验结果图1。
图4是实验结果图2。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。
实施例1
1链接反应体系
所需试剂及设备：
1.1链接酶：HiFi Taq DNA Ligase(NEB,M0647),天根恒温金属浴
1.2 DNA模板：含有正常型H1N1的m片段基因和突变型型H1N1的m片段基因的序列的质粒，质粒浓度为1X 103copies/ul
1.3 SL1引物和SL1引物生工合成，用去离子水稀释成10μM(μM＝umol/L，后面不需要再加uL了)的工作液
1.4链接反应体系的温度和引物浓度参考NEB官网的推荐参数
(http://ligasecalc.neb.com/#！/ligation)，引物SL1和SL2浓度为20nM，链接反应温度58℃。反应时间15min。
表1链接反应体系
| 加入量 | 终浓度 | |
| HiFi Taq DNA Ligase | 1μl | 按说明书推荐 |
| DNA(突变型或正常型) | 1ul | 1*10<sup>4</sup>copies |
| SL1引物 | 1μl | 20nM |
| SL1引物 | 1μl | 20nM |
| H<sub>2</sub>O | 42.8μl |
2.LAMP反应体系
2.1 WarmStart LAMP Kit(NEB,E1700)，天根恒温金属浴
2.2取上述1.0μL的连接反应产物(包括正常型和突变型)作为LAMP反应的核酸模板，其中NTC用去离子水代替。
表2 LAMP反应体系
FIP和BIP反应终浓度为160nM,FL和BL反应终浓度为40nM。
2.3 LAMP反应条件，上述25μl放置在金属浴中，65℃恒温加热，反应15分钟后结束。观察反应液体颜色变化。见图2。
如图所示：只有将SL1和SL2连接起来，形成茎环状结构的才能进行下一步的链置换扩增反应(LAMP)。
3.实验结果：见图3-4。
终点判定简单：LAMP结果可视化，即通过反应过程中颜色的变化。反应结束后，通过颜色判断实验结果。正常型DNA反应颜色从粉红色变成黄色；突变型或者NTC依旧是粉红色。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉兰丁智能医学股份有限公司
<120> 一种新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系
<130> 10
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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Claims (6)
1.一种新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系包括引物、置换引物和扩增引物，
引物SL1：AGTGGGTTGGAAACCATATCGACAGCAGAGGATCCGCTCACACTTCCACACAACAAATCCTCTGCTGTCG；
引物SL2：ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGTTGGTAACCAACACCATA；
置换引物FIP：CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGG；
置换引物BIP：ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC；
扩增引物FL：CCAGTCACGACGATGTTG；
扩增引物BL：CAGCAGAGGATTTGTTGTG。
2.根据权利要求1所述新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系，其特征在于，所述N501Y突变体包括野生型和突变型序列，野生型和突变型序列分别为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO: 8。
3.采用权利要求1-2任意一项所述检测反应体系进行快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
第一步：基于连接酶链的反应：在突变型序列病毒株和连接酶作用下，SL1和SL2引物连接形成一个哑铃结构模板；
第二步：以上述哑铃结构模板，启动LAMP快速扩增。
4.根据权利要求3所述检测反应体系进行快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
第一步是依赖连接酶的链接反应：
1.1 链接酶：HiFi Taq DNA Ligase (NEB, M0647)；
1.2 DNA模板：根据公布新冠病毒N501Y的序列，将野生型新冠病毒N501Y-W和突变型新冠病毒N501Y-M的序列构入到质粒中，作为后续实验模板，质粒浓度为1* 103copies/ul；
1.3 SL1引物和SL2引物生工合成，用去离子水稀释成10µM的工作液；
1.4 链接反应体系的温度和引物浓度：浓度为20nM，
10 X HiFi Taq DNA Ligase Buffer: N501Y野生型取5 µl，N501Y突变型取5 µl，NTC取5 µl；
HiFi Taq DNA Ligase：野生型取1 µl ，N501Y突变型取1 µl，NTC取0 µl，
DNA：野生型取1ul ，N501Y突变型取1ul，NTC取1ul，
SL1：野生型取0.1µl，N501Y突变型取0.1µl，NTC取0.1µl，
SL2：野生型取0.1µl ，N501Y突变型取0.1µl，NTC取0.1µl，
H2O：野生型取42.8µl，N501Y突变型取 42.8µl，NTC取43.8µl，
Total：野生型取50µl，N501Y突变型取50µl，NTC取50µl，
链接反应温度58℃；反应时间15min，得到连接反应产物；
第二步环介导等温扩增：
2.1 WarmStart LAMP Kit(NEB, E1700)，天根恒温金属浴；
2.2取上述1.0 µL的连接反应产物作为LAMP反应的核酸模板，其中NTC用去离子水代替，具体反应体系为：
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix：正常型DNA 12.5µl，突变型DNA 12.5µl，去离子水12.5µl
FIP和BIP：正常型DNA 1µl，突变型DNA 1µl，去离子水1µl，
FL和BL：正常型DNA 1µl，突变型DNA 1µl，去离子水1µl，
Target DNA：正常型DNA 1µl，突变型DNA 1µl，去离子水0µl，
dH2O：正常型DNA 9.5µl，突变型DNA 9.5µl，去离子水10.5µl，
Total Volume：正常型DNA 25µl，突变型DNA 25µl，去离子水25µl；
FIP和BIP反应终浓度为160nM,FL和·BL反应终浓度为40nM；
2.3 LAMP反应条件，上述25µl放置在金属浴中，65℃恒温加热，反应15分钟后结束；观察反应液体颜色变化；N501Y突变型反应颜色从粉红色变成黄色；N501Y野生型或者NTC依旧是粉红色。
5.一种应用权利要求1-4任一项所述新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系的检测产品。
6.一种应用权利要求4所述检测方法的检测产品。
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