DE3783485T2

DE3783485T2 - Fluessigphase-hybridizierungstest zum nachweis von polynukleotid-sequenzen.

Info

Publication number: DE3783485T2
Application number: DE8787102576T
Authority: DE
Inventors: Nanibhushan Dattagupta
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-03-05
Filing date: 1987-02-24
Publication date: 1993-05-06
Anticipated expiration: 2007-02-25
Also published as: DE3783485D1; JPS62282599A; KR870009031A; GR3006858T3; NO870612L; ES2053457T3; DK112187D0; JP2613203B2; EP0237833A3; AU6972487A; CA1290664C; IL81729A0; DK112187A; FI870922A; NO870612D0; EP0237833B1; EP0237833A2; FI870922A0

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Durchführung von Tests zur Bestimmung des Vorliegens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe und neue, hierfür geeignete Sonden.
Die Anwendung von nicht-überlappenden DNA-Sonden zur Hybridisierung wird in der PCT-Patentanmeldung Nr. 83/01459, den Europäischen Patenanmeldungen Nr. 0070687 und 0070685 offenbart. PCT Nr. 83/01459 und EP-A-0070687 offenbaren die Anwendung von zwei nicht-überlappenden Hybridisierungsonden zum Nachweis einer bestimmten Polynucleotidsequenz in einer Probe. Eine der Proben wird auf ein festen Träger vor der Hybridisierung fixiert. Obwohl dieses Verfahren das Problem einer elektrophoretischen Trennung von Nucleinsäuren vor der Hybridisierung vermeidet, ist das Verfahren langsam, da heterogene Phasen verwendet werden. Die europäische Veröffentlichung Nr. 0070685 offenbart einen Zweisondentests in homogener Phase mit einer nicht-radioaktiven Transfermethode. Dieses Verfahren erfordert eine komplizierte Ausrüstung, um die Hybridisierung zu überwachen. Der Hintergrund kann aufgrund der Braunschen Bewegung, einiger unspezifischen Reaktionen und, da die Konzentration der nicht- hybridisierten Sonden in der Lösung immer sehr hoch im Vergleich zu den hybridisierten Sonden ist, nicht eliminiert werden.
Ein heterogenes System mit zwei Sonden, von denen eine immobilisiert ist, wird in EP 130515 und Rank et al., Gene, 21 77-85 (1983) beschrieben. Die Sonden können DNA, RNA, gemischte Nucleinsäuren oder Oligonucleotide sein. Es werden Tests auf bestimmte Nucleinsäuresequenzen, wie solche, die Sichelzellenanämie anzeigen, offenbart, z.B. durch Inkontaktbringen der Probe mit zwei Sonden. Die immobilisierte Sonde, sonst als Trennsonde bezeichnet, wird auf einen Träger, wie Nitrocellulose, immobilisiert. Die andere Sonde, als die Nachweissonde bezeichnet, trägt eine Markierung für den abschliessenden Test. Beiden Sonden enthalten verschiedene Nucleinsäurefragmente, die jeweils komplementär zu einem verschiedenen Bereich auf der Testsequenz, falls diese in der Probe vorliegt, sind. Die Probe und die Sonden werden vermischt, den Hybridisierungsbedingungen unterworfen, und falls die Probe die richtige Sequenz enthält, wird ihre Nucleinsäure als Brücke zwischen den zwei Sonden dienen. Dadurch wird die Markierung der markierten Sonde an dem festen Träger angeheftet. Der Träger wird entfernt, und anschliessend wird auf Anwesenheit der Markierung abgelesen. Die Sonde kann so beschaffen sein, daß die Markierung auf dem festen Träger entweder ein positives oder negatives Ergebnis im Hinblick auf die zu testende Bedingung anzeigt. Zusätzlich zur Sichelzellenanämie kann der Test auf jeden anderen genetischen Zustand z.B. Thalassämie, Tay-Sachs usw. erfolgen. Ein identisches Verfahren kann auch zum Nachweis von Bakterien oder Viren in Proben durchgeführt werden.
Obwohl ein solches Verfahren ein zufriedenstellendes Ergebnis liefert, war es erwünscht, den diagnostischen Prozeß zu beschleunigen, ohne daß die Nachteile, wie bei einem homogenen Zweisondentest wie oben erwähnt, auftreten.
Ein homogenes System mit zwei Sonden wird in der EP-Anmeldung No. 0192168 beschrieben. Dieses Verfahren verwendet zwei nicht-überlappenden Sonden, von denen eine zum Nachweis markiert ist und die andere zur Trennung des Hybrids dient. Der Test findet in einer homogenen Lösung statt, und das Hybrid wird anschließend durch eine Immobilisierungsreaktion mit einem festen Träger von der Trennsonde abgetrennt.
Die australische Patentschrift 40310/85 betrifft die Verwendung einer Azidgruppe zur Markierung von Sonden. Die australische Patentschrift offenbart die Verwendung von zwei in einem Einzeltest beteiligten Sonden.
EP-A-0146815 beschreibt ein Nucleinsäure-Hybridisierungs- Testverfahren, worin das Hybridisierungsprodukt in Form eines Intercalationskomplex gebildet wird, der anschließend durch Bindung an ein für den Intercalationskomplex spezifisches Antikörperreagenz nachgewiesen wird.
WO-A-85/02628 beschreibt ein Nucleinsäure-Hybridisierungs- Testverfahren, worin das zwischen der Probe und der Nucleinsäurensonde gebildete Hybridisierungsprodukt unter Bildung von kovalenten Vernetzungen zwischen der Probe und den Sondensträngen umgesetzt wird.
WO-A-86/03227, welches einen Stand der Technik mit der Maßgabe des Artikels 54 (3) EPC darstellt, beschreibt ein Nucleinsäure-Hybridisierungs-Testverfahren unter Verwendung von Sonden mit interaktiven Markierungen.
Die Hybridisierung wird durch Überwachung des durch die sich einander nähernden interaktiven Markierungen produzierten Signals nachgewiesen.
EP-A-0235726 beschreibt ein Nucleinsäure-Hybridisierungs- Testverfahren, worin die Proben-Nucleinsäure markiert und mit mehrfach immobilisierten Proben hybridisiert wird.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Test auf eine bestimmte Nucleinsäuresequenz schnell unter Verwendung von nur einer Sonde durchzuführen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Tests ohne die Notwendigkeit von reinen Sonden und Proben durchzuführen.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile werden erfindungsgemäß gelöst, wonach ein homogenes Hybridisierungs-Verfahren zur Verfügung gestellt wird, das mit einem Hybridtrennsystem verbunden ist. Dieses Verfahren ermöglicht die Durchführung rascher Hybridisierung und schaltet das Hintergrundproblem durch selektive Abtrennung der Hybride aus der Lösung aus. Dieses Verfahren erfordert nur übliche Laborausrüstung zum Test der Post-Hybridisierungsprodukte.
Das diagnostische Verfahren findet homogen, d.h. in Lösung statt. Darüberhinaus ist die Wirksamkeit des Hybridisierungsverfahrens in Lösung höher als in einem heterogenen System.
Das obige Ziel wird durch ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe erreicht, die enthält
a) chemisch modifizierende Nucleinsäuren in der Probe, entweder, um eine Markierung oder eine reaktive Stelle unter Herstellung einer chemisch-modifizierten, hybridisierbaren Nucleinsäure einzuführen.
b) Inkontaktbringen unter Hybridisierungsbedingungen der chemisch-modifizierten Proben-Nucleinsäure mit einer hybridisierbaren Nucleinsäuresonde, die entweder, wenn die Nucleinsäuren modifiziert wurden, um eine Markierung einzuführen, eine reaktive Stelle trägt oder, wenn die Proben-Nucleinsäure durch Einführung einer reaktiven Stelle modifiziert wurde, markiert ist,
c) Inkontaktbringen der aus Schritt b) erhaltenen Lösung mit einer immobilisierten Form eines Reaktionspartners für die reaktive Stelle unter Bildung einer stabilen Bindung mit der reaktiven Stelle auf der Probennucleinsäure oder der Sonde,
d) Trennung der erhaltenen immobilisierten Fraktion von der übrigen Lösung und
e) Bestimmung des Vorliegens der Markierung in der abgetrennten, immobilisierten Fraktion oder Abnahme der Markierung in der übrigen Fraktion.
Die chemische Modifikation kann durch Reaktion mit einem photochemisch reaktiven Reagens (z.B. einem an eine Nucleinsäure bindenden Liganden), das die Markierung oder die reaktive Stelle enthält, erfolgen.
Die Konzentration der Sonde ist vorzugsweise größer als die der Probe. Z.B. kann die Sonde im Überschuß zur Probe von mindestens 1000-fach vorliegen, um die Reaktion zu beschleunigen.
Vorzugsweise ist eine solche reaktive Gruppe (reaktive Stelle) in der Sonde eine Bindungstelle, wie eine Biotin- oder Hapten- Einheit, die zur spezifischen nicht-kovalenten Bindung mit einer bindenden Substanz, wie z.B. Avidin oder einem Avidin, das als Reaktionspartner dient, in der Lage ist.
Die reaktive Gruppe in der immobilisierten Form ist von solcher Art, daß sie an einen festen Träger, z.B. Sephadex Gel, Agarose, Nitrocellulosepapier und Plastik gebunden ist.
Die Markierung der Probe oder der Sonde kann unter Verwendung einer nachweisbaren chemischen Gruppe erfolgen, die radioaktiv, fluoreszierend, enzymatisch, oder ähnlich sein kann. Vorzugsweise wird die chemische Modifikation der Probennucleinsäure entweder zur Markierung oder zur Einführung der mit dem Substrat reaktiven Gruppe photochemisch durchgeführt.
Die Sonde wird mit der Probe in einer verdünnten wässerigen Lösung zusammengebracht. Unter Verwendung geeigneter Bedingungen bzgl. der Ionenstärke, pH und Temperatur wird, falls die richtigen Komponenten vorhanden sind, die Hybridisierung sehr rasch fortschreiten. Nachdem die immobilisierte Reaktionsgruppe eingeführt ist, und nach Vorstreichen der erforderlichen Zeit, um eine Wechselwirkung der Reaktionsgruppe mit der markierten Probe zu ermöglichen, wird die immobilisierte Phase oder Fraktion entfernt, gewaschen, und der Test nach dem bekannten Verfahren, beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 0130515, durchgeführt.
Die Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Sonde enthält mindestens eine einzelsträngige Basensequenz, die im wesentlichen komplementär zu oder homolog mit der nachzuweisenden Sequenz ist. Eine solche Basensequenz muß jedoch nicht ein einzelnes kontinuierliches Polynucleotidsegmentsein, sondern kann aus zwei oder mehreren einzelnen Segmenten, die durch nicht-homologe Sequenzen unterbrochen sind, bestehen. Zusätzlich kann die homologe Region der Sonde am 3'- und 5'-Ende durch eine nicht-homologe Sequenz flankiert sein, wie z.B. eine solche für die DNA or RNA eines Vektors, in den die homologe Sequenz zur Vermehrung eingeschleust wurde. In jedem Fall werden die Sonden, als analytische Reagentien, eine nachweisbare Hybridisierung an einer oder mehreren Stellen mit der zu bestimmenden Probennucleinsäure zeigen. Lineare oder zirkuläre einzelsträngige Polynucleotide können als Sondenelemente verwendet werden, wobei größere oder kleinere Bereiche mit einem komplementären Nucleotidstrang oder -strängen duplifiziert sind, unter der Voraussetzung, daß das kritische homologe Segment oder die Segmente als Einzelstrang vorliegen und für Hybridisierung mit der Proben DNA oder RNA zugänglich sind. Die Sonden können DNA oder RNA enthalten und können von jeder beliebigen oder erwünschten Länge im Bereich von 50 zu wenigen Kilobasen, vorzugsweise 10 Kilobasen, sein und Oligonucleotide mit von ca. 4 bis 50 Basen einschliessen. Die Herstellung einer geeigneten Sonde für einen bestimmten Test gehört zu den Standardverfahren des Fachmanns.
Die Substrat-reaktive Gruppe, je nachdem, ob in der Sonde oder in den Probennucleinsäuren und die entsprechenden reaktiven Partner auf der immobilisierten Phase werden im folgenden als reaktive Stelle/reaktives Partnerpaar bezeichnet.
Im wesentlichen kann jedes Substanzpaar für diese Funktion eines reaktiven Stelle/reaktiven Partnerpaares dienen, welches eine ausreichende Affinität zur Wechselwirkung unter Bildung einer stabilen Bindung ausübt, d.h. eine Bindung oder Kopplung zwischen den beiden, die im wesentlichen während der nachfolgenden Testschritten intakt bleiben, prinzipiell der Abtrennung und den Nachweisschritten. Die gebildete Bindung kann eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Wechselwirkung sein, wobei die letztere bevorzugt ist, insbesondere wenn sie durch ein hohes Maß an Selektivität oder Spezifität charakterisiert ist. Bei einer solchen bevorzugten Bindungsbildung bezeichnet man die reaktive Stelle als Bindungsstelle und die reaktive Gruppe als Bindungssubstanz mit der eine kovalente, nicht-kovalente, im allgemeinen spezifische Bindung oder Verknüpfung gebildet wird.
In einer solchen bevorzugten Ausführungsform kann die Bindungsstelle in einem einzelsträngigen hybridisierbaren Bereich oder in einem einzel- oder doppelsträngigen nicht- hybridisierbaren Bereich der Sonde vorliegen oder kann als Ergebnis einer chemischen Modifizierung der Sonden oder Probennucleinsäure vorliegen. Beispiele von Bindungsstellen, die in der Nucleotidsequenz vorkommen, sind solche wo die Sonde eine Promotersequenz (z.B. lac-Promoter, trp-Promoter), welche an ein Promoterprotein bindbar ist (z.B. Bakteriophagen-Promotoren, RNA-Polymerase) oder eine Operatorsequenz (z.B. lac-Operator) der durch ein Repressorprotein (z.B. lac-Repressor) bindbar ist, oder seltene antigene Nucleotide oder Sequenzen (z.B. 5-Brom oder 5-Joddeoxyuridin, Z-DNA), welche durch spezifische Antikörper gebunden werden können, (siehe ebenfalls britische Patentschrift 2125964) enthält. Die durch chemische Modifizierung der Sonde oder des Probennucleotids eingeführten Bindungstellen sind besonders geeignet und erfordern normalerweise die Bindung von einem Partner einer spezifischen Bindungspaars an die Sonde oder Probennucleinsäure. Geeignete Bindungspaare zur Auswahl umfassen Biotin/Avidin (einschließlich Eiweißavidin und Streptavidin), Haptene und Antigene/Antikörper, Kohlenhydrate/Lectine, Enzyme/Inhibitoren und ähnliche. Wo das Bindungspaar aus einem Proteinpartner und einem nicht-Proteinpartner besteht, ist es normalerweise bevorzugt, den nicht-Proteinpartner an die Sonde oder Probennucleinsäure zu binden, da der Proteinpartner unter den denaturierenden Bedingungen der Hybridisierung instabil sein kann. Bevorzugte Systeme umfassen die Bindung der Sonde oder Probennucleinsäure mit Biotin oder mit einem Hapten unter Anwendung eines immobilisierten Avidin- oder Anti-Hapten- Antikörperreagenzes.
Ein Antikörperreagenz kann in der Erfindung, wie oben beschrieben, als Mittel zur Immobilisierung eines Haptens oder einer Antigen-modifizierten Sonde oder Probennucleinsäure eingesetzt werden. Wie hierin verwendet, deutet ein Antikörperreagens eine immunologisch gewonnene bindende Substanz mit einer Antikörperbindungsaktivität, und kann ein vollständiger Antikörper oder ein Fragment davon sein, oder Aggregate oder Konjugate konventioneller polyklonaler oder monoklonaler Speilarten. Wenn das Reagens als vollständiger Antikörper vorliegt, kann dieser zu einer der Klassen und Unterklassen bekannter Immunglobuline, z.B. IgG, IgM usw. gehören. Jedes Fragment eines solchen Antikörpers, welches die spezifische Bindungsaffinität für die Bindungsstelle auf die beteiligten Sonde enthält, kann ebenfalls eingesetzt werden, z.B. Fragmente von IgG, üblicherweise bekannt als Fab, F(ab'), und F(ab')&sub2;. Zusätzlich können Aggregate, Polymere, Derivate und Konjugate von Immunglobulin oder seine Fragmente, wo geeignet, verwendet werden. Die Immunglobulinquelle für das Antikörperreagens kann nach jeder üblichen Methode, wie z.B. üblichen Antiseren und monoklonalen Techniken erhalten werden.
Antiserum kann nach bekannten Verfahren erhalten werden, die die Immunisierung eines Tieres, z.B. einer Maus, Kaninchens, Meerschweinchen oder Ziege mit einem geeigneten Immunogen umfassen. Die Immunglobuline können auch durch somatische Zellhybridisierungstechniken erhalten werden, was zu im allgemeinen als monoklonal bezeichneten Antikörpern führt, die ebenfalls die Verwendung eines geeigneten Immunogens erfordern.
Eine Nucleinsäureprobe oder eine Sonde kann modifiziert sein, um reaktive
- NH&sub2;,
- SH,
- COOH,
- - , or
- OH
Reste zu haben. Dies kann nach einem bekannten Verfahren erfolgen. Unter Verwendung von 5-Allylamino-UTP oder 8- Hexylamino-ATP und terminaler Deoxynucleotidyltransferase (TDT) können -NH&sub2;-Reste am 3'-Ende der Nucleinsäureprobe oder der Sonde eingeführt werden. Unter Verwendung von 4-Thio-UTP oder 5-Carboxymethyl-UTP und -TdT können -SH und -COOH-Reste eingeführt werden. Modifizierte Basen können ebenfalls durch Nick-Translation eingeführt werden. Wahlweise kann ein Ligandkovalent an die Nucleinsäure gebunden sein. Der Ligand kann die Reaktionstelle bilden. Z.B. kann ein Psoralen, ein Angelicin oder Azidoethidium mit -NH&sub2; photochemisch kovalent an die Nucleinsäureprobe oder Sonde gebunden sein und anschliessend über die Reaktionstelle im Liganden modifiziert werden. Ein mit Restriktionsenzym verdautes Fragment liefert im allgemeinen ein 5'-phosphoryliertes Ende. Ein Carbonylrest kann durch Oxidation des terminalen Riboserestes (kann über TdT-Reaktion eingeführt werden) erhalten werden. Diese Stelle oder Stellen können in einem oder mehreren Einheiten pro Nucleinsäureprobe oder Sonde vorlegen. Nachdem diese Reste einmal vorliegen, können bekannte Reaktionen eingesetzt werden, um eine kovalente Bindung zwischen den Resten und einem immobilisierenden Medium, z.B. einem bestimmten, festen Träger mit einem -OH-Rest
oder
festem Träger
oder HS festem Träger
oder
festem Träger
oder
festem Träger
oder OHC - festem Träger, unter Bildung von
-N- -,
-S-S-,
-S-C-,
- -O-,
zu bilden.
Jeder dieser aktivierten festen Träger kann nach bekannten Reaktionen hergestellt werden. Der Reaktionspartner wird im vorliegenden Test in immobilisierter Form, d.h. in jeder geeigneten Form, die es den Reaktionspartnern und den Komponenten der Reaktionsmischung ermöglicht, mit oder durch Hybridisierung und/oder Bildung einer Bindung mit den Nucleinsäureprobe oder Sonde zu assoziieren, vorliegen, um anschliessend aus der übrigen Mischung isoliert oder abgetrennt zu werden, z.B. durch Zentrifugation und Filtrationchromatographie oder Abgiessen. Eine Vielzahl von Zusammensetzungen und Konfigurationen für die immobilisierten reaktiven Partner sind bekannt und für den in diesem Bereich arbeitenden Fachmann zugänglich. Im allgemeinen umfassen sie die Anheftung an einen festen Träger, Polymerisation oder Anheftung an einen festen Träger, Polymerisation oder Anheftung an einen wasserdispergierbares Material, das anschliessend prezipitiert oder aggregiert werden kann.
Es ist besonders bevorzugt, einen festen Träger zu verwenden, an den der reaktive Partner angeheftet oder durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen fixiert ist, wobei die letzte Möglichkeit Adsorptionsverfahren einschließt, die eine geeignet stabile und starke Verbindung gewährleisten. Der fester Träger kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen, und aus einer Vielzahl von Zusammensetzungen bestehen, einschließlich Mikropartikel, Perlen, poröse und impermeable Streifen und Membranen, die innere Oberfläche von Reaktionsgefäßen, wie Teströhrchen und Mikrotiterplatten, und ähnliches. Vorrichtungen zur Befestigung der erwünschten Reaktionspartner an einen ausgewählten festen Träger sind dem Fachmann bekannt.
Beispielsweise sind bei der Verwendung einer proteinartigen Substanz als Reaktionspartner, wie Avidin, ein Antikörperreagens, oder ein anderes Bindungsprotein, zur Bindung an einer Bindungstelle auf der Sonde oder der Probennucleinsäure, eine große Anzahl von Verfahren in der Literatur zur Immobilisierung solcher Substanzen auf festen Trägern beschrieben (siehe Methods in Enzymology, Band 44 (1976)). Proteine werden üblicherweise entweder durch kovalente Kopplung oder durch nicht-kovalente Adsorption immobilisiert. Die häufig verwendeten nicht-kovalenten Verfahren sind die nicht spezifische Adsorption auf Polystyrolperlen oder Mikropartikeln und auf Polyvinylchloridoberflächen. Es werden viele kovalente Verfahren eingesetzt, und einige benötigen Cyanbromid aktivierte Agarose und Dextrane; Glutaraldehyd aktivierte Nylons und Polyacrylamide und Epoxide auf Acryl oder anderen Trägern. Antikörper der IgG-Klasse können auch durch Bindung an immobilisierte Formen von Protein A immobilisiert werden. Nicht-spezifische Adsorption auf Poylstyrollatexteilchen kann ebenfalls eingesetzt werden.
Es sind eine Vielzahl von Verfahren zugänglich, die erfindungsgemäß zur Bestimmung des Vorliegens der markierten Probe oder der markierten Sonde in der abgetrennten immobilisierten Fraktion oder in der zurückbleibenden Reaktionslösung zur Durchführung des Tests eingesetzt werden können. Der Durchschnittsfachmann kann aus üblichen Mitteln zum Nachweis des Auftretens der Hybridisierung zwischen der Detektionssonde und der nachzuweisenden Sequenz in der immobilisierten Fase oder auf seine verminderte Anwesenheit in der Reaktionsmischung auswählen. Im allgemeinen beruht der Nachweisschritt auf die Verwendung einer markierten Form der Probe oder Sonde, der Verwendung einer Sonde, welche ein einheitlich nachweisbares Hybrid mit der zu bestimmenden Sequenz bindet, oder über sekundäre Reaktionen, die nur erfolgen können, wenn Hybridisierung stattgefunden hat, z.B. Primer-Extensionsreaktion.
Die Markierung für die Probe oder Sonde ist ein dem Polynucleotid oder der Substanz mit der nachweisbaren physikalischen, chemischen oder elektrischen Eigenschaft innewohnendes Merkmal. Bei Einführung einer nachweisbaren Markierungssubstanz kann diese direkt, z.B. durch kovalente Bindungen an die Probe oder Sonde, oder indirekt, so z.B. durch Einbau der schließlich nachzuweisenden Substanz in Mikrokapseln oder Liposome, die ihrerseits mit der Probe oder Sonde verknüpft werden, verbunden werden. Es ist besonders bevorzugt, daß die Markierung durch ein photochemisches Verfahren eingeführt wird.
Markierende Materialien sind im Immuntestbereich entwickelt worden, und im allgemeinen können die meisten in solchen Verfahren geeignete Markierungen erfindungsgemäß eingesetzt werden. Insbesondere geeignet sind enzymatisch aktive Gruppen, z.B. Enzyme (siehe Clin. Chem., 22, 1232, (1976), US Reissue Patent Nr. 31006, und UK Patent 2019408), Enzymsubstrate (siehe US-Patent Nr. 4492751), Coenzyme (siehe US-Patente Nr. 4230797 und 4238565) und Enzyminhibitoren (siehe US Patent Nr. 4134792); fluoreszierendes Substanzen (siehe Clin. Chem., 25, 353 (1979)), Chromophore; luminiszierende Substanzen wie chemiluminiszierende und bioluminiszierende Substanzen (siehe US Patent Nr. 4380580); spezifisch bindbare Liganten, wie Biotin (siehe europäische Patentanmeldung 63879) oder ein Hapten (siehe PCT Veröffentlichung 83-2286); und radioisotope, wie ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;I und ¹&sup4;C. Solche Markierungen werden auf der Grundlage ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften, z.B. fluoreszierende Substanzen, Chromophore und Radioisotope) oder aufgrund ihrer reaktiven oder Bindungseigenschaften (Liganden, Enzyme, Substrate, Coenzyme und Inhibitoren) nachgewiesen. Z.B. kann eine Cofaktor-markierte Spezies durch Zugabe des Enzyms (oder eines Enzyms bei Verwendung eines cyclischen Systems), für das die Markierung ein Cofaktor ist und ein Substrat oder Substrate für das Enzym nachgewiesen werden. Ein mit Hapten oder Ligand (z.B. Biotin) markierte Spezies kann durch Zugabe eines Antikörpers gegen das Hapten, oder Zugabe eines Proteins (z.B. Avidin) an das, der Ligand bindet, an welches ein nachweisbares Molekül angeheftet ist, nachgewiesen werden. Nachweisbare Moleküle können solche sein mit einer meßbaren physikalischen Eigenschaft (z.B. Fluoreszenz oder Absorption), oder ein Teilnehmer in einer Enzymreaktion (siehe obige Liste) sein. Z.B. kann ein Enzym verwendet werden, das auf ein Substrat und Erzeugung eines Produktes mit einer meßbaren physikalischen Eigenschaft einwirkt. Beispiele des letzteren umfassen β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Peroxide, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Verfahren zur Herstellung einer markierten Probe oder einer markierten Sonde zur Verwendung in der Erfindung sind aus dem Stand der Technik leicht zugänglich. Bei der Markierung von Proben oder Sonden können Syntheseverfahren eingesetzt werden, die zur Modifizierung der Nucleinsäuren ohne wesentliche Beeinflussung der Fähigkeit der markierten Probe oder markierten Sonde zur Teilnahme bei der Hybridisierung wirksam sind, eingesetzt werden, und Markierungen können ausgewählt werden, die unter den Hybridisierungsbedingungen ausreichend stabil sind, um ihren nachfolgenden Nachweis zu ermöglichen. Einzelsträngige oder doppelsträngige Bereiche können wie erwünscht markiert werden.
Die folgenden Verfahren können in Form von Beispielen zur Markierung von Proben oder Sonden eingesetzt werden. Radiomarkierte Nucleotide können in den DNA-Proben oder Sonden nach Verfahren wie z.B. der Nick-Translation und der terminalen Markierung mit terminaler Deoxynucleotidyltransferase eingebaut werden. Radiomarkierte Nucleotide können in RNA-Proben oder Sonden während der in vitro Synthese mit DNA-abhängiger RNA Polymerase aus Bakteriophage SP6 unter Verwendung des "RIBOPROBE" DNA Matrizensystems von Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA eingebaut werden. Das Verfahren von Langer et al., (Proc. Nat'l. Acad. Sci., 78, 6633, (1981)) kann zur Kopplung von Biotin an das primäre Amin von 5-(3-Amino)-allyluridin und Deoxyuridintriphosphat eingesetzt werden. Diese biotinylierten Nucleotide können in doppelsträngige DNA durch Nick- Translation eingebaut, oder an den 3'-OH Terminus mit terminaler Deoxynucleotidyltransferase angehängt werden. Biotin kann auch an das 3'-OH-Ende von RNA durch Polyamin (Broker, T.R., Nucl. Acids Res., 4, 363 (1978) und Cytochrom C-Brücken (Sodja, A. und Davidson N., Nucl. Acids. Res., 5, 385, (1978)) angeheftet werden. Direkte Kopplung der Proteinmarkierungen an Proben oder Sonden kann durch das Verfahren von Renz (EMBO Journal, 2 817, (1982) erfolgen, der ¹²&sup5;I-Histone an denatuierte DNA mit Glutaraldehyd koppelte. Enzyme wie Peroxidase und alkalische Phosphatase können an DNA Proben oder Sonden mittels ähnlicher chemischer Methoden gebunden werden (Renz und Kurz, Nucl. Acids Res., 12, 3435, (1984)). Andere chemische Methoden zur Endmarkierung von DNA Proben oder Sonden umfassend solche, wie bei Eshaghpour et al., (Nucl. Acids Res., 7, 1485, (1979)) beschrieben. Ein oder mehrere 4-Thiouridinreste können an die 3'-OH-Enden der DNA und der mit verschiedenen elektrophilen Reagentien von niedrigen Molekulargewicht ungesetzten Thiolen eingeführt werden. Dieses chemische Verfahren kann zur Anheftung verschiedener Haptene an deren Proben oder Sonden eingesetzt werden. Die Markierung mit dem Hapten N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren ist bei Tchen et al., (Proc. Nat'l. Acad. Sci., 81, 3466, (1984)) beschrieben. DNA und RNA Proben oder Sonden können mit N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren unter Erhalt eines Addukts mit N-Acetylaminofluoren-Resten, die an den Kohlenstoff in 8-Position des Quanins angeheftet sind, umgesetzt werden. Die kovalente modifizierte DNA kann mit einem Antikörper gegen den N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren- Rest nachgewiesen werden. Das Verfahren von Hu und Messing, Gene, 17, 271, (1982) kann zur Anheftung von Markierungen an in einzelsträngigen M13-Vektoren geklonten Sonden eingesetzt werden. Ein universeller Primer, komplementär zur 5'-Region zur Klonierungstelle, initiiert die DNA-Synthese komplementär zum M13 Strang abwärts von der Sondensequenz. Da die DNA Polymerase radioaktives Nucleotidtriphosphat und Biotin 5-(3- Aminoallyl)-deoxyuridintriphosphat in den neuen Strang einbaut, können diese Markierungen an den Vektor entfernt von der Sondensequenz angeheftet werden. Der doppelsträngige Bereich kann auch durch Reaktion mit 8-Azidoethidium modifiziert werden.
Ein weiteres besonders bevorzugtes Nachweisverfahren umfaßt die Verwendung eines Sondensystems, worin das zwischen der zur bestimmenden Polynucleotidsequenz und der Sonde gebildetes Hybrid sich hinsichtlich seiner Antigenität von seinen Einzelsträngen unterscheidet. Auf diese Weise ist man in der Lage, das Vorliegen einer Sonde in der immobilisierten, die hybridisierte Sonde enthaltenden Fraktion durch Zugabe eines Antireagenzes, wie oben beschrieben, welches selektiv für die Bindung an solche Hybride ist, nachzuweisen. Bevorzugte Antikörperreagentien sind solche, die selektiv für die Bindung doppelsträngiger Nucleinsäuren gegenüber einzelsträngigen Nucleinsäuren sind, z.B. solche, die selektiv (i) DNA-RNA oder RNA-RNA-Hybride oder (ii) Interkalationskomplexe binden. Im ersten Fall ist ein Antikörperreagenz, das selektiv für die Bindung von DNA-RNA Hybride geeignet, wo entweder die Sonde oder die nachzuweisende Sequenz DNA ist und jeweils die andere RNA ist, und in jedem Fall ist natürlich die Sonde diesselbe RNA oder DNA wie die nachzuweisende Sequenz. Man kann ein für die Auffindung von RNA-RNA Hybriden selektives Antikörperreagenz verwenden, wo sowohl die Sonde als auch die zu bestimmende Sequenz RNA ist und die Sonde DNA ist. Bei Interkalationskomplexen ist der Test so ausgebildet, daß die zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Sequenz gebildeten Hybride einen in Form eines Interkalationskomplexes an die Nucleinsäure gebundenen Interkalator enthalten.
Immunogene zur Stimulierung gegen die RNA-DNA Hybride spezifischen Antikörper können homopolymere oder heteropolymere Polynucleotidduplexe enthalten. Von den möglichen Homopolymerduplexen ist besonders poly(rA).poly(dT) bevorzugt (Itagawa und Stoller Mol. Immuno., 19, 413 (1982)). Im allgemeinen sind jedoch Heteropolymerduplexe bevorzugt verwendet, und können nach eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Transkription von φ X174 virion DNA mit RNA Polymerase (Nakazato, Biochem., 19, 2835 (1980)). Die ausgewählten RNA-DNA Duplexe werden an methyliertes Protein adsorbiert oder in einer sonstigen Weise an ein übliches immunogenes Trägermaterial, wie Rinderserumalbumin gebunden und in den erwünschten tierischen Wirt injiziiert (sie auch Stoller, Meth. Enzymol., 70 (1980)). Antikörper gegen RNA-RNA Duplexe können gegen doppelsträngige RNAs aus Viren, wie Retroviren oder den Fiji-Krankheit-Virus, der Zuckerrohr infiziert, unter anderen erzeugt werden. Ebenfalls können Homopolymerduplexe, wie poly(rI).poly(rC) oder poly(rA).poly(rU) unter anderen zur Immunisierung wie oben verwendet werden.
Antikörper gegen Interkalationskomplexe können gegen ein Immunogen hergestellt werden, das im allgemeinen einen ionischen Komplex aus einem kationischen Protein oder Proteinderivat (z.B. methyliertes Rinderserumalbumin) und dem anionischen Interkalator-Nucleinsäurekomplex enthält. Im Idealfall ist der Interkalator kovalent an die doppelsträngige Nucleinsäure gebunden. Gegebenenfalls kann das Interkalator- Nucleinsäurekonjugat kovalent an ein Trägerprotein gekoppelt sein. Der Nucleinsäureanteil des Immunogens kann die spezifischen geparten Sequenzen, wie sie im Testhybrid gefunden werden, oder beliebige andere erwünschte Sequenzen enthalten, da die Spezifität des Antikörpers im allgemeinen nicht von der beteiligten speziellen Basensequenz abhängt.
In anderen Fällen, wo ein Antikörperreagenz, das selektiv gegen Interkalationskomplexe ist, im Nachweissystem eingesetzt wird, kann eine Vielzahl von Interkalatorverbindungen beteiligt sein. Im allgemeinen kann man sagen, daß die Interkalatorverbindung vorzugsweise ein planares, im allgemeinen aromatisches, jedoch manchmal polycyclisches Molekül von niedrigen Molekulargewicht ist, das zur Bindung mit doppelsträngigen Nucleinsäuren, z.B. DNA.DNA, DNA.RNA oder RNA.RNA-Duplexe in der Lage ist, im allgemeinen durch Insertions zwischen den Basenpaaren. Der primäre Bindungsmechanismus ist im allgemeinen nicht kovalent, wobei kovalente Bindung als zweiter Schritt auftritt, wenn der Interkalator reaktive oder aktivierbare chemische Gruppen trägt, die kovalente Bindungen mit benachbarten chemischen Gruppen auf einem oder beiden der interkalierten Duplexstränge ausbildet. Das Ergebnis der Interkalation ist eine Spreizung der benachbarten Basenpaare von einem Abstand, der zweimal so hoch wie ihr normaler ist, was zu einem Anstieg der molekularen Länge des Duplex führt. Dazu muß eine Aufwindung der Doppelhelix um ca. 12 bis 36 Grad eintreten, um den Interkalator aufzunehmen. Ein allgemeiner Überblick und weitere Information können aus Lerman, J., Mol. Biol., 3, 18 (1961); Bloomfield et al., "Physical Chemistry of Nucleic Acids", Kapitel 7, Seiten 429-476, Harper und Rowe, NY (1974); Waring, Nature, 219, 1320 (1968); Hartman et al., Angew.Chem., englische Ausgabe, 7, 693 (1968); Lippard, Accts. Chem. Res., 11, 211, (1978); Wilson, Intercalation Chemistry, (1982), 445; und Berman et al.,, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 20, 87 (1981) erhalten werden. Beispiele von Interkalatoren sind Acridinfarbstoffe, z.B. Acridinorange, die Phenanthridine, z.B. Ethidium, die Phenanzine, Furocumarine, Phenothiazine und Chinoline.
Der Interkalationskomplex kann im Testmedium während der Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die in ihrer komplementären einzelsträngigen Region modifiziert wurde und nun einen daran chemisch verbundenen Interkalator trägt gebildet werden, so daß nach Hybridisierung die Interkalationskomplexe gebildet werden. Es kann praktisch jedes übliche Verfahren zur Bindungsbildung eingesetzt werden. Im allgemeinen wird die Bindung durch Interkalation mit einem reaktiven, vorzugsweise photoreaktiven Interkalator gebildet, worauf sich die Verknüpfungsreaktion anschließt. Azidointerkalatoren sind bei einem besonders geeigneten Verfahren beteiligt. Nach Einwirkung von ultraviolettem oder sichtbarem Licht werden hochreaktive Nitrene erzeugt. Die Nitrene der Arylazide bevorzugen Insertionsreaktionen im Gegensatz zu ihren umgelagerten Produkten (siehe White et al., Methods in Enzymol. , 46, 644 (1977)). Repräsentative Azidointerkalatoren sind 3-Azidoacridin, 9-Azidoacridin, Ethidiummonoazid, Ethidiumdiazid, Ethidiumdimerazid (Mitchell et al., JACS, 104, 4265 (1982)), 4-Azido-7-chlorochinolin und 2-Azidofluoren. Andere geeignete photoreaktive Interkalatoren sind die Furocumarine, die (2+2) Cycloaddukte mit Pyrimidinresten bilden. Alkylierungsmittel können ebenfalls verwendet werden, so z.B. Bischloroethylamine und Epoxide oder Aziridine, z.B. Aflatoxine, polycyclische Kohlenwasserstoffepoxide, Mitomycin und Norphillin A. Der Interkalator-modifizierte Duplex wird anschliessend unter Bildung der modifizierten einzelsträngigen Sonde denaturiert.
Der Nachweis des Antikörperreagenzes, das an das antigenisch unterschiedliche Hybrid auf der Nachweissonde und der nachzuweisenden Sequenz bindet, kann auf jede übliche Weise erfolgen. Z.B. kann man ein Antikörperreagenz verwenden, das mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe wie oben dargestellt, markiert wurde. Die Herstellung der markierten Antikörper ist ausführlich in der Literatur beschrieben. Einbau einer ¹²&sup5;Jod-Markierung kann nach dem Verfahren von Bolton und Hunter, Biochem. J., 133, 529 (1972) erfolgen. Ishikawa et al., J. Immunoassay, 4, 209 (1982) haben mehrere verschiedene Verfahren zur Kopplung verschiedener Enzyme an Antikörper ausgearbeitet. Yoshitake et al.,, Eur. J. Biochem., 101, 395 (1979) haben ein Verfahren zur Verwendung von Maleinimiden bei der Kopplung von Glucoseoxidase an Antikörper beschrieben. Alkalische Phosphatase kann an einen Antikörper mit Glutaraldehyd gebunden werden (Voller et al., Bull. World Health Organ., 53, 55 (1976)).
Antikörper können mit Fluoreszin nach dem Verfahren von Blakeslee und Baines, J. Immunol. Meth., 13, 305 (1976) markiert werden. Chemilumineszenz-Markierungen können nach dem Verfahren von Schroeder et al., Clin. Chem., 27, 1378 (1981) eingeführt werden. Gegebenenfalls kann das Antikörperreagenz aufgrund einer innewohnenden Eigenschaft, wie z.B. seiner eigenen Antigenezität nachgewiesen werden. Ein markierter anti-(Antikörper) Antikörper bindet an das primäre Antikörperreagenz während die Markierung für den zweiten Antikörper eine wie oben beschriebene übliche Markierung ist. Ferner kann der Antikörper durch Komplementfixierung oder Verwendung eines markierten Protein A, wie auch durch andere bekannte Techniken zum Nachweis von Antikörpern nachgewiesen werden.
Die zu testende Probe kann ein beliebiges Medium sein, und wird üblicherweise eine flüssige Probe von medizinischer und veterinär medizinischer Bedeutung sein, oder für die Umwelt, Ernährung oder Industrie wichtig sein. Menschliche und tierische Proben und Körperflüssigkeiten können insbesondere nach dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden, einschließlich Urin, Blut (Serum oder Plasma), Milch, cerebrospinale Flüssigkeit, Sputum, Stuhl, Lungenauswurf, Kehlkopfabstriche, Genitalabstriche und Exudate, Rektumabstriche und nasopharyngale Körperflüssigkeiten. Enthält die Patienten oder die aus einer anderen Quelle zu testende Probe prinzipiell doppelsträngige Nucleinsäure, wie sie in Zellen enthalten ist, wird die Probe zu Denaturierung der Nucleinsäuren behandelt, und falls notwendig werden zunächst die Säuren auf den Zellen entfernt.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Markierung von Nucleinsäuren in einer Probe oder ihre chemische Modifizierung zur Einführung einer reaktiven Stelle für die anschliessende Immobilisierung, entweder als ganze Zellen, als Lysate oder gereinigte Nucleinsäuren. Ein überraschendes Merkmal der Erfindung ist die wirksame Markierung oder reaktive Bindungstellenmodifizierung ganzer Zellen. Ein Verfahren zur Markierung oder zur Modifizierung der reaktiven Stelle ist eine photochemische Reaktion unter Verwendung von DNA-Bindungsliganten als Träger für nachweisbare Markierungen. Die klinische Probe wird für die Trennung von infektiösen Zellen, z.B. durch Zentrifugation von Urin oder Blut aus den Patienten vorbereitet, und anschließend wird das photochemische Reagenz zugegeben, und die Mischung unter Erhalt einer markierten oder je nach dem, reaktiven, an einer Stelle modifizierten Probe, bestrahlt.
Die Nucleinsäure wird photochemisch markiert oder modifiziert unter Verwendung eines photoreaktiven, an die Nucleinsäure bindenden Liganden, z.B. einer Interkalator-Verbindung wie Furocumarin oder einer Phenanthridin-Verbindung, oder einer nicht-Interkalator-Verbindung wie Neotropsin, Distamycin, Hoechst 33258 und bis-Benzimidazol unter Verbindung der Nucleinsäure an die Markierung, welche ganz abgelesen, oder nach übliche Weise getestet wird, einschließlich Fluoreszenznachweis oder eine reaktive Bindungsstelle, die das Mittel zur anschließenden Immobilisierung, wie oben beschrieben, darstellen kann. Das Endprodukt ist daher eine markierte oder modifizierte Nucleinsäuresonde, die (a) Nucleinsäurenbestandteil, (b) ein Interkalator oder ein anderen Nucleinsäure bindenden Liganten enthält, der photochemisch an den Nucleinsäurebestandteil gebunden ist und (c) eine Markierung oder reaktive Stelle die chemisch an (b) gebunden ist.
Das neue photochemische Verfahren bietet geeignetere Reaktionsbedingungen, als das übliche chemische Kopplungsverfahren für biochemisch empfindliche Substanzen. Durch Verwendung einer geeigneten Wellenlänge zur Bestrahlung können DNA, RNA und Proteine ohne Beeinflussung der nativen Struktur des Polymers modifiziert werden. Der Nucleinsäurebindungsligand, im folgenden durch ein Interkalator beispielhaft vertreten, und die Markierung oder reaktive Stelle können zuerst gekoppelt werden und anschließend mit der Nucleinsäure photochemisch umgesetzt werden, oder die Nucleinsäure kann zuerst photochemisch mit dem Interkalator umgesetzt werden und anschließend an die Markierung oder reaktive Stelle gekoppelt werden. Ein allgemeines Schema zur Kopplung einer Nucleinsäure, dargestellt durch doppelstränginge DNA, an eine Markierung oder reaktive Stelle, beispielhaft dargestellt durch ein Hapten, ist wie folgt:
Hapten + photoreaktiver Interkalator Hapten-modifizierter photoreaktiver Interkalator doppelsträngige DNA photoreaktiver Interkalator chemisch funktionalisierte DNA + Hapten Hapten-modifizierte DNA
Wo der hybridisierbare Anteil der Nucleinsäure in einer doppelsträngigen Form vorliegt, wird dieser Anteil anschließend unter Bildung eines hybridisierbaren einzelsträngigen Anteils denaturiert. Gegebenenfalls kann eine solche Denaturierung, falls erwünscht, vermieden werden, wenn die markierte oder modifizierte Nucleinsäure (z.B. RNA oder DNA), den hybridisierbaren Bereich bereits in einzelsträngiger Form enthält.
Zur Herstellung spezifischer und wirksamer photochemischer Produkte ist es erwünscht, daß man den Nucleinsäurebestandteil und die photoreaktive Interkalator-Verbindung im dunklen in einer speziellen Weise reagieren läßt.
Zur Kopplung an Nucleinsäure sind insbesondere Aminomethylpsoralen, Aminomethylangelicin und Aminoalkylethidium oder Methidiumazide geeignete Verbindungen. Diese binden an doppelsträngige Nucleinsäure, und nur der Komplex produziert ein Photoaddukt. Wo die markierte oder reaktive, bindungsstellenmodifizierte doppelsträngige Nucleinsäure zur Bildung einer hybridisierbaren einzelsträngigen Region denaturisiert werde muß, werden die Bedingungen so gewählt, daß gleichzeitig die Wechselwirkung der beiden Nucleinsäurestränge mit einem einzelnen Photoaddukt vermieden wird. Es ist notwendig, daß die Häufigkeit der Modifizierung entlang eines hybridisierbaren einzelsträngigen Bereiches der Sonde oder Probe nicht zu groß ist, um im wesentlichen Hybridisierung zu vermeiden, und demzufolge ist es bevorzugt, nicht mehr als eine Modifizierungsstelle pro 25, im allgemeinen pro 50 und vorzugsweise pro 100 Nucleotidbasen zu haben. Angelicinderivate sind den Psoralen- Verbindungen für Monoaddukt-Bildung vorzusehen. Falls eine einzelsträngige Nucleinsäure kovalent an etwas zusätzliche doppelsträngige Nucleinsäure gebunden wird, ist die Verwendung von Phenanthridium und Psoralen-Verbindungen bevorzugt, da diese Verbindungen spezifisch mit doppelsträngiger Nucleinsäure im dunklen reagiert. Die chemischen Verfahren für die Synthese der gekoppelten Reagentien zur Modifizierung von Nucleinsäuren für die Markierung oder Einführung einer reaktiven Stelle, wie im folgenden in Einzelheiten beschrieben, ist für alle Fälle ähnlich.
Der Nucleinsäurebestandteil kann einzel oder doppelsträngige DNA oder RNA, oder Fragmente davon sein, wie z.B. solche, die durch Restriktionsenzyme gebildet werden, oder sogar relativ kurze Oligomere.
Die Nucleinsäure bindenden Liganden zur Verwendung bei der Verknüpfung von Nucleinsäure Bestandteilen an die Markierung oder reaktive Stelle, können in jeder geeigneten photoreaktiven Form bekannter Nucleinsäure-Bindungsliganden vorliegen. Insbesondere bevorzugte Nucleinsäure- Bindungsliganden sind Interkalator-Verbindungen, wie die Furocumarine, z.B. Angelicin (Isopsoralen) oder Psoralen oder Derivate davon, die photochemisch mit den Nucleinsäure reagieren, z.B. 4'-Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin, 4'- Aminomethyltrioxsalen (4'-Aminomethyl-4,5', 8-Trimethyl- psoralen), 3-Carboxy-5- oder -8-amino oder -hydroxy-psoralen, wie auch mono- oder bis-azido-aminoalkyl-methidium oder ethidium-Verbindungen. Photoreaktive Formen einer Vielzahl anderer interkalierten Agentien können ebenfalls wie beispielhaft in der folgenden Tabelle dargestellt, eingesetzt werden:

Interkalator Klassen und Vertreter

Literaturreferenz

A. Acridinfarbstoffe Proflavin, Acridin orange, Quinacrin, Acriflavine
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Ethidium
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Wilson et al., J. Med. Chem. 19:1261(1976)
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C. Phenazine
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5-Methylphenazin Kation
D. Phenothiazine
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Chlopromazine
E. Chinoline
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Chlorochine
Chinin
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3,4-Benzpyren Benzopyrendiol
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Benzanthrancin-5,6-oxid
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H. Actinomycine
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Actinomycin D
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N. Polyinterkalatoren
Echinomycin
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Chinomycin
Triostin
BBM928A
Tandem
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Diacridine
LePecq et al., PNAS (USA) 72:2915(1975): Carrellakis et al., Biochim. Biophys. Acta 418:277(1976); Wakelin et al., Biochem 17:5057(1978); Wakelin et al., FEBS Lett. 104:261 (1979); Wright et al., Biochem. 19:5825 (1980); Bernier et al., Biochem. J. 199:479 (1981); King et al., Biochem. 21:4982 (1982)
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Heterodimere
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Trimere
Hansen et al., JCS Chem. Comm. 162(1983); Atnell et al., JACS 105:2913(1983)
O. Norphillin A
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P. Fluorene und Fluorenone
Fluorenondiamine
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Q. Furocumarine
Angelicin
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4,5'-Dimethylangelicin
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Psoralen
Marciani et al., Z. Naturforsch. B. 27(2) 196(1972)
8-Methoxypsoralen
Belognzov et al., Mutat Res. 84:11 (1981) Scott et al., Photochem. Photobiol. 34:63 (1981)
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Juarranz et al., Acta Histochem. 70:130 (1982)
Besonders geeignete photoreaktive Formen solcher interkalierenden Mittel sind die Azidointerkalatoren. Ihre reaktiven Nitrine werden leicht im langwelligen ultraviolett oder sichtbaren Licht erzeugt, und die Nitrine von Arylaziden bevorzugen die Insertionreaktionen im Gegensatz zu ihren umgelagerten Produkten (siehe White et al., Methods in Enzymol.,46. 644 (1977)). Representative Azidointerkalatoren sind 3-Azidoacridin, 9-Azidoacridin Ethidiummonoazid, Ethidiumdiazid, Ethidiumdimerazid (Mitchell et al., JACS, 104, 4265, (1982)), 4-Azido-7-chlorchinolin und 2-Azidofluoren. Andere geeignete photoreaktierbare Interkalatoren sind die Furocumarine, welche (2+2) Cycloaddukte mit Pyrimidinresten bilden. Alkylierende Mittel können ebenfalls verwendet werden, so z.B. Bis-chlorethylamine und Epoxide oder Aziridine, z.B. Aflatoxine, polycyclishe Hydrocarbonepoxide, Mitomycin und Norphillin A.
Die Markierung oder reaktive Gruppe wird an die Interkalator- Verbindung durch direkte chemische Bindung, an der kovalente Bindungen beteiligt sind, gebunden, oder durch indirekte Bindung z. B. durch Einbau der Markierung oder reaktive Gruppe in einer Mikrokapsel oder einen Liposom, welches ihrerseits an die Interkalator-Verbindung gebunden wird. Verfahren bei dem die Markierung oder reaktive Gruppe an die Interkalator- Verbindung gebunden werden, sind im Stand der Technik im wesentlichen bekannt, und jedes übliche Verfahren kann erfindungsgemäß verwendet werden.
Vorteilhafterweise wird die Interkalator-Verbindung zunächst mit der Markierung oder der reaktiven Gruppe chemisch verbunden und anschliessend mit dem Nucleinsäurebestandteil verbunden. Da Biotin eine Carboxylgruppe trägt, kann es z.B. mit Furocumarin mittels einer Amid- oder Esterbindung ohne Beeinträchtigung der photochemischen Reaktivität der Furocumarins oder der biologischen Aktivität des Biotins verbunden werden, z.B. Biotin-N-hydroxysuccinimid oder Biotin-p-nitrophenylester
oder Biotin + ROH Carbodiimid Biotin CO OR Biotin-p-nitrophenylester
Andere Aminomethylangelicin-, Psoralen- und Phenanthridium- Derivate können in ähnlicher Weise umgesetzt werden, z.B. Phenanthridiumhalogenide und Derivate davon, wie Aminopropylmethidiumchlorid, d.h.
(siehe Hertzberg et al., J. Amer. Chem. Soc., 104, 313, (1982).
Alternativ kann ein bifunktionelles Reagenz, wie z.B. Dithiobissuccinimidylpropionat oder 1,4- Butandioldiglycidylether direkt zur Kopplung des photochemischen reaktiven Moleküls mit der Markierung verwendet werden, wenn die Reaktanten Alkylaminoreste besitzten, wiederum nach einem bekannten Verfahren im Hinblick auf die Lösungsmittelanteile und Reaktionsbedingungen. Bestimmte bifunktionelle Reagentien, möglicherweise Glutaraldehyd können nicht geeignet sein, weil während ihrer Kopplung sie die Nucleinsäure modifizieren können und daher den Test stören. Routinemäßige Vorsorgemaßnamhen können ergriffen werden, um solche Schwierigkeiten zu vermeiden.
Die bestimmte Sequenz zur Herstellung der markierten oder mit reaktiven Stellen modifizierten Nucleinsäure kann variieren.
Daher kam z.B. ein Amino-substituiertes Psoralen zunächst photochemisch mit einer Nucleinsäure gekoppelt werden, wobei das Produkt entsprechende Aminogruppen trägt, an denen an die Markierung oder reaktive Stelle gekoppelt werden kann. Wahlweise kann das Psoralen zunächst an eine Markierung oder eine reaktiven Stelle und anschliessend an die Nucleinsäure gekoppelt werden.
Die Kettenlänge des Spacers zwischen dem die Nucleinsäure bindenden Liganden und der Markierung oder reaktiven Stelle kann über einen Kohlenwasserstoff oder einen Peptid verlängert werden. Ein typisches Beispiel umfaßt die Verlängerung eines 8-Hydroxypsoralen-Derivats mit einem Alkylhalogenid nach dem Verfahren, beschrieben vom J.L. DeCout und J. Lhomme, Photochemistry Photobiology, 37, 155-161, (1983). Das halogenalkylierte Derivat wird anschliessend entweder mit einem Thiol oder Aminen unter Herstellung eines reaktiven Restes umgesetzt, wie z.B. beschrieben von W.A. Saffran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 4594 (1982).
Falls die Markierung z.B. ein Enzym ist, wird das Produkt zum Schluß in ein geeignetes Medium gegeben und das Ausmaß der Katalyse bestimmt. Falls daher das Enzym eine Phosphatase ist, könnte das Medium Nitrophenylphosphate enthalten, und man würde die Menge des Nitrophenol durch Messung der Farbe bestimmen. Fals das Enzym eine beta-Galactosidase ist, kann das Medium o-Nitrophenyl-D-galacto-pyranosid enthalten, welches ebenfalls Nitrophenol freisetzt.
Denaturierung von Nucleinsäuren erfolgt vorzugsweise durch Erhitzen in kochendem Wasser oder Alkalibehandlung (z.B. 0.1 M(N) Natriumhydroxid), welches, falls erwünscht, gleichzeitig für die Lyse der Zellen zugegeben werden kann. Ebenfalls kann die Freisetzung von Nucleinsäuren, z.B. durch mechanische Einwirkung (Gefrieren/Trocknen, Reibung, Ultraschallbehandlung), physikalische oder chemische Behandlung, Detergentien wie "TRITON ", "TWEEN ", Natriumdodecylsulfat, Alkalibehandlung, osmotischen Schock oder Hitze, oder enzymatische Lyse (Lysozym, Proteinase K, Pepsin) erfolgen. Das erhaltene Testmedium enthält Nucleinsäuren in einzelsträngiger Form, die anschließend nach dem erfindungsgemäßen Hybridisierungsverfahren getestet werden können. Zusätzlich können die Nucleinsäuren spezifisch oder nicht-spezifisch fragmentiert werden, um einen ganz bestimmten Test durchzuführen, wie z.B. zum Nachweis von Punktmutationen durch spezifische Endonucleasebehandlung und anschließende duale Hybridisierung und Restriktion (siehe z.B. EP Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0130515).
Verschiedene Hybridisierbedingungen können, wie im Stand der Technik bekannt, im Test verwendet werden. Typischerweise wird die Hybridisierung bei leicht erhöhter Temperatur, z.B. zwischen ca. 35 und 75ºC und im allgemeinen bei ca. 65ºC in einer Lösung mit einem Puffer bei pH zwischen ca. 6 und 8 und mit einer geeigneten Ionenstärke (z.B. 5XSSC, wobei 1XSSC = 0.15 M Natriumchlorid und 0.015 M Natriumcitrat, pH = 7 ist) und wahlweise mit Protein, wie Rinderserumalbumin oder denaturierter fremder DNA aus dem Kalbsthymus oder Lachsspermien durchgeführt. Wo niedrigere Hybridisierungstemperaturen erwünscht sind, können Wasserstoff bindende Reagentien, wie z.B. Dimethylsulfoxid und Formamid zugesetzt werden. Das Ausmaß der Komplementarität zwischen den Proben und den Sondensträngen, die für die Hybridisierung erforderlich ist, hängt von der Stringenz der Bedingungen ab. Faktoren, die die Stringenz bestimmen, sind in dem Stand der Technik bekannt.
Normalerweise sind die Temperaturbedingungen, die für die Hybridisierung ausgewählt werden, nicht mit der Bindung eines Antikörperreagenz gegen die gebildeten Hybride und für den Nachweis der Markierung kompatibel. Demzufolge wird der Schritt der Bindung des Antikörperreagenzes und der Nachweis der Markierung nach Abschluß des Hybridisierungsschrittes erfolgen. Die Reaktionsmischung wird im allgemeinen auf eine Temperatur im Bereich von ca. 3ºC bis ca. 40ºC gebracht und anschließend erfolgen die Bindungs- und Nachweisschritte. Die Verdünnung der Hybridisierungsmischung vor Zugabe des Antireagenzes ist erwünscht, wenn die Salz- und/oder Formamidkonzentrationen hoch genug sind, um ausreichend mit dem Antikörperreagenz reagieren können. Bei Tests, welche die Verwendung von Partnern zur Markierungsbindung oder ein markiertes Antikörperreagenz zum Nachweis der Hybridisierung der Sonde erfordern, wird die Abfolge der Verfahrensschritte im allgemein wie folgt verlaufen. Die Hybridisierungsreaktionen werden zuerst mit der Probe, die im allgemeinen wie o.b. vorbehandelt wurde, durchgeführt.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein Reagenzsystem, d.h. eine Reagenzkombination oder Mittel, d.h. alle wesentlichen Elemente, die für die Durchführung des erwünschten Testverfahrens erforderlich sind, zur Verfügung. Das Reagenzsystem wird in einer handelsüblich abgepackten Form, als eine Zusammensetzung oder Mischung angeboten, wo es die Verträglichkeit der Reagentien erlaubt, in einer Testvorrichtungskonfiguration oder allgemeiner als Testkits, d.h. in einer abgepackten Kombination von einer oder mehreren Behältervorrichtungen oder ähnliches zur Lagerung der notwendigen Mittel, und im allgemeinen mit gedruckten Gebrauchsanweisungen zur Durchführung des Tests. Ein erfindungsgemäßes Reagenzsystem umfaßt alle Konfigurationen und Zusammensetzungen zur Durchführung der verschiedenen Hybridisierungsformate, wie hier beschrieben.
Ein Testkitformat des Systems kann zusätzlich Hilfschemikalien, wie Bestandteile der Hybridisierungslösung und Denaturierungsreagentien, die zur Umwandlung der doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Probe in die einzelsträngige Form in der Lage sind, enthalten. Das Kit kann auch einen Behälter oder mehrere Behälter zur Aufbewahrung der obigen Bestandteile enthalten.
Obwohl einige der zuvor beschriebenen Verfahren geeignete Ergebnisse liefern, verwenden diese Verfahren entweder ein Dreikomponentensystem oder ein kinetisch langsamen Mechanismus. Die Erfindung ist eine Verbesserung des Homogenverfahrens. Die erfindungsgemäße Hybridisierung wird mit einem Zweikomponentensystem in Lösung durchgeführt, und anschließend wird das Hybrid aus der Reaktion mit einem festen Substrat abgetrennt. Die Abtrennung erfolgt durch ein reaktive Stelle/reaktive Partner-Bindesystem. Vorzugsweise können solche reaktive Stellen in der Sonde oder der Probe eine Bindungsstelle sein, z.B. Biotin oder eine Hapteneinheit, die zur spezifischen, nicht-kovalenten Bindung an ein Bindungssubstrat, wie Avidin oder ein Antikörper, der als Reaktionspartner dient, in der Lage ist. Der Reaktionspartner wird in immobilisierter Form, z.B. an einem festen Träger angeheftet, angeboten. Demzufolge wird nach Hybridisierung die Lösung mit dem immobilisierten Reaktionspartner in Kontakt gebracht, was die Bildung einer stabilen Bindung zwischen der reaktiven Stelle und der Nucleinsäure erlaubt, der immobilisierte Reaktionspartner wird aus der Lösung abgetrennt, und entweder die erhaltene abgetrennte immobiliserte Fraktion oder die restliche Lösung, oder beides wird auf Vorliegen der Nachweismarkierung getestet.
Eine besonders geeignete Kombination von reaktiver Stelle und immobiliserten RReaktionspartner umfaßt das Avidin oder Streptavidin-Biotinkomplement. Daher wird ein Mitglied dieses Paares an die Sonden-DNA oder die Probe angeheftet, und das andere an einen festen Träger, wobei beides in bekannter Weise erfolgt, wie z.B. der europäischen Patentanmeldung Nr. 0130523, die jetzt anhängig ist, beschrieben ist. Nichtbeschränkende Beispiele zur Verwendung eines festen Trägers umfassen "SEPHADEX" Gel, Agarose, Nylon, Polystyrolperlen, Zelluloseperlen, Cellulosepapier, Nitrocellulosepapier und - plastic.
Vorzugsweise besteht die Nachweismarkierung aus einer nachweisbare chemische Gruppe, die radioaktiv, fluoreszierend, enzymatisch usw. sein kann, und jede beiliebige Markierung aus der europäischen Patentanmeldung Nr. 0130523 ist geeignet.
Die Nucleinsäuren (Probe oder Sonde) werden als verdünnte wässerige Lösungen eingesetzt, die miteinander verenigt werden können. Durch Verwendung geeigneter Bedingungen bezüglich der Ionenstärke, des pH's und der Temperatur wird die Hybridisierung sehr rasch eintreten, sofern geeignete Komponenten vorhanden sind. Anschließend wird der immobilisierte reaktive Partner eingeführt, und nach eine gewissen Zeit, um die Wechselwirkung der Reaktionspartner und der reaktiven Stelle zu erlauben, wird die immobile Phase oder Fraktion entfernt, gewaschen und der Test nach bekannter Weise durchgeführt, wie beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0130515.
Die Erfindung wird nun im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben, worin gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind.
In der Zeichnung wird die Nucleinsäure 11 mit einer Markierung oder reaktiven Stelle 12 unter Bildung einer markierten oder mit einer reaktiven Stelle modifizierten Nucleinsäure (P) 13 umgesetzt. Wenn die Markierung für den Nachweis 12 ist, und wenn die reaktive Stelle zur Trennung dient, wird die Probenaminosäure 21 mit der entsprechenden reaktiven Stelle oder Markierung 22 unter Bildung einer mit einer reaktiven Stelle modifizierten oder markierten Nucleinsäure (T) 23 umgesetzt.
Die Produkte (P) 13 und (T) 23 werden in wässeriger Lösung hybridisiert. Anschließend wird das erhaltene Produkt (PT) 31 aus der Reaktion mit einem festen Substrat 32, welches in starker Wechselwirkung mit Markierung oder reaktiver Stelle 12 oder 22, je nach dem, steht, abgetrennt. Nach Waschvorgang 33 zur Entfernung nicht-reagierter Nucleinsäuren wird das Maß der Markierung auf dem festen Träger der die Einheit 33 enthält nachgewiesen, oder die Markierung der übrigen Lösung bestimmt. Der Nachweis kann ebenfalls in den Waschlösungen erfolgen. Der Markierungstyp 12 und 22 kann ausgetauscht werden, d.h. 11 kann mit 22 markiert werden, und 21 kann mit 12 markiert werden ohne das Verfahren negativ zu beeinflussen.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben:

Beispiel 1:

Eine bekannte Probe von pBR 322 DNA (handelsüblich erhältlich von International Biotechnologic, Inc., New Haven, Connecticut, USA) wird mit pst I Restriktionsenzym unter Linearisierung verdaut. Die linearisierte Nucleinsäureprobe wird gegen 10 mM Natriumboratpuffer (pH = 8) dialysiert. Die Konzentration der Lösung wird auf 1 µg/µl eingestellt. Zur DNA-Lösung wird 4'-Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin in einem Molverhältnis von 1:5 (Ligant zu Basenpaar) zugegeben. Die Lösung wird bei 346 nm 30 Minuten bestrahlt. Die umgesetzte Nucleinsäure-Lösung (A) wird gegen den selben Puffer unter Entfernung des nicht-regierten Liganten dialysiert. Die Lösung wird anschliessend in zwei Hälften geteilt. Eine Hälfte wird mit N-Hydroxysuccinimido-Biotin unter Zusatz eines 10-fach molaren Überschusses des reaktiven Biotinderivats umgesetzt. Das biotinylierte pBR 322 (B) wird durch Dialyse gegen den selben Puffer gereinigt.
Die Proben (A) und (B) werden durch 5-minütiges Erhitzen in einem kochenden Wasserbad und anschließender Eiskühlung denaturiert.
Fünf Aliquots von Probe (A) (denaturiert wie oben) im Bereich von 1 µg bis 0.1 ng werden separat in eisgekühlte Teströhrchen gegeben. Die Volumina der Lösungen werden durch Zusatz von Boratpuffer auf 1 ml eingestellt. Zu jedem Teströhrchen wird 1 µg Äquivalent (B) (10 µl in Wasser) zugegeben und 5 Minuten bei 65ºC inkubiert, anschließend werden sie in Eis gekühlt. Zu diesen eisgekühlten Lösungen werden 2 ml NHS-aktivierter Agarose ("AFFIGEL-10", Biorad, Californa, USA) zugegeben. Das ungefähre Volumen des Gels ist 200 µl. Die Inkubation erfolgt für 30 Minuten bei 0ºC.
Das aktivierte Gel wird kovalent an (A) und das (A) (B) Hybrid binden. Nur die Hybrid-gebundenen Perlen zeigen das Vorliegen von Biotin an.
Die Perlen werden bei Raumtemperatur mit Boratpuffer (2 mal) gewaschen anschließend wird zusammen mit Boratpuffer, enthaltend BSA (1 mg/ml), FITC markiertes Avidin zugegeben und mit dem selben Puffer gewaschen. Die fluoreszierenden Perlen werden visuell unter einen Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen. Der Biotinnachweis erfolgt auch durch Zusatz eines Streptavidin-alkalische Phosphate-Systems, erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA.

Beispiel 2:

Ein prenataler Test auf alpha-Thalassaemia

Beispiel 2A

Der Hintergrund der Krankheit und die Herstellung der Sonde wurden von E.M. Rubin und Y.W. Kan, The Lancet, Jan. 12, 1985, Seite 75 beschrieben. Anstelle der Immobilisierung der Proben DNA auf Nitrocellulosepapier (wie beschrieben von Rubin et al., supra) wird die Nucleinsäureprobe photochemisch mit Biotin wie in (B) aus Beispiel 1 markiert. Die Sonde wird photochemisch mit 4'-Aminoethyl, 4,5'-Dimethylangelicin wie (A) in Beispiel 1 markiert. Die Hybridisierung und das Nachweisverfahren sind identisch mit dem wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 2B

Beispiel 2B wurde auf die selbe Weise wie in Beispiel 2A ausgeführt, mit den folgenden Unterschieden: Die DNA-Probe wird mit Aminoangelicin, wie im Beispiel 1 beschrieben, markiert, und die Sonde wird mit Biotin, wie im Beispiel 1 beschrieben, markiert.

Beispiel 3

Test auf Mikroorganismen in einer Probe

Schritt 1: Synthese der photomarkierten Reagentien:

Verbindungen 1 bis 6 wurden zur Markierung von Nucleinsäureproben verwendet, die Formeln sind wie folgt:
Bei Verwendung der Verbindungen 2 und 3 wurde eine zweite Reaktion mit N-Hydroxysuccinimidobiotin durchgeführt, um Biotin and die Nucleinsäuren zu binden. Verbindung 1 ist handelsüblich erhältlich von BRESA, Australien. Verbindungen 2 und 3 sind in der US Patentschrift 4542102 beschrieben. Verbindung 4 (4'-Biotinylamido-4,5',8-trimethylpsoralen) wurde wie folgt hergestellt: Eine Lösung mit 166 mg 4'-Aminomethyl- 4,5,8-trimethylpsoralen (0.65 mMol) und 110 µl Triethylamin (80 mg, 1.1 mMol) wurde bei 40ºC mit 275 mg N- Succinimidylbiotin (0.8 mMol) umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde 3 Stunden bei 40ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf SiO&sub2; eingedampft, auf 60 g SiO&sub2; (230-400 mesh) Flash-chromatographiert und anschließend mit einem Lösungsmittelgemisch von 9:1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH eluiert. Das Produkt wurde aus Ethanol unter Erhalt von 101 mg eines weißen Festkörpers nach Trocknung bei 55ºC 0.1 mm (32 % Ausbeute) umkristallisiert. Analyse berechnet für CH&sub2;&sub5;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub5;S.1/2H&sub2;O: C, 60.96, H; 6.14; N, 8.53.
Gefunden: C, 60.52; H, 6.01; N, 8.24.
Herstellung der Verbindungen 5 und 6 erforderte 1-Amino-17-N- (biotinylamido)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan. Dieses wurde in vier Schritten, wie folgt, erreicht:
(1) 3,6,9,12,15 Pentaoxaheptadecan (x)-1,17-Diol-ditosylat wurde synthetisiert.
(2) 1,17-Diphthalimidoderivat von (x) wurde hergestellt.
(3) 1,17-Diaminoderivat von (x) wurde hergestellt.
(4) 1 Amino, 17-Biotinylamidoderivat von (x) wurde hergestellt.

Herstellung von 3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecan- 17,diolditosylat:

Zu einer gerührten Lösung mit 50 g Hexaethylenglycol (0.177 Mol) und 64 ml Triethylamin (39.36 g, 0.389 Mol) in 400 ml CH&sub2;Cl&sub2; bei 0ºC wurde eine Lösung von 73.91 g p- Toluolsulfonylchlorid (0.389 Mol) in 400 ml CH&sub2;Cl&sub2; über einen Zeitraum von 2.5 Stunden zugetropft. Die Reaktionslösung wurde anschließend eine Stunde bei 0ºC gerührt, und man ließt dannauf Raumtemperatur für 44 Stunden erwärmen. Anschließend wurde die Mischung filtriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Der erhaltene heterogene Rückstand wurde in 500 ml Ethylacetat suspendiert und filtriert. Anschließend wurde das Filtrat im Vakuum unter Erhalt eines gelbes Öls, konzentriert, welches 8 mal mit 250 ml Anteilen von warmen Hexan zur Entfernung nicht-ungesetztem p- Toluolsulfonylchlorid trituriert wurde. Das erhaltene Öl wurde anschließend und im Hochvakuum unter Ehalt von 108.12 g eines gelben Öls (quantitative Ausbeute) konzentriert.
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub8;O&sub1;&sub1;S&sub2;
Berechnet: C, 52.87; H, 6.48
Gefunden: C, 52.56; H, 6.39.

Herstellung von 1,17-Diphthalimido-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan

Eine gerührte Suspension von 108 g 3,6,9,12,15- Pentaoxaheptadecan-1,17-diol-ditosylat (0.183 Mol), 74.57 g Kaliumphthalimid (0.403 Mol), und 700 ml Dimethylacetamid wurden auf 160-170ºC 2 Stunden erhitzt, man ließ anschließend auf Raumtemperatur abkühlen. Das Prezipitat wurde filtriert und mit Wasser und Aceton unter Erhalt von 53.05 g Produkt als weißes Pulver gewaschen, welches bei 55ºC (0.1 mm) getrocknet wurde. Schmelzpunkt 124-126ºC.
Ein zweiter Produktansatz wurde aus dem Dimethylacetamidfiltrat durch Verdampfung im Vakuum und Waschen des Prezipitats der Reihe nach mit Ethylacetat, Wasser und Aceton erhalten. Das erhaltene weiße Pulver wurde bei 55ºC (0.1 mm) unter Erhalt von zusätzlichen 9.7 g pro Produkt getrocknet. Schmelzpunkt: 124.5-126.5º. Die vereinigte Produktausbeute betrug 62.82 g (68 % Ausbeute).
Analyse: (erster Ansatz)
Berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub9;.1/2H&sub2;O
Berechnet für: C, 61.19; H, 6.05; N, 5.09
Gefunden: C, 61.08; H, 6.15; N, 5.05
(zweiter Ansatz):
Berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub9;
Berechnet: C, 62.61; H, 5.97; N, 5.18.
Gefunden: C, 61.78; H, 6.15; N, 5.13.

Herstellung von 1,7-Diamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan

Eine Lösung vo 60 g 1,17-Diphthalimido-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan (0.118 Mol), 14.8 g Hydrazinhydrat (0.296 Mol) und 500 ml Ethanl wurden unter mechanischen Rühren in einem Ölbad mit 100ºC 3 Stunden erhitzt. Man ließ die Mischung anschließend abkühlen und die Mischung wurde filtriert. Der Filterkuchen wurde vier mal mit 300 ml Anteilen von Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter Erhalt von 32.35 g eines gelben opaquen glassartigen Öls konzentriert. Verdampfende Destillation bei 150-200ºC (0.01 mm) ergab 22.82 g eines schwach gelben Öls (69 % Ausbeute).
Analyse: Für C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub5;.1/2H&sub2;O
Berechnet: C, 49.80; H, 10.10; N, 9.68.
Gefunden: C, 50.36; H, 9.58; N, 9.38.
(W. Kern, S. Iwabachi, H. Sato, und V. Bohmer, Makrol. Chem., 180, 2539 (1979)).

Herstellung von 1-Amino-17-N-(biotinylamido)-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan

Eine Lösung mit 7.2 g 1,17-Diamino-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan (25 mMol) in 75 ml DMF unter Argon wurde mit 3.41 g N-Succinimidylbiotin (10 mMol), zugegeben in Portionen über einen Zeitraum von 1.0 Stunde, umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. TLC (SiO&sub2;, 70:10.1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH-conc. NH&sub4;OH), sichtbar gemacht durch Dimethylaminocinnamaldehyd Sprayreagenz, zeigte eine hervorragende Umwandlung in ein neues Produkt (Rf = 0.18). Die Reaktionsmischung wurde in zwei Hälften geteilt und jede Hälfte wurde auf SiO&sub2; absorbiert und auf 500 g SiO&sub2;-60 (230 = 400 Mesh) unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung von 70:10.1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH-conc. NH&sub4;OH Flash-chromatographiert. Produkt-enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert unter Erhalt von 2.42 g eines gelatinösen wachsartigen Festkörpers. Das Produkt wurde aus Festkörper aus Isopropanolether prezipitiert, mit Hexan gewaschen, und bei 55ºC (0.1 mm) unter Erhalt von 1.761 g eines weißen Pulvers (35 % Ausbeute) getrocknet.
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub2;N&sub4;O&sub7;S.3/2H&sub2;O:
Berechnet: C, 49.51; H, 8.50; N, 10.49.
Gefunden: C, 49.59; H, 8.13; N, 10.39.
Massenspektrum (FAB) m/e: 507.3 (M + 1, 56 %).

Herstellung von 4'-(Biotinyl-PEG)-trioxsalen (Verbindung 5)

Eine Lösung von 380 ml 1-Amino-17-N-(Biotinylamido)- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan (0.75 mMol) in 3 ml DMF unter Argon wurde mit 146 mg N,N-Carbonyldiimidazol (0.9 mMol) umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde 2.5 Stunden gerührt. TLC (SiO&sub2; 4:1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH, Sichtbarmachung mit Dimethylaminocinnamaldehyd Sprayreagenz) zeigte eine komplette Umwandlung von Biotinylamin (Rf = 0.1) zu Imidazoharnstoff (Rf = 0.5). Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit 193 mg 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen (0.75 mMol) und 2.7 µl Triethylamin (1.57 mMol) umgesetzt. Die erhaltene Mischung wurde anschließend auf 60ºC über Nacht erhitzt. TLC (SiO&sub2;, 4:1 CHCl&sub3;-CH&sub3;OH) zeigte die Umwandlung von Imidazolid in ein neues Produkt (Rf = 0.52), welches sowohl UV Fluoreszenz zeigte und positiv mit dem Dimethylamino-cinnamaldehyd Sprayreagenz reagierte. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum unter Erhalt eines gelatinösen Öls entfernt, welches in CH&sub3;OH gelöst wurde und auf SiO&sub2; adsorbiert wurde. Der imprägnierte Festkörper wurde anschließend auf 60 g SiO&sub2;-60 (230 - 400 mesh) unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung von 9:1 CHCl&sub3;- CH&sub3;OH Flash-chromatographiert. Fraktionen mit dem teilweise gereinigten Produkt wurden gesammelt und anschließend unter Verwendung von 60 g SiO&sub2; rechromatographiert und mit dem selben Lösungsmittelsystem eluiert.
Schmelzpunkt: langsame Zersetzung bei 129.5ºC bis 149.5ºC.
Analyse: berechnet für C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub5;N&sub5;O&sub1;&sub1;S.H&sub2;O:
berechnet: C,56.49, H, 7.11; N, 8.67
gefunden: C, 56,58; H, 7.16; N, 8.53.
Massenspektrum (FAB) m/e: 790 (M + 1, 30 %).

Herstellung von 4'-Biotinyl-PEG)-4,5'-dimethylangelicin (Verbindung6)

Eine Lösung von 203 mg 1-Amino-17-N-(biotinylamido)- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecan (0.4 mMol) in 1 ml DMF unter Argon wurde mit 78 mg N,N-Carbonyldimidazol (0.48 mMol) umgesetzt. Die erhaltene Mischung wurde 4 Stunden gerührt und anschließend mit 55 mg 4'-Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicinhydrochlorid (F. Dall'Acqua, D. Vedaldi, S. Caffieri, A. Guiotto, P- Rodighiero, F. Baccichetti, F. Carlassare und F. Bordin, J. Med. Chem., 24, 178 (1981)) (0.2 mMol), 140 µl Diisopropylethylamino und 100 µl DMF umgesetzt. Die erhaltene Mischung wurde über Nacht bei 50ºC gerührt. Die Mischung wurde anschließend auf SiO&sub2; Vakuum verdampft und der impregnierte Festkörper auf 60 g SiO&sub2; (230-400 mesh) Flash chromatographiert und anschließend mit 1.5 l 7 %-igem CH&sub3;OH(CHl&sub3;) und anschließend mit 1 l 10 %-igem CH&sub3;OH(CHl&sub3;) eluiert. Produkt enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt von 72 mg eines glassartigen Festkörpers (47 % Ausbeute) konzentriert.

Schritt 2: Behandlung einer Probe zur cellulären DNA Markierung

Es werden z.B. Urinproben (obwohl die folgenden Maßnahmen gleichermaßen auf Suspensionen von Gonorrhoea verdächtigen Abstrichen, Meningitis verdächtiger cerebrospinaler Flüssigkeit, kontaminierten Wasserproben usw. anwendbar ist) zentrifugiert oder filtriert, um Bakterien in der Probe zu waschen oder zu konzentrieren. Die Bakterien werden anschließend durch Behandlung mit entweder
(i) 2 mg/ml Lysozym oder Lysostaphin und anschließender Einwirkung von ca. 90º C Hitze,
(ii) 0.2 N NaOH oder
(iii) 1 %-igen Natriumdodecylsulfat lysiert.
Nach (ii) NaoH wird das Zellysat-Lösung vor der Markierung neutralisiert; nach (iii) Detergenzlyse wird vor der DNA Markierung das SDS mit 0.5 M Kaliumacetat auf Eis entfernt. Verbindungen 1 bis 6 sollten in der Lage sein, die intakten Zellen zu durchdringen, so daß die DNA Markierung vor Zellyse erfolgen kann. Diese in situ Markierung vereinfacht das Extraktionsverfahren, da alkalische oder Detergenzlysate direkt in die Hybridisier-Lösung zugegeben werden können. Es ist auch überraschend möglich, die gesamten Zellen vor jeglicher Lyse durch Mischen der gesamten Zellen mit den markierten Agenz und Bestrahlung zu markieren.
Vor der Hybridisierung wird die markierte Probe denaturiert, und sie sollte vorzugsweise auch auf kurze einzelsträngige Längen zur Durchführung der spezifischen Hybridisierung mit einer geeigneten, nicht-markierten Sonden DNA verkleinert werden. Denaturierungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren umfassen Behandlung mit Natriumhydroxid, organischen Lösungsmittel, Erhitzen, Säurebehandlung und Kombinationen davon. Fragmentierung kann auf kontrollierte Weise durch Erhitzen der DNA auf ca. 80ºC in NaOH für eine bestimmte Zeit erfolgen, und dies denaturiert natürlich ebenfalls die DNA.

Schritt 3: Markierung der Produkte aus Schritt 2

(i) Eine Probe von ca. 10 ml Urin enthält 10&sup4; oder mehr infektiöse Keime. Nach Abtrennung durch Zentrifugation und Waschen wird das vorbehandelte Zellysat (Schritt 2) in 0.2 ml 10 mM Natriumboratpuffer (pH ca. 8) resuspendiert. Zu dieser Lösung werden 10 µg photomarkierten Reagenzes, gelöst in Ethanol (10 mg/ml) zugegeben und durch Mischen oder im Vortexmischer gemischt. Die Mischung wurde anschließend bei 365 nm 30 Minuten mit einer UVGL 25 Vorrichtung bei einer Einstellung auf der langen Wellenlänge bestrahlt. Die UVGL-Vorrichtung wird von UVP Inc., 5100 Walnut Grove Avenue, P.O. Box 1501, San Gabriel, CA 91778, USA verkauft.
(ii) Die Probe kann ebenfalls mit N-(4-Azido-2- nitrophenyl)-N'-(N-di-biotinyl-3-aminopropyl)-N'- methyl-1,3-propanediamin (handelsüblich erhältlich von BRESA, G.P.O. Box 498, Adelaide, South Australia 5001, Australien) entsprechend dem Verfahren von Forster et al., Nucleid Acids Res., 13, 745 (1985) für DNA, markiert werden.
(iii) Bei Verwendung unlysierter Zellen wird die Zellsuspension in 0.2 ml 10 mM Boratpuffer mit dem Photoreagenz eine Stunde vor Bestrahlung inkubiert.

Schritt 4: Hybridisierung und Nachweis der Produkte aus Schritte 2 und 3

Hybridisierung und Nachweis der Produkte aus Schritten 2 und 3 wird nach den im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe, umfassend:

(a) Chemisches Modifizieren von Nucleinsäuren in der Probe, entweder zur Einführung einer Markierung oder einer reaktiven Stelle unter Herstellung chemisch modifizierter hybridisierbarer Nucleinsäuren,

(b) Inkontaktbringen unter Hybridisierungsbedingungen, der chemisch modifizierten Probennucleinsäuren mit einer hybridisierbaren Nucleinsäurensonde, die entweder, wenn die Probennucleinsäuren zur Einführung einer Markierung modifiziert sind, eine reaktive Stelle trägt, oder, wenn die Probennucleinsäuren modifiziert sind, um eine reaktive Stelle einzuführen, markiert ist.

(c) Inkontaktbringen der Lösung aus Schritt (b) mit einer immobilisierten Form eines Reaktionspartners gegen die reaktive Stelle unter Bildung einer stabilen Bindung mit der reaktiven Stelle auf den Probennucleinsäuren oder der Sonde,

(d) Abtrennen der erhaltenen immobilisierten Fraktion von der übrigen Lösung, und

(e) Bestimmen des Vorliegens der Markierung in der abgetrennten immobilisierten Fraktion, oder Abnahme der Markierung in der übrigen Fraktion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Modifizierung der Probennucleinsäuren zur Einführung der Markierung oder der reaktiven Stelle durch Reaktion mit einem photochemischen reaktiven Mittel mit der Markierung oder der reaktiven Bindungstelle erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin die immobilisierte Form des reaktiven Partners einen fester Träger, an welcher die reaktive Gruppe angeheftet ist, und die reaktive Stelle eine Bindungsstelle, die zur spezifischen nicht-kovalenten Bindung in der Lage ist umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Bindungsstelle Biotin oder ein Hapten ist, und worin der immobilisierte reaktive Partner eine immobilisierte Form von Avidin oder ein Antihapten-Antikörperreagenz ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Markierung ausgewählt ist aus einer enzymatisch aktiven Gruppe einen fluoreszierendem Mittel, einem Chromophor, einem luminiszierenden Mittel, einen spezifisch bindbaren Liganden und einem Radioisotop.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Markierung ein spefisch bindbarer Ligand ist und seine Anwesenheit durch Bindung mit einem markierten Bindungspartner nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die bestimmte, zu untersuchende Sequenz charakteristisch für das Vorliegen oder die Abwesenheit einer bestimmten genetischen Fehlfunktion ist.

8. Kit für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend

a) eine immobilisierte Form eines reaktiven Partners, und

b) eine hybridisierbare Nucleinsäuresonde, welche markiert ist oder eine reaktive Stelle trägt, die eine stabile Bindung mit dem reaktiven Partner bildet.

9. Kit nach Anspruch 8, das ferner ein Reagenz umfaßt, das mit den Nucleinsäuren der Probe unter Einführung, entweder

(1) einer Markierung, wenn die Probe die reaktive Stelle trägt, oder

11) einer reaktiven Stelle, wenn die Probe markiert ist reagieren kann, zur Herstellung chemisch modifizierter hybridisierbarer Nucleinsäuren.

10. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Kit nach Anspruch 8 und 9 zum Nachweis von genetischen Fehlfunktionen.