ES2272723T3 - Procedimiento de marcaje y de fragmentacion de adn. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de marcaje y fragmentación de un ácido desoxirribonucleico (ADN), simple o de doble hebra, que comprende las siguientes etapas: - fragmentar el ADN, mediante la intermediación de por lo menos un sitio abásico sobre el citado ADN - unir un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos, mediante la intermediación de un reactivo de marcaje, acoplándose, el citado reactivo, de una forma covalente y mayoritaria, sobre por lo menos un fosfato del citado fragmento, realizándose, la fragmentación y el marcaje, en una etapa.

Description

Procedimiento de marcaje y de fragmentación de ADN.

La presente invención, se refiere a un procedimiento de fragmentación y de marcaje de ADN, y a un procedimiento para la puesta a disposición de sondas para la detección de un ácido nucleico diana.

El estado actual de la técnica, muestra que existen numerosos procedimientos, para marcar ácidos nucleicos.

Un primer procedimiento, consiste en fijar el marcador sobre la base, sea ésta natural o modificada. Un segundo procedimiento, propone fijar el marcador sobre el azúcar, también aquí, tanto como si es natural o modificado. Un tercer procedimiento, tiene por objeto la fijación del marcador sobre el fosfato.

El marcaje sobre la base, se ha utilizado, principalmente, en la propuesta de marcaje de los ácidos nucleicos, mediante la incorporación de nucleótidos directamente marcados.

El marcaje sobre el azúcar, se utiliza, a menudo, en el caso de los oligonucleótidos preparados mediante síntesis química.

El marcaje sobre el fosfato, se ha utilizado, también, para introducir brazos funcionalizados y marcadores, en el momento de la síntesis química de los oligonucleótidos.

De hecho, la persona experta en el arte especializado de la técnica que debe efectuar el marcaje sobre de un nucléotido, o de un análogo de nucleótido o de un ácido nucleico, es propenso a efectuar esta fijación sobre la base o sobre el azúcar que le ofrece más comodidades y alternativas. Esto es, además, lo que resalta del estudio de numerosos documentos, tales como los correspondientes a las solicitudes de patentes EP-A-0 329 198, EP-A-0 302 175, EP-A-0 097 373, EP-A-0 063 879, US-A-5.449.767, US-A-5.323.824, WO-A-93/16 094, DE-A-39 10 151, EP-A-0 567 841, para la base, o la EP-A-0 286 686, para el azúcar.

La fijación el marcador sobre el fosfato, es una técnica más compleja que la técnica consistente en funcionalizar la base o el azúcar, y se ha utilizado menos, principalmente, a causa de la débil reactividad del fosfato (véase, por ejemplo, Jencks W.P. et J. Amer. Chem. Soc. 82, 1778-1785, 1960). Al mismo tiempo, en la revista de O'Donnel y Mc Laughlin ("Reporter groups for analysis of nucleic acid estructure", -Grupos de reportación para el análisis de la estructura del ácido nucleico-, páginas 216-243, en "Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", -Química bioorgánica: Ácidos nucleicos-, Ed. Echt S.M., Oxford University Press, 1966), las cuales tratan de los procedimientos de introducción de sondas en los fragmentos de oligonucleótidos, la eficacia de la alquilación del fosfodiéster internucleótido, se considera como siendo imposible.

Se plantea un segundo problema para el marcaje de los ácidos nucleicos, especialmente, para los ácidos nucleicos de gran tamaño, es decir, de más de cien (100) nucleótidos, los cuales deben hibridarse con sondas nucleicas. Este problema, está ligado al impedimento estérico o la falta de especificidad entre el ácido nucleico y la sonda nucleica. Esto se traduce por una pérdida de sensibilidad de detección.

El impedimento estérico, puede ser el hecho, no únicamente de la longitud del ácido nucleico, sino también, igualmente, de la existencia o de la conservación de estructuras secundarias. La fragmentación, permite destruir estas estructuras y, así, de este modo, el optimizar la hibridación. Este impedimento estérico, juega un rol interpretativo particularmente importante, en el caso de la hibridación de las superficies que contienen sondas de captura de fuerte densidad, por ejemplos, las series de disposición de ADN puestas a punto por la firma Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High Density DNA arrays", -Acceso a la información genética, con series de disposición de ADN de alta densidad-, M. Shee et al., Science, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquense analysis", -Series de disposición de oligonucleótidos generados a la luz, para un rápido análisis de secuencias de ADN-, A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026).

En cuanto a lo concerniente a la fragmentación de ácidos nucleicos, en el estado actual de la técnica, se encuentran descritos numerosos procedimientos.

En primer lugar, la fragmentación, puede ser enzimática, es decir, que la fragmentación de los ácidos nucleicos, puede realizarse mediante nucleasas (D-Nases).

En segundo lugar, la fragmentación, puede ser química. Así, por ejemplo, en el caso del ADN, se puede efectuar la despurinación o la despirimidación del ADN, el cual, se fragmenta, a continuación, en presencia de una base, mediante un mecanismo denominado de "\beta-eliminación". La fragmentación del ADN, puede realizarse mediante mecanismos de oxidación, de alquilación, de adición de radicales libres, entre otros.

Finalmente, la fragmentación, puede ser física, por ejemplo, mediante asociación por sonificación (tratamiento con ultrasonidos) o por vía fotoquímica.

La dificultad, consiste, de hecho, en asociar estas dos etapas de fragmentación y de marcaje.

La solicitud de patente internacional WO-A-99/65 926, describe un procedimiento de marcaje de un ácido ribonucleico (ARN) de síntesis o natural, que consiste en fragmentar el ARN y en marcar, al nivel del fosfato terminal. Este documento, describe un cierto número de funciones reactivas que pueden utilizarse para el marcaje, en combinación con la fragmentación. Estas funciones, permiten el marcar el ARN, pero hace falta asociar el fosfato liberado en el momento de la fragmentación. Además, hace falta añadir un exceso importante de reactivo de marcaje, con relación al ARN, para obtener un marcaje eficaz, lo cual induce problemas de ruido de fondo, generado por el marcador en exceso. Finalmente, este procedimiento, no es aplicable al ADN de doble hebra.

Existe por lo tanto una necesidad, en cuanto al hecho de poder disponer de una técnica de marcaje de ADN, simple y eficaz, la cual permita un rendimiento del marcaje y, de una forma particular, que no afecte a las propiedades de hibridación de las bases implicadas en la formación de la doble hélice, por la intermediación de enlaces hidrógenos, y finalmente, que permita la fragmentación del ADN con la finalidad de hibridar estos fragmentos de ADN, marcados sobre sondas nucleicas y, de una forma particular, sobre sondas nucleicas fijadas sobre un soporte sólido.

La presente invención, describe un procedimiento de marcaje y de fragmentación de un ácido desoxirribonucleico (ADN) simple, o de doble hebra, el cual comprende:

- fragmentar el ADN, creando por lo menos un sitio abásico sobre el citado ADN

- unir un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos, mediante la intermediación de un reactivo de marcaje, acoplándose, el citado reactivo, de una forma covalente y mayoritaria, sobre por lo menos un fosfato del citado fragmento,

realizándose, la fragmentación y el marcaje, en una etapa.

La presente invención, se refiere igualmente a un procedimiento para la puesta a disposición de sondas de detección de un ácido nucleico diana, el cual comprende el marcaje y la fragmentación de un ácido desoxirribonucleico (ADN), simple o de doble hebra, que comprende las siguientes etapas:

- fragmentar el ADN, mediante la intermediación de por lo menos un sitio abásico sobre el citado ADN,

- unir un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos, mediante la intermediación de un reactivo de marcaje, acoplándose, el citado reactivo, de una forma covalente y mayoritaria, sobre por lo menos un fosfato del citado fragmento.

La fragmentación y el marcaje, se efectúan en una etapa o en dos etapas y, el marcaje, puede efectuarse, de una forma indiferente, antes, después o simultáneamente con la fragmentación.

De una forma preferente, el marcaje y/o la fragmentación, se efectúa(n) en solución homogénea sensiblemente acuosa. De una forma preferente, el marcaje y la fragmentación, se efectúan de una forma simultánea, es decir que, los reactivos necesarios para estas dos etapas, se ponen conjuntamente en una solución sensiblemente acuosa con ácido nucleico, por ejemplo. Este es especialmente el caso, para la fragmentación química o enzimática. En el caso de la fragmentación mecánica mediante un medio físico, efectuándose simultáneamente marcaje y fragmentación, significa que, el medio físico, se aplica a una solución que contiene por lo menos los ácidos nucleicos y el reactivo de marcaje.

Por solución sensiblemente acuosa, se entiende una solución que contiene por lo menos un 50% de agua. Esta solución, contiene, de una forma preferente, sales, como una solución tampón. Por solución homogénea, se entiende una solución monofásica tal como una solución agua/DMSO, de forma opuesta a una solución bifásica, tal como una solución agua/cloroformo.

La fragmentación del ADN mediante la intermediación de la creación de un sitio abásico, se efectúa por vía enzimática, química o física.

La fragmentación por vía química, del ADN, se realiza procediendo a poner el ácido nucleico en presencia de un medio químico de creación de sitio abásico.

Ejemplos de condiciones de fragmentación química mediante la intermediación de un sitio abásico del ADN, se proporcionan en G. Pratviel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, páginas 746-769, 1995; G. Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem., 45, páginas 251-312, 1998; D.S. Sigman et al. Chem. Rev. 93, páginas 2295-2316, 1993; J. Lhomme et al., Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 52, páginas 65-83, 1999.

Un sitio abásico, se crea cuando, el enlace N-glicosídico que une la base modificada a la desoxirribosa, se hidroliza, dejando el enlace fosfodiéster intacto. Este fenómeno, se denomina despurinación (en el caso de las purinas) o despirimidación (en el caso de las pirimidas). La despurinación, es mucho más frecuente que la despirimidación.

Los agentes químicos tales como, el pH ácido, los agentes oxidantes o los agentes alquilantes, pueden inducir el fenómeno de la despurinación y, por lo tanto, la formación de sitios abásicos. Estos agentes alquilantes, se encuentran constituidos por especies electrófilas que reaccionan con los sitios nucleófilos de ADN. El átomo de nitrógeno en la posición 7, de la guanina, es el sitio principal de alquilación de ADN. Además de la protonación de las purinas, la alquilación, es una de las modificaciones químicas susceptibles de convertir al enlace N-glicosídico en más lábil.

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La oxidación del ADN, puede igualmente generar lesiones abásicas denominadas "alcalilábilis", las cuales conducen a la fragmentación del ADN, en presencia de una base. Así, por ejemplo, el residuo ribonolactona, puede generarse mediante la reacción de un radical hidroxilo (OH) con el carbono C1'.

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El sitio abásico, es muy inestable. En su forma aldehídica, éste puede experimentar fácilmente una \beta-eliminación del fosfodiéster, fijado en la posición 3', lo cual conduce a una fragmentación de la hebra del ADN.

La despurinación, es instantánea, en las condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37°C), pero, la velocidad de la reacción, es muy reducida, del orden de 3\cdot10^{-11} despurinación por segundo, es decir, inutilizable para una fragmentación eficaz. Para aumentar la velocidad de la reacción, se utilizan agentes alquilantes que fragilizan el enlace N-glicosídico, o de las enzimas, como las ADN glicosilasas.

Una forma preferente de realización de la fragmentación, se obtiene mediante la utilización de un pH ácido, es decir, un pH inferior a 5, de una forma preferente, inferior a 4. De una forma preferente, el pH, es de aproximadamente 3.

Un tampón formiato de sodio, a pH 3, permite el fragmentar, de una forma eficaz, los ácidos nucleicos según la presente invención. Este tampón, es compatible con las condiciones de marcaje, en una etapa, tal y como se demostrará en los ejemplos. De una forma todavía más ventajosa, se utiliza un medio ácido (HCl, carbonato, H_{2}SO_{4}).

En una forma particular de presentación de la presente invención, y con la finalidad de aumentar todavía la fragmentación, el ácido desoxirribonucleico, contiene por lo menos una base modificada, susceptible de generar un sitio abásico, más fácilmente.

Son utilizables diversas bases modificadas, como las N/-alquilpurinas, las N3-alquilpurinas, las O6-alquilpurinas, las 8-bromopurinas, las 8-tiopurinas, las 8-alquiltiopurinas, las 8-azidopurinas, o las 8-alquilsulfonilpurinas.

En el caso en donde el ácido nucleico a marcar, esté generado por una técnica de amplificación enzimática, como la PCR, la utilización de una 8-bromopurina, permite el tener una incorporación eficaz del citado nucleótido, durante la amplificación, lo cual facilita en la misma cuantía, el procedimiento de fragmentación y de marcaje según la invención, al mismo tiempo que se conserva una sensibilidad excelente para la etapa de amplificación enzimática. Se incorpora, igualmente, una 8-metiltiopurina, sin molestar a la eficacia de la amplificación y incorporación por PCR. Una vez incorporada, la base tioéter, se oxida mediante un perácido o un derivado de monopersulfato, como el peroximonosulfato de potasio, por ejemplo, en sulfonilo correspondiente, que es muy lábil. Se ha demostrado el hecho de que, el tiempo vida media correspondiente a la hidrólisis de un 8-metilsulfonilguanosina, es inferior a 2 minutos, mientras que, el tiempo de vida para su homólogo natural, es de 1000 horas.

Por marcador, se entiende por lo menos un marcador capaz de generar directamente o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitativa de estos marcadores, es la que sigue:

\bullet las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo, mediante colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como la peroxidasa del rábano silvestre, la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,

\bullet los cromóforos, como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes;

\bullet los grupos de densidad electrónica detectable por microscopio electrónico o por su propiedad eléctrica, como la conductividad, la amperometría, la voltametría, la impedancia,

\bullet los grupos detectables, por ejemplo, en donde, las moléculas, son de unos tamaños suficientes como para inducir modificaciones detectable de sus características físicas y/o químicas, pudiéndose realizar, esta detección, mediante métodos ópticos, como la difracción, la resonancia plasmón de superficie, la variación de superficie, la variación del ángulo de contacto o métodos físicos, como la espectroscopia de fuerza atómica, el efecto túnel, y

\bullet las moléculas radiactivas, como el ^{32}P, el ^{35}S, ó el ^{125}I.

De una forma preferente, el marcador, no es un marcador radioactivo, para evitar los problemas de seguridad ligados a estos marcadores.

En una forma de realización particular de la presente invención, el marcador, es detectable electroquímicamente y, de una forma particular, el marcador, es un derivado de un complejo de hierro, como el ferroceno.

Pueden también utilizarse sistemas indirectos, como por ejemplo, ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando. Los pares ligando/anti-ligando, son bien conocidos por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica, lo cual es el caso, por ejemplo, de loa pares siguientes: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/complementario del polinucleótido. En este caso, es el ligando, el que porta la función reactiva. El anti-ligando, puede ser directamente detectable mediante los marcadores descritos en el párrafo precedente, o ser en sí mismo detectable mediante otro par ligando/anti-ligando.

Otro ejemplo de los sistemas indirectos, utiliza un enlace entre el reactivo de marcaje y el ácido nucleico que es covalente, pero se describe, anteriormente, arriba, el hecho de que, las interacciones no covalentes, pueden utilizarse principalmente en los sistemas de apilamiento o, en el caso en donde, el marcador, es detectable indirectamente. El término "unir", cubre por lo tanto estas diferentes posibilidades.

Estos sistemas de detección indirectos, pueden conducir, en ciertas condiciones, a una amplificación de la señal y nos podemos reportar a las solicitudes de patente internacional anteriores WO-A-00/07 982, WO-A-01/92 361 y WO-A-95/08 000 del solicitante, para los ejemplos de amplificación química que utilizan polímeros, o a la solicitud de patente internacional WO-A-01/44 506, siempre del solicitante, para los sistemas de amplificación química por apilamiento.

En una forma particular de amplificación de la señal, sobre el reactivo de marcaje, se encuentran presentes por lo menos dos marcadores.

En una forma preferente de presentación de la presente invención, el trazador, es un compuesto fluorescente de reducido impedimento estérico, como la fluoresceína, el dansyl, los cromóforos del tipo IR (Ranfolph J.B. et. al. Nucleic Acids Res., 25 (14), páginas 2923-2929, 1977) y, de una forma particular, los derivados del Cy5, o bien el trazador es un haptano de reducido impedimento estérico, como la biotina o un derivado del abietano (véase la solicitud de patente internacional WO-A-00/07 982). Por reducido impedimento histérico, se entiende un peso molecular inferior a 1000 g/mol.

En el caso de un fluoróforo, es preferible el trabajar con fluoróforos en donde, la longitud de la onda de excitación, sea superior a 450 nm, de una forma preferente, superior a 600 nm.

En el caso en donde, el trazador, es un haptano que no produce señal por sí mismo, como por ejemplo, la biotina, la detección, se realiza mediante la reacción de un anti-ligando, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba. En el caso de la biotina, se utiliza, de una forma preferente, la estreptavidina, o un anticuerpo anti-biotina, acoplado a un compuesto fluorescente, como la fluoresceína Cy5 ó la Ficoeritrina. En el caso del abietano, se utiliza un anticuerpo monoclonal, tal y como se describe en la solicitud de patente internacional WO-A-00/07 982.

El término "ácido desoxirribonucleico" o ADN, significa un encadenamiento de por lo menos dos desoxirribonucleótidos, el cual comprende, eventualmente, por lo menos un nucleótido modificado, por ejemplo, por lo menos un nucleótido que comporte una base modificada tal como la ionosina, la metil-5-desoxictidina, la dimetilamino-5-desoxiuridina, la desoxiuridina, la diamino-2,6-purina, la bromo-5-desoxiuridina, o cualquier otra base modificada que permita la hibridación.

Este ADN, puede también modificarse al nivel del enlace internucleotídico, como por ejemplo, los fosforotioatos, los H-fosfonatos, los alquil-fosfonatos, al nivel del esqueleto, como por ejemplo, los alfa-oligonucleótidos (FR-A-2 607 507), o los PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 1895-1897, 1992). El ADN, es natural o sintético y/o en forma de fragmento. El ADN, es simple o de doble hebra.

De una forma particular, de ADN, se obtiene mediante una técnica de amplificación enzimática, tal como:

\bullet la PCR (Polymerasa Chain Reaction, -Reacción en cadena de la polimerasa-), descrita en las patentes estadounidenses US-A-4.683.195, US-A-4.683.202 y US A-4.800.159, y su derivada RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, -Transcripción inversa de la PCR), especialmente, en un formato en una etapa, tal y como se describe en la solicitud de patente europea EP-A-0 569 272.

\bullet la LCR (Ligasa Chain Reaction, -Reacción en cadena de la Ligasa-), expuesta, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP-A-0 201 184,

\bullet la RCR (Repair Chain Reaction, -Reacción en cadena reparadora-), descrita en la solicitud de patente internacional WO-A-90/01 069.

Se habla, entonces, de amplicones, para designar el ADN generado mediante una técnica de amplificación enzimática. El ADN, puede también comprender ribonucleótidos, en una reducida proporción, por ejemplo, inferior a un 10%.

Cada una de estas modificaciones, puede tomarse en combinación por poco que, por lo menos, se encuentre presente un fosfato en el ADN.

Los reactivos de marcaje, comprende, como función reactiva, una formación elegida entre los compuestos siguientes: diazometilo; halogenuro de alquilo; nitrosurado, espiriciclopropano; aziridina, trifluorosulfonatos.

Las funciones reactivas, se describen abajo, a continuación:

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Para la función reactiva halogenuro de alquilo, X, significa Br, Cl, ó I. De una forma ventajosa, el reactivo de marcaje, es la -(bromometil)fluoresceína.

Para la función reactiva nitrosurada, R^{5}, es un alquilo ó H.

La función diazometilo, se ha utilizado ya, para la alquilación de los grupos sulfatos, pero se plantea un cierto número de problemas. Por una parte, los derivados diazo, en general, son en sí mismos inestables, lo cual genera problemas para la utilización de estos reactivos de marcaje, en un equipo a modo de "kit" de marcaje y, por otra parte, el producto de acoplamiento, es inestable, lo cual es redhibitorio, si el producto marcado, tiene como función el evidenciar la presencia de una molécula diana biológica, en una muestra cualquiera, o si es la diana marcada la que se desea detectar.

Finalmente, los derivados que portan la función diazometilo, son insolubles en el agua, lo cual conduce a utilizar unas condiciones bifásicas para el acoplamiento con estos ácidos nucleicos, los cuales no son solubles y estables más que en el agua, o tampones acuosos, pero, estas condiciones, enlentecen la velocidad de reacción y, por lo tanto, perjudica a la eficacia del acoplamiento.

En una forma preferida del procedimiento según la invención, el reactivo de marcaje, se elige entre los compuestos la fórmula (1):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido,

\bullet Z, comprende un marcador detectable,

\bullet Z y/ó R^{1}, se eligen para estabilizar la función diazometilo, es decir, por lo menos uno de los dos grupos Z ó R^{1}, o un núcleo fenilo.

De una forma preferente, el reactivo de marcaje, se elige entre los compuestos de la fórmula (2):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, es un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es igual a 0 ó 1, y

\bullet Z, se elige entre

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en la cual,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo, y

\bullet -Y-X-, representa -CONH-, -NHCO-, CH_{2}O, -CH_{2}S-.

En una forma particular según la fórmula (a), Z, tiene l estructura siguiente:

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En este caso, y si R^{1} es igual a H, reactivo de marcaje, es el 1-pirenildiazometano (PDAM).

Si bien este marcador es fluorescente, la longitud de onda de excitación, se encuentra demasiado próxima de la de los ácidos nucleicos. Una detección indirecta para la utilización de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la formación pireno, es la que se prefiere. La forma de obtención de este anticuerpo, es bien conocida por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO-A-00/07 982).

En una forma preferida de realización del procedimiento, el reactivo de marcaje, es de la fórmula (3):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

\bullet -Y-X-, representa -CONH-, -NHCO-, CH_{2}O, -CH_{2}S-.

\newpage

De una forma ventajosa, el reactivo, es de la fórmula (4):

12

en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo. De una forma ventajosa, el reactivo, es de la fórmula (5):

13

en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

De una forma ventajosa, el reactivo, es de la fórmula (6):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

En las fórmulas anteriores, de arriba, (3) a (6), de una forma ventajosa, R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, H, NO_{2}, OCH_{3}.

Así, de esta forma, un compuesto preferido según la fórmula (6), es de la fórmula (6'):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1.

Un compuesto preferido según la fórmula (4), es de la fórmula (4'):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1.

En una forma particular de presentación del procedimiento de la presente invención, en donde se quiere amplificar la señal, se encuentran presentes por lo menos dos marcadores, sobre el reactivo de marcaje. De una forma particular, un reactivo que permite aplicar la amplificación de la señal según la presente invención, posee una estructura R^{2}-(L)_{n}- de la fórmula (7) siguiente:

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en la cual,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet m, es un número entero comprendido entre 1 y 100, de una forma preferente, comprendido entre 1 y 20,

\bullet p, es un número entero, comprendido entre 1 y 10, de una forma ventajosa, de 2 a 6 y, de una forma preferente, 4.

Esta estructura R^{2}-(L)_{n}-, se aplica indiferentemente a las fórmulas (2) a (6) precedentes.

Otro reactivo de marcaje preferido para la amplificación de la señal, es el reactivo de la fórmula (8):

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en la cual,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet R^{3}, representa N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet -Y-X-, representa -CONH-, -NHCO-, CH_{2}O, -CH_{2}S-.

De una forma ventajosa, el reactivo para la amplificación de la señal, tiene la fórmula (9):

19

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en la cual,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet R^{3}, representa N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

Ciertos reactivos ventajosos de la invención, son:

a) de la fórmula (10):

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en la cual,

\bullet R^{1,} representa H ó un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

b) de la fórmula (11):

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en la cual,

\bullet R^{1,} representa H ó un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

c) de la fórmula (12):

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22

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en la cual,

\bullet R^{1,} representa H ó un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1.

De una forma preferente, el reactivo de marcaje, tiene:

a) la estructura

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23

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en la cual, R^{1}, representa un grupo metilo o un fenilo, ó

\newpage

b) la estructura

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24

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en la cual, R^{1}, representa un grupo metilo o fenilo, ó

c) la estructura

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25

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en la cual, R^{1}, representa un grupo metilo o fenilo.

Otros reactivos preferidos de la invención, tienen la fórmula (13):

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26

\vskip1.000000\baselineskip

en la cual,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1.

De una forma particular, los reactivos de marcaje según el procedimiento de la invención, son solubles en disolventes polares miscibles con agua, como el DMF, el DMSO, CH_{3}CN, THF, DMA (dimetilacetamida), NMP (N-metilpirrolidona), DME (dimetoxietano).

De una forma preferente, los reactivos de marcaje, son solubles en el DMSO o en el agua.

Por disolvente miscible en agua, se entiende un disolvente que es miscible en una proporción de por lo menos un 5%, en volumen, con agua o un tampón acuoso que contenga sales.

De una forma ventajosa, en las fórmulas precedentes, el brazo L, comprende una formación etilenglicol o polietilenglicol, para aumentar la solubilidad del reactivo en el agua.

Estos reactivos, pueden de este modo fijarse en fase homogénea, sobre ácidos nucleicos, encontrándose constituida, la fase homogénea, por una solución sensiblemente acuosa, es decir, que contiene por lo menos un 50% de agua.

Un objeto de la presente invención, es el de describir un procedimiento de detección de un ácido desoxirribonucleico diana (ADN), de simple o de doble hebra, que comporta las etapas siguientes:

a) fragmentar y marcar los citados ADN, según uno cualquiera de los procedimientos descritos precedentemente, arriba;

b) hibridar los fragmentos marcados, sobre por lo menos una sonda nucleica, suficientemente específica, del ácido nucleico diana; y

c) detectar el híbrido formado mediante la intermediación del marcador.

Tal y como se demostrará en los ejemplos, la desnaturalización del ADN antes de la hibridación, permite aumentar la sensibilidad. Esta etapa de desnaturalización, tiene lugar después de la fragmentación y el marcaje.

En una forma particular del procedimiento, tiene lugar una etapa de amplificación enzimática, antes de la fragmentación y el marcaje. La etapa de amplificación enzimática, genera amplicones ADN, a partir de un ácido nucleico diana ADN, pero, también, a partir de un ácido nucleico diana ARN, como un ARN mensajero, un ARN de transferencia o un ARN ribosómico. La técnica de RT-PCR, por ejemplo, es un medio conocido para amplificar el ARN.

De una forma preferente, las etapas de fragmentación, marcaje y desnaturalización, tienen lugar tanto en el caso de un ácido nucleico diana natural, como en el caso de un ácido nucleico diana obtenido mediante una técnica de amplificación enzimática.

La fragmentación por reacción de un sitio abásico, implica la pérdida de una base. En los procedimientos de detección del ácido nucleico diana y, en particular, en los procedimientos de genotipificación, es decir, en los procedimientos en donde, el ácido nucleico diana, presenta un poliformismo repartido sobre su secuencia, es necesario el identificar una pluralidad de modificaciones de secuencias, en donde, ciertas de ellas, representan la modificación de una sola base entre la diana y las sondas nucleicas cuya función es la de identificar esta modificación (sondas de captura). La especificidad, es por lo tanto esencial en este contexto. De una forma sorprendente, la presente invención, demuestra el hecho de que, esta pérdida de una base, no afecta en nada a la especificidad de la hibridación para un nucleico marcado y fragmentado según la invención.

La presente invención, tiene también por objeto un procedimiento de evidenciación de un poliformismo, repartido en posiciones predeterminadas, o no, de un ácido nucleico diana, mediante la presencia de una pluralidad de deleciones y/o de inserciones y/o mutaciones en la secuencia del citado ácido nucleico diana, con relación a una secuencia, denominada de referencia, que comporta las etapas siguientes:

a) disponer de un ADN diana, que comporte el conjunto del poliformismo a estudiar, generándose eventualmente, el citado ADN, mediante una técnica de amplificación enzimática,

b) fragmentar y marcar el citado ADN, mediante uno de los procedimientos descritos precedentemente,

c) hibridar los citados fragmentos, sobre una pluralidad de sondas nucleicas denominadas sondas de captura, fijándose, la pluralidad de sondas de captura, sobre un soporte sólido, y cubriendo, la pluralidad de sondas de captura, en su conjunto, por lo menos el poliformismo a estudiar,

d) detectar los híbridos formados entre los fragmentos marcados, y por lo menos una parte de las sondas nucleicas, mediante la intermediación del marcador, y deducir de ello, el poliformismo del ADN diana.

Tal y como se ha indicado precedentemente, arriba, una etapa de desnaturalización después de la etapa de fragmentación y marcaje, permite mejorar la sensibilidad del procedimiento y, esta etapa, se realiza, de una forma preferente, simultáneamente con la etapa de marcaje y fragmentación.

El procedimiento de fragmentación y de marcaje según la invención, es particularmente útil, en el caso en donde, el ADN marcado y fragmentado, deba hibridarse con una multitud de ácidos nucleicos, especialmente, oligonucleótidos, fijados sobre el soporte sólido, en una posición predeterminada para formar una serie de distribución de ADN. Por "serie de distribución", se entiende un soporte sólido de dimensión reducida, en donde se fijan una multitud de sondas de captura, en posiciones predeterminadas. Por multitud, se entiende un soporte sólido que comprende, por lo menos, diez (10) sondas nucleicas de secuencias diferentes, de una forma ventajosa, por lo menos cuatrocientas (400), de una forma preferente, por lo menos mil (1000).

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En efecto, la densidad de los ácidos nucleicos fijados sobre el soporte sólido, impone impedimentos estéricos importantes en el momento de la hibridación y la fragmentación, permite mejorar esta etapa de hibridación. Ejemplos de estas series de disposición ADN, se dan, por ejemplo, en las publicaciones de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, páginas 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, páginas 1-10, 1997; J. Cheng et al., Molecular Diagnosis, 1 (3), páginas 183-200, 1996; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), páginas 15-2921, 1994: J Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, páginas 541-446, 1998. El término "soporte líquido", tal y como se utiliza aquí, en este documento, incluye todo los materiales sobre los cuales puede fijarse un ácido nucleico. El soporte sólido, puede ser en forma de una placa de microtitrimetría, de una membrana, de una partícula o de una placa sensiblemente plana.

La invención, permite la utilización de un ADN marcado, tal y como se define anteriormente, arriba, con sonda de detección de un ácido nucleico diana.

Para permitir la detección y/o la cuantificación y/o la purificación del ácido nucleico diana, el ADN marcado, es capaz de formar un complejo de hibridación con una sonda nucleica. A título de ejemplo, el ácido nucleico marcado, es suficientemente complementario de la diana, para hibridarse específicamente, en función de las condiciones de reacción y, especialmente, de la temperatura o de la salinidad del medio reactivo.

El procedimiento de detección, es aplicable para la secuenciación, el perfil de la expresión de los ARN mensajeros, o el cribado de las mutaciones con fines de investigación, así como el cribado de fármacos, en la industria farmacéutica, el diagnóstico de las enfermedades infecciosas (así como también en bacteriología, virología, parasitología, etc.), o genéticas, el control alimentario o industrial.

Numerosas publicaciones, describen este tipo de aplicaciones: Antoine de Saizieu et al., Nature Biotechnology, 16, páginas 44-48, 1998; Thomas R. Gingeras et al., Genome Research, 8, páginas 435-448, 1998; David J. Lockhart et al, Nature Biotechnology, 14, páginas 1675-1680, 1996; Daniel D. Shoemaker et al., Nature Genetics, volumen 14, páginas 450-456, 1996; R. J. Lipshutz et al.; BioTecniques, 19(3), páginas 442-447, 1995; David G. Wang et al., Science, 280, páginas 1077-1082, 1998; Kelvin L. Gunderson et al; Genome Research, 8, páginas 1152-1152; Joseph G. Hacia el al., Nature Genetics, volumen 14, páginas 441-447, 1996.

La tendencia en materia de diagnóstico y, especialmente, para las enfermedades infecciosas (SIDA o tuberculosis, por ejemplo), es la de bajar el nivel de sensibilidad hasta la detección de una molécula única en una muestra, la cual puede representar varios mililitros en el caso de una extracción líquida del tipo sangre u orina, o líquido céfalo-raquídeo. Este nivel de sensibilidad, no puede obtenerse más que en el caso en donde, todas las etapas de extracción de la muestra, hasta la obtención del resultado, son óptimas. De una forma particular, en el caso en donde es necesaria una etapa de amplificación enzimática, para obtener la sensibilidad necesaria, (infección vírica o bacteriana, como VIH, VHC o tuberculosis), un procedimiento de marcaje y/o fragmentación, tal y como se describe en la presente invención, permite el no afectar la sensibilidad de la técnica de amplificación, bien ya sea porque no es necesario el reemplazar los desoxirribonucleótidos utilizados en la técnica de amplificación enzimática, o bien ya sea porque los desoxirribonucleótidos incorporados, no alteran su sensibilidad.

Pueden encontrarse informaciones complementarias en otra solicitud de patente del solicitante, concretamente, en el documento de patente francesa FR 28 24 323, la cual se depositó el 4 de mayo de 2001, bajo en número de registro FR 01/06 040, así como en su extensión internacional, depositada el mismo día que la presente invención.

La figura 1, representa las fórmulas desarrolladas de diferentes reactivos utilizados en la presente invención, así como las abreviaturas que las designan (o-, significa orto, m-, meta, y p-, para).

Las figuras 2A a 2I, representan los perfiles, en función del tiempo, analizados por electroforesis capilar de acoplamiento covalente de diferentes reactivos que portan una función diazometilo sobre la uridina 3'-monofosfato (3'-UMP), según el ejemplo 6.1. Las moléculas, son las siguientes:

\bullet

PDAM, en la figura 2A,

\bullet

DPDAM de 2 mM (milimol(es) por litro) en la figura 2B,

\bullet

DPDAM de 20 mM, en la figura 2C,

\bullet

PMDAM, en la figura 2D,

\bullet

NPDAM, en la figura 2E,

\bullet

BioDPDAM, en la figura 2F,

\bullet

meta-BioPMDAM, en la figura 2G,

\bullet

para-BioPMDAM, en la figura 2H, y

\bullet

orto-BioPMDAM, en la figura 2I.

Las figuras 3A a 3D, representan los perfiles, en función del tiempo, analizados por electroforesis capilar de la reacción del meta-BioPMDAM, sobre (4) nucleótidos 3'-monofosfato, según el ejemplo 6.2. Las moléculas, son las siguientes:

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\bullet

3'-CMP, en serie ribonucleótido, según la figura 3A,

\bullet

3'-AMP, en serie ribonucleótido, según la figura 3B,

\bullet

3'-GMP, en serie ribonucleótido, según la figura 3C, y

\bullet

3'-TMP, en serie ribonucleótido, según la figura 3D.

\vskip1.000000\baselineskip

La figura 4, representa los perfiles, en función del tiempo, analizados por electroforesis capilar, de la reacción del meta-BioPMDAM, sobre un dinucleótido 5'-ApUp, según el ejemplo 6.3.

Las figuras 5A a 5D, representan el espectro de RMN del protón, en D_{2}O, de los diferentes conjugados, entre el reactivo meta-BioPMDAM y (4) ribonucleótidos 3'-monofosfato, según el ejemplo 6.4. Las moléculas, son las siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

\bullet

3'-GMP, en la figura 5A,

\bullet

3'-AMP, en la figura 5B,

\bullet

3'-CMP, en la figura 5C, y

\bullet

3'-UMP, en la figura 5C.

\vskip1.000000\baselineskip

La figura 6, representa un esquema de síntesis de un reactivo de marcaje, que porta dos biotinas sobre la amplificación química de la señal.

La figura 7, representa un mecanismo de fragmentación en medio ácido, para la formación se sitio abásico.

La figura 8, muestra, según el ejemplo 8.1, la cinética de degradación a un pH básico, para diferentes nucleósidos modificados (8-bromo-2'-desoxiadenosina (8-brd) y la 5'-bromo-2'-desoxicitidina (5-BrdC), así como los cuatro nucleósidos naturales (dA, dC, dG y dT). Los resultados, se representan en forma de porcentaje de hidrólisis del nucleósido de partida (en la ordenada) con relación al tiempo de reacción en minutos (en la abscisa).

La figura 9, representa, según el ejemplo 11.2, la cinética del marcaje en función del tiempo, a una temperatura de 60°C, con el reactivo PDAM, sobre un ODN sintético 5'-fosfato. Los resultados, se representan en forma de porcentaje de marcaje con relación al tiempo de reacción, expresado en minutos (en la abscisa).

La figura 10, representa, según el ejemplo 11.3, el porcentaje de marcaje en función de la temperatura de reacción. Los resultados, se representan, sobre la figura 10, representándose, en la ordenada, el porcentaje de marcaje y, en la abscisa, la temperatura de reacción en °C.

La figura 11, representa una vía de síntesis para un reactivo según la fórmula 4, utilizando el reactivo comercial 5-nitrovanilina. La función aldehído, es el precursor de la función diazometilo.

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Ejemplo 1 Síntesis de reactivos con la biotina

Esquema general de síntesis

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Ejemplo 1.1

Síntesis de la meta-Bio-PMDAM \bullet Compuesto biotina meta-acetofenona 1a

Se solubiliza la D-biotina (1,0 gramos (g), 4,1 milimoles (mmol), en 45 mililitros (ml) de DMF anhidro, en caliente. Se enfría a una temperatura de 0°C, bajo argón y, a continuación, se añaden, sucesivamente la N-metilmorfolina (590 microlitros (\mul), 5,33 mmol) y el cloroformiato de isobutilo (840 \mul, 6,60 mmol). Se deja bajo agitación, durante un tiempo de 30 minutos (min) y, a continuación, se añade la 3-aminoacetofenona (824 mg, 6,10 mmol) y la N-metilmorfolina 480 \mul, 4,35 mmol) en 10 ml de DMF. La solución, se mantiene bajo agitación, a una temperatura de 0°C, durante un tiempo de 2 horas (h) y, a continuación, se evapora en seco. Se recoge el residuo en 3 ml de MeOH y, a continuación, se añaden 50 ml de agua. El precipitado obtenido, se filtra, se lava con agua, con CH_{2}Cl_{2} y éter, para proporcionar 1,2 g (80%) del producto 1a, bruto. Una cristalización en la pareja de productos MeOH-H_{2}O, proporciona 1a (1,01 g, 70%), en forma de una materia en polvo de color blanco.

F 145°C. -IR(KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590, 1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 1,3-1,7 (m, 6 H), 2,33 (t, J = 8 H, 2 H); 2,55 (s, 3 H); 2,58; (d, J = 12 Hz, 1 H), 2,83 (dd, J = 12 y 5 Hz, 1 H); 3,13 (m, 1 H), 4,15 (m, 1 H); 4,31 (m, 1 H); 6,34 (s, 1 H); 6,41 (s, 1 H); 7,44 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,64 (d, J = 8 Hz, 1 H); 7,85 (d, J = 8 Hz, 1 H); 8,17 (s, 1 H); 10,05 (s, 1 H).

-MS(FAB/glicerol), m/z: 362 [M + H]^{+}.

\bullet Compuesto meta-hidrazona 2a

Se procede a calentar una solución de 1a (500 mg, 1,38 mmol) y de hidrazina monohidrato (200 \mul, 4,15 mmol), en etanol absoluto (8 ml) y se calienta a reflujo, durante un tiempo de 2 horas. Después de enfriamiento a la temperatura ambiente, el precipitado blanco, se lava con agua, después con éter y, después, se seca. Se obtienen, de esta forma, 385 mg (74%) del producto 2a, en forma de una materia en polvo de color blanco.

F 185°C. -IR(KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 1,3-1,7 (m, 6 H), 1,98 (s, 3 H); 2,26 (t, J = 8 H, 2 H); 2,56 (d, J = 12 y 5 Hz); 2,81 (dd, J = 12 y 5 Hz, 1 H); 3,11 (m, 1 H), 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,39 (s, 3 H); 6,42 (s, 1 H); 7,22 (m, 2 H); 7,50 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,84 (s, 1 H); 9,82 (s, 1 H).

-MS(FAB/glicerol), m/z: 376 [M + H]^{+}.

\bullet Compuesto meta-diazometano 3a

Se solubiliza 2a (180 mg, 0,48 mmol) en 2 ml de DMF. Se añade, a continuación, MnO_{2}(340 mg, 3,9 mmol). Después de 30 minutos de agitación, a la temperatura ambiente, la mezcla, se filtra a través de un embudo fritado, que contiene celite (espesor: 0,5 cm) y tamices moleculares en forma de polvo, de 3 \ring{A} (0,5 cm). La mezcla reactiva, se concentra hasta un volumen final de aproximadamente 0,5 ml y, a continuación, se añaden 5 ml de éter. El precipitado resultante, se filtra, se lava con éter y, a continuación, se seca. Se obtiene el compuesto 3a (170 mg 95%), en forma de una materia en polvo de color rosa.

F 160°C. -IR(KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 1,3-1,7 (m, 6 H), 2,11 (s, 3 H); 2,28 (t, J = 8 H, 2 H); 2,57 (d, J = 12 y 1 Hz); 2,81 (dd, J = 12 y 5 Hz, 1 H); 3,11 (m, 1 H), 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,33 (s, 1 H); 6,41 (s, 1 H); 6,60 (m, 1 H); 7,25 (m, 3 H), 9,84 (s, 1 H).

Ejemplo 1.2

Síntesis del para-BioPMDAM \bullet Compuesto biotina para-acetofenona 1b

Se solubiliza la D-biotina (1 g, 4,1 mmol), en 45 ml de DMF anhidro, en caliente. Se enfría a una temperatura de 0°C, bajo argón y, a continuación, se añaden, sucesivamente la N-metilmorfolina (590 microlitros (\mul), 5,33 mmol) y el cloroformiato de isobutilo (840 \mul, 6,60 mmol). Se deja bajo agitación, durante un tiempo de 30 minutos (min) y, a continuación, se añade la 4-aminoacetofenona (824 mg, 6,10 mmol). La solución, se mantiene bajo agitación, a una temperatura de 0°C, durante un tiempo de 2 horas y, a continuación, se evapora en seco. Se recoge el residuo en 50 ml de agua. El precipitado obtenido, se filtra, se lava con agua y, después con 50 mL de MeOH, en caliente. El precipitado blanco, se disuelve en DMF, procediendo a calentar y, a continuación, la solución obtenida, se filtra y se lava con MeOH. Se recupera el filtrado, y se evapora, para proporcionar 888 mg de 1b (2,46 mmol, 60%).

F 260°C. -IR(KBr): 3260, 2930, 2358, 1706, 1673, 1610, 1526, 1401, 1380, 1322, 1257, 1150 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 8,82 (s, 1H, NH-CO); 7,57 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H), 6,83 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-AH), 6,40, (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,32 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,12 (m 1H, CH-CH-NH), 3,11 (m, 1H, CH-S), 2,80 y 2,55 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 2,10 (s, 3H, CH_{3}); 1,60-1,24 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto para-hidrazona 2b

Se procede a disolver el compuesto 1b (870 mg, 2,4 mmol) en caliente, en etanol (99%, 8 ml) y, a continuación, se añade hidrazina monohidratada (995 \mul, 19,5 mmol). La solución, se calienta a reflujo, durante un transcurso de tiempo de 3 horas. El precipitado blanco obtenido, se filtra, y se lava con agua helada. Se obtienen, de este modo, 820 mg (90%) del producto 2b, en forma de una materia en polvo de color blanco.

F 305°C. -IR(KBr): 3281, 3183, 2930, 2857, 1698, 1658, 1593, 1521, 1459, 1401, 1325, 1263, 1187 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 9,68 (s, 1H, NH-CO); 7,52 (s, 4H, J = 9 Hz, Ar-H), 6,43 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,21 (S, 2H, NH_{2}); 4,29 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,81 y 2,56 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,32 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,97 (s, 3H, CH_{3}); 1,63-1,36 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto para-diazometano 3b

Se solubiliza 2b (200 mg, 0,53 mmol) en 10 ml de DMF. Se añaden, a continuación, 800 mg de MnO_{2}. Después de 30 minutos de agitación, a la temperatura ambiente, la mezcla, se filtra a través de una capa mixta de celite (0,5 cm)-tamiz molecular (0,5 cm, en forma de polvo)). La mezcla reactiva, se evapora en seco y, a continuación, se lava con éter y se seca. Se obtiene el compuesto 3b (190 mg 96%), en forma de una materia en polvo de color rosa.

F 180°C (dec.). -IR(KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524. 1510, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 10,18 (s, 1H, NH-CO); 7,88 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 7,7 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H), 6,41 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,34 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,12 ((m, 1H, CH-CH-NH)), 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 y 2,55 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 2,10 (s, 3H, CH_{3}); 1,60-1,34 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

Ejemplo 1.3

Síntesis del orto-BioPMDAM \bullet Compuesto biotina-orto-acetofenona Ic

Se solubiliza la D-biotina (1 g, 4,1 mmol), en 45 ml de DMF anhidro, en caliente. Se enfría a una temperatura de 0°C, bajo argón y, a continuación, se añaden, sucesivamente la N-metilmorfolina (590 \mul, 5,33 mmol) y el cloroformiato de isobutilo (840 \mul, 6,60 mmol). Se deja bajo agitación, durante un tiempo de 30 minutos (min) y, a continuación, se añade la 2-aminoacetofenona (824 mg, 6,10 mmol). La solución, se mantiene bajo agitación, a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 3 horas y 30 minutos y, a continuación, se evapora en seco. Se recoge el residuo en 50 ml de agua. El precipitado obtenido, se filtra, se lava con agua y, después con 50 mL de MeOH, en caliente. Se realiza una recristalización, procediendo a disolver el producto en MeOH, en caliente, y procediendo a precipitar mediante la adición de agua. El precipitado se filtra, se lava con agua y, después con éter, para proporcionar 1 g (2,95 mmol, 72%= del producto 1c, bruto.

F 150°C. -IR(KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 11,24 (s, 1H, NH-CO); 8,33 (d, 1H, J = 8,5 Hz, Ar-H); 7,97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-AH), 7,57 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7,18 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6,44, (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,80 y 2,55 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,61 (s, 3H, CH_{3}); 2,37 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,62-1,38 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto orto-hidrazona 2c

Se procede a disolver el compuesto 1c (500 mg, 1,38 mmol) en caliente, en etanol (99%, 8 ml) y, a continuación, se añade hidrazina monohidratada (572 \mul, 11,1 mmol). La solución, se calienta a reflujo, durante un transcurso de tiempo de 50 minutos. La solución se evapora en seco. El precipitado blanco obtenido, se filtra, y se lava con agua y, después, se seca con éter. Se obtienen, de este modo, 416 mg (80%) del producto 2c, en forma de una materia en polvo de color blanco.

F 161°C. -IR(KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 11,97 (s, 1H, NH-CO); 8,35 (d, 1H, J = 8 Hz, Ar-H), 7,45 (d, 1H, J = 7 Hz, Ar-H), 7,19 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-N), 7,04 (t, 1H, J = 7H, Ar-H); 6,61 (s, 2H, NH_{2}), 6,42 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,32 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH), 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,81 y 2,56 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 2,09 (s, 3H, CH_{3}); 1,63-1,36 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto orto-diazometano 3c

Se solubiliza 2c (200 mg, 0,53 mmol) en 10 ml de DMF. Se añaden, a continuación, 800 mg de MnO_{2}. Después de 15 minutos de agitación, la mezcla, se filtra a través de una capa mixta de celite (0,5 cm)-tamiz molecular (0,5 cm, en forma de polvo)). La mezcla reactiva, se evapora en seco y, a continuación, se lava con éter y se seca. Se obtiene el compuesto 3c (130 mg 65%), en forma de una materia en polvo de color rosa.

F 110°C. -IR(KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521, 1456 cm^{-1}.

-RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 9,37 (s, 1H, NH-CO); 77,26-7,00 (m, 4H, Ar-H); 6,43 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,15 ((m, 1H, CH-CH-NH)), 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,82 y 2,54 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,24 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 2,12 (s, 3H, CH_{3}); 1,63-1,37 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\newpage

Ejemplo 1.4

Síntesis del meta-BioDPDAM \bullet Compuesto meta-benzofenona 1d

Se solubiliza la D-biotina (500 mg, 2,05 mmol), en 23 ml de DMF anhidro, en caliente. Se enfría a una temperatura de 0°C, bajo argón y, a continuación, se añaden, sucesivamente la N-metilmorfolina (295 \mul, 2,67 mmol) y el cloroformiato de isobutilo (420 \mul, 3,28 mmol). Se deja bajo agitación, durante un tiempo de 30 minutos (min) y, a continuación, se añade la 3-aminobenzofenona (605 mg, 3,07 mmol). La solución, se mantiene bajo agitación, a una temperatura de 0°C, durante un tiempo de 2 horas y a continuación, se evapora en seco. Se recoge el residuo en 1 ml de MeOH y, a continuación, se añade agua. El precipitado obtenido, se filtra, se lava con agua y, después con éter, para proporcionar 810 mg (93% del producto 1d, bruto. Una recristalización en la pareja de productos MeOH-H_{2}O, proporciona 1d (630 mg, 72%), en forma de una materia en polvo, de color blanco.

RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 10,10 (s, 1H, NH-CO); 8-7,39 (m, 9H, Ar-H), 6,43 (s amplia, 1H, NH, CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH, CO-NH); 4,27 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,84 y 2,55 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,59-1,36 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto meta-hidrazona 2d

Se procede a disolver el compuesto 1d (350 mg, 0,83 mmol) en etanol 5,5 ml de etanol absoluto y, a continuación, se añade hidrazina monohidratada (140 \mul, 2,48 mmol). La solución, se calienta a reflujo, durante el transcurso de toda una noche. Después de la evaporación, el producto se recoge en 1 ml de etanol, y en agua. El precipitado blanco, se recristaliza: éste se disuelve en 1 ml de etanol y de agua. El precipitado blanco obtenido, se recristaliza; éste se disuelve en un mínimo de etanol, en caliente, y se añade agua, hasta la aparición de una ligera turbidez. Después del enfriamiento, el precipitado obtenido, se lava con agua y, después, se seca con éter. Se obtienen, de este modo, 264 mg (73%) del producto 2d, en forma de una materia en polvo de color blanco.

RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 9,99 (s, 1H, NH-CO); 9,80 (s, 2H, NH_{2}); 7,54 6,88 (m, 9H, Ar-H), 6,26 (s amplia, 1H, NH, CO-NH); 6,21 (s amplia, 1H, NH, CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,78 y 2,59 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,57-1,36 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

\bullet Compuesto meta-diazodifenilo 3d

Se solubiliza 2d (500 mg, 0,53 mmol) en 1 ml de DMF. Se añaden, a continuación, 80 mg de MnO_{2} activado. Después de 5 minutos de agitación, la mezcla, se filtra a través de una capa mixta de Celite (0,5 cm)-tamiz molecular (0,5 cm, en forma de polvo)). La mezcla reactiva, se evapora en seco. Se obtiene el compuesto 3d (47 mg, 100%), en forma de un aceite violeta.

RMN ^{1}H(200 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 9,95 (s, 1H, NH-CO); 7,60 6,9 (m, 9H, Ar-H), 6,42 (s amplia, 1H, NH, CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH), 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,83 y 2,59 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB}= 5Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,58-1,35 (m, 6H,(CH_{2})_{3}).

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 2 Reactivo de marcaje con Cy5: Cy5-CYPMDAM

28

\bullet Compuesto yoduro de 2-[4-(N-acetil-N-fenil-amino)buta-1,3-dienil]-1,2,3,3-tetrametil[3H]indolium 6

La mezcla de monoclorhidrato de malonaldehído-bis(fenilimina) 5 (18,3 g, 70,0 mm), de NaOAc (9,0 g, 110 mmol) y de yoduro de 1,2,3,3-tetrametil[3H]indolium 4 (4,25 g, 14,1 mmol) en anhídrido acético (75 ml) se calienta a una temperatura de 110°C, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos. Después del enfriamiento, se añade éter (350 ml) y el sólido marrón precipitado, se filtra, se lava con éter (3 x 100 ml). El sólido, se redisuelve en 150 ml de CH_{2}Cl_{2}, se filtra (eliminación de sales minerales) y, a continuación, se evapora, para proporcionar un sólido marrón (6,0 g, 90%).

RMN ^{1}H(CDCl_{3}); \delta = 8,64 (d, 1H, J = 12 Hz; 1-H); 8,14 (t, 1H, J = 16; 12 Hz; 3-H), 7,63-7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H; J = 15 Hz, 4-H), 5,82 (t; 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4,06 (s; 3H; NCH_{3}); (2,16 (s; 3H; -COCH_{3}); 1,74 (s; 6H; CH_{3}).

\bullet Compuesto Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil[3H]indolium 9

Se procede a mezclar el 2,3,3-trimetilindol 7 (10,0 g; 62,8 mmol) y el ácido 6-bromohexanoico 8 (12,3 g; 62,8 mmol) sin disolvente, y se calienta una temperatura de 110°C, durante un transcurso de tiempo de 12 horas, bajo atmósfera de argón. La mezcla reactiva, de aspecto pastoso rojo violeta, se lava con acetato de etilo (2 x 60 ml, se tritura la pasta con la espátula y se decanta el sobrenadante) y, a continuación, con acetona (50 ml, la pasta solidifica). El sólido rosa, se filtra y, a continuación, se seca al vacío (16,0 g; 73%).

\bullet Compuesto Cy5COOH 10

La mezcla del yoduro 6, (6,0 g, 12,7 mmol), del bromuro 9 (4,5 g, 12,7 mmol), y de NaOAc (2,6 g; 32 mmol) en anhídrido acético (35 ml) se calienta a una temperatura de 110°C, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos. Después del enfriamiento, se añade éter (150 ml) y, el precipitado, se filtra, y se lava con éter (3 x 50 ml). El sólido, se disuelve en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}, se filtra y se purifica por cromatografía sobre columna de SiO_{2} (eluyente: MeOH 5-10% CH_{2}Cl_{2}). Se obtienen 3,4 g (44%).

RMN ^{1}H(CDCl_{3}); \delta = 8,03 (t, 2H, J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H), 7,38-6,91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6,41 (d, 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6,31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07 (t, 2H, J = 7; 7 Hz, \alpha-CH_{2}); 3,68 (s; 3H; NCH_{3}); 2,47 (t, 2H, J = 7; 7 Hz; \varepsilon-CH_{2}); 1,71 (m; 18H; CH_{3}, \beta,\gamma y \delta-CH_{2}).

\bullet Compuesto de acoplamiento de la 3-aminofenona con el Cy5COOH 10 (producto 11)

A una solución de Cy5OOH 10 (1,19 g; 1,9 mmol), en 12 ml de CH_{2}Cl_{2}, se le añade N-metilmorfolina (360 \mul; 3,2 mmol). La solución, se enfría con un baño de hielo y, a continuación, se añade el cloroformiato de isobutilo (480 \mul, 3,7 mmol). Después de un tiempo de 5 minutos de agitación, se añade la 3-aminoacetofenona (488 mg; 3,6 mmol). Se agita la mezcla, a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 3 horas. Procediendo a añadir 250 ml de éter, se obtiene un sólido pastoso. Después de la agitación, se deja reposar el sólido, en el fondo del matraz, y se decanta el sobrenadante. Se procede a añadir, de nuevo, 50 ml de éter, y se tritura con una espátula, para obtener un sólido. Éste, se filtra, se lava con agua, con éter y, a continuación, se seca bajo la acción de vacío. El producto (yoduro), se disuelve, a continuación, en etanol, se pasa sobre columna de amberlite IRA900(Cl^{-}; 15 g). La solución etanólica recogida, se evapora en seco y, a continuación, se pasa sobre columna de SiO_{2}. Se obtienen 0,93 g (77%) de sólido azul.

\bullet Compuesto Cy5-hidrazona 12

A una solución de acetofenona 11 (0,93 g; 1,46 mmol) en 5 ml de etanol absoluto, se le añade hidrazina monohidratada (180 \mul; 3,1 mmol), la cual se agita a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 7 horas. Se añaden 50 ml de éter y, el precipitado, se filtra y se lava con éter. Se disuelve el producto bruto en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}, se filtra la solución y, a continuación, se concentra a un volumen de 10 ml. El producto, se precipita mediante la adición de 100 ml de éter, se filtra, se lava con éter y se seca bajo la acción de vacío. Se obtienen 540 mg de producto 12 (57%).

\bullet Compuesto Cy5PMDAM 12 bis

A una solución de 100 mg de hidrazona 12 en 2 ml de DMF, se le añaden 300 mg de MnO_{2} y se procede a agitar, de una forma vigorosa, durante un tiempo de 10 minutos. Se filtra la suspensión a través de una capa de celite, y se lava con DMF (3 x 500 \mul). Se añaden 50 ml de éter y, el aceite depositado, se tritura con una espátula y, el sobrenadante, se decanta. Se repite tres veces la operación de lavado, con 25 ml de éter y, el sólido de esta forma obtenido, se filtra y se seca. Se obtienen 65 ml (65%) del producto 12 bis. La pureza del producto, es de aproximadamente un 80-85% (RMN^{1}H).

Ejemplo 3 Otros reactivos sintetizados

Ejemplo 3.1

Síntesis de para-nitrofenildiazometano (NPDAM)

La 4-nitrobenzaldehídohidrazona, se encuentra comercialmente obtenible en el mercado (referencia 28,118-2 Aldrich, Francia).

Se trabaja, de esta forma, sobre 600 mg (3,64 mmol) de este producto, el cual se disuelve en 9 ml de THF. La solución, se deja bajo agitación, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos y, a continuación se añaden, con precaución 1,26 g (4 equivalentes, 14,56 mmol) de MnO_{2}. La mezcla, se deja bajo agitación, durante un tiempo de 10 minutos y, a continuación, se filtra. El filtrado recuperado, se evapora en seco. Después de lavado con pentano, el compuesto para-nitrofenildiazometano, se obtiene en forma de una materia en polvo, de color naranja vivo, con un rendimiento de un 79% (468 mg, 2,87 mmol).

F 80-82°C.-RMN ^{1}H (300 MHz), DMSO-d_{6})\delta = 8,11 (d, 2H, H = 9 Hz, Ar-H_{3}); 7,18 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H_{2}); 6,06 (s, 1H, CH_{1}-N_{2}).

Ejemplo 3.2

Síntesis del fenilmetildiazometano (PMDAM) Hidrazona de la acetofenona

Se diluye la acetofenona (2,0 g, 16 mmol) en 16 ml de etanol absoluto y, a continuación, se añade la hidrazina (2,3 ml, 48 mmol). Se lleva a reflujo. Después de un transcurso de 2 horas, se evapora el disolvente y se recoge el resido, en éter (150 ml). Se procede a lavar con agua (100 ml). Después del secado sobre Na_{2}SO_{4}, se evapora el éter. Se obtiene un aceite amarillo pálido (1,5 g, 11 mmol, 69%).

Fenilmetildiazometano (PMDAM)

Se disuelve la hidrazona (150 mg, 1,1 mmol) en 3 ml de THF. Se añade el MnO_{2} (480 mg, 5,5 mmol). Se procede a agitar durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. El medio, se colorea en rojo. Se filtra y se evapora el disolvente. Se obtiene un aceite rojo (145 mg, 100%). Este reactivo, se utiliza sin purificación.

\newpage

Ejemplo 3.3

Síntesis del difenildiazometano (DPDAM)

La benzofenona-hidrazona, se encuentra comercialmente disponible en el mercado (referencia B 960-2, Aldrich, France).

Se trabaja, de este modo, sobre 196 mg (1,0 mmol), los cuales se disuelven en 5 ml de THF. Se añaden 435 mg (5 eq., 5,0 mmol) de MnO_{2}, la mezcla se deja en régimen de agitación durante un tiempo de 10 minutos y, a continuación, se filtra. El filtrado recuperado, se evapora a seco. Se obtienen 193 mg (0,99 mmol). Este reactivo, se utiliza sin purificación.

Ejemplo 3.4

Síntesis del NVDAM

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29

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La síntesis, se realiza según el protocolo descrito anteriormente, arriba, a partir del 6-nitroveratraldehído (Aldrich, referencia 27,960-9).

Ejemplo 4 Síntesis del derivado bitotinilado a partir del NPDAM

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30

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M.E. Vall et al. J. Med. Chem. 1993, 36, 2689.

El derivado 2-amino-4-nitro-benzaldehído, se prepara según el procedimiento de ME Vall et al., referenciado arriba.

La preparación del diazometano NPDAM, es idéntica a la descrita en el ejemplo 3.1 anterior.

Ejemplo 5 Preparación de los ácidos nucleicos ADN

Los amplicones ADN, se generan por PCR, a partir de dianas de ADN genómico Mycrobacterium tuberculosis 16S (10^{+4} copias como dianas de partida), utilizando el equipo, a modo de kit, Fast Start de Roche, 0,02 mM de cada desoxirribonucleótido (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3 \muM de cebadores y 0,4 \mul de enzima.

\newpage

Los parámetros de la PCR, son los siguientes:

\sim95°C: 4 minutos y, a continuación, 35 ciclos (95°C: 30 segundos; 55°C: 30 segundos; 72°C: 30 segundos), a continuación, 4°C.

Los amplicones, se analizan cualitativamente por eletroforesis sobre gel de agarosa (1,5%, TBE 0,5X). El volumen depositado, es de 5 \mul y, la migración, se efectúa durante un tiempo de 20 minutos a 100 volt (V). La visualización de los productos PCR, se realiza bajo lámpara de UV, después de la coloración con bromuro de etidio.

Las condiciones para el cultivo, la extracción de mycobacterias, así como los cebadores de amplificación, se facilitan en la solicitud de patente internacional WO-A-99/65 926.

Ejemplo 6 Reactividad de los reactivos de marcaje sobre los nucleótidos modelos

La síntesis de los reactivos de marcaje, se describe en los ejemplos 1 a 4 que se facilitan anteriormente, arriba. El PDAM descrito en la presente invención, se encuentra comercialmente disponible en el mercado (referencia P1405, Molecular Probes, Eugene, OR).

Ejemplo 6.1

Marcaje de los monómeros UMP 3'-fosfato

La reactividad de los reactivos de marcaje que portan una función diazometilo, se ha estudiado, para controlar la especificidad de la reacción.

Se ha puesto a punto un protocolo, el cual consiste en estudiar esta reactividad por electroforesis capilar sobre un compuesto modelo, el 3'-UMP (Uridina 3'-monofosfato, referencia U1126 Sigma), en las condiciones standard siguientes:

3'-UMP 0,04 mM; H_{3}BO_{3} 2,0 mM; Marcador 2,0 mM [añadido con un disolvente orgánico apropiado (THF, AcOEt ó DMSO)]: Disolventes H_{2}O-CH_{3}CN-Disolvente orgánico (relación 1/3/1).

Se procede a repartir esta solución en diez fracciones de 250 \mul, las cuales se calientan a una temperatura de 60°C. Después de una duración definida, cada fracción, se trata con 250 \mu de diclorometano. Después de agitación, se elimina la fase orgánica (fase inferior). Se procede a repetir esta operación, todavía, dos veces. Después de centrifugación (5 min., 500 revoluciones por minuto (rpm), la fase acuosa, se analiza por electroforesis capilar. Las condiciones de electroforesis capilar (EC), son las siguientes: el análisis de EC, se efectúo mediante el aparato Beckman P/ACE 5000. Se utilizó un capilar de sílice fundido, no tratado (75 \mum x 50 cm). El voltaje aplicado, era de 30 kV (polaridad normal) y, la temperatura del capilar, se mantuvo a un nivel de 23°C. Los electroforegramas, se registraron a 254 nm. La solución tampón borato (0,1 M, pH 8,3), se preparó a partir del ácido bórico, ajustando el pH con una solución NaOH, y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. Las muestras, se inyectaron bajo presión (0,5 psi, 5 segundos). Cada análisis, viene precedido de la regeneración del capilar, mediante pasadas sucesivas de una solución de NaOH (0,1 M, 2 min.) y, de tampón borato (2 min.), bajo presión (20 psi).

La reacción, se efectúa procediendo a variar el tiempo de reacción entre 0 y 4 horas, tal y como se indica sobre cada figura y, los resultados, se presentan para cada reactivo sometido a test de ensayo, sobre las figuras 2A a 2I, con la concentración del reactivo utilizado.

El tiempo de reacción, se indica sobre cada electroforegrama.

Con todos los reactivos sometidos a test de ensayo, se obtiene la formación exclusiva de un producto monoalquilado, lo cual prueba la especificidad de la reacción.

La reactividad, es decir, el tiempo de reacción media del reactivo, sobre el 3'-UMP, puede calcularse, de este modo, por comparación de la altura de los picos y, los resultados obtenidos, se presentan en la tabla 1 que se facilita abajo, a continuación (condiciones standard, descritas anteriormente, arriba):

TABLA 1 Reactividad (tiempo de vida medio) de los reactivos

31

* Con los o-BioMPDAM, la reactividad, se estima, debido al hecho de que en las condiciones de concentración de 2 mM en reactivo de marcaje, la reacción, se completa en menos de 5 minutos. La figura 2I, utiliza, por lo tanto, una concentración de 0,2 mM.

Puede por lo tanto notarse, en la tabla, el hecho de que, al ser muy específica la reacción, y que ésta no conduce a subproductos para los reactivos sometidos a test de ensayo, es posible aumentar la concentración del reactivo de marcaje, sin consecuencias, desde el punto de vista de la selectividad sobre el marcaje.

Así, de este modo, para el reactivo PDDAM, si se procede a aumentar la concentración a 20 mM (véase la figura 2C), la reactividad (tiempo de reacción medio) es de 2 horas. Se obtienen los mismos resultados, con el BiODPDAM (figura 2F), en donde, la reactividad, es de 45 minutos, a una concentración de 30 mM.

Ejemplo 6.2

Tests de ensayo de diferentes nucleótidos 2'-monofosfato

De tal forma que se evite todo error de interpretación, se procedió a efectuar un estudio complementario sobre el marcador meta-BioPMDAM, tomado a título de ejemplo significativo, con los otros nucleótidos 3'-monosfosfato.

Los nucleótidos tomados a test de ensayo, son los siguientes: 3'AMP (referencia 85,194-9, Aldrich), 3'-GMP (referencia 151214, ICN), 3'-CMP (referencia, Sigma), 3'-TMP (serie desoxirribo)(referencia T1008, Sigma). Los electroforegramas obtenidos con los diferentes nucleótidos, se representan sobre las figuras 3A a 3D. Los tiempos de reacción indicados sobre la figura 3A, se indican sobre las figuras 3B a 3D.

Sea cual fuere el nucléotido de partida (serie ribo o desoxirribo), observamos la formación exclusiva del producto alquilado en 130 minutos, a 60°C. Es importante el tomar debida nota en cuanto al hecho de que, en el caso de la guanina (la base más activa con los reactivos alquilantes usuales), sólo se observó el producto alquilado con fosfato, probando la muy gran selectividad de la reacción.

Este estudio, permite igualmente el verificar que, la velocidad de la reacción, no depende de la naturaleza del nucléotido, en calidad de substrato.

Ejemplo 6.3

Estudio de un nucléotido

Se procedió a efectuar la alquilación del nucléotido ApUp (referencia A4298, Sigma), con el meta-BioPMDAM, con el fin de verificar la selectividad de la reacción, con respecto al fosfato terminal, con relación al fosfato internucleótidico. El seguimiento de la reacción por electroforesis, se representa en la figura 4. Las condiciones, son las condiciones standard del ejemplo 6.1, ya descrito.

Se observa la formación exclusiva de un solo producto, el cual muestra una buena selectividad del reactivo meta-BioMPDAM, con respecto al fosfato terminal, con relación al fosfato internucleotídico.

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Ejemplo 6.4

Caracterización de los aducidos sobre los cuatro (4) nucleótidos 3'-monofosfato

Con objeto de asegurar la 3-UMP (en forma de sal disódica; 9,3 mg, 21,1 \mumol), en 2 ml de una solución acuosa 0,1 M de H_{3}BO_{3}, y a continuación, se añaden, de una forma sucesiva, 2 ml de CH_{3}CN, 6 ml de MeOH y, a continuación, el reactivo meta-BioPMDAM (75 mg; 0,20 mmol). La reacción, se realiza durante un transcurso de tiempo de 2,5 horas, a la temperatura ambiente. Ésta, se sigue mediante electroforesis capilar. Se añaden 3 ml de agua y, a continuación, el exceso de reactivo, se elimina mediante la extracción con CH_{2}Cl_{2}. La fase acuosa. Se evapora. El residuo, se disuelve en una pequeña cantidad de agua, y se purifica mediante pasada sobre una columna de gel de sílice, en fase inversa (Lichoprep RP-18, Merck; elución MeOH/H_{2}O (20/80). Se obtienen 10 mg (69%) del aducido del 3'-UMP.

Los espectros de RMN del protón, obtenidos para los aductos 3'-NMP (N = G, U, C, A), se presentan en las figuras 5A a 5D). La identificación de los aducidos, se realizó mediante experiencias de RMN, de dos dimensiones ^{1}H/^{1}H (CSY). Se presentan dos diasteroisómeros para cada uno de estos educidos, en una relación 1/1.

Se presentan un solo pico, para la RMN del fosfato, hacia un valor 0 pmm (300 MHz, D_{2}O).

Estas experiencias, demuestran el hecho de que, la reacción, es realmente específica, y que el marcaje, tiene lugar, realmente, sobre el fosfato. No hay reacción secundaria de alquilación sobre las bases. Los productos de marcación, se adaptan por lo tanto, de una forma particular, para una etapa de hibridación.

Ejemplo 7 Estudio de estabilidad a la temperatura

Todos los derivados del diazometano, descritos sobre la tabla 1 del ejemplo 6.1 que se ha facilitado anteriormente, arriba, se conservan en estado sólido, en un congelador, a una temperatura de -20°C, durante un transcurso de tiempo de por lo menos (3) meses, y no se observa ninguna pérdida de reactividad.

Se procede a determinar la estabilidad a la temperatura ambiente sobre el estrato o felpudo, mediante RMN^{1}H, para los reactivos, el NPDAM y el meta-BioPMDAM. No hemos observado ninguna descomposición dejando el NPDAM durante un transcurso de tiempo de 1 mes, sobre el estrato, sin precaución particular. Observamos aproximadamente un 50% de descomposición, dejando el meta-BioPMDAM sobre el estrato, durante un transcurso de tiempo de (25) días.

La estabilidad a la temperatura del reactivo de marcación, es una característica esencial. En efecto, el destino final de un reactivo de este tipo, para una aplicación industrial, es un equipo de marcación, a modo de "kit". Un reactivo que no sea estable, por lo menos durante un transcurso de tiempo de quince (15) días, a una temperatura de -20°C, de una forma preferente, de un (1) mes, es invendible. Incluso si existen medios de almacenaje y de expedición, hasta una temperatura de -110°C, existe una relación entre la estabilidad a una temperaturas de -110°C y a una temperatura de -20°, y es por ello que, el valor de quince (15) días a una temperatura de -20°C, de una forma preferible, de (1) mes, a una temperatura de -20°C, es un mínimo industrial. Más allá de los -110°C, los laboratorios, no disponen de equipos necesarios (congelador) para almacenar estos reactivos, desde el punto de vista del utilizador y del fabricante, y no existe un medio simple del tipo carbo-hielo, para expedirlos, desde el punto de vista del fabricante.

En cuanto a lo concerniente a la estabilidad a la temperatura ambiente, una estabilidad de algunas horas, de una forma preferente, de (1) día, es suficiente para permitir, al utilizador, el efectuar el marcaje.

Ejemplo 8 Estudio de la fragmentación del ADN

Ejemplo 8.1

Hidrólisis de diferentes nucleósidos en medio ácido

La finalidad de este estudio, es la demostrar la diferencia, en términos de estabilidad, en un pH ácido, entre los nucleósidos naturales, los nucleósidos modificados, así como los nucleósidos del tipo purínicos y pirimidínicos. Este estudio, permite igualmente, el controlar, de una forma mejor, la fragmentación del ADN, teniendo en cuenta su formación en bases.

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En este estudio, se emplearon dos nucleósidos modificados, la 8-bromo-2'-desoxiadenosina (8-BrdA) y la 5-bromo-2'-desoxicitidina (5-BrdC), así como los cuatro (4) nucleósidos naturales (dA, dC, dG, y dT).

Se procedió a incubar 50 nanomoles (mmol) de cada nucleósido, en 50 mM de formiato de sodio, pH 3, a una temperatura de 95°C. Los tiempos de incubación, varían de 0 a 45 minutos. Después del secado bajo la acción del vacío, y recogida mediante 20 \mul de agua pura, las muestras (10 nmol), se analizaron, a continuación, mediante HPLC, en fase inversa. Los resultados obtenidos, se facilitan en forma de porcentaje de hidrólisis del nucleósido de partida (en la ordenada), con relación al tiempo de incubación en minutos (en la abscisa); véase, a dicho efecto, la figura 8.

Las curvas de la figura 8, muestran el hecho de que, la modificación de la adenina, en la posición 8, mediante un átomo de bromo, convierte a este nucleósido en menos estable que el nucleósido natural. Por otra parte, los resultados obtenidos, muestran el hecho de que, en las condiciones utilizadas, la despurinación, es mucho más importante que la despirimidación.

Este estudio, muestra el hecho de que, la fragmentación del ADN, mediante la despurinación y la despirimidación, puede controlarse, procediendo a optimizar las condiciones de hidrólisis, o procediendo a incorporar, bien ya se bases modificadas menos estables que las bases naturales, o bien ya sea bases que puedan modificarse e hidrolizarse, después de su incorporación.

Ejemplo 8.2

Fragmentación del ADN de doble hebra, incorporando, o no, un nucleósido modificado

Se procedió a realizar tres amplificaciones por PCR, en paralelo, a partir de ADN genómico diana Mycobacterium tuberculosis 16S (10^{+4} copias de partida), utilizando el equipo, a modo de "kit" Fast Start de Roche, 0,2 mM de cada desoxirribonucleótido (d-ATP, d-CTP, d-GTP, de-TTP), 0,3 \muM de cebadores y 0,4 \mul de enzima.

Los parámetros de la PCR, son los del ejemplo 5.

En el primer caso, el protocolo, se utiliza tal cual: caso de la PCR denominada natural.

En el segundo caso, el protocolo, se modifica para obtener una PCR a un 30% de 8-Br-dATP. Éste se realiza introduciendo 0,2 mM de d-CTP, d-GTP y d-TTP. Se introducen, igualmente, 0,14 mM de d-ATP y 0,06 mM de 8-Br-dATP. (La 8-BrdATP, de comercial (referencia N-2005-1, TriLink Biotechnologies, San Diego CA)).

En el tercer caso, el protocolo, se modifica para obtener una PCR a un 50% de 8-Br-dATP. Éste se realiza introduciendo 0,2 mM de d-CTP, d-GTP y d-TTP. Se introducen, igualmente, 0,1 mM de d-ATP y 0,1 mM de 8-Br-dATP.

El estudio de la fragmentación sola de estos amplicones, se realiza en las condiciones descritas anteriormente, arriba: 50 mM de formiato de sodio, pH 3 a una temperatura de 95°C.

El análisis, se efectuó sobre gel desnaturalizante de poliacrilamida (8% de poliacrilamidaa, 4 M urea, 1 X TBE), utilizando una coloración con bromuro de etidio.

Después de un tiempo de 15 minutos de incubación, a una temperatura de 95°C, en 50 mM de formiato de sodio, pH 3, no era visible ninguna diferencia, entre las tres (3) dianas. En todos los casos, observamos una fragmentación total de los amplicones PCR.

La despurinación de los amplicones PCR, se realizó, igualmente, a diferentes pH y a diferentes temperaturas y tiempos de incubación. El análisis sobre gel, en las condiciones expuestas anteriormente, arriba, muestra el hecho de que, a un pH 3, la fragmentación, es total, después de solamente 10 minutos de incubación, a una temperatura de 95°C. A este pH, la fragmentación, es casi total, a 60°C, después de 30 minutos de incubación.

A un pH 3, son necesarios 3 minutos, para la obtención de una fragmentación total de los amplicones ADN, igualmente, a una temperatura de 95°C. Este resultado, es muy interesante, y muestra el hecho de que, el sitio abásico, a un pH ácido, es inestable y conduce, por lo tanto, a la fragmentación de la cadena de ADN, sin ningún otro tratamiento particular.

Ejemplo 9 Marcaje y fragmentación del ADN, mediante el derivado meta-bioPMDAM (3a), en dos etapas

El derivado meta-BioPMDAM (3a), se obtuvo según el esquema reactivo descrito en el ejemplo 1.1.

Los amplicones ADN, se prepararon mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5.

Marcaje

A 10 \mul de PCR, se le añadieron 38 \mul de agua pura (sigma), 50 \mul de formiato de sodio, a un pH 3 (100 mM en agua pura) y, la mezcla, se incubó, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C. A continuación, se añadieron, enseguida, 2 \mul de meta-bioPMDAM (100 mM en DMSO). La solución, se mezcló mediante vórtice (mezclador de torbellino) y, a continuación, se incubó durante 15 minutos, suplementarios, a
60°C.

Los ensayos, se realizaron por duplicado, con el fin de poder analizar la fragmentación del ADN, sobre gel, y la eficacia del marcaje, mediante hibridación de la serie de distribución de ADN.

Purificación

La purificación, se realizó sobre columna QIAQUICK® (Nucleotide removal kit, Qiagen, Hilden, Alemania). El protocolo de purificación, utilizado, es el recomendado por el proveedor.

Después de la purificación, el eluído, se transfirió al interior de un tubo limpio, el cual contenía 400 \mul de tampón de hibridación (1,75 ml, 20X SSPE; 2,9 ml Betaína 5M; 290 \mul DTAB 0,1M; 10 \mul Antiespumante 30%. Las referencias de estos substratos, son para:

\bullet la betaína referencia B-2754 Sigma, y

\bullet la DATB referencia D-5047 Sigma.

La solución, se mezcló mediante vórtice (mezclador de torbellino) y se incubó durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95°C, con el fin de separar las hebras de ADN que no se separaron durante la etapa de marcaje, durante la fragmentación (etapa de desnaturalización). El tubo, se sumergió, a continuación, en una mezcla de agua-hielo, a una temperatura de 0°C, antes de la hibridación, sobre series de disposición de ADN.

Hibridación sobre serie de distribución de ADN

Después de la etapa de marcaje, durante la fragmentación, los fragmentos obtenidos, se hibridan sobre series de disposición de ADN, concebidas para el análisis de la región 213-415 de la secuencia M20940 "Genbank", del ARN 16S de Microbacterium tuberculosis. Esta serie de distribución de ADN, se describe en A. Troesch et al., J. Clin. Microbiol., 37, páginas 49-55, 1999.

Las etapas de hibridación, se realizaron sobre las estaciones fluidas (Affimetrix, Santa Clara, Ca), utilizando el protocolo de hibridación y los tampones descritos en A. Troesch et al., J. Clin Microbiol. 37 (1), páginas 49-55, 1999. Es necesaria una etapa suplementaria, con objeto de determinar la biotina (detección indirecta).

La hibridación, se determina mediante el acoplamiento de la estreptividina marcada con la ficoeritrina (PE), la cual interactúa con la biotina de la meta-BioMPDAM, en las condiciones siguientes: 30 \mul de agua pura; 300 Ml de tampón tris 100 mM, pH 7/NaCl 1M/tween 0,05%/antiespumante 0,005%; 6 \mul de MSA (50 mg/ml); 6 \mul de estreptavidina-PE (300 \mug/ml).

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Las referencias de estos substratos, son para:

\bullet La estreptavidina-Ficoeritrina: referencia R0438, Dako, Dinamarca,

\bullet La estreptavidina-CY5; referencia C0050, Dako, Dinamarca,

\bullet el antiespumante referencia M5-575, Ultra Additives Inc. y

\bullet El Tween referencia P-749, Sigma.

Lectura de la serie de distribución de ADN

La lectura de la fluorescencia emitida en la superficie de la serie de distribución de ADN, después del marcaje y de la hibridación, así como la generación de los datos, en términos de intensidad de la señal y del porcentaje de homología, se realizan mediante los sistemas de lectura y el logicial proporcionados por Affimetrix (GeneChip® Instrument System y GeneChip® Information System, Santa Clara, CA).

El sistema de lectura, proporciona intensidades de señal y ruido de fondo, expresados en rfu ("relative fluorescence unit" -unidad de fluorescencia relativa-). El porcentaje de homología, se proporciona con relación a una secuencia de referencia, la cual es, en este caso, la secuencia de Mycobacterium tuberculosis.

Los resultados, en términos de intensidad media de la señal (I), del ruido de fondo (B) y del porcentaje de homología (%), se proporcionan en la tabla 2, la cual se facilita abajo, a continuación:

De una forma general, se considera que, un porcentaje de homología superior al 90%, es un resultado satisfactorio, si bien se busca, en general, un resultado superior al 95%. Por encima del 90%, los valores, ya no se indican, debido al hecho de que, éstos, no son satisfactorios, en el caso de la serie de distribución de ADN Micobacterias. Una intensidad elevada con un ruido de fondo débil, es el segundo resultado buscado en los ejemplos que se facilitan a continuación. En todos estos resultados, el ruido de fondo B, se deduce de la intensidad media I.

Análisis sobre gel de poliacrilamida

Las muestras destinadas a analizarse sobre gel, se secan al vacío, se recogen mediante 10 \mul de agua pura y 10 \mul de azul formamida 2X.

La migración, se efectúa sobre gel de acrilamida 8%, en TBE 1X, una hora después, a 150 V.

Para la fragmentación del ADN, se utilizó un pH ácido. Efectivamente, a este pH, el fenómeno de despurinación, engendra sitios abásicos muy inestables, que conducen a una fragmentación casi inmediata de las secuencias de ADN, a una temperatura elevada. Este tipo de fragmentación, produce fragmentos ADN-5'-fosfato.

El análisis sobre gel, muestra que, la incubación de los amplicones PCR, a una temperatura de 60°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en solución en el tampón formiato (50 mM, pH 3), conduce a una fragmentación total de estos amplicones. Esto nos permite evaluar el marcaje, durante la fragmentación de los amplicones ADN, en presencia del marcador meta-bioPMDAM.

Los resultados de marcaje, durante la fragmentación de los amplicones ADN, en términos de porcentaje de homología, de intensidad de las señales y del ruido de fondo, se proporcionan en la tabla 2 que se facilita abajo, a continuación.

TABLA 2 Marcaje y fragmentación de los amplicones ADN en términos de porcentaje de homología

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Este ejemplo, muestra el hecho de que, los derivados de la invención, pueden utilizarse para el marcaje de los fragmentos de ADN producidos mediante amplificación enzimática, en un protocolo en dos etapas. Éstos pueden utilizarse, igualmente, para el marcaje del ADN natural, no amplificado.

Ejemplo 10 Marcaje del ADN mediante el derivado Cy5-PMDAM (12 bis)

El marcaje del ADN mediante este nuevo marcador que porta la función diazometilo, se evaluó mediante un fragmento de ADN sintético.

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El reactivo de marcaje Cy6-PMDAM (bis), se prepara según el protocolo descrito en el ejemplo 2.

Se procedió a preparar un oligodesoxirribonucleótido (ODN) de veinte (20) meros, según el procedimiento denominado fosforamidita. Se introduce un fosfato en la extremidad 5', mediante un reactivo de fosforilación standard, compatible con la química de la fosforamidita. La secuencia de este ODN, se encuentra constituido por todas las bases naturales del ADN (secuencia del ODN: 5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'). Esta secuencia, es complementaria de la secuencia de captura de una serie de distribución de ADN, denominada "modelo", sintetizada según la tecnología Affimetrix. Esta serie de distribución de ADN, contiene sondas de captura idénticas en secuencia, y que se encuentran repartidas sobre su superficie. La lectura de esta serie de distribución de ADN, proporciona informaciones en cuanto a las prestaciones técnicas o rendimiento del marcaje, en términos de intensidad, pero no del resultado de la
homología.

Marcaje

Se procede a añadir, a 50 picomoles (pmoles) de este ODN, 10/l de Cy5-PMDAM (100 mM en DMSO). El volumen final, es de 100 \mul. Después de la homogeneización, se realiza la incubación, a una temperatura de 60°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos.

Purificación y lectura

La purificación para eliminar el exceso de reactivo de marcaje, se realiza según el ejemplo 9. La lectura sobre la serie de distribución de ADN, se efectúa según el ejemplo 17.

Resultados

La media de intensidades de marcaje (I), leída sobre una serie de distribución de ADN, es de 16 644 rfu, para un ruido de fondeo (B) de 450 rfu.

Este nivel de intensidad, es muy elevado, y muestra el hecho de que, el reactivo de marcaje Cy5-PMDAM (12 bis), es del todo compatible con el marcaje de los fragmentos de ADN, sobre el grupo fosfato.

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Ejemplo 11 Marcaje y fragmentación del ADN, mediante el reactivo PDAM

Ejemplo 11.1

Marcaje mediante el 1-Pirenildiazometano (PDAM)

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El PDAM, se obtiene de procedencia de la firma Molecular Probes (Eugene, OR), y se solubiliza en DMSO anhidro.

Como modelos, se utilizaron dos ODN de veinte (20) meros: un ODN de 20 meros 5'-hidroxilo y el mismo ODN de 20 meros, que portan un fosfato en la extremidad 5'. La secuencia de ODN, se describe en el ejemplo 10. La reacción de marcaje, se realizó en una mezcla de un 50% de DMSO y 1,5 mM en 1-Pirenildiazometano (PDAM), a una temperatura de 60°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos o de una hora.

La eficacia de marcaje, se evaluó por cromatografía sobre capa fina (en fase normal), en un eluyente isopropanol amoníaco/agua, 60/10/30. Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, el acoplamiento sobre el ODN 5'-fosfato, es total. Hace falta un transcurso de tiempo de una hora, para obtener un acoplamiento parcial sobre el ODN 5'-hidroxilo, es decir, de aproximadamente un 50%.

Los resultados del ejemplo 6, se confirman sobre una secuencia modelo de 20 bases, en cuanto a lo concerniente al marcaje preferencial de los reactivos que portan una función diazometilo sobre el fosfato terminal. El marcaje sobre un fosfato intranucleotídico, no es un inconveniente redhibitorio, puesto que, ello, puede conducir a un aumento de la sensibilidad, mediante la introducción de más de un marcador sobre los fragmentos de ácido nucleico. Esto permite el que, el ácido nucleico, pueda hibridarse con una buena sensibilidad sobre la diana complementaria, al mismo tiempo que se conserve una buena especificidad de hibridación.

La persona experta en arte especializado de la técnica, puede controlar, mediante reacciones de optimación, la especificidad del marcaje, jugando, por ejemplo, sobre el reactivo marcaje, el tiempo de reacción y la temperatura, para tener un marcaje exclusivo sobre el marcaje terminal.

Ejemplo 11.2

Estudio cinético de la reacción de marcaje, mediante el PDAM

Este estudio, se realizó utilizando ODN 20 meros 5'-fosfato, en las condiciones precedentes, procediendo a variar el tiempo de reacción. Los rendimientos de marcaje, se evaluaron mediante análisis de cromatografía líquida a alta presión (CLHP), en fase inversa, en las condiciones siguientes:

Columna de fase inversa del tipo Phase inverse colonne Spheri-5 RP-18-18,5 \mum, 220x 4,6 mm (Perkin Elmer). Los tampones y el gradiente utilizados, eran los siguientes:

\bullet Tampón A: 0,1 M TEAA; Tampón B = 50% Tampón A + 50% CH_{3}CCN, y

\bullet Gradiente de 10 a 50% de B en 30 minutos a 1 ml/minuto, a la temperatura ambiente.

Los resultados obtenidos, se representan sobre la figura 9, representándose, en la abscisa, el tiempo de reacción expresado en minutos y, en la ordenada, el porcentaje de marcaje.

El rendimiento, es próximo a un 90%, después de únicamente 10 minutos de incubación a una temperatura de 60°C.

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Ejemplo 11.3

Efecto de la temperatura, sobre el marcaje con PDAM

El marcaje, se realizó utilizando ODN 20 meros 5'-fosfato, en las condiciones precedentes, procediendo a variar la temperatura de incubación, y con tiempo de incubación de 10 minutos, en cada caso.

Los rendimientos de marcaje, se evaluaron mediante análisis de CLHP, en fase inversa.

Los resultados obtenidos, se representan sobre la figura 10, representándose, en la ordenada, el porcentaje de marcaje y, en la abscisa, la temperatura de reacción en °C.

Es muy importante el tomar debida nota en cuanto al hecho de que, a la misma temperatura (25°C), observamos un marcaje del ODN. Después de un transcurso de tiempo de 10 minutos de incubación, a una temperatura de 25°C, el rendimiento del marcaje, es de aproximadamente un 25%. A temperaturas superiores a un 50%, se obtienen unos rendimientos superiores al 80%.

Esto muestra la eficacia y la flexibilidad de esta química de marcaje del ADN, mediante reactivos que portan la función aldehído.

Ejemplo 12 Marcaje y fragmentación de los amplicones ADN obtenidos mediante amplificación PCR, con el reactivo de marcación meta-bioPMDAM (3a)

El derivado meta-bioPMDAM (3a), se obtuvo según el esquema reactivo descrito en el ejemplo 1.1.

Los amplicones ADN, se prepararon mediante amplificación PCR, según el procedimiento descrito en el ejemplo 5.

Ejemplo 12.1

Comparación del marcaje con su fragmentación a. Marcaje en las condiciones de fragmentación

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de formiato sódico pH 3 (50 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 30 minutos a 60°C.

b. Marcaje sin fragmentación

A 10 \mul de PCR, se le añaden 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 30 minutos a 60°C.

El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 9.

Resultados TABLA 3 Comparación del marcaje sin fragmentación

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Los resultados en la tabla 3 facilitada arriba, muestran el hecho de que, la media de las intensidades obtenidas, se encuentra al mismo nivel que el ruido de fondo (500 rfu). El marcaje, durante la fragmentación, proporciona un nivel de intensidad bien superior (aproximadamente 4000 rfu) y es un porcentaje muy bueno de homología. Las combinaciones de las dos etapas, representan bien, por lo tanto, una mejora significativa para la detección de un ácido nucleico de longitud superior a cien nucleótidos.

Ejemplo 12.2

Efecto de la desnaturalización antes de la hibridación, sobre serie de distribución de ADN

Se procedió a realizar dos reacciones de marcaje, en paralelo, en dos tubos separados, según el protocolo siguiente: A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de formiato sódico pH 3 (50 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 30 minutos a 60°C.

Después de purificación sobre columna (ejemplo 9), la solución procedente del primer tubo, se incuba durante un tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95°C (con el fin de desaparear la doble hebra del ADN) y, a continuación, el tubo se sumerge en una mezcla de agua-hielo, a una temperatura de 0°C, hasta la hibridación sobre serie de distribución de ADN.

La solución procedente del segundo tubo, se hibrida sobre serie de distribución de ADN, sin desnaturalización previa.

Los fragmentos biotinilados hibridados sobre las sondas de captura, en la superficie de la serie de distribución de ADN, se revelan, mediante la introducción de una estreptavidina marcada por la ficoeritrina, utilizando las condiciones descritas en el ejemplo 9.

Resultados TABLA 4 Comparación del marcaje sin fragmentación

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Los resultados obtenidos, presentados en la tabla 4 facilitada arriba, con la desnaturalización pre-hibridación, son superiores a los obtenidos en la etapa desnaturalización. Esto muestra el hecho de que, la desnaturalización del ADN, es necesaria, para obtener un buen nivel de intensidad. La fragmentación vía los sitios abásicos, es un medio para facilitar la desnaturalización de un ADN de doble hebra, y reforzar la hibridación sobre las sondas de capturas.

Para someter a test de ensayo otros reactivos de marcaje y, tendiendo en cuenta los resultados obtenidos con las diferentes condiciones planteadas anteriormente arriba, hemos procedido a plantear un protocolo de referencia, utilizando la fragmentación al tampón formiato de sodio (50 mM, pH 3) y una etapa de desnaturalización prehibridación.

Ejemplo 13 Marcaje y fragmentación de los amplicones PCR, mediante los reactivos biotinilados, en un protocolo en una etapa

Los derivados meta-, orto, y para-bioPMDAM, se prepararon según el protocolo descrito en los ejemplos 1.1, 1.2 y 1.3. Éstos se solubilizaron en DMSO anhidro, a una concentración de 100 mM.

El protocolo, es idéntico al del ejemplo 12.2 anterior, de arriba (marcaje y fragmentación en una etapa y, a continuación, una etapa de desnaturalización pre-hibridación).

Resultados TABLA 5 Marcaje y fragmentación de los amplicones PCR, mediante reactivos biotinilados, en un protocolo en una etapa

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El protocolo optimizado con la fragmentación y el marcaje en una etapa, proporciona excelentes resultados, con diferentes reactivos de marcaje, con la función reactiva diazometilo, tal y como lo muestran los resultados expuestos en la tabla 5.

Ejemplo 14 Marcaje y fragmentación de ADN mediante el BioDPDAM

Los amplicones ADN, se prepararon mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5.

La síntesis del reactivo de marcaje, se describe en el ejemplo 1.

El protocolo, es idéntico al del ejemplo 12.2, incluso comprendiendo la desnaturalización a 95°C, antes de la etapa de hibridación.

Resultados TABLA 6 Marcaje y fragmentación del ADN, mediante el BioDPDAM

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Este resultado, descrito en la tabla 6, muestra el hecho de que, sustituciones tan importantes como el grupo fenilo, pueden ser utilizadas, para optimizar la reactividad de los reactivos de marcaje que portan una función diazometilo.

Ejemplo 15 Marcaje y fragmentación de ADN mediante la 5-(bromometil)fluoresceína

Los amplicones ADN, se prepararon mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5.

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de formiato sódico pH 3 (100 mM) y 2 \mul 5-(bromometil)fluoresceína (Molecular Probes, Eugen, OR) (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 30 minutos, a una temperatura de 60°C.

Las condiciones de purificación, son en conformidad a las del ejemplo 9. Se efectúa una etapa de desnaturalización, tal y como se describe en el ejemplo 12.2

Las otras condiciones de hibridación y de lectura, son idénticas a las descritas en el artículo de A. Troesch et al. J. Clin. Microbiol. 37(1), páginas 49-55, 1999. La fluoresceína, es directamente detectable sobre el lector.

TABLA 7 Marcaje y fragmentación del ADN, mediante la 5-(bromometil)fluoresceína

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40

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Este resultado de la tabla 7, muestra el hecho de que, la fragmentación del ADN, mediante la creación de sitios abásicos, es realmente compatible con un reactivo de marcaje que porte una función reactiva halogenuro de alquilo. Este protocolo, se realiza en una etapa (fragmentación y marcaje), pero con las intensidades más débiles que con los marcadores que portan una función diazometilo.

Ejemplo 16 Comparación del marcaje con su fragmentación Marcaje y fragmentación de los amplicones ADN, en presencia de otro agente químico de fragmentación, derivado de la fenantrolina

Se procedió a preparar amplicones ADN, mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se utilizan dos tipos de condiciones

Condiciones a:

A 10 \mul de PCR, se le añaden 20 \mul de fenantrolina-FeSO_{4} (25 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen total, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 60 minutos a 95°C.

Condiciones b:

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (100 mM en DMSO). El volumen total, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba durante 60 minutos a una temperatura de 95°C.

Las otras condiciones del protocolo, son idénticas a las del ejemplo 9.

TABLA 8 Marcaje y fragmentación de los amplicones de ADN, en presencia de la fenantrolina

41

Las dos condiciones de fragmentación, permiten un resultado satisfactorio, tal y como se demuestra en la tabla 8.

El mejor resultado, se obtiene con las condiciones (b), utilizando la fragmentación a un pH ácido.

Ejemplo 17 Fragmentación de los amplicones PCR, marcados mediante la incorporación de d-UTP fluoresceína Incorporación del nucléotido marcado

Se procedió a realizar una amplificación PCR, según el protocolo siguiente, con el fin de generar amplicones PCR, marcados mediante la fluoresceína (marcaje sobre las bases).

A partir de una diana de ADN genómico Mycobacterium tuberculosis 16S (10^{+4} copias), utilizando el equipo a modo de "kit" Fast Start de Roche, 0,2 mM de los desoxirribonucleótidos d-ATP, d-CTP y d-GTP, así, como 0,14 mM de d-TTP y 0,06 mM de d-UTP-12-fluoresceína, 0,3 \mum de cebadores y 0,.4 \mul de enzima. El porcentaje del nucléotido marcado con relación a su homólogo natural d-UTP, es del 30%. Es esta relación, la cual se utiliza, de una forma general, en las reacciones de marcaje de los amplicones, mediante la incorporación de nucleótidos marcados.

La d-UTP-12-fluoresceína, se encuentra comercialmente disponible en el mercado, de procedencia de la firma Roche Diagnostics referencia 1373242, Manheim, Alemania).

Los parámetros de la PCR, son los del ejemplo 5.

a. Fragmentación de los amplicones PCR, marcados a un 30%, mediante d-UTP-fluoresceína

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (50 mM). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba, a continuación, durante 30 minutos a 60°C.

b. Fragmentación durante la fragmentación de los amplicones PCR, que contienen un porcentaje del 30%, mediante d-UTP-fluoresceína

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (50 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba, a continuación, durante 30 minutos a una temperatura de 60°C. Este test de ensayo, corresponde a un protocolo de referencia que permite comparar las diferentes estrategias de marcaje, liberándose de la variabilidad, debido a la etapa de amplificación.

En todos los casos, se efectúa una etapa de purificación sobre columna y una etapa de desnaturalización, a una temperatura de 95°C, en todos los casos, como en el ejemplo 9.

\newpage

Protocolo (a1)

Los ácidos nucleicos obtenidos por fragmentación de los amplicones marcados con la d-UTP-fluoresceína (condiciones a), se hibridan sobre serie de distribución de ADN, y se detectan, en un primer tiempo, mediante lectura directa de las señales fluorescentes emitidas por la fluoresceína, tal y como se describe en el ejemplo 15.

Protocolo (a2)

Se utilizó una etapa de amplificación de la señal, con objeto de mejorar la sensibilidad del marcaje. La amplificación de la señal, se realizó mediante la introducción, en el momento de la etapa de hibridación, de un anticuerpo anti-fluoresceína biotinilada (referencia 2116-065-084, Jackson Immuno Research) y, a continuación, de una estreptavidina marcada mediante la ficoeritrina, utilizando las condiciones sucesivas siguientes:

\bullet 300 \mul de agua pura,

\bullet 300 \mul de tampón Tris 100 mM pH 7/NaCl 1M (Tween 0,05%/Antiespumante 0,005%, 2,4 \mul de BSA (50 mg/ml), 1,2 \mul de anticuerpo antifluoresceína biotinilada (1 mg/ml),

\bullet 300 \mul de agua pura, y

\bullet 300 \mul de tampón Tris 100 mM pH 7/NaCl 1M (Tween 0,05%/Antiespumante 0,005%, 6 \mul de BSA (50 mg/ml); 6 \mul de estreptavidina-PE (300 \mug/ml).

Protocolo (b)

Los fragmentos biotinilados (condición b) hibridados sobre serie de distribución de ADN, se revelan, mediante la introducción de una estreptavidina marcada mediante la ficoeritrina, utilizando las condiciones sucesivas siguientes:

\bullet 300 \mul de agua pura, y

\bullet 300 \mul de tampón Tris 100 mM pH 7/NaCl 1M (Tween 0,05%/Antiespumante 0,005%, 6 \mul de BSA (50 mg/ml); 6 \mul de estreptavidina-PE (300 \mug/ml).

La lectura de la fluoresceína emitida en la superficie de la serie de distribución de ADN, después de la marcación e hibridación, así como la generación de los datos, en términos de intensidad de la señal y del porcentaje de homología, se realizaron mediante los sistemas de lectura y del logicial proporcionados por Affymetrix. Con este propósito, es importante tomar debida nota en cuento al hecho de que, el sistema de lectura utilizado, contiene dos filtros que permiten detectar directamente:

\bullet la fluoresceína, en el caso en donde, los amplicones, se marcan con d-UTP-fluoresceína, únicamente, según el protocolo Ia, ó bien

\bullet la ficoeritrina, en el caso en donde, los amplicones, se marcan:

-

con d-UTP-fluoresceína, con amplicones de señal, según el protocolo a2, ó

-

mediante el meta-BioPMDAM, durante su fragmentación, según el protocolo b.

En el caso en donde, la revelación se efectúa mediante la ficoeritrina, la utilización de un filtro, permite liberarse de la señal generada por la fluoresceína, y es bien la señal de la ficoeritrina, la que se detecta.

Resultados TABLA 9 Fragmentación de los amplicones PCR, marcados mediante la incorporación de d-UTP-fluoresceína

42

Los resultados de la tabla 9 facilitada arriba, muestran el hecho de que, la fragmentación química que utiliza la creación de sitio abásico, es compatible con el marcaje enzimático de amplicones ADN y que, el marcaje, puede tener lugar antes de la fragmentación.

\vskip1.000000\baselineskip

Los niveles de intensidad, así como el porcentaje de homología obtenidos con este protocolo de incorporación enzimática del fluoróforo, son reducidos, en comparación con aquéllos obtenidos con el marcaje, durante la fragmentación, que utiliza el reactivo de marcaje con una función diazametilo como el meta-bioPMDAM (condiciones b)).

Para alcanzar el nivel de intensidad obtenido con el derivado meta-bioPMDAM, es necesaria una etapa de amplificación de señal (condiciones a2). Esto muestra efectivamente que, la eficacia de la función reactiva diazometilo, con relación a la incorporación tradicional de base modificada, como la d-UTP-fluoresceína (protocolo de referencia (b)).

Ejemplo 18 Fragmentación del ADN de doble hebra, mediante sonificación

Los amplicones ADN, se obtuvieron utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 5. Estos amplicones, se fragmentaron mediante sonificación (tratamiento con ultrasonidos), en presencia o en ausencia del marcador.

a. Marcaje de los amplicones PCR, durante la sonificación

A 10 \mul de reacción PCR, se le añaden 2 \mul de meta-Bio-PMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul, mediante agua pura y, el valor pH, se ajusta a un nivel de 6,5. La mezcla, se incuba durante 30 minutos a 60°C, en un baño de una cuba de ultrasonidos (frecuencia 35 kHz, modelo T460-H, Bioblock, Francia).

b. Marcaje durante la fragmentación química de los amplicones PCR (protocolo de referencia en una etapa)

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (50 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO). El volumen, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba, durante 30 minutos a una temperatura de 60°C.

Los ensayos, se realizan por duplicado, con el fin de poder analizar la fragmentación del ADN sobre gel y, la eficacia del marcaje, mediante hibridación y lectura de la serie de distribución de ADN, tal y como se encuentra descrito anteriormente, arriba (ejemplo 9, sobre la deleción de la ficoeritrina).

Análisis sobre gel

El análisis, se efectuó sobre gel desnaturalizarte de la poliacrilamida (8% poliacrilamida, 7 M urea, 1 X TBE), utilizando coloración al bromuro de etidio.

El análisis sobre gel, muestra que, los amplicones ADN, se fragmentan mediante sonificación, a una temperatura de 60°C.

Resultados TABLA 10 Fragmentación del ADN de doble hebra, mediante sonificación

43

Los resultados de marcaje de la tabla 10, durante la sonificación (condiciones a), son satisfactorios. Esto muestra el hecho de que, la fragmentación física mediante sonificación de las dianas ADN, es compatible con la química de marcaje mediante los reactivos de marcación que portan una función diazometilo.

Los reducidos resultados de marcaje, en este caso, son ciertamente debidos al hecho de que, el marcaje, se degrada bajo el efecto de los ultrasonidos. Los resultados con la fragmentación por creación de sitio abásico, por acción del pH ácido, son mejores.

Ejemplo 19 Marcaje, fragmentación y desnaturalización del ADN, en una etapa

Los amplicones ADN, se prepararon mediante amplificación por PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5.

Se realizaron dos reacciones de marcaje:

a. Marcaje, fragmentación y desnaturalización, a una temperatura de 95°C, en una sola etapa

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (50 mM) y 2 \mul del marcador meta-Bio-PMDAM (100 mM en DMSO anhidro). El volumen final, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba, a continuación, durante un tiempo de 30 minutos a 95°C. En este caso, la mezcla reactiva, se hibrida sobre serie de disposición de ADN, sin ninguna purificación previa.

b. Marcaje y fragmentación, a una temperatura de 60°C

A 10 \mul de PCR, se le añaden 50 \mul de tampón formiato de sodio pH 3 (50 mM) y 2 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO anhidro). El volumen final, se ajusta a 100 \mul. La solución, se incuba, a continuación, durante 30 minutos a una temperatura de 60°C. En este protocolo, y antes de la hibridación sobre serie de disposición de ADN, los fragmentos, se desnaturalizan según el protocolo descrito en el ejemplo 12.2

Resultados TABLA 11 Marcaje, fragmentación y desnaturalización del ADN, en una etapa

44

El ejemplo 12.2, demostró la importancia de la desnaturalización del ADN de doble hebra, para sensibilidad de detección. Estos resultados de la tabla II, muestran el hecho de que, con el método propuesto de fragmentación mediante creación de sitio abásico, el marcaje, la fragmentación y la desnaturalización del ADN, pueden realizarse en una sola etapa, lo cual representa una mejora notable, desde el punto de vista de la sencillez y del tiempo para el utilizador, y ello, sin afectar a la sensibilidad de detección.

Ejemplo 20 Síntesis del para-Bio-EG3-PDAM

45

Protección del 4-carboxibenzaldehído

El 4-carboxibenzaldehído, es comercial. Se procede a disolverlo (3 g; 20 mmol) en una solución de cloruro de trimetilsililo (10 g; 92 mmol), en 100 ml de MeOH. La mezcla, se deja bajo agitación, durante un tiempo de 40 horas, a la temperatura ambiente. Después de evaporación, se aísla un sólido blanco, correspondiente al 4-metoxicarbonil-benzaldehído 24, se caracteriza por RMN y se utiliza tal cual, para la siguiente reacción.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 10,07 (s, 1H, -CHO); 8,17 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 3,93 (s, 3H, CO-O-CH_{3}).

\bullet Protección del 4'-metoxicarbonilbenzaldehído

El 4-metoxicarbonilbenzaldehído (3,35 g; 20 mmol), se pone en solución, con el ortoformiato de trimetilo (4,8 g; 40 mmol), en presencia de Dowex 50WX8-100 (1 g). La mezcla, se calienta a reflujo, durante un transcurso de tiempo 2 horas y, a continuación, se filtra y se evapora. Después de un ensayo de recristalización, un análisis por RMN, muestra el hecho de que, la reacción, no se encuentra completada y, ésta, se relanza en 30 ml de MeOH, 30 ml de CH(OMe)_{3} y 1 g de Dowex 50WX8-100, a la temperatura ambiente. Se procede a realizar una filtración, a continuación, una evaporación, con el fin de obtener 3,55 g (16,89 mmol, 84%) del producto 25.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,01 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 5,41 (s, 1H, CH); 3,93 (s, 3H, -CO-O-CH_{3}); 3,29 (s, 6H, -O-CH_{3}).

\bullet Compuesto 26

Se procede a solubilizar el compuesto 25 (3,1 g; 14,8 mmol) en 16 ml (73 mmol) de 4,7,10-trioxa-1,13-tri-decanodiamina. La solución obtenida, se calienta a una temperatura de 140-150°C, durante un tiempo de 2 horas. La mezcla, se disuelve, a continuación, en 100 ml de DCM (diclorometano ó CH_{2}Cl_{2}), y se lava 6 veces, con 10 ml de agua. La fase orgánica, se seca con MgSO_{4} y, a continuación, se evapora hasta la obtención de un aceite. Este aceite, se lava con pentano, 3 veces seguidas, mediante decantación y, a continuación, se realiza una nueva extracción con DCM y H_{2}O. Después del secado sobre MgSO_{4} y evaporación, el producto 26, se aísla, con un rendimiento del 63% (9,27 mmol).

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,78 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 5,39 (s, 1H, CH); 3,62-3,47 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'13'} y H_{3'}); 3,29 (s, 6H, -O-CH_{3});, 3,29 (s, 6H, -O-CH_{3}), 2,72 (m, 2H, H_{15'}) 187 (m, 2H, H_{4'}); 1,64 (m, 2H, H_{14'}); 1,30 (s, amplia, 2H, NH_{2}).

\bullet Compuesto biotinilado 27

Se procede a poner en suspensión la biotina (500 mg; 2,05 mmol), en 10 ml de DMF y, a continuación, se añaden 365 mg (2,25 mmol) de CDI. Esta solución, se deja bajo régimen de agitación, durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. El compuesto 26 (900 mg; 2,26 mmol), se disuelve en 1 ml de DMF y, a continuación, se añade poco a poco, a la solución precedente. La mezcla de esta forma obtenida, se deja en régimen de agitación, durante un tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente. Después de evaporación, se realiza una purificación sobre columna, por cromatografía flash (de evaporación instantánea) (columna de 2 mm de diámetro), con 250 ml de MeOH-DCM 6% y, a continuación, con 200 ml de MeOH 7% y, finalmente, 200 ml de MeOH-DCM 8%. Las fracciones correspondientes al producto 27, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 1,00 g de aceite, con un rendimiento estimado del 50%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 9,50 (s amplia, 1H, NH_{imidazol}); 7,80 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,64 (s, 1H, H_{imidazol}); 7,46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5} y 1H, NH_{2'}); 7,05 (s, 2H, H_{imidazol}); 6,76 (t, 1H, NH_{16'}), 6,20 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,44 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 5,37 (s, 1H, CH); 4,42 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,24 (m, 1H, H_{B3a}); 3,59-3,44 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'13'} y H_{3'}); 3,29 (m, 8H, H_{15'} y 2-O-CH_{3}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,66 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,85 (m, 2H, H_{4'}); 1,66 (m, 2H, H_{14'}); 1,40-1,37 (m, 6H, H_{B7,B8,B9}).

\bullet Compuesto aldehídico 28

Se procede a disolver el acetal 27, en 50 ml de cloroformo y, a continuación, se añaden 20 ml de HCl 2N. La mezcla difásica, se agita de una forma vigorosa, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos. Se recupera la fase orgánica, la cual se seca sobre NaHCO_{3} anhidro. Se procede a filtrar y a evaporar, y se obtiene el compuesto 28, en forma de una pasta (495 mg, 0,855 mmol), con un rendimiento global del 42%, a partir de la biotina.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 10,05 (s, 1H, CHO); 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 7,58 (t, 1H, NH_{2'}); 6,46 (t, 1H, NH_{2'}), 6,46 (t, 1H, NH_{16'}); 6,02 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,19 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,46 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 3,66-3,56 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,50-3,29 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,28 (m, 1H, H_{15'}); 2,95 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,71 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,89 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,63 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,23 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto hidrazona 29

Se procede a disolver el aldehído 28 (495 mg; 0,855 mmol) en 10 ml de etanol absoluto. Se añade hidrazina (350 \mul; 7,20 mmol) y, a continuación, la mezcla reactiva, se calienta a reflujo, durante un tiempo de 1 hora. El aceite obtenido después de la evaporación, se disuelve en EtOH abs, para evaporarse de nuevo. Se obtiene, entonces, una espuma, la cual se tritura con pentano. Se obtiene la pasta correspondiente al producto 29 (511 mg; 0,862 mmol), con un rendimiento del 100%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,72 (s, 1H, CH), 7,56 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 7,34 (t, 1H, NH_{2'}); 6,45 (t, 1H, NH_{16'}); 5,98 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,78 (s amplia, 2H, NH_{2}); 5,18 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,44 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,26 (m, 1H, H_{B3a}); 3,62-3,56 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,48-3,45 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,27 (m, 1H, H_{15'}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,68 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,86 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,59 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,21 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto diazo 30

Se procede a solubilizar la hidrazona 29 (357 mg; 0,602 mmol), en 17,5 ml de DMF. Se añade, a continuación, MnO_{2} (700 mg, 7,7 mmol). Después de un tiempo de 12 minutos de agitación a la temperatura ambiente, la mezcla, se filtra sobre "millipore", que contiene celite (espesor, 2 cm) y tamiz molecular en polvo de 3 \ring{A} (0,05 cm). La mezcla reactiva, se evapora hasta secado. El aceite residual obtenido, se lava con éter, tres veces seguidas. Se obtiene el compuesto 30 (290 mg, 0,491 mmol), en forma de un sólido ligeramente rosa, con un rendimiento del 82%.

RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 8,28 (t, 1H, NH_{2'}); 7,77 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,74 (t, 1H, NH_{16'}), 7,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 6,38 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 6,32 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 5,80 (s, 1H, CH-N_{2}); 4,27 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,11 (m, 1H, H_{B3a}); 3,51 3,54 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,37 (m, 2H, H_{15'}); 3,32 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,05 (m, 1H, H_{B4}); 2,79 y 2,58 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,69 (m, 2H, H_{4'}); 1,59-1,48 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,25 (m, 2H, H_{B8}).

La reactividad del compuesto 28, se sometió a test de ensayo, sobre 3'-uridina-monofosfato, y se siguió mediante electroforesis capilar. Las condiciones de análisis, son las del ejemplo 6.1. Los resultados, muestran el hecho de que, el tiempo de vida media, es de 45 minutos.

El reactivo, es estable a una temperatura de -20°C, durante por lo menos 1 mes.

Ejemplo 21 Marcaje y fragmentación de los amplicones de ADN, con el reactivo de marcaje para Bio-EG3-PDAM

Los intereses generales de este género de moléculas, es decir, de derivados de PDAM que portan un brazo de enlace a base de polietilenglicol, son los consistentes en permitir el alejamiento de la función diazo, con relación a la biotina, y aumentar la solubilidad y, finalmente, la reactividad de estas moléculas.

El derivado para-Bio-EG3-PDAM 30, se obtuvo según el esquema de reacción descrito en el ejemplo 20. Los amplicones ADN, se preparan mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se realizaron dos reacciones de marcaje.

a. Marcaje mediante el reactivo para-Bio-EG3-PDAM

A 10 \mul de PCR, se le añadieron 10 \mul de para-Bio-EG3-PDAM (100 mM en DMSO) y 77 \mul de agua "Dnase/Rnase free". La solución, es homogénea, y no presenta precipitados. Esta solución, se incuba durante un tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95°C y, a continuación, se añaden 3 \mul de HCl a 0,1 M, y la solución, se incuba durante un tiempo de 10 minutos, a 95°C.

El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 8.

b. Marcaje mediante el reactivo meta-Bio-PMDAM

A 10 \mul de PCR, se le añadieron 10 \mul de meta-Bio-PMDAM (100 mM en DMSO) y 77 \mul de agua "Dnase/Rnase free". La síntesis de este producto, es la que se evoca en el ejemplo 1.1. La solución, presenta un ligero precipitado. Esta solución, se incuba durante un tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95°C. A continuación, se añaden 3 \mul de HCl 0,1 M, y la solución, se incuba durante un tiempo de 10 minutos, a 95ºC.

El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 8.

Resultados TABLA 12 Estudio comparativo del marcaje y de la fragmentación de amplicones de ADN, con el para-Bio-EG3-PDAM y el meta-Bio-PMDAM

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46

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Las intensidades de la señal, obtenidas en esta tabla 12, son muy satisfactorias y, el porcentaje de homología, es elevado. Este resultado, muestra el hecho de que, la introducción de un brazo polietilenglicol sobre la molécula de marcaje diazo, permite aumentar la solubilidad en fase acuosa del reactivo. El test de ensayo, es por lo tanto homogéneo. Además, el aumento de la solubilidad, permite aumentar la reactividad del marcador.

Ejemplo 22 Síntesis de otros derivados PDAM que comportan un brazo de enlace a base de polietilenglicol

Ejemplo 22.1

Síntesis del meta-Bio-EG3-PMDAM

Esquema de síntesis

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Compuesto 68

Se procede a solubilizar la 3-aminoacetofenona (14,5 g, 107 mmol) en 50 ml de DMF anhidra. Se añade anhídrido succínico (10,7 g, 107 mmol) y se deja bajo agitación, bajo atmósfera de argón, y a la temperatura ambiente. El precipitado obtenido, se filtra y se lava con metanol y éter. Se obtienen, de este modo, 19,4 g (81%) del producto 68, en forma de una materia en polvo de color blanco roto.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 2,5-2,6 (m, 7H); 7,45 (t, 1H); 7,64 (d, 1H); 7,83 (d, 1H); 8,19 (s, 1H); 10,16 (s, 1H), 12,2 (s, 1H).

Compuesto 69

Se procede a solubilizar 5,07 g (22 mmol) del compuesto 68, en 10 ml de DMF anhidra, en atmósfera de argón. Después de un tiempo de 20 minutos, se añaden lentamente 20 ml (94,6 mmol) de 4,7,10-trioxatridecanodiamina (EG_{3}). Después de 3 horas de reacción, a la temperatura ambiente, se evapora el DMF y se recoge el residuo, en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se realizan las extracciones, con Na_{2}SO_{4} anhidro y, el disolvente, se evapora. Se obtienen, de este modo, 4,34 g (46%) del producto 69.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 1, 59 (m, 2H); 1,87 (m, 2H); 2,16 (s, 3H), 2,40 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 3,08 (m, 2H), 3,45 (m, 16H) 7,30 (t, 1H); 7,42 (d, 1H); 7,70 (d, 1H); 7,83 (t, 1H); 7,97 (s, 1H), 10,00 (s, 1H).

Compuesto biotinilado 70

Se procede a solubilizar la D-diotina (1,0 g, 4,1 mmol), en 10 ml de DMF anhidra, en atmósfera de argón. Se procede a enfriar, sobre hielo, y se añade el carbonildiimidazol (CDI)(0,665 g, 4,1 mmol), en 10 ml de DMF anhidra. Después de un transcurso de tiempo de 5 minutos, se añade el compuesto 69 (1,8 g, 4,1 mmol) en 2 ml de DMF anhidra. Se deja reaccionar, durante un tiempo de 3 horas, a una temperatura de 35°C y, a continuación, se evapora el DMF saturado y se recoge en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se efectúan extracciones con NaHCO_{3} saturado y H_{2}O, después de lo cual, la fase orgánica, se seca con Na_{2}SO_{4} anhidro y, el disolvente, se evapora. La caracterización por RMN del producto de esta forma obtenido, muestra el hecho de que, se obtiene una mezcla del producto 70 y EG_{3} libre. Antes de continuar con la síntesis, se efectúa una etapa de purificación.

Se obtiene el compuesto fino, meta-Bio-EG_{3}-PMDAM, después de dos etapas de síntesis, según el esquema descrito en el ejemplo 1.

El interés de esta síntesis, es doble. Por una parte, se obtiene el producto 69, en solamente dos etapas; este producto, puede utilizarse como precursor del diazo, con la posibilidad de unirle dos moléculas detectables de naturaleza diferente, gracias al grupo amina terminal. Este grupo, permite también el injertar el compuesto 69, sobre soportes sólidos, con el objetivo de inmovilizar ácidos nucleicos. Por otra parte, el compuesto 71, posee el mismo centro reactivo que el meta-Bio-PMDAM (nuestra molécula de referencia), lo cual facilita el análisis de las ventajas unidas a la inclusión del brazo etilenglicol (EG_{3}).

El reactivo, es estable, a -22°C, durante un mes.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 22.2

Síntesis del meta-Bio-EG4-PMDAM

Esquema de síntesis

48

\bullet Preparación de la 3-nitro-acetofenona 13

Se procede a disolver 33 g (0,20 mol) de 3-nitro-acetofenona, en 400 ml de tolueno y, a continuación, se añaden 40 ml (0,717 mol) de etilenglicol y 600 mg (3,15 mmol) de ácido para-toluenosulfónico (APTS). Se procede a montar un sistema de Dean Stark. Se calienta la solución, durante un tiempo de 3 horas, a una temperatura de 130°C. Después de deja que, la solución, vuelva a la temperatura ambiente, se añaden 400 ml de acetato de etilo y, a continuación, ésta se lava con 8 ml de una solución de NaHCO_{3} saturado. Se procede a secar la fase orgánica sobre MgSO_{4}. Después de evaporación, se obtiene un sólido de color amarillo pálido 13 (39,72 g; 0,190 mmol) con un rendimiento del 95%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,11 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6,87-6,78 (m, 2H, Ar-H); 6,59 (dd, 1H, J = 6,5 Hz, Ar-H; 4,00 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,79 (m 2H_{2} H_{2}C_{acetal}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

Preparación de la amina 14

Se procede a disolver el compuesto 13 (39,7 g; 0,190 mol) en 500 ml de EtOH y, a continuación, se procede a añadir 1 g de paladio sobre carbono al 10%. Se calienta, con objeto de proceder a la disolución de la totalidad y, a continuación, se deja que, la solución, vuelva a la temperatura ambiente. Después de haber realizado el vacío y haber puesto la solución bajo H_{2}, ésta se deja bajo régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 5 horas. Se procede, a continuación, a filtrar la solución en caliente y, después, ésta se evapora. El producto 14, se lava con pentano, y se aísla en forma de un sólido (34 g; 0,189 mol), con un rendimiento del 99%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,14 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6,85 (m, 2H, J = 7,5 Hz, Ar-H); 6,79 (s, 1H, Ar-H); 6,59 (dd, 1H, J = 6,5 Hz, Ar-H; 4,00 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,79 (m 2H_{2} H_{2}C_{acetal}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto bromado 15

Se procede a poner la amina 14 (12,3 g; 68,7 mmol) y la trietilamina (7 g; 69 mmol), en solución, en 150 ml de DCM, bajo atmósfera de argón. Se añade, a una temperatura de -5°C y mediante procedimiento de goteo, una solución de 13,8 g (60 mmol) de bromuro de bromoacetilo, disuelto en 150 ml de DCM. Al final de la adición, se procede a añadir 100 ml de NaHCO_{3}, acuoso, 1N. Se lava la fase orgánica, dos veces seguidas, con NaHCO_{3}, y se seca sobre MgSO_{4}. Después de la evaporación hasta secado, se obtienen 22,6 g de un aceite de color marrón, correspondiente al compuesto 15, y se utiliza tal cual, para la reacción siguiente.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta = 8,29 (s amplia, 1H, NH), 7,62 (dt, 1H_{4}, J = 5 Hz, Ar-H); 7,47 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,38-7,19 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 4,00 (m, 2H, Br-CH_{2}); 3,75 (m 4H, H_{2}C-H_{2}C_{acetal}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto alcohol 16

Se procede a lavar tres veces el hidruro de sodio (3,3 g; 82,5 mmol), con pentano y, a continuación, se pone en suspensión, en 150 ml de THF, procediéndose, a continuación, a añadir el tetraetilenglicol (50 ml; 0,29 mol), a la temperatura ambiente. Se deja la reacción bajo régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos y, a continuación, se enfría la solución, a una temperatura de -5°C.

Se efectúa la adición del compuesto 15, previamente diluido en 25 ml de THF, por procedimiento de goteo. Se deja la solución en régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, para dejarla volver a la temperatura ambiente. Se concentra la solución, a un volumen de 100 ml y, a continuación, ésta se diluye con 500 ml de CHCl_{3}. Esta fase orgánica, se lava tres veces seguidas, con 250 ml de NaHCO_{3} acuoso 1N y, a continuación, ésta se seca, sobre MgSO_{4}, antes de evaporarla. Se procede a purificar el producto, sobre columna de sílice, mediante cromatografía flash (de evaporación instantánea)(columna de 65 mm de diámetro), con 1,5 l de MeOH-DCM 5% y, a continuación, con 500 ml de MeOH-DCM 7% y, finalmente, con 500 ml de MeOH-DCM 10%. Las fracciones correspondientes al compuesto 16, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 17,4 g (42,1 mmol) de producto, con un rendimiento productivo del 61%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta = 8,86 (s amplia, 1H, NH), 7,71 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H_{4}); 7,51 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,29-7,24 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 4,09 (m, 2H, CO-CH_{2}-O); 3,99 (m 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,72-3,53 (m, 20H, O-CH_{2}-CH_{2}-O, H_{2}C_{acetal} y HO-CH_{2}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto tosilado 17

Se procede a poner el alcohol 16 (4,13 g; 10,0 mmol) en solución, en 5 ml de piridina. Se añaden, a continuación, 2,0 g (10,5 mmol) de cloruro de tosilo, a la temperatura ambiente. Se procede, a continuación, a poner la solución en régimen de agitación, bajo atmósfera de argón, durante un tiempo de 10 horas. Se diluye con 100 ml de DCM, se lava tres veces la fase orgánica, con 20 ml de NaHCO_{3} acuoso 1 N y, a continuación, se seca sobre MgSO_{4}, antes de co-evaporar con tolueno. Se procede a realizar una purificación sobre columna, mediante cromatografía flash (de evaporación instantánea)(columna de 50 mm de diámetro), con 500 ml de MeOH-DCM 2% a continuación, con 500 ml de MeOH-DCM 3% y, finalmente, con 500 ml de MeOH-DCM 4%. Las fracciones correspondientes al compuesto 16, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 3,68 g (6,48 mmol) de un aceite, con un rendimiento productivo estimado del 64%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta = 8,86 (s amplia, 1H, NH), 7,76 (d, 4H, J = 5,5 Hz, Ar-H_{tosilo}); 7,60 (d, 1H, J = 7,5 Hz, Ar-H_{4}); 7,50 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,32-7,22 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 4,10 (m, 2H, CO-CH_{2}-O); 4,00 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,73-3,54 (m, 20H, O-CH_{2}-CH_{2}-O, H_{2}C_{acetal} y HO-CH_{2}); 2,42 (s, 3H, Ar, CH_{3}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto ftalimida 18

Se procede a poner el tosilo 17 (3,68 g; 6,48 mmol) en solución con 1,52 g (10,0 mmol) de DBU (1,8-diazobiciclo-[5.4.0]-undeceno) y, a continuación, se añade la ftalimida (1,47 g; 10 mmol). La solución de esta forma obtenida, se calienta a una temperatura de 85-90°C, durante un transcurso de tiempo 17 horas y, a continuación, se evapora. Se procede a purificar el producto, sobre columna de sílice, mediante cromatografía flash (de evaporación instantánea)(columna de 50 mm de diámetro), con 1 l de acetona-DCM 15% y, a continuación, con 1 l de acetona-DCM 20%. Las fracciones correspondientes al compuesto 18, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 3,15 g (5,8 mmol) de producto, con un rendimiento productivo del 90%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta = 8,73 (s amplia, 1H, NH), 7,79 (d, 2H, r-H_{fta}), 7,99 (m, 2H, Ar-H_{fta} y Ar-H_{4}); 7,49 (s, 1H, Ar-H_{2}; 7,27-7,18 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 4,10 (m, 2H, CO-CH_{2}-O); 4,00 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,69-3,56 (m, 20H, O-CH_{2}-CH_{2}-O, H_{2}C_{acetal} y N_{fta}-CH_{2}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto amina 19

Se procede a disolver el producto 18, en 20 ml de EtOH absoluto, procediendo a calentar, a reflujo, a una temperatura de 75-80°C. A continuación, se añade hidrazina (1,07 ml; 22,1 mmol) y, la reacción, se deja en régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 1 hora y 15 minutos. El precipitado obtenido, se filtra sobre fritado y, la fase etanólica, se evapora. El precipitado blanco, se lava, a continuación, con DCM y, la fase de DCM, se evapora. El aceite amarillo obtenido (2,3 g; 5,57 mmol), se utiliza directamente para la reacción siguiente, incluso si éste contiene el imidazol, el cual podrá eliminarse a continuación, en el momento de la etapa de desprotección del acetal.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta = 8,83 (s amplia, 1H, NH), 7,69 (d, 1H, Ar-H_{4}); 7,51 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,30-7,19 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 4,10 (m, 2H, CO-CH_{2}-O); 4,00 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,69-3,56 (m, 20H, O-CH_{2}-CH_{2}-O, H_{2}C_{acetal} y H_{2}N-CH_{2}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto biotinilado 20

Se procede a solubilizar la D-biotina (1,05 g; 4,32 mmol) en 10 ml de DMF anhidra. Se añaden, bajo atmósfera de argón, 790 mg (4,87 mmol) de carbonildiimidazol (CDI). Después de un tiempo de 10 minutos de agitación, se añade la amina 19, diluida en 5 ml de DMF. La solución, se deja durante un transcurso de tiempo de 40 minutos, en régimen de agitación y, a continuación, se evapora, antes de evaporarse sobre columna, por cromatografía flash.

Para realizar este cometido, se utiliza una columna de 50 mm de diámetro, utilizando, como eluyente, 500 ml de MeOH-DCM 5%, a continuación 500 ml de MeOH-DCM 10% y, finalmente, 500 ml de MeOH-DCM 15%. Las fracciones correspondientes al compuesto 20, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar un aceite de color amarillo (1,66 g; 2,6 mmol).

El aceite amarillo obtenido (2,4 g), contenía, después del espectro de RMN, aproximadamente un 30% en peso de imidazol. De esto se deduce, por lo tanto, el hecho de que, el rendimiento productivo de la reacción que conduce al producto 20, es de aproximadamente un 60%, con relación a la biotina de partida.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,80 (s amplia, 1H, NH); 7,66 (m, 3H, Ar-H_{4} y H_{imidazol}); 7,54 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,28-7,24 (m, 2H, Ar-H_{5,6}); 7,07 (s, 2H, H_{imidazol}); 6,59 (t, 1H, NH_{15'}); 6,06 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,19 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,45 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 4,10 (s, 2H, H_{3'}); 4,0 (m, 2H, H_{2}C_{acetal}); 3,75-3,49 (m, 18H, O-CH_{2}-CH_{2}-O y H_{2}C_{acetal}); 3,36 (m, 2H, H_{14'}); 3,09 (m, 1H, H_{B4}); 2,85 y 2,66 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,61 (s, 3H, CH_{3}); 1,59-1,3 (m, 6H, H_{B9,B8,B7}).

\bullet Compuesto acetona 21

Se procede a disolver acetal en 80 ml de cloroformo y, a continuación, se añaden 30 ml de HCl 2N. Se deja la solución bajo una fuerte agitación, durante un transcurso de tiempo de 45 minutos. La fase orgánica, se recupera y, a continuación, se seca sobre NaHCO_{3} anhidro. Después de filtración, la solución, se evapora y, el aceite obtenido, se lava con pentano, para proporcionar el producto 21 (1,48 g; 2,48 mmol), con un rendimiento del 99%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,99 (s amplia, 1H, NH); 8,07 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}), 7,66 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}); 7,42 (t, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 6,38 (t, 1H, NH_{15'}); 5,78 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 4,96 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,47 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,29 (m, 1H, H_{B3a}); 4,13 (s, 2H, H_{3'}); 3,76-3,37 (m, 16H, O-CH_{2}-CH_{2}-O); 3,32 (m, 2H, H_{14'}); 3,11 (m, 1H, H_{B4}); 2,89 y 2,75 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,59 (s, 3H, CH_{3}); 2,16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,64-1,40 (m, 6H, H_{B9,B8,B7}).

\bullet Compuesto hidrazona 22

Se procede a disolver la cetona 21, en 20 ml de EtOH absoluto. Se caliente a reflujo, a una temperatura de 75-80°C. A continuación, se añade hidrazina (816 \mul; 16,81 mmol), y se deja bajo agitación, durante un transcurso de tiempo de 3 horas. Después de la filtración, se procede a evaporar hasta secado, se redisuelve en etanol, hasta la obtención de una espuma blanca pegajosa. En un primer tiempo, se procede a disolver esta espuma, en 50 ml de cloroformo y, a continuación, se añaden 20 ml de una solución de NaHCO_{3} saturado. Se lava bien y, a continuación, se recupera la fase orgánica. Ésta se seca sobre Na_{2}CO_{3} anhidro y, después de filtración, se evapora hasta secado, con la finalidad de obtener una nueva espuma pegajosa. Ésta corresponde al producto 22 (842 mg; 1,38 mmol) y se obtiene con un rendimiento del 66%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,81 (s amplia, 1H, NH); 8,82 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}), 7,32 (m, 4H, Ar-H_{5,6}); 6,43 (t, 1H, NH_{15'}); 5,89 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,46 (s amplia, 2H, NH_{2}); 4,99 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,44 (m, 1H, H_{B6a}); 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 4,11 (s, 2H, H_{3'}); 3,70-3,37 (m, 16H, O-CH_{2}-CH_{2}-O); 3,32 (m, 2H, H_{14'}); 3,08 (m, 1H, H_{B4}); 2,87 y 2,67 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,11 (m, 5H, CH_{3} y H_{B10}); 1,64-1,40 (m, 6H, H_{B9,B8,B7}).

\bullet Compuesto diazo 23

Se procede a disolver la hidrazona 22 (100 mg; 0,164 mmol), en 1 ml de DMF, bajo atmósfera de argón. Se añaden 80 mg de MnO_{2} activado, y se deja bajo fuerte agitación, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. La mezcla, se filtra a través de una capa mixta de Celite (3 cm)-tamiz molecular en polvo (1 cm). La solución, se evapora, a continuación, hasta secado. El aceite obtenido, al final de la evaporación, se tritura, hasta la obtención de una materia en polvo, correspondiente al compuesto 23 (78 mg; 0,128 mmol; 78%).

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 9,60 (s amplia, 1H, NH); 7,89 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,76 (t, 1H, NH_{15'}); 7,35-7,25 (m, 4H, Ar-H_{5,6}); 6,64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}), 6,36 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 6,32 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,28 (m, 1H, H_{B6a}); 4,08 (m, 1H, H_{B3a}); 4,06 (s, 2H, H_{13'}); 3,55-3,31 (m, 16H, O-CH_{2}-CH_{2}-O); 3,17 (m, 2H, H_{14'}); 3,08 (m, 1H, H_{B4}); 2,80 y 2,59 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,13 (m, 5H, CH_{3}), 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,99-1,30 (m, 6H, H_{B9,B8,B7}).

La reactividad del compuesto 23, se sometió a test de ensayo, sobre el 3'-uridina-monofosfato, y se siguió por electroforesis capilar. Las condiciones del análisis, son las del ejemplo 6.1. Los resultados, muestran un tiempo de vida media, de 30 minutos.

La estabilidad del reactivo, es superior a 1 mes, a una temperatura de -20°C.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 22.3

Síntesis del para-Bio-EG3-PMDAM

Esquema de síntesis

49

\bullet Protección del ácido 4-acetilbenzoico

Se procede a disolver el ácido 4-acetilbenzoico (1 g; 6,1 mmol) en una solución de cloruro de trimetilsililo (TMSCl, 10 g; 92 mmol) en 5 ml de MeOH. La mezcla, se calienta a una temperatura de 90°C, durante el transcurso de toda una noche. Después de evaporación, se aísla un sólido de color blanco, correspondiente al compuesto 31 (1,21 g; 5,75 mmol), se caracteriza por RMN y se utiliza tal cual, para la siguiente reacción.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,08 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}), 7,59 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 3,18 (s, 6H, -O-CH_{3}); 1,53 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto 32

Se procede a disolver el compuesto 31 (1,21 g; 5,75 mmol) en 5 ml de ortoformiato de trimetilo, en presencia de Dowex 50WX8-100 (0,3 g). La mezcla, se calienta a una temperatura de 60°C, durante el transcurso de toda una noche y, a continuación, se evapora, para proporcionar el compuesto 32 (1,19 g; 5,3 mmol), con un rendimiento del 87%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}), 7,54 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 3,89 (s, 1H, CO-O-CH_{3}), 3,16 (s, 1H, -O-CH_{3}); 1,53 (s, 3H, CH_{3}).

\bullet Compuesto 33

Se procede a solubilizar el compuesto 32 (1,17 g; 5,22 mmol) en 5 ml (22,7 mmol) de 4,7,10,trioxa-1,13-tridecanodiamina. La solución obtenida, se calienta a una temperatura de 140°C, durante un tiempo de 4 horas. La mezcla, se disuelve, a continuación, en 30 ml de DCM, y se lava 3 veces, con 10 ml de agua. La fase orgánica, se seca con MgSO_{4} y, a continuación, se evapora, hasta la obtención de un aceite, correspondiente al producto 33 (1,44 g; 3,49 mmol), con un rendimiento del 67%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}), 7,51 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 3,62-3,47 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} y H_{5',13'} y H_{3'}); 3,15 (s, 6H, -O-CH_{3}); 2,73 (m, 2H, H_{15'}); 1,88 (m, 2H, H_{4'}); 1,65 (m, 2H, H_{14'}); 1,38 (s amplia, 2H, NH_{2}).

\bullet Compuesto biotinilado 34

Se procede a poner en suspensión la biotina (380 mg; 3,19 mmol), en 13 ml de DMF. A continuación, se añaden 590 mg (3,60 mmol) de CDI. Esta solución, se deja bajo régimen de agitación, durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. El compuesto 33, se disuelve en 1 ml de DMF y, a continuación, se añade poco a poco, a la solución precedente. La mezcla de esta forma obtenida, se deja en régimen de agitación, durante un tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente. Después de evaporación, se realiza una purificación sobre columna, por cromatografía flash (de evaporación instantánea) (columna de 35 mm de diámetro), con 500 ml de MeOH-DCM 6% y, a continuación, con 250 ml de MeOH-DCM 7% y, finalmente, 250 ml de MeOH-DCM 8%. Las fracciones correspondientes al producto 34, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 1,05 g de aceite, con un rendimiento estimado del 30%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,49 (s amplia, 1H, NH_{imidazol}); 7,79 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,66 (s, 1H, H_{imidazol}); 7,50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 7,38 (t, 1H, NH_{2'}), 7,11 (s, 2H, H_{imidazol}); 6,67 (t, 1H, NH_{16'}), 5,59 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,15 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,46 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 3,61-3,45 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'13'} y H_{3'}); 3,28 (m, 2H, H_{15'}); 3,15 (s, 6H, -OCH_{3}); 2,85 (m, 1H, H_{B4}); 2,85 y 2,69 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,86 (m, 2H, H_{4'}); 1,69 (m, 2H, H_{14'}); 1,49 (s, 3H, CH_{3}); 1,42-1,39 (m, 6H, H_{B7,B8,B9}).

\bullet Compuesto 35

Se procede a disolver el acetal 34, en 45 ml de cloroformo y, a continuación, se añaden 10 ml de HCl 2N. La mezcla difásica, se agita de una forma vigorosa, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos. Se recupera la fase orgánica, la cual se seca sobre NaHCO_{3} anhidro. Se procede a filtrar y a evaporar, y se obtiene el compuesto 35, en forma de un sólido de color amarillo claro (504 mg, 0,87 mmol), con un rendimiento global del 27%, a partir de la biotina.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,91 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 7,51 (t, 1H, NH_{2'}); 6,50 (t, 1H, NH_{16'}), 6,05 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,23 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,45 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 3,62-3,56 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,48-3,46 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,27 (m, 1H, H_{15'}); 3,10 (m, 1H, H_{B4}); 2,85 y 2,71 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,60 (s, 3H, CH_{3}); 2,14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,89 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,61 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,40 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto hidrazona 36

Se procede a disolver la cetona 35 (500 mg; 0,864 mmol) en 11 ml de EtOH absoluto. Se añade hidrazina (335 \mul; 6,911 mmol) y, a continuación, la mezcla reactiva, se calienta a reflujo, durante un tiempo de 1 hora. El aceite obtenido después de la evaporación, se disuelve en EtOH abs, para evaporarse de nuevo. Se obtiene, entonces, una espuma pegajosa, la cual corresponde al producto 36 (488 mg; 0,823 mmol), con un rendimiento del 95%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,67 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 7,29 (t, 1H, NH_{2'}); 6,46 (t, 1H, NH_{16'}); 5,98 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,55 (s amplia, 2H, NH_{2}); 5,14 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,45 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,24 (m, 1H, H_{B3a}); 3,62-3,51 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,47-3,45 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,27 (m, 1H, H_{15'}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,68 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10} y s, 3H, CH_{3}); 1,86 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,59 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,21 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto diazo 37

Se procede a solubilizar la hidrazona 36 (200 mg; 0,337 mmol), en 5 ml de DMF. Se añade, a continuación, MnO_{2} (450 mg, 5,71 mmol). Después de un tiempo de 15 minutos de agitación a la temperatura ambiente, la mezcla, se filtra sobre "millipore", que contiene celite (espesor, 2 cm) y tamiz molecular en polvo de 3 \ring{A} (0,05 cm). La mezcla reactiva, se evapora hasta secado. El aceite residual obtenido, se lava con éter, tres veces seguidas. Se obtiene el compuesto 37 (290 mg, 0,491 mmol), en forma de un sólido ligeramente rosa, con un rendimiento del 93%.

RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 8,33 (t, 1H, NH_{2'}); 7,83 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{2,6}); 7,73 (t, 1H, NH_{16'}), 6,98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{3,5}); 6,39 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 6,33 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,30 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,12 (m, 1H, H_{B3a}); 3,51 3,54 (m, 16H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'} y H_{15'} y H_{3',13'}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,79 y 2,58 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,14 (s, 3H, CH_{3}); 2,04 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,77 (m, 2H, H_{4'}); 1,62-1,48 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,31 (m, 2H, H_{B8}).

La reactividad del compuesto 37, se sometió a test de ensayo, sobre 3'-uridina-monofosfato, y se siguió mediante electroforesis capilar. Las condiciones de análisis, son las del ejemplo 6.1. Los resultados, muestran el hecho de que, el tiempo de vida media, es de 60 minutos.

El reactivo, es estable a una temperatura de -20°C, durante por lo menos 1 mes.

Ejemplo 22.4

Síntesis del meta-Bio-EG3-PMDAM

Esquema de síntesis

50

\bullet Protección del metil-3-formilbenzoato 38

Se procede a disolver la resina Dowex 50WX8-100 (2 g), en 25 ml de MeOH y 25 ml de ortoformiato de trimetilo y, a continuación, se deja en régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos. Después de decantación, se procede a lavar la resina, dos veces seguidas, con 20 ml de MeOH. Se procede, a continuación, a poner esta resina en 100 ml de MeOH, 50 ml de CH(OMe)_{3}, y se añaden 7,12 g (43,4 mmol) de metil-3-formilbenzoato. La solución, se deja un tiempo de 15 minutos en régimen de agitación y, a continuación, se filtra sobre papel plegado, antes de evaporación. El producto 39 (9 g, 43,1 mmol), se aísla en forma de un líquido amarillo claro, con un rendimiento del 99%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,10 (s, H, Ar-H_{2}); 7,79 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}); 7,63 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}), 7,42 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 5,40 (s, 1H, CH); 3,90 (s, 3H, -CO-O-CH_{3}); 3,31 (s, 6H,-O-CH_{3}).

\bullet Compuesto 40

Se procede a solubilizar el compuesto 39 (2 g; 9,5 mmol) en 10,4 ml (47,6 mmol) de 4,7,10,trioxa-1,13-tridecanodiamina. La solución obtenida, se calienta a una temperatura de 165°C, durante un tiempo de 2 horas. La mezcla, se disuelve, a continuación, en 80 ml de DCM, y se lava 4 veces, con 20 ml de agua. Después del secado con MgSO_{4} y evaporación, el producto 40, se aísla, con un rendimiento del 60% (2,27 g; 5,69 mmol).

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,84 (s, H, Ar-H_{2}); 7,75 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}), 7,53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 5,38 (s, 1H, CH); 3,64-3,43 (m, 14H, H_{7',8',10',11'} y H_{5',13'} y H_{3'}); 3,29 (s, 6H, -O-CH_{3}); 2,72 (m, 2H, H_{15'}); 1,87 (m, 2H, H_{4'}); 1,64 (m, 2H, H_{14'}); 1,30 (s amplia, 2H, NH_{2}).

\bullet Compuesto biotinilado 41

Se procede a poner en suspensión la D-biotina (344 mg; 1,40 mmol), en 4 ml de DMF y, a continuación, se añaden 250 mg (1,54 mmol) de CDI. Esta solución, se deja bajo régimen de agitación, durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. El compuesto 40, se disuelve en 1 ml de DMF y, a continuación, se añade poco a poco, a la solución precedente. La mezcla de esta forma obtenida, se deja en régimen de agitación, durante un tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente. Después de evaporación, se realiza una purificación sobre columna, por cromatografía flash (de evaporación instantánea) (columna de 30 mm de diámetro), con 750 ml de MeOH-DCM 10%, y a continuación, con 250 ml de MeOH-DCM 15%. Las fracciones correspondientes al producto 41, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 740 mg aceite, con un rendimiento estimado del 50%.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,87 (s, 1H, Ar-H_{2}); 7,78 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}); 7,65 (s, 1H, H_{imidazol}); 7,53 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 7,07 (s, 2H, H_{imidazol}); 6,65 (t, 1H, NH_{16'}); 5,95 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,38 (s, 1H, CH); 5,15 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,43 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 3,59-3,44 (m, 14H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'13'} y H_{3'}); 3,29 (m, 8H, H_{15'} y 2-O-CH_{3}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,66 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,85 (m, 2H, H_{4'}); 1,66 (m, 2H, H_{14'}); 1,40-1,37 (m, 6H, H_{B7,B8,B9}).

\bullet Compuesto aldehídico 42

Se procede a disolver el acetal 41, en 20 ml de cloroformo y, a continuación, se añaden 5 ml de HCl 2N. La mezcla difásica, se agita de una forma vigorosa, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos. Se recupera la fase orgánica, la cual se seca sobre NaHCO_{3} anhidro. Se procede a filtrar y a evaporar, y se obtiene el compuesto 47, en forma de un aceite amarillo (593 mg; 1,02 mmol), con un rendimiento global del 87%, a partir de la biotina.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 10,04 (s, 1H, CHO), 8,34 (s, H, Ar-H_{2}); 8,16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}); 7,96 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}); 7,72 (t, 1H, NH_{2'}); 7,39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 6,51 (t, 1H, NH_{16'}), 6,00 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,30 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,46 (m, 1H, H_{B6a}); 4,27 (m, 1H, H_{B3a}); 3,66-3,56 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,50-3,29 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,28 (m, 1H, H_{15'}); 2,95 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,71 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,89 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,63 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,23 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto hidrazona 43

Se procede a disolver el aldehído 42 (593 mg; 1,02 mmol) en 10 ml de etanol absoluto. Se añade hidrazina (400 \mul; 8,19 mmol) y, a continuación, la mezcla reactiva, se calienta a reflujo, durante un tiempo de 50 minutos. El aceite obtenido después de la evaporación, se tritura con éter, hasta la obtención de una materia en polvo, de color beige, correspondiente al producto 43 (404 mg; 0,68 mmol), con un rendimiento productivo del 66%. Se procede, a continuación, a realizar una purificación sobre columna, mediante cromatografía flash (columna de 15 mm de diámetro), sobre una muestra de 150 mg (0,253 mmol) con 200 ml de MeOH-DCM 20%. Las fracciones, se reúnen y, a continuación, se evaporan hasta secado, para proporcionar 144 mg del producto 43, con un rendimiento del 76%.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})\delta = 7,95 (s, H, Ar-H_{2}); 8,16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{4}); 7,76 (s, 1H, CH); 7,96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H_{6}); 7,38 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H_{5}); 6,45 (t, 1H, NH_{16'}), 5,98 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 5,72 (s amplia, 2H, NH_{2}); 5,18 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 4,44 (m, 1H, H_{B6a}); 4,26 (m, 1H, H_{B3a}); 3,62-3,56 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,48-3,45 (m, 4H, H_{3'13'}); 3,27 (m, 2H, H_{15'}); 3,07 (m, 1H, H_{B4}); 2,84 y 2,68 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,86 (m, 2H, H_{4'}); 1,72-1,59 (m, 6H, H_{14'},_{ }H_{B7,B9}); 1,21 (m, 2H, H_{B8}).

\bullet Compuesto diazo 44

Se procede a solubilizar la hidrazona 43 (100 mg; 0,187 mmol), en 5 ml de DMF. Se añade, a continuación, MnO_{2} (200 mg; 2,3 mmol). Después de un tiempo de 13 minutos de agitación a la temperatura ambiente, la mezcla, se filtra sobre "millipore", que contiene celite (espesor, 2 cm) y tamiz molecular en polvo de 3 \ring{A} (0,05 cm). La mezcla reactiva, se evapora hasta secado. El aceite residual obtenido, se lava con éter, tres veces seguidas. Se obtiene el compuesto 44 (290 mg, 0,491 mmol), en forma de un sólido de color naranja, con un rendimiento del 83%.

RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6})\delta = 8,39 (t, 1H, NH_{2'}); 7,78 (t, 1H, NH_{16'}), 7,39-7,34 (m, Ar-H); 7,09 (d, Ar-H); 6,38 (s amplia, 1H, NH_{B1}); 6,32 (s amplia, 1H, NH_{B3}); 5,78 (s, 1H, CH-N_{2}); 4,27 (m, 1H, H_{B6a)}; 4,11 (m, 4H, H_{B3a}); 3,51 3,44 (m, 10H, H_{7',8',10'11'} y H_{5'}); 3,37 (m, 2H, H_{15'}); 3,32 (m, 4H, H_{3',13'}); 3,05 (m, 1H, H_{B4}); 2,79 y 2,58 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, H_{B6}); 2,02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_{B10}); 1,69 (m, 2H, H_{4'}); 1,59-1,48 (m, 6H, H_{14'}, H_{B7,B9}); 1,25 (m, 2H, H_{B8}).

La estabilidad del producto, es superior a 1 mes, a una temperatura de -20°C.

Ejemplo 23 Síntesis del para-Cy5-EG3-PDAM

Tal y como se ha evocado ya en el ejemplo 2, la biotina, puede reemplazarse por otro marcador tal como el Cy5. Este ejemplo, muestra el hecho de que se puede igualmente enlazar la función diazo, portada por el PDAM, a este marcador Cy5, mediante la intermediación de un brazo de enlace polietilenglicol.

Esquema de síntesis

El contra-ión I^{-}, no se encuentra representado en las fórmulas 46, 47, 50' y 51.

51

\bullet Yoduro de 2-[4-(N-acetil-N-fenilamino)buta-1,3-dienil]-1,2,3,3-tetrametil[3H]indolium 47

La mezcla del monoclorhidrato de malonaldehído-bis-(fenilamina) 45 (13 g; 50,2 mmol), de NaoAc (6,0 g; 69,7 mmol) y de yoduro de 1,2,3,3-tetrametil[3H]indolium 46 (3,01 g; 10 mmol) en anhídrido acético (50 ml), se calienta a una temperatura de 100°C, durante un tiempo de 20 minutos, precisamente. Después del enfriado, se procede a añadir éter (350 ml) y, el sólido de color marrón precipitado, se filtra, y se lava con éter (3 x 100 ml). Se procede a disolver el sólido, en 150 ml de CH_{2}CH_{2}, se filtra (eliminación de las sales minerales) y, a continuación, se precipita con 350 ml de éter, para proporcionar un sólido de color marrón (3,54 g, 54%).

RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta = 8,64 (d; 1H; J = 12 H; 1-H); 8,14 (t, 1H; J = 16; 12H; 3-H); 7,63-7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H; J = 15 Hz; 4-H); 5,82 (t, 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4,06 (s; 3H; NCH_{3}); (2,16 (s; 3H; -COCH_{3}); 1,74 (s; 6H; CH_{3}).

\bullet Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil[3H]-indolium 59

Se procede a mezclar el 2,3,3-trimetilindol 48 (10,0 g; 62,8 mmol) y el ácido 6-bromohexanoico 8 (12,3 g; 62,8 mmol) sin disolvente, y se calienta una temperatura de 110°C, durante un transcurso de tiempo de 12 horas, bajo atmósfera de argón. La mezcla reactiva, de aspecto pastoso rojo violeta, se lava con acetato de etilo (2 x 60 ml, se tritura la pasta con la espátula y se decanta el sobrenadante) y, a continuación, con acetona (50 ml, la pasta solidifica). El sólido rosa, se filtra y, a continuación, se seca al vacío (16,0 g; 73%).

\bullet Compuesto Cy5COOH 51

La mezcla del yoduro 47, (2,5 g, 5,3 mmol), del bromuro 50 (1,87 g, 5,3 mmol), y de NaOAc (1,08 g; 12,1 mmol) en anhídrido acético (11 ml) se calienta a una temperatura de 110°C, durante un transcurso de tiempo de 25 minutos. Después del enfriamiento, se añade éter (200 ml) y, el precipitado, se filtra, y se lava con éter (3 x 50 ml). El sólido correspondiente al producto 50', se disuelve en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y, a continuación, se evapora. Se procede, a continuación, a disolverlo en 15 ml de ácido acético y se agita durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 120°C. El precipitado correspondiente al producto 51, se obtiene, de este modo, después de la adición de 200 ml de éter y filtración sobre fritado, con un rendimiento del 84% (2,71 g; 4,44 mmol).

RMN ^{1}H(CDCl_{3}); \delta = 8,03 (t, 2H, J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H), 7,38-6,91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6,41 (d, 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6,31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07 (t, 2H, J = 7; 7 Hz, \alpha-CH_{2}); 3,68 (s; 3H; NCH_{3}); 2,47 (t, 2H, J = 7; 7 Hz; \varepsilon-CH_{2}); 1,71 (m; 18H; CH_{3}, \beta,\gamma y \delta-CH_{2}).

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52

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\bullet Acoplamiento del compuesto 26 con el Cy5COOH 51 (producto 52)

A una solución de Cy5OOH 50 (1,5 g; 2,46 mmol), en 15 ml de CH_{2}Cl_{2}, se le añade N-metilmorfolina (NMM, 405 \mul; 3,68 mmol). La solución, se enfría con un baño de hielo, y de pone bajo atmósfera de argón y a continuación, se añade el cloroformiato de isobutilo (480 \mul, 3,7 mmol). Después de un tiempo de 10 minutos de agitación, se añade la amina 26 (1,86 mg, 4,67 mmol), diluida en 8 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se deja la mezcla bajo régimen de agitación, a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 1 hora y 30 minutos. Se añaden 20 ml de CH_{2}Cl_{2} y se lava con 25 ml de NaHCO_{3} (1 N), tres veces seguidas. Después de secado sobre Na_{2}CO_{3}, se filtra la solución, para recuperar la fase diclorometano, la cual se evapora.

Se realiza una purificación sobre columna, mediante cromatografía flash (evaporación instantánea) (columna de 45 mm de diámetro, fracciones de 20 ml), utilizando, como eluyente, MeOH-DCM 10%. Las fracciones que corresponden al producto 52, se reúnen y, a continuación, se evaporan, hasta secado, para proporcionar un sólido de color azul, el cual se disuelve en CH_{2}Cl_{2}. El producto 52, se precipita, a continuación, y se lava con éter, para proporcionar un producto azul, con un rendimiento productivo del 72% (1,45 g; 1,77 mmol).

Se procede, a continuación, a disolver el producto 52 (yoduro), en 54 ml de metanol y, a continuación, se hace pasar sobre columna de amberlite IRA900 (Cl^{-}; 15 g). La solución metanólica recogida, se evapora hasta secado, para proporcionar un aceite pegajoso, el cual se redisuelve en CH_{2}Cl_{2}. La evaporación, permite la obtención del producto 52', con un rendimiento del 87%.

\bullet Aldehído 53

Se procede a disolver el acetal 52', en 10 ml de DCM y, a continuación, se añaden 10 ml de HCl 2N. La solución, se deja bajo un régimen de fuerte agitación, durante un transcurso de tiempo de 3 horas y 30 minutos. Después de la adición de 20 ml de DCM, Se recupera la fase orgánica y, a continuación, se seca sobre NaHCO_{3}. El producto obtenido después de evaporación, se lava con éter, para proporcionar el aldehído 53, con un rendimiento del 90% (1,18 g; 1,46 mmol).

\bullet Hidrazona 54

Se procede a disolver el aldehído 53 (200 mg; 0,247 mmol) en 1 ml de etanol absoluto, y se añade la hidrazina monohidratada (15,6 \mul, 0,321 mmol). La solución, se agita a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 30 minutos. Se añaden 8 ml de éter; se lava con éter mediante decantación, tres veces seguidas y, a continuación, se seca bajo la acción de vacío. Se obtienen 172 mg de hidrazina 54 (0,209 mmol; 85% de rendimiento) que se conservan al congelador.

\bullet Diazo 55

Se procede a añadir, a una solución de 20 mg (0,243 mmol) de hidrazona 54 en 2 ml de DMF, 100 mg de MnO_{2}, y se agita vigorosamente durante un tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente. Se procede a filtrar la suspensión, a través de una capa de celite (espesor, 2 cm) y tamiz molecular en polvo de 3 \ring{A} (0,05 cm), y se lava con DMF. Se procede a evaporar la solución y, a continuación, ésta se tritura con éter. El sólido de esta forma obtenido, se seca. Se obtienen, de este modo, 18 mg (0,185 mmol; 76%) de diazo 55.

La estabilidad del reactivo, es superior a un mes, a -20°C.

Ejemplo 24 Síntesis del meta-Flu-EG3-PMDAM

Tal y como se ha evocado ya en el ejemplo 23, la biotina, puede reemplazarse por otro marcador. Este ejemplo, muestra el hecho de que se puede igualmente enlazar la función diazo, portada por el PDAM, a este marcador fluoresceína, mediante la intermediación de un brazo de enlace polietilenglicol.

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Esquema de síntesis

53

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Compuesto 72

Se procede a solubilizar el isotiocianato de fluoresceína (250 mg, 0,64 mmol) en 1,6 ml de DMF anhidra, con un 2% de piridina, bajo atmósfera de argón. Se procede a añadir el producto 69 (0,356 g, 0,81 mmol), disuelto en 1,6 ml de DMF anhidra. Se deja reaccionar, durante un transcurso de tiempo de 3,5 horas, a la temperatura ambiente y, a continuación, se evapora con DMF y se recupera en 25 ml de H_{2}O. Se realizan tres extracciones, con 50 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se evapora la fase acuosa. Se obtienen 255 mg (48%) del producto 72.

Compuesto meta-Fluo-EG_{3}-Hidrazona-Tosilo 75

Se procede a disolver el compuesto 72 (255 mg, 0,31 mmol) en 1,5 ml de etanol, a reflujo. Se añade la p-toluen-sulfonil-hidrazina (69,2 mg, 0,37 mmol) en 1,5 ml de etanol, y se deja reaccionar durante un tiempo de 6 horas. Se procede a evaporar hasta secado y, el sólido, se lava con CH_{2}Cl_{2}, H_{2}O y éter. Se obtienen 18,5 mg (74%) del producto 75, en forma de una materia en polvo de color naranja.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 1,6-1,8 (m, 4H); 2,13 (s, 1H); 2,28 (s, 1H); 2,36 (s, 1H); 2,80 (m, 1H); 3,07 (m, 2H); 3,46 (m, 12H); 6,5-6,7 (m, 6H); 7,1-8,3 (m, 9H).

Compuesto meta-Fluo-EG_{3}-PMDAM 74

Se procede a solubilizar la hidrazona 75 (176 mg, 0,18 mmol) en 720 \mul de una solución de KOH al 10%, en metanol anhidro. La solución, se deja a reflujo, durante un tiempo de 3 horas. Se deja enfriar la solución, y aparece un precipitado. La solución, se filtra y se evapora hasta secado. El residuo se lava con éter y se seca.

El análisis por RMN, muestra la desaparición de las señales a 2,36 y 2,13 ppm (correspondientes a los Metilos de tosilo y de hidrazona) y la aparición de un pico a 1,96 ppm (correspondiente al metilo del idazo.

Ejemplo 25 Intermediario diazometilo que permite un marcaje ulterior

Puede ser interesante el hecho de no tener un marcaje directo mediante el reactivo de marcaje diazometilo que porta también el marcador R^{2}, sino de proceder en dos etapas, con un marcaje indirecto. En el caso del reactivo de marcaje que comprende la función diazometilo, se dice que es prefuncionalizada, es decir que, éste, comprende también una función química apta para reaccionar ulteriormente con marcadores directos o indirectos. La prefuncionalización, puede intervenir mediante la introducción de una función reactiva de covalencia, en el seno del reactivo de marcaje, que puede reaccionar con una función anti-reactiva de covalencia del marcador directo o indirecto. Estas funciones, pueden encontrarse constituidas por una función química orgánica electrófila y una función química orgánica nucleófila, o inversamente.

Un ejemplo de una estrategia de este tipo, es el que se ilustra mediante el esquema que se facilita abajo, a continuación

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54

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en el cual, el reactivo de marcaje, comprende, además de una función diazometilo, una función W^{1}-electrófila o nucleófila, susceptible de poder reaccionar con un marcador R^{2}, que comprende una función W^{2} complementaria de la W^{1}.

Así, por ejemplo, si W^{1} es una función metilcetona o aldehído, W^{2}, es una función alcoxiamina.

En un procedimiento de marcaje de una molécula biológica tal como un ácido nucleico, el ácido nucleico en cuestión, se pone en contacto con el reactivo de marcaje que comprende la función diazometilo y, en una etapa ulterior, el marcador W^{2}-R^{2}, reacciona con el ácido nucleico, mediante la intermediación de la función W^{1}.

Una de las utilizaciones es, por ejemplo, la que se encuentra constituida por un procedimiento de amplificación de una secuencia de un ácido nucleico o por un procedimiento de amplificación de la señal. Informaciones complementarias sobre este tipo de marcaje, se encuentran en la publicación de la solicitud de patente internacional WO-A-98/05 766, bajo prioridad, del 2 de Agosto de 1996, y en la publicación de la solicitud de patente internacional WO-A-00/40 590, bajo prioridad, del de 5 de Enero de 1999.

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Ejemplo 25.1

Síntesis del MeCO-PMDAM

Esquema de síntesis

55

El producto 85, cuya síntesis se describe en este ejemplo, permite realizar el marcaje de los ácidos nucleicos naturales, gracias a la reactividad de la función diazometilo, con los grupos fosfato, e introducir, de esta forma, una función metilcetona, la cual puede utilizarse, a continuación, para introducir una molécula detectable (fluorescente, biotina), que posea un grupo alcoxiamina.

Esta síntesis, se basa en procedimientos conocidos y utilizados de forma rutinaria en la química. El producto de partida, es el mismo que el utilizado para la síntesis de los marcadores 71 y 74. La primera etapa, consiste en la protección de la amina terminal, mediante el fluorenil-metil-formiato (Fmoc, 99). La elección de este grupo protector, se basa en su estabilidad y condiciones de segmentación.

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56

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Después de la formación de la hidrazona protegida 82, mediante el procedimiento utilizado precedentemente (ejemplo meta-Fluo-EG_{3}-PMDAM,), la amina terminal, se desprotege en las condiciones básicas que garanticen la estabilidad de la hidrazona. Se utiliza el acetoacetato de metilo, para crear la función metilcetona, mediante una reacción de acilación de la amina terminal (véase la formación de los compuestos 26 y 36) La formación del diazometilo, se realiza, a continuación, mediante los procedimientos descritos precedentemente.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 25.2

Síntesis del H_{2}NO-PMDAM

Esquema de síntesis

57

El producto 88, cuya síntesis se describe en este ejemplo, permite realizar el marcaje de los ácidos nucleicos naturales, gracias a la reactividad de la función diazometilo, con los grupos fosfato, e introducir, de esta forma, una función alcoxiamina, la cual puede utilizarse, a continuación, para introducir una molécula detectable (fluorescente, biotina), que posea un grupo metilcetona.

Esta síntesis, se basa en el modelo precedente, es decir, la utilización del precursor 69, del Fmoc, para la protección de la amina y del tosilo, para la protección de la hidrazona. La introducción de la función alcoxiamina (compuesto 86), se realiza mediante el uso de la carboximetoxilamina (comercial), protegida mediante la función Fmoc (Thése E. Trévisiol, LEDSS Grenoble, 1999). Dadas las suaves condiciones de la desprotección final (compuesto 88), ésta se realiza enseguida, después de la formación del diazometilo.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 26 Preparación de derivados de PDAM que permitan la amplificación de la señal

Ejemplo 26.1

Síntesis de marcadores bis-biotinilados, tales como el [Bio-EG3]2-PDAM

Esquema de síntesis

58

\bullet Reducción del benceno-1,3,5-tricarboxilato de trimetilo 56 en alcohol 57

Se procede a disolver el triéster 56 (12,6 g; 50,0 mmol), en 100 ml de THF y, a continuación, se añaden 1,1 g (50,5 mmol) de LiBH_{4}, a la temperatura ambiente. La solución roja, se calienta a una temperatura de 40-45°C, bajo agitación, durante un tiempo de 1 hora. Después del enfriamiento (hielo), se destruye el hidruro en exceso, con precaución (desprendimiento de H_{2}), mediante la adición de agua (200 ml) y, a continuación, HCl 2N (30 ml). Se observa el cambio de color, a amarillo claro. Se procede a extraer esta solución con CH_{2}Cl_{2} (100 ml, y a continuación, 3 veces 50 ml), la fase orgánica se lava con NaHCO_{3} anhidro, se seca sobre MgSO_{4} y, después, el disolvente, se evapora, hasta la obtención de un aceite (11,1 g). Mediante cromatografía flash (de evaporación instantánea), sobre columna de sílice (diámetro = 40 mm, eluyente: acetato de etilo/ciclohexano = 1/1), se obtiene el alcohol 57 (6,38 g, 57%).

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta = 8,53 (t, 1H, J = 2 Hz); 8,18 (d, 2H, J = 2 Hz); 4,76 (s, 2H); 3,91 (s, 6H); 2,30 (s, 1H).

\bullet Oxidación del alcohol 57 en aldehído 58

Se procede a disolver el alcohol 57 (5,86 g; 2,61 mmol) en 100 ml de THF y, a continuación, se añaden, lentamente, 40,0 g de MnO_{2}, en un tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente. La solución, se deja una noche en régimen de agitación, bajo atmósfera de argón. Se procede a filtrar la solución, en un embudo de Büchner, equipado con una capa de Celite 545, se lava con CH_{2}Cl_{2} y, a continuación, se evaporan los disolventes. El sólido bruto (4,4 g), se purifica mediante cromatografía flash (de evaporación instantánea), sobre columna de sílice (diámetro = 50 mm, eluyente: acetato de etilo/ciclohexano = 3/7). Se obtienen 3,44 g (59%) del aldehído 58.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta = 10,11 (s, 1H); 8,89 (t, 1H, J = 1 Hz); 8,69 (d, 2H, J = Hz); 3,98 (s, 6H).

\bullet Formación del acetal 59

Se procede a disolver el aldehído 58 (3,21 g; 1,44 mmol) en 30 ml de metanol y, a continuación, se añaden 6,0 ml de TMSCl. La solución, se deja a la temperatura ambiente, bajo régimen de agitación, bajo atmósfera de argón, durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Se diluye la solución con 200 ml de CH_{2}Cl_{2}, se agita sobre 1 M NaHCO_{3} (100 ml) (atención, desprendimiento de CO_{2}). Se separan las dos fases, se extrae la fase acuosa tres veces, con CH_{2}Cl_{2} (25 ml), se reúnen las fases orgánicas, se seca sobre MgSO_{4} y, a continuación, se evapora el disolvente. Se obtienen 3,55 g (92%) del acetal 59.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta = 8,63 (t, 1H, J = 2 Hz); 8,29 (d, 2H, J = Hz); 5,45 (s, 2H); 3,93 (s, 6H); 3,32 (s, 3H).

\bullet Hidrólisis del diéster 59 en diácido 69

Se procede a disolver el diéster 59 (3,18 g; 11,9 mmol) en 10 ml de THF y, a continuación, se añade una solución de KOH (2,0 g; pastilla 85%), en 100 ml de metanol. Después de un tiempo de 15 minutos, a la temperatura ambiente, se evaporan los disolventes. El residuo, se disuelve en H_{2}O (50 ml). Se añade H_{3}PO_{4} (aproximadamente 2,5 ml, 85%), hasta un pH 3 y, el precipitado blanco, se filtra sobre el fritado (#3), se lava con agua y se seca al vacío. Se obtienen 2,59 g (91%) del diácido 60.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 8,43 (t, 1H, J = 1 Hz); 8,15 (d, 2H, J = Hz); 5,53 (s, 1H); 3,27 (s, 6H);

\bullet Trifluoracetamida

Se procede a disolver la diamina 61 (66 g; 0,30 mol) en 250 ml de CH_{2}Cl_{2} y, a continuación, se añade trifluoroacetato de etilo (11,8 ml, 0,10 mmol), gota a gota, en un tiempo de 5 minutos, a una temperatura de 10°C, en régimen de agitación, bajo atmósfera de argón. Después de un transcurso de tiempo de 15 minutos a la temperatura ambiente, se procede a transferir la solución, al interior de una ampolla de decantación, se lava con H_{2}O (3 x 100 ml), se seca sobre MgSO_{4} y se evapora el disolvente. Se obtienen 22,4 g (71%) de la monoamida 62, de una pureza de aproximadamente un 85% (determinada por F^{19} RMN). Este compuesto, se conserva a una temperatura de -20°C, y se utiliza sin purificación.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta = 3,5-3,6 (m, 12H); 3,42 (t, 2H; J = 6 Hz); 2,75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1,81 (cuantipleto, 2H, J = 2 Hz); 1,67 (cuantipleto, 2H); 1,30 (s. amplia, 2H).

RMN^{19}F (190 MHz, CDCl_{3}): \delta = -76,3

\bullet Compuesto 63

A una suspensión de D-biotina (6,39 g; 26,2 mmol) en 50 ml de DMF, se le añade el carbonildiimidazol (CDI, 6,32 g, 80%, 31,2 mmol). La mezcla, se calienta a una temperatura de 55-60°C, en régimen de agitación, bajo atmósfera de argón, durante un tiempo de 30 minutos. Se observa inicialmente una disolución completa de material y, a continuación, una solidificación, con la precitación de un sólido blanco (evolución de CO_{2}). Se procede a añadir la amina (aceite), con la ayuda de 5 ml de CH_{2}Cl_{2} (700 ml) y 2N HCl (100 ml). Después de una filtración en dos fases, a través de una capa de Celite 545, se separan las dos fases, se extrae la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} (15 x 100 ml), se reúnen las fases orgánicas, se secan sobre NaHCO_{3} anhidro y MgSO_{4} y, a continuación, se evapora el disolvente. El residuo aceitoso, se tritura con 150 ml de éter, para obtener una suspensión. El sólido pastoso, es difícil de filtrar. Se procede a decantar el sobrenadante, y se repite el lavado, con éter. Después de un secado al vacío, se obtienen 9,13 g (64%) del compuesto 63.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta = 3,5-3,6 (m, 12H); 3,42 (t, 2H; J = 6 Hz); 2,75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1,81 (cuantipleto, 2H, J = 2 Hz); 1,67 (cuantipleto, 2H); 1,30 (s. amplia, 2H).

\bullet Compuesto 64

Se procede a calentar una solución del compuesto 63, en amoníaco (100 ml, 22% acuoso), en un matraz de 250 ml, tapado con septum, a una temperatura de 55-60°C, durante un tiempo de 2 horas. Después de enfriamiento, se evapora el disolvente. El residuo, se disuelve en metanol (20 ml) y se pasa sobre una columna de resina intercambiadora de aniones Dowex 21K [altura 12 cm x diámetro 35 mm, forma OH^{-}, obtenida mediante lavado previo con NaOH 1N (1,5 l] y, a continuación, metanol (1,5 l)]. El compuesto 64, libre del ión trifluoroacetato, pasa en las primeras fracciones, con 200 ml del metanol. Después de evaporación, se procede a evaporar el residuo, con 20 ml de éter y, a continuación, éste se decanta. El lavado con éter, se repite cinco veces seguidas. Después del secado, se obtiene el compuesto 64 (6,43 g, 86%).

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}): \delta = 6,77 (t, 1H, J = 4 Hz); 6,32 (s, 1H); 5,52 (s, 1H), 4,45 (m, 1H); 4,28 (m, 1H), 3,50-3,68 (m, 12H); 3,30 (m, 3H); 3,11 (m, 1H); 2,86 (dd, 1H, J = 13 y 5 Hz); 2,75 (t, 2H, J = 13 Hz); 2,68 (d, 1H, J = 13 Hz); 2,68 (d, 1H, J = 13 Hz); 2,16 (t, 2H, J = 7 Hz); 1,60-1,85 (m, 8 H); 1,41 (m, 2H).

\bullet [Bio-EG_{3}]_{2}-acetal 65

A una suspensión del diácido 60 (120 mg, 0,500 mol) en diclorometano (5 ml), se le añade el carbonildiimidazol (225 mg, 90%, 1,25 mmol), y ésta, se calienta a una temperatura de 55-60°C, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Se procede a añadir la amina 64 (550 mg, 1,23 mmol) y, la solución, se calienta a una temperatura de 55-60°C, durante un transcurso de tiempo de 6 horas. Después de la evaporación, se pasa sobre una columna de sílice (diámetro: 25 mm, eluyente: metanol 15-30%, en CH_{2}Cl_{2}). Se obtienen 413 mg (75%) del compuesto 65.

RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}): \delta = 8,34 (s, 1H); 8,06 (s, 2H); 7,87 (m, 2H); 6,85 (m, 2H), 6,60 (s, 2H); 5,93 (s, 2H); 5,40 (s, 1H); 4,45 (s, 1H); 4,27 (m, 2H), 3,43-3,68 (m, 24H); 3,31 (s, 6H); 3,25 (m, 4H); 2,98 (m, 2H); 2,83 (dd, 2H, J =12 y 5 Hz); 2,70 (t, 2H, J = 13 Hz); 2,13 (t, 4H, J = 7 Hz); 1,89 (quintupleto, 4H, J = 7 Hz; 1,55-1,70 (m, 12 H); 1,37 (m, 4H).

\bullet [Bio-EG_{3}]_{2}-aldehído 66

El acetal 65 (414 mg; 0,376 mml), en solución en el metanol, se trata con HCl 2N (0,5 ml). Después de evaporación y lavado con éter, se obtiene el aldehído 66 (0,37 g, 90%).

RMN ^{1}H (300 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 10,11 (s, 1H), 8,82 (t, 2H, J = 6 Hz); 8,62 (s, 1H); 8,47 (s, 2H); 7,73 (t, 2H, J = 5 Hz); 4,30 (m, 2H); 4,11 (m, 2H, 3,30-3,60 (m, 24H); 3,06 (m 6H); 2,80 (dd, 2H J = 12 y 5 Hz); 2,56 (t, 2H, J = 12 Hz); 2,03 (t, 4H, J = Hz), 1,78 (quintupleto, 4 H, J = 7 Hz); 1,35-1,60 (m, 12H); 1,28 (m, 4H).

\bullet [Bio-EG_{3}]_{2}-PDAM 67

El aldehído 66, se transforma en diazometano 67, según el procedimiento utilizado para la preparación de los diazometanos (ejemplo 1).

La estabilidad del reactivo, es superior a un mes, a una temperatura de -20°C.

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Ejemplo 26.2

Síntesis del meta-Bio7-EG3-PMDAM

Esquema de síntesis

59

Compuesto EG_{3}-acetofenona 76

Se procede a disolver el ácido 3,6,9-trioxa-1,11-undecanoico (EG_{3}, 12,64 ml, 75 mmol), en 80 ml de DMF anhidra, bajo atmósfera de argón, y se enfría en un baño de hielo. Se procede, a continuación, a disolver la diciclohexilcarbodiimida (DCC, 11,45 g, 55,5 mmol), en 20 ml de DMF anhidra, y se añade lentamente. Después de un tiempo de 30 minutos, se añade la 3-aminofenona (5,0 g, 37 mmol) y se deja reaccionar durante un tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente, bajo atmósfera de argón. A continuación, se procede a evaporar la DMF, bajo la acción del vacío, y se añaden 70 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se filtra la solución, y ésta se extrae con 3 x 25 ml de ácido acético al 1%. Las fases acuosas, se reúnen y se lavan con 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas, se mezclan, se secan con sulfato de sodio anhidro, y se evaporan a seco. El producto, se recristaliza en la pareja MeOH: H_{2}O. Se obtienen, de este modo, 8,74 g (70%) del producto 76.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 2,55 (s, 3H), 3,5-3,7 (m, 8H); 4,0 (s, 2H); 4,1 (s, 2H), 7,45 (t, 1H); 7,65 (d, 1H); 7,90 (d, 2H); 8,2 (s, 1H); 9,8 (s, 1H).

Compuesto (NH_{2})_{7}-EG_{3}-acetofenona 77

Se procede a disolver el producto 76 (120 mg, 0,35 mmol), en 15 ml de DMF anhidra, en atmósfera de argón, éste se enfría sobre hielo y, a continuación, se añade el DCC (110 mg, 0,53 mmol). Después de un tiempo de 30 minutos, esta solución, se añade lentamente, y bajo una fuerte agitación, sobre una solución del dendrímero comercial "Starburst PAMAM Dendrimer, Generation 1" (Aldrich, St. Quentin Fallevier (1 g, 0,71 mmol, en 5 ml de metanol). Se deja reaccionar a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 1 hora, y éste se evapora. El residuo, se recoge en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} y se extrae dos veces con 30 ml de ácido acético.

Compuesto Biot_{7}-EG_{3}-acetofenona 78

Se procede a solubilizar la D-diotina (1,73 g, 7,08 mmol), en 80 ml de DMF anhidra, en atmósfera de argón y, la solución, se enfría sobre hielo. Se añaden, sucesivamente, la N-metilmorfolina (NMM, 856 \mul, 7,7 mmol) y el cloroformiato de isobutilo (1022 \mul, 7,7 mmol). Después de un tiempo de 30 minutos, se añade el producto 77 (1,13 g, 0,7 mmol, en 5 ml de metanol), y se deja reaccionar durante un tiempo de 3 horas, sobre hielo, y bajo atmósfera de argón. Se concentra bajo la acción del vacío, hasta 50 ml, y se añaden 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se forma un precipitado, el cual se filtra, se lava con éter, y se seca bajo la acción del vacío. Se obtienen, de este modo, 1,3 g del producto 78, en forma de una materia en polvo de color blanco.

Compuesto Biot_{7}-EG_{3}-hidrazona 79

Se procede a disolver el compuesto 78 (300 mg, 0,09 mmol), en 10 ml de etanol absoluto, a reflujo. Se añade hidrazina monohidrato (20 ml, 0,40 mmol) y se deja reaccionar durante un tiempo de 3 horas, a reflujo. Después del enfriamiento, se forma un precipitado, el cual se filtra, se lava con éter y se seca bajo la acción del vacío. Se obtienen, de este modo, 109 mg (36%) del producto 79, en forma de una materia en polvo, de color blanco.

Compuesto Biot_{7}-EG_{3}-PMDAM 80

Se procede solubilizar la hidrazona 79 (100 mg, 0,03 mmol) en 5 ml de DMF anhidra, a una temperatura de 70°C. Se deja volver a la temperatura ambiente, y se añade el MnO_{2} (31 mg, 0,36 mmol). Se deja reaccionar durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, se elimina el óxido de manganeso por filtración sobre un fritado, con celite (0,5 cm, y tamiz molecular en polvo (0,5 cm). El filtrado, se evapora hasta secado, se lava con éter y se seca bajo la acción del vacío. Se obtienen, de este modo, 78 mg (78%) del producto 80.

Los dendrímeros, son modelos arborescentes que poseen, en las extremidades, varios grupos reactivos, tales como las aminas, los carboxilos, los hidroxilos y otros (para revisión, véase el trabajo de Newcome et al., (1996) Dendritic molecules: Concept, Syntheses, Perspectives, -Moléculas dendríticas: Concepto, síntesis, perspectivas-. VHC ed., Weinheim, Alemania). La síntesis de estas moléculas, se conduce hoy en día bien, y se comercializan numerosos dendrímeros en le mercado, procedentes de la industria química. La elección del PAMAM (Sigma Aldrich), se realizó en base a su aceptabilidad, solubilidad y suavidad, puesto que están disponibles, en el mercado, varias versiones de estas moléculas, con un número y tipo de terminaciones diferentes. El "PAMAM Generation 1", permite añadir siete moléculas del marcado (en una sola etapa de síntesis), para cada grupo diazometilo.

Ejemplo 27 Marcaje y fragmentación de los amplicones ADN, con el meta-Bio-PMDAM

Se procedió a preparar amplicones ADN, mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se realizaron dos reacciones de marcaje.

a. Marcaje y fragmentación en dos etapas a

A 10 \mul de PCR, se le añaden 10 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 77 \mul de agua " Dnase/Renasefree". La solución, se incuba durante 10 minutos, a 95°C. A continuación, se añaden 3 \mul de HCl a 0,1 M, y, la solución, se incuba durante 60 minutos a 95°C.

b. Marcaje y fragmentación en una etapa:

A 10 \mul de PCR, se le añaden 10 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO), 5 \mul de HCl a 0,1 M y 75 \mul de agua "Dnase/Renase free". La solución, se incuba durante 30 minutos a 65°C. El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 9.

Resultados TABLA 13 Estudio comparativo del marcaje y de la fragmentación, en dos etapas distintas y en una sola etapa

60

Tal y como lo demuestra la tabla 13, los resultados obtenidos con el protocolo en una etapa, son satisfactorios. Los resultados obtenidos con un marcaje y fragmentación en dos etapas, son todavía mejores. Este ejemplo, muestra el hecho de que, las etapas de marcaje y de segmentación, pueden disociarse, para mejorar el marcaje, en función de la diana utilizada.

Ejemplo 28 Marcaje y fragmentación de los amplicones ADN, con diferentes formatos de reacción

Se procedió a preparar amplicones ADN, mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se realizaron tres reacciones de marcaje.

a. Marcaje y fragmentación en un formato de 250 \mul

A 50 \mul de PCR, se le añaden 75 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 102,5 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba 25 minutos a 95°C. A continuación, se añaden 22,5 \mul de HCl a 0,1 M, y, la solución, se incuba durante 5 minutos a 95°C.

b. Marcaje y fragmentación en un formato de 200 \mul

A 50 \mul de PCR, se le añaden 75 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 52,5 \mul de agua "Dnase/Renase-free". La solución, se incuba 25 minutos a 95°C. A continuación, se añaden 22,5 \mul de HCl a 0,1 M, y, la solución, se incuba durante 5 minutos a 95°C.

c. Marcaje y fragmentación en un formato de 150 \mul

A 50 \mul de PCR, se le añaden 75 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 2,5 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba 25 minutos a 95°C. A continuación, se añaden 22,5 \mul de HCl 0,1 M, y, la solución, se incuba durante 5 minutos a 95°C.

El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 9.

Resultados TABLA 14 Marcaje y fragmentación, según diferentes formatos

61

Los resultados obtenidos, en términos de señal y de porcentaje de homología, son muy satisfactorios, en todos los casos de estas figuras. Además, si bien el formato de reacción varía entre 150 y 250 \mul, los resultados, tienen valores similares.

Este ejemplo, muestra una flexibilidad del formato reactivo del protocolo de marcaje, pudiendo aceptar diferentes volúmenes y, especialmente, diferentes volúmenes de productos de amplificación.

Tal y como lo demuestra la tabla 13, los resultados obtenidos con el protocolo en una etapa, son satisfactorios. Los resultados obtenidos con un marcaje y fragmentación en dos etapas, son todavía mejores. Este ejemplo, muestra el hecho de que, las etapas de marcaje y de segmentación, pueden disociarse, para mejorar el marcaje, en función de la diana utilizada.

Ejemplo 29 Comparación entre un protocolo que utiliza una etapa de purificación antes de la fragmentación y protocolo que utiliza una etapa de purificación después de la fragmentación

Se procedió a preparar amplicones de ADN, mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se realizaron dos reacciones de marcaje.

a. Marcaje y purificación y, después, fragmentación de los amplicones ADN

A 10 \mul de PCR, se le añaden 10 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 80 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba 10 minutos a 95°C. A continuación, se procede a realizar la purificación, según el protocolo descrito en el ejemplo 9. A la solución de amplicones marcados, purificados, se le añaden 6 \mul de HCl a 0,1 M. La solución, se incuba durante 10 minutos, a 95°C. Se añaden cuatrocientos (400) \mul de tampón de hibridación, precalentado a 95°C, durante un tiempo de 10 minutos.

La composición del tampón de hibridación de esta forma obtenido, es idéntica a la del ejemplo 9.

b. Marcaje y fragmentación y, después, purificación, en los amplicones ADN

A 10 \mul de PCR, se le añaden 10 \mul de meta-BioPMDAM (100 mM en DMSO) y 77 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba 25 minutos a 95°C.

A continuación, se añaden 3 \mul de HCl a 0,1 M, y, la solución, se incuba de nuevo, durante 5 minutos a 95°C. El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 9.

Resultados TABLA 15 Comparación entre el protocolo en el que se utiliza una etapa de purificación antes de fragmentación y el protocolo que utiliza una etapa de purificación después de fragmentación

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62

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Este resultado presentado en la tabla 15, muestra el hecho de que, la etapa de purificación, puede inducirse entre dos las etapas de marcaje y fragmentación. Además, la introducción de la purificación entre las etapas de marcaje y de fragmentación, permiten el realizar la desnaturalización durante la segmentación, e hibridar sobre la serie de distribución, la totalidad de los amplicones marcados.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 30 Síntesis del 2-nitro-para-Bio-PDAM

Esquema de síntesis

63

\bullet Protección del aldehído

Se procede a disolver el 2,4-dinitrobenzaldehído, en 250 ml de tolueno, y se añaden 20 ml de etilenglicol y 150 mg de ácido para-toluenosulfónico. Se procede a calentar a reflujo, recuperando agua, en un sistema Dean-Stark, durante un tiempo de 6 horas. Se trata con 150 ml de EtOAc y 100 ml de H_{2}O. La solución, se extrae dos veces con acetato de etilo, se seca la fase orgánica con MgSO_{4} y, a continuación, ésta, se evapora. El aceite obtenido, que corresponde al producto 100, se utiliza para la reacción siguiente.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta = 8,70 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 8,44 (dd, 1H_{aro}, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H_{5}); 8,02 (d, 1 H_{aro}, J = 8 Hz, H_{6}); 6,49 (s, 1H, CH); 4,12-4,06 (m, 4H, CH_{2}-CH_{2}).

\bullet Reducción del derivado dinitro

El 2,4-dinitrobenzaldehído (6,4 g; 25,5 mmol), se disuelve en una mezcla de etanol-agua (6/1) y, a continuación, se añaden 2 equivalentes de Na_{2}S nonahidratado (12,3 g; 51,1 mmol). Se procede, a continuación, a calentar la mezcla reactiva, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Se realizan una evaporación y a continuación una extracción con diclorometano. Después del secado y filtración, el medio reactivo, se evapora, con el fin de obtener un aceite, el cual se purifica directamente sobre columna de sílice (ciclohexano-acetato de etilo 60/40). El compuesto 101, se aísla, con un rendimiento del 45%.

Compuesto 101: F 58-60°C.

RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3})\delta =7,49 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 7,09 (d, 1H_{aro}, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H_{6}); 6,80 (dd, 1 H_{aro}, J = 2 Hz, H_{5}); 6,27 (s, 1H, CH); 3,99-3,97 (m, 4H, CH_{2}-CH_{2}).

\bullet Acoplamiento con la biotina

Se procede a solubilizar la D-biotina (1,0 g, 4,1 mmol) en 20 ml de DMF anhidra y 600 \mul de N-metilmorfolina. Se añade cloroformiato de isobutilo (700 \mul; 5,5 mmol), en atmósfera de argón, procediendo a enfriar en un baño helado. Se deja bajo régimen de agitación durante un transcurso de tiempo de 5 minutos y, a continuación, se añade 1 g (4,75 mmol) del compuesto 101, y 505 \mul de N-metilmorfolina. La solución, se mantiene en régimen de agitación, a la temperatura ambiente, durante un tiempo de 4 horas y, a continuación, se evapora hasta secado. El aceite obtenido, se hace pasar directamente sobre columna de sílice, utilizando, como disolvente de elución, MeOH-DCM 7% y, después, 10%. Se obtiene el producto 102, con un rendimiento productivo del 62%.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}) \delta = 10,40 (s, 1H, NH-CO); 8,31 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 7,77 (d, 1H_{aro}, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H_{5}); 7,68 (dd, 1 H_{aro}, J = 2 Hz, H_{6}); 6,43 (s, amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,36 (s amplia, 1H, NH-CO-NH(, 6,23 (s, 1H, CH); 4,28 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,92 (s, 4H, CH_{2}- CH_{2}); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,85 y 2,76 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,61-1,39 (m, 6H, (CH_{2})_{3}).

\bullet Desprotección del acetal

Se procede a poner el producto 102 (768 mg, 1,76 mmol) en suspensión, en 25 ml de THF. Se disuelve la totalidad, mediante la adición de 4 ml de H_{2}SO_{4} 2N. Se deja bajo agitación, durante un tiempo de 2 horas. Se evapora y, a continuación, se enjuaga y se lava con agua sobre fritado. Se obtiene el compuesto 103 (694 g), en forma de una materia en polvo, de color amarillo, con un rendimiento productivo del 90%.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}) \delta = 10,69 (s, 1H, NH-CO); 10,09 (s, H, CHO); 8,43 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 7,91 (s, 2H_{aro}, H_{5} y H_{6}); 6,42 (s, amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s amplia, 1H, NH-CO-NH)); \delta = 6,23 (s, 1H, CH); 4,29 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 y 2,78 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,61-1,39 (m, 6H, (CH_{2})_{3}).

\bullet Formación de la hidrazona 104

Se pone el aldehído 103, en suspensión en etanol, y se calienta a una temperatura de 80°C. Cuando se añade la hidrazina, se disuelve todo y, la solución, se colora inmediatamente en color naranja. Después de un transcurso de tiempo de 5 minutos, se forma un precipitado. Se calienta bajo régimen de agitación, durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Se filtra sobre fritado y, a continuación, se procede a secar el precipitado. Se obtiene el producto 104 (700 mg; 690 mmol), con un rendimiento productivo del 98%.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}) \delta = 10,31 (s, 1H, NH-CO); 8,31 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 7,96 (s, H, CHO); 7,87 (d, 1H_{aro}, J = 2 Hz, H_{6}); 7,68 (dd, 1H_{aro}, J = 2Hz, J = 6 Hz, H_{5}); 7,31 (s, 2H, NH_{2}); 6,42 (s, amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,34 (s amplia, 1H, NH-CO-NH)); 4,29 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 y 2,78 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,61-1,39 (m, 6H, (CH_{2})_{3}).

\bullet Formación del diazo 105

Se procede a disolver el compuesto 104 (200 mg; 0,492 mg), en 8 ml de DMF. Se añaden, a continuación 400 mg de MnO_{2}. Se agita de una forma vigorosa, durante un tiempo de 10 minutos. Se procede a filtrar sobre "millipore", que contiene celite (espesor, 2 cm) y tamiz molecular en polvo de 3 \ring{A} (0,05 cm). Se evapora hasta secado y, a continuación, se lava con éter. Se filtra de nuevo sobre millipore. Se obtiene el compuesto 105 (180 mg, 0,445 mmol), en forma de un sólido ligeramente naranja, con un rendimiento productivo del 98%.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}) \delta = 10,21 (s, 1H, NH-CO); 8,60 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, H_{3}); 7,77 (d, 1H_{aro}, J = 6 Hz, H_{5}); 7,22 (d, 1H_{aro}, J = 2Hz, J = 6 Hz, H_{6}); 6,60 (s, H, CH-N); 6,41 (s, amplia, 1H, NH-CO-NH); 6,33 (s amplia, 1H, NH-CO-NH)); 4,29 (m, 1H, CH_{2}-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 y 2,78 (sistema ABX, 2H, ^{2}J_{AB} = 5 Hz, ^{3}J_{AX} = 12 Hz, ^{3}J_{BX} = 0 Hz, CH_{2}-S); 2,29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH_{2}-CO); 1,61-1,39 (m, 6H, (CH_{2})_{3}).

La reactividad del compuesto 105, se sometió a test de ensayo, sobre 3'-uridina-monofosfato, seguido por electroforesis capilar. Las condiciones de análisis, son las del ejemplo 6.1. Los resultados, muestran el hecho de que, el tiempo de vida media, es de 45 minutos.

La estabilidad del reactivo, es superior a un mes, a una temperatura de -20°C.

Ejemplo 31 Marcaje y fragmentación de los amplicones de ADN, con el reactivo de marcaje 2-nitro-para-Bio-PDAM

El derivado 2-nitro-para-Bio-PDAM, se obtuvo según el esquema reactivo descrito en el ejemplo 30. Se procedió a preparar amplicones ADN, mediante amplificación PCR, según el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se realizaron dos reacciones de marcaje.

a. Marcaje mediante el reactivo 2-nitro-para-BioPDAM

A 10 \mul de PCR, se le añaden 2 \mul de nitro-para-BioPDAM (100 mM en DMSO) y 5 \mul de HCl y a 0,1 M y 83 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba durante 30 minutos, a 60°C.

b. Marcaje mediante el reactivo meta-BioPMDAM

A 10 \mul de PCR, se le añaden 2 \mul de meta-BioPDAM (100 mM en DMSO) y 5 \mul de HCl y a 0,1 M y 83 \mul de agua "Dnase/Renasefree". La solución, se incuba durante 30 minutos, a 60°C.

El resto del protocolo, es idéntico al del ejemplo 9.

Resultados

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TABLA 16 Estudio comparativo del marcaje del ADN, mediante el derivado 2-nitro-para-BioPDAM, con respecto al derivado meta-BioPMDAM

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El reactivo 2-nitro-para-BioDAM utilizado para el marcaje del ADN, proporciona unos resultados interesantes, en términos de intensidad del marcaje y porcentaje de homología.

Ejemplo 32 Inserción de un doble enlace entre las funciones diazometilo y el nuevo fenilo, alejamiento del DAM y síntesis de una nueva molécula particularmente adaptada a este alejamiento

El objetivo buscado, es el alejamiento de la función diazometilo (DAM) de la estructura aromática, para minimizar el efecto del impedimento estérico, en el momento de la alquilación de los fosfatos y, así, de este modo, en el momento de la hibridación del ácido nucleico marcado con su secuencia complementaria.

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Esquema de síntesis

65

Para la reacción alcohólica de la formación de la (para-metoxicarbonil)-esterilcetona 89, se utiliza el acetato de etilo, para la fuerte acidez de los protones del metileno, lo cual facilita el ataque del grupo formilo, con la eliminación posterior de H_{2}O, (favorecida por la conjugación del doble enlace en el anillo aromático), y descarboxilación por hidrólisis debido al medio básico. El resto de la síntesis, es similar a lo que se ha demostrado en los otros ejemplos.

El producto final para-Bio-EG_{3}-SMDAM 90, posee dos carbonos de más, entre el diazometilo y anillo aromático, lo cual limita los posibles problemas estéricos, al mismo tiempo que se conserva la estabilización del diazometilo, por el sistema aromático, mediante conjugación.

Ejemplo 33 Captura y detección de un ácido nucleico sobre un soporte sólido que porta grupos diazometilos

Se estudió la reactividad de una resina que portaba grupos diazometilo, con objeto de determinar su capacidad de unir los ácidos nucleicos.

El 4-(Diazometil)fenoximetil-poliestireno (referencia 17338, Fluka), es una resina descrita por su poder de unir los grupos carboxílicos, de una forma particular, aquéllos presentes en las proteínas (G. Bhalay, A.R. Dunstan, Tetrahedron Lett. 39, 7803-1998), pero ésta, no se describe por su capacidad de unir las moléculas de ADN. Nosotros, hemos sometido a test de ensayo, la posibilidad de capturar ácidos nucleicos con este reactivo, y de revelarlos mediante un test de ensayo colorimétrico.

La experiencia, se realizó con una parte de los reactivos presentes en el equipo a modo de "kit" HLA-DR oligodetección (referencia 33 202, bioMerieux, Francia, principio de base descrito en la patente europea EP 549 776-B1), que permite la detección de ácidos nucleicos amplificados por PCR, en las microplacas, mediante lectura colorimétrica. En el ámbito de la experiencia descrita, se procede a hacer reaccionar, de una forma simultánea, ácidos nucleicos producidos por PCR, con la resina sometida a test de ensayo, así como con una molécula de para-Bio-EG3-PDAM, cuya síntesis, se evoca en el ejemplo 20. Si el ADN reacciona con las funciones diazometilo presentes sobre los dos compuestos, será posible el revelarla, después del lavado y eliminación de las moléculas fijadas de una forma no covalente, gracias a una reacción colorimétrica que hace intervenir una enzima acoplada a la estreptavidina. La estreptavidina, se encuentra asociada a una peroxidasa del rábano blanco, pudiendo descomponer, esta enzima, una molécula de Ortofenilendiamina (reactivo color 1 del "kit"), en un compuesto detectable a una longitud de onda de 492 nm.

Ejemplo 33.1

Captura y detección del ADN

Se procede a incubar 10 mg de resina, durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C, con 50 \mul de PCR, realizados tal y como se describe en el ejemplo 5, en 400 \mul de agua pura (Sigma), aditivada con 5 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. A continuación, se lava esta resina, con 500 \mul de tampón PBS tween (Reactivo color 0 HLA del "kit", PBS pH 7,0; Twenn 1% BND 0,2 g/l; Ciproflaxacina 0,01 g/l). Se procede, a continuación, a volver a poner la resina en suspensión, en 100 \mul de PBS Tween, y 250 \mul de tampón de hibridación estreptavidina (BPS pH 7,0 TWEEN 0,5%), aditivado con estreptavidina HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE OR, USA), diluida al 1/10000. Se incuba la mezcla reactiva, durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. A continuación, se lava la resina tres (3) veces, mediante 500 \mul de tampón PBS tween, y se procede a incubar a la temperatura ambiente, en presencia de reactivo cromogénico (1 Comprimido color 1, clorhidrato de ortofenilendiamina, diluido en 5 ml de tampón color 2, fosfato de sodio 100 mM, ácido cítrico 40 mM, H_{2}O_{2} 0,03%). Después de un tiempo de incubación de 20 minutos en la oscuridad, la reacción, se bloquea, a continuación, mediante 50 \mul de H_{2}SO_{4} (18 N reactivo color 3). Se procede, a continuación, a recoger el sobrenadante mediante pipeta, y a emplazarlo en un microplaca, para leer la absorbancia del medio reactivo, a 492 nm.

Ejemplo 33.2

Testigo sin ácido nucleico

Se procede a incubar 10 mg de resina, durante un transcurso de tiempo 30 minutos, en 425 \mul de agua pura (Sigma) aditivada con 5 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Se procede, a continuación, a lavar esta resina, mediante 500 \mul de tampón PBS. Entonces, se procede a tratar la muestra, de una forma idéntica a la del procedimiento descrito en el ejemplo 33.1.

Ejemplo 33.3

Testigo con PCR, realizado sin dianas

Se procede a incubar 10 mg de resina en 400 \mul de agua pura, aditivada con 5 \mul de para-Bio-EG3-PDAM, durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C, con 50 \mul de PCR, realizada con un volumen de 25 \mul de agua pura, en lugar del volumen del ADN genómico descrito. Se procede, a continuación, a lavar esta resina, mediante 500 \mul de tampón PBS. Entonces, se procede a tratar la muestra, de una forma idéntica a la del procedimiento descrito en el ejemplo 33.1.

Ejemplo 33.4

Testigo con PCR, realizado sin molécula de revelación

Se procede a incubar 10 mg de resina con 50 \mul de PCR, en 400 \mul de agua pura, durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C. Se procede, a continuación, a lavar esta resina, mediante 500 \mul de tampón PBS. Entonces, se procede a tratar la muestra, de una forma idéntica a la del procedimiento descrito en el ejemplo 33.1.

Ejemplo 33.5

Testigo con ácido nucleico no capturado

Se procede a incubar 10 mg de resina, durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C, con 400 \mul de agua pura, aditivada con 5 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. A continuación, se lava esta resina, con 500 \mul de tampón PBS tween (Reactivo color 0 HLA del "kit", PBS pH 7,0; Twenn 1% BND 0,2 g/l; Ciproflaxacina 0,01 g/l). Se procede, a continuación, a volver a poner la resina en suspensión, en 100 \mul de PBS Tween, y 250 \mul de tampón de hibridación estreptavidina, aditivado con estreptavidina HRP, diluida al 1/10000. Se incuba la mezcla reactiva, durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente. A esta preparación, se le añaden 50 \mul de una preparación de ADN, preparada del siguiente modo:

Se añaden 5 \mul de para-Bio-EG3-PDAM y 70 \mul de agua pura, a 25 \mul de ADN procedentes de una PCR preparada de la misma forma que la que se describe en el ejemplo 5. Esta mezcla, se incuba durante un tiempo de 30 minutos a una temperatura de 60°C y, a continuación, se elimina el exceso de marcador, sometiendo la preparación a una purificación sobre columna QIAquick (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor, efectuando una elución final en un volumen de 50 \mul.

La mezcla reactiva, se incuba durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente y, a continuación, se trata siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 33.1

Resultados TABLA 17 Estudio de la reactividad de una resina que porta grupos diazometilo

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En la tabla 17, un fuerte valor colorimétrico, indica una fuerte concentración de enzimas en el medio reactivo, correspondiente a una presencia importante del ácido nucleico, que porta derivados biotinas. Los testigos, indican el hecho de que, la señal, no es debida a una adsorción no específica del ADN sobre la perla (bolita), a una reacción del para-Bio-EG3-PDAM sobre la resina, o a una absorción de la estreptavidina HPR sobre la resina, sino que, ésta, es debida a la presencia de ADN capturado de forma covalente y marcado mediante el para-Bio-EG3-PDAM.

Ejemplo 34 Marcaje de un producto PCR, que permite su captura y su detección en una microplaca

En este ejemplo, se muestra la posibilidad de marcar una molécula de ADN, con un solo tipo de molécula que porta una función diazometilo, de tal forma que se capture y se detecte este ácido nucleico, en una sola etapa, sobre una microplaca.

La experiencia, se realiza con una parte de los reactivos presentes en el equipo a modo de "kit" HLA-DR oligodetección (referencia 33 202 bioMerieux), que permite la detección de los ácidos nucleicos amplificados por PCR, en microplacas, mediante lectura colorimétrica. En el ámbito de la experiencia descrita, se procede a hacer reaccionar para-Bio-EG3-PDAM, cuya síntesis se encuentra descrita en el ejemplo 20, sobre ácidos nucleicos producidos por PCR. El ADN, reacciona con los grupos diazometilo de la molécula, y se encuentra, de este modo, dotada de biotina injertada sobre sus fosfatos. Será entonces posible el capturar el ácido nucleico, mediante incubación sobre una microplaca, en donde, las moléculas de estreptavidina, son absorbidas, y el revelarlo, gracias a una reacción colorimétrica. Se utiliza un reactivo de detección, el cual es también una molécula de estreptavidina, asociada a una peroxidasa del rábano blanco (Horse Radish Peroxidasa, HPR). En las condiciones utilizadas, la peroxidasa, puede descomponer una molécula de Ortofenilendiamina (reactivo color 1 del "kit"), en un compuesto detectable a una longitud de onda de 492 nm.

Ejemplo 34.1

Captura y detección del ADN procedente de la PCR, sobre microplaca

Se procede a marcar 10 \mul de ADN obtenido mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, incubando durante un tiempo de 30 minutos a 60°C, en 80 \mul de agua pura (Sigma) aditivada de 10 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Después del marcaje, el ADN, se purifica sobre columna QIAquick (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor y, el eluído final, se recoge en 50 \mul de tampón EB (Tris EDTA 10 mM, pH 8,5). Se procede a diluir veinte (20) \mul de este eluído, en 180 \mul de tampón PEG (0,1 M NaPO_{3}; 0,5 M NaCl; 0,65% Tween 20; 0,14 mg/ml ADN de esperma de salmón (Gibco); 2% PEG 4000), aditivado con estreptavidina HRP (S-911, Molecular Probes, Eugene OR, USA) diluida al 1/10000. Se procede, a continuación, a incubar cien (100) \mul de esta preparación, durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37°C, bien ya sea en un hoyo de "Combiplate 8, estreptavidine coated" (referencia 95029263, Labsystem, Helsinki, Finlandia), bien ya sea en un hoyo testigo, procedente de una barrita de Maxisorb (Nunc,
Danemark).

Ejemplo 34.2

Realización de los testigos

Se procede a realizar testigos, de una forma simultánea, de la forma siguiente:

A - Testigo de marcaje sin ADN

Se procede a incubar noventa (90) \mul de agua pura, aditivada con 10 \mul de para-Bio-EG3-PDAM, durante transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C. La mezcla reactiva, se trata, a continuación, de una forma similar a la del procedimiento que se ha descrito previamente en el ejemplo 34.1

B - Testigo de marcaje sin marcadores

Se procede a incubar diez (10) \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, tal y como se describe en el ejemplo 5, durante transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C, en 90 \mul de agua pura. La mezcla reactiva, se trata, a continuación, de una forma similar a la del procedimiento que se ha descrito previamente en el ejemplo 34.1

Todas las barritas se lavan a continuación, mediante tres veces 100 \mul de tampón PBS Tween (Reactivo Color 0 HLA del "kit", PBS pH 7,0, Tween 1% BND 0,2 g/l; Ciproflaxacina 0,01 g/l) y, a continuación, se revela la presencia de estreptavidina HRP, mediante la adición de 100 \mul del reactivo cromogénico (1 Comprimido Color 1), clorhidrato de ortofenilendiamina, diluido en 5 ml de tampón Color 2, Fosfato de sodio 100 mM, ácido cítrico 50 mM, H_{2}O_{2} 0,03%), incubado durante un tiempo de 20 minutos en la oscuridad, bloqueándose la reacción, a continuación, mediante 50 \mul de H_{2}SO_{4} (1,8 N Reactivo Color 3). La absorbancia del medio reactivo, se mide, a continuación, a 492 nm.

Resultados TABLA 18 Detección del ADN capturado y marcado mediante para-Bio-EG3-PDAM

\vskip1.000000\baselineskip

67

\;

*

Placa combinada

La experiencia expuesta en la tabla 18, muestra por lo tanto el hecho de que, el ADN marcado mediante para-Bio-EG3-PDAM, puede capturarse y detectarse en una sola etapa, en un hoyo de microplaca. Tal y como lo indican los testigos de reacción, la señal generada, se debe únicamente al ADN, y no es el resultado de una adsorción no específica del ácido nucleico sobre la pared de la microplaca, o sobre la estreptavidina, o bien se debe a una reacción no específica de la estreptavidina HRP sobre el ADN no marcado, o sobre el plástico de la microplaca.

Ejemplo 35 Doble marcaje de un producto PCR que permite su captura y su detección sobre un soporte sólido del tipo microplaca

Se muestra, en este ejemplo, la posibilidad de proceder a marcar con dos moléculas, portadoras de funciones diazometilos, y en una sola etapa, una molécula de ADN, de tal forma que se capture y se detecte sobre una microplaca.

La experiencia, se realiza con una parte de los reactivos presentes en el equipo a modo de "kit" HLA-DR oligodetección, que permite la detección de los ácidos nucleicos amplificados por PCR, en microplacas, mediante simple lectura colorimétrica. En el ámbito de la experiencia descrita, se procede a hacer reaccionar simultáneamente, sobre ácidos nucleicos producidos por PCR de

\bullet 1-Pirenildiazometano (PDAM), y

\bullet para-Bio-EG3-PDAM.

Si el ADN, reacciona con las funciones diazometilo presentes en los dos compuestos, éste podrá fijarse sobre un soporte que porte anticuerpos anti-pireno, y será posible el revelarlo, con una molécula de estreptavidina asociada a una peroxidasa del rábano blanco. Esta enzima, puede descomponer una molécula de Ortofenilendiamina, efectuando la función de reactivo de revelación, en un compuesto detectable a una longitud de onda de 492 nm.

Ejemplo 35.1

Doble marcaje de ADN y detección sobre microplaca

Se procedió a absorber, sobre dos barritas Maxisorp, ocho (8) hoyos de los anticuerpos anti-pireno, incubando, una noche, a la temperatura ambiente, 100 \mul de una solución de 1,1 \mul de anticuerpos anti-pireno, diluidos en 100 \mul de tampón bicarbonato (0,05 M pH 9,6). Tales tipos de anticuerpos, denominados Rabbit anti-pireno (Rabbit anti-pyrene (Ref: YSRT-AHP236), se encuentran comercialmente disponibles en el mercado, de procedencia de la firma Chemical & Scientific (Westbury, New York, Estados Unidos de América). En el bien entendido, esto podría haberse realizado con otros anticuerpos comercialmente disponibles, sin que existan resultados divergentes con relación a los que hemos obtenido en este ejemplo.

Se procedió, a continuación, a marcar 10 \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, incubando durante un tiempo de 30 minutos a 60°C, en 40 \mul de agua pura (Sigma) aditivada de 10 \mul de para-Bio-EG3-PDAM, 2 \mul de PDAM (P-1405, 1-pirenildiazometano, Molecular Probes, Eugene, OR, USA), en 38 \mul de DMSO.

Después del marcaje, el ADN, se purificó mediante la utilización de un equipo a modo de "kit" QIAquick (QIAGEN) y, el eluyente final, se recogió en 50 \mul de tampón EB (Tris EDTA 10 mM, pH, 8,5). Se procedió a diluir veinte (20) \mul de este eluído, en 180 \mul de tampón PEG (0,1 M NaPO_{3}; 0,5 M NaCl; 0,65% Tween 20; 0,14 mg/ml ADN de esperma de salmón (Gibco); 2% PEG 4000), aditivado con estreptavidina HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE OR, USA) diluida al 1/10000. Se procedió, a continuación, a incubar cien (100) \mul de esta preparación, durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37°C, bien ya sea en un hoyo de barrita Maxisorp, bien ya sea en un hoyo testigo no absorbido.

Ejemplo 35.2

Realización de los testigos

Se procedió a realizar testigos, de una forma simultánea, de la forma siguiente:

A - Testigo de marcaje con Bio-EG3-PDAM solo

Se procede a marcar diez (10) \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, mediante una incubación de 30 minutos a 60°C, en 90 \mul de agua pura aditivada de 10 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Después del marcaje, el ADN, se purifica mediante la utilización de un equipo a modo de "kit" QIAquick (QIAGEN) y, el eluyente final, se recoge en 50 \mul de tampón EB. Se procede a diluir veinte (20) \mul de este eluído, en 180 \mul de tampón PEG, aditivado con estreptavidina HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE OR, USA) diluida al 1/10000. Se procede, a continuación, a incubar cien (100) \mul de esta preparación, durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37°C, bien ya sea en un hoyo de barrita Maxisorp adsorbida, bien ya sea en un hoyo testigo no absorbido.

B - Testigo de marcaje con PDAM solo

Se procede a marcar diez (10) \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, mediante una incubación de 30 minutos a 60°C, en 90 \mul de agua pura aditivada de 2 \mul de PDAM y 38 \mul de DMSO. Después del marcaje, el ADN, se purifica mediante la utilización de un equipo a modo de "kit" QIAquick (QIAGEN) y, el eluyente final, se recoge en 50 \mul de tampón EB. Se procede a diluir veinte (20) \mul de este eluído, en 180 \mul de tampón PEG, aditivado con estreptavidina HRP (S-911, MOLECULAR PROBES, EUGENE OR, USA) diluida al 1/10000. Se procede, a continuación, a incubar cien (100) \mul de esta preparación, durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37°C, bien ya sea en un hoyo de barrita Maxisorp adsorbida, bien ya sea en un hoyo testigo no absorbido.

\newpage

C - Testigo sin marcaje

Se procede a incubar diez (10) \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, durante un tiempo de 30 minutos a 60°C, en 100 \mul de agua pura. Después del marcaje, el ADN, se purifica mediante la utilización de un equipo a modo de "kit" QIAquick (QIAGEN) y, el eluyente final, se recoge en 50 \mul de tampón EB. Se procede a diluir veinte (20) \mul de este eluído, en 180 \mul de tampón PEG, aditivado con estreptavidina HRP diluída al 1/10000. Se procede, a continuación, a incubar cien (100) \mul de esta preparación, durante un tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37°C, bien ya sea en un hoyo de barrita Maxisorp adsorbida, bien ya sea en un hoyo testigo no absorbido.

Las barritas se lavan a continuación, mediante tres veces 100 \mul de tampón PBS Tween (Color 0) y, a continuación, se revela la presencia de estreptavidina HRP, mediante la adición de 100 \mul del reactivo cromogénico (Color 2), incubado durante un tiempo de 20 minutos en la oscuridad, bloqueándose la reacción, a continuación, mediante 50 \mul de H_{2}SO_{4} (Color 3). La absorbancia del medio reactivo, se mide, a continuación, a 492 nm.

Resultados TABLA 19 Doble marcaje del ADN mediante el PDAM y el para-Bio-EG3-PDAM

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El resultado de la tabla 19, muestra claramente una señal importante resultante de la captura del ADN, en los hoyos, mediante los anticuerpos anti-pireno, así como el marcaje estimulado de éste, mediante la estreptavidina HPR que se ha fijado. Tal y como lo muestra la ausencia de señal al nivel de los testigos, esta detección, es específica del ADN marcado, y no se debe a la adsorción no específica del ADN o de la estreptavidina HPR sobre el plástico, o a un enlace específico de la enzima sobre el ADN capturado. Este ejemplo, muestra por lo tanto el hecho de que es posible el realizar un doble marcaje del ADN en una sola etapa, pudiéndose utilizar, este doble marcaje, para capturarlo y detectarlo simultáneamente.

Ejemplo 36 Marcaje de un producto PCR que permite simultáneamente su captura y su detección mediante sondas nucleicas complementarias

Esta experiencia, permite demostrar que es posible detectar específicamente un ADN, capturándose, el ciado ADN, sobre una superficie sólida, utilizando la reactividad de la función diazometilo, con respecto a un grupo fosfato del ADN.

La experiencia, se realiza con una parte de los reactivos presentes en el equipo a modo de "kit" HLA-DR oligodetección (referencia 33 202, bioMerieux), que permite la detección de los ácidos nucleicos amplificados por PCR, en microplacas, mediante lectura colorimétrica. En el ámbito de la experiencia descrita, se procede a hacer reaccionar para-Bio-EG3-PDAM, sobre ácidos nucleicos producidos por PCR. El ADN, reacciona con las funciones diazometilo de la molécula, y se encuentra de esta forma dotado de biotinas injertadas sobre sus fosfatos. Será entonces posible el capturar el ácido nucleico por incubación sobre una microplaca, en donde, las moléculas de estreptavidina, se adsorben, y el revelarlas, gracias a una sonda constituida por un oligonucleótido complementario de la secuencia capturadas, asociado a una peroxidasa del rábano blanco, pudiendo descomponer, esta enzima, moléculas incoloras de Ortofenilendiamina (reactivo Color 1 del kit), en un compuesto detectable a una longitud de onda de 492 nm.

Ejemplo 36.1

Captura y detección específica del ADN sobre microplaca

Se realiza, en doble, el marcaje de 10 \mul de ADN obtenido mediante amplificación PCR, procediendo a incubar durante un tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C, con 20 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Después del marcaje, el ADN, se purifica sobre columna QIAquick (Nucleotid Removal Kit, Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor, y, el eluyente final, se recoge en 50 \mul de tampón EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5). Se procede a desnaturalizar ochenta y cinco (85) \mul de la mezcla de estos eluídos, mediante 85 \mul del reactivo R4 (NaOH 2N), durante un tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente y, a continuación, la solución, se neutraliza mediante 8,5 \mul de reactivo R5 (ácido acético 2 N). Se añaden, a la mezcla, 850 \mul de tampón de hibridación (R6-Tris-CHl 10 mM, pH 7,0 BND 0,2 g/l, Ciproflaxacina 0,01 g/l) y 85 \mul de oligonucleótido de detección (R7-fosfato de sodio 4 mM, fosfato potásico 1 mM, pH 7,0, albúmina de suero bovino 0,1%, fenol 0,5%). Se depositan cien (100) \mul de esta preparación, bien ya sea sobre el control positivo de una barrita R1, proporcionada con el "kit" (captura mediante una secuencia consenso del gen amplificado), bien ya sea sobre una placa combinada del tipo "Combiplate 8 streptavidine coated" (referencia 95029263, Labsystem, Helsinki, Finlandia), bien ya sea sobre una placa testigo Maxisorp (Nunc, Dinamarca).

Paralelamente, la misma reacción de hibridación, se realiza sobre una dilución, en tampón EB, a la décima parte y a la centésima parte, de la preparación de ADN, con el fin de someter a test de ensayo la sensibilidad de la técnica.

Ejemplo 36.2

Realización de los testigos

Se procedió a realizar testigos, de una forma simultánea, de la forma siguiente:

A - Comparación con el "kit" HLA-DR

Se procede a incubar diez (10) \mul de ADN obtenidos mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, durante un tiempo de 30 minutos a 60°C, con 20 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Después del marcaje, el ADN, se purifica sobre columna QIAquick (QIAGEN) y, el eluyente final, se recoge en un volumen de 50 \mul de tampón EB. Los 45 \mul de eluyente, se desnaturalizan mediante 45 \mul de reactivo R4, durante un tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente y, a continuación, la solución, se neutraliza mediante 4,5 \mul del reactivo R5. Se añaden, a la mezcla, 450 \mul de tampón de hibridación R6 y 45 \mul de oligonucléotido de reacción. Cien (100) \mul de esta preparación, se depositan bien ya sea sobre el control positivo de una barrita R1 proporcionada con el "kit" (hibridación con una secuencia consenso del gen amplificado), bien ya se sobre una "Combiplate 8 estreptavidina", bien ya sea sobre una placa testigo Maxisorp.

B - Hibridación realizada sobre un ADN, no hibridándose a la sonda específica

Se procede a incubar diez (10) \mul de ADN obtenido mediante amplificación PCR, de la forma que se ha descrito en el ejemplo 5, durante un tiempo de 30 minutos a 60°C, con 20 \mul de para-Bio-EG3-PDAM. Después, de procede a tratar la muestra, de una forma idéntica a la del procedimiento descrito precedentemente, en el ejemplo A.

C - Testigo sin ADN

Se procede a depositar diez (10) \mul de reactivo R6 (tampón de hibridación) y 100 \mul de reactivo R7 (oligonucleótido de detección), bien ya sea sobre el control positivo de una barrita R1 proporcionada con el kit, sobre una placa de estreptavidina, bien ya sea sobre una placa testigo del tipo Maxisorp.

Todas las barritas de los protocolos anteriormente descritos, arriba, se incuban durante un tiempo de una hora y media, a una temperatura de 37°C y, a continuación, se lavan mediante tres veces 100 \mul de tampón PBS Tween (reactivo Color 0 HLA) y, a continuación, se revela la presencia de la sonda de detección específica, mediante la adición de 100 \mul del reactivo cromogénico (Reactivo Color 2, PBS pH 7,0; Tween 1%, BND 0,2 g/l; Ciproflaxacina 0,01 g/l), incubado durante un tiempo de 20 minutos en la oscuridad, bloqueándose la reacción, a continuación, mediante 50 \mul de H_{2}SO_{4} (1,8 N reactivo Color 3). La absorbancia del medio reactivo, se mide, a continuación, a 492 nm.

Resultados TABLA 20 Detección específica sobre microplaca, de un ADN procedente de una PCR

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Los resultados de la tabla 20, indican una excelente amplificación de la diana, permitiendo pretender una utilización en un ámbito doméstico. Este ejemplo, muestra el hecho de que, el marcaje al nivel de los grupos fosfato, permite la captura del ADN y no impide la hibridación específica de éste.

Ejemplo 37 Captura y amplificación del ADN procedente de un lisado bacteriano y marcado mediante para-Bio-EG3-PDAM

Este ejemplo, muestra el hecho de que es posible el capturar y amplificar un ADN bacteriano, utilizando una captura basada en la reactividad de la función diazometilo, sobre el fosfato del ácido nucleico.

En el presente caso, los ácidos nucleicos contenidos en un lisado bacteriano y marcados mediante para-Bio-EG3-PDAM, se capturan sobre bolitas magnéticas recubiertas de estreptavidina. La utilización de bolitas magnéticas, permite inmovilizar éstas, mediante imantación, en el momento de los lavados sucesivos que pretenden eliminar los residuos celulares presentes en el medio reactivo, debiendo estos residuos eliminarse, puesto que, éstos, pueden inhibir la amplificación por PCR, la cual se practica a continuación.

Los productos de amplificación, se pudieron analizar mediante pasada sobre series de distribución de ADN.

El ADN bacteriano, se obtiene mediante la lisis celular de las células contenidas en un cultivo de Microbacterium tuberculosis. La lisis, se efectúa por lisis mecánica. De una forma más precisa, ésta se realiza mediante sonificación (tratamiento con ultrasonidos), conteniendo, la muestra líquida tratada, bolitas de vidrio. Un procedimiento de este tipo, se ha descrito ya, de una forma correcta, por parte del solicitante, en su solicitud de patente internacional WO-A-99/15 621, en cuanto a lo concerniente a las bolitas, y en su solicitud de patente internacional WO-A-00/60 049, en cuanto a lo concerniente a la sonificación. La sonificación, puede igualmente realizarse con la ayuda de un baño líquido.

De todos modos, pueden utilizarse otras técnicas conocidas por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica, como las que se describen en la solicitud de patente estadounidense US-A-5.902.746, y en las solicitudes de patentes internacionales WO-A-98/54 303 y WO-A-00/05 338. Todos estos títulos de propiedad industrial, pertenecen al solicitante.

El ADN bacteriano, se cuantificó mediante Picogreen (P-7589; Molecular Probes, Eugene, OR, USA), siguiendo el protocolo descrito por parte del proveedor, a una concentración de 10^{7} copias por \mul.

Se procede a incubar diez (10) \mul de lisado, en presencia de 20 \mul de para-Bio-EG3-PDAM, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C. Paralelamente, se incuban 10 \mul de lisado en 20 \mul de agua pura (Sigma), en las mismas condiciones.

Se procede, a continuación, a purificar el medio reactivo sobre columna QIAquick (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Alemania). El protocolo de purificación utilizado, es el recomendado por el proveedor. El volumen final de elución, es de 50 \mul.

Los fragmentos de ADN marcados, se capturan a continuación, sobre bolitas magnéticas Dynal (Dynabeads M-280 estreptavidin; referencia 112.05; Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega), las cuales se preparan según el protocolo siguiente:

Se procede a lavar noventa (90) \mul de bolitas Dynal, dos veces, mediante 200 \mul de agua pura Free (Sigma) y, a continuación, se recuperan mediante 200 \mul de tampón PEG (0,1 M NaPO_{4}, pH 7, 0,5 M NaCl; 0,65% Tween 20; 0,14 ml de esperma de Hareng (arenque) (Referencia 15634-017, GibcoBRL); 2% PEG 4000), y se incuban durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 37°C. Éstas se lavan, a continuación, dos veces, mediante 200 \mul de tampón PBS 1X Tween 20, 0,5%, y a continuación, finalmente, se recuperan mediante 90 \mul del mismo tampón.

Se procede a incubar diez (10) \mul de eluídos de ADN, marcados o no marcados, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente, con 40 \mul de tampón PEG y 2,5 \mul de la preparación de bolitas magnéticas descritas precedentemente.

A continuación, se procede a lavar tres veces las bolitas, mediante 200 \mul de tampón PBS 1 X tween 0,5%, se recuperan en 200 \mul de agua, y se incuban durante un tiempo de 20 minutos a una temperatura de 60°C y, a continuación, se lavan de nuevo, cuatro veces, mediante 200 \mul de PBS tween. Las bolitas, se recuperan, finalmente, mediante 25 \mul de agua, y se procede a realizar una PCR, siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se efectúan dos controles reactivos, uno de ellos con 25 \mul de agua pura y, el otro, con 2,5 \mul de bolitas preparadas y lavadas en las mismas condiciones que las muestras biológicas, y se recuperan en 25 \mul de agua.

Resultado

Se procede, a continuación, a cuantificar los productos de PCR, mediante Picogreen (P-7589; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) siguiendo el protocolo descrito por el proveedor. Este procedimiento, se basa en la utilización de una molécula (Picogreen) que tiene la particularidad de convertirse en fluorescente, únicamente cuando éstas se posicionan en el interior de una molécula de ADN (intercalándose entre las bases). A raíz del carácter muy específico de esta intercalación, y debido al hecho de que, la señal fluorescente producida, es directamente proporcional a la cantidad de ADN presente en el medio, es posible el dosificar, de esta medo, de una forma muy precisa, la concentración de ácido nucleico presente en una muestra, La señal, se expresa, entonces, en rfu (relative fluorescence unit-unidad de fluorescencia relativa).

El análisis de los resultados de PCR sobre gel, muestran la presencia de una sola banda específica en el tamaño esperado, en las muestras realizadas a partir de ADN genómico marcado mediante para-Bio-EG3-PDAM. Las bandas, no se detectan cuando la PCR se ha efectuado a partir de ADN genómico no marcado. Una cuantificación del ADN mediante Picogreen, permite confirmar la producción de ADN, a partir de ADN genómico capturado sobre bolitas.

TABLA 21 Cuantificación del ADN producido por PCR, a partir de un lisado bacteriano, capturado y purificado mediante para-Bio-EG3-PDAM

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El análisis sobre una serie de distribución de ADN, siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 8, permite confirmar la especificidad de la amplificación, tal y como se muestra en la tabla 34, la cual se facilita abajo, a continuación.

TABLA 22 Detección específica de la diana capturada y purificada mediante el para-Bio-EG3-PDAM

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Este ejemplo, muestra el hecho de que es posible preparar una muestra biológica de tal forma que se amplifique el ácido nucleico que ésta contiene, utilizando una técnica de captura basada en la reactividad de la función diazometilo, sobre los grupos fosfatos de éste.

Ejemplo 38

Amplificación sucesiva de dos genes a partir de un ADN bacteriano capturado sobre un soporte sólido

Este ejemplo, muestra el hecho de que es posible amplificar varias recuperaciones y sobre dianas diferentes, un ADN capturado gracias a la reactividad de la función diazometilo, sobre los grupos fosfatos de éste.

En el presente caso, los ácidos nucleicos contenidos en un lisado bacteriano y marcados mediante para-Bio-EG3-PDAM, se capturan sobre bolitas magnéticas recubiertas de estreptavidina. La utilización de bolitas magnéticas, permite el conservar éstas, mediante imantación, en el momento de los lavados sucesivos que pretenden eliminar los residuos celulares presentes en el medio reactivo, debiendo estos residuos eliminarse, puesto que, éstos, pueden inhibir las amplificaciones por PCR, las cuales se practicarán a continuación. Estas amplificaciones, tendrán lugar sobre dos genes diferentes presentes en el ADN genómico, respectivamente designados con los nombres de 16S y rpoB. Estos dos genes, se analizan, a continuación, mediante la utilización de series de distribución de ADN.

El ADN bacteriano, se obtiene mediante la lisis celular de las células contenidas en un cultivo de Microbacterium tuberculosis, siguiendo el protocolo que se ha descrito ya en el ejemplo 37. El ADN bacteriano, se cuantificó mediante Picogreen, siguiendo el protocolo descrito por parte del proveedor, a una concentración de 10^{7} copias por \mul.

Se procede a incubar diez (10) \mul de lisado, en presencia de 20 \mul de para-Bio-EG3-PDAM, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 60°C. Paralelamente, se incuban 10 \mul de lisado en 20 \mul de agua pura (Sigma), en las mismas condiciones.

Se procede, a continuación, a purificar el medio reactivo sobre columna QIAquick (Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Alemania). El protocolo de purificación utilizado, es el recomendado por el proveedor. El volumen final de elución, es de 50 \mul.

Los fragmentos de ADN marcados, se capturan a continuación, sobre bolitas magnéticas Dynal, las cuales se preparan según el protocolo siguiente:

Se procede a lavar noventa (90) \mul de bolitas Dynal, dos veces, mediante 200 \mul de agua pura Free (Sigma) y, a continuación, se recuperan mediante 200 \mul de tampón PEG (0,1 M NaPO_{4}, pH 7, 0,5 M NaCl; 0,65% Tween 20; 0,14 ml de esperma de salmón (Gibco); 2% PEG 4000), y se incuban durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 37°C. Éstas se lavan, a continuación, dos veces, mediante 200 \mul de tampón PBS 1X Tween 20, 05% y a continuación, finalmente, se recuperan mediante 90 \mul del mismo tampón.

Se procede a incubar diez (10) \mul de eluídos de ADN, marcados o no marcados, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente, con 40 \mul de tampón PEG y 2,5 \mul de la preparación de bolitas magnéticas descritas precedentemente.

A continuación, se procede a lavar tres veces las bolitas, mediante 200 \mul de tampón PBS 1 X tween 0,5%, se recuperan en 200 \mul de agua, y se incuban durante un tiempo de 20 minutos a una temperatura de 60°C y, a continuación, se lavan de nuevo, cuatro veces, mediante 200 \mul de PBS tween. Las bolitas, se recuperan, finalmente, mediante 25 \mul de agua, y se procede a realizar una PCR, siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 5. Se efectúan dos controles reactivos, uno de ellos con 25 \mul de agua pura (Sigma) y, el otro, con 2,5 \mul de bolitas preparadas y lavadas en las mismas condiciones que las muestras biológicas, y se recuperan en 25 \mul de agua.

Después de la amplificación, se procede a recoger el medio reactivo y, las bolitas, se preparan y se lavan, mediante 150 \mul de PBS 1 X Tween 0,5% y, a continuación, se vuelven a suspender en 25 \mul de agua pura (Sigma). Se realiza una nueva amplificación sobre las bolitas, pero en presencia de cebadores destinados a amplificar el gen rpoB.

Se realizan, en paralelo, amplificaciones testigo, a partir de ADN no capturado, sobre dos sistemas de amplificación (rpoB y 16S).

Resultado

Se procede, a continuación, a analizar los productos obtenidos de PCR, mediante series de distribución de ADN, siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 8

TABLA 21 Análisis sobre series de distribución de ADN, de los amplicones ADN procedentes de las PCR amplificadas sucesivamente, o no

72

El análisis de los resultados de PCR sobre gel, muestra la presencia de una sola banda específica del tamaño esperado, en las muestras realizadas a partir de ADN genómico marcado mediante para-Bio-EG3-PDAM. Las bandas, no se detectan cuando la PCR se efectúa a partir de ADN genómico no marcado.

Un análisis mediante serie de distribución de ADN, tal como el que se ha presentando en la tabla 23, facilitada anteriormente, arriba, permite confirmar la especificidad de dos amplificaciones sucesivas de varios genes, a partir de ADN inmovilizado sobre un soporte sólido, permitiendo esto evitar la puesta a punto de sistemas multiplex, que reducen, a menudo, de una forma importante, la sensibilidad y la eficacia de las amplificaciones de ácidos nucleicos.

Ejemplo 33 Captura y amplificación de ADN sobre una membrana de Nylon que porta grupos diazometilos

Se utilizó una membrana de nylon, activada de tal forma que portara grupos diazometilo, con el fin de capturar ADN bacteriano, con la finalidad de amplificar mediante PCR.

Ejemplo 39.1

Modificación del filtro Biodyne C

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Compuesto 68

Se procede a solubilizar la 3'-aminoacetofenona (14,5 g, 107 mmol), en 50 ml de DMF anhidra. Se añade el anhídrido succínico (10,7 g, 107 mol) y se deja bajo agitación, bajo atmósfera de argón, y a la temperatura ambiente. Después de un tiempo de 6 horas, se concentra bajo vacío, y se añaden 50 ml de metanol. El precipitado obtenido, se filtra y se lava con metanol y éter. Se obtienen, de este modo, 19,4 g (81%) del producto 68, en forma de una materia en polvo de color blanco roto.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 2,5-2,6 (m, 7H); 7,45 (t, 1H); 7,64 (d, 1H); 7,83 (d, 1H); 8,19 (s, 1H); 10,16 (s, 1H); 12,12 (s, 1H).

Compuesto 69

Se procede a solubilizar 5,07 g (22 mmol) del compuesto 68, en 10 ml de DMF anhidro, bajo atmósfera de argón. Se coloca sobre hielo, y se añaden 5,00 g (32 mmol) de carbonildiimidazol. Después de un tiempo de 20 minutos, se añaden, lentamente, 20 ml (94,6 mmol) de l,4,7,10-trioxatridecanodiamina (EG_{3}). Después de 3 horas de reacción a la temperatura ambiente, se evapora la DMF, y se recupera el residuo, en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se realizan extracciones con NaHCO_{3} saturado y H_{2}O, después de lo cual, la fase orgánica, se seca con N_{a}SO_{4} anhidro y, el disolvente, se evapora. Se obtienen, de este modo, 4,34 g (46%), del producto 69.

RMN ^{1}H (200 MHz, DMSO-d_{6}): d = 1,59 (m, 2H); 1,87 (m, 2H); 2,16 (s, 3H); 2,40 (m, 2H); 2,55 (m, 2H); 3,08 (m, 2H); 3,45 (m, 16H); 7,30 (t, 1H); 7,42 (d, 1H); 7,70 (d, 1H); 7,83 (t, 1H); 7,97 (s, 1H); 10,00 (s, 1H).

Compuesto 91

Se procede a recortar un rectángulo de 4 cm^{3}, sobre una hoja de filtro Biodyne C (referencia 60314; Pall Gelman Laboratory; Ann Arbor; Michigan, USA), éste se introduce en un frasco, y se pone en contacto con 0,97 g (6 mmol) de carbonildiimidazol (CDI), en 3 ml de DMF anhidra, sobre hielo, bajo atmósfera de argón y bajo fuerte agitación. Después de un tiempo de 20 minutos, la solución, se elimina y el filtro, se lava con DMF. Se procede, a continuación, a añadir una cantidad de 0,53 g del producto 68 (1 mmol) en 3 ml de DMF anhidra y, la reacción, se realiza durante una noche, a la temperatura ambiente. Se recoge la solución y, el filtro, se lava con etanol, se seca bajo la acción de vacío, y se guarda sobre atmósfera de argón.

Compuesto 92

El filtro modificado 91, se pone en una solución de 97 ml de hidrato de hidrazina (2 mmol) en 4 ml de etanol absoluto. La solución, se pone e reflujo, durante un transcurso de tiempo de 5 horas. Después de haber dejado enfriar, el filtro, se lava con H_{2}O, etanol y éter, se seca sobre vacío, y se pone bajo atmósfera de argón. A continuación, se añaden 4 ml de DMF anhidra y 86 mg de MnO_{2} (1 mmol), y se deja reaccionar bajo fuerte agitación. Después de un tiempo de 20 minutos, la solución, se retira y, el filtro, se lava con DMF y éter. El filtro modificado de diazometilo 92, se conserva bajo atmósfera de argón, a una temperatura de -19 a -31°C.

Ejemplo 39.2

Ensayos biológicos

Se procede a cortar la membrana activada, en pequeños fragmentos de 2 mm^{2}, los cuales se incubarán durante un tiempo de 30 minutos a la temperatura ambiente, en 25 \mul de lisado bacteriano Mycobacterium tuberculosis, preparado mediante lisis mecánica, siguiendo la misma técnica y la misma concentración final que en el ejemplo 37, y 377 \mul de agua pura (Sigma).

A continuación, se procede a emplazar la membrana, a una temperatura de 65°C, durante un tiempo de 60 minutos, en 100 ml de tampón de lavado (5% de Formamida (Sigma), 1X SSPE (Perbio), 0,01% triton X-100) con el fin de eliminar los ácidos nucleicos no específicos adsorbidos sobre la membrana y, a continuación, ésta se almacena en 1 ml de agua pura, antes de amplificación.

Se procede a practicar la PCR, de la forma que se describe en el párrafo 5.1, completándose, el volumen reactivo, mediante una cantidad suficiente de agua pura.

Paralelamente, se procede a efectuar controles, siguiendo el mismo procedimiento, con membranas, no pudiendo unir, de una forma covalente, los ácidos nucleicos:

\bullet Membrana Biodyne C no modificada (membrana A),

\bullet Membrana Biodyne C modificada químicamente, siguiendo el procedimiento descrito, pero no tratada mediante DMF anhidra y MnO_{2}; este control, permite verificar el comportamiento de la membrana, en ausencia de grupos diazometilos (membrana B), y

\bullet Membrana Biodyne C no modificada, pero tratada durante un tiempo de 20 minutos, bajo fuerte agitación, mediante DMF anhidra y MnO_{2}, permitiendo verificar, este control, el hecho de que, esta última etapa, no modifica la adsorción del ADN sobre la membrana (membrana C).

Con el fin de controlar la ausencia de inhibición de la PCR, provocada por el tratamiento de las membranas, se procede a amplificar otro fragmento de las membranas A, B, C, simultáneamente, con 25 \mul de lisado bacteriano (tubos A', B', C').

Se procede, a continuación, a cuantificar los productos de PCR, mediante Picogreen, siguiendo el protocolo descrito por el proveedor.

Resultado TABLA 24 Cuantificación del ADN obtenido por PCR, a partir de lisado bacteriano capturado sobre soporte sólido

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Estos resultados de la tabla 24, indican que es posible capturar, de una forma covalente, sobre un soporte sólido, ácidos nucleicos, procedentes de un lisado, gracias a la química diazometilo. La amplificación observada, no es debida a una adsorción no específica del ADN sobre la membrana. Por otra parte, se observa, con los controles efectuados con la PCR, el hecho de que, las membranas, no provocan inhibición de la reacción de amplificación.

Con el fin de controlar la naturaleza del producto amplificado sobre la membrana, el producto de amplificación, se analizó mediante pasada sobre serie de distribución de ADN, siguiendo el protocolo descrito anteriormente, arriba.

Claims (28)

1. Procedimiento de marcaje y fragmentación de un ácido desoxirribonucleico (ADN), simple o de doble hebra, que comprende las siguientes etapas:

- fragmentar el ADN, mediante la intermediación de por lo menos un sitio abásico sobre el citado ADN

- unir un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos, mediante la intermediación de un reactivo de marcaje, acoplándose, el citado reactivo, de una forma covalente y mayoritaria, sobre por lo menos un fosfato del citado fragmento, realizándose, la fragmentación y el marcaje, en una etapa.

2. Procedimiento para la puesta a disposición de sondas de detección de un ácido nucleico diana, el cual comprende el marcaje y la fragmentación de un ácido desoxirribonucleico (ADN), simple o de doble hebra, que comprende las siguientes etapas:

- fragmentar el ADN, mediante la intermediación de por lo menos un sitio abásico sobre el citado ADN,

- unir un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos, mediante la intermediación de un reactivo de marcaje, acoplándose, el citado reactivo, de una forma covalente y mayoritaria, sobre por lo menos un fosfato del citado fragmento.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que, la fragmentación y el marcaje, se realizan en dos etapas.

4. Procedimiento, según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que, la fragmentación y el marcaje, se realizan en una etapa.

5. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que, el sitio abásico, se genera mediante la acción de un medio acuoso ácido.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, el pH del medio ácido, es inferior a 5, de una forma preferente, inferior a 4.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, el medio acuoso ácido, es un tampón formiato de sodio, a un valor pH de aproximadamente 3.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que, el ADN, contiene por lo menos una base modificada, susceptible de poder generar un sitio abásico.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que, la base modificada susceptible de generar un sitio abásico, se elige entre los derivados de la 8-bromopurina.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que, el sitio abásico, se genera mediante un agente alquilante o un agente oxidante.

11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que, el reactivo de marcaje comprende, como función reactiva, una formación elegida entre los compuestos siguientes: diazometilo; halogenuro de alquilo; nitrosurado; espirociclopropano; aziridina; epóxido; trifluorosulfonatos.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que, el citado reactivo de marcaje, es la 5-(bromometil)fluoresceína.

13. Procedimiento, según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que, el reactivo de marcaje, se elige entre los compuestos la fórmula (1):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido,

\bullet Z, comprende un marcador detectable.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que, Z, es:

76

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado por el hecho de que, el reactivo de marcaje, se elige entre los compuestos la fórmula (2):

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en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, es un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es igual a 0 ó 1, y

\bullet Z, se elige entre

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en la cual,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo y,

\bullet -Y-X-, representa -CONH-, -NHCO-, CH_{2}O, -CH_{2}S-.

\newpage

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que, el reactivo de marcaje, tiene la fórmula (3):

79

en la cual,

\bullet R^{1}, representa H ó un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,

\bullet R^{2}, representa un marcador detectable,

\bullet L, es un brazo de enlace, que comporta una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n, es un número entero igual a 0 ó 1,

\bullet R^{3} y R^{4}, representan, de una forma independiente la una con respecto a la otra, N, NO_{2}, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR_{2}, R, NHCOR, CONHR, COOR, en donde, R = alquilo o arilo.

\bullet -Y-X-, representa -CONH-, -NHCO-, CH_{2}O, -CH_{2}S-.

17. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado por el hecho de que, R^{2}, es un compuesto fluorescente o un haptano.

18. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado por el hecho de que, el citado reactivo de marcaje, es soluble en un disolvente miscible con agua.

19. Procedimiento de detección de un ácido desoxirribonucleico diana (ADN), de simple o de doble hebra, que comporta las etapas siguientes:

\bullet fragmentar y marcar los citados ADN, según uno cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1 a 18,

\bullet hibridar los fragmentos marcados, sobre por lo menos una sonda nucleica, suficientemente específica, del ácido nucleico diana, y

\bullet detectar el híbrido formado mediante la intermediación del marcador.

20. Procedimiento de detección de un ácido desoxirribonucleico diana (ADN), de doble hebra, según la reivindicación 19, el cual comporta, además, una etapa de desnaturalización, después de la fragmentación y el marcaje.

21. Procedimiento, según la reivindicación 20, caracterizado por el hecho de que, la fragmentación, el marcaje y la desnaturalización, se realizan en una sola etapa.

22. Procedimiento de detección de un ácido desoxirribonucleico diana, que comporta las etapas siguientes:

\bullet amplificar enzimáticamente el ácido nucleico diana, para generar una multitud de amplicones ADN de doble hebra.

\bullet fragmentar y marcar los citados ADN, según uno cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1 a 18,

\bullet hibridar los fragmentos marcados, sobre por lo menos una sonda nucleica, suficientemente específica, del ácido nucleico diana, y

\bullet detectar el híbrido formado mediante la intermediación del marcador.

23. Procedimiento, según la reivindicación 22, el cual comporta, además, una etapa de desnaturalización, después de la etapa de fragmentación y marcaje.

\newpage

24. Procedimiento, según la reivindicación 23, caracterizado por el hecho de que, la fragmentación, el marcaje y la desnaturalización, se realizan en una sola etapa.

25. Procedimiento de evidenciación de un poliformismo, repartido en posiciones predeterminadas, o no, de un ácido nucleico diana, mediante la presencia de una pluralidad de deleciones y/o de inserciones y/o mutaciones en la secuencia del citado ácido nucleico diana, con relación a una secuencia, denominada de referencia, que comporta las etapas siguientes:

\bullet disponer de un ADN diana, que comporte el conjunto del poliformismo a estudiar, generándose eventualmente, el citado ADN, mediante una técnica de amplificación enzimática,

\bullet fragmentar y marcar el citado ADN, mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

\bullet hibridar los citados fragmentos, sobre una pluralidad de sondas nucleicas denominadas sondas de captura, fijándose, la pluralidad de sondas de captura, sobre un soporte sólido, y cubriendo, la pluralidad de sondas de captura, en su conjunto, por lo menos el poliformismo a estudiar,

\bullet detectar los híbridos formados entre los fragmentos marcados, y por lo menos una parte de las sondas nucleicas, mediante la intermediación del marcador, y deducir de ello, el poliformismo del ADN diana.

26. Procedimiento, según la reivindicación 25, el cual comporta, además, una etapa de desnaturalización, después de la etapa de fragmentación y marcaje.

27. Procedimiento, según la reivindicación 26, caracterizado por el hecho de que, la fragmentación, el marcaje y la desnaturalización, se realizan en una sola etapa.

28. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, comporta por lo menos diez (10) sondas nucleicas de secuencias diferentes, de una forma ventajosa, por lo menos cuatrocientas (400), de una forma preferente, por lo menos mil (1000).