JP2009137954A - 標識試薬、このような試薬の合成方法および生体分子の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】温度安定性標識試薬を開発する。
【解決手段】式の温度安定性標識試薬:

[R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、R³およびR⁴は相互に独立にH、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0から2の整数、好ましくは0または1である。]
【選択図】なし

Description

本発明は、生体分子を標識するための新規の試薬、前記のマーカーを合成するための方法、さらに、特に核酸プローブを使用する診断分野での生体分子を標識するための用途に関する。

先行技術により、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸を標識するために、数多くの方法が存在することが判明している。

第1の方法は、マーカーを塩基に結合(attack)させることからなり、その際、後者は、天然塩基でも修飾塩基でもよい。第2の方法は、マーカーを糖に結合させることを提示しており、この場合にも、天然の糖でも修飾された糖でもよい。第3の方法は、マーカーをリン酸塩に結合させることを目的としている。

塩基での標識は、特に、直接的に標識されたヌクレオチドを導入することにより、核酸を標識する手法で使用されている。

糖での標識は、化学合成により調製された核酸プローブの場合に使用される。

リン酸塩での標識も、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、官能化されたアームおよびマーカーを導入するために使用されている。

実際には、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または核酸の標識を実施すベき当技術分野の専門家は、この結合を、塩基上で、またはより簡単で、代わりとなる糖の上で実施しがちである。これは実際に、塩基では、EP-A第0329198号、EP-A第0302175号、EP-A第0097373号、EP-A第0063879号、US-A第5449767号、US-A第5328824号、WO-A第93/16094号、DE-A第3910151号、EP-A第0567841号または糖では、EP-A第0286898号などの数多くの文献の研究から明らかである。

リン酸塩へのマーカーの結合は、塩基または糖を官能化させることからなる技術よりも複雑な技術であり、特に、リン酸塩の低い反応性により、使われることは少ない(例えば、Jencks W.P.et al., J.Amer.Chem.Soc., 82, 1778-1785頁, 1960年参照)。同様に、O'DonnelおよびMcLaughlinによる概観("Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure", 216-243頁, in "Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed. Hecht S.M., Oxford University Press, 1996)では、オリゴヌクレオチド断片にプローブを導入するための方法に関連して、ヌクレオチド間(internucleotide)ホスホジエステルの有効なアルキル化は、不可能と考えられている。

特許出願WO第99/65926号には、RNAを断片化し、末端リン酸のレベルで標識することからなる合成または天然リボ核酸(RNA)を標識する方法が記載されている。この文献には、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、アルキルハロゲン化物およびベンジルタイプアルキルハロゲン化物官能基に関連して、特に、5'-(ブロモメチル)フルオレセイン誘導体を標識するために使用することができる数多くの官能基が記載されている。これらの官能基により、核酸を標識することができるが、この標識は、断片化の間に遊離されたリン酸塩で生じるので、有効な標識のためには、断片化を伴う必要がある。さらに、有効な標識を得るためには、RNAに対して多大に過剰な標識試薬を加える必要があり、これによって、過剰なマーカーにより生じる背景ノイズの問題が生じる。最後に、この方法は、二本鎖DNAでは有効に作用しない。
EP-A第0329198号 EP-A第0302175号 EP-A第0097373号 EP-A第0063879号 US-A第5449767号 US-A第5328824号 WO-A第93/16094号 DE-A第3910151号 EP-A第0567841号 EP-A第0286898号 Jencks W.P.et al., J.Amer.Chem.Soc., 82, 1778-1785頁, 1960年 Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure("Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids"、216-243頁、Ed. Hecht S.M., Oxford University Press, 1996年) WO第99/65926号 EP-A第0561722号 EP-A第0669991号 WO-A第01/92361号 EP-A第0827552号 US-A第4507466号 US-A第4568737号 US-A第6083708号 特許出願WO-A第00/40590号 WO-A第98/05766号 Randolph J.B.et al., Nucleic Acids Res., 25(14), 2923-2929頁, 1997年 WO-A第00/07982号 FR第2607507号 M.Egholm et al., J.Am.Chem.Soc., 114, 1895-1897頁、1992年 特許US-A第4683195号 US-A第4683202号 US-A第4800159号 EP-B第0569272号 EP-A第0201184号 WO-A第90/01069号 WO-A第90/06995号 WO-A第91/02818号 US-A第5399491号 staline、Hunt S., Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985年 "Chemistry of protein conjugation and cross linking", S.S.Wong, CRC Press 1991年 "Peptide Chemistry, a practical textbook"M.bodansky(Springer Verlag、Berlin, 1988, Chapter V,55-73頁) X.Creary, Organic Syntheses, Wiley: New York, Coll. Vol. VII, 438-443頁, 1990年 H.Zollinger, Diazo Chemistry II, VCH, Weinheim, 34-47頁, 1995年 T.L.Holton and H.Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725-4729, 1995年 T.W.Greene and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd edition, John Wiley and Sons, (New York, 1991年) G.Ramsay, Nature Biotechnology, 16, 40-44頁, 1998年 F.Ginot, Human Mutation, 10, 1-10頁, 1997年 J.Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), 183-200頁, 1996年 T.Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), 2915-2921頁, 1994年 J.Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, 541-546頁, 1998年 Oivanen M. et al.、Chem. Rev., 98, 961-990頁, 1998年 G.Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem., 45, 251-312頁, 1998年 D.S.Sigman et al. Chem. Rev., 93, 2295-2316頁, 1993年 Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties、S.Agrawal発行, Humana Press, Totowa, New Jersey B.Charleux et al., Die Makromolecular Chem., 193, 187頁および205頁, 1992年 EP-B第0350407号 US-A第6110426号 特許US-A第6083763号 T.Okamoto et al., Nature Biotechnology, 18, 438-441頁, 2000年 WO-A第00/60049号 WO-A第00/05338号 WO-A第99/53304号 WO-A第99/15621号 WO-A第97/45202号 WO-A第99/35500号 WO-A第00/40590号 Newcome et al., (1996年) Dendritic Molecules: Concept, Syntheses, Perspectives. VCH Ed., Weinheim, Germany G. Bhalay, A.R. Dunstan, Tetrahedron Lett. 39, 7803頁、1998年 EP第549776-B1 US-A第5902746号 WO-A第98/54306号

したがって、標識収率の観点から有効で、標識位置のレベルで特異的であり、特に、水素結合を介しての二重らせんの形成に関する塩基のハイブリダイゼーションの特性に影響を及ぼさず、DNAおよびRNAの両方に使用することができ、最後に、天然由来か、酵素による増幅により調製されるヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸をそれによって標識することができる新規の試薬に対する必要性が存在する。

本発明は、前記の条件を満たし、標識のための反応性官能基としてジアゾメチル官能基を使用する新規のマーカーを記載する。

ジアゾメチル官能基(式: -C(N₂)-)は既に、リン酸塩基をアルキル化するために使用されているが、数多くの問題が存在する。一方では、ジアゾ誘導体は通常、それ自体不安定で、標識キット中でこれらの標識試薬を使用するには問題があり、他方で、連結の生成物は、不安定で、標識された生成物の役割が、何らかのサンプル中でターゲット生体分子の存在を検出することである場合、その使用は不可能である。

最後に、ジアゾメチル官能基を有する誘導体は、水に不溶性で、このことにより、水または水性緩衝液中でのみ可溶性で安定な生体分子と連結するために、2相状態が用いられるが、これらの状態は、反応速度を遅くし、したがって、連結の効率を邪魔する。

本発明の新規の標識試薬は、これらの技術的問題も解決する。

第1の実施形態では、本発明は、式(0)の温度安定性標識試薬を記載する:

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0から2の整数、好ましくは0または1に等しく、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

第2の実施形態では、本発明は、式(1)の温度安定性標識試薬を記載している

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。
有利には、第2の実施形態の第1の変法では、温度安定性試薬は式(2)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、第2の実施形態の第2の変法では、温度安定性試薬は式(3)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、第2の実施形態の第3の変法では、温度安定性試薬は式(4)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、第1の実施形態の第1の変法では、温度安定性試薬は式(21)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、第1の実施形態の第2の変法では、温度安定性試薬は式(22)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。
有利には、第1の実施形態の第3の変法では、温度安定性試薬は式(23)である。

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールである]。

前記の式(0)から(4)および(21)から(23)では、好ましくは、R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、OCH₃、-CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂-NH-R₂、-CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₄-CH₂-NH-R₂を表す。

したがって、第2の実施形態の第3の変法による好ましい化合物(式(4))は、式(4')である:

[R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。

同様に、第2の実施形態の第1の変法による好ましい化合物(式(2))は、式(2')である:

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。

有利には、式(2')中、ジアゾメチル官能基を有する置換基は、オルトまたはメタ位にある。

同様に、第1の実施形態の第1の変法による好ましい化合物(式(21))は、式(24)である:

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しい]。

「多量体構造」との表現は、化学的または生物学的シントンの繰り返し単位からなるポリマーを意味すると理解されたい。例は、下記の実施例34.2に挙げる。本発明で使用することができるこのような構造の多くの変法は知られていて、例えば、
線状ポリマー(EP-A第0561722号、EP-A第0669991号)、
分枝鎖ポリマー(WO-A第01/92361号)、
粒子(EP-A第0827552号)、
デンドリマー(US-A第4507466号、US-A第4568737号、US-A第6083708号)、
ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドなどである。

「検出可能なマーカー」との表現は、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを発しうる少なくとも1個のマーカーを意味すると理解されたい。これらのマーカーの非限定的なリストは、次である:
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの、例えば測色法、蛍光、発光により検出可能なシグナルを生じる酵素、
蛍光、発光または呈色化合物などの発色団、
電子顕微鏡法により、または導電性、電流測定、電圧測定、インピーダンスなどの電気的特性により検出可能な電子密度を伴う基、
その分子が、物理的および/または化学的特性の検出可能な修飾をもたらすに十分なサイズを有する検出可能な基であって、検出が、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化、接触角変化などの光学的方法により、または原子間力分光法、トンネル効果などの物理的方法により実施することができる基、
³²P、³⁵Sまたは¹²⁵Iなどの放射性分子。

好ましくは、これらのマーカーに伴う安全性の問題を回避するために、マーカーは、放射性マーカーではない。

本発明の特別な実施形態では、マーカーは、電気化学的に検出可能であり、特にマーカーは、フェロセンなどの鉄錯体の誘導体である。

例えば、抗リガンド(antiligand)と反応しうるリガンドなどの間接的な系を使用することもできる。リガンド/抗リガンド対は、当分野の技術者によく知られていて、これは、例えば、次の対のケースである: ビオチン/ストレプトアビジン、ハプテン/抗体、抗原/抗体、ペプチド/抗体、糖/レクチン、ポリヌクレオチド/該ポリヌクレオチドの相補鎖。この場合、ジアゾメチル反応性官能基を有するリガンドである。抗リガンドは、前のパラグラフに記載のマーカーにより直接的に検出することができるか、それ自体、他のリガンド/抗リガンド対によって検出することができる。このスタッキング系は、実施例で詳述する。

間接的な系の他の例は、リガンドと抗リガンドとの、例えばメチルケトンとアルコキシアミンとの間の特異的な共有結合を使用する。この系の例は、特許出願WO-A第00/40590号およびWO-A第98/05766号に記載されている。これらの間接的な検出系は、特定の条件下では、シグナルの増幅をもたらし、ポリマーを使用する化学増幅の例では、先行特許出願WO-A第00/07982号、WO-A第01/92361号およびWO-A第95/08000号を、またはスタッキング化学増幅系では出願WO-A第01/44506号を参照することができる。

シグナル増幅の特別な実施形態では、少なくとも2個のマーカーが、標識試薬の上に存在する。

特に、本発明によるシグナル増幅を実施することを可能にする試薬は、下式の式(5)の構造R²-(L)_n-を有する

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーを表し、
mは、1から100、好ましくは1から20の整数であり
pは、1から10、有利には2から6の整数、好ましくは4である]。

R²-(L)_n-のこの構造は、式(0)から(4)および(21)から(23)の別なく、適用することができる。

シグナル増幅のための他の好ましい標識試薬は、式(6)の試薬である

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーを表し、
R³は、H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数であり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

有利には、シグナル増幅のための試薬は、式(7)を有する

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
R³は、H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールを表し、好ましくはR³は、H、NO₂、OCH₃、-CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂-NH-R₂、-CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₄-CH₂-NH-R₂を表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。

シグナル増幅のためのさらに他の好ましい標識試薬は、式(25)の試薬である

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
R³は、H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数であり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

本発明の好ましい実施形態では、トレーサーは、フルオレセイン、ダンシル、IRタイプの発色団(Li-COR Inc., Lincoln Ne, USA)、Cy5およびCy3などのシアニン誘導体(Randolph J.B.et al., Nucleic Acids Res., 25(14), 2923-2929頁, 1997年)および特に、Cy5誘導体などの低い立体障害の蛍光化合物であるか、もしくは、トレーサーは、ビオチンまたはアビエタン(abietane)誘導体などの低い立体障害のハプテンである(出願WO-A第00/07982号参照)。低い立体障害との表現は、1000g/mol未満の分子量を意味すると理解されたい。

蛍光体の場合には、励起波長が450nmを上回る、好ましくは600nmを上回る蛍光体で作業するのが好ましい。

トレーサーが、例えばビオチンなどの、それ自体はシグナルを発しないハプテンである場合には、前記のように標識された抗リガンドの認識により、検出を実施する。フルオレセインなどの蛍光化合物に連結したビオチン、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体の場合には、Cy5またはフィコエリトリンを使用するのが好ましい。アビエタン(abietane)の場合には、特許出願WO-A第00/07982号に記載されているようなモノクローナル抗体を使用する。

特に、本発明の標識試薬は、DMF、DMSO、CH₃CN、THF、DMA(ジメチルアセトアミド)、NMP(N-メチルピロリドン)、DME(ジメトキシエタン)などの極性溶剤に可溶性である。

好ましくは、標識試薬は、DMSOまたは水に可溶性である。

水混和性溶剤との表現は、水あるいは塩を含有する水性緩衝液に少なくとも5容量%の割合で混和可能な溶剤を意味すると理解されたい。

有利には、前記の式中、アームLは、水への試薬の可溶性を増大させるために、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールモチーフを含有する。

Aは、ジアゾメチル官能基と芳香環との共役を可能にするエチレンタイプの少なくとも1個の二重結合を含む連結アームである。架橋アームAの役割は、ジアゾメチル官能基を環から離して、立体障害を低減しつつ、ジアゾメチル官能基の安定性を維持することである。「共役」との表現は、連結アームAの炭素鎖を伴う芳香環の電子非局在化を意味すると理解されたい。例えば、アームAは、次の構造を有してもよい:

[上式中、
vは、1から10の整数であり、好ましくはvは、1または2であり、
R¹⁰は、Hまたはアルキル基であり、好ましくはR¹⁰は、H、メチルまたはエチルである]。

したがってこれらの試薬は、生体分子と同一な相、いわゆる水を少なくとも50%含有する実質的に水溶液からなる均一な相で結合しうる。

「生体分子」との表現は、生体該当物のターゲット分子との反応を可能にする少なくとも1個の認識部位を有する化合物を意味すると理解されたい。例えば、生体分子として、核酸、抗原、抗体、ポリペプチド、タンパク質およびハプテンを挙げることができる。

「核酸」という用語は、場合によって、イノシン、5-メチルデオキシシチジン、5-ジメチルアミノデオキシウリジン、デオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、5-ブロモデオキシウリジンなどの修飾された塩基またはハイブリダイゼーションを可能にする他の修飾された塩基を含有する少なくとも1個の修飾ヌクレオチド、例えば少なくとも1個のヌクレオチドを含む少なくとも2個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる連続を意味する。このポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、H-ホスホネート、アルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、例えば、α-オリゴヌクレオチド(FR第2607507号)またはPNA(M.Egholm et al., J.Am.Chem.Soc., 114, 1895-1897, 1992)などの骨核のレベルで修飾されていてもよい。核酸は、天然または合成であってよく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームRNA、メッセンジャーRNA、トランスファーRNA、以下の酵素増幅技術:
特許US-A第4683195号、US-A第4683202号およびUS-A第4800159号に記載のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)および特に特許EP-B第0569272号に記載の一段階方式のそのRT-PCR(逆転写PCR)誘導法、
例えば、特許出願EP-A第0201184号で開示されているLCR(リガーゼ連鎖反応)、
特許出願WO-A第90/01069号に記載のRCR(修復連鎖反応)、
特許出願WO-A第90/06995号での3SR(自己持続配列複製)、
特許出願WO-A第91/02818号でのNASBA(核酸配列ベース増幅)、
特許US-A第5399491号でのTMA(転写仲介増幅)
などにより得られる核酸であってよい。

次いで、発現増幅産物(amplicon)を使用して、酵素的増幅技術により生じる核酸を明示する。

少なくとも1種のリン酸塩が核酸中に存在する限り、これらの修飾のそれぞれを、組み合わせて行うことができる。

「ポリペプチド」との表現は、少なくとも2個のアミノ酸からなる連続を意味すると理解されたい。

「アミノ酸」との表現は、
タンパク質をコードする一級アミノ酸、
トランス-4-ヒドロキシプロリンなどの酵素作用の後に誘導されるアミノ酸、
ノルバリン、N-メチル-L-ロイシン、スタリン(staline、Hunt S., Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985参照)などの天然だが、タンパク質中には存在しないアミノ酸および
固体支持体の上で、または液相での合成の際に使用することができる化学的官能基で保護されたアミノ酸および非天然アミノ酸
を意味すると理解されたい。

「ハプテン」との用語は、非免疫原性化合物、即ち、それ自体は、抗体の産生により免疫反応を促進することはできないが、知られている条件下に動物を免疫することにより、特にハプテン-タンパク質複合体で免疫することにより得られる抗体を認識することができる化合物を表している。これらの化合物は通常、3000Da未満の、往々にして2000Da未満の分子量を有し、例えば、グリコシル化ペプチド、代謝産物、ビタミン、ホルモン、プロスタグランジン、毒素または様々な薬剤、ヌクレオシドおよびヌクレオチドであってよい。

「抗体」との用語には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、遺伝的組換えにより得られる抗体、FabまたはF(ab')断片などの抗体断片が含まれる。

「抗原」との用語は、抗体を生じうる化合物を表している。

「タンパク質」との用語には、繊維状および球状、その特徴的な立体形の核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質および糖タンパク質などのホロタンパク質(holoprotein)およびへテロタンパク質(heteroprotein)が含まれる。

有利には、生体分子は、リン酸基、すなわち少なくとも1個のモチーフ

を有する基を有し、これは、生体分子中に天然に存在するか、例えば、化学的または酵素的修飾により導入されうる。タンパク質の化学的修飾の例は、"Chemistry of protein conjugation and cross linking", S.S.Wong, CRC Press 1991に記載されている。

好ましくは、生体分子は、核酸である。

本発明のいくつかの有利な試薬は、
a) 式(8)の試薬

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、
nは、0または1に等しい整数である]。

b) 式(9)の試薬

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、
nは、0または1に等しい整数である]。

c) 式(10)の試薬

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、
nは、0または1に等しい整数である]。

好ましくは、標識試薬は、
a) 式(11)

[上式中、
R¹は、メチル基またはフェニルを表す]、
b) 式(12)

[上式中、
R¹は、メチルまたはフェニル基を表す]、
c) 式(13)

[上式中、
R¹は、メチルまたはフェニル基を表す]を有する。

本発明による他の好ましい試薬は、
a) 式(14)

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、
nは、0または1に等しい整数である]、
b) 式(26)

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。

c) 式(15)

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、
nは、0または1に等しい整数である]。

d) 式(27)

[上式中、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、1に等しく、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームであり、nは、0または1に等しい整数である]。

試薬の変法および実施形態に関わらず、Lは、1から20回、好ましくは1から10回、さらに好ましくは2から5回繰り返される単位-(O-CH₂-CH₂)-を含んでよい。

本発明の他の目的は、次のステップ:

a) 式(16a)の誘導体

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R⁶、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
R⁶は、COOH、COOM、NH₂、OHまたはSHを表し、ここで、M=アルキル、特にメチルまたはエチルであり、
Aは、ジアゾメチル官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0または1に等しい整数である]を用意するステップと、
b) R⁶に相補的な反応性官能基R⁷を有するマーカーまたはマーカー前駆体を用意するステップと、
c) 少なくとも1種のカップリング剤の存在下に、前記マーカーまたはマーカー前駆体の相補的官能基を式(16a)の誘導体の官能基R⁶と反応させ、共有結合を形成するステップと、
d) ヒドラジン誘導体またはヒドラジンを、ケトンまたはアルデヒド官能基と反応させて、ヒドラゾンを生成するステップと、
e) 適切な処理を用いて、ヒドラゾンをジアゾメチル官能基に変えるステップ
を含む標識試薬の合成方法、さらに、この方法により得られる、温度に対して安定な標識試薬を記載することである。

官能基R⁶がCOOHまたはCOOMである場合に、相補的官能基R⁷は、NH₂である。

官能基R⁶がNH₂である場合に、相補的官能基R⁷は、COOHである。

官能基R⁶がOHである場合に、相補的官能基R⁷は、アルキル、ハリド、スルホネート、トシレートから選択される。

官能基R⁶がSHである場合に、相補的官能基R⁷は、アルキル、ハリド、マレイミドから選択される。

合成方法の変法は、次のステップ:
a) 式(16a)の誘導体

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R⁶、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
R⁶は、COOH、COOM、NH₂、OHまたはSHを表し、ここで、M=アルキル、特にメチルまたはエチルであり、
Aは、ジアゾメチル官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0または1に等しい整数である]を用意するステップと、
b) 同じか異なる少なくとも2個の反応性官能基R⁸の中、R⁶に相補的な第1の官能基R⁸およびR⁷に相補的な第2の官能基R⁸を有する連結アームを用意するステップと、
c) 少なくとも1種のカップリング剤の存在下に、連結アームLの第1の反応性官能基R⁸を式(16a)の誘導体と反応させて共有結合を形成し、次いで、少なくとも1種のカップリング剤の存在下に連結アームLの第2の反応性官能基R⁸を前記のマーカーまたはマーカー前駆体と反応させて共有結合を形成するステップと、
d) ヒドラジン誘導体またはヒドラジンを、ケトンまたはアルデヒド官能基と反応させて、ヒドラゾンを生成するステップと、
e) 適切な処理を用いて、ヒドラゾンをジアゾメチル官能基に変えるステップ
を含む。

この特別なケースでは、方法は、化合物(16a)に連結アームLを加え、その後、マーカーまたはマーカー前駆体を反応させる付加的なステップを含む。この場合、連結アームLは、R⁶に相補的で、化合物(16a)へのアームLの連結を可能にする少なくとも1個の第1の反応性官能基R⁸および連結アームLへのマーカーまたはマーカー前駆体の連結を可能にする少なくとも1個の第2の官能基R⁸を有し、その際、アームLに有されている2個の官能基R⁸はそれぞれ、連結手順ならびに化合物(16a)に担持されている反応性官能基R⁶およびR⁷ならびにマーカーまたはマーカー前駆体によって同一または異なってよい。

官能基R⁶および/または官能基R⁷がCOOHまたはCOOMである場合、第1および/または第2の相補的官能基R⁸は、NH₂である。

官能基R⁶および/または官能基R⁷がNH₂である場合、第1および/または第2の相補的官能基R⁸は、COOHである。

官能基R⁶および/または官能基R⁷がOHである場合、第1および/または第2の相補的官能基R⁸は独立に、アルキル、ハリド、スルホネート、トシレートから選択される。

官能基R⁶および/または官能基R⁷がSHである場合、第1および/または第2の相補的官能基R⁸は独立に、アルキル、ハリド、マレイミドから選択される。

R⁶がOHまたはSHである場合には、カップリング剤は、水酸化カリウムまたは炭酸カリウムなどの塩基あるいは有機塩基である。

R⁶がCOOHまたはNH₂である場合、カップリング剤は例えば、ペプチド合成で使用されるカップリング剤から選択される。Springer Verlagにより出版された"Peptide Chemistry, a practical textbook"M.bodansky著(Berlin, 1988, Chapter V,55-73頁)を参照することができる。

「ヒドラジン誘導体」との表現は、NH₂-NH-官能基を有する分子を意味すると理解されたい。トシルヒドラジンは、このような誘導体の1例である。

慣用の方法で、特にMnO₂での酸化により、ジアゾメチルへのヒドラゾンの変換を実施する。

X.Creary, Organic Syntheses, Wiley: New York, Coll. Vol. VII, 438-443頁, 1990年; H.Zollinger, Diazo Chemistry II, VCH, Weinheim, 34-47頁, 1995年; T.L.Holton and H.Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725-4729, 1995年に記載されているような他の方法を使用することもできる。

トシルヒドラジン誘導体を使用する場合には、方法は、X. Creary, Organic Synthesis; Wiley: New York, Coll. Vol. VII, 438-443頁, 1990年に記載されている。

方法の特別な実施形態では、前記の方法は、
化合物(16a)のケトンまたはアルデヒド官能基(式中のR¹がHである場合)を保護する付加的なステップと、
前記のケトンまたはアルデヒド官能基を脱保護する引き続く付加的なステップを含む。

この保護は、例えばアセタール基を用いて達成される。アセタール基では酸性媒体などの適切な手段により、脱保護を実施する。当技術分野の専門家であれば、化合物に応じて、合成のどの時点で、これら2つの保護および脱保護ステップを行うかを決定することができるであろう。

本発明の他の実施形態では、次のステップを含む標識試薬を合成する方法、さらに、この方法により得られる温度に安定な標識試薬を記載する:
a) 式(16)の誘導体

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R⁶、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
R⁶は、COOH、NH₂、OHまたはSHを表す]を用意するステップと、
b) R⁶に相補的な反応性官能基R⁷を有するマーカーまたはマーカー前駆体を用意するステップと、
c) 共有結合を生成する少なくとも1種のカップリング剤の存在下に、前記のマーカーまたはマーカー前駆体の相補的官能基を、式(16)の誘導体のR⁶官能基と反応させるステップと、
d) ヒドラジンまたはその誘導体の1種を、ケトンまたはアルデヒド官能基と反応させて、ヒドラゾンを生成するステップと、
e) 適切な処理により、ヒドラゾンをジアゾメチル官能基に変えるステップ。

官能基R⁶がCOOHである場合、相補的官能基R⁷は、NH₂である。

官能基R⁶がNH₂である場合、相補的官能基R⁷は、COOHである。

官能基R⁶がOHである場合、相補的官能基R⁷は、アルキル、アルキル、ハリド、スルホネート、トシレートから選択される。

官能基R⁶がSHである場合、相補的官能基R⁷は、アルキル、ハリド、マレイミドから選択される。

R⁶がOHまたはSHである場合、カップリング剤は、水酸化カリウムまたは炭酸カリウムなどの塩基である。

R⁶がCOOHまたはNH₂である場合、カップリング剤は例えば、ペプチド合成で使用されるカップリング剤から選択される。Springer Verlagにより出版された"Peptide Chemistry, a practical textbook"M.bodansky著(Berlin, 1988, Chapter V,55-73頁)を参照することができる。

「ヒドラジン誘導体」との表現は、官能基NH₂-NH-を有する分子を意味すると理解されたい。トシルヒドラジンは、このような誘導体の1例である。

慣用の方法で、特にMnO₂での酸化により、ジアゾメチルへのヒドラゾンの変換を実施する。

X.Creary, Organic Syntheses, Wiley: New York, Coll. Vol. VII, 438-443頁, 1990年; H.Zollinger, Diazo Chemistry II, VCH, Weinheim, 34-47頁, 1995年; T.L.Holton and H.Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725-4729, 1995年に記載されているような他の方法を使用することもできる。

トシルヒドラジン誘導体を使用する場合には、方法は、X. Creary, Organic Synthesis; Wiley: New York, Coll. Vol. VII, 438-443頁, 1990年に記載されている

本発明による好ましい1方法は、
a) 式(17)の誘導体

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表す]を用意し、
b) カルボン酸官能基を有するマーカーまたはマーカー前駆体を用意し、
c) アミド結合を生成するための少なくとも1種のカップリング剤の存在下に、前記のマーカーまたはマーカー前駆体のカルボン酸官能基と式(17)の誘導体の一級アミン官能基とを一緒に反応させ、
d) ヒドラジンを、式(17)の誘導体からのケトンまたはアルデヒド官能基と反応させて、ヒドラゾンを生成し、
e) MnO₂の存在下に、前記のヒドラゾンを酸化させて、ジアゾメチル官能基を生成する方法である。

前記の方法のいずれでも、有利には、アルキル基は、直鎖または分枝鎖C₁〜C₄基であり、アリール基は、置換されていてもよいフェニル基である。

好ましくは、R⁴は、メチルまたはフェニルであり、即ち、式(17)の誘導体は、オルト、メタまたはパラ位で置換されている汗トフェノンまたはベンゾフェノンである。

誘導体(17)のアミン官能基は、所望の最終生成物に応じて、オルト、メタまたはパラ位に、好ましくはオルトまたはメタ位に位置する。

カップリング剤は、前記のようなペプチド合成で特に使用されるカップリング剤から選択され、例えば、N-メチルモルホリンなどの塩基の存在下ではiBuOCOClである。

「マーカー前駆体」との表現は、ジアゾメチル官能基とは異なり、マーカーの後の結合、いわゆる方法のステップのいずれか1ステップの後、特に、MnO₂での酸化ステップの前の結合を可能にする前記の官能基と相容性な少なくとも1個の保護されていてもよい反応性官能基を有する化合物を意味すると理解されたい。特に、マーカー前駆体は、連結アームLを有してもよい。マーカー前駆体を使用する手段の1例は、シグナル増幅の場合の下記に記載するが、当技術分野の専門家によく知られている様々な保護基を使用する他の変法も可能である。

シグナル増幅の場合には、合成方法は同様である。マーカー前駆体は、下式(18)を有する。

[上式中、
GP₁およびGP₂は、同じか、異なる、アミン官能基を保護する2個の基を表し、pは、1から10、有利には2から6の整数、好ましくは4である]。有利には、下記に示すようないくつかのモチーフを加えることができるように、GP₁およびGP₂は、異なる。

本発明で使用することができる保護基GP1またはGP2の例は、T.W.Greene and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd edition, John Wiley and Sons, (New York, 1991)に記載されていて、好ましくは、Boc(T-ブチルオキシカルボニル)、Fmoc(9-フルオレニルメチレンオキシカルボニル)、Cbz(カルボキシベンジル)またはAlloc(アリルオキシカルボニル)などのペプチド合成で通常使用されるものである。

特に、GP1またはGP2はそれぞれ、保護基BocおよびFmocである。

カルボキシル官能基を有するこの前駆体と式(17)の誘導体との反応は、アミド結合を生成するカップリング剤の存在下に行う。通常の条件下での2個の保護基の一方、例えば、ピペリジンなどの塩基を用いてのFmocの脱保護の後に、遊離されたアミン官能基を使用して、式(18)の他の分子を連結する。保護基、例えばBoc官能基で保護されたNH₂官能基規模を得るために、必要な回数、このプロセスを繰り返す。モチーフを、1回から100回、好ましくは1回から20回加える。

ヒドラジンを、フェニルケトン誘導体からのケトン官能基と反応させて、ヒドラゾンを生成し、次いでこれを、MnO₂の存在下に酸化させて、ジアゾメチル残留基を生成する。次いで、Boc基を担持するアミン官能基を脱保護した後に、トレーサー、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド基で活性化されたビオチンを、アミン官能基に連結させて、その単位R²-(L)_n-が式(5)の単位である試薬を生成する。

本発明の他の課題は、生体分子、特に核酸を標識する方法であって、溶液中、実質的に均一な水溶液中で生体分子および標識試薬を接触させることを含む方法ならびに、この方法により得られる生成物を記載することである。

「実質的に水溶液」との表現は、少なくとも50%の水を含有する溶液を意味すると理解されたい。この溶液は好ましくは、緩衝溶液などの塩を含有する。

「均一な溶液」との表現は、水/クロロホルム溶液などの2相溶液とは異なり、水/DMSOなどの単一相溶液を意味すると理解されたい。

生体分子およびマーカーによって、標識反応のための個々の条件は変動する。核酸に関しては、5から8のpHによって、効率的な標識が可能である。特に、5.5から7.0のpHが、本発明の全ての試薬で好ましい。式(11)に関しては、pH範囲は、標識のためよりも広い。この試薬では、3から8のpHで、良好な標識効率が得られる。

特に、一本または二本鎖核酸を標識化および断片化するための方法は、いずれかの順序で次のステップ:
核酸を断片化するステップと、
式(19)の化合物

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
Zは、検出可能なマーカーを含む]から選択される標識試薬を介して、マーカーを少なくとも1個の断片に結合させるステップとを含み、この際、前記の試薬は、前記の断片の少なくとも1個のホスフェートに主に共有により結合している。

基Zおよび/またはR¹は、ジアゾメチル官能基を安定させるために選択される、即ち、2個の基Zおよび/またはR¹の少なくとも一方は、フェニル核を有する。

標識試薬と核酸との結合は、共有であるが、非共有相互作用を、特に、スタッキング系で、またマーカーが間接的に検出可能である場合に使用することができることは、前記した。したがって「結合」との用語は、これらの様々な可能性をカバーする。

好ましくは、標識試薬は、式(20)の化合物

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーであり、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しく、
Zは、

(上式中、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す)から選択される]から選択する。

式(19)での特別な一実施形態では、Zは、次の構造を有する。

この場合に、R¹がHであると、標識試薬は、1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)である。

このマーカーは蛍光性であるが、励起波長が核酸の波長に近すぎる。ピレンモチーフを対象とするモノクローナル抗体を使用する間接的な検出が、好ましい。この抗体を調製するための方法は、当技術分野の専門家にはよく知られている(例えば、特許出願WO-A第00/07982号)。

式(1)から(27)で表される本発明による他の新規の試薬、さらに、本発明による合成方法により得られる試薬も、前記の断片化および標識の方法による好ましい試薬である。

標識化および断片化のこの方法は特に、標識された核酸を、所定の位置で個体支持体に結合している多数の核酸、特にオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして、DNAチップを生成する場合に使用することができる。「DNAチップ」との表現は、多数の捕捉プローブが所定の位置に結合している小型固体支持体を意味すると理解されたい。実際に、固体支持体に結合している核酸の密集は、ハイブリダイゼーションの間に高い立体障害を負わせ、断片化によって、このハイブリダイゼーションステップを改善することができる。これらのDNAチップの例は例えば、G.Ramsay, Nature Biotechnology, 16, 40-44頁, 1998年; F.Ginot, Human Mutation, 10, 1-10頁, 1997年; J.Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), 183-200頁, 1996年; T.Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), 2915-2921頁, 1994年; J.Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, 541-546頁, 1998年による刊行物に記載されている。

断片化および標識は、1ステップまたは2ステップで実施し、断片化の前、その後、またはそれと同時に標識を実施することができる。

好ましくは、標識化および断片化を同時に実施する、即ち、これら2つのステップに必要な試薬を一緒に、例えば核酸を伴う実質的に水性の均一な溶液に入れる。これは特に、化学的または酵素的断片化の場合である。物理的手段による機械的断片化の場合には、標識化および断片化を同時に実施するということは、少なくとも核酸および標識試薬を含有する実質的に均一な溶液に物理的手段を適用するということである。

核酸の断片化は、酵素的、化学的または物理的経路で実施する。

核酸の酵素的経路による断片化は例えば、ヌクレアーゼにより実施する。

核酸の物理的経路による断片化は、例えば、超音波処理または放射線により実施する。

化学的経路による断片化は、核酸がRNAである場合には、慣用の方法により実施する(例えば、Oivanen M. et al.によるChem. Rev., 98, 961-990, 1998参照)。

G.Pratviel et al., Adv. Org. Chem., 45, 251-312頁, 1998年による概観またはG.Pratviel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 746-769頁, 1995年による概観に記載されているような金属錯体を、DNAまたはRNAの断片化のために使用することができる。

第1の実施形態では、RNAの化学的断片化は、組み合わされた金属カチオンにより、もしくは化学的触媒を用いて実施する。この場合、金属カチオンは、Mg²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ru³⁺、Ce³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Tm³⁺、Yb³⁺またはLu³⁺イオンであり、化学的触媒は、イミダゾールまたは置換された類似体、例えば、N-メチルイミダゾールまたはRNAに対して親和性を有し、イミダゾール核または置換された類似体を担持する何らかの化学的分子からなる。金属を使用する断片化のための条件は、特許出願WO-A第99/65926号に記載されている。有利には、金属は、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Tb³⁺またはCe³⁺、好ましくはMg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺である。

2から100mMのMn⁺⁺などの金属カチオン濃度、2から100mMのイミダゾール濃度を用いると、効率的な断片化条件が得られる。

3から15mMのMn⁺⁺などの金属カチオン濃度、20から50mM、特に30mMのイミダゾール濃度を用いると、特に効率的な断片化条件が得られる。

反応pHは、5から8でなければならない。有利には、pHは5.5から6.5、好ましくはpHは、6である。その理由は、6のpHが、RNAでの標識化および断片化を同時に実施するための特に有利な折衷点であるためである(標識に関する前記の検討を参照)。

第2の実施形態では、RNAの化学的断片化を、スペルミン、プトレッシンまたはカダベリンなどのポリアミンの作用により実施する。5から100mMの濃度で、断片化が可能である。後者は、ポリアミン10mMから十分である。

第3の実施形態では、RNAの化学的断片化を、鉄、銅または亜鉛などの金属カチオンと組み合わされた1,10-フェナントロリンなどの合成ヌクレアーゼ(G.Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem., 45, 251-312頁, 1998年; D.S.Sigman et al. Chem. Rev., 93, 2295-2316頁, 1993年参照)の作用により実施する。これらのカチオンは、特には溶液の形で、FeSO₄またはCuCl₂またはZnCl₂から得られる。1,10-フェナントロリン2から50mM、特に4から10mMの濃度を、RNAの断片化のために使用する。

DNAの化学的経路による断片化は、核酸を非塩基性(abasic)部位をもたらす化学的手段と接触させることにより実施する。非塩基性部位の生成により、核酸に2-デオキシリボース糖を結合しているN-グリコシド結合の開裂が生じる。これは、プリン(グアニン、アデニン)の損失での脱プリンあるいはピリミジン(シトシン、チミン)での脱ピリミジンに関する。

生理学的条件(pH7.4、37℃)下では、この脱プリンは自発的であるが、反応速度は非常に遅く、1秒当たり3×10^-11脱プリンの速度であり、即ち、効率的な断片化には不十分である。反応速度を高めるために、N-グリコシド結合を脆くするアルキル化剤またはDNAグリコシラーゼ(glycosylase)などの酵素、特にウラシルDNAグリコシラーゼなどの酵素を使用する。

脱プリンまたは脱ピリミジンにより得られる非塩基性部位は、非常に不安定である。この部位のレベルでの断片化は、室温、塩基性媒体中で得られる。酸性媒体中では、高温によっても、この断片化は促進される。β-脱離現象を開始しうる分子を使用しても、断片化は促進される。

酸性pH、即ち、5未満のpHを使用すると、断片化の好ましい実施形態が得られる。有利には、pHは、3である。

pH3のギ酸ナトリウム緩衝液により、本発明の効率的な断片化が可能となる。この緩衝液は、実施例で証明されるように、1ステップ標識条件と相容性である。さらに特に有利には、酸性媒体(HCl、炭酸塩、H₂SO₄)を使用する。

本発明の特別な実施形態では、断片化をさらに増加させるために、デオキシリボ核酸は、非塩基性部位をより簡単に生じうる少なくとも1種の修飾塩基を含有する。

N7-アルキルプリン、N3-アルキルプリン、O6-アルキルプリン、8-ブロモプリン、8-チオプリン、8-アルキルチオプリン、8-アジドプリンまたは8-アルキルスルホニルプリンなどの様々な修飾塩基を使用することができる。

標識すべき核酸を、PCRなどの酵素的増幅技術により生成する場合には、8-ブロモプリンを使用すると、増幅の間に効率的な導入を得ることができ、これは対応して、本発明による断片化および標識の方法を簡単にしつつ、酵素的増幅ステップに対する優れた感受性を維持する。

本発明は、本発明による方法のいずれかにより得られる標識された生体分子、特に標識された核酸を記載する。

本発明はさらに、本発明による標識試薬を含む、生体分子、特にターゲット核酸を検出するためのキットに関する。キットの用途に応じて、例えば、溶解手段(微生物および/または細胞)および/または濃縮手段(シリカまたは磁粒など)および/または酵素的増幅手段などの他の構成要素が、キットに含まれる。

本発明は、ターゲット生体分子、特にターゲット核酸分子を検出するためのプローブとしての、前記で定義した標識された生体分子、特に標識された核酸の使用に関する。

本発明はさらに、捕捉プローブに結合しうる標識ターゲットとしての、前記で定義した核酸の使用に関する。

ターゲット生体分子を検出および/または定量および/または精製できるように、標識された生体分子は、ターゲット生体分子と錯体を生じうる。例えば、核酸タイプのターゲット分子を検出できるように、標識された核酸は、ターゲットに対して十分に相補的で、反応条件、特に温度または反応媒体の塩度に応じて、特異的にハイブリダイゼーションされる。

この検出方法は、研究目的のための配列決定、メッセンジャーRNA発現のプロファイル作成または突然変異のスクリーニング、および製薬工業での薬のスクリーニング、感染または遺伝子疾患の診断あるいは食品または工業制御に適用することができる。

特に感染疾患(例えばAIDSまたは結核)の診断分野での傾向は、血液または尿または髄液タイプの液体サンプルの場合には数ミリリットルが代表的であるサンプル中のただ1個の分子の検出まで感度レベルを下げることである。この感度レベルは、サンプルの採取から結果の提示までの全てのステップを最適化した場合にしか得ることができない。本発明の様々な手段により、難なくこの最適化が可能である。それというのも、本発明の試薬、方法およびプロセスは、様々な生体分子に非常に幅広く適用可能であるためである。特に、必要な感度を得るために酵素的増幅ステップが必要な場合には(HIV、HCVまたは結核などのウイルスまたは細菌感染)、本発明で記載したような標識および/または断片化方法は、増幅技術の感度に影響を及ぼし得ない。それというのも、酵素的増幅技術で使用されるデオキシリボ核酸を置換する必要がないか、導入されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが感度を変えないためである。

本発明に記載のグラフト化学は、反応性および特異性の観点から特徴を有し、他の適用を下記に記載する:
第1の実施形態では、グラフト化学が、固体支持体への核酸の共有結合に適用される、
方法の第1の変法では、前記のようなケトンまたはヒドラジンなどのジアゾメチル官能基の前駆体を、化学合成の間に導入し、ジアゾメチル官能基を、核酸の上に第2ステップで導入する、
方法の第2の好ましい変法では、ジアゾメチル官能基を、固体支持体の上に導入し、核酸を、核酸のホスフェート、特に末端(5'または3')ホスフェートを介して固体の上に結合させる。

核酸の3'または5'末端でのホスフェートの導入はよく知られている("Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties"、S.Agrawal発行, Humana Press, Totowa, New Jersey参照)。

このような固体支持体の個々の実施形態では、リガンド、特にビオチンまたはアビエタンなどのハプテンを担持する標識試薬を、固体支持体に結合させ、これに、例えばストレプトアビジンまたは抗体などの抗リガンドを、共有により、または吸着により結合させる。これらの固体支持体は、当技術分野ではよく知られていて、市販もされている(例えば、微量定量プレート-ストレプトアビジンまたはラテックスのストレプトアビジン)。この場合には、マーカーの役割は、検出を可能にすることにあるのではなく、固体支持体に標識試薬を結合させることにある。次いで、官能基を、核酸と反応させることができる。式(11)、(12)、(13)の誘導体またはPDAM誘導体が、このような固体支持体を調製するために使用することができる試薬の例である。モノクローナル抗体技術により、フルオレセインまたはCy5誘導体などの数多くのマーカーに対する抗体を調製することができる。当技術分野の専門家であれば、固体支持体を調製するこの間接的な方法により全く難なく、本発明の標識試薬を伴う固体支持体を使用することができ、その際、この固体支持体中で、リガンド/抗リガンド反応を使用して、固体支持体にジアゾメチル官能基を結合させる。

固体支持体の第2の実施形態は、ラテックスなどの特別な支持体に関する。重合の様々な方法を使用して、ジアゾメチル官能基または好ましくは、アルデヒドまたはケトンなどのジアゾメチル官能基の前駆体である官能基を有する重合可能な官能性モノマーから、ジアゾメチル官能基を有する粒子を調製することができ、特に:
バッチ反応器中での重合: モノマーを、反応器に入れ、その後、後で添加することなく、他の成分との反応を開始させる。モノマーの反応性の差異により、この方法は往々にして、組成ドリフトを出現させる。このことは、変換率の関数としてかなり変動する組成を有する高分子の算出により証明される。この方法は、表面に導入するために特に効率的とはいえない。大きな割合の官能基モノマーが、粒子内部で、または水溶性ポリマーの形で失われるというリスクを有するからである。共重合をバッチ法で、極性特性を有するモノマーを用いて実施する場合、限られた変換率で、大量に、より小さい粒子が得られる。この特性は、これらのモノマーの高い水溶性に結びついていて、均一な核形成機構を優勢なものとする;
半連続重合: 少なくとも一部のモノマーを、反応の開始時からその終了の間の期間にわたって反応器に導入する。この添加は、一定の速度で、または所定のプロファイルに従って実施することができる。この目的は、モノマーからなる混合物の添加を制御して、制御された組成のコポリマー得ることである(界面の組成の制御);したがって添加状態は往々にして、重合の速度が、添加の速度よりも速いような状態である;
ショット添加重合: 重合反応が進行し始めたら、官能性モノマーを、単独で、または塩基性モノマーの存在下に、制御して系に導入する。したがって運転の成功は、共重合の速度に関する先行する知識に依存している。表面導入を促進するために、これは効率的な方法である。実験状態(添加時での変換率の規模、モノマー混合物の組成および濃度)を選択することにより、表面収率を最適化することができる;
播種重合: これは、官能性モノマーを、すでに構成され、完全に特徴付けられたラテックスを含有する系に導入することからなる。官能性モノマーを、単独で、または播種の塩基性モノマーとの混合物として、単一ステップで、または半連続的に加えることができる
である。

播種重合、ショット添加重合および半連続重合技術が好ましい。それというのも、界面への、ジアゾメチル官能基の前駆体を有する誘導体の最大導入をもたらすためである。アルデヒド官能基を有する粒子の例は例えば、B.Charleux et al., Die Makromolecular Chem., 193, 187頁および205頁, 1992年またはEP-B第0350407号に記載されている。

本発明の他の目的は、式(30)の温度安定な結合中間体を記載することである

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R¹⁵は、求核性または求電子性反応性官能基、特に、COOH、NH₂、SH、OH、O-NH₂、アルキルケトン、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、アルキルハリド、活性化エステル、トシレートを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R¹⁵-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0から2の整数、好ましくは0または1に等しく、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

本発明による好ましい結合中間体は、式(30a)のものである

[上式中、
R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
R¹⁵は、求核性または求電子性反応性官能基、特に、COOH、NH₂、SH、OH、O-NH₂、アルキルケトン、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、アルキルハリド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、トシレートを表し、
Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0から2の整数、好ましくは0または1に等しく、
-Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

固体支持体の第3の実施形態は、例えばNH₂、SH、OH、O-NH₂、アルキルケトン、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、アルキルハリド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、トシレートなどの第1の求核性または求電子性反応性官能基を含有する固体支持体を用意し、次いで、その官能基R¹⁵が固体支持体の第1の反応性官能基に相補的な前記の式(30)または(30a)の結合中間体を反応させることからなる。固体支持体と結合中間体との反応を場合によって、共有結合を生成するためのカップリング剤の存在下に生成する。

前記の様々な実施形態による少なくとも1個のジアゾメチル官能基を有するこのような固体支持体、特に本発明の標識試薬が間接的に結合している固体支持体が、さらに、ジアゾメチル官能基を介して固体支持体に結合している核酸を含有する固体支持体が、本発明の対象である。

このような固体支持体の第1の用途は、DNAチップの製造である。この方法は、個別および所定の位置で固体支持体に核酸を分散させるために存在する。

特許US-A第6110426号は、固体表面に接触させて、制御された容量の液体を輸送させる毛細管を使用して、これらのDNAチップを製造する方法を提案している。毛細管の末端と固体支持体とを有効に接触させて、滴を、毛細管により堆積させる。同様に、特許US-A第6083763号は、それぞれの高さの差異を補正するために、装置中でスライドする毛細管セットを記載している。これらを、個々のオリゴヌクレオチドの毛管現象により、堆積のために平板な表面と接触させる。

特許US-A第6083762号は、固体表面の上に1ナノリットル未満の滴容量を排出するために、圧電形変換器に接続されているミクロディスペンサを含む、滴を分散させるための系を提案している。規定の容量の溶液を排出するバブルを形成するために、毛細管からなる壁に熱源を適用することにより、同様の結果が得られる(T.Okamoto et al., Nature Biotechnology, 18, 438-441頁, 2000年参照)。

したがって、ジアゾメチル官能基によって、核酸を支持体に共有的にグラフトすることができる。グラフトは簡単で、特に吸着に比較すると結合は安定で、末端リン酸に関する反応の選択性によって、固体支持体への核酸の定方位(oriented)連結を実施することができ、対応して、これによって、立体障害が低減されることにより、後のハイブリダイゼーションステップが簡単になる。

本発明による固体支持体の第2の用途は、核酸の精製である。

精製の場合、この精製は、直接的(ジアゾメチル官能基を有する固体支持体を、精製されるべき核酸と反応させる)または間接的(捕捉核酸を、固体支持体に結合させる)である。これらの捕捉核酸は、所望の規模の特異性でハイブリダイゼーションするために捕捉されるターゲットに対して十分に相補的で、これが、ターゲット核酸の精製を可能にする「捕捉核酸/固体支持体」錯体である。

ラテックス粒子、例えば磁粒などの精製で使用するためには、固体支持体は、分散形である。

「精製ステップ」との表現は、特に、微生物の核酸と、核酸の精製に先立つ溶解段階で放出される細胞成分との分離を意味すると理解されたい。これらの溶解段階は、よく知られている。指針としての例では、特許出願:
超音波処理による溶解に関するWO-A第00/60049号、
混合磁気的および機械的溶解に関するWO-A第00/05338号、
電気的溶解に関するWO-A第99/53304号および
機械的溶解に関するWO-A第99/15621号
に記載の溶解方法を使用することができる。

当技術分野の専門家であれば、熱または浸透圧ショックなどの溶解またはグアニジウム塩などのカオトロピック試薬での処理の他のよく知られた方法を使用することができるであろう。(US-A第5234809号)

このステップにより通常、核酸を濃縮することができる。例えば、磁粒(これに関しては、US-A第4672040号およびUS-A第5750338号参照)を使用して、これらの磁粒に結合した核酸を洗浄により精製することができる。後で前記の核酸を増幅するのが望ましい場合には、核酸を精製するこのステップは特に有利である。これらの磁粒の特に有利な実施形態は、特許出願WO-A第97/45202号およびWO-A第99/35500号に記載されている。

ここで使用する場合の「固体支持体」との用語には、核酸が結合しうる全ての材料が含まれる。合成材料または場合によって化学的に修飾された天然材料、特に、セルロースベース材料などの多糖類、例えば、紙、酢酸セルロースおよびニトロセルロースなどのセルロース誘導体およびデキストラン;ポリマー、特にスチレンタイプモノマーをベースとするコポリマー、綿などの天然繊維およびナイロンなどの合成繊維;シリカ、石英、ガラス、セラミックなどの無機材料;ラテックス;磁粒;ゲルなどの金属誘導体を、固体支持体として使用することができる。固体支持体は、微量定量プレート、膜、粒子またはガラスまたはシリコーンまたは誘導体からなる実質的に平坦なプレートの形であってもよい。

本発明は最後に、次のステップを含む核酸を捕捉するための方法に関する:
ジアゾメチル官能基を有する少なくとも1個の分子が直接的または間接的に結合する固体支持体を用意し、
遊離核酸を含有すると思われる生体サンプルを、接触させ、
分子が少なくとも1個の核酸に共有結合している固体支持体を洗浄する。

付加的な情報を、登録番号FR01/06039で2001年5月4日に提出された本出願人による他の特許出願、さらに本発明と同日に提出されたその国際出願に見出すことができる。

添付の図面および実施例は、特別な実施形態を示しており、これによって、本発明の範囲が限定されるとは見なされない。
好ましい実施形態の記載

ビオチンを用いる試薬の合成:

実施例1.1: メタ-BioPMDAMの合成
化合物ビオチン メタ-アセトフェノン1a:
D-ビオチン(1.0グラム(g)、4.1mmol(mmol)を、温かい状態の無水DMF45ミリリットル(ml)に溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590マイクロリットル(μl)、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次加える。混合物を30分間(min)攪拌し続け、次いで、DMF10ml中の3-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)およびN-メチルモルホリン(480μl、4.35mmol)を加える。溶液を0℃に2時間(h)維持し、次いで、蒸発乾燥させる。残留物をMeOH3mlにいれ、次いで、水50mLを加える。得られた沈殿物を濾過し、水、CH₂Cl₂およびエーテルで洗浄すると、粗製生成物1a1.2g(80%)が得られる。MeOH-H₂O対から再結晶化させると、白色の粉末の形の1a(1.01g、70%)が得られる。
融点145℃。- IR (KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590, 1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm^-1。- ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 2.33 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.55 (s, 3H); 2.58; (d, J = 12 Hz, 1H); 2.83 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.13 (m, 1H); 4.15 (m, 1H); 4.31 (m, 1H); 6.34 (s, 1H); 6.41 (s, 1H); 7.44 (t, J = 8 Hz, 1H); 7.64 (d, J = 8 Hz, 1H); 7.85 (d, J = 8 Hz, 1H); 8.17 (s, 1H); 10.05 (s, 1H)。- MS (FAB/グリセロール), m/z: 362 [M+H]⁺。

化合物メタ-ヒドラゾン2a:
1a(500mg、1.38mmol)およびヒドラジン一水和物(200μl、「4.15mmol)からなる無水エタノール(8ml)溶液を還流下に2時間加熱する。室温まで冷却した後に、白色の沈殿物を濾過し、水で、次いでエーテルで洗浄し、乾燥させる。こうすると、生成物2a 385mg(74%)が白色の粉末の形で得られる。
融点185℃。- IR (KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm^-1。- ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 1.98 (s, 3H); 2.26 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.56 (d, J = 12 Hz, 1H); 2.81 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.11 (m, 1H); 4.13 (m, 1H); 4.29 (m, 1H); 6.39 (s, 3H); 6.42 (s, 1H); 7.22 (m, 2H); 7.50 (d, J = 8 Hz, 1H); 7.84 (s, 1H); 9.82 (s, 1H)。- MS (FAB/グリセロール), m/z: 376 [M+H]⁺。

化合物メタ-ジアゾメタン3a
2a(180mg、0.48mmol)を、DMF2mlに溶かす。次いで、MnO₂(340mg、3.9mmol)を加える。室温で30分間攪拌した後に、セライト(厚さ0.5cm)および3Å粉末分子ふるい(0.5cm)を含有する焼結漏斗を介して、混合物を濾過する。反応混合物を濃縮して約0.5mlの容量にし、次いで、エーテル5mlを加える。生じた沈殿物を濾過し、水で洗浄し、次いで乾燥させる。化合物3a(170mg、95%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点160℃。- IR (KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm^-1。- ¹H NMR (300 MHz) δ = 1.3-1.7 (m, 6H); 2.11 (s, 3H); 2.28 (t, J = 8 Hz, 2H); 2.57 (d, J = 12 Hz, 1H); 2.81 (dd, J = 12および5 Hz, 1H); 3.11 (m, 1H); 4.13 (m, 1H); 4.29 (m, 1H); 6.33 (s, 1H); 6.41 (s, 1H); 6.60 (m, 1H); 7.25 (m, 3H); 9.84 (s, 1H)。

実施例1.2: パラ-BioPMDAMの合成:
化合物ビオチン パラ-アセトフェノン1b
D-ビオチン(1g、4.1mmol)を、温かい状態の無水DMF45mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590μl、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し、次いで、4-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)を加える。溶液を0℃で2時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物を水50mlに入れる。得られた沈殿物を濾過し、水で、次いで温かい状態のMeOH50mlで洗浄する。白色の沈殿物を加熱しながら、DMFに溶かし、次いで、得られた溶液を、濾過し、MeOHで洗浄する。濾液を回収し、蒸発乾燥させると、1b 888mg(2.46mmol、60%)が得られる。
融点260℃。- IR (KBr): 3260, 2930, 2358, 1706, 1673, 1610, 1526, 1401, 1380, 1322, 1257, 1150 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.82 (s, 1H, NH-CO); 7.57 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.83 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.40 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.32 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.11 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2.10 (s, 3H, CH₃); 1.60-1.34 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物パラ-ヒドラゾン2b:
化合物1b(870mg、2.4mmol)を温かい状態でエタノール(99%、8ml)に溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(995μl、19.5mmol)を加える。溶液を還流下に3時間加熱する。得られた白色の沈殿物を濾過し、氷冷水で洗浄する。こうすると、生成物2b 820mg(90%)が白色の粉末の形で得られる。
融点305℃。- IR (KBr): 3281, 3183, 2930, 2857, 1698, 1658, 1593, 1521, 1459, 1401, 1325, 1263, 1187 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9.68 (s, 1H, NH-CO); 7.52 (s, 4H, J = 9 Hz, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.21 (s, 2H, NH₂); 4.29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.81および2.56 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.32 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.97 (s, 3H, CH₃); 1.63-1.36 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物パラ-ジアゾメタン3b:
2b(200mg、0.53mmol)をDMF10mlに溶かす。次いで、MnO₂800mgを加える。10分間攪拌した後に、混合物を、セライト(0.5cm)分子ふるい(粉末の形の0.5cm)混合層を介して濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで、エーテルで洗浄し、乾燥させる。化合物3b(190mg、96%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点180℃ (分解)。- IR (KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524, 1510, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.18 (s, 1H, NH-CO); 7.88 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 7.7 (d, 2H, J = 6 Hz, Ar-H); 6.41 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.34 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.12 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.11 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.35 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2.10 (s, 3H, CH₃); 1.60-1.34 (m, 6H, (CH₂)₃)。

実施例1.3: オルト-BioPMDAMの合成
化合物ビオチンオルト-アセトフェノン1c:
D-ビオチン(1g、4.1mmol)を、温かい状態の無水DMF45mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(590μl、5.33mmol)およびクロロギ酸イソブチル(840μl、6.60mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し続け、次いで、2-アミノアセトフェノン(824mg、6.10mmol)を加える。溶液を室温で3時間30分攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物を水50mlに入れる。得られた沈殿物を濾過し、水で、次いで温かい状態のMeOH50mlで洗浄する。得られた沈殿物を濾過し、水で洗浄する。温かい状態のMeOH中に生成物を溶かし、水を加えることにより再沈殿させることにより、再結晶を実施する。沈殿物を濾過し、水で、次いでエーテルで洗浄すると、粗製生成物1c 1.1g(2.95mmol、72%)が得られる。
融点150℃。- IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 11.24 (s, 1H, NH-CO); 8.33 (d, 1H, J = 8.5 Hz, Ar-H); 7.97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H); 7.57 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7.18 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6.44 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.30 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.80および2.55 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.61 (s, 3H, CH₃); 2.37 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.62-1.38 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物オルト-ヒドラゾン2c:
化合物1c(500mg、1.38mmol)を温かい状態でエタノール(99%、8ml)に溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(572μl、11.1mmol)を加える。溶液を還流下に50分間加熱する。溶液を蒸発乾燥させる。得られた白色の沈殿物を濾過し、水で洗浄し、次いでエーテルを用いて乾燥させる。こうすると、生成物2c 416mg(11.1mmol、80%)が、白色の粉末の形で得られる。
融点161℃。- IR (KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 11.97 (s, 1H, NH-CO); 8.35 (d, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 7.45 (d, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 7.19 (t, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H); 7.04 (t, 1H, J = 7 Hz, Ar-H); 6.61 (s, 2H, NH₂); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.32 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.81および2.56 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2.09 (s, 3H, CH₃); 1.63-1.36 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物オルト-ジアゾメタン3c:
2c(200mg、0.53mmol)を、DMF10mlに溶かす。次いで、MnO₂800mgを加える。15分間攪拌した後に、セライト(0.5cm)分子ふるい(粉末の形で0.5cm)混合層を介して混合物を濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで、エーテルで洗浄し、乾燥させる。化合物3c(130mg、65%)が、ピンク色の粉末の形で得られる。
融点110℃。- IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521, 1456 cm^-1。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9.37 (s, 1H, NH-CO); 7.26-7.00 (m, 4H, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.30 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.15 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.82および2.54 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.24 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 2.12 (s, 3H, CH₃); 1.63-1.37 (m, 6H, (CH₂)₃)。

実施例1.4: メタ-BioDPDAMの合成
化合物メタ-連結1d:
D-ビオチン(500mg、2.05mmol)を、温かい状態の無水DMF23mlに溶かす。混合物をアルゴン下に0℃に冷却し、次いで、N-メチルモルホリン(295μl、2.67mmol)およびクロロギ酸イソブチル(420μl、3.28mmol)を順次、加える。混合物を30分間攪拌し続け、次いで、DMF7ml中の3-アミノベンゾフェノン(605mg、3.07mmol)およびN-メチルモルホリン(240μl、2.17mmol)を加える。溶液を0℃で2時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。残留物をMeOH1mlにいれ、次いで、水25mlを加える。得られた沈殿物を濾過し、水、次いでエーテルで洗浄すると、粗製生成物1d 810mg(93%)が得られる。MeOH-H₂O対から再結晶させると、白色の粉末の形の1d(630mg、72%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.10 (s, 1H, NH-CO); 8-7.39 (m, 9H, Ar-H); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.27 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.55 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.59-1.36 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物メタ-ヒドラゾン2d:
1d(350mg、0.83mmol)を、無水エタノール5.5mlに溶かし、次いで、ヒドラジン一水和物(140μl、2.48mmol)を加える。溶液を還流下に一夜加熱する。蒸発の後に、生成物をエタノールおよび水1mlに入れる。白色の沈殿物を再結晶させる: これを、温かい状態の最小量のエタノールに溶かし、若干の曇りが生じるまで、水を加える。冷却した後に、得られた沈殿物を水で洗浄し、次いで、エーテルを用いて乾燥させる。こうすると、生成物2d264mg(73%)が、白色の粉末の形で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9.99 (s, 1H, NH-CO); 9.80 (s, 2H, NH₂); 7.54-6.88 (m, 9H, Ar-H); 6.26 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.21 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.78および2.59 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.57-1.36 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物メタ-ジアゾジフェニル3d:
3d(500mg、0.53mmol)をTHF1mlに溶かす。ついで、活性化MnO₂80mgを加える。室温で5分間攪拌した後に、セライト(0.5cm)-分子ふるい(粉末の形で0.5cm)混合層を介して、混合物を濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。化合物3d(47mg、100%)が、紫色のオイルの形で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 9.95 (s, 1H, NH-CO); 7.60-6.9 (m, 9H, Ar-H); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.83および2.59 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.58-1.35 (m, 6H, (CH₂)₃)。

Cy5で標識するための試薬: Cy5PMDAm

化合物 ヨウ化2-[4-(N-アセチル-N-フェニルアミノ)ブタ-1,3-ジエニル]-1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウム6:
無水酢酸(75ml)中の一塩酸マロンアルデヒドビス(フェニルイミン)5(18.3g、70.0mmol)、NaOAc(9.0g、110mmol)およびヨウ化1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウム(4.25g、14.1mmol)の混合物を110℃に20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(350ml)を加え、沈殿する茶色の固体を濾過し、エーテル(3×100ml)で洗浄する。固体を、CH₂Cl₂150mlに再溶解させ、濾過し(無機塩の除去)、次いで、蒸発させると、茶色の固体(6.0g、90%)が得られる。
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8.64 (d, 1H, J = 12 Hz, 1-H); 8.14 (t, 1H, J = 16, 12 Hz, 3-H); 7.63-7.19 (m, 9H); 6.90 (d, 1H, J = 15 Hz, 4-H); 5.82 (t, 1H, J = 12, 13 Hz, 2-H); 4.06 (s, 3H, NCH₃); 2.16 (s, 3H, -COCH₃); 1.74 (s, 6H, CH₃)。

化合物 臭化1-(5-カルボキシペンチル)-2,3,3-トリメチル[3H]インドリウム9:
2,3,3-トリメチルインドール7(10.0g、62.8mmol)および6-ブロモヘキサン酸8(12.3g、62.8mmol)を、溶剤を用いずに混合し、アルゴン下に、110℃に12時間加熱する。赤紫色のペースト状反応混合物を酢酸エチル(2×60ml、ペーストをスパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する)で、次いで、アセトン(50ml、ペースト凝固)で洗浄する。ピンク色の固体を濾過し、次いで真空下に乾燥させる(16.0g;73%)。

化合物 Cy5COOH 10:
ヨウ化物6(6.0g、12.7mmol)、臭化物9(4.5g、12.7mmol)およびNaOAc(2.6g、32mmol)からなる無水酢酸(35ml)中の混合物を110で20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(150ml)を加え、沈殿物を濾過し、エーテル(3×50ml)で洗浄する。固体を、CH₂Cl₂100mlに溶かし、濾過し、SiO₂カラムでクロマトグラフィー(溶離剤: MeOH5〜10%/CH₂Cl₂)により精製する。3.4g(44%)が、得られる。
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8.03 (t, 2H, J = 10, 11 Hz, 2-H, 4-H); 7.38-6.91 (m, 9H, Ar-H, 3-H); 6.41 (d, 1H, J = 14 Hz, 1-H); 6.31 (d, 1H, J = 13 Hz, 5-H); 4.07 (t, 2H, J = 7, 7 Hz, α-CH₂); 3.68 (s, 3H, NCH₃); 2.47 (t, 2H, J = 7,7 Hz, ε-CH₂); 1.71 (m, 18H, CH₃, β,γおよびδ-CH₂)。

3-アミノアセトフェノンとCy5COOH10とを連結するための化合物(生成物11)
N-メチルモルホリン(360μl、3.2mmol)を、Cy5COOH 10(1.19g、1.9mmol)のCH₂Cl₂12ml溶液に加える。溶液を氷浴で冷却し、次いで、クロロギ酸イソブチル(480μl、3.7mmol)を加える。5分間攪拌した後に、3-アミノアセトフェノン(488mg、3.6mmol)を加える。混合物を室温で3時間攪拌する。エーテル250mlを加えると、ペースト状の固体が得られる。攪拌した後に、固体を放置して、丸底フラスコの底部に位置させ、上澄みをデカンテーション除去する。エーテル50mlを再び加え、媒体を、スパチュラで粉砕して、固体を得る。後者を濾過し、水、エーテルで洗浄し、次いで、真空乾燥させる。次いで、生成物(ヨウ化物)をエタノールに溶かし、アンバーライトIRA900(Cl^-;15g)カラムに通す。エタノール溶液を回収し、蒸発乾燥させ、次いで、SiO₂カラムに通す。青色の固体0.93g(77%)が得られる。

化合物Cy5-ヒドラゾン12:
アセトフェノン11(0.93g、1.46mmol)の無水エタノール5ml溶液に、ヒドラジン一水和物(180μl、3.1mmol)を加え、これを室温で7時間攪拌する。エーテル50mlを加え、沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄する。粗製生成物を、CH₂Cl₂50mlに溶かし、溶液を濾過し、ついで、濃縮して10mlにする。エーテル100mlを加えて、生成物を沈殿させ、濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。生成物12(57%)540mgが得られる。

化合物 Cy5PMDAM12a
MnO₂300mgを、ヒドラゾン12 100mgのDMF2ml溶液に加え、混合物を10分間激しく攪拌する。セライトの層を介して、懸濁液を濾過し、DMF(3×500μl)で洗浄する。エーテル50mlを加え、沈降するオイルを、スパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する。洗浄操作を、エーテル25ml用いて3回繰り返し、こうして得られた固体を濾過し、乾燥させる。生成物12a 65mg(65%)が得られる。生成物の純度は、約80〜85%(¹H NMR)である。

合成される他の試薬:
実施例3.1: パラニトロフェニルジアゾメタン(NPDAM)の合成:
4-ニトロベンズアルデヒドは、市販されている(参照28、118-2、Aldrich, France)。

THF9mlに溶かされているこの生成物600mg(3.64mmol)で、作業を実施する。溶液を5分間攪拌し続け、次いで、MnO₂1.26g(4当量、14.56mmol)を慎重に加える。混合物を10分間攪拌し続け、次いで、濾過する。回収された濾液を、蒸発乾燥させる。ペンタンで洗浄した後に、化合物パラ-ニトロフェニルジアゾメタンが、明るいオレンジ色の粉末の形で、収率79%で得られる(468mg、2.87mmol)。
融点80-82℃。- ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.11 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H ₃); 7.18 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H ₂); 6.06 (s, 1H, CH ₁-N₂)。

実施例3.2: フェニルメチルジアゾメタン(PMDAM)の合成
アセトフェノンヒドラゾン: アセトフェノン(2.0g、16mmol)を、無水エタノール16ml中で希釈し、次いで、ヒドラジン(2.3ml、48mmol)を加える。混合物を還流温度まで加熱する。2時間後、溶剤を蒸発させ、残留物をエーテル(150ml)に入れる。媒体を水(100ml)で洗浄する。Na₂SO₄上で乾燥させた後に、エーテルを留去する。淡黄色のオイル(1.5g、11mmol、69%)が得られる。

フェニルメチルジアゾメタン(PMDAM): ヒドラゾン(150mg、1.1mmol)を、THF3mlに溶かす。MnO₂(480mg、5.5mmol)を加える。媒体を室温で30分間攪拌する。媒体は赤色になる。これを濾過し、溶剤を留去する。赤色のオイル(145mg、100%)が得られる。この試薬を、精製することなく使用する。

実施例3.3: ジフェニルジアゾメタン(DPDAM)の合成:
ベンゾフェノンヒドラゾンは、市販品に由来する(参照B960-2Aldrich, France)。

THF5mlに溶けた196mg(1.0mmol)で、作業を実施する。MnO₂435mg(5当量、5.0mmol)を加え、混合物を10分間攪拌し続け、次いで、濾過する。回収された濾液を蒸発乾燥させる。193mg(0.99mmol)が得られる。この試薬を、精製することなく使用する。

実施例3.4: NVDAMの合成

前記のプロトコルに従い、6-ニトロベラトラルデヒド(Aldrich, 参照27、960-9)から、この合成を実施する。

NPDAMからのビオチン化誘導体の合成

2-アミノ-4-ニトロベンズアルデヒド誘導体を、前記で参照したMe Wall et alに従い調製する。

ジアゾメタンNPDAMの調製は、前記の実施例3.1に記載の調製と同一である。

DNAおよびRNA核酸の調製
実施例5.1: DNA増幅産物の調製:
PCRにより、16S結核菌(Mycobacterium tuberculosis)ゲノムDNAターゲット(出発ターゲットとしての10^E+4コピー)から、RocheからのFast start kit、デオキシリボヌクレオチドそれぞれ0.2mM(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、プライマー0.3μMおよび酵素0.4μlを使用して、DNA増幅産物を生成する。

PCRパラメーターは、次である:
-95℃: 4分、次いで35サイクル(95℃: 30秒; 55℃: 30秒; 72℃: 30秒)、次いで4℃。

増幅産物を、アガロースゲル電気泳動法により定量分析する(1.5%、TBE 0.5X)。析出される容量は5μlであり、移動を、100ボルト(V)で20分間行う。PCR生成物の可視化を、臭化エチジウムで染色した後に、UVランプ下で実施する。

培養、マイコバクテリアの抽出および増幅プライマーの条件は、特許WO-A第99/65926号に記載されている。

実施例5.2: 転写RNAの調製:
PCRターゲット(結核菌16S RNA 断片)から、AmbionからのMEGAscript キット: ヌクレオチド(ATP、CTP、GTPおよびUTP)それぞれ7.5mMおよび酵素(RNAポリメラーゼ)2μlを使用して、転写を実施する。インキュベーション時間は、37℃で3時間である。PCRのための増幅プライマーは、出願WO-A第99/65926号または論文J.Clin.Microbiol.37(1)、49-55頁、1999年に記載のT3またはT7ポリメラーゼ促進剤を有し、これにより、転写を実施することができる。

転写産物(transcript)を、アガロースゲル電気泳動法(1.5%、TBE 0.5X)により分析する。析出される容量は5μlであり、移動を、100ボルト(V)で20分間行う。転写産物の可視化を、臭化エチジウムで染色した後に、UVランプ下で実施する。

直接的にRNA増幅産物をもたらすNASBAまたはTMAなどの他の増幅技術を使用しても、本発明の観点から同一である結果が得られる。

モデルヌクレオチドに対する標識試薬の反応性
標識試薬の合成は、実施例1から4に記載している。本発明に記載のPDAMは、市販されている(参照P1405、Molecular Probes, Eugene, OR)。

実施例6.1: モノマーUMP3'-ホスフェートの標識
ジアゾメチル官能基を有する標識試薬の反応性を、反応の特異性を制御するために研究した。

次の標準的な条件下に、モデル化合物3'-UMP(ウリジン、3'一リン酸、参照U1126 Sigma)で毛細管電気泳動によりこの反応性を研究することからなるプロトコルを開発した:
3'-UMP0.04mM;H₃BO₃ 2.0mM;マーカー2.0mM[適切な有機溶剤(THF, AcOEt またはDMSO)を加える];溶剤H₂O-CH₃CN-有機溶剤(比: 1/3/1)。

この溶液を、250μlの10の分画にわけ、これを60℃に加熱する。規定の時間後に、核分画を、ジクロロメタン250μlを用いて処理する。攪拌の後に、有機相(低相)を除去する。さらに2回、操作を繰り返す。遠心分離(5分間、1分当たり5000回転(rpm))の後に、水相を、毛細管電気泳動により分析する。毛細管電気泳動(CE)条件は次である: CE分析を、Beckman P/ACE 5000装置により実施した。未処理の溶融ガラス毛細管(75μM×50cm)を使用した。印加された電圧は、30kV(正常極性)であり、毛細管の温度を、23℃に維持した。電気泳動図を、254nmで記録した。NaOH溶液でpHを調製し、0.2μmフィルターで濾過することにより、ホウ酸からホウ酸塩緩衝液(0.1M、pH8.3)を調製した。サンプルを、圧力下に注入した(0.5psi、5秒)。それぞれの分析の前に、NaOH溶液(0.1M、2分)、水(2分)およびホウ酸塩緩衝液(2分)を圧力(20psi)下に順次通過させることにより、毛細管を再生する。

各図に示されているように、反応時間を0から4時間の間で変化させることにより、反応を実施し、結果を、使用した試薬濃度と共に、図2Aから2Iに試験された各試薬に関して示す。

反応時間を、各電気泳動図に示す。

試験された全ての試薬で、モノアルキル化生成物が、排他的に形成され、反応の特異性を証明している。

反応性、即ち3'-UMPとの試薬の半反応時間を、ピーク高さを比較することにより算出することができ、結果を、下記の表1に示す(前記の標準条件):

しかしながら、反応は非常に特異的で、試験された全ての試薬で、副産物が生じないので、標識の選択性の観点から影響されずに、標識試薬の濃度を高めることができると、記載することができる。

したがって、DPDAM試薬では、濃度を20mMまで高めると(図2c参照)、反応性(半反応時間)は、2時間である。30mMの濃度で反応性が45分であるBioDPDAM(図2F)でも、同じ結果が得られる。

実施例6.2: 様々なヌクレオチド3'一リン酸の試験:
間違った解釈を回避するために、重要な試験であるメタ-BioPMDAMマーカーでの付加的な研究を、他のヌクレオチド3'一リン酸を用いて実施した。

試験されたヌクレオチドは、次である: 3'-AMP(参照85、194-9Aldrich)、3'-GMP(参照151214、ICN)、3'-CMP(参照C1133、Sigma)、3'-TMP(デオキシリボシリーズ)(参照T1008、Sigma)。様々なヌクレオチドで得られた電気泳動図を、図3Aから3Dに示す。図3Aに示された反応時間は、図3Bから3Dと同一である。

出発ヌクレオチド(リボまたはデオキシリボシリーズ)に関わらず、アルキル化生成物の排他的かつ完全な生成が、60℃、130分間に観察された。グアニンの場合には(慣用のアルキル化試薬での最も反応性の塩基)、ホスフェートでアルキル化された生成物だけが観察され、これは、反応の非常に高い選択性を証明していることを記載することは、重要である。

この研究によって、反応速度は、基質としてのヌクレオチドの性質には依存していないことを確かめることができる。

実施例6.3: ジヌクレオチドの研究:
ジヌクレオチドApUp(参照A4298、Sigma)のアルキル化を、メタ-BioPMDAMを用いて実施して、ヌクレオチド間ホスフェートに対する、末端リン酸の反応の選択性を確かめた。電気泳動による反応の監視を、図4に示す。条件は、既に記載した実施例6.1の標準的条件である。

単一生成物の排他的な生成が観察され、このことは、ヌクレオチド間ホスフェートと比較した、末端リン酸に対するメタ-BioPMDAM試薬の良好な選択性を示している。

実施例6.4: 4ヌクレオチド3'一リン酸との付加物の特定:
得られた生成物が確かにホスフェートでのアルキル化から生じていることを確かめるために、一リン酸3'-UMP、3'-CMP、3'-GMPおよび3'-AMPとメタ-BioPMDAM試薬との付加生成物の合成を実施した。アルキル化反応を、下記に示す調製規模で実施した。70%の規模の収率で得られた付加生成物を生成し、次いで、プロトンまたはリンNMRにより調べた。

調製プロトコル:
3'-UMP(二ナトリウム塩の形で、9.3mg、21.1μmol)を、0.1MのH₃BO₃水溶液2mlに溶かし、次いで、CH₃CN2ml、MeOH6ml、次いでメタBioPMDAM試薬(75mg;0.20mmol)を順次、加える。反応を室温で2.5時間実施する。毛細管電気泳動により監視する。水3mlを加え、次いで、過剰の試薬を、CH₂Cl₂での抽出により除去する。水相を留去する。残留物を少量の水に溶かし、逆相シリカゲルカラム(Lichroprep RP-18、Merck;MeOH/H₂O(20/80)溶離)に通過させることにより精製する。3'-UMPの付加生成物10(69%)が得られる。

3'-NMP(N=G、U、C、A)の付加生成物で得られたプロトンNMRスペクトルを、図5Aから5Dに示す。付加生成物の同定を、2次元¹H/¹H NMR実験(COSY)により実施した。1/1の比で、これらの付加生成物それぞれの立体異性体が存在する。

リンNMRでは約0ppmに、ピークが1つだけ存在する(300MHz、D₂O)。

反応は確かに特異的で、1種の付加生成物のみが観察され、標識は、リンの所で生じることが、これらの実験によって証明される。塩基の所でのアルキル化副反応は存在しない。標識の生成物はしたがって、ハイブリダイゼーションステップに特に適している。

安定性の研究:
実施例7.1: 温度に対する標識試薬の安定性
前記実施例6.1の表に記載の全てのジアゾメタン誘導体を、固体状態で、冷凍庫中、-20℃で、少なくとも3カ月貯蔵しても、反応性の損失は観察されない。

ベンチ上、室温での安定性を、NPDAMおよびメタ-BioPMDAMの2種の試薬に関して、¹H NMRにより決定した。特に用心することなくNPDAMを、ベンチ上に1カ月間放置しても、分解は観察されなかった。ベンチの上に25日間メタ-BioPMDAMを放置すると、約50%分解が観察された。

温度に対する標識試薬の安定性は、本質的な特徴である。確かに、工業的用途でのこのような試薬の最終目標は、標識キットである。-20℃で少なくとも15日間、好ましくは1カ月安定でない試薬は、市場に出すことができない。貯蔵および発送の手段が、-110℃を下回っている場合にも、-110℃および-20℃の安定性の間に関係があり、このことが、-20℃での15日間、好ましくは-20℃での1カ月の値が、工業的最低要件である理由である。-110℃を上回ると、使用者および製造者の観点からは、実験室は、これらの試薬を貯蔵するための装置(冷凍庫)の必要な備品を有さず、製造者の観点からは、これらを輸送するためのドライアイス型の単純な手段はない。

室温での安定性に関しては、標識を使用者が実施するには数時間、好ましくは1日の安定性で十分である。

実施例7.2: 様々なヌクレオチド3'-UMPマーカー複合体の加水分解:
塩基性媒体中での[3'-UMP-マーカー]複合体の安定性を試験した。加水分解の機構は、次のように示すことができる:

使用した様々な複合体を、メタ-BioPMDAMによる一リン酸3'-UMP(リボヌクレオチドシリーズ)をアルキル化するための次のプロトコルに従い合成した。

3'-UMPで試験される様々な標識試薬は、
メタ-BioPMDAM、
オルト-BioPMDAM、
パラ-BioPMDAM、
DPDAMおよび
PDAMである。

手順
標識試薬の20mM溶液を、DMSO中で調製する。

反応のために、次を混合する:
この溶液20μl、
1NのNaOH40μl、
40mMの参照生成物10μlおよび
H₂O130μl。

この溶液を、60℃に加熱し、サンプルを、正確な時点に採取した。

サンプルのために、次のように手順を実施する:
加熱された溶液10μl、
0.5MのH₃BO₃40μlおよび
H₂O150μl。

次いで、この最終溶液15μlを、各サンプルで毛細管電気泳動により注入する。

加水分解反応の速度を毛細管電気泳動により、時間の関数として複合体の量の減少を調査することにより決定した(内部標準: 3,5-ジアミノ安息香酸またはナフトエ酸の表面積に比較して、ピークの表面積を測定)。

こうして、様々な複合体の安定性を比較することができた。

結果を、下記の表2に示す。

したがって、メタ-BioPMDAMとの複合体は、197分の半減期を有し、これは、パラ-BioPMDAM誘導体の期間の25倍長い期間、DPDAM誘導体の期間の7倍長い期間、さらに、オルト-BioPMDAM誘導体の期間の4倍長い期間であることが判明した。

オルトおよびメタ誘導体により、複合体をより安定化することができ、これにより、診断試験の場合により良好な検出が可能になる。

メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を用いる転写RNAの標識:
標識:

実施例1.1に記載の反応スキームに従い、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を得た。実施例5.2に記載の手順に従い、RNAターゲットをポストPCR転写により調製した。

RNA転写産物を含有する溶液50μlに、精製水(Sigma)9μl、0.1Mのイミダゾール9μlおよび1MのMnCl₂9μlを加えた。イミダゾールおよびMnCl₂の濃度はそれぞれ、6mMおよび60mMである。インキュベーションするために、RNAターゲットを含有する溶液および断片化に必要な緩衝液、DMSO中100mMのメタ-bioPMDAM(3a)3μlを加えた。メタ-bioPMDAMマーカーの最終濃度は、2mMである。精製水で、溶液を150μlに調節した後に、反応混合物を均質化し、60℃で30分間インキュベーションした。EDTA(最終100mM)のインキュベーションおよび添加の30分後に、メーカーの緩衝液およびプロトコルを使用して、QIAVAC(登録商標)カラム(Qiagen、Hilden、Germany)での精製により、過剰なマーカーを除去する。

ハイブリダイゼーション:
断片化の間の標識ステップの後に、得られた断片を、結核菌16S RNAの"Genbank"M20940シークエンスの領域213-415を分析するために設計されたDNAチップの上にハイブリダイゼーションさせる。このDNAチップは、A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されている。

A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルおよび緩衝液を使用して、流体ステーション(Affymetrix、Santa Clara, CA)の上で、ハイブリダイゼーションステップを実施した。付加的なステップが、ビオチンを現すために必要である(間接的検出)。

次の条件を使用して、フィコエリトリン(励起: 488ナノメートル(nm))およびCy5(励起: 650nm)で標識されたストレプトアビジンを導入することにより、DNAチップの表面で捕捉プローブにハイブリダイゼーションされたビオチン化断片を現させた: 精製水300μl;100mMのトリス緩衝液pH7/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml);標識されたストレプトアビジン6μl(200μg/ml)。使用された成分の参照は:
ストレプトアビジン-フィコエリトリン: 参照R0438、Dako、Denmark;
ストレプトアビジン-CY5: 参照C0050 Dako Denmark;
消泡剤参照m5-575, Ultra Additives Inc.;
ツイーン参照P-7949、Sigma。

DNAチップの読み取り:
標識化およびハイブリダイゼーション後にDNAチップの表面で放出された蛍光の読み取り、ならびに信号強度および相同性パーセンテージを示すデータの作成を、Affymetrix(GeneChip(登録商標)Instrument SystemおよびGeneChip(登録商標)Information System, Santa Clara CA)により提供される読み取り系およびソフトウェアにより行う。

読み取り系により、シグナルおよびrfu(蛍光単位)で表されるバックグラウンドノイズ強度を得る。相同性パーセンテージはこの場合、結核菌の配列である参照配列に比較して得られる。

シグナルの平均強度(I)、バックグラウンドノイズ(B)および相同性パーセンテージ(%)を示す結果を、下記の表3に示す。

通常、90%を上回る相同性パーセンテージが十分な結果であるが、95%を上回る結果が通常求められると考えられている。95%を上回ると、この値はもはや示していない。マイコバクテリアDNAチップの場合には、それは重要ではないためである。低いバックグラウンドノイズを伴う高い強度が、後の実施例で求められる第2の結果である。全ての結果で、バックグラウンドノイズBは、平均強度Iから推測されている。

2種のマーカーで、相同性パーセンテージが、95%を上回る。rfuでのシグナル強度は、標準的な標識技術により得られる強度を上回る。

これらの結果により、メタ-bioPMDAM誘導体を使用するRNA転写産物の断片化の間の標識反応により、DNAチップで検出可能な十分に標識された断片を生成することができることが判明する。したがって、ジアゾメチル官能基により、ビオチンマーカーを、RNA転写産物の配列に導入することができる。この化学は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用の特性を修飾しない。確かに、蛍光体フィコエリトリンまたはCy5のいずれでも、強度レベル、さらにバックグラウンドノイズに対するシグナルの比(I/B)は、良好である。この技術により、用途に応じて様々な蛍光体を使用すること、さらに、2種の異なる波長で検出することができる(例えば、Nature Genetics volume 14, pages 441-447, 1996参照)。

メタ-bioPMDAM誘導体を用いる標識のための条件の最適化:
実施例9.1: 断片化塩(MnCl₂)の濃度の最適化:
RNA転写産物の標識を、様々な濃度のMnCl₂を使用して、実施例8に記載のプロトコルに従い実施した。

ハイブリダイゼーションおよび読み取りを、実施例8に記載の手順に従い実施した。

標識結果は、低濃度のMnCl₂でも高い強度が得られることを示している。
MnCl₂: 0mM、強度I: 3857rfu、相同性: 93.5%、
MnCl₂: 5mM、強度I: 3031rfu、相同性: 93.5%および
MnCl₂: 10mM、強度I: 2471rfu、相同性: 94.1%。

様々な濃度のMnCl₂でのRNA転写産物の断片化の分析により、断片化は、金属に対して5mMおよび60℃でのインキュベーションで十分であることが分かる。

これにより、最適な標識化および断片化条件下で標識試薬を使用すると、非常に良好な標識結果が得られることが分かる。

実施例9.2: イミダゾール濃度の最適化:
RNA転写産物(16S マイコバクテリア)の溶液50μlを含有する4本の管を、イミダゾール(精製水中1M)4.5μlまたは18μlまたは36μlと接触させて、30、120および240mMの最終濃度をそれぞれ得る。次いで、メタ-bioPMDAM(DMSO中100mM)3μlを加え、全容量を精製水で150μlに調節する。

4本の管中の溶液をボルテックス処理し、60℃で10分間インキュベーションする。

精製
QIAVAC(登録商標)カラムで、標識反応からの4種の溶液を精製することにより、過剰なマーカーの除去を実施した。

ハイブリダイゼーションおよび読み取りステップは、実施例8のステップである(ストレプトアビジンフィコエリトリン検出)。

シグナル強度に関する結果は、次である:
イミダゾール 30mM 強度3600rfu、
イミダゾール 120mM 強度1600rfuおよび
イミダゾール 240mM 強度1400rfu。

標識強度に関連する最良の結果が、30mMのイミダゾールで得られる。高い濃度(120および240mM)により、過剰の断片化が生じて、より短い断片が生じるであろう。

これにより、ジアゾメチル官能基をベースとする標識の化学を最適化し、標識状態に、かつ標識されるべきターゲットに適合させることが分かる。

実施例9.3: メタ-bioPMDAMマーカーの濃度の効果:
RNA転写産物(実施例5.2)の溶液50μlを含有する6本の管を、イミダゾール4.5μl(精製水中1M)と、さらにそれぞれメタ-bioPMDAM(DMSO中100mM)0.38;0.75;1.5;3;4.5および7.5μlの容量と接触させる。全容量を、精製水で150μlに調節する。

溶液をボルテックス処理し、60℃で10分間インキュベーショする。

精製、ハイブリダイゼーションおよび読み取り条件は、実施例8に従う。

結果を、下記の表4に示す:

2mMのメタ-bioPMDAMから、相同性パーセンテージおよび標識強度は良好である。フィコエリトリンを担持するストレプトアビジンでのビオチンの可視化の場合に、さらにCy5に連結しているストレプトアビジンの場合にも、これは、真である。この濃度以上で、シグナルは増加し、相同性パーセンテージは、影響を受けない。

実施例9.4: 標識後精製ステップの排除:
精製ステップを省くために、様々な標識反応量を、予め精製することなしに、DNAチップの上でハイブリダイゼーションする。

RNA転写産物(実施例5.2)の溶液50μlに、断片化の間に標識緩衝液を加え、次いで、混合物を60℃で30分間インキュベーションする。断片化の間の標識条件は: 30mMのイミダゾール(精製水中1Mで、イミダゾール溶液4.5μl)、10mMのMnCl₂(精製水中1Mで、塩化マンガン溶液1.5μl)および2mMのメタ-BioPMDAM(無水DMSO中、100mMの溶液3μl)である。

インキュベーションの後に、様々な容量の標識溶液を、予め精製することなく、DNAチップ上でハイブリダイゼーションさせた。使用したハイブリダイゼーションプロトコルは、前記している。DNAチップの表面の所の捕捉プローブにハイブリダイゼーションされたビオチン化断片を、実施例8の条件を使用してフィコエリトリン(励起: 488nm)で標識されたストレプトアビジンを導入することにより検出する。

フィコエリトリンマーカーの検出および結果の分析も、実施例8に記載されているAffymetrixにより推奨されているプロトコルに従い実施した。

結果を、下記の表5に記載する。

これらの結果から、2mMのメタ-BioPMDAMを用いると、反応容量全体がハイブリダイゼーションされなくても、精製を省くことができることが分かる。DNAチップの上でハイブリダイゼーションされた20μlでは、相同性パーセンテージおよびシグナル強度に関する結果は、精製ステップを使用する標準的なプロトコルで得られる結果に匹敵する。

表6に示されている同様の結果は、金属(MnCl₂)を用いない標識プロトコルで得られる。シグナルは、より高い。

これらの結果によって、金属以外の断片化剤を使用することは、沈殿および高いバックグラウンドノイズを回避するための1つの解決策であることが分かる。

この実施例9.4では、参照を使用することにより、比較することができるが、使用されるRNA転写産物は劣化し、このことが、シグナルの弱さを説明している。

RNAを標識するために使用することができる他の断片化剤:
実施例10.1: ポリアミン鎖の使用:
塩が存在する場合の標識収率の低下の問題を排除するために、断片化剤として「生体」ポリアミン、スペルミンを使用した。核酸のホスフェートとのその相互作用に関し、このポリアミン鎖は知られている。

RNA転写産物(実施例5.2)50μlを、様々な濃度のスペルミン(参照13275-0010、Acros, FR, 0.5Mのストック溶液pH7.5)および2mMのメタ-BioPMDAM(無水DMSO中BioPMDAM 100mM溶液3μl)と共に最終150μlで、60℃で30分間インキュベーションする。

DNAチップでの精製、ハイブリダイゼーションおよび検出を、実施例8に記載のプロトコルに従い実施した(ストレプトアビジン-フィコエリトリン検出)。

標識結果を、表7に示す:

断片化剤としてスペルミンを用いる場合の断片化の間の標識結果、相同性パーセンテージおよび信号強度は、十分である。したがって、ポリアミン鎖を使用して、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬を用いるその標識の間にRNAターゲットを断片化することができる。

実施例10.2: フェナントロリン誘導体の使用:
試験1: RNA転写産物5μlに、フェナントロリンのFeSO₄(参照p1929、Sigma、25mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)を加える。容量を、100μlに調節する。管を、95℃で60分間インキュベーションする。

試験2: RNA転写産物5μlに、イミダゾールpH9.5 3μl(精製水中1M)、MnCl₂0.5μlおよびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)を加える。容量を、100μlに調節する。管を、60℃で10分間インキュベーションする。

いずれの場合にも、サンプルをDNAチップでハイブリダイゼーション、検出および分析する。

前記のような蛍光体、フィコエリトリン(励起: 488nm)に連結したストレプトアビジンを導入することにより、DNAチップの表面の捕捉プローブにハイブリダイゼーションされたビオチン化断片を検出する。

断片化剤としてのフェナントロリンで得られた表8の結果は、金属およびイミダゾールを使用する標準的なプロトコルで得られる結果よりも高い。

Fe⁺⁺以外の他の金属と錯化している他のフェナントロリン誘導体を使用することもできる。例えば、Cu⁺⁺、Zn⁺⁺など。

メタ-bioPMDAMを用いるRNAの2ステップでの標識化および断片化:
実施例5.2に記載のプロトコルに従い得られるRNA転写産物の溶液50μlを、断片化緩衝液: 30mMのイミダゾールおよび10mMのMnCl₂の存在下に60℃で30分間インキュベーションする。次いで、メタ-bioPMDAM誘導体を、2mMの最終濃度で加え、60℃でさらに5分間インキュベーションする。

ハイブリダイゼーションの前に、標識されたRNA断片を、前記のプロトコル(実施例8)に従いカラムで精製する。

ここでは、強度およびI/B比に関する表9による比較を、考慮すべきである。それというのも、プロトコル1(断片化、その後に標識)の場合に得られたシグナルは、強すぎるためである。読み取り機の飽和が観察され、これにより、参照プロトコルで得られた91.9%に比較して低い相同性パーセンテージ値(81%)がもたらされる。

しかしながら、この実施例により、断片化および標識ステップを別々にすることができることが分かる。

メタ-bioPMDAM試薬を用いる、RNAを標識するためのシグナルの増幅:
この手法の目的は、メタ-bioPMDAM1分子当たり複数の蛍光体を導入することにより、蛍光シグナルを増幅することである。

標識反応
転写産物(myco 16S)5μlに、精製水(Sigma)89μl、イミダゾール(精製水中1M)30μl、MnCl₂1μl(精製水中1M)およびメタ-bioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。

管をボルテックス処理し、次いで、60℃で10分間インキュベーションする。

カラム精製およびDNAチップでのハイブリダイゼーションを、実施例8に記載のプロトコルに従い実施する。

信号の増幅を伴わない
標識試薬メタ-bioPMDAMを用いたストレプトアビジン(フィコエリトリン: PEで標識)との相互作用により、ビオチン化断片を検出する。DNAチップにストレプトアビジンを加えるためのプロトコルは、実施例8に記載されているプロトコルである。

信号の増幅を伴う
第1ステップ: ストレプトアビジンの結合(精製水300μl、100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;50mg/mlでBSA6μl;1.5mg/mlでストレプトアビジン4μl)。

第2ステップ: ビオチン化アンチストレプトアビジン抗体の結合(精製水300μl、100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;50mg/mlでBSA6μl;1mg/mlでビオチン化アンチ-ストレプトアビジン3μl)。

第3ステップ: フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンの結合(精製水300μl、100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;50mg/mlでBSA6μl;1.5mg/mlでストレプトアビジン4μl)

次のビオチン化アンチ-ストレプトアビジンを前記のステップで使用する: 参照216の065-084、Jackson Immuno Research。

DNAチップでのシグナルの読み取りを、実施例8に記載のプロトコルに従い実施する。相同性パーセンテージおよび標識強度に関する結果を、下記の表10に示す:

シグナルの増幅は、検出の感度をかなり改善する。

パラ-bioPMDAM(3b)およびオルト-bioPMDAM(3c)誘導体を用いるRNAの標識:
実施例1.2および1.3に記載のプロトコルに従い、2種の試薬を調製し、RNA転写産物の断片化の間の標識手法で評価した。

実施例5.2に記載のプロトコルに従い、RNA転写産物を得た。

標識、ハイブリダイゼーション、フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンの導入のためのプロトコルおよび精製プロトコルは、実施例8に記載のプロトコルである。

結果を、下記の表11に示す:

これらの結果により、オルトおよびパラでの置換も、標識強度および相同性パーセンテージに関して有効な結果をもたらすことが分かる。

BioDPDAM誘導体(3d)でのRNA転写産物の標識:
実施例1.4に記載のプロトコルに従い、BioDPDAM誘導体(3d)を調製した。

実施例5.2に記載のプロトコルに従い、RNA転写産物を得た。

標識化および断片化方法を、下記の表12に記載の条件下(反応容量100μl)に、メタ-BioPMDAM試薬と比較して、1ステップで実施する。

ハイブリダイゼーション、フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンの導入のためのプロトコルおよび精製プロトコルは、実施例8に記載のプロトコルである。

結果を、下記の表に示す:

誘導体3dは、ホスフェートでのRNAの標識に関して良好な結果をもたらす。この結果により、フェニル基などの置換を使用して、ジアゾメチル官能基を有するマーカーの反応性および安定性を変更することができることが分かる。

Cy5-PMDAM誘導体(12a)でのRNAの標識

マーカーCy5-PMDAM(12a)を、実施例2に記載のプロトコルに従い調製した。

様々な断片化および標識条件下に、RNA転写産物(実施例5.2)5μlをCy5-PMDAMで標識する。通常の条件は、次である:
最終反応容量100μl、
30mMのイミダゾールpH8(1Mのストック溶液3μl)、
5mMのMnCl₂(0.1Mのストック溶液6μl)および
3mMのCy5-PMDAM(無水DMSO中の100mMのストック溶液3μl)。

第1の試験では、断片化の間の標識を、単一のステップで実施する。

第2の試験では、標識化および断片化を2つのステップで実施した: 標識の前に、断片化を実施する。

MnCl₂を含有する各インキュベーションの後に、0.5MのEDTA溶液20μlを加えることにより、塩を中和する。

1ステップでの標識化および断片化のために、インキュベーションを60℃で30分間実施した。標識化および断片化を2つのステップで実施する第2の試験では、インキュベーション、15分のインキュベーションを、各ステップで使用した。

実施例8に記載のプロトコルに従い、標識された断片を精製、ハイブリダイゼーションおよび検出した。差は、適切な読み取り機(GMS 418 Array Scanner , Affymetrix, Santa Clara, CA)によりマーカーを直接検出することができるので、ハイブリダイゼーションステップの間に、標識されたストレプトアビジンがもはや必要ではないという事実にある。

標識結果を、下記の表13に示す:

標識試薬(12a)でRNA転写産物のホスフェートで標識することにより、標識強度および相同性パーセンテージにおいて非常に満足な結果が得られる。

信号とバックグラウンドノイズとの比は、このマーカーの場合には非常に満足なものであることを記載することも大切である。シアニン誘導体の励起および放出波長は、生体分子のそれらとは離れている。

これらの結果から、ジアゾメチル官能基により、ビオチン以外のマーカーを、核酸のホスフェート基のレベルで導入することができることが分かる。

DNAの断片化の研究
実施例16.1: 酸性媒体中での様々なヌクレオシドの加水分解
この研究の目的は、天然ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドとの、さらにプリンとピリミジンタイプヌクレオシドとの、酸性pHに対する安定性に関する差を証明することである。この研究によって、その塩基組成を考慮することにより、DNAの断片化をより良好に制御することができる。

2種の修飾ヌクレオシド、8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン(8-BrdA)および5-ブロモ-2'-デオキシシチジン(5-BrdC)、さらに4種の天然ヌクレオシド(dA、dC、dGおよびdT)を、この研究では使用した。

各ヌクレオシド50ナノモル(nmol)を、50mMのギ酸ナトリウムpH3中、95℃でインキュベーションする。インキュベーション時間は、0から45分で変動させる。真空乾燥させ、精製水20μlに入れた後に、サンプル(10nmol)を、逆相HPLCにより分析する。分でのインキュベーション時間(X軸)に対する、出発ヌクレオシドの加水分解パーセンテージ(y軸)の形で示す、図8参照。

図8の曲線は、臭素原子で8-位のアデニンを修飾することにより、このヌクレオシドが、天然ヌクレオシドよりも安定でなくなることを示している。さらに、この結果により、使用された条件下では、脱プリンの方が、脱ピリミジンよりも優勢であることが分かる。

この研究によって、加水分解条件を最適化するか、天然塩基よりも安定性の低い修飾された塩基またはその導入の後に修飾および加水分解することができる塩基を導入することにより、脱プリンまたは脱ピリミジンによるDNAの断片化は制御されることが分かる。

実施例16.2: 修飾ヌクレオチドまたはその他を導入する、二本鎖DNAの断片化:
RocheからのFast start kit、デオキシリボヌクレオチドそれぞれ0.2mM(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、プライマー0.3μMおよび酵素0.4μlを使用して、16S結核菌ゲノムDNAターゲット(出発ターゲットとしての10^E+4コピー)から平行出発して、3つのPCR増幅を実施した。

PCRパラメーターは、実施例5のパラメーターである。

第1の場合には、いわゆる天然PCRの場合のようなプロトコルを使用する。

第2の場合には、プロトコルを修飾して、8Br-dATP30%でPCRを得る。0.2mMのd-CTP、d-GTPおよびd-TTPを導入することにより、これを達成する。0.14mMのd-ATPおよび0.06mMの8-BrdATPも導入する。(8-BrdATPは、市販由来のものである(参照N-2005-1、TriLink Biotechnologies, San Diego CA))。

第3の場合には、プロトコルを修飾して、8-BrdATP50%でPCRを得る。0.2mMのd-CTP、d-GTPおよびd-TTPを導入することにより、これを達成する。0.1mMのd-ATPおよび0.1mMの8-BrdATPも導入する。

これらの増幅産物の単独断片化の研究を、前記の条件下: 50mMのギ酸ナトリウムpH3、95℃で、実施した。

臭化エチジウム染色を使用して、分解ポリアクリルアミドゲル(ポリアクリルアミド8%、7Mの尿素、1×TBE)で、分析を実施した。

50mMのギ酸ナトリウムpH3中、95℃で15分間インキュベーションした後に、3種のターゲットの間で、差は見られない。全ての場合に、PCR増幅産物の完全な断片化が観察された。

PCR増幅産物の脱プリンを、様々なpH値ならびに様々な温度およびインキュベーション時間で実施した。前記の条件下でのゲル分析により、pH3で、95℃でのインキュベーション僅か10分の後に完全であることが分かる。このpHでは、断片化は、60℃で30分のインキュベーションの後に、完全である。

pH4では、95℃でもDNA増幅産物の完全な断片化を得るためには、インキュベーション30分が必要である。この結果は非常に重要であり、これにより、酸性pHで生じた非塩基性部位は、不安定で、他の特別な処置を伴わなくてもDNA鎖-断片化をもたらすことが分かる。

2ステップでの、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を用いるDNAの標識化および断片化:
実施例1.1に記載の反応スキームに従い、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を得た。

実施例5.1に記載のプロトコルを従い、PCRによりDNA増幅産物を調製した。

標識
PCR10μlに、精製水(Sigma)38μl、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(精製水中100mM)を加え、混合物を60℃で30分間インキュベーションする。次いで、メタ-bioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。溶液をボルテックス処理し、次いで、60℃でさらに15分間インキュベーションした。

ゲルでのDNAの断片化およびハイブリダイゼーションによる標識効率およびDNAチップの読み取りを分析することができるように、2回、試験を実施する。

精製
精製を、QIAQUICK(登録商標)カラム(Nucleotide Removalキット、Qiagen, Hilden, Germany)で実施する。使用精製プロトコルは、メーカーにより推奨されるプロトコルである。

精製の後に、溶出液を、ハイブリダイゼーション緩衝液(20×SSPE1.75ml;5Mのベタイン2.9ml;0.1MのDTAB290μl;消泡剤30% 10μl)400μlを含有する清潔な管に移す。これらの参照は、例えば:
ベタイン参照 B-2754 Sigmaおよび
DTAB参照 D-5047 Sigmaである。

溶液をボルテックス処理し、95℃で10分間インキュベーションして、DNA鎖を分離したが、これは、断片化の間の標識ステップの間には分離しない(分解ステップ)。次いで、管を、0℃で氷水混合物に浸漬し、その後、DNAチップの上でハイブリダイゼーションする。

DNAチップの上でのハイブリダイゼーション
断片化の間の標識ステップの後に、得られた断片を、結核菌16S RNAの"Genbank"M20940シークエンスの領域213-415を分析するために設計されたDNAチップの上にハイブリダイゼーションさせる。このDNAチップは、A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されている。

A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルおよび緩衝液を使用して、流体ステーション(Affymetrix、Santa Clara, CA)の上で、ハイブリダイゼーションステップを実施した。付加的なステップが、ビオチンを現すために必要である(間接的検出)。

次の条件下に、メタ-BioPMDAMのビオチンと相互作用するフィコエリトリン(PE)で標識されたストレプトアビジンを連結させることにより、ハイブリダイゼーションを検出する: 精製水300μl;100mMのトリス緩衝液pH7/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml);ストレプトアビジン6μl(300μg/ml)。これらの物質の参照は:
ストレプトアビジン-フィコエリトリン: 参照R0438、Dako、Denmark、
ストレプトアビジン-CY5: 参照C0050 Dako Denmark、
消泡剤参照M5-575, Ultra Additives Inc.および
ツイーン参照P-7949、Sigma。

DNAチップの読み取り:
標識化および断片化の後にDNAチップの表面で放出された蛍光の読み取り、さらに信号強度および相同性パーセンテージを示すデータの作成を、Affymetrix(GeneChip(登録商標)Instrument SystemおよびGeneChip(登録商標)Information System, Santa Clara CA)により提供される読み取り系およびソフトウェアにより行う。

読み取り系により、シグナルおよびrfu(蛍光単位)で表されるバックグラウンドノイズ強度が得られる。相同性パーセンテージが、この場合、結核菌の配列である参照配列に比較して得られる。

シグナルの平均強度(I)、バックグラウンドノイズ(B)および相同性パーセンテージ(%)を示す結果を、下記の表に示す:
通常、90%を上回る相同性パーセンテージが十分な結果であるが、95%を上回る結果が通常求められると考えられる。95%を上回ると、この値はもはや示されたない。これは、マイコバクテリアDNAチップの場合には重要ではないためである。低いバックグラウンドノイズを伴う高い強度が、後の実施例で求められる第2の結果である。全ての結果で、バックグラウンドノイズBは、平均強度Iから推測されている。

ポリアクリルアミドゲルの分析
ゲル上で分析されることを意図されたサンプルを、真空乾燥させ、精製水10μlおよび2×青色ホルムアミド10μlに入れる。

1×TBE中の8%アクリルアミドゲルで、150Vで1時間移動を行う。

酸性pHを、DNAを断片化するために使用した。このpHでは、脱プリン現象が、非常に不安定な非塩基性部位で生じて、高温で、DNA配列は実際に、直ちに断片化する。このタイプの断片化により、DNA-5'リン酸断片が生じる。

ゲル分析により、ギ酸緩衝液中の溶液中で60℃で30分間、PCR増幅産物をインキュベーションすると、これらの増幅産物の完全な断片化が生じることが分かる。これにより、メタ-bioPMDAMマーカーの存在下でのDNA増幅産物の断片化の間の標識を評価することができた。

相同性パーセンテージ、シグナル強度およびバックグラウンドノイズを示すDNA増幅産物の断片化中の標識結果を、下記の表14に記載する。

この実施例により、本発明の試薬を、2ステッププロトコルで酵素的増幅により生じたDNA断片を標識するために使用することができることが分かる。これらは、非増幅天然DNAを標識するために使用することもできる。

Cy5-PMDAM誘導体(12a)でのDNAの標識:
ジアゾメチル官能基を有する新規のマーカーでのDNAの標識を、合成DNA断片を使用して評価した。

実施例2に記載のプロトコルに従い、標識試薬Cy5-PMDAM(12a)を調製する。

いわゆるホスホラミダイト(phosphoramidite)方法に従い、20マーのオリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)を調製する。ホスホラミダイト化学に相容性な標準的なリン酸化により、ホスフェートを5'末端に導入する。このODNの配列は、全てDNAの天然塩基からなる(ODNの配列: 5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3')。この配列は、Affymetrix技術により合成されたいわゆる「モデル」DNAチップの配列を捕捉するために相補的である。このDNAチップは、配列に関して同一で、その表面で照合されるパターンを示す捕捉プローブを含む。このDNAチップを読み取ることにより、相同性の結果ではなく、強度に関する標識の特性などの情報が得られる。

標識: このODN50ピコモル(pmol)に、Cy5-PMDAM(DMSO中、100mM)を加える。最終容量は、100μlである。均質化のために、インキュベーションを、60℃で30分間実施する。

精製および読み取り: 過剰の標識試薬を除去するための精製を、実施例17に従い実施する。DNAチップでの読み取りを、実施例17に従い実施する。

結果:
DNAチップの上で読み取られた標識強度(I)の平均は、バックグラウンドノイズ(B)450rfuで、16644rfuである。

この強度レベルは非常に高く、これにより、標識試薬Cy5-PMDAM(12a)は、ホスフェート基でのDNA断片の標識と完全に相容性であることが分かる。

PDAM試薬を用いる、DNAの標識化および断片化:
実施例19.1: 1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)での標識:

PDAMを、Molecular Probes(Eugene, OR)から得て、無水DMSOに溶かす。

20マーの2種のODNを、DNAモデルとして使用した: 20マーの5'-ヒドロキシルの1種のODNおよび5'末端にホスフェートを担持する20マーの同じODN。ODNの配列は、実施例18に記載している。標識反応を、50%DMSOおよび1.5mMの1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)を含有する混合物中、60℃で、30分間または1時間実施する。

標識効率を、イソプロパノール/アンモニア/水 60/10/30溶離剤中での薄層クロマトグラフィー(順相)により評価した。30分後、ODN5'-ホスフェートでのカップリングは終了する。ODN5'-ヒドロキシルでの部分カップリング、即ち、約50%を得るには、1時間必要である。

実施例6の結果を、20塩基からなるモデル配列で、末端リン酸の上にジアゾメチル官能基を有する試薬の非常に選択的な標識に関して確認する。ヌクレオチド内ホスフェートでの標識は、障害となる不都合ではない。核酸断片の上に複数のマーカーが導入されることにより、感度の上昇が生じるためである。これにより、核酸を、相補的なターゲットに対する良好な感度を伴ってハイブリダイゼーションすることができる一方で、良好なハイブリダイゼーション特異性を維持することができる。

反応を最適化することにより、当分野の技術者であれば、例えば標識試薬、反応時間および温度を変動させることにより、標識の特異性を制御して、末端リン酸での排他的な標識を得ることができる。

実施例19.2: PDAMでの標識反応の速度研究:
反応時間を変えることにより、前記の条件下に、20マーのODN5'-ホスフェートを使用して、この研究を実施した。次の条件下に、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、標識収率を評価した:
逆相カラムSpheri-5 RP-18 5μm、220×4.6mm(Perkin Elmer)。使用された緩衝液および勾配は:
緩衝液A: 0.1MのTEAA;緩衝液B=緩衝液A50%+CH₃CN50%および
室温で、1ml/分で、30分かけてのB10から50%の勾配。

結果を、X軸に分で表された反応時間、y軸に標識パーセンテージをとって図9に示す。

60℃でのインキュベーションの僅か10分後に、収率は90%に近い。

実施例19.3: PDAMでの標識に対する、温度の効果:
インキュベーション時間を変え、それぞれの場合に10分のインキュベーション時間で、前記の条件下に、20マーのODN5'-ホスフェートを使用して、標識を実施した。

標識収率を、逆相HPLC分析により評価した。

結果を、y軸に標識パーセンテージ、X軸に℃での反応温度をとって図10に示す。

室温(25℃)でも、ODNの標識が観察されることを特記することは、非常に重要である。25℃でのインキュベーション10分の後に、標識収率は、約25%である。50℃を上回る温度では、80%を上回る収率を観察することができる。

これにより、ジアゾメチル官能基を有する試薬でDNAを標識するこの化学の効率および柔軟性が分かる。

標識試薬メタ-bioPMDAM(3a)を用いる、PCR増幅により得られたDNA増幅産物の標識化および断片化:
実施例1.1に記載の反応スキームに従い、メタ-bioPMDAM誘導体(3a)を得た。

実施例5.1に記載のプロトコルを従い、PCRによりDNA増幅産物を調製した。

実施例20.1: 断片化を伴う標識および伴わない標識の比較:
a. 断片化条件下での標識:
PCR10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を100μlに調節する。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

b. 断片化を伴わない標識:
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を100μlに調節する。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

残りのプロトコルは、実施例17のプロトコルと同一である。

結果:

前記の表15に記載の結果から、断片化を伴わないと、得られる強度の平均は、バックグラウンドノイズのレベル(500rfu)と同一である。断片化の間の標識では、より高い強度レベル(約4000rfu)および非常に良好な相同性パーセンテージが得られる。したがって、2つのステップを組み合わせることにより、100を上回るヌクレオチド長さの核酸の検出が著しく改善される。

実施例20.2: DNAチップの上でハイブリダイゼーションする前の変性の効果:
次のプロトコルに従い、2本の別々の管で平行して、標識反応を実施した: PCR10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。全容量を100μlに調節し、60℃で30分間インキュベーションする。

カラムで精製した後に(実施例17)、第1の管から生じた溶液を、95℃で10分間インキュベーションし(DNA二本鎖を不対させるために)、次いで、管を、DNAチップの上にハイブリダイゼーションするまで、0℃で氷水混合物に浸漬する。

第2の管から生じた溶液を、予め変性することなく、DNAチップの上でハイブリダイゼーションする。

DNAチップの表面で捕捉プローブにハイブリダイゼーションされたビオチン化断片を、実施例17に記載の条件を使用してフィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを導入することにより現させた。

結果:

表16に示されている、ハイブリダイゼーション前の変性結果は、変性ステップを伴わずに得られた結果を上回った。これにより、DNAの変性は、良好な強度レベルを得るためには必要であることが分かる。非塩基性部位を介しての断片化は、二本鎖DNAの変性を簡単にし、捕捉プローブへのハイブリダイゼーションを強化するための手段の1つである。

他の標識試薬を試験し、前記の様々な条件で得られた結果を考慮するために、我々は、ギ酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH3)での断片化およびハイブリダイゼーション前の変性ステップを使用する参照プロトコルを規定した。

1ステッププロトコルで、ビオチン化試薬を用いるPCR増幅産物の標識化および断片化:
実施例1.1、1.2および1.3に記載のプロトコルに従い、メタ-、オルト-およびパラ-bioPMDAM誘導体を調製した。これらを、100mMの濃度で、無水DMSOに溶かした。

このプロトコルは、前記の実施例20.2のプロトコルと同一である(単一ステップでの標識化および断片化、その後、ハイブリダイゼーション前の変性ステップ)。

結果:

単一ステップでの断片化および標識を伴う最適化されたプロトコルにより、表17に示されている結果から分かるように、反応性ジアゾメチル官能基を含有する様々な標識試薬で、優れた結果が得られる。

BioDPDAMでのDNAの標識化および断片化:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。

標識試薬の合成は、実施例1に記載している。

このプロトコルは、ハイブリダイゼーションの前に、95℃での変性を含む、実施例20.2のプロトコルと同一である。

結果:

表18に記載のこの結果から、フェニル基と同様に重要な置換を使用して、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬の反応性を最適化することができることが分かる。

5-(ブロモメチル)フルオレセインでのDNAの標識化および断片化:
実施例5.1に記載のプロトコルを従い、PCRによりDNA増幅産物を調製した。

PCR10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(100mM)および5-(ブロモメチル)フルオレセイン(Molecular probes、Eugen, OR)(DMSO中100mM)を加える。容量を、100μlに調節する。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

精製条件は、実施例17の条件に従う。変性ステップは、実施例20.2の記載と同様に実施する。

ハイブリダイゼーションおよび読み取りのための他の条件は、論文A.Troesch et al., J. Clin. Microbiol, 37(1), 49-55頁, 1999年に記載されている条件と同一である。

表19のこの結果から、非塩基性部位を生成することによるDNAの断片化は、反応性アルキルハリド官能基を有する標識試薬と完全に相容性であることが分かる。このプロトコルを1ステップ(断片化および標識)で実施するが、ジアゾメチル官能基を有するマーカーの場合よりも低い強度を伴う。

フェナントロリンに由来する他の化学的断片化剤の存在下での、DNA増幅産物の標識化および断片化:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅によりDNA増幅産物を調製した。2つのタイプの条件を使用する:
条件a:
PCR10μlに、フェナントロリン-FeSO₄20μlおよびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。全容量を、100μlに調節する。混合物を、95℃で60分間インキュベーションする。

条件b:
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中100mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。全容量を、100μlに調節する。混合物を、95℃で60分間インキュベーションする。

プロトコルのための他の条件は、実施例17のプロトコルと同一である。

2種の断片化条件により、表20に示されているような十分な結果が得られる。

酸性pHでの断片化を使用する条件(b)で、最も良好な結果が得られる。

d-UTP-フルオレセインを導入することにより標識されたPCR増幅産物の断片化:
標識されたヌクレオチドの導入
次のプロトコルに従い、PCR増幅を実施して、フルオレセインで標識されたPCR増幅産物を生成した(塩基上で標識)。

Roche製のFast start kit、デオキシリボヌクレオチドd-ATP、d-CTP、d-GTP各2mM、ならびにD-TTP 0.14mMとd-UTP-12フルオレッセイン0.06mM、プライマー0.3μMおよび酵素0.4μlを使用して、16S結核菌ゲノムDNAターゲット(10⁺⁴コピー)から出発。その天然同族体d-UTPに比較しての標識されたヌクレオチドのパーセンテージは、30%である。これは、標識されたヌクレオチドの導入により増幅産物を標識するための反応で通常使用されるのは、この比である。

d-UTP-12-フルオレセインは、Roche Diagnostics参照1373242, Mannheim, Germany)から市販されている。

PCRのためのパラメーターは、実施例5.1のパラメーターである。

a. d-UTP-フルオレセインで30%標識されたPCR増幅産物の断片化:
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中100mM)を加える。容量を、100μlに調節する。次いで溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

b. d-UTP-フルオレセイン30%を含有するPCR増幅産物の断片化の間の標識:
PCR10μlに、ギ酸ナトリウム緩衝液pH3 50μl(精製水中50mM)およびメタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)2μlを加える。容量を、100μlに調節する。ついで溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。この試験は、参照プロトコルに対応し、このことにより、増幅ステップによる変動性を省くことにより、様々な標識手段を比較することができる。

カラムでの精製ステップおよび95℃での変性ステップを、いずれの場合にも実施例17と同様に実施する。

プロトコル(a1):
d-UTP-フルオレセインで標識された増幅産物の断片化により得られた核酸(条件a)を、DNAチップにハイブリダイゼーションし、第一に、実施例23に記載されたように、フルオレセインにより放出される蛍光シグナルを直接読み取ることにより検出する。

プロトコル(a2):
シグナル増幅ステップを使用して、標識感度を改善した。ハイブリダイゼーションステップの間に、ビオチン化抗フルオレセイン抗体(参照216-065-084、Jackson ImmunoResearch)、次いでフィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを導入することにより、次の連続条件で、シグナルの増幅を実施した:
精製水300μl、
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA2.4μl(50mg/ml)、ビオチン化抗フルオレセイン抗体1.2μl(1mg/ml)、
精製水300μl、
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml)、ストレプトアビジン6μl(300μg/ml)。

このプロトコルでは、フルオレセインは、ハプテンとして作用し(標識された抗体で間接的に検出可能なトレーサー)、蛍光体としては作用しない。

プロトコル(b):
DNAチップの上にハイブリダイゼーションされたビオチン化断片(条件b)を、次の条件を使用して、フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを導入することにより現させた:
精製水300μlおよび
100mMのトリス緩衝液pH7 300μl/1MのNaCl/ツイーン0.05%/消泡剤0.005%;BSA6μl(50mg/ml);標識されたストレプトアビジン6μl(300μg/ml)。

標識およびハイブリダイゼーションの後にDNAチップの表面で放出された蛍光の読み取り、さらに信号強度および相同性パーセンテージに関するデータの作成を、Affymetrixにより提供される読み取り系およびソフトウェアにより実施する。これに関して、使用される読み取り系が、直接的な検出を可能にする2種のフィルターを含むことを特記することが重要である:
プロトコルa1に従い、d-UTP-フルオレセインのみで増幅産物が標識されている場合には、フルオレセイン、もしくは
増幅産物が、
プロトコルa2に従いシグナルの増幅を伴うd-UTP-フルオレセインで、または
プロトコルbに従いその断片化の間のメタ-bioPMDAMで
標識されている場合には、フィコエリトリン。

フィコエリトリンにより可視化を実施する2つの場合には、フィルターの使用により、フルオレセインにより生じるシグナルを省くことができ、検出されるのは、フィコエリトリンシグナルである。

結果:

前記の表21の結果から、非塩基性部位の発生を使用する化学的断片化は、DNA増幅産物の酵素的標識と適合し、標識を断片化の前に行うことができることが分かる。

蛍光体を酵素的に導入するためのこのプロトコルで得られる強度レベルさらに相同性パーセンテージは、メタ-bioPMDAMなどのジアゾメチル官能基を有する標識試薬を使用する断片化の間の標識(条件(b))で得られるものに僅かしか匹敵しない。

メタ-bioPMDAM誘導体で得られる強度レベルを達成するために、シグナルを増幅するためのステップが必要である(条件a2)。これにより、d-UTPフルオレセインなどの修飾塩基の慣用的な導入(参照プロトコル(b))に比較しての、ジアゾメチル反応性官能基の有効性が分かる。

超音波処理による二本鎖DNAの断片化
実施例5.1に記載のプロトコルを使用して、DNA増幅産物を得た。これらの増幅産物を、マーカーの存在下および不在下に、超音波処理することにより、断片化した。

a. 超音波処理の間のPCR増幅産物の標識
PCR反応10μlに、メタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を、精製水を用いて100μlに調節し、次いで、pHを、6.5に調節する。混合物を、超音波容器の浴(周波数35kHz、モデルT460-H、Bioblock, France)中、60℃で30分間インキュベーションする。

b. PCR増幅産物の化学的断片化の間の標識(単一ステップ参照プロトコル):
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)を加える。容量を、精製水を用いて100μlに調節する。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

前記(フィコエリトリン検出に関する実施例17)のように、ゲルでのDNAの断片化およびハイブリダイゼーションによる標識効率およびDNAチップの読み取りを分析することができるように、2回、試験を実施する。

ゲルでの分析
臭化エチジウム染色を使用して、分解ポリアクリルアミドゲル(ポリアクリルアミド8%、7Mの尿素、1×TBE)で、分析を実施した。

ゲル分析から、60℃での超音波処理により、DNA増幅産物が断片化されることが分かる。

結果:

表10に記載の、超音波処理の間の標識(条件a)の結果は、十分である。このことから、DNAターゲットの超音波処理による物理的断片化は、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬での標識の化学と適合することが分かる。

この場合の弱い標識結果はおそらく、マーカーが、超音波効果の下で分解するという事実による。酸性pHの作用により非塩基性部位を発生させることによる断片化の結果の方が、良好である。

単一ステップでのDNAの標識、断片化および変性:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。

2つの標識反応を実施した:
a. 単一ステップでの95℃での標識、断片化および変性:
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-bioPMDAM2μl(無水DMSO中100mM)を加える。最終容量を、100μlに調節する。この溶液を、95℃で30分間インキュベーションする。この場合、反応混合物を、予め精製することなく、DNAチップの上でハイブリダイゼーションさせた。

b. 60℃での標識化および断片化:
PCR反応10μlに、ギ酸ナトリウムpH3 50μl(50mM)およびメタ-BioPMDAMマーカー(3d)2μl(無水DMSO中100mM)を加える。最終容量を、100μlに調節する。次いで、この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、前記のプロトコルに従い精製した。このプロトコルでは、DNAチップの上でハイブリダイゼーションさせる前に、断片を、実施例20.2に記載のプロトコルに従い変性させた。

結果:

実施例20.2により、検出感度のためには、二本鎖DNAの変性が重要であることが証明された。表23に記載のこれらの結果から、非塩基性部位を発生させることによる断片化手法では、DNAの標識、断片化および変性は、単一ステップで実施することができ、これにより、検出感度に影響を及ぼすことなく、使用者に、簡便さおよび時間の観点から顕著な改善をもたらす。

4-カルボキシベンズアルデヒドの保護:
4-カルボキシベンズアルデヒドは、市販品である。これ(3g;20mmol)を、塩化トリメチルシリル(10g;92mmol)のMeOH100ml溶液に溶かした。混合物を室温で40時間攪拌し続ける。蒸発の後に、4-メトキシカルボニルベンズアルデヒド24に対応する白色の固体を単離し、NMRにより同定し、そのまま、次の反応のために使用する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 10.07 (s, 1H, -CHO); 8.17 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3.93 (s, 3H, CO-O-CH₃)。

4'-メトキシカルボニルベンズアルデヒドの保護:
Dowex 50WX8-100(1g)の存在下に、4-メトキシカルボニルベンズアルデヒド(3.35g;20mmol)を、オルトギ酸トリメチル(4.8g、40mmol)で溶かす。混合物を還流下に2時間加熱し、次いで、濾過し、蒸発させる。再結晶処置の後に、NMR分析により、反応が完全ではないことが分かり、後者を、MeOH30ml、CH(OMe)₃30mlおよびDowex 50WX8-1001g中、室温で再開する。濾過、次いで蒸発を実施すると、生成物25 3.55g(16.89mmol、84%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.01 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 5.41 (s, 1H, CH); 3.93 (s, 3H, -CO-O-CH₃); 3.29 (s, 6H, -O-CH₃)。

化合物26:
化合物25(3.1g;14.8mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン16ml(73mmol)を溶かす。得られた溶液を、140〜150℃に2時間加熱した。次いで、混合物を、DCM(ジクロロメタンまたはCH₂Cl₂)100mlに溶かし、水10mlで6回洗浄する。有機相をMgSO₄上で乾燥させ、オイルが得られるまで、蒸発させる。このオイルを、ペンタンで3回洗浄し、続いてデカンテーションし、次いで、DCMおよびH₂Oで新たに抽出する。MgSO₄上で乾燥させ、蒸発させた後に、生成物26が、収率63%(9.27mmol)で単離される。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.78 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 5.39 (s, 1H, CH); 3.62-3.47 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_{5', 13'}およびH_3'); 3.29 (s, 6H, -O-CH₃); 2.72 (m, 2H, H_15') 1.87 (m, 2H, H_4'); 1.64 (m, 2H, H_14'); 1.30 (ブロード s, 2H, NH₂)。

ビオチン化化合物27:
ビオチン(500mg;2.05mmol)を、DMF10mlに懸濁させ、次いで、CDI365mg(2.25mmol)を加える。この溶液を室温で30分間攪拌し続け、化合物26(900mg;2.26mmol)を、DMF1mlに溶かし、次いで、少量ずつ前述の溶液に加える。こうして得られた混合物を、室温で1時間攪拌し続ける。蒸発の後に、カラム(直径20mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM6% 250mLで、次いでMeOH-DCM7% 200ml、最後にMeOH-DCM8% 200mlで実施する。生成物27に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル1.00gが、50%と推測される収率で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 9.50 (ブロード s, 1H, NH_{イミダゾール}); 7.80 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.64 (s, 1H, H_{イミダゾール}); 7.46 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5および1H, NH_2'); 7.05 (s, 2H, H_{イミダゾール}); 6.76 (t, 1H, NH_16'), 6.20 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.44 (ブロード s, 1H, NH _B3); 5.37 (s, 1H, CH); 4.42 (m, 1H, H_B6a); 4.24 (m, 1H, H_B3a); 3.59-3.44 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_5',13'およびH_3'); 3.29 (m, 8H, H_15'および2-O-CH₃); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.66 (ABX系, 2H, ²J_AB= 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.85 (m, 2H, H_4'); 1.66 (m, 2H, H_14'); 1.40-1.37 (m, 6H, H_{B7, B8, B9})。

アルデヒド化合物28:
アセタール27を、クロロホルム50mlに溶かし、次いで、2NのHCl20mlを加える。2相の混合物を激しく、15分間攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO₃上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物28が、ペースト(495mg;0.855mmol)の形で、ビオチンからの全体収率42%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 10.05 (s, 1H, CHO); 7.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.92 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7.58 (t, 1H, NH_2'); 6.46 (t, 1H, NH_16'), 6.02 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.19 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.46 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 3.66-3.56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'); 3.50-3.29 (m, 4H, H_3',13'); 3.28 (m, 2H, H_15'); 2.95 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.71 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.89 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.63 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.23 (m, 2H, H_B8)。

ヒドラゾン化合物29:
アルデヒド28(495mg;0.855mmol)を、無水エタノール10mlに溶かす。ヒドラジン(350μl;7.20mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に1時間加熱する。蒸発後に得られたオイルを、無水EtOHに溶かして、再び蒸発させる。次いで、発泡物質が得られ、これを、ペンタンとともに砕く。生成物29(511mg;0.862mmol)に対応するペーストが、収率100%で得られた。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.72 (s, 1H, CH); 7.56 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7.34 (t, 1H, NH_2'); 6.45 (t, 1H, NH_16'), 5.98 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.78 (ブロード s, 2H, NH₂); 5.18 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.44 (m, 1H, H_B6a); 4.26 (m, 1H, H_B3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'); 3.48-3.45 (m, 4H, H_3',13'); 3.27 (m, 2H, H_15'); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.68 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.86 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.21 (m, 2H, H_B8)。

ジアゾ化合物30:
ヒドラゾン29(357mg;0.602mmol)を、DMF17.5mlに溶かす。次いで、MnO₂(700mg;7.7mmol)を加える。室温で12分間攪拌した後に、混合物を、セライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)の粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄する。化合物30(290mg、0.491mmol)が、ややピンク色の固体の形で収率82%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.28 (t, 1H, NH_2'); 7.77 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.74 (t, 1H, NH_16'); 7.00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 6.38 (ブロード s, 1H, NH _B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH _B3); 5.80 (s, 1H, CH-N₂); 4.27 (m, 1H, H_B6a); 4.11 (m, 1H, H_B3a); 3.51-3.44 (m, 10H, H_{7', 8', 10', 11'}およびH_5'); 3.37 (m, 2H, H_15'); 3.32 (m, 4H, H_3',13'); 3.05 (m, 1H, H_B4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.69 (m, 2H, H_4'); 1.59-1.48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.25 (m, 2H, H_B8)。

化合物30の反応性を、3'一リン酸ウリジンで試験し、毛細管電気泳動により監視した。分析条件は、実施例6.1の条件である。結果は、45分間の半減期を示す。

試薬は、-20℃で少なくとも1カ月間安定である。

標識試薬パラ-Bio-EG3-PDAMを用いるDNA増幅産物の標識化および断片化:
このタイプの分子、即ち、ポリエチレングリコールベースの連結アームを有するPDAM誘導体の主な利点は、ジアゾ官能基とビオチンとを離しておくことができ、可溶性が、最終分析では、これらの分子の反応性が、増大することである。

パラ-Bio-EG3-PDAM誘導体30を、実施例28に記載の反応スキームに従い得た。実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。

a. パラ-Bio-EG3-PDAM試薬での標識:
PCR10μlに、パラ-Bio-EG3-PDAM(DMSO中100mM)およびDNアーゼ/Rnアーゼを含まない水77μlを加える。溶液は均質で、沈殿物は有さない。この溶液を、95℃で10分間インキュベーションし、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例8のものと同一である。

b. メタ-BioPMDAM試薬での標識:
PCR10μlに、メタ-Bio-PDAM(DMSO中100mM)およびDNアーゼ/Rnアーゼを含まない水77μlを加える。この生成物の合成は、実施例1.1に記載されている。溶液は、僅かな沈殿物を有する。この溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例8のものと同一である。

結果:

この表24で得られたシグナル強度は、非常に満足なもので、相同性パーセンテージは、高い。この結果から、ジアゾ標識分子にポリエチレングリコールを導入することにより、試薬の水相可溶性を高めることができることが分かる。試験は、均質である。さらに、可溶性が高まることにより、マーカーの反応性も高まりうる。

ポリエチレングリコールベースの架橋アームを含む他のPDAM誘導体の合成:
実施例30.1: メタ-Bio-EG3-PMDAMの合成

化合物68:
3-アミノアセトフェノン(14.5g、107mmol)を、無水DMF50mlに溶かす。無水コハク酸(10.7g、107mmol)を加え、混合物をアルゴン下に室温で攪拌し続ける。6時間後、溶液を真空濃縮し、メタノール50mLを加える。得られた沈殿物を濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄する。生成物68 19.4(81%)がこうして、オフホワイト色の粉末の形で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.5-2.6 (m, 7H); 7.45 (t, 1H); 7.64 (d, 1H); 7.83 (d, 1H); 8.19 (s, 1H); 10.16 (s, 1H); 12.12 (s, 1H)。

化合物69:
化合物68 5.07g(22mmol)をアルゴン下に、無水DMF10mlに溶かす。混合物を氷の上に置き、カルボニルジイミダゾール5.00g(32mmol)を加える。20分後に、4,7,10-トリオキサトリデカンジアミン(EG₃)20ml(94.6mmol)を徐々に加える。室温での3時間の反応の後に、DMFを蒸発させ、残留物を、CH₂Cl₂100mlに入れる。飽和NaHCO₃およびH₂Oで抽出を実施し、そのあと、有機相を無水Na₂SO₄を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして、生成物69 4.34g(46%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 1.59 (m, 2H); 1.87 (m, 2H); 2.16 (s, 3H); 2.40 (m, 2H); 2.55 (m, 2H); 3.08 (m, 2H); 3.45 (m, 16H); 7.30 (t, 1H); 7.42 (d, 1H); 7.70 (d, 1H); 7.83 (t, 1H); 7.97 (s, 1H); 10.00 (s, 1H)。

ビオチン化化合物70:
D-ビオチン(1.0g、4.1mmol)を、アルゴン下に無水DMF10mlに溶かす。混合物を、氷の上で冷やし、無水DMF10ml中のカルボニルジイミダゾール(CDI)(0.665g、4.1mmol)を加える。15分後に、無水DMF2ml中の化合物69(1.8g、4.1mmol)を加える。反応を放置して、35℃で3時間進行させ、次いで、DMFを蒸発させ、残留物を、CH₂Cl₂100mlに入れる。飽和NaHCO₃およびH₂Oで抽出を実施し、そのあと、有機相を無水Na₂SO₄を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして得られた生成物のNMR特性により、生成物70および遊離EG₃の混合物が得られたことが分かる。合成を継続する前に、他の精製ステップを実施する。

実施例1に記載のスキームによる2つの合成ステップの後に、最終化合物、メタ-Bio-EG₃-PMDAMが得られる。

この合成の利点は、二重である。一方では、生成物69が、僅か2つのステップで得られる;この生成物は、末端アミン基により、様々な性質の検出可能な分子に結合しうるジアゾの前駆体として使用することができる。この基によって、核酸を固定化する目的で、固体支持体に化合物69をグラフトすることができる。他方で、化合物71は、メタ-Bio-PMDAM(我々の参照分子)と同じ反応中心を有し、これにより、エチレングリコール(EG₃)アームの包含に伴う利点の分析が促進される。

試薬は、-20℃で少なくとも1カ月安定である。

実施例30.2: メタ-Bio-EG4-PMDAMの合成:

3-ニトロアセトフェノン13の保護:
3-ニトロアセトフェノン33g(0.20モル)を、トルエン400mlに溶かし、次いで、エチレングリコール40ml(0.717モル)およびパラ-トルエンスルホン酸(PTSA)600mg(3.15mmol)を加えた。ディーンスターク系にマウントする。溶液を130℃に3時間加熱する。溶液を室温にもどした後に、酢酸エチル400mlを加え、次いで、溶液を飽和NaHCO₃溶液8mlで洗浄する。有機相をMgSO₄上で乾燥させる。蒸発の後に、淡黄色の固体13(39.72g;0.190モル)が収率95%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.11 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6.87-6.78 (m, 2H, Ar-H); 6.59 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, Ar-H); 4.00 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.79 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

アミン14の調製:
化合物13(39.7g、0.190モル)を、EtOH500mlに溶かし、次いで、炭素に担持された10%パラジウム1gを加える。混合物を加熱して、全体を溶かし、次いで、溶液を放置して室温に戻す。真空を適用し、溶液をH₂下に置いた後に、これを激しく5時間攪拌し続ける。次いで溶液を温時ろ過し、次いで、蒸発させる。生成物14を、ペンタンで洗浄し、固体(34g;0.189モル)の形で収率99%で単離する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.14 (t, 1H, J = 8 Hz, Ar-H); 6.85 (m, 2H, J = 7.5 Hz, Ar-H); 6.79 (s, 1H, Ar-H); 6.59 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, Ar-H); 4.00 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.77 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

臭素化化合物15:
アミン14(12.3g;68.7mmol)およびトリエチルアミン(7g;69mmol)をアルゴン下に、DCM150mlに溶かす。DCM150mlに溶かされた臭化ブロモアセチル13.8g(60mmol)の溶液を-5℃で滴加する。添加の終了時に、水性の1NのNaHCO₃100mlを加える。有機相を水性NaHCO₃で連続して2回洗浄し、MgSO₄上で乾燥させる。蒸発乾燥の後に、化合物15に対応する茶色のオイル22.6gが得られ、これをそのまま、次の反応で使用する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.29 (ブロード s, 1H, NH); 7.62 (dt, 1H₄, J = 5 Hz, Ar-H); 7.47 (s, 1H, Ar-H₂); 7.38-7.19 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4.00 (m, 2H, Br-CH ₂); 3.75 (m, 4H, H ₂C-H ₂C_{アセタール}); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

アルコール化合物16:
水素化ナトリウム(3.3g;82.5mmol)を、ペンタンで3回洗浄し、次いで、THF150mlに懸濁させ、次いで、テトラエチレングリコール(50ml;0.29モル)を室温で加える。反応を、15分間攪拌し続け、次いで、溶液を-5℃に冷却する。

予めTHF25mlで希釈された化合物15を滴加する。混合物を30分間攪拌し続けて、室温に戻す。溶液を濃縮して100mlにし、次いで、これを、CHCl₃500mlで希釈する。この有機相を、水性の1NのNaHCO₃250mlで連続して3回洗浄し、次いで、これをMgSO₄上で乾燥させ、その後、これを蒸発させる。生成物を、MeOH-DCM5% 1.5lで、次いでMeOH-DCM7% 500ml、最後にMeOH-DCM10% 500mlを用いるシリカカラム(直径65mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。化合物16に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、生成物17.4g(42.1mmol)が収率61%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.86 (ブロード s, 1H, NH); 7.71 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H₄); 7.51 (s, 1H, Ar-H₂); 7.29-7.24 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4.09 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 3.99 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.72-3.53 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_{アセタール}およびHO-CH ₂); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

トシレート化合物17:
アルコール16(4.13g;10.0mmol)を、ピリジン5mlに溶かす。次いで、塩化トシル2.0g(10.5mmol)を室温で加える。混合物をアルゴン下に10時間攪拌する。これを、DCM100mlで希釈し、有機相を、水性の1NのNaHCO₃20mlで3回洗浄し、次いでこれを、MgSO₄上で乾燥させ、その後、トルエンと共に同時蒸発させる。カラム(直径50mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM2% 500mlで、次いでMeOH-DCM3% 500ml、最後にMeOH-DCM4% 500mlを用いて実施する。生成物17に対応する分画を合わせ、蒸発乾燥させると、オイル3.68g(6.48mmol)が65%と推測される収率で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.86 (ブロード s, 1H, NH); 7.76 (d, 4H, J = 5.5 Hz, Ar-H_トシル); 7.60 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H₄); 7.50 (s, 1H, Ar-H₂); 7.32-7.22 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4.00 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.73-3.54 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_{アセタール}およびHO-CH ₂); 2.42 (s, 3H, Ar-CH₃); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

フタルイミド化合物18:
トシレート17(3.68g;6.48mmol)を、DBU(1,8-ジアゾビシクロ[5.4.0]ウンデセン)1.52g(10.0mmol)で溶かし、次いで、フタルイミド(1.47g;10mmol)を加える。こうして得られた溶液を85〜90℃に17時間加熱し、次いで、蒸発させる。生成物を、アセトン-DCM15%1l、次いでアセトン-DCM20%1lを用いるシリカカラム(直径50mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。化合物18に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、生成物3.15g(5.8mmol)が収率90%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.73 (ブロード s, 1H, NH); 7.79 (m, 2H, Ar-H_{フタルイミド}); 7.99 (m, 2H, Ar-H_{フタルイミド}およびAr-H₄); 7.49 (s, 1H, Ar-H₂); 7.27-7.18 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4.00 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.69-3.56 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_{アセタール}およびN_{フタルイミド}-CH ₂); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

アミン化合物19:
還流下に75〜80℃に加熱することにより、生成物18を、無水EtOH20mlに溶かす。次いで、ヒドラジン(1.07ml;22.1mmol)を加え、反応を1時間15分攪拌し続ける。得られた沈殿物を焼結ガラスで濾過し、エタノール相を蒸発させる。次いで、白色の沈殿物をDCMで洗浄し、DCM相を蒸発させる。アセタールを脱保護するためのステップの間に除去することができるイミダゾールを含有していても、得られた黄色のオイル(2.3g;5.57mmol)をそのまま、次の反応のために使用する。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.83 (ブロード s, 1H, NH); 7.69 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Ar-H₄); 7.51 (s, 1H, Ar-H₂); 7.30-7.19 (m, 2H, Ar-H_5,6); 4.10 (m, 2H, CO-CH ₂-O); 4.00 (m, 2H, H ₂C_actal); 3.69-3.56 (m, 20H, O-CH ₂-CH ₂-O, H ₂C_{アセタール}およびH₂N-CH ₂); 1.61 (s, 3H, CH₃)。

ビオチン化化合物20:
D-ビオチン(1.05g;4.32mmol)を、無水DMF10mlに溶かす。カルボニルジイミダゾール(CDI)790mg(4.87mmol)をアルゴン下に加える。10分攪拌した後に、DMF5ml中で希釈されたアミン19を加える。溶液を40分間攪拌し続け、次いで、蒸発させ、その後、カラムでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。

このために、溶離剤として、MeOH-DCM5% 500ml、次いでMeOH-DCM10% 500ml、最後にMeOH-DCM15% 500mlを用いる直径50mmのカラムを使用する。生成物20に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、黄色のオイル(1.66g;2.6mmol)が得られる。

得られた黄色のオイル(2.4g)は、NMRスペクトルによると、イミダゾール約30重量%を含有する。したがって、生成物20で得られる反応収率は、出発ビオチンに対して約60%であると推測される。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.80 (ブロード s, 1H, NH); 7.66 (m, 3H, Ar-H₄およびH_{イミダゾール}); 7.54 (s, 1H, Ar-H₂); 7.28-7.24 (m, 2H, Ar-H_5,6); 7.07 (s, 2H, H_{イミダゾール}), 6.59 (t, 1H, NH_15'); 6.06 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.19 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.45 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 4.10 (s, 2H, H_3'); 4.00 (m, 2H, H ₂C_{アセタール}); 3.75-3.49 (m, 18H, O-CH ₂-CH ₂-OおよびH ₂C_{アセタール}); 3.36 (m, 2H, H_14'); 3.09 (m, 1H, H_B4); 2.85および2.66 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.61 (s, 3H, CH₃); 1.59-1.3 (m, 6H, H_{B9, B8, B7})。

ケトン化合物21:
アセタール20を、クロロホルム80mlに溶かし、次いで、2NのHCl30mlを加える。混合物を激しく45分間攪拌し続ける。有機相を回収し、次いで、無水NaHCO₃上で乾燥させる。濾過の後に、溶液を蒸発させ、得られたオイルを、ペンタンで洗浄すると、生成物21(1.48g;2.48mmol)が収率99%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.99 (ブロード s, 1H, NH); 8.07 (s, 1H, Ar-H₂); 7.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.66 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.42 (t, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6.38 (t, 1H, NH_15'); 5.78 (ブロード s, 1H, NH _B1); 4.96 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.47 (m, 1H, H_B6a); 4.29 (m, 1H, H_B3a); 4.13 (s, 2H, H_3'); 3.76-3.37 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3.32 (m, 2H, H_14'); 3.11 (m, 1H, H_B4); 2.89および2.75 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.59 (s, 3H, CH₃); 2.16 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.64-1.40 (m, 6H, H_{B9, B8, B7})。

ヒドラゾン化合物22:
ケトン21を、無水EtOH20mlに溶かす。混合物を還流下に75〜80℃で加熱する。次いで、ヒドラジン816μl;16.81mmolを加え、混合物を3時間攪拌し続ける。濾過の後に、混合物を蒸発乾燥させ、粘稠性の白色の発泡物質が得られるまで、残留物をエタノールに再溶解させる。第2の場合には、この発泡物質を、クロロホルム50mlに溶かし、次いで、飽和NaHCO₃溶液20mlを加える。混合物を十分に洗浄し、次いで、有機相を回収する。これを、無水Na₂CO₃上で乾燥させ、濾過の後に、蒸発乾燥させると、新たな粘稠性の発泡物質が得られる。後者は、生成物22(842mg;1.38mmol)に対応し、収率66%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.81 (ブロード s, 1H, NH); 8.82 (s, 1H, Ar-H₂); 7.64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.32 (m, 4H, Ar-H_5,6); 6.43 (t, 1H, NH_15'); 5.89 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.46 (ブロード s, 2H, NH₂); 4.99 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.44 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 4.11 (s, 2H, H_3'); 3.70-3.37 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3.32 (m, 2H, H_14'); 3.08 (m, 1H, H_B4); 2.87および2.67 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.11 (m, 5H, CH₃およびH_B10); 1.64-1.40 (m, 6H, H_{B9, B8, B7})。

ジアゾ化合物23:
ヒドラゾン22(100mg;0.164mmol)を、アルゴン下にDMF1mlに溶かす。活性化MnO₂80mgを加え、混合物を激しく30分間攪拌し続ける。混合物を、セライト(3cm)-粉末分子ふるい(1cm)混合層で濾過する。次いで溶液を、蒸発乾燥させる。蒸発の終了時に得られたオイルを、化合物23(78mg;0.128mmol;78%)に対応するピンク色の粉末が得られるまで粉砕する。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 9.60 (ブロード s, 1H, NH); 7.89 (s, 1H, Ar-H₂); 7.76 (t, 1H, NH_15'); 7.35-7.25 (m, 4H, Ar-H_5,6); 6.64 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 6.36 (ブロード s, 1H, NH _B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.28 (m, 1H, H_B6a); 4.08 (m, 1H, H_B3a); 4.06 (s, 2H, H_3'); 3.55-3.31 (m, 16H, O-CH ₂-CH ₂-O); 3.17 (m, 2H, H_14'); 3.08 (m, 1H, H_B4); 2.80および2.59 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.13 (m, 5H, CH₃); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.99-1.30 (m, 6H, H_{B9, B8, B7})。

化合物23の反応性を、ウリジン3'-一リン酸で試験し、毛細管電気泳動で監視した。分析条件は、実施例6.1の条件である。結果から、30分の半減期が分かる。

試薬の安定性は、-20℃で1カ月を上回る。

実施例30.3: パラ-Bio-PMDAMの合成:

4-アセチル安息香酸の保護:
4-アセチル安息香酸(1g;6.1mmol)を、塩化トリメチル(TMSCl、10g;92mmol)のMeOH5ml溶液に溶かす。混合物を、90℃に一晩加熱する。蒸発の後に、化合物31(1.21g;5.75mmol)に対応する白色の固体を単離し、NMRにより同定し、そのまま、次の反応のために使用する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.08 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.59 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3.18 (s, 6H, -O-CH₃); 1.53 (s, 3H, CH₃)。

化合物32:
化合物31(1.21g;5.75mmol)を、Dowex 50WX8-100(0.3g)の存在下に、オルトギ酸トリメチル5mlに溶かす。混合物を60℃に一晩加熱し、次いで、濾過し、蒸発させると、化合物32(1.19g;5.3mmol)が収率87%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.54 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3.89 (s, 1H, CO-O-CH₃); 3.16 (s, 6H, -O-CH₃); 1.51 (s, 3H, CH₃)。

化合物33:
化合物32(1.17g;5.22mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン5ml(22.7mmol)に溶解させる。得られた溶液を、140℃に4時間加熱する。次いで混合物を、DCM30mlに溶かし、水10mlで3回洗浄する。有機相をMgSO₄上で乾燥させ、次いで、蒸発させると、生成物33(1.44g;3.49mmol)に対応するオイルが収率67%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.51 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 3.62-3.47 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_5',13'およびH_3'); 3.15 (s, 6H, -O-CH₃); 2.73 (m, 2H, H_15') 1.88 (m, 2H, H_4'); 1.65 (m, 2H, H_14'); 1.38 (ブロード s, 2H, NH₂)。

ビオチン化化合物34:
ビオチン(780mg;3.19mmol)を、DMF13mlに懸濁させる。次いで、CDI590mg(3.60mmol)を加える。この溶液を室温で30分間攪拌し続ける。化合物33を、DMF1mlに溶解させ、次いで、前述の溶液を少量ずつ加える。次いで、混合物を室温で1時間攪拌し続ける。DMFを蒸発させた後に、カラム(直径35mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM6%500ml、次いで、MeOH-DCM8%250ml、最後にMeOH-DCM8%250mlを用いて実施する。生成物34に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル1.05gが推測される収率30%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 8.49 (ブロード s, 1H, NH_{イミダゾール}); 7.79 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.66 (s, 1H, H_{イミダゾール}); 7.50 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7.38 (t, 1H, NH_2'); 7.11 (s, 2H, H_{イミダゾール}); 6.67 (t, 1H, NH_16'), 5.99 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.15 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.46 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 3.61-3.45 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_5',13'およびH_3'); 3.28 (m, 2H, H_15'); 3.15 (s, 6H, -OCH₃); 2.85 (m, 1H, H_B4); 2.85および2.69 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.86 (m, 2H, H_4'); 1.69 (m, 2H, H_14'); 1.49 (s, 3H, CH₃); 1.42-1.39 (m, 6H, H_{B7, B8, B9})。

化合物35:
アセタール34を、クロロホルム45mlに溶解させ、次いで、2NのHCl10mlを加える。2相混合物を5分間激しく攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO₃上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物35が、薄い黄色の固体(504mg;0.87mmol)の形で、ビオチンからの全体収率27%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 7.97 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.91 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7.51 (t, 1H, NH_2'); 6.50 (t, 1H, NH_16'), 6.05 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.23 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.45 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H_{7' 8',10',11'}およびH_5'); 3.48-3.46 (m, 4H, H_3',13'); 3.27 (m, 2H, H_15'); 3.10 (m, 1H, H_B4); 2.85および2.71 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.60 (s, 3H, CH₃); 2.14 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.89 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.61 (m, 6H, H_14', H_{B7 B9}); 1.40 (m, 2H, H_B8)。

ヒドラゾン化合物36:
ケトン35(500mg;0.864mmol)を、無水EtOH11mlに溶かす。ヒドラジン(335μl;6.911mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に1時間加熱する。蒸発の後に得られるオイルを、全体EtOHに溶かして、再び蒸発させる。すると、生成物36(488mg;0.823mmol)に対応する粘稠性の発泡物質が、収率95%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 7.76 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.67 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 7.29 (t, 1H, NH_2'); 6.46 (t, 1H, NH_16'), 5.98 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.55 (ブロード s, 2H, NH₂); 5.14 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.45 (m, 1H, H_B6a); 4.24 (m, 1H, H_B3a); 3.62-3.51 (m, 10H, H_{7', 8',10',11'}およびH_5'); 3.47-3.45 (m, 4H, H_3',13'); 3.27 (m, 2H, H_15'); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.69 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10およびs, 3H, CH₃); 1.86 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.21 (m, 2H, H_B8)。

ジアゾ化合物37:
ヒドラゾン36(200mg;0.337mmol)を、DMF5mlに溶解させる。次いで、MnO₂(450mg;5.17mmol)を加える。室温で15分間攪拌した後に、混合物をセライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄して、粉末を得る。化合物37(290mg、0.491mmol)が、ピンク色の固体の形で収率93%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.33 (t, 1H, NH_2'); 7.83 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_2,6); 7.73 (t, 1H, NH_16'); 6.98 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H_3,5); 6.39 (ブロード s, 1H, NH _B1); 6.33 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.30 (m, 1H, H_B6a); 4.12 (m, 1H, H_B3a); 3.51-3.45 (m, 16H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'およびH_15'およびH_3',13'); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.14 (s, 3H, CH₃); 2.04 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.77 (m, 2H, H_4'); 1.62-1.48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.31 (m, 2H, H_B8)。

化合物37の反応性を、ウリジン3'-一リン酸で試験し、毛細管電気泳動で監視した。分析条件は、実施例6.1の条件である。結果から、60分の半減期が分かる。

試薬の安定性は、-20℃で少なくとも1カ月である。

実施例30.4: メタ-Bio-EG3-PDAMの合成:

3-ホルミル安息香酸メチル38の保護:
Dowex 50WX8-100樹脂(2g)を、MeOH25mlおよびオルトギ酸トリメチル25mlに溶かし、次いで、15分間攪拌し続ける。デカンテーションの後に、樹脂をMeOH20mlで連続して2回洗浄する。次いで、この樹脂をMeOH100mlに入れ、CH(OMe)₃50mlおよび3-ホルミル安息香酸メチル7.12g(43.4mmol)を加える。溶液を、15分間攪拌し続け、次いで、プリーツ型の紙で濾過し、その後、蒸発させる。生成物39(9g;43.1mmol)が、薄い黄色の液体の形で収率99%で単離される。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 8.10 (s, H, Ar-H₂); 7.9 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.63 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.42 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 5.40 (s, 1H, CH); 3.90 (s, 3H, -CO-O-CH₃); 3.31 (s, 6H, -O-CH₃)。

化合物40:
化合物39(2g;9.5mmol)を、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン10.4ml(47.6mmol)を溶解させる。得られた溶液を165℃に2時間加熱する。次いで、混合物をDCM80mlに溶かし、水20mlで4回洗浄する。MgSO₄上で乾燥させ、蒸発させた後に、生成物40が収率60%(2.27g;5.69mmol)で単離される。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.84 (s, H, Ar-H₂); 7.75 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 5.38 (s, 1H, CH); 3.64-3.43 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_5',13'およびH_3'); 3.29 (s, 6H, -O-CH₃); 2.72 (m, 2H, H_15'); 1.87 (m, 2H, H_4'); 1.64 (m, 2H, H_14'); 1.30 (ブロード s, 2H, NH₂)。

ビオチン化化合物41:
D-ビオチン(344mg;1.40mmol)を、DMF4mlに懸濁させ、次いで、CDI250mg(1.54mmol)を加える。溶液を、室温で30分間攪拌し続ける。化合物40(616mg;1.54mmol)を、DMF2mlに溶かし、次いで、前述の溶液を少量ずつ加える。こうして得られた混合物を室温で50分間攪拌し続ける。蒸発させた後に、カラム(直径30mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、MeOH-DCM10%750ml、次いで、MeOH-DCM15%250mlを用いて実施する。生成物41に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、オイル740mgが推測される50%の収率で得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ = 7.87 (s, H, Ar-H₂); 7.78 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.65 (s, 1H, H_{イミダゾール}); 7.53 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 7.07 (s, 2H, H_{イミダゾール}); 6.65 (t, 1H, NH_16'), 5.95 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.38 (s, 1H, CH); 5.15 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.43 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 3.59-3.44 (m, 14H, H_{7',8',10',11'}およびH_5',13'およびH_3'); 3.29 (m, 8H, H_15'および2-O-CH₃); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.66 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.13 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.85 (m, 2H, H_4'); 1.66 (m, 2H, H_14'); 1.40-1.37 (m, 6H, H_{B7, B8, B9})。

アルデヒド化合物42:
アセタール41を、クロロホルム20mlに溶かし、次いで2NのHCl5mlを加える。2相混合物を15分間激しく攪拌する。有機相を回収し、無水NaHCO₃上で乾燥させる。これを濾過し、蒸発させると、化合物42が、黄色のオイル(593mg;1.02mmol)の形で、ビオチンからの全体収率87%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 10.04 (s, 1H, CHO); 8.34 (s, H, Ar-H₂); 8.16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.72 (t, 1H, NH_2'); 7.39 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6.51 (t, 1H, NH_16'); 6.00 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.30 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.46 (m, 1H, H_B6a); 4.27 (m, 1H, H_B3a); 3.66-3.56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'); 3.50-3.29 (m, 4H, H_3',13'); 3.28 (m, 2H, H_15'); 2.95 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.71 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.15 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.89 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.63 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.23 (m, 2H, H_B8)。

ヒドラゾン化合物43:
アルデヒド42(593mg;1.02mmol)を、無水エタノール10mlに溶かす。ヒドラジン(400μl;8.19mmol)を加え、次いで、反応混合物を還流下に50分間加熱する。蒸発の後に得られた黄色のオイルを、エーテルと共に粉砕すると、生成物43(404mg;0.68mmol)に対応するベージュ色の粉末が収率66%で得られる。次いで、カラム(直径15mmカラム)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、サンプル150mg(0.253mmol)で、MeOH-DCM20%200mlを用いて実施する。分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、生成物43 144mgが収率76%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ = 7.95 (s, H, Ar-H₂); 8.16 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₄); 7.76 (s, 1H, CH); 7.96 (d, H, J = 8 Hz, Ar-H₆); 7.38 (t, H, J = 8 Hz, Ar-H₅); 6.45 (t, 1H, NH_16'); 5.98 (ブロード s, 1H, NH _B1); 5.72 (ブロード s, 2H, NH₂); 5.18 (ブロード s, 1H, NH _B3); 4.44 (m, 1H, H_B6a); 4.26 (m, 1H, H_B3a); 3.62-3.56 (m, 10H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'); 3.48-3.45 (m, 4H, H_3',13'); 3.27 (m, 2H, H_15'); 3.07 (m, 1H, H_B4); 2.84および2.68 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.11 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.86 (m, 2H, H_4'); 1.72-1.59 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.21 (m, 2H, H_B8)。

ジアゾ化合物44:
ヒドラゾン43(100mg;0.187mmol)を、DMF4mlに溶かす。次いで、MnO₂(200mg;2.3mmol)を加える。室温で13分間攪拌した後に、混合物を、セライトを含有するミリポア(厚さ: 2cm)および3Å(0.5cm)の粉末分子ふるいで濾過する。反応混合物を蒸発乾燥させる。得られた残留オイルを、エーテルで連続して3回洗浄する。化合物44(290mg、0.491mmol)が、オレンジ色の固体の形で収率83%で得られる。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 8.39 (t, 1H, NH_2'); 7.78 (t, 1H, NH_16'); 7.39-7.34 (m, Ar-H); 7.09 (d, Ar-H); 6.38 (ブロード s, 1H, NH _B1); 6.32 (ブロード s, 1H, NH _B3); 5.78 (s, 1H, CH-N₂); 4.27 (m, 1H, H_B6a); 4.11 (m, 1H, H_B3a); 3.51-3.44 (m, 10H, H_{7',8',10',11'}およびH_5'); 3.37 (m, 2H, H_15'); 3.32 (m, 4H, H_3',13'); 3.05 (m, 1H, H_B4); 2.79および2.58 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, H_B6); 2.02 (t, 2H, J = 8 Hz, H_B10); 1.69 (m, 2H, H_4'); 1.59-1.48 (m, 6H, H_14', H_{B7, B9}); 1.25 (m, 2H, H_B8)。

生成物の安定性は、-20℃で1カ月よりも長い。

パラ-Cy5-EG3-PDAMの合成:
実施例2で既に述べたように、ビオチンは、Cy5などの他のマーカーに代えることができる。この実施例により、PDAMにより担持されているジアゾ官能基は、ポリエチレングリコール連結アームを介して、このCy5マーカーにも連結しうることが分かる。

合成スキーム: 対イオンI^-は、式46、47、50'および51には示されていない。

2-[4-(N-アセチル-N-フェニルアミノ)ブタ-1,3-ジエニル]-1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウムヨウ化物47:
一塩酸モノアルデヒドビス(フェニルイミン)45(13g;50.2mmol)、NaOAc(6.0g;69.7mmol)および1,2,3,3-テトラメチル[3H]インドリウムヨウ化物46(3.01g;10mmol)からなる無水酢酸(50ml)中の混合物を、100℃に正確に20分間加熱する。冷却した後に、エーテル(350ml)を加え、茶色の固体沈殿物を濾過し、エーテル(3×100ml)で洗浄する。固体をCH₂Cl₂150mlに再溶解させ、濾過し(無機塩の除去)、次いで、エーテル350mlで沈殿させると、茶色の固体(3.54g、54%)が得られる。
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8.64 (d; 1H; J = 12 Hz; 1-H); 8.14 (t; 1H; J = 16; 12 Hz; 3-H); 7.63-7.19 (m; 9H); 6.90 (d; 1H; J = 15 Hz; 4-H); 5.82 (t; 1H; J = 12; 13 Hz; 2-H); 4.06 (s; 3H; NCH₃); (2.16 (s; 3H; -COCH₃); 1.74 (s; 6H; CH₃)。

1-(5-カルボキシペンチル)-2,3,3-トリメチル[3H]インドリウム臭化物50:
2,3,3-トリメチルインドール48(10.0g;62.8mmol)および6-ブロモヘキサン酸49(12.3g;62.8mmol)を、溶剤を用いずに混合し、アルゴン下に110℃に12時間加熱する。赤紫色のペースト状の反応混合物を酢酸エチル(2×60ml、ペーストをスパチュラで粉砕し、上澄みをデカンテーション除去する)で、次いでアセトン(50ml、ペーストが凝固する)で洗浄する。ピンク色の固体を濾過し、次いで、真空乾燥させる(16.0g;73%)。

Cy5COOH化合物51:
ヨウ化物47(2.5g;5.3mmol)、臭化物50(1.87g;5.3mmol)およびNaOAc(1.08g;12.1mmolからなる無水酢酸(11ml)中の混合物を、120℃に25分間加熱する。冷却した後に、エーテル(200ml)を加え、沈殿物を濾過し、エーテル(3×50ml)で洗浄する。生成物50'に対応する固体を、CH₂Cl₂100mlに溶かし、次いで蒸発させる。次いで、酢酸15mlに溶かし、120℃で30分間攪拌する。すると、エーテル200mlを加え、焼結ガラスで濾過した後に、生成物51に対応する沈殿物が、収率84%(2.71g;4.44mmol)で得られる。
¹H NMR (CDCl₃): δ = 8.03 (t; 2H; J = 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7.38-6.91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6.41 (d; 1H; J = 14 Hz; 1-H); 6.31 (d; 1H; J = 13 Hz; 5-H); 4,07 (t; 2H, J = 7; 7 Hz; -CH₂); 3.68 (s; 3H; NCH₃); 2.47 (t; 2H, J = 7; 7 Hz; -CH₂); 1.71 (m; 18H; CH₃, ,および-CH₂)。

化合物26とCy5COOH51との連結(生成物52):
Cy5COOH51(1.5g;2.46mmol)のCH₂Cl₂15ml溶液に、N-メチルモルホリン(NMM、405μl;3.68mmol)を加える。溶液を、氷浴で冷却し、アルゴン下に入れ、次いで、クロロギ酸イソブチル(494μl;3.81mmol)を加える。10分間攪拌した後に、CH₂Cl₂8ml中で希釈されたアミン26(1.86mg;4.67mmol)を加える。混合物を室温で1時間30分攪拌し続ける。CH₂Cl₂20mlを加え、混合物をNaHCO₃(1N)25mlで連続して3回洗浄する。Na₂CO₃上で乾燥させた後に、溶液を濾過して、ジクロロメタン相を回収し、これを蒸発させる。

カラム(直径45mmカラム、20ml分画)でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製を、溶離剤としてMeOH-DCM10%を用いて実施する。生成物52に対応する分画を合わせ、次いで、蒸発乾燥させると、青色の固体が得られ、これを、CH₂Cl₂に溶かす。次いで、生成物52を沈殿させ、エーテルで洗浄すると、青色の生成物が収率72%(1.45g;1.77mmol)で得られる。

次いで、生成物52(ヨウ化物)を、メタノール54mlに溶かし、次いで、アンバーライトIRA900カラム(Cl^-;15g)に通過させる。回収されたメタノール溶液を蒸発乾燥させると、粘稠性のオイルが得られ、これを、CH₂Cl₂に再溶解させる。蒸発により、生成物52'が収率87%で得られる。

アルデヒド53:
アセタール52'を、DCM10mlに溶かし、次いで、2NのHCl10mlを加える。溶液を3時間30分激しく攪拌し続ける。DCM20mlを加えた後に、ジクロロメタン相を回収し、次いで、NaHCO₃上で乾燥させる。蒸発の後に得られる生成物をエーテルで洗浄すると、アルデヒド53が収率90%(1.18g;1.46mmol)で得られる。

ヒドラゾン54:
アルデヒド53(200mg;0.247mmol)を、無水エタノール1mlに溶かし、ヒドラジン一水和物(15.6μl;0.321mmol)を加える。溶液を室温で30分間攪拌する。エーテル8mlを加え;混合物をエーテルで、3回連続してデカンテーションすることにより洗浄し、ついで、真空乾燥させる。ヒドラジン54 172mg(0.209mmol;収率85%)が得られ、冷凍庫に貯蔵する。

ジアゾ55:
ヒドラゾン54 20mg(0.243mmol)のDMF2ml溶液に、MnO₂100mgを加え、混合物をアルゴン下に室温で5分間激しく攪拌する。懸濁液を、セライト(厚さ: 2cm)および粉末分子ふるい3Å(0.5cm)からなる層で濾過し、DMFで洗浄する。溶液を蒸発させ、次いで、残留物をエーテルで粉砕する。こうして得られた固体を乾燥させる。ジアゾ55 18mg(0.185mmol;76%)が得られる。

試薬の安定性は、-20℃で1カ月を上回る。

メタ-Fluo-EG3-PMDAMの合成:
実施例23および25で既に述べたように、ビオチンを、他のマーカーに代えることができる。この実施例により、PMDAMにより担持されているジアゾ官能基を、ポリエチレングリコール連結アームを介して、このフルオレセインマーカーにも連結しうることが分かる。

化合物72: メタ-Fluo-EG₃-PMDAM 74
イソチオシアン酸フルオレセイン(250mg、0.64mmol)を、無水DMF1.6mlにピリジン2%と共にアルゴン下に溶かす。無水DMF1.6mlに溶けている生成物69(0.356g、0.81mmol)を加える。混合物を放置して、室温で3.5時間反応させ、次いで、DMFを蒸発させ、残留物をH₂O25mlに入れる。次いで、3回の抽出を、CH₂Cl₂50mlを用いて行い、水相を蒸発させる。生成物72 255mg(48%)が得られる。

メタ-Fluo-EG₃-ヒドラゾン-トシル化合物75:
化合物72(255mg、0.31mmol)を、還流下にエタノール1.5mlに溶かす。エタノール1.5ml中のp-トルエンスルホニル-ヒドラジン(69.2mg、0.37mmol)を加え、混合物を放置して、6時間反応させる。混合物を蒸発乾燥させ、固体をCH₂Cl₂、H₂Oおよびエーテルで洗浄する。生成物75 18.5mg(74%)が、オレンジ色の粉末の形で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 1.6-1.8 (m, 4H); 2.13 (s, 1H); 2.28 (s, 1H); 2.36 (s, 1H); 2.80 (m, 1H); 3.07 (m, 2H); 3.46 (m, 12H); 6.5-6.7 (m, 6H); 7.1-8.3 (m, 9H)。

メタ-Fluo-EG₃-PMDAM化合物74:
ヒドラゾン75(176mg、0.18mmol)を、10%KOHの無水メタノール溶液720μlに溶かす。溶液を、還流下に3時間維持する。溶液を放置して冷却させ、沈殿物を生成する。溶液を濾過し、蒸発乾燥させる。残留物をエーテルで洗浄し、乾燥させる。

NMR分析により、2.36および2.13ppmでのシグナル(トシルおよびヒドラゾンのメチルに対応)の消失および1.96ppmでのピーク(ジアゾのメチルに対応)の出現が判明する。

後続の標識を可能にするジアゾメチル中間体:
マーカーR²を担持しているジアゾメチル標識試薬での直接的な標識ではなく、間接的な標識で2段階で処理することが有利である。この場合、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬は、予め予備官能化されていると言うことができる。即ち、これは、直接的または間接的マーカーと後で反応させることができる化学的官能基を含む。反応性共有官能基を、直接的または間接的マーカーの抗反応性共有官能基と反応しうる標識試薬に導入することにより、予備官能化を行うことができる。これらの官能基は、求電子性有機化学官能基および求核性有機化学官能基またはその逆からなる。

このような標識手順の例を、下記のスキームで詳述する。

この場合、標識試薬は、ジアゾメチル官能基に加えて、求電子性または求核性官能基W¹を含み、これは、W¹に相補的な官能基W²を有するマーカーR²と反応しうる。

例えば、W¹は、メチルケトンまたはアルデヒド官能基である場合、W²は、アルコキシアミン官能基である。

核酸などの生体分子を標識する方法では、核酸を、ジアゾメチル官能基を有する標識試薬と接触させ、続くステップで、マーカーW²-R²を、官能基W¹を介して核酸と反応させる。

使用の1つは、例えば、核酸の配列を増幅する方法またはシグナル増幅の方法である。このタイプの標識に関する更なる情報は、1996年8月2日の優先日を有する特許出願WO-A第98/05766号および1999年1月5日に優先日を有する特許出願WO-A第00/40590号に見ることができる。

実施例33.1: MeCO-PMDAMの合成:

その合成はこの実施例に記載する生成物85により、ホスフェート基とのジアゾメチル官能基の反応性により天然核酸の標識を実施して、メチルケトン官能基を導入し、これを、後で、アルコキシアミン基を有する検出可能な(蛍光、ビオチン)分子を導入するために使用することができる。

この合成は、化学で日常的に使用される知られている方法をベースとする。出発原料は、マーカー71および74を合成するためのものと同一である。第1のステップは、ギ酸フルオレニルメチル(Fmoc,99)で末端アミンを保護することである。この保護基の選択は、その安定性および開環条件に基づく。

前記で使用した方法(メタ-Fluo-EG₃-PMDAM例)により保護されたヒドラゾン82を生成した後に、末端アミンを、穏やかな塩基性条件下に脱保護し、これにより、ヒドラゾンの安定性を保証する。アセト酢酸メチルを使用して、末端アミンをアシル化反応させることにより、メチルケトン官能基を生成する(化合物26および36の生成参照)。次いで、ジアゾメチルの精製を、前記の方法のいずれかにより実施する。

実施例33.2: H₂NO-PMDAMの合成:

合成はこの実施例に記載されている生成物88により、ホスフェート基とのジアゾメチル官能基の反応性により天然核酸の標識を実施して、アルコキシアミン官能基を導入し、これを、後で、メチルケトン基を有する検出可能な(蛍光、ビオチン)分子を導入するために使用することができる。

この合成は、先行する合成モデル、即ち、アミンを保護するためにFmocの、さらにヒドラゾンを保護するためにトシルの前駆体69を使用することをベースとする。アルコキシアミン官能基(化合物86)の導入を、Fmoc官能基により保護されているカルボキシメトキシアミン(市販)(E.Trevisiol Thesis,LEDSS Grenoble, 1999)を使用して行う。最終脱保護のために、穏やかな条件を使用して(化合物88)、この脱保護を、ジアゾメチルの生成の直後に実施する。

シグナルの増幅を可能にするPDAM誘導体の調製:
実施例34.1: [Bio-EG3]2-PDAMなどのビス-ビオチン化マーカーの合成:

アルコール57への1,3,5-ベンゼンカルボン酸トリメチル56の還元:
トリエステル56(12.6g;50.0mmol)を、THF100mlに溶かし、次いで、LiBH₄1.1g(50.5mmol)を室温で加える。アルゴン下に攪拌しながら、赤い溶液を、40〜45℃に1時間加熱する。冷却(氷)の後に、過剰の水素化物を、水(200ml)、次いで2NのHCl(30ml)を加えることにより、慎重に分解する(H₂の放出)。明るい黄色への色変化が観察される。この溶液を、CH₂Cl₂(100ml、次いで50mlで3回)で抽出し、有機相を無水NaHCO₃で洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させると、オイル(11.1g)が得られる。シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(直径=40mm、溶離剤: 酢酸エチル/シクロヘキサン=1/1)を使用すると、アルコール57(6.38g、57%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8.53 (t, 1H, J = 2 Hz); 8.18 (d, 2H, J = 2 Hz); 4.76 (s, 2H); 3.91 (s, 6H); 2.30 (s, 1H)。

アルデヒド58へのアルコール57の酸化:
アルコール57(5.86g;26.1mmol)を、THF100mlに溶かし、次いで、MnO₂40.0gを少量ずつ、室温で5分かけて加える。溶液を、アルゴン下に一晩攪拌し続ける。溶液を、セライト545の層を備えたブフナー漏斗で濾過し、CH₂Cl₂で洗浄し、次いで、溶剤を蒸発させる。粗製の固体(4.4g)を、シリカカラム(直径=50mm、溶離剤: 酢酸エチル/シクロヘキサン 3/7)でのフラッシュクロマトグラフィーにより生成する。アルデヒド58 3.44g(59%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 10.11 (s, 1H); 8.89 (t, 1H, J = 1 Hz); 8.69 (d, 2H, J = 1 Hz); 3.98 (s, 6H)。

アセタール59の生成:
アルデヒド58(3.21g;14.4mmol)を、メタノール30mlに溶かし、次いで、TMSCl6.0mlに加える。溶液を、アルゴン下に室温で1時間攪拌し続ける。溶液を、CH₂Cl₂200mlで希釈し、1MのNaHCO₃(100ml)と共に攪拌する(CO₂の放出に注意)。2相を分け、水相をCH₂Cl₂(25ml)で3回抽出し、有機相を合わせ、MgSO₄上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させる。アセタール59 3.55g(92%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8.63 (t, 1H, J = 2 Hz); 8.29 (d, 2H, J = 2 Hz); 5.45 (s, 2H); 3.93 (s, 6H); 3.32 (s, 6H)。

二酸60へのジエステル59の加水分解:
ジエステル59(3.18g;11.9mmol)を、THF10mlに溶かし、次いで、KOH(2.0g、ペレット85%)のメタノール10ml溶液を加える。室温で15分の後に、溶剤を蒸発させる。残留物をH₂O(50ml)に溶かす。H₃PO₄(約2.5ml、85%)を加えてpH3にし、白色の沈殿物を焼結ガラス(#3)で濾過し、水で洗浄し、真空乾燥させる。二酸60 2.59g(91%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.43 (t, 1H, J = 1 Hz); 8.15 (d, 2H, J = 1 Hz); 5.53 (s, 1H); 3.27 (s, 6H)。

トリフルオロアセトアミド62:
ジアミン61(66g;0.30モル)を、CH₂Cl₂250mlに溶かし、次いで、トリフルオロ酢酸エチル(11.8ml、0.10モル)を、アルゴン下に攪拌しながら、10℃で5分かけて滴加する。室温での15分の後に、溶液を分離漏斗に移し、H₂O(3×100ml)で洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、溶剤を蒸発させる。約85%の純度(¹⁹F NMRにより決定)を有するモノアミド62 22.4g(71%)が得られる。この化合物を、-20℃で貯蔵し、精製することなく使用する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 3.5-3.6 (m, 12H); 3.42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2.75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1.81 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.67 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.30 (ブロード s, 2H)。
¹⁹F NMR (190 MHz, CDCl₃): δ = -76.3。

化合物63:
D-ビオチン(6.39g;26.2mmol)のDMF50ml懸濁液に、カルボニルジイミダゾール(CDI,6.32g、80%、31.2mmol)を加える。混合物を、アルゴン下に攪拌しながら55〜60℃に30分間加熱する。物質の完全な溶解が初めに観察され、続いて、白色の固体の沈殿を伴って、一塊に集まる(CO₂放出)。アミン(オイル)を、すすぎのためのCH₂Cl₂5mlを用いて加え、混合物を55〜60℃に3時間加熱する。真空(<1mmHg)下にDMFを蒸発させ、残留物をCH₂Cl₂(700ml)および2NのHCl(100ml)と共に攪拌する。セライト545の層で2相を濾過した後に、相を分離し、水相をCH₂Cl₂(15×100ml)で抽出し、有機相を合わせ、無水NaHCO₃およびMgSO₄の上で乾燥させ、次いで、溶剤を蒸発させる。油性の残留物をエーテル150mlと共に砕くと、懸濁液が得られる。ペースト状の固体は、濾過するのが難しい。上澄みをデカンテーション除去し、エーテルでの洗浄を繰り返す。真空下に乾燥させた後に、化合物63 9.13g(64%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 3.5-3.6 (m, 12H); 3.42 (t, 2H, J = 6 Hz); 2.75 (t, 2H, J = 6 Hz); 1.81 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1,67 (四重線, 2H, J = 6 Hz); 1.30 (ブロード s, 2H)。
化合物64:
化合物63の水性アンモニア溶液(100ml、22%水溶液)を、隔膜を備えた250ml丸底フラスコ中で、55〜60℃で2時間加熱する。冷却の後に、溶剤を蒸発させる。残留物をメタノール(20ml)に溶かし、Dowex 21Kアニオン-交換樹脂に通過させる[高さ12cm×直径35mm、1NのNaOH(1.5l)、次いでH₂O(1.5l)、次いでメタノール(1.5l)での先行する洗浄により得られるOH^-形]。トリフルオロアセテートイオンを含有しない化合物64を、第1の分画にメタノール200mlと共に通過させる。蒸発の後に、残留物をエーテル50mlと共に砕き、次いで、これをデカンテーション除去する。エーテルでの洗浄を、連続して5回繰り返す。乾燥の後に、化合物64(6.43g、86%)が得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 6.77 (t, 1H, J = 4 Hz); 6.32 (s, 1H); 5.52 (s, 1H): 4.45 (m, 1H); 4.28 (m, 1H), 3.50-3.68 (m, 12H); 3.30 (m, 2H), 3.11 (m, 1H); 2.86 (dd, 1H, J = 13および5 Hz), 2.75 (t, 2H, J = 13 Hz), 2.68 (d, 1H, J = 13 Hz); 2.16 (t, 2H, J = 7 Hz); 1.60-1.85 (m, 8H); 1.41 (m, 2H)。

[Bio-EG₃]₂-アセタール65:
二酸60(120mg;0.500mmol)のジクロロエタン(5ml)懸濁液に、カルボニルジイミダゾール(225mg、90%、1.25mmol)を加え、混合物を、アルゴン下に攪拌しながら55〜60℃に30分間加熱する。アミン64(550mg;1.23mmol)を加え、溶液を55〜60℃に6時間加熱する。蒸発の後に、残留物をシリカカラムに通過させる(直径: 25mm、溶離剤: CH₂Cl₂中メタノール15〜30%)。化合物65 413mg(75%)が得られる。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 8.34 (s, 1H); 8.06 (s, 2H); 7.87 (m, 2H); 6.85 (m, 2H); 6.60 (s, 2H); 5.93 (s, 2H): 5.40 (s, 1H); 4.45 (m, 2H); 4.27 (m, 2H), 3.43-3.68 (m, 24H); 3.31 (s, 6H); 3.25 (m, 4H), 3.08 (m, 2H); 2.83 (dd, 2H, J = 13および5 Hz), 2.70 (t, 2H, J = 13 Hz); 2.13 (t, 4H, J = 7 Hz); 1.89 (五重線, 4H, J = 7 Hz); 1.55-1.70 (m, 12H); 1,37 (m, 4H)。

[Bio-EG₃]₂-アルデヒド66:
メタノールに溶かしたアセタール65(413mg;0.376mmol)を、2NのHCl(0.5ml)で処理する。蒸発させ、エーテルで洗浄した後に、アルデヒド66(0.37g、90%)が得られる。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ = 10.11 (s, 1H); 8.82 (t, 2H, J = 6 Hz); 8.62 (s, 1H); 8.47 (s, 2H); 7.73 (t, 2H, J = 5 Hz); 4.30 (m, 2H); 4.11 (m, 2H), 3.30-3.60 (m, 24H); 3.06 (m, 6H); 2.80 (dd, 2H, J = 12および5 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 12 Hz); 2.03 (t, 4H, J = 7 Hz); 1.78 (五重線, 4H, J = 7 Hz); 1.35-1.60 (m, 12H); 1.28 (m, 4H)。

[Bio-EG₃]₂-PDAM67:
アルデヒド66を、ジアゾメタン(実施例1)を調製するために使用された方法に従い、ジアゾメタン67に変える。

試薬の安定性は、-20℃で、1カ月を上回る。

実施例34.2: メタ-Bio7-EG3-PMDAMの合成:

EG₃-アセトフェノン化合物76:
3,6,9-トリオキサ-1,11-ウンデカンジオ酸(undecanedioic acid)(EG₃、12.64ml、74mmol)を、無水DMF80mlにアルゴン下に溶かし、氷浴上で冷却させた。次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、11.45g、55.5mmol)を無水DMF20mlに溶かし、徐々に加える。30分後に、3-アミノアセトフェノン(5.0g、37mmol)を加え、反応を放置して、アルゴン下に室温で1時間進行させる。次いで、DMFを真空下に蒸発させ、CH₂Cl₂70mlを加える。溶液を濾過し、1%酢酸3×25mlで抽出する。水相を合わせ、CH₂Cl₂25mlで洗浄する。有機相を混合し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾燥させる。生成物を、MeOH: H₂O対から再結晶させる。こうして、生成物76 8.74g(70%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.55 (s, 3H); 3.5-3.7 (m, 8H); 4.0 (s, 2H); 4.1 (s, 2H); 7.45 (t, 1H); 7.65 (d, 1H); 7.90 (d, 2H); 8.2 (s, 1H); 9.8 (s, 1H)。

(NH₂)₇-EG₃-アセトフェノン化合物77:
生成物76(120mg、0.35mmol)を、アルゴン下に無水DMF15mlに溶かし、氷上で冷却し、ついで、DCC(110mg、0.53mmol)を加える。30分後に、この溶液を、市販のデンドリマー"Starburst PAMAM Dendrimer,Generation 1"(Aldrich,St Quentin Fallavier)の溶液(1g、0.71mmol、メタノール中5ml)の上に、激しく攪拌しながら徐々に加える。反応を放置して、室温で1時間進行させ、混合物を蒸発させる。残留物をCH₂Cl₂10mlに入れ、1%酢酸30mlで2回抽出する。

Biot₇-EG₃-アセトフェノン化合物78:
D-ビオチン(1.73g、7.08mmol)を、アルゴン下に無水DMF80mlに溶かし、溶液を氷の上で冷却する。N-メチルモルホリン(NMM、856μl、7.7mmol)およびクロロギ酸イソブチル(1022μl、7.7mmol)を連続して加える。30分後、生成物77(1.13g、0.7mmol、メタノール5ml中)を加え、反応を放置して、氷の上、アルゴン下に、3時間進行させる。混合物を真空下に濃縮して50mlにし、CH₂Cl₂100mlを加える。沈殿物が生じ、これを濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。78 1.3gが、白色の粉末の形で得られる。

Biot₇-EG₃-ヒドラゾン化合物79:
化合物78(300mg、0.09mmol)を、無水エタノール10mlに還流下に溶かす。ヒドラジン一水和物(20ml、0.40mmol)を加え、反応を放置して、還流下に3時間進行させる。冷却の後に、沈殿物が生じ、これを濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。こうして、生成物79 109mg(36%)が白色の粉末の形で得られる。

Biot₇-EG₃-PMDAM化合物80:
ヒドラゾン79(100mg、0.03mmol)を、無水DMF5mlに70℃で溶かす。混合物を放置して、室温に戻し、MnO₂(31mg、0.36mmol)を加える。反応を放置して10分間進行させ、セライト(0.5cm)および粉末分子ふるい(0.5cm)を備えた焼結ガラスで濾過することにより、酸化マンガンを除去する。濾液を蒸発乾燥させ、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥させる。こうして、生成物80 78mg(78%)が得られる。

デンドリマーは、アミン、カルボキシル、ヒドロキシルなどの複数の反応性基を末端に有する樹枝状分子である(概観のためには、Newcome et al., (1996) Dendritic Molecules: Concept, Syntheses, Perspectives. VCH Ed., Weinheim, Germany参照)。これらの分子の合成は今日では、完全に制御されていて、多くのデンドリマーが、化学工業で取引されている。PAMAM(Sigma-Aldrich)の選択は、その安定性、可溶性および柔軟性に基づいた。番号および末端タイプが異なる複数種のこの分子を利用することができるためである。"PAMAM Generation 1"により、マーカーの7つの分子(単一合成ステップ)を各ジアゾメチル基に加えることができる。

メタ-BioPMDAMを用いる、DNA増幅産物の2ステップでの標識化および断片化:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。

a. 2ステップでの標識化および断片化:
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水77μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を95℃で10分間インキュベーションする。

b. 1ステップでの標識化および断片化:
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μl、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水75μlを加える。溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例17のものと同一である。

結果:

表25で証明されているように、1ステップのプロトコルで得られた結果は、十分である。2ステップでの標識化および断片化で得られた結果は、さらに良好である。この実施例により、標識および開裂ステップを別々にして、使用されるターゲットにより標識を改善することができることが分かる。

様々な反応フォーマットでのDNA増幅産物の標識化および断片化:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。3つの標識反応を実施した。

a. 250μlフォーマットでの標識化および断片化:
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水102.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl22.5μlを加え、溶液を95℃で5分間インキュベーションする。

b. 200μlフォーマットでの標識化および断片化:
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水52.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl22.5μlを加え、溶液を95℃で5分間インキュベーションする。

c. 150μlフォーマットでの標識化および断片化:
PCR50μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)75μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水2.5μlを加える。溶液を、95℃で25分間インキュベーションする。

次いで、0.1MのHCl22.5μlを加え、溶液を95℃で5分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例17のものと同一である。

結果:

シグナルおよび相同性パーセンテージに関して得られた結果は、いずれのケースでも非常に十分なものである。さらに、反応フォーマットを150から250μlで変動させるが、結果は、同様の値を有する。

この実施例は、様々な容量および特に増幅生成物の異なる容量を許容しうる標識プロトコルの反応フォーマットの柔軟性を示している。

断片化の前に精製ステップを使用するプロトコルと、断片化の後に精製ステップを使用するプロトコルとの比較:
実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。

a. DNA増幅産物の標識、精製、断片化:
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水80μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、精製を、実施例17に記載のプロトコルに従い実施する。精製された標識増幅産物の溶液に、0.1MのHCl6μlを加える。溶液を95℃で10分間インキュベーションする。予め95℃に10分間予備加熱されたハイブリダイゼーション緩衝液400μlを加える。

ハイブリダイゼーション緩衝液の組成およびプロトコルの残りは、実施例17のものと同一である。

b. DNA増幅産物の標識、断片化および精製:
PCR10μlに、メタ-BioPMDAM(DMSO中100mM)10μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水77μlを加える。溶液を、95℃で10分間インキュベーションする。次いで、0.1MのHCl3μlを加え、溶液を再び、95℃で10分間インキュベーションする。プロトコルの残りは、実施例17のものと同一である。

結果:

表27に示されているこの結果から、精製ステップは、標識化および断片化ステップの間に導入することができる。さらに、標識化および断片化ステップの間に精製を導入することにより、開裂の間に変性を実施し、標識された増幅産物断片の全てを、チップの上にハイブリダイゼーションすることができる。

2-ニトロ-パラ-BioPDAMの合成:

アルデヒドの保護:
2,4-ジニトロベンズアルデヒド5g(25.5mmol)を、トルエン250mlに溶かし、エチレングリコール20mlおよびパラ-トルエンスルホン酸150mgを加える。混合物を、還流下に加熱し、水を、ディーンスターク系で6時間回収する。混合物をEtOAc150mlおよびH₂O100mlで処理する。溶液を、酢酸エチルで2回抽出し、有機相をMgSO₄上で乾燥させ、ついで、蒸発させる。生成物100に対応する得られたオイルを、次の反応に使用する。
¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 8.70 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 8.44 (dd, 1H_aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 8.02 (d, 1H_aro, J = 8 Hz, H₆); 6.49 (s, 1H, CH); 4.12-4.06 (m, 4H, CH₂-CH₂)。

ジニトロ誘導体100の還元:
保護された2,4-ジニトロベンズアルデヒド(6.4g;25.5mmol)を、エタノール-水(6/1)混合物に溶かし、次いで、Na₂S九水和物2当量(12.3g;51.1mmol)を加える。次いで、反応混合物を30分間加熱する。蒸発、次いでジクロロメタンを使用する抽出を実施する。乾燥させ、濾過した後に、反応媒体を蒸発させると、オイルが得られ、これを、シリカカラム(シクロヘキサン/酢酸エチル 60/40)で直接精製する。化合物101が、収率45%で単離される。
化合物101: 融点58-60℃。- ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃): 7.49 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7.09 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₆); 6.80 (dd, 1H_aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 6.27 (s, 1H, CH); 3.99-3.97 (m, 4H, CH₂-CH₂)。

ビオチンとの連結:
D-ビオチン(1.0g;4.1mmol)を、無水DMF20mlおよびN-メチルモルホリン600μlに可溶化させる。クロロギ酸イソブチル(700μl;5.5mmol)をアルゴン下に加え、その間、氷浴上で冷却する。混合物を5分間攪拌し続け、次いで、化合物101 1g(4.75mmol)およびN-メチルモルホリン500μlを加える。溶液を、室温で4時間攪拌し続け、次いで、蒸発乾燥させる。得られたオイルを、溶離剤としてMeOH-DCM7%、次いで10%を用いるシリカカラムに直接通過させる。生成物102(1.1g;2.52mmol)が、収率62%で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.40 (s, 1H, NH-CO); 8.31 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7.77 (dd, 1H_aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 7.68 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₆); 6.43 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.36 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.23 (s, 1H, CH); 4.28 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.92 (s, 4H, CH₂-CH₂); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.85および2.76 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH₂)₃)。

アセタールの脱保護:
生成物102(768mg;1.76mmol)を、THF25mlに懸濁させる。2NのH₂SO₄4mlを加えた後に、全体を溶かす。混合物を2時間攪拌し続ける。これを蒸発させ、次いで、焼結ガラスの上で水を用いてすすぎ、洗浄する。化合物103(694mg)が、黄色の粉末の形で、収率90%で得られる。
融点165℃。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.69 (s, 1H, NH-CO); 10.09 (s, H, CHO); 8.43 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7.91 (s, 2H_aro, H₅およびH₆); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.35 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); δ = 6.23 (s, 1H, CH); 4.29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH₂)₃)。

ヒドラゾン104の生成:
アルデヒド103を、エタノールに懸濁させ、この懸濁液を、80℃に加熱する。ヒドラジンを加えると、全体が溶け、この溶液は直ちにオレンジ色を呈する。5分後に沈殿物が生じる。混合物を、攪拌しながら1時間加熱する。これを、焼結ガラスで濾過し、次いで、沈殿物を乾燥させる。生成物104(700mg;690mmol)が、収率98%で得られる。
融点169℃。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.31 (s, 1H, NH-CO); 8.31 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7.96 (s, H, CHO); 7.87 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₆); 7.68 (dd, 1H_aro, J = 2 Hz, J = 6 Hz, H₅); 7.31 (s, 2H, NH₂); 6.42 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.34 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH₂)₃)。

ジアゾ105の生成:
化合物104(200mg;0.492mmol)を、DMF8mlに溶かす。MnO₂400mgを加える。混合物を激しく10分間攪拌する。セライト(厚さ: 2cm)および粉末分子ふるい3Å(0.5cm)を含有するミリポアで濾過する。これを蒸発乾燥させ、次いでエーテルで洗浄する。混合物を再びミリポアで濾過する。化合物105(180mg;0.445mmol)が、オレンジ色の粉末の形で、収率98%で得られる。
融点155℃。- ¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.21 (s, 1H, NH-CO); 8.60 (d, 1H_aro, J = 2 Hz, H₃); 7.77 (d, 1H_aro, J = 6 Hz, H₅); 7.22 (d, 1H_aro, J = 6 Hz, H₆); 6.60 (s, H, CH-N); 6.41 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 6.33 (ブロード s, 1H, NH-CO-NH); 4.29 (m, 1H, CH₂-CH-NH); 4.13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3.12 (m, 1H, CH-S); 2.84および2.78 (ABX系, 2H, ²J_AB = 5 Hz, ³J_AX = 12 Hz, ³J_BX = 0 Hz, CH₂-S); 2.29 (t, 2H, J = 8 Hz, CH₂-CO); 1.61-1.39 (m, 6H, (CH₂)₃)。

化合物105の反応性を、ウリジン3'-一リン酸で試験し、毛細管電気泳動を続けた。分析条件は、実施例6.1のものである。結果は、45分の半減期を示す。

試薬の安定性は、-20℃で1カ月を上回る。

2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体でのRNAの標識:
実施例38に記載のプロトコルに従い、2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体105を調製した。実施例5.2に記載のプロトコルに従い、RNA転写産物を得た。標識化および断片化方法を、下記の表28に記載の条件下に、2-ニトロ-パラ-BioPDAM試薬を用いて単一ステップで実施する。2種の標識反応を実施した:
a. 2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体での標識:
転写産物10μlに、2-ニトロ-パラ-BioPDAM2μl(DMSO中100mM)、イミダゾール3μl(水中1M)、MnCl₂5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水85μlを加える。この溶液を、60℃で10分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例8のものと同一である。

b. メタ-BioPMDAM試薬での標識:
転写産物10μlに、メタ-BioPMDAM2μl(DMSO中100mM)、イミダゾール3μl(水中1M)、MnCl₂5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水85μlを加える。この溶液を、60℃で10分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例8のものと同一である。

結果:

表28から、2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体は、RNAに対して良好な標識結果をもたらすことが判明する。ニトロ基などの置換基を使用して、ジアゾメチル官能基を有するマーカーの反応性および安定性を修飾することができる。

標識剤2-ニトロ-パラ-BioPDAMによるDNA増幅産物の標識化および断片化
実施例38に記載の反応スキームに従い、2-ニトロ-パラ-BioPDAM誘導体を得た。実施例5.1に記載のプロトコルに従い、PCR増幅により、DNA増幅産物を調製した。2つの標識反応を実施した。

a. 2-ニトロ-パラ-BioPDAM試薬での標識:
PCR10μlに、2-ニトロ-パラ-BioPDAM2μl(DMSO中100mM)、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水83μlを加える。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

b. メタ-bioPMDAM試薬での標識:
PCR10μlに、メタ-bioPMDAM2μl(DMSO中100mM)、0.1MのHCl5μlおよびDNアーゼ/RNアーゼを含まない水83μlを加える。この溶液を、60℃で30分間インキュベーションする。

プロトコルの残りは、実施例17のものと同一である。

結果:

DNAを標識するために使用された2-ニトロ-パラ-BioPDAM試薬により、標識強度および相同性パーセンテージに関して有利な結果が得られる。

ジアゾメチル官能基とフェニル核との間への二重結合の挿入、DAMを隔離すること、この隔離に特に適した分子の合成:
この目的は、芳香族構造のジアゾメチル(DAM)官能基を隔離して、ホスフェートをアルキル化する間、さらに標識された核酸とその相補的な配列とのハイブリダイゼーションの間の立体障害の作用を低減することである。

(パラ-メトキシカルボニル)スチリルメチルケトン89を生成するためのアルドール反応のために、ホルミル基の攻撃を容易にするメチレンのプロトンの高い酸性のためにアセト酢酸エチルを使用し、後で、H₂O(芳香環との二重結合の結合によって促進される)を除去し、塩基性媒体による加水分解で脱炭酸反応する。合成の残りは、他の実施例で示されているものと同様である。

最終生成物パラ-Bio-EG₃-SMDAM90は、ジアゾメチルと芳香環との間に2個以上の炭素を有し、これによって、起こりうる立体問題が制限されつつ、結合により、芳香系によるジアゾメチルの安定が保持される。

ジアゾメチル基を有する固体支持体上での核酸の捕捉および検出:
ジアゾメチル基を有する樹脂の反応性を、核酸を結合するその能力を決定するために研究した。

4-(ジアゾメチル)フェノキシメチルポリスチレン(参照17338、Fluka)は、カルボキシル基、特にタンパク質中に存在するカルボキシル基に結合するその能力が記載されている樹脂であるが(G. Bhalay, A.R. Dunstan, Tetrahedron Lett. 39, 7803 - 1998)、DNA分子に結合する能力に関しては記載されていない。我々は、この試薬で核酸を捕捉し、これらを、比色試験により可視化することができるかを試験した。

この実験を、HLA-DRオリゴ検出キット(参照33202、bioMerieux,France,基本原理は、特許EP第549776-B1に記載)内に存在する一部の試薬を用いて実施し、比色読み取りによる、マイクロプレートでPCRにより増幅された核酸の検出を可能にする。前記の実験に関連して、PCRにより調製された核酸により、試験される樹脂との、さらに、その合成は実施例28に記載されているパラ-Bio-EG3-PDAMの分子との同時反応が生じる。DNAが、2つの化合物の上に存在するジアゾメチル官能基と反応する場合、非共有結合している分子を洗浄および除去した後に、これを可視化することができ、その際、ストレプトアビジンに結合される酵素を必要とする比色反応を使用する。ストレプトアビジンが、ホースラディッシュペルオキシダーゼと組合されると、この酵素は、オルトフェニレンジアミン分子(キットの色1試薬)を分解して、波長492nmで検出することができる化合物にする。

実施例42.1: DNAの捕捉および検出:
樹脂10mgを、実施例5.1に記載のように、PCR50μlと共に、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水(Sigma)400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBSツイーン緩衝液500μl(キットの色0 HLA試薬、PBS pH7.0;1%ツイーン、BND0.2g/l;シプロフラキサシン(Ciproflaxacin)0.01g/l)で洗浄する。次いで樹脂を、PBSツイーン100μlおよび1/10000希釈されたストレプトアビジンHRP(S-911、MOLECULAR PROBES,EUGENE,OR,USA)を添加したストレプトアビジンハイブリダイゼーション緩衝液250μl(PBS pH7.0 0.5%ツイーン)に再懸濁させる。反応混合物を室温で30分間インキュベーションする。次いで樹脂を、PBSツイーン緩衝液500μlで3回洗浄し、これを、発色試薬(1色1錠、オルト-フェニレンジアミン塩酸塩、色2緩衝液5mlで希釈、100mMのリン酸ナトリウム、50mMのクエン酸、0.03%H₂O₂)の存在下に、室温でインキュベーションする。暗所で20分間インキュベーションした後に、反応をH₂SO₄(1.8Nの色3試薬)50μlでブロックする。次いで、上澄みをピペットし、マイクロプレートに置いて、492nmでの反応媒体の吸収を読み取る。

実施例42.2: 核酸を用いない対照:
樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水(Sigma)425μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いでサンプルを、実施例42.1に記載の手順と同様に処理する。

実施例42.3: ターゲットを用いないで実施されるPCRでの対照:
前記のゲノムDNAの容量の代わりに精製水25μl容量を用いて行われるPCR50μlと共に、樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いでサンプルを、実施例42.1に記載の手順と同様に処理する。

実施例42.4: リビーリング(revealing)分子を用いないPCRでの対照:
樹脂10mgを、PCR50μlと共に精製水400μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂をPBS緩衝液500μlで洗浄する。次いで、サンプルを実施例42.1に記載の手順と同様に処理する。

実施例42.5: 非捕捉核酸での対照:
樹脂10mgを、パラ-Bio-EG3-PDAM5μlを添加した精製水400μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、この樹脂を、PBSツイーン緩衝液500μlで洗浄する(キットの色0 HLA試薬、PBS pH7.0;ツイーン1%、BND0.2g/l;シプロフラキサシン0.01g/l)。次いで、この樹脂を、PBSツイーン100μlおよび1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したストレプトアビジンハイブリダイゼーション緩衝液250μlに再懸濁させる。この試料に、次のように調製されたDNA試料50μlを加える:
パラ-Bio-EG3-PDAM5μlおよび精製水70μlを、実施例5.1の記載のように調製されたPCRから得られたDNA25μlに加える。この混合物を、60℃で30分間インキュベーションし、次いで、過剰のマーカーを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で試料を精製することにより除去し、容量50μlで最終溶離を実施する。

反応混合物を、室温で30分間インキュベーションし、次いで、これを、実施例42.1に記載の手順と同様に処理する。

結果:

表30で、高い比色値は、反応媒体中での酵素の高い濃度を示しており、これは、ビオチン誘導体を有する核酸の存在量に対応している。対照は、シグナルが、ビーズに対するDNAの非特異的吸収によるものでも、樹脂上でのパラ-Bio-EG3-PDAMの反応によるものでも、または樹脂上のストレプトアビジンHRPの吸収によるものでもなく、パラ-Bio-EG3-PDAMで共有的に捕捉され、標識されたDNAの存在によるものであることを示している。

マイクロプレートでの捕捉および検出を可能にするPCR産物の標識:
ジアゾメチル官能基を有する1タイプのみの分子でDNA分子を標識して、マイクロプレートの上で、単一ステップでこの核酸を捕捉し、検出することができることを、この実施例では示す。

実験を、HLA-DRオリゴ検出キット(参照33202、bioMerieux)内に存在する一部の試薬を用いて実施し、比色読み取りによる、マイクロプレートでPCRにより増幅された核酸の検出を可能にする。記載の実験に関連して、その合成は実施例28に記載されているパラ-Bio-EG3-PDAMを、PCRにより調製された核酸と反応させる。DNAを、分子のジアゾメチル基と反応させ、次いで、そのホスフェートの上にグラフトされたビオチンを備えさせる。次いで、ストレプトアビジン分子が吸着したマイクロプレートの上でインキュベーションすることにより、核酸を捕捉し、比色反応によりこれを可視化することができる。検出試薬を使用するが、これも、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と組み合わされたストレプトアビジン分子である。使用条件下に、ペルオキシダーゼは、オルトフェニレンジアミン分子(キットの色1試薬)を分解して、波長492nmで検出することができる化合物にすることができる。

実施例43.1: マイクロプレート上での、PCR由来DNAの捕捉および検出:
実施例5.1に記載されているようなPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水(Sigma)80μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μl(10mMのトリスEDTA、pH8.5)に集める。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRP(S-911、MOLECULAR PROBES,EUGENE,OR,USA)を添加したPEG緩衝液180μl(0.1MのNaPO₃;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;サケ精液DNA(Gibco)0.14mg/ml;2%PEG4000)で希釈する。次いで、この試料100μlを、ストレプトアビジン被覆Combiplate8(参照95029263、Labsystem,Helsinki,Finland)のウェル中で、またはMaxisorb strip(Nunc,Denmark)からの対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。

実施例43.2: 対照の調製:
対照を、次の方法で同時に調製する:
A- DNAを伴わない標識対照:
パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水90μlを、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、実施例43.1で前記した手順と同様に処理する。

B- マーカーを伴わない標識対照:
実施例5.1の記載と同様にPCR増幅により得られたDNA10μlを、精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションする。次いで、反応混合物を、実施例43.1で前記した手順と同様に処理する。

次いで、全てのストリップをPBSツイーン緩衝液100μl(キットの色0 HLA試薬、PBS pH7.0;1%ツイーン、BND0.2g/l;シプロフラキサシン0.01g/l)で3回洗浄し、色素性試薬100μl(1色1錠、オルトフェニレンジアミン塩酸塩、色2緩衝液5mlで希釈、100mMのリン酸ナトリウム、50mMのクエン酸、0.03%H₂O₂)を加えることにより、ストレプトアビジンHRPの存在を可視化し、暗所で20分間インキュベーションし、次いで、反応を、H₂SO₄50μl(1.8Nの色3試薬)でブロックする。次いで、反応媒体の吸収を、492nmで測定する。

結果:

したがって、表31に示されているようにこの実験から、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識されたDNAは、マイクロプレートウェル中での単一ステップで捕捉および検出することができることが分かる。反応対照が示すように、生じるシグナルは、DNAによるだけで、マイクロプレートの壁、またはストレプトアビジン、あるいは非標識DNAまたはマイクロプレートのプラスチックとのストレプトアビジンHRPの非特異的反応への、核酸の非特異的吸着から生じているのではない。

マイクロプレートタイプの固体支持体上での捕捉および検出を可能にする、PCR産物の二重標識:
1ステップで、ジアゾメチル官能基を有する2種の分子でDNA分子を標識し、これをマイクロプレート上で捕捉および検出することができることを、この実施例では示す。

実験を、HLA-DRオリゴ検出キット内に存在する一部の試薬を用いて実施し、簡単な比色読み取りによる、マイクロプレートでPCRにより増幅された核酸の検出を可能にする。記載の実験に関連して、
1-ピレニルジアゾメタン(PDAM)および
パラ-Bio-EG3-PDAM
は、PCRにより生じた核酸と同時に反応する。

DNAが、2種の化合物の上に存在するジアゾメチル官能基と反応する場合、抗ピレン抗体を担持する支持体と結合することができ、さらに、ホースラディッシュペルオキシダーゼと組み合わされたストレプトアビジン分子でこれを可視化することができる。この酵素は、顕色化試薬として作用するオルト-フェニレンジアミンの分子を分解して、波長492nmで検出することができる化合物にする。

実施例44.1: マイクロプレートでのDNAの二重標識および検出
重炭酸緩衝液100μl(0.05M pH9.6)中で希釈されたpf抗ピレン抗体1.1μlの溶液100μlを、室温で一晩インキュベーションすることにより、抗ピレン抗体を、8ウェルMaxisorpストリップの上に吸着させた。ウサギ抗ピレンと称されるこのような抗体(参照: YSRT-AHP236)は、Accurate Chemical & Scientific (Westbury, New York, United States of America)から入手することができる。勿論、これを、他の市販の抗体を用いて実施することもできるであろうし、この実施例で得られる結果と比較して異なる結果も生じないであろう。

次いで、精製水(Sigma)40μl、パラ-Bio-EG3-PDAM10μl、PDAM2μl(P-1405、1-ピレニルジアゾメタン、Molecular Probes, Eugene, OR, USA)およびDMSO38μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより、実施例5.1に記載されているようなPCR増幅により得られたDNA10μlを標識した。

標識の後に、DNAを、QIAquickキット(Qiagen)を使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μl(10mMのトリスEDTA、pH8.5)に集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRP(S-911、MOLECULAR PROBES,EUGENE,OR,USA)を添加したPEG緩衝液180μl(0.1MのNaPO₃;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;サケ精液DNA(Gibco)0.14mg/ml;2%PEG4000)で希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションした。

実施例44.2: 対照の調製:
次の方法で、対照を同時に調製した:
A- パラ-Bio-EG3-PDAMのみで標識するための対照:
実施例5.1の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM10μlを添加した精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。

B- PDAMのみで標識するための対照:
実施例5.1の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、PDAM2μlおよびDMSO38μlを添加した精製水90μl中、60℃で30分間インキュベーションすることにより標識する。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。

C- 標識を伴わない対照:
実施例5.1の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、精製水100μl中、60℃で30分間インキュベーションする。標識の後に、DNAを、QIAquickキットを使用して精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlに集めた。この溶離液20μlを、1/10000希釈されたストレプトアビジンHRPを添加したPEG緩衝液180μlで希釈する。次いで、この試料100μlを、吸着Maxisorpストリップウェル中で、または非吸着対照ウェル中で、37℃で1時間インキュベーションする。

次いで、ストリップを、PBSツイーン緩衝液100μl(色0)で3回洗浄し、色素性試薬100μl(色2)を加えることにより、ストレプトアビジンHRPの存在を可視化し、暗所で20分間インキュベーションし、次いで、反応を、H₂SO₄50μl(色3)でブロックする。次いで、反応媒体の吸収を、492nmで測定する。

結果:

表32の結果から、多くのシグナルが、抗ピレン抗体によるウェル中でのDNAの捕捉、さらに、結合したストレプトアビジンHRPでの同時標識により生じていることがはっきりと分かる。対照にシグナルが存在しないことが示しているように、この検出は、標識DNAに特異的で、プラスチックへのDNAまたはストレプトアビジンHRPの非特異的吸着あるいは捕捉DNAへの酵素の非特異的結合によるものではない。したがってこの実施例により、単一ステップでDNAの二重標識を実施することができ、この二重結合を、同時に捕捉および検出のために使用することができることが分かる。

相補的核酸プローブによる捕捉および検出を同時に可能にするPCR生成物の標識:
この実験により、DNAを特異的に検出することができ、DNAのホスフェート基に対するジアゾメチル官能基の反応性を用いて、前記のDNAは固体表面の上で捕捉されることを証明することができる。

実験を、HLA-DRオリゴ検出キット(参照33202、bioMerieux、France)内に存在する一部の試薬を用いて実施し、比色読み取りによる、マイクロプレートでPCRにより増幅された核酸の検出を可能にする。記載の実験に関連して、パラ-Bio-EG3-PDAMを、PCRにより調製された核酸と反応させる。DNAを、分子のジアゾメチル基と反応させ、次いで、そのホスフェートの上にグラフトされるビオチンを備えさせる。次いで、ストレプトアビジン分子が吸着するマイクロプレートの上でインキュベーションすることにより、核酸を捕捉し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と組み合わされた捕捉配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるプローブによりこれを可視化することができるが、その際、この酵素が、オルトフェニレンジアミン(キットの色1試薬)を分解して、波長492nmで検出することができる化合物にすることができる。

実施例45.1: マイクロプレート上でのDNAの捕捉および特異的検出:
PCR増幅により得られたDNA10μlの標識を、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に60℃で30分間インキュベーションすることにより重複して実施する。標識の後に、DNAを、メーカーが推奨するプロトコルに従いQIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μl(10mMのトリス-HCl、pH8.5)に集める。これらの溶離液からなる混合物85μlを、試薬R4(2NのNaOH)8.5μlを用いて室温で5分間変性し、次いで、溶液を、試薬R5(2Nの酢酸)8.5μlで中和する。ハイブリダイゼーション緩衝液850μl(R6-10mMのトリス-HCl、pH7.0、BND0.2g/l、シプロフラキサシン0.01g/l)および検出オリゴヌクレオチド85μl(R7-4mMのリン酸ナトリウム、1mMのリン酸カリウム、pH7.0、ウシ血清アルブミン0.1%、フェノール0.5%)を混合物に加える。この試薬100μlを、キットに備えられたストリップR1の陽性対照(増幅遺伝子のコンセンサス配列による捕捉)の上に、またはストレプトアビジン被覆Combiplate8プレートの上に(参照95029263、Labsystem,Helsinki,Finland)の上に、または対照Maxisorpプレート(Nunc,Denmark)の上に堆積させる。

平行して、同じハイブリダイゼーション反応を、DNA試料の10倍および100倍希釈で、EB緩衝液中で実施して、技術の感度を試験する。

実施例45.2: 対照の調製:
対照を、次の方法で同時に調製した:
A- HLA-DRキットとの比較:
実施例5.1の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。標識の後に、DNAを、QIAquickカラムで精製し、最終溶離液を、EB緩衝液50μlの容量で集める。この溶離液45μlを、試薬R4 4.5μlを用いて室温で5分間変性し、溶液を、試薬R5 4.5μlで中和する。ハイブリダイゼーション緩衝液R6 450μlおよび検出オリゴヌクレオチド45μlを混合物に加える。この試料100μlを、キット(増幅遺伝子のコンセンサス配列とハイブリダイゼーション)に備えられたストリップR1の陽性対照の上に、またはストレプトアビジンCombiplate8プレートの上に、または対照Maxisorpプレートの上に堆積させる。

B- 特異的プローブにハイブリダイゼーションしないDNAで行われるハイブリダイゼーション:
実施例5.1の記載のようにPCR増幅により得られたDNA10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlと共に、60℃で30分間インキュベーションする。次いでサンプルを、実施例Aで前記した手順と同様に処理する。

C- DNAを伴わない対照:
試薬R6(ハイブリダイゼーション緩衝液)10μlおよび試薬R7(検出オリゴヌクレオチド)100μlを、キットに備えられたストリップR1の陽性対照の上に、またはストレプトアビジンプレートの上に、またはMaxisorpタイプの対照プレートの上に堆積させる。

前記のプロトコルの全てのストリップを、37℃で1.5時間インキュベーションし、次いで、PBSツイーン緩衝液100μl(色0 HLA試薬)で3回洗浄し、色素性試薬100μl(色2試薬、PBS pH7.0;1%ツイーン、BND0.2g/l;シプロフラキサシン0.01g/l)を加えることにより、特異的検出プローブの存在を可視化し、暗所で20分間インキュベーションし、次いで、反応を、H₂SO₄50μl(1.8Nの色3試薬)でブロックする。次いで、反応媒体の吸収を、492nmで測定する。

結果:

表33の結果は、ターゲットの優れた増幅を示しており、これにより、診断状況での使用を考えることができる。この実施例から、ホスフェート基での標識により、DNAの捕捉が可能であり、さらに、特異的ハイブリダイゼーションは妨害されないことが分かる。

細菌溶解産物から得られ、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識されたDNAの捕捉および増幅:
この実施例により、核酸のホスフェートに対するジアゾメチル官能基の反応性に基づく、捕捉を使用して細菌DNAを捕捉および増幅することができることが分かる。

この場合、細菌溶解産物に含まれ、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識された核酸を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの上で捕捉する。磁気ビーズを使用することにより、反応媒体中に存在する細胞残留物を除去することを目的とする後続の洗浄の間に、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識された核酸を、磁化により固定化することができ、この際、これらの残留物は除去することが必要である。これらは、後で行われるPCR増幅を阻害しうるためである。

増幅産物を、DNAチップに通過させることにより分析することができた。

結核菌培養液に含まれる細胞を溶解することにより、細菌DNAを得る。機械的な溶解により、溶解を行う。正確には、超音波処理で実施し、処理されるサンプルは、ガラスビーズを含む。このような方法は既に本出願人により、ビーズに関する特許出願WO-A第99/15621号に、超音波処理に関する特許出願WO-A第00/60049号に記載されている。超音波処理は、液浴を使用して実施することもできる。

しかしながら、特許US-A第5902746号および特許出願WO-A第98/54306号およびWO-A第00/05338号などの当分野の技術者に知られている他の技術を使用することもできる。これらの工業所有権は全て、本出願人に属する。

メーカーが記載したプロトコルに従い、1μl当たり10⁷コピーの濃度で、細菌DNAをPicogreen(P-7589;Molecular Probes,Eugene,OR,USA)により定量した。

溶解産物10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlの存在下に、60℃で30分間インキュベーションする。平行して、溶解産物10μlを、精製水(Sigma)20μl中、同じ条件でインキュベーションする。

次いで、QIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で、反応媒体を精製する。使用される精製プロトコルは、メーカーが推奨するものである。最終溶離容量は、50μlである。

次いで、次のプロトコルに従い調製されたDynal磁気ビーズ(Dynabeads M-280ストレプトアビジン; 参照 112.05; Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)で、標識されたDNA断片を捕捉する:
Dynalビーズ90μlを、Free精製水(Sigma)200μlで2回洗浄し、PEG緩衝液200μl(0.1MのNaPO₄、pH7;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;ニシン精液DNA(参照15634-017, GibcoBRL)0.14ml;2%PEG4000)に入れ、37℃で30分間インキュベーションする。次いでこれを、ツイーン20 0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで2回洗浄し、最後に、同じ緩衝液90μlに入れる。

標識または非標識DNA溶離液10μlを、PEG緩衝液40μlおよび前記の磁気ビーズ試料2.5μlと共に室温で5分間インキュベーションする。

次いで、ビーズを、ツイーン0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで3回洗浄し、水200μlに入れ、60℃で20分間インキュベーションし、次いで再び、PBS Tween200μlで4回洗浄する。最後に、ビーズを水25μlに入れ、実施例5.1に記載のプロトコルに従いPCRを実施する。一方は精製水25μlを、他方はビーズ2.5μlを用いて調製された2種の反応対照を行い、生体サンプルとして同じ条件下に洗浄し、水25μlに入れる。

結果:
次いで、メーカーにより記載されたプロトコルに従い、Picogreen(P-7589;Molecular Probes,Eugene,OR,USA)により、PCR産物を定量する。この方法は、DNA分子の内部に位置する時だけ(塩基の間にインターカレーションされることにより)、蛍光になるという特徴を有する分子(Picogreen)を使用することに基づく。このインターカレーションの非常に特異的な特性により、さらに、生じる蛍光シグナルが、媒体中に存在するDNAの量と正比例するので、サンプル中に存在する核酸の濃度を非常に正確にアッセイすることができる。次いで、シグナルをrfuで表現する(相対蛍光単位)。

ゲルでのPCRの結果を分析することにより、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識されたゲノムDNAから調製されたサンプルで、予測された規模で、シグナル特異的バンドが存在することが分かる。非標識ゲノムDNAを使用してPCRを実施した場合には、このバンドは検出されない。PicogreenでのDNAの定量により、ビーズ上に捕捉されたゲノムDNAからのDNA産生を確認することができる。

実施例8に記載のプロトコルに従い、DNAチップを分析することにより、下記の表35に示すように増幅の特異性を確認することができる。

この実施例から、生体サンプルを調製して、このサンプルが含有する核酸を、ホスフェート基へのジアゾメチル官能基の反応性をベースとする技術を使用して増幅することができることが分かる。

固体支持体の上に捕捉された細菌DNAからの2種の遺伝子の連続増幅:
この実施例から、ホスフェート基へのジアゾメチル官能基の反応性により、捕捉されたDNAを複数回、別のターゲットで増幅することができることが分かる。

この場合には、細菌溶解産物に含まれ、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識された核酸を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズで捕捉する。磁気ビーズを使用することにより、反応媒体中に存在する細胞残留物を除去することを目的とする後続の洗浄の間に、磁化によりパラ-Bio-EG3-PDAMで標識された核酸を維持することができ、その際、これらの残留物は除去することが必要である。それというのも、これらは、後で行われるPCR増幅を阻害しうるためである。これらの増幅を、それぞれ16SおよびrpoBと称される、ゲノムDNA中に存在する2種の異なる遺伝子で行う。次いで、これら2種の遺伝子をDNAチップを使用して分析する。

実施例46に既に記載のプロトコルに従い、結核菌培養液に含まれる細胞を溶解することにより、細菌DNAを得る。メーカーが記載したプロトコルに従い、1μl当たり10⁷コピーの濃度で、細菌DNAをPicogreenにより定量した。

溶解産物10μlを、パラ-Bio-EG3-PDAM20μlの存在下に、60℃で30分間インキュベーションする。平行して、溶解産物10μlを、精製水(Sigma)20μl中、同じ条件でインキュベーションする。

次いで、QIAquickカラム(Nucleotide Removal Kit, Qiagen, Hilden, Germany)で、反応媒体を精製する。使用される精製プロトコルは、メーカーが推奨するものである。最終溶離容量は、50μlである。

次いで、次のプロトコルに従い調製されたDynal磁気ビーズで、標識されたDNA断片を捕捉する:
Dynalビーズ90μlを、Free精製水(Sigma)200μlで2回洗浄し、PEG緩衝液200μl(0.1MのNaPO₄、pH7;0.5MのNaCl;0.65%ツイーン20;サケ精液DNA(GibcoBRL)0.14ml;PEG4000 2%)に入れ、37℃で30分間インキュベーションする。次いでこれを、ツイーン20 0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで2回洗浄し、最後に、同じ緩衝液90μlに入れる。

標識または非標識DNA溶離液10μlを、PEG緩衝液40μlおよび前記の磁気ビーズ試料2.5μlと共に室温で5分間インキュベーションする。

次いで、ビーズをツイーン0.5%を含有する1×PBS緩衝液200μlで3回洗浄し、水200μlに入れ、60℃で20分間インキュベーションし、次いで再び、PBS Tween200μlで4回洗浄する。最後に、ビーズを水25μlに入れ、実施例5.1に記載のプロトコルに従いPCRを実施する。一方は精製水(Sigma)25μlを、他方はビーズ2.5μlを用いて調製された2種の反応対照を行い、生体サンプルとして同じ条件下に洗浄し、水25μlに入れる。

増幅の後に、反応媒体を集め、ビーズを分離し、ツイーン0.5%を含有する1×PBS150μlで洗浄し、次いで、精製水(Sigma)25μlに再懸濁する。他方の増幅をビーズ上で行うが、その際、rpoB遺伝子を増幅することを目的とするプライマーが存在する。

非捕捉ゲノムDNAを使用して行われる対照増幅を、2つの増幅系(rpoBおよび16S)と平行して行う。

結果:
次いで、実施例8に記載のプロトコルに従い、得られたPCR産物を、DNAチップを使用して分析する。

ゲルでのPCRの結果を分析すると、パラ-Bio-EG3-PDAMで標識されたゲノムDNAから調製されたサンプル中に、予測された規模で単一の特異的バンドが存在することが分かる。非標識ゲノムDNAを使用してPCRを実施した場合には、このバンドは検出されない。

前記の表36に示されているように、DNAチップを使用する分析により、2つの連続する増幅の特異性、したがって、固体支持体の上に固定化されたDNAからの複数の遺伝子の連続増幅を実施する可能性を確認することができ、この可能性により、核酸増幅の感度および効率を往々にしてかなり低下させる複雑な系の展開を回避することができる。

ジアゾメチル基を担持するナイロン膜上でのDNAの捕捉および増幅:
PCRにより増幅する目的で、ジアゾメチル基を担持するように活性化されたナイロン膜を使用して、細菌DNAを捕捉する。

実施例48.1: Biodyne Cフィルターの修飾:

化合物68:
3'-アミノアセトフェノン(14.5g、107mmol)を、無水DMF50mlに溶かす。無水コハク酸(10.7g、107mmol)を加え、混合物をアルゴン下、室温で攪拌し続ける。6時間後、溶液を真空濃縮し、メタノール50mlを加える。得られた沈殿物を濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄する。こうして、生成物68 19.4g(81%)が、オフホワイト色の粉末の形で得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.5-2.6 (m, 7H); 7.45 (t, 1H); 7.64 (d, 1H); 7.83 (d, 1H); 8.19 (s, 1H); 10.16 (s, 1H); 12.12 (s, 1H)。

化合物69:
化合物68 5.07g(22mmol)を、アルゴン下に無水DMF10mlに溶かす。溶液を、氷の上に置き、カルボニルジイミダゾール5.00g(32mmol)を加える。20分後に、4,7,10-トリオキサトリデカンジアミン(EG₃)20ml(94.6mmol)を徐々に加える。室温で3時間反応させた後に、DMFを蒸発させ、残留物をCH₂Cl₂100ml中に入れる。飽和NaHCO₃およびH₂Oを使用して、抽出を実施し、その後、有機相を無水Na₂SO₄を用いて乾燥させ、溶剤を蒸発させる。こうして、生成物69 4.34g(46%)が得られる。
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ = 1.59 (m, 2H); 1.87 (m, 2H); 2.16 (s, 3H); 2.40 (m, 2H); 2.55 (m, 2H); 3.08 (m, 2H); 3.45 (m, 16H); 7.30 (t, 1H); 7.42 (d, 1H); 7.70 (d, 1H); 7.83 (t, 1H); 7.97 (s, 1H); 10.00 (s, 1H)。

化合物91:
4cm²長方形を、Biodyne Cフィルター(参照 60314; Pall Gelman Laboratory; Ann Arbor; Michigan; USA)から切り出し、ボトルに装入し、氷の上、アルゴン下で、激しく攪拌しながら、無水DMF3ml中のカルボニルジイミダゾール(CDI)0.97g(6mmol)と接触させる。20分間攪拌した後に、溶液を除去し、フィルターをDMFで洗浄する。次いで、無水DMF3ml中の生成物68 0.53g(1mmol)量を加え、室温で一晩反応させる。次いで、溶液を除去し、エタノールでフィルターをすすぎ、真空下に乾燥させ、アルゴン下に保持する。

化合物92:
修飾されたフィルター91を、ヒドラジン水和物(2mmol)97mlの無水エタノール4ml溶液に入れる。溶液を5時間再還流させる。放置して冷却した後に、H₂O、エタノールおよびエーテルでフィルターを洗浄し、真空下に乾燥させ、アルゴン下に置く。次いで、無水DMF4mlおよびMnO₂86mg(1mmol)を加え、激しく攪拌しながら、混合物を反応させる。20分後に、溶液を捨てて、DMFおよびエーテルでフィルターをすすぐ。ジアゾメチル修飾されたフィルター92をアルゴン下に、温度-19から-31℃で貯蔵する。

実施例48.2: 生体試験:
活性化された膜を、2mm²の小さい断片に切り、これを、実施例46においてと同様の技術および同じ最終濃度を使用して、機械的溶解により調製された結核菌細菌溶解産物25μlおよび精製水(Sigma)375μl中、室温で30分間インキュベーションする。

次いで、膜を65℃で60分間、洗浄緩衝液100ml(ホルムアミド(Sigma)5%、1×SSPE(Perbio)、Triton X-100 0.01%)中に入れて、膜の上に吸着した非特異的核酸を除去し、次いで、後者を、増幅の前に精製水1ml中で貯蔵する。

パラグラフ5.1に記載のようにPCRを実施するが、その際、十分な量の精製水を用いて、反応容量を調節する。

平行して、核酸と共有結合しえない膜を用いて、同じ手順に従い対照を調製する:
非修飾Biodyne C膜(膜A)、
記載の手順に従い化学的に修飾されているが、無水DMFおよびMnO₂では処理されていないBiodyne膜;この対照により、ジアゾメチル基の不在下での膜の特性を確認することができる(膜B)および
修飾されていないが、激しく攪拌しながら、無水DMFおよびMnO₂で20分間処理されているBiodyne C膜;この対照により、後者の膜が、膜に対するDNAの吸着を修飾しないことを確認することができる(膜C)。

膜の処理により生じるPCRの阻害が存在しないことをチェックするために、膜A、BおよびCの他の断片を同時に、細菌溶解産物25μlで増幅する(管A'、B'およびC')。

次いで、PCR産物を、メーカーにより記載されたプロトコルに従い、Picogreenを用いて定量する。

結果:

表37のこれらの結果から、ジアゾメチル化学により、溶解産物から得られた核酸を、固体支持体の上で共有的に捕捉することができることが分かる。観察された増幅は、膜へのDNAの非特異的吸着によるものではない。他方、PCRで行われた対照により、膜は、増幅反応を阻害しないことが観察される。

膜の上で増幅された生成物の性質をチェックするために、前記のプロトコルに従い、DNAチップに通過させることにより、増幅産物を分析した。

本発明で使用される様々な試薬の構造式、さらにこれらを設計するための略図である(o-は、オルトを、m-は、メタを、p-は、パラを示す)。 図2Aから2Iは、実施例6.1によるウリジン3'-一リン酸(3'-UMP)へのジアゾメチル官能基を担持する様々な試薬の共有結合の、キャピラリー電気泳動により分析された時間を関数とするプロファイルを示す図である: 図2Aでは、PDAM、 図2Bでは、1リットル当たり(mM)2mmolのDPDAM、 図2Cでは、20mMでのDPDAM、 図2Dでは、PMDAM、 図2Eでは、NPDAM、 図2Fでは、BioDPDAM、 図2Gでは、メタ-BioPMDAM、 図2Hでは、パラ-BioPMDAM、 図2Iでは、オルト-BioPMDAM。 図2Aから2Iは、実施例6.1によるウリジン3'-一リン酸(3'-UMP)へのジアゾメチル官能基を担持する様々な試薬の共有結合の、キャピラリー電気泳動により分析された時間を関数とするプロファイルを示す図である: 図2Eでは、NPDAM、 図2Fでは、BioDPDAM、 図2Gでは、メタ-BioPMDAM。 図2Aから2Iは、実施例6.1によるウリジン3'-一リン酸(3'-UMP)へのジアゾメチル官能基を担持する様々な試薬の共有結合の、キャピラリー電気泳動により分析された時間を関数とするプロファイルを示す図である: 図2Hでは、パラ-BioPMDAM、 図2Iでは、オルト-BioPMDAM。 図3Aから3Dは、実施例6.2による4種のヌクレオチド3'一リン酸とのメタBioPMDAMの反応の、キャピラリー電気泳動により分析された時間を関数とするプロファイルを示す図である: 図3Aでは、リボヌクレオチドシリーズ中の3'-CMP、 図3Bでは、リボヌクレオチドシリーズ中の3'-AMP、 図3Cでは、リボヌクレオチドシリーズ中の3'-GMP、 図3Dでは、デオキシリボヌクレオチドシリーズ中の3'-TMP。 実施例6.3によるジヌクレオチド5'-ApUpとのメタBioPMDAMの反応の、キャピラリー電気泳動により分析された時間を関数とするプロファイルを示す図である。 図5Aから5Dは、実施例6.4によるメタBioPMDAM試薬と4種のリボヌクレオチド3'-一リン酸との様々な複合体のD₂OでのプロトンNMRスペクトルを示す図である: 図5Aでは、3'-GMP、 図5Bでは、3'-AMP。 図5Aから5Dは、実施例6.4によるメタBioPMDAM試薬と4種のリボヌクレオチド3'-一リン酸との様々な複合体のD₂OでのプロトンNMRスペクトルを示す図である: 図5Cでは、3'-CMP、 図5Dでは、3'-UMP。 シグナルを化学増幅するために2個のビオチンを担持する標識試薬を合成するためのスキームを示す図である。 非塩基性部位を生成することによる酸性媒体中での断片化機構を示す図である。 実施例16.1による、様々な修飾ヌクレオシド(8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン(8-BrdA)および5-ブロモ-2'-デオキシシチジン(5-BrdC)さらに、4種の天然ヌクレオシド(dA、dC、dGおよびdT)の酸性pHでの分解の速度を示す図である。分での反応時間(x軸)に関する、出発ヌクレオシドの加水分解パーセンテージの形(y軸)で、結果は示されている。 実施例19.2による、合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)5'-リン酸上のPDAMを用いる、温度60℃での時間を関数とする標識の速度を示す図である。結果は、分(min)で示される反応時間に関する、標識パーセンテージの形(x軸)で示されている。 実施例19.3による、反応温度を関数とする標識パーセンテージを示す図である。結果は、y軸に標識パーセンテージ、x軸に℃の反応温度を伴う図10に示されている。 市販の試薬5-ニトロバニリンを使用する、式(4')の試薬を合成するための経路を示す図である。アルデヒド官能基を用いて、ヒドラゾンを生成し、次いで、MnO₂でヒドラゾンを酸化させることにより、ジアゾメチル官能基を得ることができる。

Claims (1)

1. 式(0)の温度安定性標識試薬:
   

   

   [上式中、
   R¹は、Hまたはアルキル、アリールまたは置換アリール基を表し、
   R²は、検出可能なマーカーまたは少なくとも1個の多量体構造により相互に連結している少なくとも2個の検出可能なマーカーを表し、
   Lは、線状に連続する少なくとも2個の共有結合を含む連結アームを表し、nは、0または1に等しい整数であり、
   R³およびR⁴は相互に独立に: H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COORを表し、ここで、R=アルキルまたはアリールであり、
   Aは、ジアゾ官能基と芳香環との共役を可能にする少なくとも1個の共有二重結合を含む連結アームであり、uは、0から2の整数、好ましくは0または1に等しく、
   -Y-X-は、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-、-CH₂S-を表す]。

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