DE4023212A1 - Neue fluorophorderivate, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung zur herstellung neuartiger fluoreszenzmarkierter nucleoside, nucleotide und oligonucleotide - Google Patents

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Fluorophorderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur Fluores­ zenzmarkierung von Nucleosiden, Nucleotiden und Oligonucleo­ tiden, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer, insbesondere zur manuellen und automatischen Sequenzanalyse einsetzbar sind.

2. Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bisherige Verfahren zur chemischen nichtradioaktiven Markie­ rung von Oligonucleotiden mit Fluorophoren erfordern die Ein­ führung spezieller Ankergruppen, die danach mit allgemein be­ kannten reaktiven Derivaten von Fluorophoren im Anschluß an die eigentliche Oligonucleotidsynthese unter kovalenter Bin­ dung des Farbstoffs umgesetzt werden. Zu diesen Ankergruppen gehören Aminogruppen am 5′-Ende des Oligonucleotids (Smith, L.M.; Fung, S.; Hunkapillar, M.W.; Hunkapillar, T.J. und Hood, L.S.; Nucl. Acids Res. 13 (1985) 2399; WO 88/00 201, Smith, L.M.; Fung, S. und Kaiser, R.J.jr.), verschiedene Alkylaminogruppen, die über eine Phosphorsäurediesterbindung (Tanaka, T.; Sakata, T.; Fujimoto, K. und Ikehara, M.; Nucl. Acids Res. 15 (1987) 6209; DE-OS 36 42 939, Sproat,B.) oder die heterocyclische Base (Sarfati, S.R.; Pochet, S.; Cureiro, C.; Nansame, A.; Huynh-Dinh, T. und Igolen, J.; Tetrahedron 43 (1987) 3491) in das Oligonucleotid eingeführt werden. Eine Bindung über Sulfhydrylgruppen ist ebenfalls beschrieben (DE-OS 36 42 939, Sproat, B.).

Eine weitere Variante zur Markierung von Oligonucleotiden oder von natürlicher DNA besteht in der Synthese von fluores­ zierenden Nucleosidtriphosphaten (Prober, J.M.; Trainer, G.L.; Dans, R.J.; Hobbs, F.W.; Robertson, C.W.; Cagursky, R.J.; Cocuzza, A.J.; Jensen, M.A. und Baumeister, C.W.; Science 238 (1987) 336) und deren enzymatischem Einbau an ei­ nem DNA-Templat unter Verwendung eines Oligonucleotid­ primers. Die aufgeführten Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Oligonucleotiden oder von DNA erfordern neben dem Aufwand zur Synthese dieser Verbindungen, zusätzliche experimentelle Arbeit zum Einführen der Ankergruppen bzw. zur Darstellung der Spacer bei Kopplung über eine Aminoalkyl-phosphorsäure­ diesterbindung. Die Synthese der fluoreszierenden Nucleosid­ triphosphate für den enzymatischen Einbau erfordert ebenfalls einen erheblichen experimentellen Aufwand. Nachteilig wirkt sich weiterhin aus, daß das zu markierende Oligonucleotid nach der eigentlichen Synthese gelelektrophoretisch aufgerei­ nigt und nach erfolgtem Umsatz mit dem entsprechenden Farb­ stoff nochmals über eine Ausschlußchromatographie von nicht umgesetzten Farbstoff und unmarkiertem Oligonucleotid ge­ trennt werden muß. Das erfordert einen hohen Zeitaufwand.

3. Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide mit geringem Aufwand ohne Nutzung von spezi­ ellen Ankergruppen im Laufe der normalen Oligonucleotidsyn­ these in guter Ausbeute mit Fluorophoren zu markieren.

4. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe neuer Synthesebausteine ein Verfahren zur Herstellung nichtradioak­ tiv markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide zu entwickeln. Die Einführung von neuen Fluorophorderivaten er­ folgt auf einfachem Weg ohne Nutzung zusätzlicher An­ kergruppen oder spezieller Schutzgruppentechniken im Verlauf der Oligonucleotidsynthese.

Es wurde gefunden, daß die neuen Fluorophorderivate der all­ gemeinen Formel I

F-O-(X)_n-R (I)

mit

F = fluoreszierender Farbstoff
X = CH₂
n = 1 bis 18
R = Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit, H-Phosphonat, substituiertes H-Phosphonat, Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat, Phosphoramidat, substituiertes Phosphoramidate

durch Umsetzung von Fluorophoren der allgemeinen Formel II

F-O-(X)_n-YH (II)

mit der für F, X und n erklärten Bedeutung und für Y = O, S oder NH mit üblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- oder H-Phosphonylierungsmitteln erhalten werden und diese neuen Stoffe unter für den Kettenaufbau von Oligonucleotiden üblichen Bedingungen oder mit Nucleosiden bzw. Nucleotiden direkt im manuellen, semiautomatischen und vollautomatischen Syntheseregim zu fluoreszenzmarkierten Nucleosiden, Nucleo­ tiden oder Oligonucleotiden der allgemeinen Formel III

mit der für F, X, n und Y erklärten Bedeutung und für R₁ = 3′- oder 5′-Oligonucleotid bzw. Nucleosid oder Nucleotid um­ gesetzt werden. Diese Verbindungen sind ebenfalls neue Stoffe.

Der fluoreszierende Farbstoff in der Verbindung mit der all­ gemeinen Formel I ist vorzugsweise Fluorescein oder Fluores­ cein-O-hydroxyalkylether mit einem Alkylspacer von 1 bis 18 Methylengruppen, vorzugsweise 1 bis 10 Methylengruppen, ins­ besondere 4 bis 6 Methylengruppen.

Zur Phosphorylierung der Fluorophore wird bevorzugt p-Chlor­ phenyl-phosphorsäureditriazolid, zur Phosphitylierung insbe­ sondere N,N′-Bis-(diisopropylamino)-O-methylphosphin oder zur H-Phosphonylierung vorzugsweise Salicoylchlorphosphit einge­ setzt.

In seiner Struktur entpricht das Farbstoffderivat der allge­ meinen Formel I den in der Oligonucleotidsynthese verwendeten Syntheseintermediaten und ist wie diese Verbindungen analog einfach handhabbar. Beim vorzugsweisen Einsatz des N,N′-Bis­ (diisopropylamino)-O-methylphosphins als R in der Verbindung der allgemeinen Formel I erfolgt die Umsetzung mit dem Oligo­ nucleotid in Gegenwart schwacher Säuren, vorzugsweise Tetra­ zol, in aprotisch polaren Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceto­ nitril.

Soll das neue Fluorophorderivat mit Hilfe des Phosphor­ triesterverfahrens an das Oligonucleotid gebunden werden, setzt man das polymer gebundene bzw. in Lösung befindliche, üblich geschützte Oligonucleotid mit freier 3′- bzw. 5′-Hydroxylgruppe mit der Verbindung der allgemeinen Formel I mit der für F, X und n erklärten Bedeutung und für R = Phos­ phat bzw. substituiertes Phosphat, vorzugsweise Phosphor­ säure-p-chlor (oder o-chlor)phenylester in Gegenwart von Sulfonsäurechloriden oder -azoliden, vorzugsweise Triiso­ propylbenzensulfonsäurechlorid, und nucleophiler Katalysato­ ren, vorzugsweise N-Methylimidazol, in aprotisch polaren Lö­ sungsmitteln, vorzugsweise wasserfreiem Pyridin, um.

Bei Anwendung des H-Phosphonat-Verfahrens wird die Verbindung der allgemeinen Formel I mit der für F, X und n erklärten Be­ deutung und in der für R = Phosphonat bzw. substituiertes Phosphonat steht, mit dem polymer gebundenen bzw. in Lösung befindlichen, üblich geschützten Oligonucleotid mit freier 3′- bzw. 5′-Hydroxylfunktion in Gegenwart von Aktivierungs­ reagentien wie Sulfonsäure- bzw. Carbonsäurechloriden, vor­ zugsweise Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid, in polar aprotischen Lösungsmitteln oder Gemische derer, vorzugsweise ein Gemisch von Pyridin und Acetonitril, umgesetzt.

Im Fall einer automatisierten Synthesestrategie kann der für die normale Nucleosidverlängerung der Oligonucleotidkette verwendete Synthesecyclus genutzt und zur Gewährleistung ei­ ner möglichst quantitativen Markierung beliebig oft wieder­ holt werden.

In der beschriebenen Art und Weise lassen sich erfindungs­ gemäß auch Nucleoside und Nucleotide markieren.

Nach erfolgter Kopplung des Fluorophors an das Nucleosid, Nucleotid oder Oligonucleotid und Ausbildung der Inter­ nucleotidbindung kann das Syntheseprodukt in für unmarkierte Oligonucleotide üblicher Weise aufgearbeitet werden. Dazu werden die alkalilabilen Schutzgruppen durch Behandlung mit Basen, vorzugsweise einer wäßrigen konzentrierten Lösung von Ammoniak, in einem Temperaturbereich von 5-60°C, vorzugs­ weise bei 50°C, im Verlauf von 12-60 h, vorzugsweise im Verlauf von 15 h, abgespalten. Die so erhaltenen markierten Oligonucleotide lassen sich sowohl über eine Gelelektro­ phorese auf Acrylamid als auch durch Hochdruckflüssig­ keitschromatographie aufreinigen und in die für den biologi­ schen Einsatz erforderliche Form bringen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß ausgehend von einem nach üblichen Verfahren synthetisierten Oligonucleotid, ohne zusätzliche Ankergruppen im Kohlen­ hydratteil als auch in der heterocyclischen Base, die Einfüh­ rung von neuen erfindungsgemäßen Fluorophorderivaten direkt im Verlauf der Oligonucleotidsynthese möglich ist. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin durch eine milde Reaktionsführung aus. Die unkomplizierte Wiederhol­ barkeit der Anknüpfung sichert eine quantitative Markierung des Oligonucleotids. Die entstehenden Produkte sind von hoher Reinheit und in hoher Ausbeute erhältlich. Die Bindung zwi­ schen dem Fluorophor und dem Oligonucleotid ist überraschen­ derweise gegenüber milden sauren oder alkalischen Bedingungen stabil und erlaubt somit die Abspaltung von am Oligonucleotid vorhandenen Schutzgruppen ohne Beeinflussung der Bindung des Fluorophors. Die dargestellten Stoffe sind neuartig und kön­ nen als DNA-Sonden oder als Primer in der Gentechnik und der Molekularbiologie, insbesondere bei der Sequenzierung von ge­ netischen Strukturen nach chemisch degradierenden oder dem Kettenabbruchverfahren zum Einsatz gebracht werden.

Die fluorimetrische Bestimmung der erfindungsgemäß markierten Verbindungen kann mit der bisher üblicherweise für fluo­ reszenzmarkierte Verbindungen genutzten Technik erfolgen.

5. Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert wer­ den, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Darstellung des Alkylierungsreagenzes 4-Chlor-1-(4,4-di­ methoxytrityl)butanol-1

2,2 g 4-Chlorbutanol werden in 30 ml absolutem Pyridin gelöst und unter Rühren 7,44 g 4,4′-Dimethoxytritylchlorid zugege­ ben. Die Mischung läßt man 4 h bei Raumtemperatur rühren und stoppt anschließend durch Zugabe von wenig Methanol. Danach wird eingeengt, in Chloroform aufgenommen und mit verdünnter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen. Die or­ ganische Phase trocknet man über Natriumsulfat, engt i.V. ein und codestilliert bis zur Pyridinfreiheit mit Toluen. Man er­ hält 5,9 g Produkt (71% der Theorie) .

Beispiel 2 Darstellung des hydroxyalkylierten Farbstoffes 6-(U-hydroxy­ butyl)-fluorescein-methylester

1 g Fluoresceinmethylester wird in 20 ml absolutem Dimethyl­ formamid gelöst und mit 20 ml absolutem Benzen, 0,52 g K₂CO₃, 0,02 g KI und 1,64 g 4-Chlor-1-(4,4-dimethoxytrityl)butanol in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Die Reaktionsmi­ schung läßt man 20 h am Rückfluß sieden. Nach Abkühlen dampft man zunächst das Benzen und anschließend bei ca. 80°C das Dimethylformamid ab. Der Rückstand wird in Chloroform aufge­ nommen und mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat wird die Lösung unter Rühren und Kühlen mit 1 Masse-% CF₃COOH versetzt. Nach 10 min engt man ein und codestilliert den Rückstand mit Ethanol. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch Chromatographie an Kieselgel (Eluent CHCl₃/CH₃OH : 9/1 v/v; R_F = 0,48). Man er­ hält 0,4 g Produkt (33% der Theorie bezogen auf eingesetzten Fluoresceinmethylester); ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, TMS als in­ nerer Standard): Ü (ppm) 1,72-1,78 (m, 4H), 2,70 (br.s,1H), 3,62 (s, 3H), 3,74 (t, 2H), 4,17 (t, 2H), 6,79;7,76 (br.m, 10H).

Beispiel 3 Darstellung des Phosphoramidites

167 mg F-(CH₂)₄-OH (F = Fluoresceinmethylester) werden in 20 ml absolutem Methylenchlorid gelöst und unter Rühren mit 28 mg Diisopropylammoniumtetrazolid und 0,12 ml Bis-(diiso­ propylamino)methoxyphosphin versetzt. Man läßt die Reaktions­ mischung 1 h bei Raumtemperatur rühren. Danach wird auf 50 ml verdünnt und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat engt man ein und trocknet im Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxyd. Man erhält 200 mg des Produktes (83% der Theorie). Chromatographie an Kieselgel 60 F₂₅₄ (Firma Merck Darmstadt) R_F = 0,65 (Laufmittel CHCl₃/CH₃OH 9/1 v/v).

Beispiel 4 Markierung des Oligonucleotides nach der Phosphoramidit-Me­ thode im automatischen Syntheseregime (Maßstab 1 µmol)

Die Markierung erfolgt im Verlauf der Oligonucleotidsynthese. Dazu wird eine 0,1 m Lösung der im Beispiel 3 hergestellten Verbindung in absolutem Acetonitril je nach Bauart des DNA-Syntheseautomaten an entsprechender Position installiert und der Farbstoff nach angegebenen Synthesezyclus angekoppelt (Beispiel für 1 µmol, trägerfixiertes Oligonucleotid):

Die Schritte 2-6 lassen sich bis zur Vollständigkeit der Re­ aktion beliebig oft wiederholen.

Beispiel 5 Aufarbeitung des markierten Oligonucleotides

Der Träger mit dem fixierten Oligonucleotid wird 60 h bei Raumtemperatur mit konzentriertem Ammoniak versetzt, danach wird zentrifugiert und die überstehende gelbe, stark fluores­ zierende Lösung eingeengt. Die Reinigung des Rohproduktes kann über Gelelektrophorese an Polyacrylamid erfolgen, wobei sich markiertes und nichtmarkiertes Oligonucleotid deutlich im Laufverhalten unterscheiden. Das markierte Oligonucleotid erscheint beim Betrachten des Gels auf einem Transilluminator bei 310 nm als schwach fluoreszierende deutlich sichtbare Bande, die ausgeschnitten werden kann. In für unmarkierte Oligonucleotide üblicher Weise wird das markierte Produkt aus dem Gel eluiert und in den für den biologischen Einsatz er­ forderlichen Zustand gebracht (Entsalzung an RP 18 Kieselgel oder an Sephadex).

Markiertes und unmarkiertes Oligonucleotid unterscheiden sich ferner durch die Retentionszeiten in der Hochdruckflüs­ sigkeitschromatographie und lassen sich darüber trennen.

Beispiel 6 Darstellung des 3-O-β-Hydroxyethyl-fluoresceinmethylesters

1 g (2,9 mmol) Fluoresceinmethylester werden mit 0,968 g (5,8 mmol) Essigsäure-β-brommethylester und 1,3 g Silber(I)-oxid in 50 ml Acetonitril drei Stunden am Rückfluß gekocht. Die Lösung wird nach Abkühlen filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird über Säulenchromatographie an Kieselgel (Eluent Chloroform/Methanol: 98/2; v/v) gereinigt. Vom so erhaltenen 3-O-(Acetyl-β-hydroxyethyl)-fluorescein­ methylester wird die Acetylgruppe mit 10 ml Chlorwasserstoff- Methanol (4 g HCl pro Liter) im Verlauf von 2 h abgespalten. Das Produkt kann wie im Beispiel 3 phosphitiliert werden, je­ doch wird anstelle von F-(CH₂)₄-OH die Verbindung F-(OH₂)₂-OH eingesetzt.

Die Phosphonylierung des Produktes erfolgt wie im Beispiel 2 beschrieben.

Claims (8)

1. Neue Fluorophorderivate, gekennzeichnet durch die allge­ meine Formel I F-O-(X)_n-R (I)mitF = fluoreszierender Farbstoff
X = CH₂
n = 1 bis 18
R = Phosphat, substituiertes Phosphat; Phosphoramidit; substituiertes Phosphoramidit; H-Phosphonat; substituiertes H-Phosphonat; Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat; Phosphoramidat; substituiertes Phosphoramidat.

2. Neue Fluorophorderivate nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der fluoreszierende Farbstoff Fluorescein oder Fluorescein-O-hydroxyalkylether bzw. deren Substitutionsprodukte mit einem Alkylspacer von 1 bis 18 Methylengruppen, vorzugsweise 1 bis 10 Methylengruppen, ins­ besondere 4 bis 6 Methylengruppen ist.

3. Verfahren zur Herstellung der neuen Fluorophorderivate, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophore der allgemeinen Formel II F-O-(X)_n-YH (II)mit der für F, X und n erklärten Bedeutung und für Y = O, S oder NH mit üblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- oder H-Phosphonylierungsmitteln nach bekannten Verfahren zu Verbindungen der allgemeinen For­ mel I umgesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß hydroxyalkylierte Fluorophore eingesetzt werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Phosphorylierung der Fluorophore mit p-Chlorphenylphosphorsäureditriazolid, die Phosphitylie­ rung mit N,N′-Bis-(diisopropylamino)-O-methylphosphin oder N,N′-Bis-(diisopropylamino)-O-cyanoethylphosphin und die H-Phopshonylierung mit Salicoylchlorphosphit vorgenommen werden.

6. Neuartige fluoreszenzmarkierte Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel III mit der für F, X, n und Y erklärten Bedeutung und für R₁ = 3′- oder 5′-Oligonucleotid bzw. Nucleosid oder Nucleotid.

7. Verfahren zur Herstellung der neuartigen fluoreszenzmar­ kierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, da­ durch gekennzeichnet, daß Fluorophorderivate der allge­ meinen Formel I mit der für F, X, n und R erklärten Be­ deutung unter den für den Kettenaufbau von Oligo­ nucleotiden üblichen Bedingungen oder mit Nucleosiden bzw. Nucleotiden direkt zu Verbindungen der allgemeinen Formel III umgesetzt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophor-Phosphortriester, -Phosphoramidite oder -H- Phosphonate eingesetzt werden.