DD295855A5 - Verfahren zur herstellung markierter nucleoside, nucleotide und oligonucleotide unter verwendung von fluoreszenzfarbstoffen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer einsetzbar sind. Erfindungsgemaesz werden die fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide durch Umsetzung herkoemmlich geschuetzter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide in aprotischen Loesungsmitteln wie Pyridin oder Acetonitril, mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein bzw. Fluorescein-O-hydroxyalkylethern mit einem Alkylspacer von 1 bis 6 Mehtylengruppen, und einem Dihalogen-tetraalkyldisiloxan als Linker hergestellt. Die Verbindung zwischen Fluoreszenzfarbstoff und Nucleosid, Nucleotid und Oligonucleotid erfolgt ueber eine substituierte Siloxanbruecke. Die markierten Stoffe sind mit ueblichen Techniken nachweisbar.{nichtradioaktive Markierung; Fluoreszenz; Nucleoside; Nucleotide; Oligonucleotide; Silyllinker; Festphasenmethode; Schutzgruppen; Fluorescein; Fluoresceinmethylester}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer einsetzbar sind.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bisherige Verfahren zur chemischen nichtradioaktiven Markierung von Nucleosides Nucleotiden und Oligonucleotiden erfordern die Einführung spezieller Ankergruppen. Dies können Aminogruppen sein, die relativ aufwendig, entwedor in Form des 2',&'-Didesoxy-5'-aminothymidins (Smith, L.M.; Fung, S.; Hunkapiller, M.W.; Hunkapiller, T.J., und Hood, L.E.; Nucl. Acids Res. 13 [1985] 2399), verschiedener Alkylaminogruppen, die über eine Phosphorsaurediesterbindung (Tanaka, T.; Sakata,T.; Fujimoto, K., und Ikehara, M.; Nucl. Acids Res. 15 [1987] 6209) oder die heterocyclische Base (Sarfati, S. R.; Pochet, S.; Gureiro, C; Nansame, A.; Huynh-Dlnh,T., u.-\d Igolen, J.; Tetrahedron43 [1987] 3491); Prober,Ü.M.; Trainor,G.L.; Dans, R.L.; Hobbs, F. W.; Robertson, C. W.; Cagursky, R. J.; Cocuzza, A. J.; Jensen, M. Α.; Baumeister, K.; Science 238 [1987) 336) in das Oligonucleotid eingeführt werden und Sulfhydrylgruppen (DE-OS 3642939, Sproat, B.) sein.

Nach vollständiger Abspaltung aller Schutzgruppen, wobei Sulfhydrylgruppen spezielle Abspaltungsbedingungen erfordern, werden die aufgereinigten Nucieinsäurederivate in einem zusätzlichen Reaktionsschrict mit einer aktivierten Spezies des Markers umgesetzt (beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat) und wiederum das Substrat vom Reagenz chromatographisch gereinigt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Nucleoside, Nucleotide und Oligonucelotide mit geringem Arbeitsaufwand, ohne Nutzung von Ankergruppen, in guten Ausbeuten mit Fluophoron zu markieren.

Darlogung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung nichtn dioaktiv markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotido zu entwickeln, das die Einführung von Fluophoren auf einfachem Wege ohne Nutzung zusätzlicher Ankergruppen und spezieller Schutzgruppentechniken durch die Verwendung von Linkern gestattet. Erfindungsgemäß werden dio fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotido der allgemeinen Formel I

1 ?3 S ß

FO-(X)_n-O-Si-O-Si-

^s'- {^R5°-V°N

^R2

— Z-, R.O

F = fluoreszierender Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein oder substituiertes Fluorescein,

Ri, Rj, Ra, R4 = Alkyl-, substituiertes Alkyl-, Aryl-, substituiertes Aryl-, Alkoxy-, substituiertes Alkoxy-, Aryloxy- bzw. substituiertes Aryloxy- und bei R5 = a, Re = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R₈ = a, R₅ = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat oder R₅ = R6 — a sowie

B = Heterocyclus mit einem 1"¹UNn- bzw. Pyrimidingrundkörper ist, durch Umsetzung herkömmlich geschützter Nucleoside, Nucleotide oder Oligonucleotide der allgemeinen Formel Il mit der für Rs und R3 genannten Bedeutung,

(R₅)HO

(H)IU) b

in einem aprotischen Lösungsmittel mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein bzw. substituiertes Fluorescein und einem Dihalogendisiloxan als Linker hergestellt, das Reaktionsgemisch nach üblichen Methoden aufgearbeitet und gereinigt sowie die vorhandenen Schutzgruppen in üblicher Weise abgespalten werden. Die Einsatzstoffe kommen vorzugsweise in equimolarem Verhältnis zur Anwendung.

Als Dihalogendisiloxane werden bevorzugt Dichlordisiloxano verwendet. Die Reaktion findet bei Temperaturen zwischen O⁰C und 50°C, insbesondere bei Raumtemperatur statt. Die Reaktionsdauer beträgt 12 h bis 48 h, bevorzugt 20 h bis 24 h.

Als dipolar aprotisches Lösungsmittel wird beispielsweise Pyridin oder Acetonitril verwendet.

Zur vorstehenden Reaktion können Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, die δ'-substituiert als auch 3'-substituiert sind, vorzugsweise 3'-substituierte Pyrimidln- bzw. Purinderivate eingesetzt werden.

Nach vollständiger Reaktion {dünnschichtchromatographische Reaktionskontrolle) wird das Reaktionsgemisch nach üblichen Methoden aufgearbeitet, indem zunächst das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das zurückbleibende Öi zwischen Wasser und Chloroform verteilt wird. Die Chloroformphase wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Eine säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel führt zum Zielprodukt I.

Im Anschluß daran können unter milden alkalischen oder sauren Bedingungen am Nucleosid, Nucleotid oder Oligonucleotid befindliche Schutzgruppen abgespalten werden und die markierten Verbindungen über für Nucleinsäuren typische Verfahren, beispielsweise Gelchromatographie, goreinigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine einfache Möglichkeit zur Einführung von Fluophoren in Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide dar. Es zeichnet sich dadurch aus, daß ausgehend von einem nach üblichen Verfahren synthetisierten Oligonucleotid, ohne Nutzung zusätzlicher Ankergruppen im Kohlenhydrat als auch in der heterocyclischen Base, die Einführung von Fluophoren direkt im Anschluß an die Oligonucleotidsynthese möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine milde Reaktionsführung aus.

Die bei dieser „Eintopfreaktion" entstehenden Produkte sind in hoher Reinheit und mit guten Ausbeuten erhältlich. Die Bindung zwischen Fluophor und Nucleosid, Nucleotid und Oligonucleotid ist stabil gegenüber milden sauren und milden alkalischen Einflüssen und erlaubt die Abspaltung von an Nucleosiden, Nucleotiden und Oligonucleotiden vorhandenen Schutzgruppen. Die dargestellten Stoffe sind neuartig und können als DNA-Sonden oder als Primer in der Gentechnik und Molekularbiologie zum Einsatz kommen.

Die fluorimetrische Bestimmung der erfindungsgemäß markierten Verbindungen kann mit der bisher üblicherweise für fluoreszenzmarkierte Oligonucfeotide genutzte Technik erfolgen.

Ausführungsboisplele

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

253mg (0,73mmol) 3'-O-Benzoylthymidin und 269mg (0,73mmol) Fluoresceinmethylester werden mit Pyridin codestilliert und in 5 ml trockenem Pyridin aufgenommen. Nach Zugabe von 0,231 ml (0,73 mmol) 1,3-DiChIOr-IjI ,3,3-tetraisopropyldisiloxan wird die I ösung 24 h bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels Dü'inschichtchromatographie (Laufmittel: Chloroform/Methanol, 9/1, v/v). Die Reaktionsmischung wird eingeengt und mit Toluen codestilliert. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen, mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, die organische Phase mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es erfolgt die Reinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Chloroform mit steigendem Methanolgehalt) Ausbeute: 336mg (47,6% d. Theorie) S'-O-Benzoyl-ö'-O-e-O-d.i.SiS-tetraisopropyldisilox-I.S-diyD-fluoresceinmethylester-thymidin ¹H-NMR, Massenspektrum

Beispiel

41 mg (0,1 mmol) ß-O-Hydroxyethyl-fluoresceinmethylester und 35mg (0,1 mmol) 3'-0-Benzoylthymidin werden mit Pyridin codestilliert und in 3ml trockenem Pyridin aufgenommen. Nach Zugabe von 0,031 ml (0,1 mmol) 1,3-Dichlor-i,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan wird die Lösung bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Reaktionskontrolle und Aufarbeitung erfolgt wie unter Beispiel I.Ausbeute: 58 mg (58% d. Theorie) 3'-0-Benzoyl-5'-0-6-0-ethoxy-(1,1,3,3-tetraisopropyldisilox-I.S-diyD-fluoresceinmethylester-thymidin

Massenspektrum

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide unter

Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzmarkierten Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide der allgemeinen Formel I

FO -(XL-O —Si — 0—Si —

" I I

^R2 \

F = fluoreszierender Xanthenfarbstoff, vorzugsweise Fluorescein oder substituiertes Fluorescein, X = CH2

η = Obis 6

Rn R2/ R3/ R4 = Alkyl-, substituiertes Alkyl-, Aryl-, substituiertes Aryl-, Alkoxy-, substituiertes Alkoxy-, Aryloxy- bzw. substituiertes Aryloxy- und bei R₅ = a, R₆ = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat,

substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R₆ = a, R₅ = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat,

substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat, oder bei R₆ = a, R₅ = Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphit, substituiertes Phosphit, Phosphonat oder R5 = R₆ = a sowie

B = Hetorocyclus mit einem Purin- bzw. Pyrimidingrundkörper ist, durch Umsetzung herkömmlich geschützter Nucleoside, Nucleotide oder Oligonucleotide der allgemeinen Formel Il mit der für R₅ bzw. R₆ angegebenen Bedeutung, in einem aprotischen Lösungsmittel mit einem fluoreszierenden Xanthenfarbstoff und einem Dihalogendisiloxan als Linker hergestellt werden und die Aufarbeitung und Reinigung sowie Abspaltung der Schutzgruppen nach üblichen Methoden erfolgt.

B
(R

(H)R.O

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleoside, Nucleotide oder
Oligonucleotide sowohl 5'-substituierte als auch 3'-substituierte, vorzugsweise 3'-substituierte
Pyrimidin- bzw. Purinderivate eingesetzt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß als aprotische Lösungsmittel Pyridin oder Acetonitril verwendet werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszierende
Xanthenfarbstoffe vorzugsweise Fluorescein bzw. O-Hydroxyalkylether des Fluoresceins mit einem Alkylspacer von 1 bis 6 Methylengruppen zur Reaktion gebracht werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Silylierungsmittel
bevorzugt Dichlordisiloxane eingesetzt werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei
Temperaturen von 0^cC bis 50⁰C, insbesondere bei Raumtemperatur, und in einem Zeitraum von
12h bis 48h, bevorzugt 20h bis 24h, stattfindet.