JP2787775B2 - 固体支持体上にアンモニアに不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチド類の合成方法 - Google Patents
固体支持体上にアンモニアに不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチド類の合成方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
- C07F9/24—Esteramides
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Description
本発明は一般的に固相支持体上におけるオリゴヌクレ
オチド類の合成方法、より詳しくは合成オリゴヌクレオ
チド類の蛍光染料による標識化方法に関する。
オチド類の合成方法、より詳しくは合成オリゴヌクレオ
チド類の蛍光染料による標識化方法に関する。
合成オリゴヌクレオチド類は、相補的デオキシリボ核
酸（cDNA）及びゲノムDNAライブラリーのスクリーニン
グのためのプローブとして、及びDNAポリメラーゼ及び
逆転写酵素によるDNA合成のためのプライマーとして分
子生物学において広汎な応用を有する。 後者の応用としては、部分的タンパク質配列方法及び
タンパク質生成物のための感受性生物学的アッセイが利
用可能である場合には稀なメッセンジャーRNA（mRNA）
の同定のための技術、例えばガンマーインターフェロン
についてグレイ等（Gray et al,Nature 第295巻、503-
508頁、1982年）、及びジオキシ鎖停止方法によるDNAを
配列するための技術、例えば、スミス等（Smith et al,
Nucleic Acids Research、13巻、2399-2412頁 1985
年；シュライヤー等（Schreier et al,J.Mol.Biol.129
巻、169-172頁、1979年）；及びサンガー等（Sanger et
al,J.Mol.Biol.143巻、161-178頁、1980年）などが挙
げられる。 最近、DNA配列決定方法における改良は複数蛍光ラベ
ルを利用して単一カラムゲル上で自動的に配列決定を行
っている。例えば，スミス等（上掲）及びスミス等、Na
ture、321巻、674-679頁（1986年）。典型的には、蛍光
ラベルはプライマーの造築過程において、その様な方法
において最終工程（或いは一連の工程）において用いら
れるオリゴヌクレオチドプライマーに結合される。現
在、ホスファイト−トリエステル法において、新たに合
成されたオリゴヌクレオチドをその支持体から除去する
前に蛍光ラベルを結合するために三つまでの付加的段階
が必要とされている。先ず第一は、結合剤がヌクレオシ
ドホスホルアミダイトを添加するのに用いられる同一条
件下でオリゴヌクレオチドの５′末端に結合される。第
二に、結合剤が例えば保護基を除去することにより活性
化されて、一級アミンなどの反応性官能基を曝露する。
そして最後に、活性化染料が結合剤上の曝露官能基と反
応させられる。 分光的に分解可能な蛍光標識の組の選択において重要
なクラスの染料であるローダミン染料で結合されたオリ
ゴヌクレオチドを標識しようと試みる場合に更に複雑な
問題が生ずる、例えば、スミス等（上掲）；及びローケ
ン等（loken et al,Cytometry、５巻、152-159頁、1984
年）。オリゴヌクレオチドをその支持体から切断するた
めの主たる試薬は又、ローダミン染料を化学的に劣化さ
せ、それらの蛍光特性を激しく変化させる。この様に、
ローダミン染料が現在の固相合成方法に用いられる場合
には、それらはオリゴヌクレオチドが固相支持体から切
断された後に結合されなければならず、その結果付加的
工程を生じ、総合合成においてより大きな不便を生ず
る。 前記に鑑み、固相DNA合成における直接使用のための
染料−ホスホルアミダイト複合体が利用可能であればラ
ベルを結合するために必要な工程を減ずることにより標
識化プライマー合成の効率を改良させるものと思われ
る。 特に、ローダミン結合に必要とされる手動の液相合成
工程がローダミン染料の化学的完全性及び蛍光特性を保
存する切断試薬の利用可能性により省略することができ
るならば、幾つかのDNA配列決定系がより自動化に則し
たものとなると思われる。
酸（cDNA）及びゲノムDNAライブラリーのスクリーニン
グのためのプローブとして、及びDNAポリメラーゼ及び
逆転写酵素によるDNA合成のためのプライマーとして分
子生物学において広汎な応用を有する。 後者の応用としては、部分的タンパク質配列方法及び
タンパク質生成物のための感受性生物学的アッセイが利
用可能である場合には稀なメッセンジャーRNA（mRNA）
の同定のための技術、例えばガンマーインターフェロン
についてグレイ等（Gray et al,Nature 第295巻、503-
508頁、1982年）、及びジオキシ鎖停止方法によるDNAを
配列するための技術、例えば、スミス等（Smith et al,
Nucleic Acids Research、13巻、2399-2412頁 1985
年；シュライヤー等（Schreier et al,J.Mol.Biol.129
巻、169-172頁、1979年）；及びサンガー等（Sanger et
al,J.Mol.Biol.143巻、161-178頁、1980年）などが挙
げられる。 最近、DNA配列決定方法における改良は複数蛍光ラベ
ルを利用して単一カラムゲル上で自動的に配列決定を行
っている。例えば，スミス等（上掲）及びスミス等、Na
ture、321巻、674-679頁（1986年）。典型的には、蛍光
ラベルはプライマーの造築過程において、その様な方法
において最終工程（或いは一連の工程）において用いら
れるオリゴヌクレオチドプライマーに結合される。現
在、ホスファイト−トリエステル法において、新たに合
成されたオリゴヌクレオチドをその支持体から除去する
前に蛍光ラベルを結合するために三つまでの付加的段階
が必要とされている。先ず第一は、結合剤がヌクレオシ
ドホスホルアミダイトを添加するのに用いられる同一条
件下でオリゴヌクレオチドの５′末端に結合される。第
二に、結合剤が例えば保護基を除去することにより活性
化されて、一級アミンなどの反応性官能基を曝露する。
そして最後に、活性化染料が結合剤上の曝露官能基と反
応させられる。 分光的に分解可能な蛍光標識の組の選択において重要
なクラスの染料であるローダミン染料で結合されたオリ
ゴヌクレオチドを標識しようと試みる場合に更に複雑な
問題が生ずる、例えば、スミス等（上掲）；及びローケ
ン等（loken et al,Cytometry、５巻、152-159頁、1984
年）。オリゴヌクレオチドをその支持体から切断するた
めの主たる試薬は又、ローダミン染料を化学的に劣化さ
せ、それらの蛍光特性を激しく変化させる。この様に、
ローダミン染料が現在の固相合成方法に用いられる場合
には、それらはオリゴヌクレオチドが固相支持体から切
断された後に結合されなければならず、その結果付加的
工程を生じ、総合合成においてより大きな不便を生ず
る。 前記に鑑み、固相DNA合成における直接使用のための
染料−ホスホルアミダイト複合体が利用可能であればラ
ベルを結合するために必要な工程を減ずることにより標
識化プライマー合成の効率を改良させるものと思われ
る。 特に、ローダミン結合に必要とされる手動の液相合成
工程がローダミン染料の化学的完全性及び蛍光特性を保
存する切断試薬の利用可能性により省略することができ
るならば、幾つかのDNA配列決定系がより自動化に則し
たものとなると思われる。
広義に、本発明はアンモニアに不安定な基で標識化さ
れたオリゴヌクレオチド類の合成方法に向けられたもの
である。本発明の一つの重要な側面は、三成分、即ち１
〜３個の炭素原子を有する低級アルキルアルコール，
水、及び３〜６個の炭素原子を有する非求核ヒンダード
アルキルアミンを含んでなる切断試薬により、アンモニ
ア無しに固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の塩基に
不安定な結合基の切断である。好ましくは、この切断試
薬の三つの成分は約1:1:1乃至約1:3:1（容量）の低級ア
ルコール：水：非−求核障害アルキルアミンの比で存在
する。より具体的には、本発明は、固相支持体上でのロ
ーダミン−標識化オリゴヌクレオチド類の合成方法を含
むものである。好ましくは、この後者の方法は合成方法
において、ローダミンホスホルアミダイト類の使用を含
むものである。 好ましくは、非求核ヒンダードアルキルアミンはイソ
プロピルアミン,t−ブチルアミン，ジエチルアミン，ピ
ペリジン,t−アミルアミン，ジイソプロピルアミン及び
ジプロピルアミンから選ばれる。最も好ましくは、非求
核ヒンダードアルキルアミンはｔ−ブチルアミンであ
る。 好ましくは低級アルキルアルコールはメタノール，エ
タノール，及びプロパノールよりなる群から選ばれる。
最も好ましくは、低級アルキルアルコールはメタノール
である。 好ましくは、塩基に不安定な結合基はコハク酸エステ
ルである。最も好ましくは、コハク酸エステルはオリゴ
ヌクレオチドの３′ヒドロキシ基によりオリゴヌクレオ
チドを固相支持体に結合する。 本発明の重要な側面は、オリゴヌクレオチド合成完了
時におけるオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合する
塩基に不安定な結合部分、例えばコハク酸エステルの切
断及び／又は塩基不安定アミノ保護基例えばベンゾイル
の除去である。 本発明のもう一つの重要な側面は上記反応がローダミ
ン劣化なしに行われることにより、固相支持体上におけ
るローダミン標識化オリゴヌクレオチドの完全な合成を
可能にすることである。
れたオリゴヌクレオチド類の合成方法に向けられたもの
である。本発明の一つの重要な側面は、三成分、即ち１
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不安定な結合基の切断である。好ましくは、この切断試
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ーダミン−標識化オリゴヌクレオチド類の合成方法を含
むものである。好ましくは、この後者の方法は合成方法
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むものである。 好ましくは、非求核ヒンダードアルキルアミンはイソ
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核ヒンダードアルキルアミンはｔ−ブチルアミンであ
る。 好ましくは低級アルキルアルコールはメタノール，エ
タノール，及びプロパノールよりなる群から選ばれる。
最も好ましくは、低級アルキルアルコールはメタノール
である。 好ましくは、塩基に不安定な結合基はコハク酸エステ
ルである。最も好ましくは、コハク酸エステルはオリゴ
ヌクレオチドの３′ヒドロキシ基によりオリゴヌクレオ
チドを固相支持体に結合する。 本発明の重要な側面は、オリゴヌクレオチド合成完了
時におけるオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合する
塩基に不安定な結合部分、例えばコハク酸エステルの切
断及び／又は塩基不安定アミノ保護基例えばベンゾイル
の除去である。 本発明のもう一つの重要な側面は上記反応がローダミ
ン劣化なしに行われることにより、固相支持体上におけ
るローダミン標識化オリゴヌクレオチドの完全な合成を
可能にすることである。
本発明は固相支持体上のオリゴヌクレオチド類、特に
ローダミン染料で標識化されたオリゴヌクレオチド類の
合成方法を提供する。この方法の重要な特徴は、（１）
オリゴヌクレオチドを固相支持体間の結合基、通常はコ
ハク酸エステルをオリゴヌクレオチドが固相支持体から
遊離されるように加水分解することができ、（２）オリ
ゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンとアミノ保護
基、通常ベンゾイル或いはイソブチリルとの間の結合を
加水分解することができ、及び（３）オリゴヌクレオチ
ドに結合したローダミン染料の化学構造を変化させない
切断試薬の使用である。 本発明に用いられるローダミン染料は各種結合手段に
よりオリゴヌクレオチドに結合されてよい。例えば、後
で適当な誘導化ローダミン染料と反応させられてよい１
種以上の官能基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化
するためのいくつかの手段が利用可能である。例えば、
オリゴヌクレオチドはアミノ誘導化されてよく、適当な
ローダミン誘導体はイソチオシアネート−Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドなどである。アミノ或いはチオール官能
基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化するための方
法を開示する文献としては、コノリー等（Connolly et
al）、Nucleic Acids Research、13巻、4485-4402頁（1
985）；コノリー、Nucleic Acids Research、15巻、313
1-3139頁（1987）；ルタ（Ruth）、DNA、３巻、123頁
（1984）；ハラランビディス（Haralanbidis et al）、
Nucleic Acids Research、15巻、4857-4876頁（198
7）；スミス（Simith et al）、Nucleic Acids Researc
h、13巻、2399-2412頁（1985）が挙げられる。これらの
文献は茲に準用する。 好ましくは、ローダミン染料はローダミンホスホルア
ミダイトとしてオリゴヌクレオチドと結合される。 固相オリゴヌクレオチド合成についての「切断」とい
う用語は固相支持体にオリゴヌクレオチドを結合させる
結合の破壊を意味する。通常、切断は結合オリゴヌクレ
オチドの３′ヒドロキシルと固相支持体の間のコハク酸
エステル結合の加水分解を含む。 本発明において用いられる「脱保護」という用語はオ
リゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンからの保護
基の除去を意味する。通常、脱保護は環外アミンとアミ
ノ保護基、例えばベンゾイル或いはイソブチリルなどよ
りなるアミド部分の加水分解を含む。文献において、
「脱保護」という用語は切断前のホスフェートジエステ
ルからの保護基の除去を含むより一般的に用いられてい
る場合がある。その様な保護基がメトキシである場合に
は、本発明において用いられる「脱保護」はそれらの除
去を含まない。この場合には、標準的チオフェルノール
含有試薬による追加の処理が必要である。 本発明において用いられる「オリゴヌクレオチド」と
いう用語は、少ないヌクレオチド例えば２〜20乃至多く
のヌクレオチド例えば20〜数百以上を含有するデオキシ
リボヌクレオチド或いはリボヌクレオチドのいづれかの
一本鎖を指す。より詳しくは、この用語は上記範囲の大
きさのデオキシリボヌクレオチドの一本鎖を指す。 本発明において用いられるアルキルアミンについての
「非求核」とは、脱保護時（アルキルアミンの存在下）
にアミド保護基の加水分解が全環外アミン−保護基複合
体が離脱基として作用するアルキルアミンを含む競走的
求核置換反応に対して支配的であって、かくして、ヌク
レオシド塩基を修飾することを意味する。 ローダミン染料については、ローダミン染料の炭素原
子数を示すために、カラー・インデックス（Colour Ind
ex），（Association of Textile Chemist、２版、197
1）付番方法が用いられる。キサンテン様構造における
炭素原子は下記の如くダッシュを付けた番号で示され、
９′−置換フェニルの炭素原子は下記に示される如くダ
ッシュを付けられない数により示される。 好ましくは、本発明において用いられるローダミン染
料は、下記一般式により規定される群から選ばれる。 式中、 Ｚはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いは
スルホネート、及びより好ましくはカルボキシレートで
ある。 Ｒ1及びＲ8は各々水素，ハロゲン,1〜８個の炭素原子
を有するアルキル、１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルエーテル或いは１〜８個の炭素原子を有するアルキル
チオエーテル、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と
共に各々２〜５個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。
好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素,1〜３個の炭素原子
を有するアルキルクロロ或いは１〜３個の炭素原子を有
するアルキルエーテルであり、及びＲ1はＲ2と共に、及
びＲ8はＲ7と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それ
ぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖を形成する。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素
であり、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と共に各
々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素を６′炭素
に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を３′炭素に
結合する窒素に連結するアルキル鎖を形成する。 Ｒ2及びＲ7は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8と共に各
々上記の如く２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖で
ある。好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々１〜３個の炭素原
子を有するアルキルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及び
Ｒ7はＲ8と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それぞ
れ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。最も好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々メチル或
いはエチルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8
と共に、各々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。 Ｒ3及びＲ6は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ル、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々２〜
５個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に
結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素に結
合する窒素に連結するアルキル鎖である。好ましくは、
Ｒ3及びＲ6は各々１〜３個の炭素原子を有するアルキル
であり、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々
２〜３個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭
素に結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素
に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。最も好ま
しくは、Ｒ3及びＲ6は各々メチル或いはエチルであり、
及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々３個の炭
素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に結合する
窒素に連結し、及び４′炭素を３′炭素に結合する窒素
に連結するアルキル鎖である。 Ｒ4及びＲ5はそれぞれ水素、１〜８個の炭素原子を有
するアルキル、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有する
アルキルエーテル，或いは１〜８個の炭素原子を有する
アルキルチオエーテル、及び、Ｒ4はＲ3と共に及びＲ5
はＲ6と共に各々上記２〜５個の炭素原子を有するアル
キル鎖である。好ましくは、Ｒ4及びＲ5は各々水素，ク
ロロ,1〜３個の炭素原子を有するアルキル，或いは１〜
３個の炭素原子を有するアルキルエーテル、及びＲ4は
Ｒ3と共に、及びＲ5はＲ6と共に上記の如く２〜３個の
炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好ましくは、
Ｒ4及びＲ5は各々水素であり、及び、Ｒ4はＲ3と共に、
及びＲ5はＲ6と共に各々３個の炭素原子を有し、それぞ
れ５′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
４′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。 Ｌはその特性がそれが結合する基（本発明において
「相補的官能基」と称する）の性質に応じて異なる結合
基を表わす。結合官能基の具体例を表Ｉにそれらの相補
的官能基及び得られる結合基と共に掲げる。最も好まし
い結合官能基はヒドロキシル相補的官能基と反応させら
れた場合に、次いで酸化されてホスフェートエステル結
合基を与えるホスファイトエステル結合基を形成するホ
スホルアミダイトである。 Ｗ1,W2，及びＷ3は水素或いはクロロ、好ましくは水
素である。 この発明において用いられる「ローダミンＸ」（RO
X）と略記）はＲ1及びＲ2,R3及びＲ4,R5及びＲ6,R7及び
Ｒ8が一緒に上記の如く３個の炭素のアルキル鎖を形成
し、Ｂがカルボキシレートであり、及びＷ1,W2，及びＷ
3が水素であり、及び結合官能基がそれぞれ５−或いは
６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を指す。本発
明において用いられる「テトラメチルローダミン」
（「TMR」と略記）はＲ1,R4,R5,R8,W1,W2，及びＷ3が水
素であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＲ2,R3,R
6及びＲ7がメチルであり、結合官能基がそれぞれ５−或
いは６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を意味し
ている。 幾つかの本発明において用いるローダミン染料は、た
とえばEastman Kodak社（ロチェスター，ニューヨー
ク）、Molecular Probes社（ジャンクション シティ，
オレゴン州）、或いはResearch Organics（クリーブラ
ンド，オハイオ州）により市販されており、その他は米
国特許第2,242,572号、同第2,153,059号、同第3,822,27
0号、同第3,932,415号及び同第4,005,092号各明細書の
教示に従って合成することができ、これらの文献は全て
茲に準用する。 ROX及びTMRは本発明において使用する最も好ましいロ
ーダミン染料である。 ホスファイト−トリエステル、ホスホトリエステル、
及びＨ−ホスホネート化学による固相合成方法の詳細な
説明は広く利用可能である。例えば、イタクラ（Itakur
a,米国特許第4,401,796号明細書）；カルザース等（Car
uthers et al,米国特許第4,458,066号、及び同第4,500,
707号各明細書）；マテウッチ等（Matteucci et al,J.A
mer.Chem.Soc.103巻、3185〜3191頁、1981年）；カルザ
ース等（Caruthers et al,Genetic Engineering:4巻,1
〜17頁（198 年）；ジョーンズ（Jones）第２章、アッ
キンソン等（Atkinson et al）第３章、及びスプロート
等（Sproat et al）第４章、Grait編Oligonucleotide S
ynthesis;A Practical Approach（IRL Press,ワシント
ン,D.C.,1984年）；フレーラー等（Froehler et al,Tet
rahedron letters）27巻、469-472頁、1986）；ガレッ
グ等（Garegg et al、Tetrahedron Letters、27巻、405
1-4054頁及び4955-4058頁、1986）；及びフレーラー等
（Froehler et al,Nucleic Acids Research、14巻、539
9-5407頁、1986）。従って、これらの文献は茲に準用す
る。 好ましくは、本発明は、ホスファイトトリエステル法
によるローダミン−標識化オリゴヌクレオチドの合成を
含むものである。即ち、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トを成長鎖の５′ヒドロキシルと反応させることによ
り、ヌクレオチドを、ヌクレオチドの成長鎖に逐次添加
する。 特に、オリゴヌクレオチドはローダミンホスホルアミ
ダイトを結合するオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
ルと反応させることにより標識化される。 本発明のローダミンホスホルアミダイトは、先ずロー
ダミンの５−或いは６−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
（NHS）エステルをアミノアルコール、例えばエタノー
ルアミン、ヘキサノールアミンなどとN,N−ジメチルホ
ルムアミド（DMF）或いは同様な非プロトン極性溶媒中
で室温において反応させてローダミン染料の５−或いは
６−アルコールアミドを形成し、それを次いで標準手段
により反応液から分離する。このローダミン染料のアル
コールアミドを次いで触媒量のテトラゾール及びジイソ
プロピルアミンを含有するアセトニトリルにおいて室温
で過剰のジ−（N,N−ジイソプロピルアミノ）メトキシ
ホスフィンと反応させてローダミンホスホルアミダイト
を形成し、これを反応液から分離する。 一般的に、切断及び脱保護は本発明の切断試薬によ
り、先ず固相支持体に（塩基に不安定な結合基を介して
結合したオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドが固
相から放出されるように室温で約１〜２時間切断試薬に
曝露し、次いで放出されたオリゴヌクレオチドを含有す
る切断試薬を環外アミンに結合した保護基が除去される
ように約80〜約90℃で約20〜約60分間加熱することによ
り行われる。或いは又、脱保護工程は、より低温で行う
ことができるが、しかし、反応は完結までより長くかか
り、例えば55℃においては加熱は５時間行われる。 切断及び脱保護後、標識化或いは未標識化オリゴヌク
レオチドを標準的操作により精製する。例えば、Applie
d Biosystems Users Bulletin No.13（1987年４月１日
改訂）；ガイト（Gait）のOligonucleotide Synthesis:
A Practical Approach（IRL Press,ワシントン,D.C.,19
84年）の第５章及び第６章。
ローダミン染料で標識化されたオリゴヌクレオチド類の
合成方法を提供する。この方法の重要な特徴は、（１）
オリゴヌクレオチドを固相支持体間の結合基、通常はコ
ハク酸エステルをオリゴヌクレオチドが固相支持体から
遊離されるように加水分解することができ、（２）オリ
ゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンとアミノ保護
基、通常ベンゾイル或いはイソブチリルとの間の結合を
加水分解することができ、及び（３）オリゴヌクレオチ
ドに結合したローダミン染料の化学構造を変化させない
切断試薬の使用である。 本発明に用いられるローダミン染料は各種結合手段に
よりオリゴヌクレオチドに結合されてよい。例えば、後
で適当な誘導化ローダミン染料と反応させられてよい１
種以上の官能基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化
するためのいくつかの手段が利用可能である。例えば、
オリゴヌクレオチドはアミノ誘導化されてよく、適当な
ローダミン誘導体はイソチオシアネート−Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドなどである。アミノ或いはチオール官能
基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化するための方
法を開示する文献としては、コノリー等（Connolly et
al）、Nucleic Acids Research、13巻、4485-4402頁（1
985）；コノリー、Nucleic Acids Research、15巻、313
1-3139頁（1987）；ルタ（Ruth）、DNA、３巻、123頁
（1984）；ハラランビディス（Haralanbidis et al）、
Nucleic Acids Research、15巻、4857-4876頁（198
7）；スミス（Simith et al）、Nucleic Acids Researc
h、13巻、2399-2412頁（1985）が挙げられる。これらの
文献は茲に準用する。 好ましくは、ローダミン染料はローダミンホスホルア
ミダイトとしてオリゴヌクレオチドと結合される。 固相オリゴヌクレオチド合成についての「切断」とい
う用語は固相支持体にオリゴヌクレオチドを結合させる
結合の破壊を意味する。通常、切断は結合オリゴヌクレ
オチドの３′ヒドロキシルと固相支持体の間のコハク酸
エステル結合の加水分解を含む。 本発明において用いられる「脱保護」という用語はオ
リゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンからの保護
基の除去を意味する。通常、脱保護は環外アミンとアミ
ノ保護基、例えばベンゾイル或いはイソブチリルなどよ
りなるアミド部分の加水分解を含む。文献において、
「脱保護」という用語は切断前のホスフェートジエステ
ルからの保護基の除去を含むより一般的に用いられてい
る場合がある。その様な保護基がメトキシである場合に
は、本発明において用いられる「脱保護」はそれらの除
去を含まない。この場合には、標準的チオフェルノール
含有試薬による追加の処理が必要である。 本発明において用いられる「オリゴヌクレオチド」と
いう用語は、少ないヌクレオチド例えば２〜20乃至多く
のヌクレオチド例えば20〜数百以上を含有するデオキシ
リボヌクレオチド或いはリボヌクレオチドのいづれかの
一本鎖を指す。より詳しくは、この用語は上記範囲の大
きさのデオキシリボヌクレオチドの一本鎖を指す。 本発明において用いられるアルキルアミンについての
「非求核」とは、脱保護時（アルキルアミンの存在下）
にアミド保護基の加水分解が全環外アミン−保護基複合
体が離脱基として作用するアルキルアミンを含む競走的
求核置換反応に対して支配的であって、かくして、ヌク
レオシド塩基を修飾することを意味する。 ローダミン染料については、ローダミン染料の炭素原
子数を示すために、カラー・インデックス（Colour Ind
ex），（Association of Textile Chemist、２版、197
1）付番方法が用いられる。キサンテン様構造における
炭素原子は下記の如くダッシュを付けた番号で示され、
９′−置換フェニルの炭素原子は下記に示される如くダ
ッシュを付けられない数により示される。 好ましくは、本発明において用いられるローダミン染
料は、下記一般式により規定される群から選ばれる。 式中、 Ｚはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いは
スルホネート、及びより好ましくはカルボキシレートで
ある。 Ｒ1及びＲ8は各々水素，ハロゲン,1〜８個の炭素原子
を有するアルキル、１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルエーテル或いは１〜８個の炭素原子を有するアルキル
チオエーテル、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と
共に各々２〜５個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。
好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素,1〜３個の炭素原子
を有するアルキルクロロ或いは１〜３個の炭素原子を有
するアルキルエーテルであり、及びＲ1はＲ2と共に、及
びＲ8はＲ7と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それ
ぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖を形成する。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素
であり、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と共に各
々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素を６′炭素
に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を３′炭素に
結合する窒素に連結するアルキル鎖を形成する。 Ｒ2及びＲ7は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8と共に各
々上記の如く２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖で
ある。好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々１〜３個の炭素原
子を有するアルキルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及び
Ｒ7はＲ8と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それぞ
れ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。最も好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々メチル或
いはエチルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8
と共に、各々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。 Ｒ3及びＲ6は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ル、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々２〜
５個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に
結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素に結
合する窒素に連結するアルキル鎖である。好ましくは、
Ｒ3及びＲ6は各々１〜３個の炭素原子を有するアルキル
であり、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々
２〜３個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭
素に結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素
に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。最も好ま
しくは、Ｒ3及びＲ6は各々メチル或いはエチルであり、
及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々３個の炭
素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に結合する
窒素に連結し、及び４′炭素を３′炭素に結合する窒素
に連結するアルキル鎖である。 Ｒ4及びＲ5はそれぞれ水素、１〜８個の炭素原子を有
するアルキル、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有する
アルキルエーテル，或いは１〜８個の炭素原子を有する
アルキルチオエーテル、及び、Ｒ4はＲ3と共に及びＲ5
はＲ6と共に各々上記２〜５個の炭素原子を有するアル
キル鎖である。好ましくは、Ｒ4及びＲ5は各々水素，ク
ロロ,1〜３個の炭素原子を有するアルキル，或いは１〜
３個の炭素原子を有するアルキルエーテル、及びＲ4は
Ｒ3と共に、及びＲ5はＲ6と共に上記の如く２〜３個の
炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好ましくは、
Ｒ4及びＲ5は各々水素であり、及び、Ｒ4はＲ3と共に、
及びＲ5はＲ6と共に各々３個の炭素原子を有し、それぞ
れ５′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
４′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。 Ｌはその特性がそれが結合する基（本発明において
「相補的官能基」と称する）の性質に応じて異なる結合
基を表わす。結合官能基の具体例を表Ｉにそれらの相補
的官能基及び得られる結合基と共に掲げる。最も好まし
い結合官能基はヒドロキシル相補的官能基と反応させら
れた場合に、次いで酸化されてホスフェートエステル結
合基を与えるホスファイトエステル結合基を形成するホ
スホルアミダイトである。 Ｗ1,W2，及びＷ3は水素或いはクロロ、好ましくは水
素である。 この発明において用いられる「ローダミンＸ」（RO
X）と略記）はＲ1及びＲ2,R3及びＲ4,R5及びＲ6,R7及び
Ｒ8が一緒に上記の如く３個の炭素のアルキル鎖を形成
し、Ｂがカルボキシレートであり、及びＷ1,W2，及びＷ
3が水素であり、及び結合官能基がそれぞれ５−或いは
６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を指す。本発
明において用いられる「テトラメチルローダミン」
（「TMR」と略記）はＲ1,R4,R5,R8,W1,W2，及びＷ3が水
素であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＲ2,R3,R
6及びＲ7がメチルであり、結合官能基がそれぞれ５−或
いは６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を意味し
ている。 幾つかの本発明において用いるローダミン染料は、た
とえばEastman Kodak社（ロチェスター，ニューヨー
ク）、Molecular Probes社（ジャンクション シティ，
オレゴン州）、或いはResearch Organics（クリーブラ
ンド，オハイオ州）により市販されており、その他は米
国特許第2,242,572号、同第2,153,059号、同第3,822,27
0号、同第3,932,415号及び同第4,005,092号各明細書の
教示に従って合成することができ、これらの文献は全て
茲に準用する。 ROX及びTMRは本発明において使用する最も好ましいロ
ーダミン染料である。 ホスファイト−トリエステル、ホスホトリエステル、
及びＨ−ホスホネート化学による固相合成方法の詳細な
説明は広く利用可能である。例えば、イタクラ（Itakur
a,米国特許第4,401,796号明細書）；カルザース等（Car
uthers et al,米国特許第4,458,066号、及び同第4,500,
707号各明細書）；マテウッチ等（Matteucci et al,J.A
mer.Chem.Soc.103巻、3185〜3191頁、1981年）；カルザ
ース等（Caruthers et al,Genetic Engineering:4巻,1
〜17頁（198 年）；ジョーンズ（Jones）第２章、アッ
キンソン等（Atkinson et al）第３章、及びスプロート
等（Sproat et al）第４章、Grait編Oligonucleotide S
ynthesis;A Practical Approach（IRL Press,ワシント
ン,D.C.,1984年）；フレーラー等（Froehler et al,Tet
rahedron letters）27巻、469-472頁、1986）；ガレッ
グ等（Garegg et al、Tetrahedron Letters、27巻、405
1-4054頁及び4955-4058頁、1986）；及びフレーラー等
（Froehler et al,Nucleic Acids Research、14巻、539
9-5407頁、1986）。従って、これらの文献は茲に準用す
る。 好ましくは、本発明は、ホスファイトトリエステル法
によるローダミン−標識化オリゴヌクレオチドの合成を
含むものである。即ち、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トを成長鎖の５′ヒドロキシルと反応させることによ
り、ヌクレオチドを、ヌクレオチドの成長鎖に逐次添加
する。 特に、オリゴヌクレオチドはローダミンホスホルアミ
ダイトを結合するオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
ルと反応させることにより標識化される。 本発明のローダミンホスホルアミダイトは、先ずロー
ダミンの５−或いは６−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
（NHS）エステルをアミノアルコール、例えばエタノー
ルアミン、ヘキサノールアミンなどとN,N−ジメチルホ
ルムアミド（DMF）或いは同様な非プロトン極性溶媒中
で室温において反応させてローダミン染料の５−或いは
６−アルコールアミドを形成し、それを次いで標準手段
により反応液から分離する。このローダミン染料のアル
コールアミドを次いで触媒量のテトラゾール及びジイソ
プロピルアミンを含有するアセトニトリルにおいて室温
で過剰のジ−（N,N−ジイソプロピルアミノ）メトキシ
ホスフィンと反応させてローダミンホスホルアミダイト
を形成し、これを反応液から分離する。 一般的に、切断及び脱保護は本発明の切断試薬によ
り、先ず固相支持体に（塩基に不安定な結合基を介して
結合したオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドが固
相から放出されるように室温で約１〜２時間切断試薬に
曝露し、次いで放出されたオリゴヌクレオチドを含有す
る切断試薬を環外アミンに結合した保護基が除去される
ように約80〜約90℃で約20〜約60分間加熱することによ
り行われる。或いは又、脱保護工程は、より低温で行う
ことができるが、しかし、反応は完結までより長くかか
り、例えば55℃においては加熱は５時間行われる。 切断及び脱保護後、標識化或いは未標識化オリゴヌク
レオチドを標準的操作により精製する。例えば、Applie
d Biosystems Users Bulletin No.13（1987年４月１日
改訂）；ガイト（Gait）のOligonucleotide Synthesis:
A Practical Approach（IRL Press,ワシントン,D.C.,19
84年）の第５章及び第６章。
以下の実施例は本発明を説明するのに役立つものであ
る。試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの値
は本発明を例示するのみであり、それを制限するものと
考えられてはならない。 実施例1.アミノアルキルホスホルアミダイト結合剤の調
製 以下に、アミノアルキルホスホルアミトの一般的製造
方法を開示する。大まかに言って、同一の操作がコノリ
ーによりヌクレイック・アシッズ・リサーチ、15巻3131
-3139頁（1987年）〔Connolly,Nucleic Acides Researc
h,Vol.15,pgs.3131〜3139（1987）〕に開示されてい
る。これらの化合物は固相支持体に結合したアミノ誘導
オリゴヌクレオチド類に有用である。本発明において有
用なアミノアルキルホスホルアミダイト類の一群は下記
一般式により定義される。 式中、Ｂ1は固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の
塩基に不安定な結合基を切断することなしに除去するこ
とのできる酸に不安定な或いは塩基に不安定なアミノ保
護基を表わす。その様な基はグリンにより「有機合成に
おける保護基（Protective Groups in Organic Synthes
is）」、（John Wiley ＆ Sons,ニューヨーク、1981）
第７章に説明されており、この章は茲に準用する。好ま
しくは、塩基に不安定な保護基は複素環の窒素、或いは
その前駆体のそれと共に塩基に不安定なアミド及びカル
バメート保護基、好ましくはトリハロアセチル，アセト
アセチル及びフルオレニルメチルカルバメート、特に９
−フルオレニルメチルカルバメート及び９−（２−スル
ホ）−フルオレニルメチルカルバメート及びトリフルオ
ロアセチルである。好ましい酸に不安定な保護基として
は未誘導トリチル及びその低級（１〜３個の炭素原子を
含む）アルコキシ誘導体、特に４−モノメトキシトリチ
ルが挙げられる。Ｂ2及びＢ3はそれぞれ別々に水素，低
級アルキル，低級置換アルキル，特にハロ−，シアノ
−，或いはニトロ−置換低級アルキル，低級アシル，シ
アノ，ハロ，及びニトロを表わし、より好ましくはＢ2
及びＢ3は各々別々に水素，低級アルキル，及び低級ハ
ロアルキルを表わし、好ましくはＢ2及びＢ3は水素を表
わす。 Ｂ4は10個までの炭素原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アリール、アラルキル或いはシクロアルキルを
表わす。より好ましくは、Ｂ4は低級アルキル；電子引
抜きベータ−置換エチル、特にベータ−トリハロメチル
−、ベータ−シアノ−、特にベータ−スルホ−、ベータ
−ニトロ置換エチルなど；電子引抜き置換フェニルエチ
ル、特にハロ−、スルホ−、シアノ−、或いはニトロ−
置換フェニル；或いは電子引抜き置換フェニルを表わ
す。最も好ましくは、Ｂ4はメチル、ベータ−シアノエ
チル、或いは４−ニトロフェニルエチルを表わす。 本発明において用いられる「低級アルキル」という用
語は１〜６個の炭素原子を含む直鎖及び分岐鎖アルキル
基、例えばメチル，エチル，プロピル，イソプロピル,t
ert−ブチル，イソブチル,sec−ブチル，ネオペンチル,
tert−ペンチルなどを示す。「低級置換アルキル」と
は、「電子引抜き」置換基例えばハロ，シアノ，ニト
ロ，スルホ或いはモノ−，ジ−，或いはトリハロメチル
などを有する低級アルキルを示す。「低級ハロアルキ
ル」とは１個以上のハロゲン原子置換基、通常フルオ
ロ，クロロ，ブロモ或いはヨードを有する低級アルキル
を示す。「低級アシル」とは非二重結合炭素がハロ−，
シアノ−，或いはニトロ−置換基を有してもよい低級ア
ルキルよりなる１〜７個の炭素原子を含むアシルを示
す。「電子引抜き」とはある置換基のそれが離れた分子
の原子価電子を吸引する傾向、即ち、それが電子陰性で
あることを示す、マーチ，アドバンスド・オーガニック
・ケミストリー，第三版〔March,Advanced Organic Che
mistry,Third Ed.（John Wiley,ニューヨーク、1985
年）〕。 ｊは２〜10の範囲にある。 Ｒ′及びＲ″は各々別々に10個までの炭素原子を含有
するアルキル，アラルキル，シクロアルキル，及びシク
ロアルキルアルキルを表わす。好ましくは、Ｒ′及び
Ｒ″は各々別々に低級アルキルを表わし、最も好ましく
は、上記ホスホルアミダイト類が直接結合剤として用い
られる場合にはＲ′及びＲ″は別々にホスホルアミダイ
ト類の化学的安定性、従ってそれらの貯蔵寿命を高める
立体障害低級アルキルである。その様な立体障害低級ア
ルキルとしては、イソプロピル,t−ブチル，イソブチ
ル,sec−ブチル，ネオペチル,tert−ペンチル，イソペ
ンチル,sec−ペンチルなどが挙げられる。 Ｒ′及びＲ″は一緒に主鎖に５個までの及び合計10個
までの炭素原子を含有し，該鎖の両末端原子価結合が
Ｒ′及びＲ″が結合している窒素原子に結合しているア
ルキル鎖を形成するか、或いはＲ′及びＲ″はそれらが
結合する窒素原子と共に窒素、酸素及びイオウよりなる
群から選ばれる１個以上の追加のヘテロ原子を含有して
もよい飽和窒素複素環を形成する。より好ましくは、
Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にプロリジ
ノ，モルホリノ，或いはピペリジノを表わす。最も好ま
しくは、Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にモ
ルホリノを形成する。 本発明において用いられるもう一つのアミノアルキル
ホスホルアミダイト類の群は次式で定義されるものであ
る。 （式中、Ｂ1,B4,R′及びＲ″は上記の通りであり、及
びｔは０〜８の範囲にあり、ｓは０〜８の範囲にあり、
但し、ｓ＋ｔは１〜８の範囲にある）。 上記アミノアルキルホスホルアミダイト類式II及びII
Iを合成するための一般的方法は次の工程を含んでな
る。下記一般式により規定されるハロ−置換−N,N−ジ
−置換−０−置換ホスフィン： （式中、Ｘはハロゲン、通常は塩素であり、及び
Ｒ′,R″及びＢ4上記の通りである） を下記一般式により規定されるアミノ−保護アルコール
アミン： （式中、Ｂ1,B2及びＢ3は上記の通りである）と反応
時に放出されるハロゲン酸を吸収する非求核塩基、例え
ばN,Nジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキル
アミンを含有するジクロロメタンとの非プロトン溶媒中
で反応させる。好ましくは、反応はアルゴンなどの不活
性雰囲気下に行われる。酸はホスホルアミダイト生成物
のアミンが陽子を加えて反応性にさせるので、反応液に
おける酸性条件は避けられるべきである。非求核塩基は
塩基と活性化ホスホルアミダイト類との間の副反応の可
能性を減少させる。 上記物質を反応後、以下に第一反応液と称する反応液
を穏やかな塩基性溶液で洗浄して非求核塩基の塩類を除
去する。最後に第一反応液をたとえばMgSO4,Na2SO4など
で乾燥させて、保護アミノアルキルホスホルアミダイト
を得る。 A.保護アミノエチルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（5.0ml、Aldrich Chemical社、ウィスコンシン
州、ミルウォーキー、より市販）を０℃において、アル
ゴン下に撹拌されたジクロロメタン（約40ml）中のＮ−
（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロアセ
タミド（3.9g），並びにジイソプロピルエチルアミン
（5.0ml）の溶液に滴加した。（Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドはラザラス
（Lazarus）及びベンコビック（Benkovic）によりJ.Am.
Chem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法に従って合成した：すなわち、50mlのクロロホルム中
のエチルトリフルオロアセテート（56.8g,0.4mol）を50
mlのクロロホルム中24.4g（0.4mol）のエタノールアミ
ンの撹拌された溶液に滴加した。この溶液を室温で５時
間撹拌し、回転蒸発させて溶媒を除去して、115℃（4.3
Torr）で蒸留し、58.5gの油を得、これは引掻くと結晶
化した。）室温で0.5時間撹拌後、反応液を0.2M炭酸カ
リウム溶液で２回及び塩水で１回洗浄し、乾燥させ（Mg
SO4）、減圧下に濃縮してＮ−（２−（Ｎ′,N′−ジイ
ソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）エチ
ル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドを無色液体とし
て得た（7.77g）。1 Ｈ−NMR（CD2Cl2）：δ3.6（6H,m）、3.4（3H,d,J＝1
2）、1.2（12H,d,J＝6.5）31 Ｐ−NMR（CD2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） B.保護アミノプロピルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（3.7ml）を０℃において、アルゴン下に撹拌され
たジクロロメタン（約20ml）中のＮ−（３−ヒドロキシ
プロピル）−2,2,2−トリフルオロアセタミド（2.9g,3
−アミノ−１−プロパノール及びエチルトリフルオロア
セテートからラザラス及びベンコビックによりJ.Amer.C
hem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法と同様にして合成）、及びジイソプロピルエチルアミ
ン（3.7ml）の撹拌された溶液に滴加した。室温で３時
間撹拌後、反応液をヘキサン（100ml）に注いで撹拌し
た。混合物を沈澱させ、上澄液を分離し、減圧下に濃縮
してＮ−（３−（Ｎ′,N′−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィニルオキシ）プロピル）−2,2,2−トリフ
ルオロアセタミドを無色液体として得た（5.2g）。31 Ｐ−NMR（CH2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） C.アミノエチルホスホルアミダイトによるオリゴヌクレ
オチドのアミン誘導化 固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′ヒド
ロキシルの脱トリチル化後９−フルオレニルメチル−保
護アミノエチルホスホルアミダイトをホスファイトトリ
エステル合成のための標準的アセトニトリル／テトラゾ
ール反応溶媒中の約0.2Mの濃度にて添加した。この９−
フルオレニルメチル−保護アミノエチルホスホルアミダ
イトはアグラワル等（Agrawal et al）によりヌクレイ
ック・アッシズ・リサーチ（Nucleic Acids Researc
h）,14巻6227頁（1986）にも開示されているように、Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロア
セタミドをＮ−（２−ヒドロキシエチル）−９−フルオ
レニルメチルガルバメートに代えた他はパートＡの物質
と同様にして調製した。この９−フルオレニルメチル−
保護基は、80:20％（容量）のアセトニトリルと、ピペ
リジンの溶液により室温で除去した。上記反応はApplie
d Biosystemsモデル380Aなどの標準的自動化DNAシンセ
サイザー上で行った。 実施例II.ROX−ホスホルアミダイトの合成 97.1mg（0.158mmol）の５−及び６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミンのエタノールアミンアミド及び13.5mg（0.
079mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
の混合物を、乾燥アルゴンでパージし、8mlの乾燥（水
素化カルシウムから蒸留）アセトニトリルで希釈した。
0.40g（1.53mmol）のメトキシ−ビス−（ジイソプロピ
ルアミノ）ホスフィンを添加し、溶液をアルゴン下に室
温で撹拌した。２時間後に溶液を7mlづつのヘキサンで
４回洗浄し、0.5％トリエチルアミンを含有するクロロ
ホルムで200mlに希釈し、100mlの1:1 塩水：水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させ
た。ゴム状固体をヘキサンと共にすりつぶし、高真空下
に乾燥させ、この操作を黒色のさらさらした固体が得ら
れるまで繰返して113mgのROX−５−及びROX−６−ホス
ホルアミダイトを得た。 実施例III TMR−ホスホルアミダイトの合成 61.4mg（0.130mmol）の５−及び６−カルボキシルテ
トラメチルローダミンのエタノールアミンアミド混合物
及び0.005Mジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
（0.0013mmol）の0.26mlのアセトニトリル溶液を合一し
て、＜0.1mm圧力で蒸発させ、次いでアルゴンでパージ
して10mlの乾燥（水素化カルシウムから蒸留）アセトニ
トリルで希釈した。0.22g（0.840mmol）のメトキシ−ビ
ス−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添加し、溶
液を窒素下に室温で1.5時間撹拌した。得られた反応液
を5mlづつのヘキサンで５回洗浄し、0.5％のトリエチル
アミンを含有するクロロホルムで100mlに希釈し、60ml
の1:1の塩水：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、濾過し、ヘキサンと共にこすり、高真空下に蒸発乾
固させた。この操作を黒色のさらさらした固体が得られ
るまで繰返し、67.6mgのTMR−５−及びTMR−６−ホスホ
ルアミダイトを得た。 実施例IV 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護ヌクレオチドの1:2:1のメタノール：水:t−ブ
チルアミンによる切断及び脱保護 本例において、保護18−マ−オリゴヌクレオチドはAp
plied Biosystemsモデル380B DNAシンセサイザー上でホ
スファイトトリエステル法により合成した。通常の切断
試薬、水酸化アンモニウムの代わりに、それぞれ1:2:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンの本発明の切断
試薬を用いた。シンセサイザーを反応器内の固相支持体
及び結合オリゴヌクレオチドが逐次室温において1500秒
間（４×1500）切断試薬に曝露されるように再プログラ
ム化した。反応容器流出液を別の容器に集め、脱保護の
ために85℃で40分間加熱した。反応液を取出し、18−マ
−をHPLCにより反応液から分離した。取出し後、固相支
持体をABIモデルＢの標準的切断方法に従って濃水酸化
アンモニウムで処理した。この水酸化アンモニウム切断
からの反応液を次いでHPLCにより分析して追加のオリゴ
ヌクレオチド類が固相支持体から除去されたかどうかを
求めた。二つの反応液からクロマトグラフの比較は最初
の切断反応により100％のオリゴヌクレオチド類が固相
支持体から除去されたことを示した。 同一のオリゴヌクレオチドを1:2:1 メタノール：水:
t−ブチルアミンの切断試薬による切断工程の時間を、
４×1500秒の代わりに４×900秒にした他は同一方法で
再び合成した。HPLC分析は最初の切断反応において71％
のオリゴヌクレオチドが切断されたことを示した。 実施例Ｖ 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの1:1:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を、1:1:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一
のシンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行っ
た。HPLC分析は、約80％のオリゴヌクレオチドが固相支
持体から切断されたことを示した。 実施例VI 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの2:2:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を2:2:1の
比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一の
シンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行った。
HPLC分析は約10％のオリゴヌクレオチドが固相支持体か
ら切断されたことを示した。 実施例VII TMR−及びROX−標準化オリゴヌクレオチド
の固相合成及び1:2:1のメタノール：水:t−ブチルアミ
ンによる切断及び脱保護 ROX及びTMR標準化オリゴヌクレオチドを別々に、Appl
ied Biosystemsモデル380B自動化DNAシンセサイザー上
で合成した。ホスファイトトリエステル化学を用いる同
等のDNAシンセサイザーも又、使用可能であった。標準
化は、ROXホスホルアミダイト或いはTMRホスホルアミダ
イトのいずれかを製造者によりヌクレオシドホスホルア
ミダイトを接合するために推薦された条件下に、固相支
持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
と反応させることにより達成された。カルザス等（Caru
thers et al），米国特許第4,415,732号明細書、及びカ
ルザス等、ジェネティック・エンジニヤリング（Geneti
c Engineering）,4巻,1〜17頁（1982）はApplied Biosy
stemsモデル380Bシンセサイザーにより用いられる化学
の詳細な説明を与えている。従って、これらの文献は、
それらの説明のために準用する。ROX及びTMRホスホルア
ミダイトは0.5Mテトラゾール／アセトニトリル溶液と組
合わせて0.2Mアセトニトリル溶液として用いられて合成
サイクルに活性試薬を形成した。切断及び脱保護は実施
例IVと同様にして行った。ROX及びTMR標準化オリゴヌク
レオチドの完全性はHPLC,ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及び蛍光ジデオキシDNA配列決定を用いた確実な試
料による比較により確認された。 前記本発明の好ましい実施態様の開示内容は例示及び
説明を目的として示されたものである。それは徹底的な
ものではなく、或いは本発明を開示された正確な形に限
定する趣旨のものではなく、明らかに上記開示に照らし
て多くの修正及び変化が可能である。これらの実施態様
は本発明の原理及び実際的応用を最良に説明することに
より当業者が本発明を各種実施態様において、又、考え
られる特別な用途に適した各種修正をもって最良に利用
できるように選ばれ、説明されたものである。本発明の
範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定されるも
のである。
る。試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの値
は本発明を例示するのみであり、それを制限するものと
考えられてはならない。 実施例1.アミノアルキルホスホルアミダイト結合剤の調
製 以下に、アミノアルキルホスホルアミトの一般的製造
方法を開示する。大まかに言って、同一の操作がコノリ
ーによりヌクレイック・アシッズ・リサーチ、15巻3131
-3139頁（1987年）〔Connolly,Nucleic Acides Researc
h,Vol.15,pgs.3131〜3139（1987）〕に開示されてい
る。これらの化合物は固相支持体に結合したアミノ誘導
オリゴヌクレオチド類に有用である。本発明において有
用なアミノアルキルホスホルアミダイト類の一群は下記
一般式により定義される。 式中、Ｂ1は固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の
塩基に不安定な結合基を切断することなしに除去するこ
とのできる酸に不安定な或いは塩基に不安定なアミノ保
護基を表わす。その様な基はグリンにより「有機合成に
おける保護基（Protective Groups in Organic Synthes
is）」、（John Wiley ＆ Sons,ニューヨーク、1981）
第７章に説明されており、この章は茲に準用する。好ま
しくは、塩基に不安定な保護基は複素環の窒素、或いは
その前駆体のそれと共に塩基に不安定なアミド及びカル
バメート保護基、好ましくはトリハロアセチル，アセト
アセチル及びフルオレニルメチルカルバメート、特に９
−フルオレニルメチルカルバメート及び９−（２−スル
ホ）−フルオレニルメチルカルバメート及びトリフルオ
ロアセチルである。好ましい酸に不安定な保護基として
は未誘導トリチル及びその低級（１〜３個の炭素原子を
含む）アルコキシ誘導体、特に４−モノメトキシトリチ
ルが挙げられる。Ｂ2及びＢ3はそれぞれ別々に水素，低
級アルキル，低級置換アルキル，特にハロ−，シアノ
−，或いはニトロ−置換低級アルキル，低級アシル，シ
アノ，ハロ，及びニトロを表わし、より好ましくはＢ2
及びＢ3は各々別々に水素，低級アルキル，及び低級ハ
ロアルキルを表わし、好ましくはＢ2及びＢ3は水素を表
わす。 Ｂ4は10個までの炭素原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アリール、アラルキル或いはシクロアルキルを
表わす。より好ましくは、Ｂ4は低級アルキル；電子引
抜きベータ−置換エチル、特にベータ−トリハロメチル
−、ベータ−シアノ−、特にベータ−スルホ−、ベータ
−ニトロ置換エチルなど；電子引抜き置換フェニルエチ
ル、特にハロ−、スルホ−、シアノ−、或いはニトロ−
置換フェニル；或いは電子引抜き置換フェニルを表わ
す。最も好ましくは、Ｂ4はメチル、ベータ−シアノエ
チル、或いは４−ニトロフェニルエチルを表わす。 本発明において用いられる「低級アルキル」という用
語は１〜６個の炭素原子を含む直鎖及び分岐鎖アルキル
基、例えばメチル，エチル，プロピル，イソプロピル,t
ert−ブチル，イソブチル,sec−ブチル，ネオペンチル,
tert−ペンチルなどを示す。「低級置換アルキル」と
は、「電子引抜き」置換基例えばハロ，シアノ，ニト
ロ，スルホ或いはモノ−，ジ−，或いはトリハロメチル
などを有する低級アルキルを示す。「低級ハロアルキ
ル」とは１個以上のハロゲン原子置換基、通常フルオ
ロ，クロロ，ブロモ或いはヨードを有する低級アルキル
を示す。「低級アシル」とは非二重結合炭素がハロ−，
シアノ−，或いはニトロ−置換基を有してもよい低級ア
ルキルよりなる１〜７個の炭素原子を含むアシルを示
す。「電子引抜き」とはある置換基のそれが離れた分子
の原子価電子を吸引する傾向、即ち、それが電子陰性で
あることを示す、マーチ，アドバンスド・オーガニック
・ケミストリー，第三版〔March,Advanced Organic Che
mistry,Third Ed.（John Wiley,ニューヨーク、1985
年）〕。 ｊは２〜10の範囲にある。 Ｒ′及びＲ″は各々別々に10個までの炭素原子を含有
するアルキル，アラルキル，シクロアルキル，及びシク
ロアルキルアルキルを表わす。好ましくは、Ｒ′及び
Ｒ″は各々別々に低級アルキルを表わし、最も好ましく
は、上記ホスホルアミダイト類が直接結合剤として用い
られる場合にはＲ′及びＲ″は別々にホスホルアミダイ
ト類の化学的安定性、従ってそれらの貯蔵寿命を高める
立体障害低級アルキルである。その様な立体障害低級ア
ルキルとしては、イソプロピル,t−ブチル，イソブチ
ル,sec−ブチル，ネオペチル,tert−ペンチル，イソペ
ンチル,sec−ペンチルなどが挙げられる。 Ｒ′及びＲ″は一緒に主鎖に５個までの及び合計10個
までの炭素原子を含有し，該鎖の両末端原子価結合が
Ｒ′及びＲ″が結合している窒素原子に結合しているア
ルキル鎖を形成するか、或いはＲ′及びＲ″はそれらが
結合する窒素原子と共に窒素、酸素及びイオウよりなる
群から選ばれる１個以上の追加のヘテロ原子を含有して
もよい飽和窒素複素環を形成する。より好ましくは、
Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にプロリジ
ノ，モルホリノ，或いはピペリジノを表わす。最も好ま
しくは、Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にモ
ルホリノを形成する。 本発明において用いられるもう一つのアミノアルキル
ホスホルアミダイト類の群は次式で定義されるものであ
る。 （式中、Ｂ1,B4,R′及びＲ″は上記の通りであり、及
びｔは０〜８の範囲にあり、ｓは０〜８の範囲にあり、
但し、ｓ＋ｔは１〜８の範囲にある）。 上記アミノアルキルホスホルアミダイト類式II及びII
Iを合成するための一般的方法は次の工程を含んでな
る。下記一般式により規定されるハロ−置換−N,N−ジ
−置換−０−置換ホスフィン： （式中、Ｘはハロゲン、通常は塩素であり、及び
Ｒ′,R″及びＢ4上記の通りである） を下記一般式により規定されるアミノ−保護アルコール
アミン： （式中、Ｂ1,B2及びＢ3は上記の通りである）と反応
時に放出されるハロゲン酸を吸収する非求核塩基、例え
ばN,Nジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキル
アミンを含有するジクロロメタンとの非プロトン溶媒中
で反応させる。好ましくは、反応はアルゴンなどの不活
性雰囲気下に行われる。酸はホスホルアミダイト生成物
のアミンが陽子を加えて反応性にさせるので、反応液に
おける酸性条件は避けられるべきである。非求核塩基は
塩基と活性化ホスホルアミダイト類との間の副反応の可
能性を減少させる。 上記物質を反応後、以下に第一反応液と称する反応液
を穏やかな塩基性溶液で洗浄して非求核塩基の塩類を除
去する。最後に第一反応液をたとえばMgSO4,Na2SO4など
で乾燥させて、保護アミノアルキルホスホルアミダイト
を得る。 A.保護アミノエチルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（5.0ml、Aldrich Chemical社、ウィスコンシン
州、ミルウォーキー、より市販）を０℃において、アル
ゴン下に撹拌されたジクロロメタン（約40ml）中のＮ−
（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロアセ
タミド（3.9g），並びにジイソプロピルエチルアミン
（5.0ml）の溶液に滴加した。（Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドはラザラス
（Lazarus）及びベンコビック（Benkovic）によりJ.Am.
Chem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法に従って合成した：すなわち、50mlのクロロホルム中
のエチルトリフルオロアセテート（56.8g,0.4mol）を50
mlのクロロホルム中24.4g（0.4mol）のエタノールアミ
ンの撹拌された溶液に滴加した。この溶液を室温で５時
間撹拌し、回転蒸発させて溶媒を除去して、115℃（4.3
Torr）で蒸留し、58.5gの油を得、これは引掻くと結晶
化した。）室温で0.5時間撹拌後、反応液を0.2M炭酸カ
リウム溶液で２回及び塩水で１回洗浄し、乾燥させ（Mg
SO4）、減圧下に濃縮してＮ−（２−（Ｎ′,N′−ジイ
ソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）エチ
ル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドを無色液体とし
て得た（7.77g）。1 Ｈ−NMR（CD2Cl2）：δ3.6（6H,m）、3.4（3H,d,J＝1
2）、1.2（12H,d,J＝6.5）31 Ｐ−NMR（CD2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） B.保護アミノプロピルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（3.7ml）を０℃において、アルゴン下に撹拌され
たジクロロメタン（約20ml）中のＮ−（３−ヒドロキシ
プロピル）−2,2,2−トリフルオロアセタミド（2.9g,3
−アミノ−１−プロパノール及びエチルトリフルオロア
セテートからラザラス及びベンコビックによりJ.Amer.C
hem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法と同様にして合成）、及びジイソプロピルエチルアミ
ン（3.7ml）の撹拌された溶液に滴加した。室温で３時
間撹拌後、反応液をヘキサン（100ml）に注いで撹拌し
た。混合物を沈澱させ、上澄液を分離し、減圧下に濃縮
してＮ−（３−（Ｎ′,N′−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィニルオキシ）プロピル）−2,2,2−トリフ
ルオロアセタミドを無色液体として得た（5.2g）。31 Ｐ−NMR（CH2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） C.アミノエチルホスホルアミダイトによるオリゴヌクレ
オチドのアミン誘導化 固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′ヒド
ロキシルの脱トリチル化後９−フルオレニルメチル−保
護アミノエチルホスホルアミダイトをホスファイトトリ
エステル合成のための標準的アセトニトリル／テトラゾ
ール反応溶媒中の約0.2Mの濃度にて添加した。この９−
フルオレニルメチル−保護アミノエチルホスホルアミダ
イトはアグラワル等（Agrawal et al）によりヌクレイ
ック・アッシズ・リサーチ（Nucleic Acids Researc
h）,14巻6227頁（1986）にも開示されているように、Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロア
セタミドをＮ−（２−ヒドロキシエチル）−９−フルオ
レニルメチルガルバメートに代えた他はパートＡの物質
と同様にして調製した。この９−フルオレニルメチル−
保護基は、80:20％（容量）のアセトニトリルと、ピペ
リジンの溶液により室温で除去した。上記反応はApplie
d Biosystemsモデル380Aなどの標準的自動化DNAシンセ
サイザー上で行った。 実施例II.ROX−ホスホルアミダイトの合成 97.1mg（0.158mmol）の５−及び６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミンのエタノールアミンアミド及び13.5mg（0.
079mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
の混合物を、乾燥アルゴンでパージし、8mlの乾燥（水
素化カルシウムから蒸留）アセトニトリルで希釈した。
0.40g（1.53mmol）のメトキシ−ビス−（ジイソプロピ
ルアミノ）ホスフィンを添加し、溶液をアルゴン下に室
温で撹拌した。２時間後に溶液を7mlづつのヘキサンで
４回洗浄し、0.5％トリエチルアミンを含有するクロロ
ホルムで200mlに希釈し、100mlの1:1 塩水：水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させ
た。ゴム状固体をヘキサンと共にすりつぶし、高真空下
に乾燥させ、この操作を黒色のさらさらした固体が得ら
れるまで繰返して113mgのROX−５−及びROX−６−ホス
ホルアミダイトを得た。 実施例III TMR−ホスホルアミダイトの合成 61.4mg（0.130mmol）の５−及び６−カルボキシルテ
トラメチルローダミンのエタノールアミンアミド混合物
及び0.005Mジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
（0.0013mmol）の0.26mlのアセトニトリル溶液を合一し
て、＜0.1mm圧力で蒸発させ、次いでアルゴンでパージ
して10mlの乾燥（水素化カルシウムから蒸留）アセトニ
トリルで希釈した。0.22g（0.840mmol）のメトキシ−ビ
ス−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添加し、溶
液を窒素下に室温で1.5時間撹拌した。得られた反応液
を5mlづつのヘキサンで５回洗浄し、0.5％のトリエチル
アミンを含有するクロロホルムで100mlに希釈し、60ml
の1:1の塩水：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、濾過し、ヘキサンと共にこすり、高真空下に蒸発乾
固させた。この操作を黒色のさらさらした固体が得られ
るまで繰返し、67.6mgのTMR−５−及びTMR−６−ホスホ
ルアミダイトを得た。 実施例IV 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護ヌクレオチドの1:2:1のメタノール：水:t−ブ
チルアミンによる切断及び脱保護 本例において、保護18−マ−オリゴヌクレオチドはAp
plied Biosystemsモデル380B DNAシンセサイザー上でホ
スファイトトリエステル法により合成した。通常の切断
試薬、水酸化アンモニウムの代わりに、それぞれ1:2:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンの本発明の切断
試薬を用いた。シンセサイザーを反応器内の固相支持体
及び結合オリゴヌクレオチドが逐次室温において1500秒
間（４×1500）切断試薬に曝露されるように再プログラ
ム化した。反応容器流出液を別の容器に集め、脱保護の
ために85℃で40分間加熱した。反応液を取出し、18−マ
−をHPLCにより反応液から分離した。取出し後、固相支
持体をABIモデルＢの標準的切断方法に従って濃水酸化
アンモニウムで処理した。この水酸化アンモニウム切断
からの反応液を次いでHPLCにより分析して追加のオリゴ
ヌクレオチド類が固相支持体から除去されたかどうかを
求めた。二つの反応液からクロマトグラフの比較は最初
の切断反応により100％のオリゴヌクレオチド類が固相
支持体から除去されたことを示した。 同一のオリゴヌクレオチドを1:2:1 メタノール：水:
t−ブチルアミンの切断試薬による切断工程の時間を、
４×1500秒の代わりに４×900秒にした他は同一方法で
再び合成した。HPLC分析は最初の切断反応において71％
のオリゴヌクレオチドが切断されたことを示した。 実施例Ｖ 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの1:1:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を、1:1:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一
のシンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行っ
た。HPLC分析は、約80％のオリゴヌクレオチドが固相支
持体から切断されたことを示した。 実施例VI 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの2:2:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を2:2:1の
比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一の
シンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行った。
HPLC分析は約10％のオリゴヌクレオチドが固相支持体か
ら切断されたことを示した。 実施例VII TMR−及びROX−標準化オリゴヌクレオチド
の固相合成及び1:2:1のメタノール：水:t−ブチルアミ
ンによる切断及び脱保護 ROX及びTMR標準化オリゴヌクレオチドを別々に、Appl
ied Biosystemsモデル380B自動化DNAシンセサイザー上
で合成した。ホスファイトトリエステル化学を用いる同
等のDNAシンセサイザーも又、使用可能であった。標準
化は、ROXホスホルアミダイト或いはTMRホスホルアミダ
イトのいずれかを製造者によりヌクレオシドホスホルア
ミダイトを接合するために推薦された条件下に、固相支
持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
と反応させることにより達成された。カルザス等（Caru
thers et al），米国特許第4,415,732号明細書、及びカ
ルザス等、ジェネティック・エンジニヤリング（Geneti
c Engineering）,4巻,1〜17頁（1982）はApplied Biosy
stemsモデル380Bシンセサイザーにより用いられる化学
の詳細な説明を与えている。従って、これらの文献は、
それらの説明のために準用する。ROX及びTMRホスホルア
ミダイトは0.5Mテトラゾール／アセトニトリル溶液と組
合わせて0.2Mアセトニトリル溶液として用いられて合成
サイクルに活性試薬を形成した。切断及び脱保護は実施
例IVと同様にして行った。ROX及びTMR標準化オリゴヌク
レオチドの完全性はHPLC,ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及び蛍光ジデオキシDNA配列決定を用いた確実な試
料による比較により確認された。 前記本発明の好ましい実施態様の開示内容は例示及び
説明を目的として示されたものである。それは徹底的な
ものではなく、或いは本発明を開示された正確な形に限
定する趣旨のものではなく、明らかに上記開示に照らし
て多くの修正及び変化が可能である。これらの実施態様
は本発明の原理及び実際的応用を最良に説明することに
より当業者が本発明を各種実施態様において、又、考え
られる特別な用途に適した各種修正をもって最良に利用
できるように選ばれ、説明されたものである。本発明の
範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定されるも
のである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティーブン ファング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト アドベ プレイ ス 420 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 21/00 C12N 15/10 C12N 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】オリゴヌクレオチドと固相支持体との間の
塩基に不安定な結合基の切断方法であって、結合基が加
水分解するまで結合基を切断試薬に曝露する工程を含ん
でなり、切断試薬が低級アルキルアルコール、水、及び
３〜６個の炭素原子を有する非求核ヒンダードアルキル
アミンをそれぞれ約1:1:1乃至約1:3:1の容量比で含んで
なることを特徴とする方法。 - 【請求項２】該低級アルキルアルコールがメタノール、
エタノール及びプロパノールよりなる群から選ばれ、及
び該非求核ヒンダードアルキルアミンがイソプロピルア
ミン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジ
ン、ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミン、及びジ
プロピルアミンよりなる群から選ばれる特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - 【請求項３】該結合基がコハク酸エステルである特許請
求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】該切断試薬がメタノール、水、及びｔ−ブ
チルアミンをそれぞれ約1:2:1の比で含んでなる特許請
求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】固相支持体上にアンモニアに不安定な基で
標識化されたオリゴヌクレオチド類の製法であって、下
記工程を含んでなることを特徴とする方法： 塩基に不安定な結合基により固相支持体に結合されたオ
リゴヌクレオチドを提供する工程； このオリゴヌクレオチドに１種以上のアンモニアに不安
定な基を結合してアンモニアに不安定な基で標識化され
たオリゴヌクレオチドを形成する工程；及び その塩基に不安定な結合基を切断試薬によりアンモニア
に不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチドが固相
支持体から遊離されるように切断する工程であって、 切断試薬が、低級アルキルアルコール、水、及び３〜６
個の炭素原子を含有する非求核ヒンダードアルキルアミ
ンをそれぞれ約1:1:1乃至約1:3:1の容量比で含んでなる
工程。 - 【請求項６】該塩基に不安定な結合基が該オリゴヌクレ
オチドの３′水酸基と該固相支持体との間に共有結合を
形成する特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】（１）該低級アルキルアルコールがメタノ
ール、エタノール、及びプーパノールよりなる群から選
ばれ、（２）該非求核ヒンダードアルキルアミンがイソ
プロピルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、
ピペリジン、ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミ
ン、及びジプロピルアミンよりなる群から選ばれ、およ
び（３）該塩基に不安定な結合基がコハク酸エステルで
ある特許請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】該アンモニアに不安定な基がローダミン染
料分子に含まれる基である特許請求の範囲第７項記載の
方法。 - 【請求項９】該切断試薬がメタノール、水、及びｔ−ブ
チルアミンをそれぞれ約1:2:1の比で含んでなる特許請
求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】ローダミン染料分子に含まれる１種以上
のアンモニアに不安定な基を結合する該工程がローダミ
ンホスホルアミダイトを該オリゴヌクレオチドの５′ヒ
ドロキシルと反応させることを含む特許請求の範囲第８
項記載の方法。 - 【請求項１１】該アンモニアに不安定な基がローダミン
染料分子に含まれる基である特許請求の範囲第５項記載
の方法。 - 【請求項１２】該ローダミンがテトラメチルローダミン
である特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１３】該ローダミンがローダミンＸである特許
請求の範囲第11項記載の方法。
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