JP2004507565A - オリゴヌクレオチド合成用のリンカーホスホルアミダイト - Google Patents
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Abstract
カルボン酸リンカーアームの易切断性を、オリゴヌクレオチド合成に有用な汎用担体の単一ホスホルアミダイトとのカップリング化学反応と組み合わせる新規手法。３’−エステル結合を介して結合した保護されたヌクレオシドを一端に有し、反応性ホスホルアミダイト基又は他のホスフェート前駆体基をもう一端に有する２官能リンカーアームを含む、新しいホスホルアミダイト試薬群のリンカーホスホルアミダイトを開示する。リンカーホスホルアミダイト上のホスホルアミダイト基は、中間リンカーアームのない従来のヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト試薬と同じ条件で活性化することができ、類似の反応性を有する。リンカーホスホルアミダイト内に含まれる３’−エステル結合は、予め誘導体化された担体上の結合に類似した諸特性を有する。このエステル結合は後続する全ての合成工程に対して安定であるが、水酸化アンモニウムなどの切断試薬で処理すると加水分解される。これにより、所望の３’−水酸基末端を有するオリゴヌクレオチド生成物が遊離し、担体に付着した該試薬のホスフェート部分（その後廃棄される）が残る。
【選択図】 図５
【選択図】 図５
Description
【０００１】
【関連出願の相互参照】
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、本明細書にその内容を参考文献として援用した仮出願番号６０／２３１３０１号（２０００年９月８日出願）の利益を主張する。
【０００２】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、その態様の１つにおいて、オリゴヌクレオチド合成に有用な一連の新規リン含有化合物に関する。他の態様において、本発明はオリゴヌクレオチド合成におけるこれらの化合物の使用に関する。
【０００３】
従来技術の説明
オリゴヌクレオチド類は、生化学及び分子生物学の試薬として広く使用されるようになってきた（Ｇ．Ｍ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。これらの物質は、ＤＮＡ配列決定用プライマー（Ｃ．Ｊ．Ｈｏｗｅ ａｎｄ Ｅ．Ｓ．Ｗａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８９、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）、ポリメラーゼ連鎖反応又は「ＰＣＲ」（Ｎ．Ｓｍｙｔｈ Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、１９９２、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １、５８〜７２）プライマー、ＤＮＡプローブ（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）として、及び合成遺伝子又は改変遺伝子の構築（Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）において使用されている。改変オリゴヌクレオチドには、診断薬及び治療薬としての広い用途が見出されている。下記の参照文献を参照されたい。
【０００４】
【参考文献１】
特に有意義なのは、数千又は数万の異なるＤＮＡ配列を含めることができる高密度ＤＮＡアレイの開発であった（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒｅｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９９、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。その結果、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの需要が着実に高まり、現在では毎年数百万個のオリゴヌクレオチドが必要とされている。
【０００５】
化学的固相合成法は、必要とされる数多くの合成オリゴヌクレオチドを生成できる唯一の方法であり、ホルホルアミダイトカップリング化学反応を用いた自動合成法（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ、１９９２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １２、２２２３〜２３１１）が、好ましい合成法となった。固相合成法の第１段階は、ヌクレオシド残基を不溶性支持体、たとえば細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリスチレンビーズの表面に共有結合によって結合させることである（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０００、Ｕｎｉｔ ３．１、Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この結合は、支持体の表面上でオリゴヌクレオチドを合成するために必要な全ての化学的段階に対して耐性でなければならない。さらに、この結合は支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離するために合成完了後に切断可能でなければならない。
【０００６】
支持体から遊離した生成物は、十分に定義され、且つその後の酵素反応に関与可能な（すなわちポリメラーゼなどの酵素によって認識される）末端を有することも重要である。固相オリゴヌクレオチド合成の好ましい方法ではいずれも、３′末端残基を支持体に結合させ、オリゴヌクレオチド配列を３′から５′方向へ組み立てる。支持体から切断した後は３′−水酸基が望ましいが、これは酵素的切断によって生じる構造と一致するからである。３′末端リン酸はポリメラーゼによって延長することができず、このようなオリゴヌクレオチドはＰＣＲ又は配列決定用プライマーとしても機能することができないので不十分である。
【０００７】
前記リンカーの必要条件は、カルボン酸又はジカルボン酸リンカーアームを使用し、第１のヌクレオチド残基をエステル結合によって３′−水酸基に結合させることによって満たされる。合成後、このエステル結合を水酸化アンモニウムで加水分解すると、支持体から所望する３′−ＯＨ官能基を備えたオリゴヌクレオチドが遊離する。このような手段によって支持体にヌクレオチドを結合させる方法は、図１ａ及び図１ｂで示した従来技術に例示されているようによく知られている。このようなアプローチでは、ジカルボン酸リンカーアーム、たとえばコハク酸、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸、ジグリコール酸、シュウ酸、マロン酸などが頻繁に使用される。
【０００８】
しかし、支持体にカルボン酸エステル又はアミド結合を形成するために必要な化学反応は、オリゴヌクレオチド配列を作製するために必要なホスホルアミダイト化学反応とは異なる。したがって、ヌクレオシド結合段階は通常、自動化合成とは別に実施する。自動化合成に先立って、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はその他の微量ヌクレオシドを含有した予め正確に誘導体化した支持体を選択しなければならない。オリゴヌクレオチド数が少ないときにはこれで十分であるが、異なる配列を９６ウェルプレートなどで多数合成するときは面倒で、間違いの原因となり得る。ホスホルアミダイト合成サイクルの直前に自動的にエステル化／アミド化段階を実施する迅速な結合試薬が開発されたが（Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、Ｓ．Ｙｕ ａｎｄ Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、１０５１〜１０５７ 及びＲ．Ｔ．Ｐｏｎ ａｎｄ Ｓ．Ｙｕ、１９９９、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１７７８〜１７８０参照）、これらの試薬にはエステル化化学反応並びにホスホルアミダイト化学反応を実施するために特別に変更したＤＮＡ合成機が必要である。
【０００９】
市販の自動装置はホスホルアミダイト合成のためのみに設計されているので、単一の化学結合反応のみを使用する方法がより望ましい。この要求を満たすために、１個の遊離水酸基と１個の保護されているか、又は支持体に結合した水酸基を有し、ジオール部分を含有する様々な「汎用」固相支持体が開発されてきた（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０００、Ｕｎｉｔ ３．１、Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。図１〜３を参照のこと。このアプローチでは、オリゴヌクレオチド配列を合成するために使用された同ヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト試薬を使用して第一のヌクレオシド残基を支持体に結合させる。しかし、これによってオリゴヌクレオチドは３′−エステル結合ではなく３′−リン酸結合によって支持体に結合するようになる。したがって、支持体から切断することによって最初に生成するのは３′−リン酸化生成物である。所望する３′−ＯＨ末端の形成には、他の試薬が必要であるか、又は３′−リン酸基を除去するために脱保護の時間を延長することが必要である。脱リン酸化反応はまた、定量的ではなく、そのため生成物の混合物が生じる。したがって、このアプローチは処理時間が長く、所望する３′−ＯＨ生成物の収率が低く、最終生成物中に３′がリン酸化された配列とリン酸化されていない配列が混合しているため、満足のいくものではない。
【００１０】
したがって、現在まで進歩はしてきたにもかかわらず、まだ改善の余地が残されている。具体的には、ホスホルアミダイトカップリング化学反応を使用する利点と、前述した「正確に予め誘導体化された支持体」を使用する必要なく効率的に自動合成する利点とを兼ね備えた新規オリゴヌクレオチド合成法を得ることが望まれる。
【００１１】
【発明の概要】
本発明の一つの目的は、従来技術の上記欠点の少なくとも１つを取り除く又は軽減することである。
【００１２】
本発明の一つの目的は、オリゴヌクレオチド合成に有用な新規リン含有化合物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、新規オリゴヌクレオチド合成方法を提供することである。
【００１４】
したがって、その一側面において、本発明は式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化４７】
（式中、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化４８】
（式中、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化４９】
（式中、Ｇは、Ｃ又はＮであって、少なくとも１つがＮである）、及び
【化５０】
から選択され、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物を提供する。
【００１５】
その別の側面において、本発明は式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化５１】
（式中、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化５２】
（式中、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化５３】
（式中、ＧはＣ又はＮであって、少なくとも１つのＧはＮである）、及び
【化５４】
から選択され、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つは電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物を生成する方法であって、
式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの化合物：
Ｘ１−ＯＨ （ＩＩ）
Ｈ−Ｑ−Ｏ−Ｒ２４ （ＩＩＩ）
Ｚ２ （ＩＶ）
（式中、Ｒ１８は保護基であり、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）
を反応させる工程を備える方法を提供する。
【００１６】
その別の側面において、本発明は、式Ｖａ又は式Ｖｂ：
【化５５】
（式中、
Ｘ１は、以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化５６】
（式中、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化５７】
（式中、Ｇは、Ｃ又はＮであって、少なくとも１つがＮである）、及び
【化５８】
から選択され、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数であり、
Ｒ２５は水素又は保護基である）
で表される誘導体化されたヌクレオシドを生成する方法であって、
式ＩＩ及びＶＩで表される化合物：
【化５９】
（Ｒ２６は、水素又は保護基である）
を、式ＶＩＩａ（式Ｖａのヌクレオシドを生成する場合）又はＶＩＩｂ（式Ｖｂのヌクレオシドを生成する場合）で表される化合物：
【化６０】
とともに反応させる工程を備える方法を提供する。
【００１７】
このように、本発明者等は、カルボン酸リンカーアームの易切断性を、単一ホスホルアミダイトの汎用担体カップリング化学反応と組み合わせる新規手法を開発した。この手法は、一端に３’−エステル結合を介して結合した保護されたヌクレオシドを、他端に反応性ホスホルアミダイト基又は他のホスフェート前駆体基を有する二官能リンカーアームを含有する新しい一群のホスホルアミダイト試薬（リンカーホスホルアミダイト）の合成を必然的に伴う（図２及び３参照）。前記リンカーホスホルアミダイト上のホスホルアミダイト基は、中間リンカーアームを欠く従来のヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト試薬と同一条件下で活性化され、同様の反応性を有する。前記リンカーホスホルアミダイト内に含まれる３’−エステル結合は、予め誘導体化された担体上の結合に類似した諸特性を有する。このエステル結合は、後続する全ての合成工程に対して安定であるが、水酸化アンモニウムなどの切断試薬で処理すると加水分解される。これにより、所望の３’−水酸基末端を有するオリゴヌクレオチド生成物が遊離し、担体に付着した該試薬のホスフェート部分（その後廃棄される）が残る。
【００１８】
本明細書を通して、「オリゴヌクレオチド」という語は広い意味を有し、本来のオリゴヌクレオチド、主鎖が修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴ治療薬として有用なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びメチルホスホネート類縁体）、標識されたオリゴヌクレオチド、糖修飾オリゴヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド−ペプチド複合体などのオリゴヌクレオチド誘導体を包含するものである。
【００１９】
本明細書を通して、置換部分に言及するときには、置換の性質は本明細書に限定されるものではないが、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、Ｃ５〜Ｃ４０アルカリール基（ａｌｋａｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）（前述の各炭化水素基は、それ自体が１以上のハロゲン、酸素、及び硫黄で置換されていてもよい）、ハロゲン、酸素、及び硫黄からなる群から選択される１以上の要素であり得る。さらに、「アルキル」という語は、本明細書を通して、単結合、１以上の二重結合、１以上の三重結合、及びこれらの混合物を有する炭化水素部分を包含する。
【００２０】
式Ｉの化合物は、担体材料上に所望配列のオリゴヌクレオチドを生成するのに有用である。本明細書では、「担体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」及び「担体材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）」という語は区別なく使用され、従来の固体担体を包含するものである。固体担体の性質は、特に限定されず、当業者に周知のものである。したがって、固体担体は無機物でもよい。好適な無機物の例として、これらに限定されるものではないが、シリカ、多孔質ガラス、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム、酸化鉄、酸化ニッケル）、及び１以上のこれら物質を含有する粘土からなる群から選択してもよい。あるいは、固体担体は架橋ポリマーなどの有機物でもよい。好適な架橋ポリマーの例として、これらに限定されるものではないが、ポリアミド、ポリエーテル、ポリスチレン、及びこれらの混合物からなる群から選択してもよい。本発明で使用する好ましい一つの固体担体は従来のものであり、細孔の調節されたガラスビーズ及びポリスチレンビーズから選択してもよい。
【００２１】
【好ましい実施態様の詳細な説明】
ホスホルアミダイト試薬は、通常、アルコールを、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミドクロライド、又はビス−（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスフィンなどの３価のホスファイトと反応させて調製する。得られるヌクレオシドホスホルアミダイト試薬はオリゴヌクレオチド配列の構築に使用できるので、保護された２’−デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、又は保護されていない３’−又は５’−水酸基の何れかを有するその他のヌクレオシド化合物は、この反応の最も一般的な基質である。しかし、アミノ又はチオール末端修飾剤などの他の多数の試薬、非ヌクレオチドスペーサー、蛍光色素、コレステロール又はビタミンＥなどの親油基、及びビオチンなどの非同位体標識も、アルコールに、次いでホスホルアミダイト試薬に変換される。これらの試薬では、安定なホスフェート結合を介してオリゴヌクレオチド配列にこの試薬を恒久的に結合させるために、ホスホルアミダイト基が反応基として使用される。
【００２２】
本発明の一側面においては、保護されたヌクレオシド又は遊離の水酸基を有する非ヌクレオシド末端修飾剤などの試薬は、カルボン酸リンカーアームにエステル化される。得られるエステル結合は、水酸化アンモニウム又は他の切断条件に曝されたときにその後切断される部位になるであろう。本発明のリンカーホスホルアミダイトは、この内部切断部位を有する点で、生成物からホスフェート基を決して分離しない従前のホスホルアミダイト試薬とは異なるものである。カルボン酸リンカーアームは、３価のホスファイトと反応して前記試薬をホスホルアミダイト試薬に転換できる第２の部位（例えば、水酸基）を有するべきである。したがって、前記リンカーはカルボン酸基及びアルコールの両者を有する任意の化合物であり得る（図２参照）。リンカーとなり得るものの例には、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸（ＨＭＰＢ）、３−（４−ヒドロキシメチルフェノキシ）プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、１０−ヒドロキシデカン酸、１２−ヒドロキシドデカン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸、又は１２−ヒドロキシステアリン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
従来から、固相オリゴヌクレオチド合成のリンカーアームは、コハク酸、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸、ジグリコール酸、シュウ酸、マロン酸などのジカルボン酸であり、それらの有用な諸特性は十分に確立されているため、本発明ではこれらのタイプのリンカーアームを継続使用することが望ましい。したがって、周知のジカルボン酸を使用するリンカーホスホルアミダイト試薬の第２の合成ルート（図３）も可能である。この手順では、ジカルボン酸リンカーの一端をヌクレオシドに結合させることにより、切断可能なエステル結合を形成する。次いで、リンカーホスホルアミダイトのホスホルアミダイト部を形成可能なアルコール又はアミノ基へカルボキシル基を転換するのに役立つ第２のジオール又はアミノアルコールに、エステル又はアミド結合を介して、ジカルボン酸の他端を結合する。リンカーアームの第２の部分の化合物候補例には、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、２−アミノエタノール、１，２−ジアミノエタン、１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１−プロパノール、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ブタンジオール、４−アミノ−１−ブタノール、１，４−ジアミノブタン、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、６−アミノ−１−ヘキサノ−ル、１，６−ジアミノヘキサン、又は４−アミノ−シクロヘキサノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
前記リンカーの末端に存在するリン含有基は、オリゴヌクレオチド合成条件下で活性化することができ、且つ反応できる任意のタイプの前駆体であり得る。オリゴヌクレオチド合成に関しては、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、修正ホスホトリエステル法、クロロホスファイト又はホスファイトトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスホルアミダイト法などの様々な化学的手法が知られている。しかし、現在、最後の２つの方法のみが普通に用いられ、ホスホルアミダイト法が格段に普及している。
【００２５】
本発明を通して使用される「活性化」又は「活性化されたリン酸化部分」という用語は広い意味を有するものであり、亜リン酸エステル、リン酸エステル、又はホスホネート結合のいずれかを介してリン基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｇｒｏｕｐ）を結合することができる様々な方法を指す。３価（ＰＩＩＩ）又は５価（ＰＶ）のいずれかの酸化状態を含むリン部分が可能であり、リンの酸化状態はカップリング反応の過程で（通常、ＰＩＩＩからＰＶへと）変化し得る。したがって、所望の生成物の前駆体となる試薬は、生成物とは異なる酸化状態をとってもよい。リン酸化に使用される試薬は、本質的に反応性であり得、そのため外来の活性化又はカップリング試薬は不要である。このタイプの例には、クロロホスファイト、クロロホスフェート、及びイミダゾール、トリアゾール、若しくはテトラゾール置換ホスファイト、及びホスフェート試薬などがある。別個の活性化剤の存在によって活性化されるまでは安定なリン酸化試薬はより便利であり、広範に使用される。これらの試薬の例には、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト誘導体、及びビス−（Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスフィンなどのホスホルアミダイト及びビスホスホルアミダイト試薬がある。カップリング特性をより望ましくするために、反応基を有する試薬を他の反応基で置換してもよい。使用前に、高反応性三塩化リンをトリス−（イミダゾリド）リン又はトリス−（トリアゾリド）リン種へと変換するのがこの例である。カップリング試薬を追加してリン酸化試薬を活性種へとインサイチュで転化する必要がある場合もある。これは、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は１−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及びこれに類する試薬などのカルボジイミドカップリング試薬；Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、又はＯ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、及びこれらに類する試薬などのウロニウムカップリング試薬；及びベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、又はベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、及びこれらに類する試薬などのホスホニウムカップリング試薬が使用できる、カルボン酸エステル及びアミドの形成に類似しているかもしれない。Ｈ−ホスホネート試薬のカップリングに特に有用な塩化ピバロイル；及びホスフェート試薬のカップリングに特に有用な置換アリールスルホニルクロライド、イミダゾリド、トリアゾリド、テトラゾリド試薬などの無水中間体混合物を生成するカップリング試薬が必要なこともある。リン酸化試薬は、中性の非荷電種としてそれらの取扱いを容易にする保護基を有していてもよい。これらの保護基は除去可能であり、単離することなく、インサイチュで荷電種を生成することを可能とし、次いでこの荷電種がカップリング反応に関与する。このアプローチの一例は、修正ホスホトリエステル法として知られている。したがって、リン基を導入し、それらをカップリングしてホスファイト、ホスフェート、及びホスホネート結合を生成する広範且つ多様な試薬と反応条件が存在する。しかし、これらの方法はすべて当業者には既知である。
【００２６】
４つの一般的な塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）又は一般的でないその他の塩基のリンカーホスホルアミダイト試薬は、４つの従来のヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト試薬と同様にして調製し、自動ＤＮＡ合成装置にかけることができる（図２及び３）。その際、安価で容易に入手可能な誘導体化されていないアミノ又はヒドロキシル固相担体は、「汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」担体としてカラム又はプレート形式のいずれでも使用することができる。さらに、後続の鎖伸張工程のために従来のホスホルアミダイト試薬に切り替える前に、第１の合成サイクルでリンカーホスホルアミダイトを結合させるために、標準のホスホルアミダイトカップリングサイクルを使用することができる。両タイプのホスホルアミダイト試薬に対して活性化剤（通常、テトラゾール）が依然同じであるため、追加のカップリング試薬は不要である。１回に８つの異なるホスホルアミダイト試薬を支持できる自動合成装置がすでに広く入手可能なため、４つのリンカーホスホルアミダイトと４つの従来のホスホルアミダイトの１セットを同時に取り付けることは問題とならない。第１のヌクレオシドをエステル又はアミド結合を介して自動的に結合させる本発明者等の従来法は、５つの余分な試薬（４つのヌクレオシドと１つのカップリング試薬）を要し、且つかかる多量の余分な試薬を収容する合成装置は容易に入手できないので、追加されるリンカーホスホルアミダイトが４つしか必要ではないということは、この従来法よりも遥かに有利である。
【００２７】
合成終了後、予め誘導体化された担体ですでに使用したものと同じ試薬と条件を用いて、生成物を切断することができ、所望の３’−水酸基末端を有する生成物が遊離することになる。ホスホルアミダイトリンカーのホスフェート部分は、担体に付着したままであり、廃棄される。リンカーホスホルアミダイトで使用されたリンカーアームによっては、この切断工程は非常に速くなり得る。例えば、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸を含有するリンカーホスホルアミダイトを使用すれば、室温の水酸化アンモニウムでほんの２分間処理すれば十分である。担体から遊離したら、これらの生成物を従来法によりさらに脱保護しなければならないが、更なる脱リン酸化工程は不要であり、３’−リン酸化生成物と３’−ＯＨ生成物の混合物は生成しない。
【００２８】
複数のオリゴヌクレオチドも同じ合成カラムで直列に生成される（図４）。この方法では、第１のオリゴヌクレオチド配列が、５’−末端水酸基を有する、すなわち５’−ジメトキシトリチル基を持たない担体上に合成される。次いで、第１のオリゴヌクレオチドの末端５’−水酸基は、第２のオリゴヌクレオチド配列の３’−末端塩基を含有するホスホルアミダイトリンカーに対する反応部位として働くことができる。この第２の配列は、調製された第１の配列とは同じでも異なってもよい。ホスホルアミダイトリンカーを用いて最初の塩基を付加した後、次いで第２の配列の残部を合成するために従来のホスホルアミダイト試薬を使用する。総塩基数が固相担体の細孔容積を超えるまで、更なる配列を担体上に蓄積し続けてもよい。このようにして調製された複数のオリゴヌクレオチドは、第１の配列を担体表面から切断する試薬で処理したときに、相互及び担体表面から同時に遊離することが好ましい。あるいは、オリゴヌクレオチド生成物間で異なるホスホルアミダイトリンカーを使用すると、個々のホスホルアミダイトリンカーの切断条件を調節することにより、担体から生成物を選択的に且つ順次遊離することが可能になる。第１のオリゴヌクレオチド配列を担体に付着させるために使用したホスホルアミダイトリンカーのホスフェート残基は、使用した担体と共に廃棄してもよい。しかし、後続のホスホルアミダイト付加体リンカーのホスフェート残基は、先行するオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合されたままであろう。ホスホルアミダイトリンカーの選択によっては、ある残留リンカー部分が５’−末端ホスホジエステル基を生成するホスフェート残基に結合したままになることもある。こうした５’−ホスフェートジエステル末端修飾は不自然ではあるが、それらが存在しても、ＤＮＡ配列決定やＰＣＲプライマーとして３’−末端修飾にのみ感受性のあるオリゴヌクレオチドを使用することを妨げず、そのためこのようなオリゴヌクレオチドは、多くの用途に重大な影響を与えずに、なお使用することができる。好ましいホスホルアミダイトリンカー試薬としては、切断と同じ条件下で５’−末端ホスフェート基から脱離する結合基が挙げられる。このホスホルアミダイトリンカーは、天然の５’−モノホスフェート及び天然の３’−ＯＨ基を先行オリゴヌクレオチド末端上に生成する。好ましいホスホルアミダイトリンカーを用いて生成されたオリゴヌクレオチドは、５’−末端の関与する連結反応と３’−末端の関与するプライマー伸張反応の両方に関わることができる。
【００２９】
したがって、本発明の一側面は、式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化６１】
（式中、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化６２】
（式中、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化６３】
（式中、ＧはＣ又はＮであって、少なくとも１つのＧはＮである）、及び
【化６４】
から選択され、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物に関する。
【００３０】
前記リン酸化部分は、
【化６５】
（式中、
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基でもよく、あるいはＲ１１及びＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択されることが好ましい。
【００３１】
好ましくは、前記保護基は、置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−３０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ５−４０アルカリール基、Ｃ１−２０ハロアルキル基、Ｃ５−３０ハロアリール基、Ｃ３−１０ハロシクロアルキル基、Ｃ１−２０ニトロアルキル基、Ｃ５−２０ニトロアリール基、Ｃ３−１０ニトロシクロアルキル基、Ｃ１−２０チオアルキル基、Ｃ５−３０チオアリール基、Ｃ３−１０チオシクロアルキル基、Ｃ１−２０シアノアルキル基、Ｃ５−３０シアノアリール基、Ｃ３−１０シアノシクロアルキル基、Ｃ１−２０アルキルシリル基、及びＣ５−３０アリールシリル基を含む群から選択される。より好ましくは、前記保護基は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５− １０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される。
【００３２】
より好ましいリン酸化部分は、
【化６６】
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、上で定義した通りである）である。好ましくは、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは１以上のハロゲン、ニトロ基、チオ基、及びシアノ基で必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１１とＲ１２は同一である。最も好ましくは、Ｒ１１及びＲ１２それぞれはｉ−プロピルである。さらに好ましくは、Ｒ１０はＣ１−１０シアノアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ１０はシアノエチル基である。
【００３３】
式Ｉの化合物において、Ｑ１は有機部分である。好ましくは、この有機部分は、１以上の酸素、窒素、ハロゲン、及び硫黄で必要に応じて置換されたＣ１−３００炭化水素部分である。
【００３４】
ひとつの好ましい実施態様において、Ｑ１は、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基（ａｌｋｙａｒｙｌ）、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される。
【００３５】
別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式
−ＣＨ２−ＣＨ２−
で表される。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
で表される。
【００３７】
さらに別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式：
【化６７】
（式中、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン化物、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；Ｒ２０及びＲ２１は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；Ｑ４は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２、及び−Ｎ（Ｒ）−からなる群から選択され；Ｒは、水素、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；ｒは０、１、又は２であり；Ｑ５及びＱ６のうち一方は、水素、ハロゲン化物、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基からなる群から選択され、Ｑ５及びＱ６のうち他方は次式：
【化６８】
（式中、ｐは０又は１であり、Ｑ７は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（０）２−、及び−Ｎ（Ｒ）−からなる群から選択され、Ｒは水素、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され、Ｒ２２及びＲ２３は同一であるか又は異なり、水素、ハロゲン、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基からなる群から選択され、ｓは０、１、又は２である）で表される）
で表される。
【００３８】
式１の化合物における極めて好ましい変数の組み合わせは以下の通りである。
【００３９】
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑはすべて１であり、
Ｑ１は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
【化６９】
（式中、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン化物、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；Ｒ２０及びＲ２１は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；Ｑ４は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、及び−Ｎ（Ｒ）−からなる群から選択され；Ｒは、水素、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され；ｒは０、１、又は２であり；Ｑ５及びＱ６のうち一方は、水素、ハロゲン化物、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基からなる群から選択され、Ｑ５及びＱ６のうち他方は次式：
【化７０】
（式中、ｐは０又は１であり、Ｑ７は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（０）２−、及び−Ｎ（Ｒ）−からなる群から選択され、Ｒは水素、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基を含む群から選択され、Ｒ２２及びＲ２３は同一であるか又は異なり、水素、ハロゲン、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、及び置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ４０アルキルアリール基からなる群から選択され、ｓは０、１、又は２である）で表される）
から選択され、
Ｑ２は酸素であり、
Ｑ３は−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はすべて水素であり、
Ｚ１は、以下の構造：
【化７１】
（式中、Ｒ１０は２−シアノエチルであり、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれイソプロピルである）を有する。
【００４０】
式の化合物は式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの化合物：
Ｘ１−ＯＨ （ＩＩ）
Ｈ−Ｑ−Ｑ−Ｒ２４ （ＩＩＩ）
ｚ２ （ＩＶ）
（式中、Ｒ２４は水素又は保護基であり、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）を一緒に反応させる工程を備える方法によって生成してもよい。
【００４１】
１つの好ましい実施態様においては、Ｒ２４は保護基であり、前記方法は、式ＩＩ及びＩＩＩの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＶの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える。
【００４２】
別の好ましい実施態様においては、Ｒ２４は水素であり、前記方法は、式ＩＩＩ及びＩＶの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＩの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える。
【００４３】
保護基を使用することは当該技術分野では従来から行われており、その選択は当業者には周知である。したがって、本明細書で特に言及していない他の保護基を本発明の範囲から逸脱することなく使用することができる。
【００４４】
本発明の別の側面は、１以上の目的のオリゴヌクレオチドを合成するために、式Ｉの化合物を使用することに関する。このことは、
（ｉ） 式Ｉの化合物を式ＶＩＩＩ：
【化７２】
（式中、Ｘは−Ｏ−及び−ＮＲ１９−から選択され、Ｒ１９は水素、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択される）
で表される担体材料と反応させて、
式ＩＸ：
【化７３】
で表される第１の誘導体化された担体を生成する工程と、
（ｉｉ） 式ＶＩの第１の誘導体化された担体材料を、第１の目的のオリゴヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、少なくとも１つのヌクレオチドと反応させる工程と、
（ｉｉｉ） 式ＩＸの化合物から第１の対象オリゴヌクレオチドを切断する工程とを備える方法により達成される。当業者であれば理解できるように、Ｚ１に選ばれるリン酸化部分の選択次第で、リンの酸化状態はＰＩＩＩからＰＶに変化し得る。
【００４５】
オリゴヌクレオチド合成に使用する他の試薬、一般的な反応条件、及び装置は、この主題に関する以下の概説記事／テキストに見出せるであろう。
【００４６】
【参考文献２】
また、１以上の国際公開第９７／２３４９７号［Ｐｏｎ他（Ｐｏｎ ＃１）］、国際公開第９７／２３４９６号［Ｐｏｎ他（Ｐｏｎ ＃２）］、国際公開第００／０１７１１号［Ｐｏｎ他（Ｐｏｎ ＃３）］、及び同時係属中の２００１年９月５日出願の米国特許出願［Ｐｏｎ他（Ｐｏｎ ＃４）］も参照されたい。
【００４７】
本発明の実施態様を、以下の例を参照して説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではなく、又はそのように解釈してはならない。
【００４８】
例１− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールスクシネート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト ４ａ
５′−ジメトキシトリチルチミジン１（３．２７ｇ、６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１．１０ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（４０ｍｌ）に溶解して、室温で（２日間）撹拌した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムに再溶解して、水（２ｘ）及び飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。このクロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥して留去すると粗５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（４．５０ｇ）が得られ、さらに精製することなく使用した。
【００４９】
５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（２．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）及びピリジン（２．９ｍｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．６４ｇ、８．６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（１．２６ｍｌ、１５．８ｍｍｏｌ）に溶解した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．２５ｍｌ、４．５ｍｍｏｌ）を添加して、この溶液を室温で２０分間撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、水、飽和ＮａＣｌ水溶液及び水で順番に洗浄した。このクロロホルム溶液を濃縮してシリカゲルクロマトグラフィ（２％メタノール／クロロホルム）で精製すると所望する５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールスクシネート） ３ａが３１％の収率（９３５ｍｇ）で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール／クロロホルム）Ｒｆ＝０．３８。
【００５０】
或いは、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（１．２９ｇ、２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）及びピリジン（１．３ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（０．７４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．５７ｍｌ、７．２ｍｍｏｌ）に溶解した。室温で（１０分間）撹拌した後、この溶液をシリンジでエチレングリコール（１１．２ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）に滴下した。撹拌後（３０分）、溶媒を留去に濃縮して、クロロホルムに再溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液及び水（２ｘ）で洗浄した。次いで、１〜２％メタノール／クロロホルムを使用したシリカゲルクロマトグラフィで粗生成物を精製した。３ａの収量は１．０４５ｇ（７６％）であった。
【００５１】
アルコール３ａ（９２３ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．９１ｍｌ、５．２ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３９ｍｌ、１．７５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温で１時間撹拌した。この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄して、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５から開始してトリエチルアミン／クロロホルム５：９５で終了させることによって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ａが８９％（１．０６ｇ）の収率で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、２０％ヘキサン／酢酸エチル）Ｒｆ＝０．６５。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５０．７５４及びδ１５０．２６９。
【００５２】
例２− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールジグリコレート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト４ｂの合成
５′−ジメトキシトリチルチミジン １（１．６３ｇ、３ｍｍｏｌ）、無水ジグリコール酸（５２２ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（７３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｍｌ）に溶解して、室温で（２日間）撹拌した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムに再溶解して、水（２ｘ）、飽和ＮａＣｌ水溶液及び水で洗浄した。このクロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥して留去すると粗５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ジグリコレート ２ｂ（１．９３ｇ、９８％）が得られ、さらに精製することなく使用した。
【００５３】
５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ジグリコレート ２ｂ（１．９３ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（４０ｍｌ）及びピリジン（１．９ｍｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．０９ｇ、５．７ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．８４ｍｌ、１０．５ｍｍｏｌ）に溶解した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．１６ｍｌ、２．９ｍｍｏｌ）を添加して、この溶液を室温で２０分間撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、水及び飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ（２％メタノール／クロロホルム）で精製すると所望する５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールジグリコレート） ３ｂが５３％の収率（１．０９ｇ）で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール／クロロホルム）Ｒｆ＝０．３５。
【００５４】
アルコール ３ｂ（８３０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．８０ｍｌ、４．６ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３４ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温で１時間撹拌した。この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄して、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５から開始してトリエチルアミン／クロロホルム５：９５で終了させることによって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ｂが６７％（７２０ｍｇ）の収率で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、２０％ヘキサン／酢酸エチル）Ｒｆ＝０．６５。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５０．７７４及びδ１５０．６９１。
【００５５】
例３− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールハイドロキノンジアセテート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト ４ｃの合成
５′−ジメトキシトリチルチミジン １及びハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸を使用して、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ、ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｕｎｉｔ ３．２、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔ．Ｐｏｎ、「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００に記載されているように、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−ジアセテートピリジニウム塩又はトリエチルアンモニウム塩 ２ｃを調製した。２ｃ（２．５０ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）及びピリジン（１．９ｍｌ）に溶解した。塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．１２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．８６ｍｌ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．１７ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を３０分間撹拌した。反応は不完全で、さらにエチレングリコール（０．０８５ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を一晩放置した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムで希釈して、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、及び水（２ｘ）で洗浄した。粗生成物を０〜３％メタノール／クロロホルムを使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製すると、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールハイドロキノンジアセテート） ３ｃが収率３５％（８３０ｍｇ）で得られた。
【００５６】
或いは、２ｃ（２．１３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１．６ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解した。塩化ｐ−トルエンスルホニル（０．９３ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．７２ｍｌ、９．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を室温で（１０分間）撹拌した。この溶液をシリンジでエチレングリコール（１４ｍｌ、２５０ｍｍｏｌ）に撹拌しながら滴下した。さらに３０分間撹拌後、反応物を留去に濃縮して、クロロホルムに再溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液及び水（２ｘ）で洗浄した。粗物質をクロロホルムに溶かした０〜２％（ｖ／ｖ）メタノール勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製したところ３ｃが得られた（７１９ｍｇ、収率３６％）。
【００５７】
ジイソプロピルエチルアミン（０．３８ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）及びアルコール ３ｃ（３８２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１６ｍｌ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄し、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５（ｖ／ｖ／ｖ）から開始して、次にクロロホルムに溶かした５〜１０％のトリエチルアミン（ｖ／ｖ）によって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ｃが２７％（１２８ｍｇ）の収率で得られた。
【００５８】
例４− ＣＰＧ支持体からのリンカーホスホルアミダイトの切断速度
リンカーホスホルアミダイト ４ａ、４ｂ、及び４ｃを無水アセトニトリルに溶解して０．１Ｍ溶液を得た。この溶液をＰＥ／Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ 自動ＤＮＡ合成機の予備の塩基取付位置に入れた。非誘導体化長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）又は非誘導体化グリセロール細孔性ガラス（Ｇｌｙ−ＣＰＧ）支持体を含有する１μｍｏｌｅ規模の合成カラムを、ＤＮＡ合成用の通常のテトラゾール試薬、脱保護試薬、キャッピング試薬、及び洗浄試薬と共に装備した。リンカーホスホルアミダイト試薬をＣＰＧ支持体に結合させるために、１μｍｏｌｅ規模の塩基付加サイクルを１回実施した。いずれの場合も５′−ジメトキシトリチル保護基がヌクレオシドに残存した。
【００５９】
この合成カラムを合成機から取り外して、真空下で乾燥させた（１０分間）。ＣＰＧ支持体をカラムから取り出し、メタノール及びクロロホルムで再度洗浄して乾燥させた。保持されたヌクレオシドを測定するために各支持体の一部を計量してジメトキシトリチル分析を行った。さらに一部を計量して指定した時間室温の水酸化アンモニウムで処理した。次いで、この支持体を水、アセトニトリル、メタノール、及び最後にクロロホルムで洗浄した。この支持体を乾燥させて、残存した保持ヌクレオシドをジメトキシトリチル分析によって決定した。各リンカーホスホルアミダイトのリンカー切断量を表１に示した。
【００６０】
【表１】
表１の結果から、リンカーホスホルアミダイト試薬の切断速度は、従来のスクシネート、ジグリコレート、又はハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−ジアセテートリンカーアームによって結合したヌクレオシドの切断速度と同様であることがわかる。
【００６１】
例５− リンカーホスホルアミダイト試薬を使用した（Ｔｐ） ７ Ｔのオリゴヌクレオチド合成
オクタチミジン配列、ＴＴＴＴＴＴＴＴは、０．１Ｍリンカーホルホルアミダイト試薬４ａ〜ｃを使用して第１のヌクレオシドを添加すること以外は標準的１μｍｏｌｅ規模合成条件を使用して、ＰＥ／Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ合成機で調製した。非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ又はＧｌｙ−ＣＰＧ支持体を使用した。保持された最初のヌクレオシドは、第１のリンカーホスホルアミダイト結合サイクルによって遊離するジメトキシトリチル陽イオンの量を定量することによって測定した。総結合効率及び平均結合効率は、最初と最後のトリチルの色によって推定した。
【００６２】
合成後、トリチル−ｏｆｆ自動末端切断方法を使用して、支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離させた。４ａ〜ｂを使用して作製した配列は水酸化アンモニウムで６０分間自動処理して切断して、４ｃの配列は水酸化アンモニウムで５分間自動処理して切断した。収集した生成物の量は２６０ｎｍでのＵＶ吸収で測定した。結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
ＬＣＡＡ−ＣＰＧ支持体上で試薬４ａ〜ｃから調製した（Ｔｐ）７Ｔ生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析したところ、各オリゴヌクレオチドの質量は予測通りだった（Ｍ＋Ｈ、計算値２３７１．５７、測定値２３７３．０〜２３７４．６）。したがって、リンカーホスホルアミダイトから生成した生成物は、従来の合成法によって調製した生成物と同一であった。
【００６４】
例６− リンカーホルホルアミダイト試薬を使用したオリゴヌクレオチドｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴの合成
１７塩基長のＭ１３汎用プライマー配列ｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴは、０．１Ｍリンカーホルホルアミダイト試薬４ａ〜ｃを使用して第１のヌクレオシドを添加すること以外は標準的１μｍｏｌｅ規模合成条件を使用して、ＰＥ／Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ合成機で調製した。非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ又はＧｌｙ−ＣＰＧ支持体を使用した。保持された最初のヌクレオシドは、第１のリンカーホスホルアミダイト結合サイクルによって遊離するジメトキシトリチル陽イオンの量を定量することによって測定した。
【００６５】
合成後、トリチル−ｏｆｆ自動末端切断方法を使用して、支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離させた。収集した生成物の量を２６０ｎｍでのＵＶ吸収で測定した。次に、他の物質もまた回収できるかどうかを決定するために合成支持体に第２の自動切断サイクルを実施した。表３からわかるように、結果から８９〜９４％の間の生成物が第１の切断期間中に遊離することが示された。
【００６６】
【表３】
ＬＣＡＡ−ＣＰＧ支持体上で試薬４ａ〜ｃから調製したＭ１３プライマーオリゴヌクレオチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。いずれの場合も、生成物は予測通りの質量であった（Ｍ＋Ｈ、計算値５２２８．４１、測定値５２２５．７〜５２２８．２）。従来の予備誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ支持体上で同配列を制御して合成してもまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって同じ結果が得られることがわかった（Ｍ＋Ｈ、計算値５２２８．４１、測定値５２２９．３）。したがって、リンカーホスホルアミダイトから生成した生成物は、従来の合成法によって調製した生成物と同一であった。
【００６７】
例７− リンカーホスホルアミダイト合成による生成物と従来の予備誘導体化支持体から調製した生成物との比較
例５で調製した６種類の未精製オクタチミジン生成物の試料及び例６で調製した６種類の１７塩基長Ｍ１３汎用プライマー配列の試料を、２４％ポリアクリルアミド／７Ｍウレアゲルを使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。５′−ジメトキシトリチルチミジンで予備誘導体化した従来の長鎖アルキルアミンＣＰＧ支持体上で合成した標準オクタチミジン及びＭ１３汎用プライマー配列を比較として前記試料と並べて泳動した。さらに、非３′−水酸基ではなく３′−リン酸基を有するオクタチミジン及びＭ１３汎用プライマー配列を合成した。これらの試料もまた、前記試料と並べて泳動して、所望しない３′−リン酸残基を含有する可能性がある生成物を確認した。この結果によって、リンカーホスホルアミダイト生成物は標準生成物と同様に移動することが示された。３′−リン酸化オクタチミジンマーカーは、リンカーホスホルアミダイト生成物よりも早く移動した。３′−リン酸化１７塩基長配列もまた、非３′−リン酸化生成物よりも早く移動したが、この場合移動度の違いはそれほど多くない。
【００６８】
前記のオリゴヌクレオチドをまた、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）によって、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３−Ｄ ＣＥ装置、１００μｍｘ４８．５ｃｍ ＰＶＡコーティングキャピラリー、ＨＰ置換可能オリゴヌクレオチドポリマーＡ及びＨＰオリゴヌクレオチド緩衝液を使用して分析した。５′−ＤＭＴ−Ｔ−３′−コハク酸ホスホルアミダイト ４ａで作製したＭ１３汎用プライマー配列及び同配列を有する３′−リン酸化オリゴヌクレオチドの混合物のＣＧＥ分析によって、３′−リン酸化配列の移動は異なっており、リンカーホスホルアミダイトから得られた生成物から完全に分離することが示された。
【００６９】
ポリアクリルアミドゲル及びＣＧＥ両方の結果から、リンカーホスホルアミダイトで作製した生成物の移動は予備誘導体化支持体上で作製した標準物と一致し、３′−リン酸化マーカーの移動とは異なることが示された。したがって、いずれの場合においても、オリゴヌクレオチドが支持体から遊離するとき、リン酸残基は生成物の３′−末端から切断されていた。
【００７０】
例８−タンデム合成用リンカーホスホルアミダイトの合成（図６）
２，２′−ジスルホニルジエタノールの６５％水溶液（１０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（４ｘ２０ｍｌ）と共に乾燥するまで留去して、無水ピリジン（２５ｍｌ）に再溶解した。次に、５′−ジメトキシトリチル−Ｎ−保護２′−デオキシリボヌクレオシド−３′−Ｏ−コハク酸ヘミエステルトリエチルアンモニウム塩（２．０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（２．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．６ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で（１０分間）撹拌したところ、ＴＬＣ（５％メタノール／ＣＨＣｌ３）で反応が完了したことが示された。この溶液を留去によって濃縮してピリジンを除去し、ＣＨＣｌ３で希釈して、水（４ｘ）で洗浄して乾燥するまで留去した。次に、粗生成物 ５を１〜３％メタノール／ＣＨＣｌ３を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。収率：Ｂ＝ＡＢｚ、７３％、Ｂ＝ＣＢｚ、８０％、Ｂ＝ＧｉＢｕ、７３％、及びＢ＝Ｔ、７６％。ＥＳＩ質量分析：Ｂ＝ＡＢｚ、Ｍ＋Ｎａ計算値９１７．９５、Ｂ＝ＣＢｚ、Ｍ＋Ｎａ計算値８９２．９２、測定値８９２、Ｂ＝ＧｉＢｕ、Ｍ＋Ｎａ計算値８９８．９３、測定値＝８９８、及びＢ＝Ｔ、Ｍ＋Ｎａ計算値８０３．８５、測定値８０３。
【００７１】
ヌクレオシド ５（１．２８ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（１５ｍｌ）に溶かしたジイソプロピルエチルアミン（５．０ｍｍｏｌ）の溶液に溶解した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．６６ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で（１時間）撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）で洗浄した。このクロロホルム溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィによってジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５５：３から４２：５３：５、その後５％トリエチルアミン／ＣＨＣｌ３を使用して生成物 ６を精製した。収率：Ｂ＝ＡＢｚ、４７％、Ｂ＝ＣＢＺ、５０％、Ｂ＝ＧｉＢｕ、４９％、及びＢ＝Ｔ、５６％。
【００７２】
例９− リンカーホスホルアミダイト ６を使用した１個のオリゴヌクレオチド合成
リンカーホスホルアミダイト試薬 ６の０．１〜０．５Ｍ溶液を予備の塩基取付位置５〜８に入れること以外は標準的方法による１μｍｏｌｅ規模の合成のために、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成機を設計した。アミノ基１０２μｍｏｌ／ｇを含有する非誘導体化長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）を含有する合成カラムを予備誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧの代わりに装備した。次に、合成機を表４に示した配列を調製するようにプログラムした。
【００７３】
合成後、ＮＨ４ＯＨを使用して生成物を支持体から自動的に切断し（６０分間）、加熱することによって（５５°、１６時間）脱保護した。粗生成物をＵＶによって定量し、結合収率はトリチルの色によって推定し、配列の同一性はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した（表４）。
【００７４】
【表４】
例１０− ５′−リン酸化オリゴヌクレオチドの合成
末端に５′−リン酸基を有する１７塩基長オリゴヌクレオチド配列、５′−ｐ−ｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴを例９のように調製したが、他の結合サイクルは試薬６（Ｂ＝Ｔ）を使用して実施して、配列末端に他のチミジンヌクレオシド及び５′−リン酸を添加した。次いで、この配列を支持体から切断し、例９のように脱保護した。この段階の間、末端チミジンヌクレオシドは１７マーの末端から切断され、５′−リン酸残基を遊離した。同一の配列はまた、従来の「リン酸Ｏｎ」ホスホルアミダイト試薬を使用して合成し、末端５′−リン酸基を添加した。２種の生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動による移動度は同一であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法もまた使用して、２個のオリゴヌクレオチドの正確で同一の構造であることを確かめた。６でリン酸化されたオリゴヌクレオチド、Ｍ＋Ｈ計算値５３０８．４、測定値５３０６．１、「リン酸Ｏｎ」試薬でリン酸化されたオリゴヌクレオチド、Ｍ＋Ｈ計算値５３０８．４、測定値５３０８．８。
【００７５】
例１１− ５′−リン酸化トリヌクレオチドのタンデム合成
アセトニトリルに溶かしたリンカーホスホルアミダイト ６（Ｂ＝Ｔ）の０．１Ｍ溶液を３９４ＤＮＡ合成の塩基取付位置＃８に入れた。リン酸Ｏｎホスホルアミダイトの溶液を位置＃５に入れた。他の試薬は全て従来の合成法通りに入れた。ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸リンカーアームによってＬＣＡＡ−ＣＰＧに結合させた５′−ジメトキシトリチルチミジン３４ｍｇを含有する合成カラムを使用した。次に、１回のタンデム合成で、配列５ＡＡ８ＧＧ８ＣＣ８ＴＴＴを入れることによって４種類のトリヌクレオチド、ｄ（ｐＡＡＴ）、ｄ（ｐＣＣＴ）、ｄ（ｐＧＧＴ）、及びｄ（ｐＴＴＴ）を調製するように合成機をプログラムした。合成後、ＮＨ４ＯＨを使用して（６０分）生成物を支持体から自動的に切断し、脱保護した（１６時間、５５°）。収率：７０．６Ａ２６０単位。
【００７６】
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴヌクレオシドに対応する６のリンカーホスホルアミダイト溶液をそれぞれ３９４ＤＮＡ合成機の位置＃５、６、７及び８に入れた。５′−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシシチジンで誘導体化した１０００Å低保持ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１０．７μｍｏｌ／ｇ）３４．１ｍｇを含有する合成カラムを装備した。次に、１アミノ酸のコドンにそれぞれ対応する以下の２０個のトリヌクレオチド−５′−リン酸、ｄ（ｐＡＡＡ）、ｄ（ｐＡＡＧ）、ｄ（ｐＡＣＴ）、ｄ（ｐＡＴＧ）、ｄ（ｐＡＴＣ）、ｄ（ＣＡＣ）、ｄ（ｐＣＡＴ）、ｄ（ｐＣＣＣ）、ｄ（ＣＧＴ）、ｄ（ｐＣＴＣ）、ｄ（ＧＡＡ）、ｄ（ｐＧＡＧ）、ｄ（ｐＧＣＴ）、ｄ（ｐＧＧＴ）、ｄ（ｐＧＴＴ）、ｄ（ｐＴＡＧ）、ｄ（ｐＴＣＴ）、ｄ（ｐＴＧＧ）、ｄ（ｐＴＧＣ）、ｄ（ｐＴＴＣ）を、配列ＡＡ５ＡＡ６ＡＣ８ＡＴ６ＡＴ７ＣＡ７ＣＡ８ＣＣ７ＣＧ８ＣＴ７ＧＡ５ＧＡ６ＧＣ８ＧＧ８ＧＴ８ＴＡ６ＴＣ８ＴＧ６ＴＧ７−ＴＴＣを入れることによって１回のタンデム合成で調製するように合成機をプログラムした。トリチル−ＯＮ／マニュアルモードで前記合成を完了した後、位置＃５のリンカーホスホルアミダイト試薬をリン酸Ｏｎホルホルアミダイトと置き換えて、他の合成サイクルを実施して末端５′−リン酸基を添加した。次に、ＮＨ４ＯＨを使用して（６０分間）生成物を支持体から自動的に切断し、脱保護した（１６時間、５５°）。収率：２３．６ Ａ２６０単位。
【００７７】
例１２− スクシニルスルホニルジエタノール（ｓｕｃｃ−ＳＥ）リンカーアームの加水分解
この例では、スルホニルジエタノール（ＳＥ）リンカーホスホルアミダイトが迅速に加水分解されることを示す。この切断の速さは、前述の例３で使用したリンカーで認められた切断とほとんど同じである。
【００７８】
アセトニトリルに溶かした５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシニルスルホニルジエタノールホスホルアミダイト ６の０．１Ｍ溶液をＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成機の予備の塩基取付位置に入れた。合成カラムには非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを使用した。他には変更していない１μｍｏｌｅ規模の合成サイクルを使用して２種類の合成を実施した。
【００７９】
第１の場合では、トリチル−ｏｎ／マニュアル末端法を使用したホスホルアミダイト結合サイクルを１回のみ実施して、支持体にＳＥリンカーホスホルアミダイトを添加した。ＣＰＧを除去して、支持体の一部をジメトキシトリチル定量分析することによってジメトキシトリチル含量が２０．３μｍｏｌ／ｇであることを測定した。次に支持体の他の部分を２８％水酸化アンモニウム水溶液で１分、５分及び１０分間処理した。メタノール及びクロロホルムで洗浄後、支持体をジメトキシトリチル分析したところ、１分、５分及び１０分後に生じた加水分解はそれぞれ９２％、９６％及び９８％であることが示された。
【００８０】
第２の場合では、トリチル−ｏｆｆ／マニュアル末端法を使用して２１塩基長配列ｄＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴを調製した。リンカーホルホルアミダイトの最初の保持量をジメトキシトリチル分析によって測定したところ２０μｍｏｌ／ｇで、合成全体の平均結合効率は９９．８％であった。次に、特定の自動化末端方法を使用して、水酸化アンモニウム２８％水溶液を少量ずつ収集バイアルに１分間隔で１５分間添加した。この合成法によって３′−ＯＨ遊離末端を有するオリゴヌクレオチドが生成した。水酸化アンモニウム各画分を手動で収集し、５５°で一晩加熱することによって脱保護し、留去してアンモニアを除去し、次いで２６０ｎｍのＵＶで定量した。次いで、支持体から遊離したＡ２６０累積量を時間に対してプロットして、加水分解の程度を測定した。この実験によって、１分、５分及び１０分後それぞれに生じた加水分解は６５％、９４％及び９８％であることが示された。したがって、支持体からの２１塩基長オリゴヌクレオチド配列の切断は、１個のヌクレオシドの切断よりもほんのわずかに遅い。
【００８１】
第３の実験では、スルホニルジエタノール結合を含有する市販の「リン酸−Ｏｎ」ホスホルアミダイト試薬を使用して、非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを含有する合成カラムをリン酸化した。次に、３′−リン酸化末端を含有し、３′−ＯＨ末端を含有しない２１塩基長配列ｄＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴをこの支持体上で調製した。最初に保持されるリン酸−Ｏｎ試薬は３３μｍｏｌ／ｇで、合成全体の平均結合効率は９９．８％であった。次いで、前述のように水酸化アンモニウム２８％水溶液中での加水分解速度を測定した。結果から、１分、５分及び１０分後それぞれに生じた加水分解は６４％、９８％及び９９％であることが示された。
【００８２】
これらの結果によって、より安定なコハク酸結合を加水分解するよりも、より不安定なスルホニルジエタノール官能基を除去することによって、リンカーホスホルアミダイトの切断が生じることが示される。観察された切断速度（５分で９８％）は、ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸リンカーアームの切断速度（２分で９８％）とほとんど同じで、従来のコハク酸リンカーアームの切断速度（約２時間で９８％）より著しく速い。したがって、リンカーアームを含有するスルホニルジエタノールは、迅速な切断条件を必要とする適用に適している。
【００８３】
例示的な実施態様及び例を参照にして本発明を説明してきたが、この説明は限定した意味で解釈されるものではない。したがって、当業者にとって、例示的実施形態の様々な変更、並びに本発明の他の実施形態は、この説明を参照にすれば明らかであろう。したがって、添付のクレームはこのような変更又は実施形態を包含するものと考えられる。
【００８４】
個々の出版物、特許又は特許明細書が具体的かつ個別的にその全体を参考文献として援用するものと表示される場合と同等に、本明細書に関する全ての出版物、特許及び特許明細書は、その全体が参考文献として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
本発明の実施態様を添付の図面を参照して説明するが、同一の数字は同一の要素を示す。図１ａは、ヌクレオシドを担体に付ける従来の合成法を示したものである。
【図１ｂ】
図１ｂは、オリゴヌクレオチドを直列に合成する従来手法を示したものである。
【図２】
本方法の好ましい実施態様を示す。
【図３】
本方法の好ましい実施態様を示す。
【図４】
オリゴヌクレオチドを直列に合成する本方法の好ましい実施態様を示す。
【図５】
下記例１〜３に使用する合成ルートを示す。
【図６】
直列合成用の好ましい試薬の合成について示したものである。
【関連出願の相互参照】
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、本明細書にその内容を参考文献として援用した仮出願番号６０／２３１３０１号（２０００年９月８日出願）の利益を主張する。
【０００２】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、その態様の１つにおいて、オリゴヌクレオチド合成に有用な一連の新規リン含有化合物に関する。他の態様において、本発明はオリゴヌクレオチド合成におけるこれらの化合物の使用に関する。
【０００３】
従来技術の説明
オリゴヌクレオチド類は、生化学及び分子生物学の試薬として広く使用されるようになってきた（Ｇ．Ｍ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。これらの物質は、ＤＮＡ配列決定用プライマー（Ｃ．Ｊ．Ｈｏｗｅ ａｎｄ Ｅ．Ｓ．Ｗａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８９、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）、ポリメラーゼ連鎖反応又は「ＰＣＲ」（Ｎ．Ｓｍｙｔｈ Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、１９９２、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １、５８〜７２）プライマー、ＤＮＡプローブ（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）として、及び合成遺伝子又は改変遺伝子の構築（Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）において使用されている。改変オリゴヌクレオチドには、診断薬及び治療薬としての広い用途が見出されている。下記の参照文献を参照されたい。
【０００４】
【参考文献１】
【０００５】
化学的固相合成法は、必要とされる数多くの合成オリゴヌクレオチドを生成できる唯一の方法であり、ホルホルアミダイトカップリング化学反応を用いた自動合成法（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ、１９９２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １２、２２２３〜２３１１）が、好ましい合成法となった。固相合成法の第１段階は、ヌクレオシド残基を不溶性支持体、たとえば細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリスチレンビーズの表面に共有結合によって結合させることである（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０００、Ｕｎｉｔ ３．１、Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この結合は、支持体の表面上でオリゴヌクレオチドを合成するために必要な全ての化学的段階に対して耐性でなければならない。さらに、この結合は支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離するために合成完了後に切断可能でなければならない。
【０００６】
支持体から遊離した生成物は、十分に定義され、且つその後の酵素反応に関与可能な（すなわちポリメラーゼなどの酵素によって認識される）末端を有することも重要である。固相オリゴヌクレオチド合成の好ましい方法ではいずれも、３′末端残基を支持体に結合させ、オリゴヌクレオチド配列を３′から５′方向へ組み立てる。支持体から切断した後は３′−水酸基が望ましいが、これは酵素的切断によって生じる構造と一致するからである。３′末端リン酸はポリメラーゼによって延長することができず、このようなオリゴヌクレオチドはＰＣＲ又は配列決定用プライマーとしても機能することができないので不十分である。
【０００７】
前記リンカーの必要条件は、カルボン酸又はジカルボン酸リンカーアームを使用し、第１のヌクレオチド残基をエステル結合によって３′−水酸基に結合させることによって満たされる。合成後、このエステル結合を水酸化アンモニウムで加水分解すると、支持体から所望する３′−ＯＨ官能基を備えたオリゴヌクレオチドが遊離する。このような手段によって支持体にヌクレオチドを結合させる方法は、図１ａ及び図１ｂで示した従来技術に例示されているようによく知られている。このようなアプローチでは、ジカルボン酸リンカーアーム、たとえばコハク酸、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸、ジグリコール酸、シュウ酸、マロン酸などが頻繁に使用される。
【０００８】
しかし、支持体にカルボン酸エステル又はアミド結合を形成するために必要な化学反応は、オリゴヌクレオチド配列を作製するために必要なホスホルアミダイト化学反応とは異なる。したがって、ヌクレオシド結合段階は通常、自動化合成とは別に実施する。自動化合成に先立って、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はその他の微量ヌクレオシドを含有した予め正確に誘導体化した支持体を選択しなければならない。オリゴヌクレオチド数が少ないときにはこれで十分であるが、異なる配列を９６ウェルプレートなどで多数合成するときは面倒で、間違いの原因となり得る。ホスホルアミダイト合成サイクルの直前に自動的にエステル化／アミド化段階を実施する迅速な結合試薬が開発されたが（Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、Ｓ．Ｙｕ ａｎｄ Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、１０５１〜１０５７ 及びＲ．Ｔ．Ｐｏｎ ａｎｄ Ｓ．Ｙｕ、１９９９、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１７７８〜１７８０参照）、これらの試薬にはエステル化化学反応並びにホスホルアミダイト化学反応を実施するために特別に変更したＤＮＡ合成機が必要である。
【０００９】
市販の自動装置はホスホルアミダイト合成のためのみに設計されているので、単一の化学結合反応のみを使用する方法がより望ましい。この要求を満たすために、１個の遊離水酸基と１個の保護されているか、又は支持体に結合した水酸基を有し、ジオール部分を含有する様々な「汎用」固相支持体が開発されてきた（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２０００、Ｕｎｉｔ ３．１、Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。図１〜３を参照のこと。このアプローチでは、オリゴヌクレオチド配列を合成するために使用された同ヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト試薬を使用して第一のヌクレオシド残基を支持体に結合させる。しかし、これによってオリゴヌクレオチドは３′−エステル結合ではなく３′−リン酸結合によって支持体に結合するようになる。したがって、支持体から切断することによって最初に生成するのは３′−リン酸化生成物である。所望する３′−ＯＨ末端の形成には、他の試薬が必要であるか、又は３′−リン酸基を除去するために脱保護の時間を延長することが必要である。脱リン酸化反応はまた、定量的ではなく、そのため生成物の混合物が生じる。したがって、このアプローチは処理時間が長く、所望する３′−ＯＨ生成物の収率が低く、最終生成物中に３′がリン酸化された配列とリン酸化されていない配列が混合しているため、満足のいくものではない。
【００１０】
したがって、現在まで進歩はしてきたにもかかわらず、まだ改善の余地が残されている。具体的には、ホスホルアミダイトカップリング化学反応を使用する利点と、前述した「正確に予め誘導体化された支持体」を使用する必要なく効率的に自動合成する利点とを兼ね備えた新規オリゴヌクレオチド合成法を得ることが望まれる。
【００１１】
【発明の概要】
本発明の一つの目的は、従来技術の上記欠点の少なくとも１つを取り除く又は軽減することである。
【００１２】
本発明の一つの目的は、オリゴヌクレオチド合成に有用な新規リン含有化合物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、新規オリゴヌクレオチド合成方法を提供することである。
【００１４】
したがって、その一側面において、本発明は式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化４７】
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化４８】
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化４９】
【化５０】
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物を提供する。
【００１５】
その別の側面において、本発明は式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化５１】
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化５２】
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化５３】
【化５４】
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つは電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物を生成する方法であって、
式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの化合物：
Ｘ１−ＯＨ （ＩＩ）
Ｈ−Ｑ−Ｏ−Ｒ２４ （ＩＩＩ）
Ｚ２ （ＩＶ）
（式中、Ｒ１８は保護基であり、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）
を反応させる工程を備える方法を提供する。
【００１６】
その別の側面において、本発明は、式Ｖａ又は式Ｖｂ：
【化５５】
Ｘ１は、以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化５６】
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−０−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化５７】
【化５８】
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数であり、
Ｒ２５は水素又は保護基である）
で表される誘導体化されたヌクレオシドを生成する方法であって、
式ＩＩ及びＶＩで表される化合物：
【化５９】
を、式ＶＩＩａ（式Ｖａのヌクレオシドを生成する場合）又はＶＩＩｂ（式Ｖｂのヌクレオシドを生成する場合）で表される化合物：
【化６０】
【００１７】
このように、本発明者等は、カルボン酸リンカーアームの易切断性を、単一ホスホルアミダイトの汎用担体カップリング化学反応と組み合わせる新規手法を開発した。この手法は、一端に３’−エステル結合を介して結合した保護されたヌクレオシドを、他端に反応性ホスホルアミダイト基又は他のホスフェート前駆体基を有する二官能リンカーアームを含有する新しい一群のホスホルアミダイト試薬（リンカーホスホルアミダイト）の合成を必然的に伴う（図２及び３参照）。前記リンカーホスホルアミダイト上のホスホルアミダイト基は、中間リンカーアームを欠く従来のヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト試薬と同一条件下で活性化され、同様の反応性を有する。前記リンカーホスホルアミダイト内に含まれる３’−エステル結合は、予め誘導体化された担体上の結合に類似した諸特性を有する。このエステル結合は、後続する全ての合成工程に対して安定であるが、水酸化アンモニウムなどの切断試薬で処理すると加水分解される。これにより、所望の３’−水酸基末端を有するオリゴヌクレオチド生成物が遊離し、担体に付着した該試薬のホスフェート部分（その後廃棄される）が残る。
【００１８】
本明細書を通して、「オリゴヌクレオチド」という語は広い意味を有し、本来のオリゴヌクレオチド、主鎖が修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴ治療薬として有用なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びメチルホスホネート類縁体）、標識されたオリゴヌクレオチド、糖修飾オリゴヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド−ペプチド複合体などのオリゴヌクレオチド誘導体を包含するものである。
【００１９】
本明細書を通して、置換部分に言及するときには、置換の性質は本明細書に限定されるものではないが、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ５〜Ｃ３０アリール基、Ｃ５〜Ｃ４０アルカリール基（ａｌｋａｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）（前述の各炭化水素基は、それ自体が１以上のハロゲン、酸素、及び硫黄で置換されていてもよい）、ハロゲン、酸素、及び硫黄からなる群から選択される１以上の要素であり得る。さらに、「アルキル」という語は、本明細書を通して、単結合、１以上の二重結合、１以上の三重結合、及びこれらの混合物を有する炭化水素部分を包含する。
【００２０】
式Ｉの化合物は、担体材料上に所望配列のオリゴヌクレオチドを生成するのに有用である。本明細書では、「担体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」及び「担体材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）」という語は区別なく使用され、従来の固体担体を包含するものである。固体担体の性質は、特に限定されず、当業者に周知のものである。したがって、固体担体は無機物でもよい。好適な無機物の例として、これらに限定されるものではないが、シリカ、多孔質ガラス、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム、酸化鉄、酸化ニッケル）、及び１以上のこれら物質を含有する粘土からなる群から選択してもよい。あるいは、固体担体は架橋ポリマーなどの有機物でもよい。好適な架橋ポリマーの例として、これらに限定されるものではないが、ポリアミド、ポリエーテル、ポリスチレン、及びこれらの混合物からなる群から選択してもよい。本発明で使用する好ましい一つの固体担体は従来のものであり、細孔の調節されたガラスビーズ及びポリスチレンビーズから選択してもよい。
【００２１】
【好ましい実施態様の詳細な説明】
ホスホルアミダイト試薬は、通常、アルコールを、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミドクロライド、又はビス−（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスフィンなどの３価のホスファイトと反応させて調製する。得られるヌクレオシドホスホルアミダイト試薬はオリゴヌクレオチド配列の構築に使用できるので、保護された２’−デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、又は保護されていない３’−又は５’−水酸基の何れかを有するその他のヌクレオシド化合物は、この反応の最も一般的な基質である。しかし、アミノ又はチオール末端修飾剤などの他の多数の試薬、非ヌクレオチドスペーサー、蛍光色素、コレステロール又はビタミンＥなどの親油基、及びビオチンなどの非同位体標識も、アルコールに、次いでホスホルアミダイト試薬に変換される。これらの試薬では、安定なホスフェート結合を介してオリゴヌクレオチド配列にこの試薬を恒久的に結合させるために、ホスホルアミダイト基が反応基として使用される。
【００２２】
本発明の一側面においては、保護されたヌクレオシド又は遊離の水酸基を有する非ヌクレオシド末端修飾剤などの試薬は、カルボン酸リンカーアームにエステル化される。得られるエステル結合は、水酸化アンモニウム又は他の切断条件に曝されたときにその後切断される部位になるであろう。本発明のリンカーホスホルアミダイトは、この内部切断部位を有する点で、生成物からホスフェート基を決して分離しない従前のホスホルアミダイト試薬とは異なるものである。カルボン酸リンカーアームは、３価のホスファイトと反応して前記試薬をホスホルアミダイト試薬に転換できる第２の部位（例えば、水酸基）を有するべきである。したがって、前記リンカーはカルボン酸基及びアルコールの両者を有する任意の化合物であり得る（図２参照）。リンカーとなり得るものの例には、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸（ＨＭＰＢ）、３−（４−ヒドロキシメチルフェノキシ）プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、１０−ヒドロキシデカン酸、１２−ヒドロキシドデカン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸、又は１２−ヒドロキシステアリン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
従来から、固相オリゴヌクレオチド合成のリンカーアームは、コハク酸、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸、ジグリコール酸、シュウ酸、マロン酸などのジカルボン酸であり、それらの有用な諸特性は十分に確立されているため、本発明ではこれらのタイプのリンカーアームを継続使用することが望ましい。したがって、周知のジカルボン酸を使用するリンカーホスホルアミダイト試薬の第２の合成ルート（図３）も可能である。この手順では、ジカルボン酸リンカーの一端をヌクレオシドに結合させることにより、切断可能なエステル結合を形成する。次いで、リンカーホスホルアミダイトのホスホルアミダイト部を形成可能なアルコール又はアミノ基へカルボキシル基を転換するのに役立つ第２のジオール又はアミノアルコールに、エステル又はアミド結合を介して、ジカルボン酸の他端を結合する。リンカーアームの第２の部分の化合物候補例には、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、２−アミノエタノール、１，２−ジアミノエタン、１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１−プロパノール、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ブタンジオール、４−アミノ−１−ブタノール、１，４−ジアミノブタン、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、６−アミノ−１−ヘキサノ−ル、１，６−ジアミノヘキサン、又は４−アミノ−シクロヘキサノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
前記リンカーの末端に存在するリン含有基は、オリゴヌクレオチド合成条件下で活性化することができ、且つ反応できる任意のタイプの前駆体であり得る。オリゴヌクレオチド合成に関しては、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、修正ホスホトリエステル法、クロロホスファイト又はホスファイトトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスホルアミダイト法などの様々な化学的手法が知られている。しかし、現在、最後の２つの方法のみが普通に用いられ、ホスホルアミダイト法が格段に普及している。
【００２５】
本発明を通して使用される「活性化」又は「活性化されたリン酸化部分」という用語は広い意味を有するものであり、亜リン酸エステル、リン酸エステル、又はホスホネート結合のいずれかを介してリン基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｇｒｏｕｐ）を結合することができる様々な方法を指す。３価（ＰＩＩＩ）又は５価（ＰＶ）のいずれかの酸化状態を含むリン部分が可能であり、リンの酸化状態はカップリング反応の過程で（通常、ＰＩＩＩからＰＶへと）変化し得る。したがって、所望の生成物の前駆体となる試薬は、生成物とは異なる酸化状態をとってもよい。リン酸化に使用される試薬は、本質的に反応性であり得、そのため外来の活性化又はカップリング試薬は不要である。このタイプの例には、クロロホスファイト、クロロホスフェート、及びイミダゾール、トリアゾール、若しくはテトラゾール置換ホスファイト、及びホスフェート試薬などがある。別個の活性化剤の存在によって活性化されるまでは安定なリン酸化試薬はより便利であり、広範に使用される。これらの試薬の例には、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト誘導体、及びビス−（Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスフィンなどのホスホルアミダイト及びビスホスホルアミダイト試薬がある。カップリング特性をより望ましくするために、反応基を有する試薬を他の反応基で置換してもよい。使用前に、高反応性三塩化リンをトリス−（イミダゾリド）リン又はトリス−（トリアゾリド）リン種へと変換するのがこの例である。カップリング試薬を追加してリン酸化試薬を活性種へとインサイチュで転化する必要がある場合もある。これは、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は１−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及びこれに類する試薬などのカルボジイミドカップリング試薬；Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、又はＯ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、及びこれらに類する試薬などのウロニウムカップリング試薬；及びベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、又はベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、及びこれらに類する試薬などのホスホニウムカップリング試薬が使用できる、カルボン酸エステル及びアミドの形成に類似しているかもしれない。Ｈ−ホスホネート試薬のカップリングに特に有用な塩化ピバロイル；及びホスフェート試薬のカップリングに特に有用な置換アリールスルホニルクロライド、イミダゾリド、トリアゾリド、テトラゾリド試薬などの無水中間体混合物を生成するカップリング試薬が必要なこともある。リン酸化試薬は、中性の非荷電種としてそれらの取扱いを容易にする保護基を有していてもよい。これらの保護基は除去可能であり、単離することなく、インサイチュで荷電種を生成することを可能とし、次いでこの荷電種がカップリング反応に関与する。このアプローチの一例は、修正ホスホトリエステル法として知られている。したがって、リン基を導入し、それらをカップリングしてホスファイト、ホスフェート、及びホスホネート結合を生成する広範且つ多様な試薬と反応条件が存在する。しかし、これらの方法はすべて当業者には既知である。
【００２６】
４つの一般的な塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）又は一般的でないその他の塩基のリンカーホスホルアミダイト試薬は、４つの従来のヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト試薬と同様にして調製し、自動ＤＮＡ合成装置にかけることができる（図２及び３）。その際、安価で容易に入手可能な誘導体化されていないアミノ又はヒドロキシル固相担体は、「汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」担体としてカラム又はプレート形式のいずれでも使用することができる。さらに、後続の鎖伸張工程のために従来のホスホルアミダイト試薬に切り替える前に、第１の合成サイクルでリンカーホスホルアミダイトを結合させるために、標準のホスホルアミダイトカップリングサイクルを使用することができる。両タイプのホスホルアミダイト試薬に対して活性化剤（通常、テトラゾール）が依然同じであるため、追加のカップリング試薬は不要である。１回に８つの異なるホスホルアミダイト試薬を支持できる自動合成装置がすでに広く入手可能なため、４つのリンカーホスホルアミダイトと４つの従来のホスホルアミダイトの１セットを同時に取り付けることは問題とならない。第１のヌクレオシドをエステル又はアミド結合を介して自動的に結合させる本発明者等の従来法は、５つの余分な試薬（４つのヌクレオシドと１つのカップリング試薬）を要し、且つかかる多量の余分な試薬を収容する合成装置は容易に入手できないので、追加されるリンカーホスホルアミダイトが４つしか必要ではないということは、この従来法よりも遥かに有利である。
【００２７】
合成終了後、予め誘導体化された担体ですでに使用したものと同じ試薬と条件を用いて、生成物を切断することができ、所望の３’−水酸基末端を有する生成物が遊離することになる。ホスホルアミダイトリンカーのホスフェート部分は、担体に付着したままであり、廃棄される。リンカーホスホルアミダイトで使用されたリンカーアームによっては、この切断工程は非常に速くなり得る。例えば、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸を含有するリンカーホスホルアミダイトを使用すれば、室温の水酸化アンモニウムでほんの２分間処理すれば十分である。担体から遊離したら、これらの生成物を従来法によりさらに脱保護しなければならないが、更なる脱リン酸化工程は不要であり、３’−リン酸化生成物と３’−ＯＨ生成物の混合物は生成しない。
【００２８】
複数のオリゴヌクレオチドも同じ合成カラムで直列に生成される（図４）。この方法では、第１のオリゴヌクレオチド配列が、５’−末端水酸基を有する、すなわち５’−ジメトキシトリチル基を持たない担体上に合成される。次いで、第１のオリゴヌクレオチドの末端５’−水酸基は、第２のオリゴヌクレオチド配列の３’−末端塩基を含有するホスホルアミダイトリンカーに対する反応部位として働くことができる。この第２の配列は、調製された第１の配列とは同じでも異なってもよい。ホスホルアミダイトリンカーを用いて最初の塩基を付加した後、次いで第２の配列の残部を合成するために従来のホスホルアミダイト試薬を使用する。総塩基数が固相担体の細孔容積を超えるまで、更なる配列を担体上に蓄積し続けてもよい。このようにして調製された複数のオリゴヌクレオチドは、第１の配列を担体表面から切断する試薬で処理したときに、相互及び担体表面から同時に遊離することが好ましい。あるいは、オリゴヌクレオチド生成物間で異なるホスホルアミダイトリンカーを使用すると、個々のホスホルアミダイトリンカーの切断条件を調節することにより、担体から生成物を選択的に且つ順次遊離することが可能になる。第１のオリゴヌクレオチド配列を担体に付着させるために使用したホスホルアミダイトリンカーのホスフェート残基は、使用した担体と共に廃棄してもよい。しかし、後続のホスホルアミダイト付加体リンカーのホスフェート残基は、先行するオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合されたままであろう。ホスホルアミダイトリンカーの選択によっては、ある残留リンカー部分が５’−末端ホスホジエステル基を生成するホスフェート残基に結合したままになることもある。こうした５’−ホスフェートジエステル末端修飾は不自然ではあるが、それらが存在しても、ＤＮＡ配列決定やＰＣＲプライマーとして３’−末端修飾にのみ感受性のあるオリゴヌクレオチドを使用することを妨げず、そのためこのようなオリゴヌクレオチドは、多くの用途に重大な影響を与えずに、なお使用することができる。好ましいホスホルアミダイトリンカー試薬としては、切断と同じ条件下で５’−末端ホスフェート基から脱離する結合基が挙げられる。このホスホルアミダイトリンカーは、天然の５’−モノホスフェート及び天然の３’−ＯＨ基を先行オリゴヌクレオチド末端上に生成する。好ましいホスホルアミダイトリンカーを用いて生成されたオリゴヌクレオチドは、５’−末端の関与する連結反応と３’−末端の関与するプライマー伸張反応の両方に関わることができる。
【００２９】
したがって、本発明の一側面は、式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
【化６１】
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
【化６２】
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
【化６３】
【化６４】
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物に関する。
【００３０】
前記リン酸化部分は、
【化６５】
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基でもよく、あるいはＲ１１及びＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択されることが好ましい。
【００３１】
好ましくは、前記保護基は、置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−３０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ５−４０アルカリール基、Ｃ１−２０ハロアルキル基、Ｃ５−３０ハロアリール基、Ｃ３−１０ハロシクロアルキル基、Ｃ１−２０ニトロアルキル基、Ｃ５−２０ニトロアリール基、Ｃ３−１０ニトロシクロアルキル基、Ｃ１−２０チオアルキル基、Ｃ５−３０チオアリール基、Ｃ３−１０チオシクロアルキル基、Ｃ１−２０シアノアルキル基、Ｃ５−３０シアノアリール基、Ｃ３−１０シアノシクロアルキル基、Ｃ１−２０アルキルシリル基、及びＣ５−３０アリールシリル基を含む群から選択される。より好ましくは、前記保護基は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５− １０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される。
【００３２】
より好ましいリン酸化部分は、
【化６６】
【００３３】
式Ｉの化合物において、Ｑ１は有機部分である。好ましくは、この有機部分は、１以上の酸素、窒素、ハロゲン、及び硫黄で必要に応じて置換されたＣ１−３００炭化水素部分である。
【００３４】
ひとつの好ましい実施態様において、Ｑ１は、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基（ａｌｋｙａｒｙｌ）、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される。
【００３５】
別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式
−ＣＨ２−ＣＨ２−
で表される。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
で表される。
【００３７】
さらに別の好ましい実施態様において、Ｑ１は次式：
【化６７】
【化６８】
で表される。
【００３８】
式１の化合物における極めて好ましい変数の組み合わせは以下の通りである。
【００３９】
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑはすべて１であり、
Ｑ１は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
【化６９】
【化７０】
から選択され、
Ｑ２は酸素であり、
Ｑ３は−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はすべて水素であり、
Ｚ１は、以下の構造：
【化７１】
【００４０】
式の化合物は式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの化合物：
Ｘ１−ＯＨ （ＩＩ）
Ｈ−Ｑ−Ｑ−Ｒ２４ （ＩＩＩ）
ｚ２ （ＩＶ）
（式中、Ｒ２４は水素又は保護基であり、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）を一緒に反応させる工程を備える方法によって生成してもよい。
【００４１】
１つの好ましい実施態様においては、Ｒ２４は保護基であり、前記方法は、式ＩＩ及びＩＩＩの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＶの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える。
【００４２】
別の好ましい実施態様においては、Ｒ２４は水素であり、前記方法は、式ＩＩＩ及びＩＶの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＩの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える。
【００４３】
保護基を使用することは当該技術分野では従来から行われており、その選択は当業者には周知である。したがって、本明細書で特に言及していない他の保護基を本発明の範囲から逸脱することなく使用することができる。
【００４４】
本発明の別の側面は、１以上の目的のオリゴヌクレオチドを合成するために、式Ｉの化合物を使用することに関する。このことは、
（ｉ） 式Ｉの化合物を式ＶＩＩＩ：
【化７２】
で表される担体材料と反応させて、
式ＩＸ：
【化７３】
（ｉｉ） 式ＶＩの第１の誘導体化された担体材料を、第１の目的のオリゴヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、少なくとも１つのヌクレオチドと反応させる工程と、
（ｉｉｉ） 式ＩＸの化合物から第１の対象オリゴヌクレオチドを切断する工程とを備える方法により達成される。当業者であれば理解できるように、Ｚ１に選ばれるリン酸化部分の選択次第で、リンの酸化状態はＰＩＩＩからＰＶに変化し得る。
【００４５】
オリゴヌクレオチド合成に使用する他の試薬、一般的な反応条件、及び装置は、この主題に関する以下の概説記事／テキストに見出せるであろう。
【００４６】
【参考文献２】
【００４７】
本発明の実施態様を、以下の例を参照して説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではなく、又はそのように解釈してはならない。
【００４８】
例１− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールスクシネート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト ４ａ
５′−ジメトキシトリチルチミジン１（３．２７ｇ、６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１．１０ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（４０ｍｌ）に溶解して、室温で（２日間）撹拌した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムに再溶解して、水（２ｘ）及び飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。このクロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥して留去すると粗５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（４．５０ｇ）が得られ、さらに精製することなく使用した。
【００４９】
５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（２．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）及びピリジン（２．９ｍｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．６４ｇ、８．６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（１．２６ｍｌ、１５．８ｍｍｏｌ）に溶解した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．２５ｍｌ、４．５ｍｍｏｌ）を添加して、この溶液を室温で２０分間撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、水、飽和ＮａＣｌ水溶液及び水で順番に洗浄した。このクロロホルム溶液を濃縮してシリカゲルクロマトグラフィ（２％メタノール／クロロホルム）で精製すると所望する５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールスクシネート） ３ａが３１％の収率（９３５ｍｇ）で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール／クロロホルム）Ｒｆ＝０．３８。
【００５０】
或いは、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシネート ２ａ（１．２９ｇ、２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）及びピリジン（１．３ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（０．７４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．５７ｍｌ、７．２ｍｍｏｌ）に溶解した。室温で（１０分間）撹拌した後、この溶液をシリンジでエチレングリコール（１１．２ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）に滴下した。撹拌後（３０分）、溶媒を留去に濃縮して、クロロホルムに再溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液及び水（２ｘ）で洗浄した。次いで、１〜２％メタノール／クロロホルムを使用したシリカゲルクロマトグラフィで粗生成物を精製した。３ａの収量は１．０４５ｇ（７６％）であった。
【００５１】
アルコール３ａ（９２３ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．９１ｍｌ、５．２ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３９ｍｌ、１．７５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温で１時間撹拌した。この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄して、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５から開始してトリエチルアミン／クロロホルム５：９５で終了させることによって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ａが８９％（１．０６ｇ）の収率で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、２０％ヘキサン／酢酸エチル）Ｒｆ＝０．６５。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５０．７５４及びδ１５０．２６９。
【００５２】
例２− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールジグリコレート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト４ｂの合成
５′−ジメトキシトリチルチミジン １（１．６３ｇ、３ｍｍｏｌ）、無水ジグリコール酸（５２２ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（７３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｍｌ）に溶解して、室温で（２日間）撹拌した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムに再溶解して、水（２ｘ）、飽和ＮａＣｌ水溶液及び水で洗浄した。このクロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥して留去すると粗５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ジグリコレート ２ｂ（１．９３ｇ、９８％）が得られ、さらに精製することなく使用した。
【００５３】
５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ジグリコレート ２ｂ（１．９３ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（４０ｍｌ）及びピリジン（１．９ｍｌ）、次に塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．０９ｇ、５．７ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．８４ｍｌ、１０．５ｍｍｏｌ）に溶解した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．１６ｍｌ、２．９ｍｍｏｌ）を添加して、この溶液を室温で２０分間撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、水及び飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ（２％メタノール／クロロホルム）で精製すると所望する５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールジグリコレート） ３ｂが５３％の収率（１．０９ｇ）で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、５％メタノール／クロロホルム）Ｒｆ＝０．３５。
【００５４】
アルコール ３ｂ（８３０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．８０ｍｌ、４．６ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３４ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を室温で１時間撹拌した。この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄して、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５から開始してトリエチルアミン／クロロホルム５：９５で終了させることによって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ｂが６７％（７２０ｍｇ）の収率で得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、２０％ヘキサン／酢酸エチル）Ｒｆ＝０．６５。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５０．７７４及びδ１５０．６９１。
【００５５】
例３− ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールハイドロキノンジアセテート）−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト ４ｃの合成
５′−ジメトキシトリチルチミジン １及びハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸を使用して、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｇ．Ｄ．Ｇｌｉｃｋ、ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ著「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｕｎｉｔ ３．２、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔ．Ｐｏｎ、「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００に記載されているように、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−ジアセテートピリジニウム塩又はトリエチルアンモニウム塩 ２ｃを調製した。２ｃ（２．５０ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）及びピリジン（１．９ｍｌ）に溶解した。塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．１２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．８６ｍｌ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。透明な溶液が形成されたら、エチレングリコール（０．１７ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を３０分間撹拌した。反応は不完全で、さらにエチレングリコール（０．０８５ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を一晩放置した。この溶液を留去して濃縮し、クロロホルムで希釈して、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、及び水（２ｘ）で洗浄した。粗生成物を０〜３％メタノール／クロロホルムを使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製すると、５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（１，２−エタンジオールハイドロキノンジアセテート） ３ｃが収率３５％（８３０ｍｇ）で得られた。
【００５６】
或いは、２ｃ（２．１３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１．６ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解した。塩化ｐ−トルエンスルホニル（０．９３ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．７２ｍｌ、９．０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を室温で（１０分間）撹拌した。この溶液をシリンジでエチレングリコール（１４ｍｌ、２５０ｍｍｏｌ）に撹拌しながら滴下した。さらに３０分間撹拌後、反応物を留去に濃縮して、クロロホルムに再溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液及び水（２ｘ）で洗浄した。粗物質をクロロホルムに溶かした０〜２％（ｖ／ｖ）メタノール勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製したところ３ｃが得られた（７１９ｍｇ、収率３６％）。
【００５７】
ジイソプロピルエチルアミン（０．３８ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）及びアルコール ３ｃ（３８２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（８ｍｌ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１６ｍｌ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、この反応物をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）及び水で洗浄し、次いでシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５３：５（ｖ／ｖ／ｖ）から開始して、次にクロロホルムに溶かした５〜１０％のトリエチルアミン（ｖ／ｖ）によって精製した。これによって、ホスホルアミダイト生成物 ４ｃが２７％（１２８ｍｇ）の収率で得られた。
【００５８】
例４− ＣＰＧ支持体からのリンカーホスホルアミダイトの切断速度
リンカーホスホルアミダイト ４ａ、４ｂ、及び４ｃを無水アセトニトリルに溶解して０．１Ｍ溶液を得た。この溶液をＰＥ／Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ 自動ＤＮＡ合成機の予備の塩基取付位置に入れた。非誘導体化長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）又は非誘導体化グリセロール細孔性ガラス（Ｇｌｙ−ＣＰＧ）支持体を含有する１μｍｏｌｅ規模の合成カラムを、ＤＮＡ合成用の通常のテトラゾール試薬、脱保護試薬、キャッピング試薬、及び洗浄試薬と共に装備した。リンカーホスホルアミダイト試薬をＣＰＧ支持体に結合させるために、１μｍｏｌｅ規模の塩基付加サイクルを１回実施した。いずれの場合も５′−ジメトキシトリチル保護基がヌクレオシドに残存した。
【００５９】
この合成カラムを合成機から取り外して、真空下で乾燥させた（１０分間）。ＣＰＧ支持体をカラムから取り出し、メタノール及びクロロホルムで再度洗浄して乾燥させた。保持されたヌクレオシドを測定するために各支持体の一部を計量してジメトキシトリチル分析を行った。さらに一部を計量して指定した時間室温の水酸化アンモニウムで処理した。次いで、この支持体を水、アセトニトリル、メタノール、及び最後にクロロホルムで洗浄した。この支持体を乾燥させて、残存した保持ヌクレオシドをジメトキシトリチル分析によって決定した。各リンカーホスホルアミダイトのリンカー切断量を表１に示した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
例５− リンカーホスホルアミダイト試薬を使用した（Ｔｐ） ７ Ｔのオリゴヌクレオチド合成
オクタチミジン配列、ＴＴＴＴＴＴＴＴは、０．１Ｍリンカーホルホルアミダイト試薬４ａ〜ｃを使用して第１のヌクレオシドを添加すること以外は標準的１μｍｏｌｅ規模合成条件を使用して、ＰＥ／Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ合成機で調製した。非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ又はＧｌｙ−ＣＰＧ支持体を使用した。保持された最初のヌクレオシドは、第１のリンカーホスホルアミダイト結合サイクルによって遊離するジメトキシトリチル陽イオンの量を定量することによって測定した。総結合効率及び平均結合効率は、最初と最後のトリチルの色によって推定した。
【００６２】
合成後、トリチル−ｏｆｆ自動末端切断方法を使用して、支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離させた。４ａ〜ｂを使用して作製した配列は水酸化アンモニウムで６０分間自動処理して切断して、４ｃの配列は水酸化アンモニウムで５分間自動処理して切断した。収集した生成物の量は２６０ｎｍでのＵＶ吸収で測定した。結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
例６− リンカーホルホルアミダイト試薬を使用したオリゴヌクレオチドｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴの合成
１７塩基長のＭ１３汎用プライマー配列ｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴは、０．１Ｍリンカーホルホルアミダイト試薬４ａ〜ｃを使用して第１のヌクレオシドを添加すること以外は標準的１μｍｏｌｅ規模合成条件を使用して、ＰＥ／Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ合成機で調製した。非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ又はＧｌｙ−ＣＰＧ支持体を使用した。保持された最初のヌクレオシドは、第１のリンカーホスホルアミダイト結合サイクルによって遊離するジメトキシトリチル陽イオンの量を定量することによって測定した。
【００６５】
合成後、トリチル−ｏｆｆ自動末端切断方法を使用して、支持体からオリゴヌクレオチド生成物を遊離させた。収集した生成物の量を２６０ｎｍでのＵＶ吸収で測定した。次に、他の物質もまた回収できるかどうかを決定するために合成支持体に第２の自動切断サイクルを実施した。表３からわかるように、結果から８９〜９４％の間の生成物が第１の切断期間中に遊離することが示された。
【００６６】
【表３】
【００６７】
例７− リンカーホスホルアミダイト合成による生成物と従来の予備誘導体化支持体から調製した生成物との比較
例５で調製した６種類の未精製オクタチミジン生成物の試料及び例６で調製した６種類の１７塩基長Ｍ１３汎用プライマー配列の試料を、２４％ポリアクリルアミド／７Ｍウレアゲルを使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。５′−ジメトキシトリチルチミジンで予備誘導体化した従来の長鎖アルキルアミンＣＰＧ支持体上で合成した標準オクタチミジン及びＭ１３汎用プライマー配列を比較として前記試料と並べて泳動した。さらに、非３′−水酸基ではなく３′−リン酸基を有するオクタチミジン及びＭ１３汎用プライマー配列を合成した。これらの試料もまた、前記試料と並べて泳動して、所望しない３′−リン酸残基を含有する可能性がある生成物を確認した。この結果によって、リンカーホスホルアミダイト生成物は標準生成物と同様に移動することが示された。３′−リン酸化オクタチミジンマーカーは、リンカーホスホルアミダイト生成物よりも早く移動した。３′−リン酸化１７塩基長配列もまた、非３′−リン酸化生成物よりも早く移動したが、この場合移動度の違いはそれほど多くない。
【００６８】
前記のオリゴヌクレオチドをまた、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）によって、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３−Ｄ ＣＥ装置、１００μｍｘ４８．５ｃｍ ＰＶＡコーティングキャピラリー、ＨＰ置換可能オリゴヌクレオチドポリマーＡ及びＨＰオリゴヌクレオチド緩衝液を使用して分析した。５′−ＤＭＴ−Ｔ−３′−コハク酸ホスホルアミダイト ４ａで作製したＭ１３汎用プライマー配列及び同配列を有する３′−リン酸化オリゴヌクレオチドの混合物のＣＧＥ分析によって、３′−リン酸化配列の移動は異なっており、リンカーホスホルアミダイトから得られた生成物から完全に分離することが示された。
【００６９】
ポリアクリルアミドゲル及びＣＧＥ両方の結果から、リンカーホスホルアミダイトで作製した生成物の移動は予備誘導体化支持体上で作製した標準物と一致し、３′−リン酸化マーカーの移動とは異なることが示された。したがって、いずれの場合においても、オリゴヌクレオチドが支持体から遊離するとき、リン酸残基は生成物の３′−末端から切断されていた。
【００７０】
例８−タンデム合成用リンカーホスホルアミダイトの合成（図６）
２，２′−ジスルホニルジエタノールの６５％水溶液（１０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（４ｘ２０ｍｌ）と共に乾燥するまで留去して、無水ピリジン（２５ｍｌ）に再溶解した。次に、５′−ジメトキシトリチル−Ｎ−保護２′−デオキシリボヌクレオシド−３′−Ｏ−コハク酸ヘミエステルトリエチルアンモニウム塩（２．０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（２．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．６ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で（１０分間）撹拌したところ、ＴＬＣ（５％メタノール／ＣＨＣｌ３）で反応が完了したことが示された。この溶液を留去によって濃縮してピリジンを除去し、ＣＨＣｌ３で希釈して、水（４ｘ）で洗浄して乾燥するまで留去した。次に、粗生成物 ５を１〜３％メタノール／ＣＨＣｌ３を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。収率：Ｂ＝ＡＢｚ、７３％、Ｂ＝ＣＢｚ、８０％、Ｂ＝ＧｉＢｕ、７３％、及びＢ＝Ｔ、７６％。ＥＳＩ質量分析：Ｂ＝ＡＢｚ、Ｍ＋Ｎａ計算値９１７．９５、Ｂ＝ＣＢｚ、Ｍ＋Ｎａ計算値８９２．９２、測定値８９２、Ｂ＝ＧｉＢｕ、Ｍ＋Ｎａ計算値８９８．９３、測定値＝８９８、及びＢ＝Ｔ、Ｍ＋Ｎａ計算値８０３．８５、測定値８０３。
【００７１】
ヌクレオシド ５（１．２８ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（１５ｍｌ）に溶かしたジイソプロピルエチルアミン（５．０ｍｍｏｌ）の溶液に溶解した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．６６ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で（１時間）撹拌した。この溶液をクロロホルムで希釈して、ＮａＣｌ水溶液（４ｘ）で洗浄した。このクロロホルム溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィによってジクロロメタン／ヘキサン／トリエチルアミン４２：５５：３から４２：５３：５、その後５％トリエチルアミン／ＣＨＣｌ３を使用して生成物 ６を精製した。収率：Ｂ＝ＡＢｚ、４７％、Ｂ＝ＣＢＺ、５０％、Ｂ＝ＧｉＢｕ、４９％、及びＢ＝Ｔ、５６％。
【００７２】
例９− リンカーホスホルアミダイト ６を使用した１個のオリゴヌクレオチド合成
リンカーホスホルアミダイト試薬 ６の０．１〜０．５Ｍ溶液を予備の塩基取付位置５〜８に入れること以外は標準的方法による１μｍｏｌｅ規模の合成のために、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成機を設計した。アミノ基１０２μｍｏｌ／ｇを含有する非誘導体化長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）を含有する合成カラムを予備誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧの代わりに装備した。次に、合成機を表４に示した配列を調製するようにプログラムした。
【００７３】
合成後、ＮＨ４ＯＨを使用して生成物を支持体から自動的に切断し（６０分間）、加熱することによって（５５°、１６時間）脱保護した。粗生成物をＵＶによって定量し、結合収率はトリチルの色によって推定し、配列の同一性はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した（表４）。
【００７４】
【表４】
末端に５′−リン酸基を有する１７塩基長オリゴヌクレオチド配列、５′−ｐ−ｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴを例９のように調製したが、他の結合サイクルは試薬６（Ｂ＝Ｔ）を使用して実施して、配列末端に他のチミジンヌクレオシド及び５′−リン酸を添加した。次いで、この配列を支持体から切断し、例９のように脱保護した。この段階の間、末端チミジンヌクレオシドは１７マーの末端から切断され、５′−リン酸残基を遊離した。同一の配列はまた、従来の「リン酸Ｏｎ」ホスホルアミダイト試薬を使用して合成し、末端５′−リン酸基を添加した。２種の生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動による移動度は同一であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法もまた使用して、２個のオリゴヌクレオチドの正確で同一の構造であることを確かめた。６でリン酸化されたオリゴヌクレオチド、Ｍ＋Ｈ計算値５３０８．４、測定値５３０６．１、「リン酸Ｏｎ」試薬でリン酸化されたオリゴヌクレオチド、Ｍ＋Ｈ計算値５３０８．４、測定値５３０８．８。
【００７５】
例１１− ５′−リン酸化トリヌクレオチドのタンデム合成
アセトニトリルに溶かしたリンカーホスホルアミダイト ６（Ｂ＝Ｔ）の０．１Ｍ溶液を３９４ＤＮＡ合成の塩基取付位置＃８に入れた。リン酸Ｏｎホスホルアミダイトの溶液を位置＃５に入れた。他の試薬は全て従来の合成法通りに入れた。ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸リンカーアームによってＬＣＡＡ−ＣＰＧに結合させた５′−ジメトキシトリチルチミジン３４ｍｇを含有する合成カラムを使用した。次に、１回のタンデム合成で、配列５ＡＡ８ＧＧ８ＣＣ８ＴＴＴを入れることによって４種類のトリヌクレオチド、ｄ（ｐＡＡＴ）、ｄ（ｐＣＣＴ）、ｄ（ｐＧＧＴ）、及びｄ（ｐＴＴＴ）を調製するように合成機をプログラムした。合成後、ＮＨ４ＯＨを使用して（６０分）生成物を支持体から自動的に切断し、脱保護した（１６時間、５５°）。収率：７０．６Ａ２６０単位。
【００７６】
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴヌクレオシドに対応する６のリンカーホスホルアミダイト溶液をそれぞれ３９４ＤＮＡ合成機の位置＃５、６、７及び８に入れた。５′−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシシチジンで誘導体化した１０００Å低保持ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１０．７μｍｏｌ／ｇ）３４．１ｍｇを含有する合成カラムを装備した。次に、１アミノ酸のコドンにそれぞれ対応する以下の２０個のトリヌクレオチド−５′−リン酸、ｄ（ｐＡＡＡ）、ｄ（ｐＡＡＧ）、ｄ（ｐＡＣＴ）、ｄ（ｐＡＴＧ）、ｄ（ｐＡＴＣ）、ｄ（ＣＡＣ）、ｄ（ｐＣＡＴ）、ｄ（ｐＣＣＣ）、ｄ（ＣＧＴ）、ｄ（ｐＣＴＣ）、ｄ（ＧＡＡ）、ｄ（ｐＧＡＧ）、ｄ（ｐＧＣＴ）、ｄ（ｐＧＧＴ）、ｄ（ｐＧＴＴ）、ｄ（ｐＴＡＧ）、ｄ（ｐＴＣＴ）、ｄ（ｐＴＧＧ）、ｄ（ｐＴＧＣ）、ｄ（ｐＴＴＣ）を、配列ＡＡ５ＡＡ６ＡＣ８ＡＴ６ＡＴ７ＣＡ７ＣＡ８ＣＣ７ＣＧ８ＣＴ７ＧＡ５ＧＡ６ＧＣ８ＧＧ８ＧＴ８ＴＡ６ＴＣ８ＴＧ６ＴＧ７−ＴＴＣを入れることによって１回のタンデム合成で調製するように合成機をプログラムした。トリチル−ＯＮ／マニュアルモードで前記合成を完了した後、位置＃５のリンカーホスホルアミダイト試薬をリン酸Ｏｎホルホルアミダイトと置き換えて、他の合成サイクルを実施して末端５′−リン酸基を添加した。次に、ＮＨ４ＯＨを使用して（６０分間）生成物を支持体から自動的に切断し、脱保護した（１６時間、５５°）。収率：２３．６ Ａ２６０単位。
【００７７】
例１２− スクシニルスルホニルジエタノール（ｓｕｃｃ−ＳＥ）リンカーアームの加水分解
この例では、スルホニルジエタノール（ＳＥ）リンカーホスホルアミダイトが迅速に加水分解されることを示す。この切断の速さは、前述の例３で使用したリンカーで認められた切断とほとんど同じである。
【００７８】
アセトニトリルに溶かした５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−スクシニルスルホニルジエタノールホスホルアミダイト ６の０．１Ｍ溶液をＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成機の予備の塩基取付位置に入れた。合成カラムには非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを使用した。他には変更していない１μｍｏｌｅ規模の合成サイクルを使用して２種類の合成を実施した。
【００７９】
第１の場合では、トリチル−ｏｎ／マニュアル末端法を使用したホスホルアミダイト結合サイクルを１回のみ実施して、支持体にＳＥリンカーホスホルアミダイトを添加した。ＣＰＧを除去して、支持体の一部をジメトキシトリチル定量分析することによってジメトキシトリチル含量が２０．３μｍｏｌ／ｇであることを測定した。次に支持体の他の部分を２８％水酸化アンモニウム水溶液で１分、５分及び１０分間処理した。メタノール及びクロロホルムで洗浄後、支持体をジメトキシトリチル分析したところ、１分、５分及び１０分後に生じた加水分解はそれぞれ９２％、９６％及び９８％であることが示された。
【００８０】
第２の場合では、トリチル−ｏｆｆ／マニュアル末端法を使用して２１塩基長配列ｄＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴを調製した。リンカーホルホルアミダイトの最初の保持量をジメトキシトリチル分析によって測定したところ２０μｍｏｌ／ｇで、合成全体の平均結合効率は９９．８％であった。次に、特定の自動化末端方法を使用して、水酸化アンモニウム２８％水溶液を少量ずつ収集バイアルに１分間隔で１５分間添加した。この合成法によって３′−ＯＨ遊離末端を有するオリゴヌクレオチドが生成した。水酸化アンモニウム各画分を手動で収集し、５５°で一晩加熱することによって脱保護し、留去してアンモニアを除去し、次いで２６０ｎｍのＵＶで定量した。次いで、支持体から遊離したＡ２６０累積量を時間に対してプロットして、加水分解の程度を測定した。この実験によって、１分、５分及び１０分後それぞれに生じた加水分解は６５％、９４％及び９８％であることが示された。したがって、支持体からの２１塩基長オリゴヌクレオチド配列の切断は、１個のヌクレオシドの切断よりもほんのわずかに遅い。
【００８１】
第３の実験では、スルホニルジエタノール結合を含有する市販の「リン酸−Ｏｎ」ホスホルアミダイト試薬を使用して、非誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを含有する合成カラムをリン酸化した。次に、３′−リン酸化末端を含有し、３′−ＯＨ末端を含有しない２１塩基長配列ｄＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴをこの支持体上で調製した。最初に保持されるリン酸−Ｏｎ試薬は３３μｍｏｌ／ｇで、合成全体の平均結合効率は９９．８％であった。次いで、前述のように水酸化アンモニウム２８％水溶液中での加水分解速度を測定した。結果から、１分、５分及び１０分後それぞれに生じた加水分解は６４％、９８％及び９９％であることが示された。
【００８２】
これらの結果によって、より安定なコハク酸結合を加水分解するよりも、より不安定なスルホニルジエタノール官能基を除去することによって、リンカーホスホルアミダイトの切断が生じることが示される。観察された切断速度（５分で９８％）は、ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ′−二酢酸リンカーアームの切断速度（２分で９８％）とほとんど同じで、従来のコハク酸リンカーアームの切断速度（約２時間で９８％）より著しく速い。したがって、リンカーアームを含有するスルホニルジエタノールは、迅速な切断条件を必要とする適用に適している。
【００８３】
例示的な実施態様及び例を参照にして本発明を説明してきたが、この説明は限定した意味で解釈されるものではない。したがって、当業者にとって、例示的実施形態の様々な変更、並びに本発明の他の実施形態は、この説明を参照にすれば明らかであろう。したがって、添付のクレームはこのような変更又は実施形態を包含するものと考えられる。
【００８４】
個々の出版物、特許又は特許明細書が具体的かつ個別的にその全体を参考文献として援用するものと表示される場合と同等に、本明細書に関する全ての出版物、特許及び特許明細書は、その全体が参考文献として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
本発明の実施態様を添付の図面を参照して説明するが、同一の数字は同一の要素を示す。図１ａは、ヌクレオシドを担体に付ける従来の合成法を示したものである。
【図１ｂ】
図１ｂは、オリゴヌクレオチドを直列に合成する従来手法を示したものである。
【図２】
本方法の好ましい実施態様を示す。
【図３】
本方法の好ましい実施態様を示す。
【図４】
オリゴヌクレオチドを直列に合成する本方法の好ましい実施態様を示す。
【図５】
下記例１〜３に使用する合成ルートを示す。
【図６】
直列合成用の好ましい試薬の合成について示したものである。
Claims (72)
- 式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４のうち少なくとも１つは電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
で表される化合物。 - 前記リン酸化部分が
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基であり得、あるいはＲ１１及びＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択される、請求項１に記載の化合物。 - 前記保護基が、置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−３０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ５−４０アルカリール基、Ｃ１−２０ハロアルキル基、Ｃ５−３０ハロアリール基、Ｃ３− １０ハロシクロアルキル基、Ｃ１−２０ニトロアルキル基、Ｃ５−２０ニトロアリール基、Ｃ３−１０ニトロシクロアルキル基、Ｃ１−２０チオアルキル基、Ｃ５−３０チオアリール基、Ｃ３−１０チオシクロアルキル基、Ｃ１−２０シアノアルキル基、Ｃ５−３０シアノアリール基、Ｃ３−１０シアノシクロアルキル基、Ｃ１−２０アルキルシリル基、及びＣ５−３０アリールシリル基を含む群から選択される、請求項２に記載の化合物。
- 前記保護基が、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５−１０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項２に記載の化合物。
- 前記リン酸化部分が、
である請求項１に記載の化合物。 - Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２が同一であるか又は異なり、それぞれは１以上のハロゲン、ニトロ基、チオ基、及びシアノ基で必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキル基である、請求項５に記載の化合物。
- Ｒ１１及びＲ１２が同一である、請求項５に記載の化合物。
- Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれｉ−プロピルである、請求項５に記載の化合物。
- Ｒ１０がＣ１−１０シアノアルキル基である、請求項５に記載の化合物。
- Ｒ１０がシアノエチル基である、請求項５に記載の化合物。
- Ｑ１が、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- Ｑ１が次式
−ＣＨ２−ＣＨ２−
で表される、請求項１に記載の化合物。 - Ｑ１が次式
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
で表される、請求項１に記載の化合物。 - Ｑ１が次式：
で表される、請求項１に記載の化合物。 - ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑがすべて１であり、
Ｑ１が、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
から選択され、
Ｑ２が酸素であり、
Ｑ３が−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がすべて水素であり、
Ｚ１が、以下の構造を有する
請求項１に記載の化合物。 - 式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
で表される化合物を生成する方法であって、
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑが、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、少なくとも一つのＡ３及びＡ４は電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの化合物：
Ｘ１−ＯＨ （ＩＩ）
Ｈ−Ｑ−Ｏ−Ｒ２４ （ＩＩＩ）
Ｚ２ （ＩＶ）
（式中、Ｒ２４は水素又は保護基であり、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）
を反応させる工程を備えた方法。 - Ｒ２４が保護基であり、式ＩＩとＩＩＩの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＶの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える、請求項１６に記載の方法。
- Ｒ２４が水素であり、式ＩＩＩとＩＶの化合物を反応させて反応生成物を生成する工程と、その後該反応生成物を式ＩＩの化合物と反応させて式Ｉの化合物を生成する工程とを備える、請求項１６に記載の方法。
- Ｚ１が、
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基であり得、あるいはＲ１１及びＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。 - 前記保護基が、置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−３０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ５−４０アルカリール基、Ｃ１−２０ハロアルキル基、Ｃ５−３０ハロアリール基、Ｃ３−１０ハロシクロアルキル基、Ｃ１−２０ニトロアルキル基、Ｃ５−２０ニトロアリール基、Ｃ３−１０ニトロシクロアルキル基、Ｃ１−２０チオアルキル基、Ｃ５−３０チオアリール基、Ｃ３−１０チオシクロアルキル基、Ｃ１−２０シアノアルキル基、Ｃ５−３０シアノアリール基、Ｃ３−１０シアノシクロアルキル基、Ｃ１−２０アルキルシリル基、及びＣ５−３０アリールシリル基を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
- 前記保護基が、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５−１０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
- Ｚ１が、
である、請求項１６に記載の方法。 - Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２が同一であるか又は異なり、それぞれは１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキル基である、請求項２２に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２が同一である、請求項２２に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれｉ−プロピルである、請求項２２に記載の方法。
- Ｒ１０がＣ１−１０シアノアルキル基である、請求項２２に記載の方法。
- Ｒ１０がシアノエチル基である、請求項２２に記載の方法。
- Ｑ１が、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
- Ｑ１が次式
−ＣＨ２−ＣＨ２−
で表される、請求項１６に記載の方法。 - Ｑ１が次式
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
で表される、請求項１６に記載の方法。 - Ｑ１が次式：
で表される、請求項１６に記載の方法。 - ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑがすべて１であり、
Ｑ１が、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
から選択され、
Ｑ２が酸素であり、
Ｑ３が−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がすべて水素であり、
Ｚ１が以下の構造：
を有する、請求項１６に記載の方法。 - 第一の目的のオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
（ｉ） 式Ｉ：
Ｘ１−Ｑ−Ｚ１ （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は以下の構造から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
Ｑは、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数である）
から選択される部分であり、
Ｚ１はリン酸化部分である）
の化合物を式ＶＩＩＩ：
で表される担体材料と反応させて、式ＩＸ：
（ｉｉ） 前記式ＶＩの第１の誘導体化された担体材料を、前記第１の目的のオリゴヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、少なくとも１つのヌクレオチドと反応させる工程と、
（ｉｉｉ） 式ＩＸの化合物から前記第１の目的のオリゴヌクレオチドを切断する工程とを備える方法。 - 前記リン酸化部分が、
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基であり得、あるいはＲ１１とＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択される、請求項３３に記載の方法。 - 前記保護基が、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５−１０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記保護基が、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項３４に記載の方法。
- 前記リン酸化部分が、
である、請求項３３に記載の方法。 - Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２が同一であるか又は異なり、それぞれは１以上のハロゲン、ニトロ基、チオ基、及びシアノ基で必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキル基である、請求項３７に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２が同一である、請求項３７に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２それぞれがｉ−プロピルである、請求項３７に記載の方法。
- Ｒ１０がＣ１−１０シアノアルキル基である、請求項３７に記載の方法。
- Ｒ１０がシアノエチル基である、請求項３７に記載の方法。
- Ｑ１が、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項３３に記載の方法。
- Ｑ１が次式
−ＣＨ２−ＣＨ２−
で表される、請求項３３に記載の方法。 - Ｑ１が次式
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
で表される、請求項３３に記載の方法。 - Ｑ１が次式：
で表される請求項３３に記載の方法。 - ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑがすべて１であり、
Ｑ１が、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
Ｑ２が酸素であり、
Ｑ３が−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がすべて水素であり、
Ｚ１が以下の構造：
を有する、請求項３３に記載の方法。 - 工程（ｉｉｉ）の前に、以下の追加の工程、すなわち、
末端水酸基保護基を工程（ｉｉ）の生成物から除去し、次いで該生成物を式Ｉの別の化合物と反応させて第２の誘導体化された担体材料を生成する工程と、
第２の目的のオリゴヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、前記第２の誘導体化された担体材料を少なくとも１つのヌクレオチドと反応させる工程とを実施する、請求項３３に記載の方法。 - 前記第１の目的のオリゴヌクレオチドと前記第２の目的のオリゴヌクレオチドとが実質的に同じ配列を有する、請求項４８に記載の方法。
- 前記第１の目的のオリゴヌクレオチドと前記第２の目的のオリゴヌクレオチドとが実質的に異なる配列を有する、請求項４８に記載の方法。
- 工程（ｉｉｉ）が、前記第１の目的のオリゴヌクレオチド及び前記第２の目的のオリゴヌクレオチドを実質的に同時に切断することを備えた、請求項４８に記載の方法。
- 工程（ｉｉｉ）が、前記第１の目的のオリゴヌクレオチドと前記第２の目的のオリゴヌクレオチドを順次切断することを備えた、請求項４８に記載の方法。
- 前記除去と前記反応工程を少なくとも２サイクル繰り返し実施して、少なくとも３つの目的のオリゴヌクレオチドを生成する、請求項４８に記載の方法。
- 工程（ｉｉｉ）が、少なくとも３つの目的のオリゴヌクレオチドを実質的に同時に切断することを備えた、請求項５３に記載の方法。
- 工程（ｉｉｉ）が、少なくとも３つの目的のオリゴヌクレオチドの順次切断することを備えた、請求項５３に記載の方法。
- 式Ｖａ又は式Ｖｂ：
Ｘ１は、以下の構造：
Ｒ１は水素、フッ素、又は−ＯＲ３であり、
Ｒ２及びＲ３は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、メチル、及び保護基から選択され、
Ｂ＊は核酸塩基である）
から選択される保護されたヌクレオシド部分を含み、
Ｑ１は有機部分であり、
Ｑ２は−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ７）−、及び−Ｓ−から選択され、
Ｑ３は−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−（Ｒ８）−Ｏ−、及び−Ｒ９−から選択され、
Ａ１及びＡ２は同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ、−ＣＯＮＲ７、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＳＲ７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−ＳＣ（Ｃ６Ｈ５）３、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ１−１０アルキルチオ基、−Ｓｉ（Ｒ７）３、Ｃ１−１０ハロアルキル基、ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラキノニル、
Ａ３及びＡ４は、同じでも異なってもよく、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、及び電子吸引基から選択され（但し、Ａ３とＡ４の少なくとも１つが電子吸引基を含む）、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であるか又は異なり、それぞれは水素、ハロゲン、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ７はＣ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、及びＣ３−１０シクロアルキル基から選択され、
Ｒ８はＣ１−１０アルキル基又はＣ５−１０アリール基であり、
Ｒ９はＣ５−１０アリール基又は−ＣＨ２−であり、
ｌ、ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ独立に０又は１であり、
ｏは０〜３０の整数であり、
ｑは０〜５０の整数であり、
Ｒ２５は水素、保護基、又はＺ１（Ｚ１はリン酸化部分）である）
で表される誘導体化されたヌクレオシドを生成する方法であって、
式ＩＩ及びＶＩで表される化合物：
- ｌ、ｏ、及びｑがそれぞれ独立に０又は１であり、
ｍ及びｎがそれぞれ１であり、
ｏが０〜１０の整数である、請求項５６に記載の方法。 - 式ＩＩとＶＩの化合物を反応させて反応生成物を生成させる工程と、その後前記反応生成物を式ＶＩＩａ又はＶＩＩｂの化合物と反応させて式Ｖａ又はＶｂの化合物を生成させる工程とを備える、請求項５６に記載の方法。
- 式ＶＩとＶＩＩａ又はＶＩとＶＩＩｂの化合物を反応させて反応生成物を生成させる工程と、その後前記反応生成物を式ＩＩの化合物と反応させて式Ｖａ又はＶｂの化合物を生成させる工程とを備える、請求項５６に記載の方法。
- 前記保護基が、置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−３０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ５−４０アルカリール基、Ｃ１−２０ハロアルキル基、Ｃ５−３０ハロアリール基、Ｃ３−１０ハロシクロアルキル基、Ｃ１−２０ニトロアルキル基、Ｃ５−２０ニトロアリール基、Ｃ３−１０ニトロシクロアルキル基、Ｃ１−２０チオアルキル基、Ｃ５−３０チオアリール基、Ｃ３−１０チオシクロアルキル基、Ｃ１−２０シアノアルキル基、Ｃ５−３０シアノアリール基、Ｃ３−１０シアノシクロアルキル基、Ｃ１−２０アルキルシリル基、及びＣ５−３０アリールシリル基を含む群から選択される、請求項５６に記載の方法。
- 前記保護基が、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ５−１０アリール基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ１−１０アルキルシリル基、Ｃ５−１０アリールシリル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項５６に記載の方法。
- 式Ｖａ又は式Ｖｂの化合物を式ＩＶの化合物
Ｚ２
（ＩＶ）
（式中、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）
と反応させる工程をさらに備える、請求項５６に記載の方法。 - Ｚ１が、
Ｒ１１及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル基、置換又は非置換Ｃ５−２０アリール基、置換又は非置換Ｃ５−２０アラルキル基であり得、あるいはＲ１１とＲ１２は共にＣ３−１０シクロアルキル基を形成し、これらすべてが酸素、窒素、及び硫黄から選択される１以上のヘテロ原子で必要に応じて置換されており、
Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は同一であるか又は異なり、それぞれは保護基である）
を含む群から選択される、請求項６２に記載の方法。 - Ｚ１が
である、請求項６２に記載の方法。 - Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は同一であるか又は異なり、それぞれは１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキル基である、請求項６４に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２が同一である、請求項６４に記載の方法。
- Ｒ１１及びＲ１２それぞれがｉ−プロピルである、請求項６４に記載の方法。
- Ｒ１０がＣ１−１０シアノアルキル基である、請求項６４に記載の方法。
- Ｒ１０がシアノエチル基である、請求項６４に記載の方法。
- Ｑ１が、Ｃ１−４０アルキル基、Ｃ５−４０アリール基、Ｃ５−４０アルキルアリール基、Ｃ３−４０シクロアルキル基、及び１以上のハロゲン、酸素、硫黄、ニトロ基、シリル基、チオ基、及びシアノ基で置換されたこれらの類縁体を含む群から選択される、請求項５６に記載の方法。
- ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑがすべて１であり、
Ｑ１が、
−ＣＨ２−ＣＨ２−
又は
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
又は
Ｑ２が酸素であり、
Ｑ３が−ＳＯ２であり、
Ａ１、Ａ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６がすべて水素であり、
前記リン酸化部分が以下の構造：
を有する、請求項５６に記載の方法。 - Ｒ２５がＺ１であり、前記工程の前に、まず式ＶＩＩａ又は式ＶＩＩｂの化合物を式ＩＶ：
Ｚ２
（式中、Ｚ２はＺ１のリン含有前駆体又は活性化されたリン酸化部分である）の化合物と最初に反応させ、その後、式（ＩＩ）の化合物及び式（ＶＩ）の化合物と順次反応させる請求項５６に記載の方法。
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