JPH07121954B2 - アミノ−誘導化重合体を合成するための有機リン結合剤 - Google Patents
アミノ−誘導化重合体を合成するための有機リン結合剤Info
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- JPH07121954B2 JPH07121954B2 JP5065993A JP6599393A JPH07121954B2 JP H07121954 B2 JPH07121954 B2 JP H07121954B2 JP 5065993 A JP5065993 A JP 5065993A JP 6599393 A JP6599393 A JP 6599393A JP H07121954 B2 JPH07121954 B2 JP H07121954B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般的に有機リン化合
物、より詳しくはアミノ−誘導化重合体、特にオリゴヌ
クレオチド類を合成するための有機リン結合剤に関す
る。
物、より詳しくはアミノ−誘導化重合体、特にオリゴヌ
クレオチド類を合成するための有機リン結合剤に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子及び遺伝子コントロール領域は現
在では分子レベルにおいて日常的に特徴付けられ研究す
ることができる。これはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を
操作及び変成することに伴う技術における幾つかの最近
の進歩により可能である。特に重要であるのはＤＮＡ配
列決定における進歩である（Methods in Enzymology,Gr
ossman及びMoldave 編, Vol.65 (Academic Press, ニュ
ーヨーク、1980) 中のマクサム（Maxam)及びギルバート
(Gilbert) の“Sequencing End-Labeled DNAwith Base-
Specific Chemical Cleavages"、及びスミス(Smith) "D
NA SequenceAnalysis by Primed Synthesis" 、それぞ
れ p.499〜560 及び 560〜580 ；多数の宿主制限変成酵
素の単離、Methods in Enzymology, Wu 編 Vol.68 (Aca
demicPress, ニューヨーク、1979) 中のロバーツ（Robe
rts)“Dictionary of Restriction Endonucleases"; 及
び規定されたＤＮＡ配列のクローニング及び増幅のため
のベクターの造成、例えば Methods in Enzymology、Wu
編 Vol.68 (AcademicPress ニューヨーク、1979）中の
ボリバー（Bolivar)及びバックマン（Backman)"Plasmid
s of Escherichia coli as Cloning Vectors"など) 。
在では分子レベルにおいて日常的に特徴付けられ研究す
ることができる。これはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を
操作及び変成することに伴う技術における幾つかの最近
の進歩により可能である。特に重要であるのはＤＮＡ配
列決定における進歩である（Methods in Enzymology,Gr
ossman及びMoldave 編, Vol.65 (Academic Press, ニュ
ーヨーク、1980) 中のマクサム（Maxam)及びギルバート
(Gilbert) の“Sequencing End-Labeled DNAwith Base-
Specific Chemical Cleavages"、及びスミス(Smith) "D
NA SequenceAnalysis by Primed Synthesis" 、それぞ
れ p.499〜560 及び 560〜580 ；多数の宿主制限変成酵
素の単離、Methods in Enzymology, Wu 編 Vol.68 (Aca
demicPress, ニューヨーク、1979) 中のロバーツ（Robe
rts)“Dictionary of Restriction Endonucleases"; 及
び規定されたＤＮＡ配列のクローニング及び増幅のため
のベクターの造成、例えば Methods in Enzymology、Wu
編 Vol.68 (AcademicPress ニューヨーク、1979）中の
ボリバー（Bolivar)及びバックマン（Backman)"Plasmid
s of Escherichia coli as Cloning Vectors"など) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの新しい技術の
多くはＤＮＡ断片或いはオリゴヌクレオチドが重合体支
持体に標識化或いは結合されることを要求する。商業的
或いは化学的に重要な天然遺伝子の配置を助けるために
用いることのできるＤＮＡ配列決定技術及び遺伝子プロ
ーブは標識化オリゴヌクレオチドの使用を要求する。最
近まで全てのＤＮＡ配列決定技術は電気泳動により分離
されたオリゴヌクレオチド断片を区別するために放射活
性標識に頼っていた。放射活性標識は感度が高く立体妨
害、その他の化学的副作用なしに導入することが出来
る。しかしながら、それらの使用は実験室の健康の危険
を生じ、それらが特別の取扱い及び処分を受けることを
必要とする。更に、それらの使用はヌクレオチド特異性
放射性標識が異ったヌクレオチド塩基の実際的な同定に
は利用可能でなく、オートラジオグラフィ及びシンチレ
ーション計数などの放射検知技術は余りにも時間がかか
るのでオリゴヌクレオチド類の迅速な自動配列決定には
適していない。その結果、蛍光及び比色標識化などの蛍
光性或いは発色性分子を共有結合的にオリゴヌクレオチ
ドに結合させる能力に依存する他の非−放射性標識化技
術が探索されてきた。
多くはＤＮＡ断片或いはオリゴヌクレオチドが重合体支
持体に標識化或いは結合されることを要求する。商業的
或いは化学的に重要な天然遺伝子の配置を助けるために
用いることのできるＤＮＡ配列決定技術及び遺伝子プロ
ーブは標識化オリゴヌクレオチドの使用を要求する。最
近まで全てのＤＮＡ配列決定技術は電気泳動により分離
されたオリゴヌクレオチド断片を区別するために放射活
性標識に頼っていた。放射活性標識は感度が高く立体妨
害、その他の化学的副作用なしに導入することが出来
る。しかしながら、それらの使用は実験室の健康の危険
を生じ、それらが特別の取扱い及び処分を受けることを
必要とする。更に、それらの使用はヌクレオチド特異性
放射性標識が異ったヌクレオチド塩基の実際的な同定に
は利用可能でなく、オートラジオグラフィ及びシンチレ
ーション計数などの放射検知技術は余りにも時間がかか
るのでオリゴヌクレオチド類の迅速な自動配列決定には
適していない。その結果、蛍光及び比色標識化などの蛍
光性或いは発色性分子を共有結合的にオリゴヌクレオチ
ドに結合させる能力に依存する他の非−放射性標識化技
術が探索されてきた。
【０００４】チュ等（Chu et al.) は“Derivatization
of Unprotected Polynucleotides"Nucleic Acids Rese
arch, Vol. 11、p. 6513-6529 (1983) においてアミン
をオリゴヌクレオチドの末端５´−ホスフェートに結合
する方法を開示している。この方法の一つの目的はアミ
ン結合により有機標識分子をオリゴヌクレオチドに結合
する手段を提供することである。この方法はオリゴヌク
レオチドをカルボジイミドで処理することを含む。
of Unprotected Polynucleotides"Nucleic Acids Rese
arch, Vol. 11、p. 6513-6529 (1983) においてアミン
をオリゴヌクレオチドの末端５´−ホスフェートに結合
する方法を開示している。この方法の一つの目的はアミ
ン結合により有機標識分子をオリゴヌクレオチドに結合
する手段を提供することである。この方法はオリゴヌク
レオチドをカルボジイミドで処理することを含む。
【０００５】コレット（Chollet)及びカワシマ（Kawash
ima)は"Biotin-Labeled SyntheticOligodeoxyribonucle
otides : Chemical Synthesis and Uses as Hybridizat
ionProbes", Nucleic Acids Research, Vol 13, p. 152
9-1541 (1985) においてチュ等のビオチンをオリゴヌク
レオチドの５´−ホスフェートに結合する方法の使用を
開示する。報告された50〜70％の収率は自動シンセサイ
ザーに使用するに必要とされるよりも低いものであり、
カルボジイミドは反応の途中においてオリゴヌクレオチ
ド塩基の望ましくない変成を引起こし得るものである。
ima)は"Biotin-Labeled SyntheticOligodeoxyribonucle
otides : Chemical Synthesis and Uses as Hybridizat
ionProbes", Nucleic Acids Research, Vol 13, p. 152
9-1541 (1985) においてチュ等のビオチンをオリゴヌク
レオチドの５´−ホスフェートに結合する方法の使用を
開示する。報告された50〜70％の収率は自動シンセサイ
ザーに使用するに必要とされるよりも低いものであり、
カルボジイミドは反応の途中においてオリゴヌクレオチ
ド塩基の望ましくない変成を引起こし得るものである。
【０００６】スミス等（Smith et al.) は "Synthesis
of Oligonucleotides Containingan Aliphatic Amino G
roup at the 5' Terminis : Synthesis of Fluorescent
DNA Primers for Use in DNA Sequence Analysis", Nuc
leic Acids Research,Vol. 13, p. 2399-2412 (1985)に
おいて蛍光或いは比色標識をオリゴヌクレオチド断片に
結合するための保護されたアミノ−誘導化ヌクレオチド
ホスホルアミダイドを開示する。この結合剤は塩基−特
異性標識をオリゴヌクレオチドの５´−末端に結合する
のに極めて有用であるが、保護−アミンホスホルアミダ
イトは容易に精製されない。
of Oligonucleotides Containingan Aliphatic Amino G
roup at the 5' Terminis : Synthesis of Fluorescent
DNA Primers for Use in DNA Sequence Analysis", Nuc
leic Acids Research,Vol. 13, p. 2399-2412 (1985)に
おいて蛍光或いは比色標識をオリゴヌクレオチド断片に
結合するための保護されたアミノ−誘導化ヌクレオチド
ホスホルアミダイドを開示する。この結合剤は塩基−特
異性標識をオリゴヌクレオチドの５´−末端に結合する
のに極めて有用であるが、保護−アミンホスホルアミダ
イトは容易に精製されない。
【０００７】コノリー（Connolly）及びライダー（Ride
r)は "Chemical Synthesis of Oligonucleotides Conta
ining a Free Sulphydryl Group and Subsequent Attac
hment of Thiol Specific Probes ", Nucleic Acids Re
search, Vol. 13, p. 4485-4502 (1985) においてトリ
チル−保護イオウを２、３、或いは６個の炭素鎖を介し
てオリゴヌクレオチドの５´ホスフェートに結合して有
するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。
r)は "Chemical Synthesis of Oligonucleotides Conta
ining a Free Sulphydryl Group and Subsequent Attac
hment of Thiol Specific Probes ", Nucleic Acids Re
search, Vol. 13, p. 4485-4502 (1985) においてトリ
チル−保護イオウを２、３、或いは６個の炭素鎖を介し
てオリゴヌクレオチドの５´ホスフェートに結合して有
するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。
【０００８】標識化剤をオリゴヌクレオチド類に結合す
ることから離れて、調製的及び分析的用途の両目的のた
めに各種分子を触媒、酵素、微生物、アフィニティ試
薬、免疫吸着剤などの重合体支持体上に固定化すること
に、大きな関心が寄せられている。例えばショット（Sc
hott), Affinity Chromatography (Mercel Dekker,Inc.
ニューヨーク 1984)及びモスバック（Mosback)編、Meth
ods in Enzymology,Vol. 44, "Immobilized Enzymes",
(Academic Press ニューヨーク 1976)。特にこの分野で
興味深いのは分子及び細胞を共有結合により固定化する
ための手段である。
ることから離れて、調製的及び分析的用途の両目的のた
めに各種分子を触媒、酵素、微生物、アフィニティ試
薬、免疫吸着剤などの重合体支持体上に固定化すること
に、大きな関心が寄せられている。例えばショット（Sc
hott), Affinity Chromatography (Mercel Dekker,Inc.
ニューヨーク 1984)及びモスバック（Mosback)編、Meth
ods in Enzymology,Vol. 44, "Immobilized Enzymes",
(Academic Press ニューヨーク 1976)。特にこの分野で
興味深いのは分子及び細胞を共有結合により固定化する
ための手段である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の化合物は２−置
換−３−保護−１，３，２ −オキサザホスファシクロ
アルカン類よりなる新規結合剤を包含するものである。
本発明は蛍光及び発色染料などの有機部分をＤＮＡ断片
及びオリゴヌクレオチド類、特に一本鎖ＤＮＡ及びＲＮ
Ａに結合するために、及びＤＮＡ断片、オリゴヌクレオ
チド類、タンパク質などを重合体支持体に結合するため
に有用な化合物に関する。これらの化合物及びそれらの
複合体は自動及び手動ＤＮＡ及びＲＮＡ合成及び配列分
析、遺伝子プローブの構成、アフィニティ技術などにお
いて有用である。特に、本発明の結合剤の環状態様はよ
り容易に精製された結合剤を提供することにより現在利
用可能な結合方法に伴う欠点を有利に克服するものであ
る。
換−３−保護−１，３，２ −オキサザホスファシクロ
アルカン類よりなる新規結合剤を包含するものである。
本発明は蛍光及び発色染料などの有機部分をＤＮＡ断片
及びオリゴヌクレオチド類、特に一本鎖ＤＮＡ及びＲＮ
Ａに結合するために、及びＤＮＡ断片、オリゴヌクレオ
チド類、タンパク質などを重合体支持体に結合するため
に有用な化合物に関する。これらの化合物及びそれらの
複合体は自動及び手動ＤＮＡ及びＲＮＡ合成及び配列分
析、遺伝子プローブの構成、アフィニティ技術などにお
いて有用である。特に、本発明の結合剤の環状態様はよ
り容易に精製された結合剤を提供することにより現在利
用可能な結合方法に伴う欠点を有利に克服するものであ
る。
【００１０】本発明の結合化合物は下記一般式により表
わされる２−置換−３−保護−１，３，２−オキサザホ
スファシクロアルカン類を包含する：
わされる２−置換−３−保護−１，３，２−オキサザホ
スファシクロアルカン類を包含する：
【００１１】
【化２】
【００１２】式中：ｊは２または３であり、Ｒ1 はトリ
ハロアセチルである。Ｒ4 は６個までの炭素原子を含有
する低級アルキルである。本発明において用いられる
「低級アルキル」という用語は１〜６個の炭素原子を含
有する直鎖及び分岐鎖アルキル基、例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、tert−ブチル、イソブチ
ル、sec−ブチル、ネオペンチル、tert−ペンチルなど
を示す。
ハロアセチルである。Ｒ4 は６個までの炭素原子を含有
する低級アルキルである。本発明において用いられる
「低級アルキル」という用語は１〜６個の炭素原子を含
有する直鎖及び分岐鎖アルキル基、例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、tert−ブチル、イソブチ
ル、sec−ブチル、ネオペンチル、tert−ペンチルなど
を示す。
【００１３】本発明の結合化合物を使用して次の複合体
を精製することができる。この複合体は次式で表わされ
る亜リン酸トリエステル及びリン酸トリエステル及びジ
エステル化合物を包含する：
を精製することができる。この複合体は次式で表わされ
る亜リン酸トリエステル及びリン酸トリエステル及びジ
エステル化合物を包含する：
【００１４】
【化３】
【００１５】式中：ｉは０または１であり（ｉ＝０は亜
リン酸エステルを示し、及びｉ＝１はリン酸エステルを
示す）ｊは２または３であり、Ｒ1 はトリハロアセチル
であり、Ｒ4 は６個までの炭素原子を含有する低級アル
キルであり、及びＷはオリゴヌクレオチド、或いは重合
体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを示す。
リン酸エステルを示し、及びｉ＝１はリン酸エステルを
示す）ｊは２または３であり、Ｒ1 はトリハロアセチル
であり、Ｒ4 は６個までの炭素原子を含有する低級アル
キルであり、及びＷはオリゴヌクレオチド、或いは重合
体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを示す。
【００１６】オリゴヌクレオチド類としては、一本鎖或
いは二本鎖ＲＮＡの断片及び一本鎖−及び二本鎖ＤＮＡ
の断片を含む。好ましくは結合剤はオリゴヌクレオチド
の末端５´炭素、オリゴヌクレオチドの末端３´炭素或
いはＲＮＡの末端２´炭素に接合している。より好まし
くは、結合剤はオリゴヌクレオチドの末端５´炭素原子
に接合しており、最も好ましくは結合剤は一本鎖ＤＮＡ
の断片の末端５´炭素に接合している。
いは二本鎖ＲＮＡの断片及び一本鎖−及び二本鎖ＤＮＡ
の断片を含む。好ましくは結合剤はオリゴヌクレオチド
の末端５´炭素、オリゴヌクレオチドの末端３´炭素或
いはＲＮＡの末端２´炭素に接合している。より好まし
くは、結合剤はオリゴヌクレオチドの末端５´炭素原子
に接合しており、最も好ましくは結合剤は一本鎖ＤＮＡ
の断片の末端５´炭素に接合している。
【００１７】重合体支持体は各種の形態及び組成を有し
てよい。重合体支持体は天然材料、合成的に変成された
天然材料及び合成材料から誘導することができる。特に
興味深いのはポリサッカライド類、特に架橋ポリサッカ
ライド類、例えばSepharoseとして利用可能なアガロー
ス、Sephadex及びSephacylとして利用可能なデキストラ
ン、セルロース、デンプンなどである（Sepharose, Sep
hadex 及びSephacylはPharmacia Fine Chemicalsの商標
を付された製品である）。その他の材料としてはポリア
クリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、
ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレー
トの共重合体、シリコーン、テフロンガラス、細胞など
が挙げられる。粒子などの形状の固体支持体に加えて、
重合体支持体は又内部液体を含有し、空間を規定するの
に役立つ親油性或いは両親媒性膜よりなる液体粒子の形
態であってよい。その様な粒子としては、小胞、細胞、
リポソームなどが挙げられる。好ましくはＡ´はヒドロ
キシル官能性を有する不溶性重合体支持体を表わす。本
発明の結合剤は以下に一般的に説明される結合剤をオリ
ゴヌクレオチド類に結合させる次の方法によりヒドロキ
シル官能性を有する重合体支持体に結合される。
てよい。重合体支持体は天然材料、合成的に変成された
天然材料及び合成材料から誘導することができる。特に
興味深いのはポリサッカライド類、特に架橋ポリサッカ
ライド類、例えばSepharoseとして利用可能なアガロー
ス、Sephadex及びSephacylとして利用可能なデキストラ
ン、セルロース、デンプンなどである（Sepharose, Sep
hadex 及びSephacylはPharmacia Fine Chemicalsの商標
を付された製品である）。その他の材料としてはポリア
クリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、
ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレー
トの共重合体、シリコーン、テフロンガラス、細胞など
が挙げられる。粒子などの形状の固体支持体に加えて、
重合体支持体は又内部液体を含有し、空間を規定するの
に役立つ親油性或いは両親媒性膜よりなる液体粒子の形
態であってよい。その様な粒子としては、小胞、細胞、
リポソームなどが挙げられる。好ましくはＡ´はヒドロ
キシル官能性を有する不溶性重合体支持体を表わす。本
発明の結合剤は以下に一般的に説明される結合剤をオリ
ゴヌクレオチド類に結合させる次の方法によりヒドロキ
シル官能性を有する重合体支持体に結合される。
【００１８】一般式IIの左手側の（Ｈ及びＲ1 を囲む）
はこの実施態様が化合物の保護及び脱保護形態の両者を
含むことを示す。オリゴヌクレオチド類はアフィニティ
クロマトグラフィの標準的技術により或いは例えばカル
サーズ等（Caruthers et al.）により米国特許 4,458,0
66号及び4,415,732 号明細書などにより開示される結合
手段により重合体支持体に結合される。
はこの実施態様が化合物の保護及び脱保護形態の両者を
含むことを示す。オリゴヌクレオチド類はアフィニティ
クロマトグラフィの標準的技術により或いは例えばカル
サーズ等（Caruthers et al.）により米国特許 4,458,0
66号及び4,415,732 号明細書などにより開示される結合
手段により重合体支持体に結合される。
【００１９】一般的に本発明のリン酸トリエステル化合
物は上記亜リン酸複合体から酸化により、例えば水、
２，６−ルチジン及びテトラヒドロフラン中においてＩ
2 を用いて酸化により得られる。酸化は極めて迅速であ
る（１〜２分）。本発明のリン酸ジエステル複合体は上
記リン酸トリエステルから標準的技術により、例えばＲ
4 がメチルである場合にはリン酸ジエステルはチオフェ
ノール／トリエチルアミンで約30分間処理することによ
りリン酸トリエステルから得られる。一般式Ｉのホスホ
ルアミダイド前駆体を合成する一般的方法は次の工程を
含んでなる。次式により表されるハロ−置換−Ｎ，Ｎ−
ジ−置換−Ｏ−置換ホスフィン：
物は上記亜リン酸複合体から酸化により、例えば水、
２，６−ルチジン及びテトラヒドロフラン中においてＩ
2 を用いて酸化により得られる。酸化は極めて迅速であ
る（１〜２分）。本発明のリン酸ジエステル複合体は上
記リン酸トリエステルから標準的技術により、例えばＲ
4 がメチルである場合にはリン酸ジエステルはチオフェ
ノール／トリエチルアミンで約30分間処理することによ
りリン酸トリエステルから得られる。一般式Ｉのホスホ
ルアミダイド前駆体を合成する一般的方法は次の工程を
含んでなる。次式により表されるハロ−置換−Ｎ，Ｎ−
ジ−置換−Ｏ−置換ホスフィン：
【００２０】
【化４】
【００２１】（式中、Ｘはハロゲン、通常クロロであ
り、及びＲ´、Ｒ”及びＲ4 は上記と同義である。）を
次式で定義されるアミノ−保護アルコールアミン：
り、及びＲ´、Ｒ”及びＲ4 は上記と同義である。）を
次式で定義されるアミノ−保護アルコールアミン：
【００２２】
【化５】
【００２３】（式中、Ｒ1 及びｊは上記と同義であ
る。）を反応中に放出されたハロゲン酸を吸収する非−
求核塩基、例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
などのトリアルキルアミンを含有する非−プロトン性溶
媒例えばジクロロメタンなどの中で反応させる。好まし
くは反応はアルゴンなどの不活性雰囲気下に行われる。
酸はホスホルアミダイト生成物のアミンをプロトン化さ
せて反応性にするので反応混合物中の酸性条件は避ける
べきである。非−求核塩基は塩基と活性化ホスホルアミ
ダイトとの間の副反応の可能性を減少させる。
る。）を反応中に放出されたハロゲン酸を吸収する非−
求核塩基、例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
などのトリアルキルアミンを含有する非−プロトン性溶
媒例えばジクロロメタンなどの中で反応させる。好まし
くは反応はアルゴンなどの不活性雰囲気下に行われる。
酸はホスホルアミダイト生成物のアミンをプロトン化さ
せて反応性にするので反応混合物中の酸性条件は避ける
べきである。非−求核塩基は塩基と活性化ホスホルアミ
ダイトとの間の副反応の可能性を減少させる。
【００２４】上記材料を反応後、以下第一反応混合物と
称される反応混合物を軽度に塩基性の溶液で洗浄して非
−求核塩基の塩を除去する。最後に、第一反応混合物を
例えば MgSO4、Na2SO4などを用いて乾燥し、ホスホルア
ミダイト前駆体を得る。一般式Ｉの複素環は適当な前駆
体を加熱して第二反応混合物を形成し、次いで複素環を
混合物から除去することにより得られる。必要な加熱
量、即ち温度及び継続時間は本発明の異った実施態様に
応じて異るが、好ましくは加熱は前駆体を約25〜250 ℃
の、より好ましくは約25〜150 ℃、最も好ましくは約25
〜100 ℃の範囲内の温度に上昇させることを含む。分離
方法の選択は、置換基Ｒ1 及びＲ4の性質に応じて異
る。例えば大雑把な近似として置換基の総分子量が十分
に低い場合には、加熱及び分離工程は蒸留により達成す
ることが出来る。その他の分離方法としては、結晶化及
びクロマトグラフィーが挙げられる。好ましくは、本発
明のオリゴヌクレオチドと結合剤の複合体は結合剤をカ
ルーサース(Caruthers)及び彼の共同研究者により開発
された固相合成方法により合成されたオリゴヌクレオチ
ド類に結合させることにより形成される〔例、カルーサ
ース等(Carutherset al.)、p.１〜17、Genetic Enginee
ring, Vol.4、Setlow and Hollaender編（Plenum Pres
s, ニューヨーク 1982)、及びカルーサース等 (Caruthe
rs et al.) 、米国特許4,458,066号明細書〕。
称される反応混合物を軽度に塩基性の溶液で洗浄して非
−求核塩基の塩を除去する。最後に、第一反応混合物を
例えば MgSO4、Na2SO4などを用いて乾燥し、ホスホルア
ミダイト前駆体を得る。一般式Ｉの複素環は適当な前駆
体を加熱して第二反応混合物を形成し、次いで複素環を
混合物から除去することにより得られる。必要な加熱
量、即ち温度及び継続時間は本発明の異った実施態様に
応じて異るが、好ましくは加熱は前駆体を約25〜250 ℃
の、より好ましくは約25〜150 ℃、最も好ましくは約25
〜100 ℃の範囲内の温度に上昇させることを含む。分離
方法の選択は、置換基Ｒ1 及びＲ4の性質に応じて異
る。例えば大雑把な近似として置換基の総分子量が十分
に低い場合には、加熱及び分離工程は蒸留により達成す
ることが出来る。その他の分離方法としては、結晶化及
びクロマトグラフィーが挙げられる。好ましくは、本発
明のオリゴヌクレオチドと結合剤の複合体は結合剤をカ
ルーサース(Caruthers)及び彼の共同研究者により開発
された固相合成方法により合成されたオリゴヌクレオチ
ド類に結合させることにより形成される〔例、カルーサ
ース等(Carutherset al.)、p.１〜17、Genetic Enginee
ring, Vol.4、Setlow and Hollaender編（Plenum Pres
s, ニューヨーク 1982)、及びカルーサース等 (Caruthe
rs et al.) 、米国特許4,458,066号明細書〕。
【００２５】結合剤の結合は合成方法の最終工程として
行われる、即ち結合剤はそれがあたかもカルーサース等
におけるヌクレオチドのサブユニットであるが如く、オ
リゴヌクレオチドに結合される。
行われる、即ち結合剤はそれがあたかもカルーサース等
におけるヌクレオチドのサブユニットであるが如く、オ
リゴヌクレオチドに結合される。
【００２６】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するのに役立つ
ものである。試薬の濃度、温度、及びその他の可変パラ
メータの値は本発明の応用を例示するのみであり、それ
らの限定と考えられてはならない。 実施例Ｉ．２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−
１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンのホスホ
ルアミダイド前駆体の合成 クロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（5.0ml, AldrichChemical Co.,ミルウォーキー、
ウィスコンシン州から市販) を０℃においてジクロロメ
タン（約40ml）中のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−
２，２，２−トリフルオロアセタミド（3.9g）及びジイ
ソプロピルエチルアミン（5.0ml)の攪拌された溶液にア
ルゴン下に滴加した。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−
２，２，２−トリフルオロアセタミドをラザラス（Laza
rus)及びベンコビック(Benkovic)によりJ. Am. Chem. S
oc., Vol.101, p. 4300-4312 (1979）により開示される
次の方法に従って合成した。即ち、50mlのクロロホルム
中のエチルトリフルオロアセテート（56.8g, 0.4mol)を
50mlのクロロホルム中の24.4g (0.4mol)のエタノールア
ミンの攪拌された溶液に滴下した。この溶液を室温で５
時間攪拌し、ロータリーエバポレーションにより溶媒を
除去し、および115 ℃で蒸留して（4.3Torr)、58.5ｇの
油を得、これは引掻くことにより結晶化した。室温にお
いて0.5 時間攪拌後、反応混合物を 0.2Ｍ炭酸カリウム
溶液で一回、及び塩水で一回洗浄し、乾燥し（MgSO4)、
減圧濃縮してＮ−（２−（Ｎ´，Ｎ´−ジイソプロピル
アミノメトキシホスフィニルオキシ）エチル）−２，
２，２−トリフルオロアセタミドを無色液体として得た
（7.77ｇ）。1 Ｈ−ＮＭＲ（CD2Cl2) : δ3.6 (6H, m), 3.4 (3H, d,
J=12),1.2 (12H, d, J=6.5)31 Ｐ−ＮＭＲ（CD2Cl2, 1H−decoupled) : δ149 (s)
ものである。試薬の濃度、温度、及びその他の可変パラ
メータの値は本発明の応用を例示するのみであり、それ
らの限定と考えられてはならない。 実施例Ｉ．２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−
１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンのホスホ
ルアミダイド前駆体の合成 クロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（5.0ml, AldrichChemical Co.,ミルウォーキー、
ウィスコンシン州から市販) を０℃においてジクロロメ
タン（約40ml）中のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−
２，２，２−トリフルオロアセタミド（3.9g）及びジイ
ソプロピルエチルアミン（5.0ml)の攪拌された溶液にア
ルゴン下に滴加した。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−
２，２，２−トリフルオロアセタミドをラザラス（Laza
rus)及びベンコビック(Benkovic)によりJ. Am. Chem. S
oc., Vol.101, p. 4300-4312 (1979）により開示される
次の方法に従って合成した。即ち、50mlのクロロホルム
中のエチルトリフルオロアセテート（56.8g, 0.4mol)を
50mlのクロロホルム中の24.4g (0.4mol)のエタノールア
ミンの攪拌された溶液に滴下した。この溶液を室温で５
時間攪拌し、ロータリーエバポレーションにより溶媒を
除去し、および115 ℃で蒸留して（4.3Torr)、58.5ｇの
油を得、これは引掻くことにより結晶化した。室温にお
いて0.5 時間攪拌後、反応混合物を 0.2Ｍ炭酸カリウム
溶液で一回、及び塩水で一回洗浄し、乾燥し（MgSO4)、
減圧濃縮してＮ−（２−（Ｎ´，Ｎ´−ジイソプロピル
アミノメトキシホスフィニルオキシ）エチル）−２，
２，２−トリフルオロアセタミドを無色液体として得た
（7.77ｇ）。1 Ｈ−ＮＭＲ（CD2Cl2) : δ3.6 (6H, m), 3.4 (3H, d,
J=12),1.2 (12H, d, J=6.5)31 Ｐ−ＮＭＲ（CD2Cl2, 1H−decoupled) : δ149 (s)
【００２７】実施例II．２−メトキシ−３−トリフルオ
ロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロヘキ
サンのホスホルアミダイド前駆体の合成 クロロ─Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（3.7ml)を０℃でジクロロメタン（約20ml）中のＮ
−（３−ヒドロキシプロピル）−２，２，２−トリフル
オロアセタミド（2.9g、３−アミノ−１−プロパノール
及びエチルトリフルオロアセテートからラザラス及びベ
ンコビック、J. Amer. Chem. Soc.,Vol. 101, p. 4300-
4312（1979) に開示された方法と同様にして合成）及び
ジイソプロピルエチルアミン（3.7ml)の攪拌された溶液
にアルゴン下に滴加した。室温で３時間攪拌後反応混合
物をヘキサン（100ml)中に注ぎ攪拌した。混合物を沈澱
させ、上澄液を分離し、減圧濃縮してＮ−（３−（Ｎ
´，Ｎ´−ジイソプロピルアミノメトキシホスホニルオ
キシ）プロピル）−２，２，２−トリフルオロアセタミ
ドを無色液体として得た（5.2g) 。31 Ｐ−ＮＭＲ（CH2Cl2, 1H−decoupled) : δ149(s)
ロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロヘキ
サンのホスホルアミダイド前駆体の合成 クロロ─Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（3.7ml)を０℃でジクロロメタン（約20ml）中のＮ
−（３−ヒドロキシプロピル）−２，２，２−トリフル
オロアセタミド（2.9g、３−アミノ−１−プロパノール
及びエチルトリフルオロアセテートからラザラス及びベ
ンコビック、J. Amer. Chem. Soc.,Vol. 101, p. 4300-
4312（1979) に開示された方法と同様にして合成）及び
ジイソプロピルエチルアミン（3.7ml)の攪拌された溶液
にアルゴン下に滴加した。室温で３時間攪拌後反応混合
物をヘキサン（100ml)中に注ぎ攪拌した。混合物を沈澱
させ、上澄液を分離し、減圧濃縮してＮ−（３−（Ｎ
´，Ｎ´−ジイソプロピルアミノメトキシホスホニルオ
キシ）プロピル）−２，２，２−トリフルオロアセタミ
ドを無色液体として得た（5.2g) 。31 Ｐ−ＮＭＲ（CH2Cl2, 1H−decoupled) : δ149(s)
【００２８】実施例III. ２−メトキシ−３−トリフル
オロアセチル−１，３，２，−オキサザホスファシクロ
ペンタンの合成 Ｎ−（２−（Ｎ´，Ｎ´−ジイソプロピルアミノメトキ
シホスフィニルオキシ）エチル）−２，２，２−トリフ
ルオロアセタミド(7.7g)を蒸留して（0.8Torrにおいて5
8〜59℃）、定量的に２−メトキシ−３−トリフルオロ
アセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタ
ンを無色液体として得た。 ＩＲ（膜）：1705, 1420, 1230, 1200, 1160, 1020, 96
5 cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（CD2Cl2) : δ4.45 (2H, m), 3.65 (2H,
m) 3.60 (3H, d, J=12)31 Ｐ−ＮＭＲ（CD2Cl2, 1H−decoupled) : δ132 (s),
125 (q, J=61), ＭＳ：m/e 217 (M+), 197, 148, 136, 123, 120, 109,
92, 79, 70 (100),69, 62
オロアセチル−１，３，２，−オキサザホスファシクロ
ペンタンの合成 Ｎ−（２−（Ｎ´，Ｎ´−ジイソプロピルアミノメトキ
シホスフィニルオキシ）エチル）−２，２，２−トリフ
ルオロアセタミド(7.7g)を蒸留して（0.8Torrにおいて5
8〜59℃）、定量的に２−メトキシ−３−トリフルオロ
アセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタ
ンを無色液体として得た。 ＩＲ（膜）：1705, 1420, 1230, 1200, 1160, 1020, 96
5 cm-1 1 Ｈ−ＮＭＲ（CD2Cl2) : δ4.45 (2H, m), 3.65 (2H,
m) 3.60 (3H, d, J=12)31 Ｐ−ＮＭＲ（CD2Cl2, 1H−decoupled) : δ132 (s),
125 (q, J=61), ＭＳ：m/e 217 (M+), 197, 148, 136, 123, 120, 109,
92, 79, 70 (100),69, 62
【００２９】実施例IV．２−メトキシ−３−トリフルオ
ロアセチル−１，３，２─オキサザホスファシクロペン
タンのオリゴヌクレオチドの５´末端への結合 ２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２
−オキサザホスファシクロペンタンのオリゴヌクレオチ
ドの５´ヒドロキシルへの結合は、アプライド・バイオ
システム 380A ＤＮＡシンセサイザー (Applied Biosys
tems、フォスターシティ、カリフォルニア州）或いは同
様の機器上で行った。カルーサース等(Caruthers et a
l.)、米国特許4,458,066 号；カルーサース等、米国特
許4,415,732 号；及びカルーサース等「デオキシオリゴ
ヌクレオチド類の新しい合成方法（New Methods for Sy
nthesizing Deoxyoligonucleotides) 」、Genetic Engi
neering, Vol.4, １〜17頁（Plenum Press、ニューヨー
ク、1982）はアプライド・バイオシステム 380A ＤＮＡ
シンセサイザーにより用いられる化学の詳細な説明を与
えている。従って、これらの文献はそれらの説明に対し
て準用する。２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル
−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンは、0.
5 Ｍテトラゾール／アセトニトリル溶液と組合わせて0.
2 Ｍアセトニトリル溶液として用い、合成サイクルにお
ける活性試薬を形成した。通常のシンセサイザーサイク
ルは活性試薬の添加時においての４次の様に変成した。
活性試薬は各添加後１時間の待時間で２度添加した。カ
ップリング収率は約95％であった。チオフェノール／ト
リエチルアミン及び次いで水酸化アンモニウムによる通
常の脱保護は５´−アミノエチルホスフェートオリゴヌ
クレオチドを与えた。活性試薬が0.2M ２−メトキシ−
３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホス
ファシクロペンタン及び0.1M ４−ジメチルアミノピリ
ジンを含有するアセトニトリル溶液よりなる場合にも同
様な収率が得られた。この場合には、変成活性剤試薬は
一度添加され、約15分間反応させた。
ロアセチル−１，３，２─オキサザホスファシクロペン
タンのオリゴヌクレオチドの５´末端への結合 ２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２
−オキサザホスファシクロペンタンのオリゴヌクレオチ
ドの５´ヒドロキシルへの結合は、アプライド・バイオ
システム 380A ＤＮＡシンセサイザー (Applied Biosys
tems、フォスターシティ、カリフォルニア州）或いは同
様の機器上で行った。カルーサース等(Caruthers et a
l.)、米国特許4,458,066 号；カルーサース等、米国特
許4,415,732 号；及びカルーサース等「デオキシオリゴ
ヌクレオチド類の新しい合成方法（New Methods for Sy
nthesizing Deoxyoligonucleotides) 」、Genetic Engi
neering, Vol.4, １〜17頁（Plenum Press、ニューヨー
ク、1982）はアプライド・バイオシステム 380A ＤＮＡ
シンセサイザーにより用いられる化学の詳細な説明を与
えている。従って、これらの文献はそれらの説明に対し
て準用する。２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル
−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンは、0.
5 Ｍテトラゾール／アセトニトリル溶液と組合わせて0.
2 Ｍアセトニトリル溶液として用い、合成サイクルにお
ける活性試薬を形成した。通常のシンセサイザーサイク
ルは活性試薬の添加時においての４次の様に変成した。
活性試薬は各添加後１時間の待時間で２度添加した。カ
ップリング収率は約95％であった。チオフェノール／ト
リエチルアミン及び次いで水酸化アンモニウムによる通
常の脱保護は５´−アミノエチルホスフェートオリゴヌ
クレオチドを与えた。活性試薬が0.2M ２−メトキシ−
３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホス
ファシクロペンタン及び0.1M ４−ジメチルアミノピリ
ジンを含有するアセトニトリル溶液よりなる場合にも同
様な収率が得られた。この場合には、変成活性剤試薬は
一度添加され、約15分間反応させた。
【００３０】実施例Ｖ．２−メトキシ−３−トリフルオ
ロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペン
タンのオリゴヌクレオチドの３´末端への結合 結合はオリゴヌクレオチドが一般的にカルーサース等
（Caruthers et al.) 米国特許4,458,066 号明細書に記
載された方法に従って３’方向に合成された以外は実施
例IVと実質的に同様にして達成された。〔大雑把に云っ
て、相違はオリゴヌクレオチドが５´−保護ヌクレオチ
ドの３´Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダ
イドの代りに３´−保護ヌクレオチドの５´Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスホルアミダイドから合成される
ことである。或いは又、オリゴヌクレオチドはコラナ(K
horana) 及びイタクラ(Itakura) のホスホトリエステル
法を用いて３´方向に合成される（即ち、Khorana, Sci
ence, Vol. 203, p, 614-625(1979)；Itakura et al.
J. Biol. Chem., Vol. 250, p. 4592-4600 、これらの
両文献は準用する）或いはその他者による修正、例えば
レッシンガー（Letsinger)及びマハデラン（Mahadera
n)、J. Am. Chem. Soc. Vol. 187, p. 3526- (1965)
〕。いづれの場合にも結合剤はヌクレオチドの代りに
最終添加として結合される。
ロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペン
タンのオリゴヌクレオチドの３´末端への結合 結合はオリゴヌクレオチドが一般的にカルーサース等
（Caruthers et al.) 米国特許4,458,066 号明細書に記
載された方法に従って３’方向に合成された以外は実施
例IVと実質的に同様にして達成された。〔大雑把に云っ
て、相違はオリゴヌクレオチドが５´−保護ヌクレオチ
ドの３´Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダ
イドの代りに３´−保護ヌクレオチドの５´Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスホルアミダイドから合成される
ことである。或いは又、オリゴヌクレオチドはコラナ(K
horana) 及びイタクラ(Itakura) のホスホトリエステル
法を用いて３´方向に合成される（即ち、Khorana, Sci
ence, Vol. 203, p, 614-625(1979)；Itakura et al.
J. Biol. Chem., Vol. 250, p. 4592-4600 、これらの
両文献は準用する）或いはその他者による修正、例えば
レッシンガー（Letsinger)及びマハデラン（Mahadera
n)、J. Am. Chem. Soc. Vol. 187, p. 3526- (1965)
〕。いづれの場合にも結合剤はヌクレオチドの代りに
最終添加として結合される。
【００３１】実施例VI．フルオレッセインイソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）のアミノエチルホスフェートオリゴ
ヌクレオチドへの結合 フルオレッセイン−６−イソチオシアネートのジメチル
ホルムアミド溶液 (10mg／ml濃度の25μl、例えば Mole
cular Probes,Inc.、ジャンクションシティ、オレゴン
州から市販）を水(200μl)及び１M NaHCO3／Na2CO3緩衝
液、pH9.0 (25μl)中の５´−アミノエチルホスフェー
ト TCCCAGTCACGACGTT (0.200μmol、Applied Biosyste
ms 380A ＤＮＡシンセサイザー上で作られた未精製物
質、ここでＴ＝チミジン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアノシ
ン、及びＡ＝アデノシン）の溶液に添加した。得られた
溶液を室温において暗所で少なくとも６時間貯蔵した。
未結合染料を除去するために反応混合物を平衡化された
10ml Sephadex (Pharmacia Fine Chemicalsの商標）Ｇ
−25（媒体）カラムに水で通過させた。排除された容積
内の着色物質のバンドを集めた。粗製５´─フルオレッ
セインアミノエチルホスフェートオリゴヌクレオチドを
ＨＰＬＣ（例、Perkin-Elmer Series ４、或いは同様の
機器）により Vydac C18カラム（No. 218T54）などの上
で10〜20％アセトニトリル/0.1M トリエチルアンモニウ
ムアセテート、pH7.0 の線形勾配中で精製した。
ネート（ＦＩＴＣ）のアミノエチルホスフェートオリゴ
ヌクレオチドへの結合 フルオレッセイン−６−イソチオシアネートのジメチル
ホルムアミド溶液 (10mg／ml濃度の25μl、例えば Mole
cular Probes,Inc.、ジャンクションシティ、オレゴン
州から市販）を水(200μl)及び１M NaHCO3／Na2CO3緩衝
液、pH9.0 (25μl)中の５´−アミノエチルホスフェー
ト TCCCAGTCACGACGTT (0.200μmol、Applied Biosyste
ms 380A ＤＮＡシンセサイザー上で作られた未精製物
質、ここでＴ＝チミジン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアノシ
ン、及びＡ＝アデノシン）の溶液に添加した。得られた
溶液を室温において暗所で少なくとも６時間貯蔵した。
未結合染料を除去するために反応混合物を平衡化された
10ml Sephadex (Pharmacia Fine Chemicalsの商標）Ｇ
−25（媒体）カラムに水で通過させた。排除された容積
内の着色物質のバンドを集めた。粗製５´─フルオレッ
セインアミノエチルホスフェートオリゴヌクレオチドを
ＨＰＬＣ（例、Perkin-Elmer Series ４、或いは同様の
機器）により Vydac C18カラム（No. 218T54）などの上
で10〜20％アセトニトリル/0.1M トリエチルアンモニウ
ムアセテート、pH7.0 の線形勾配中で精製した。
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、蛍光及び発色染料など
の有機部分をＤＮＡ断片及びオリゴヌクレオチド類、特
に、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡに結合するために、及びＤ
ＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、タンパク質などを重
合体支持体に結合するために有用であり、自動及び手動
ＤＮＡ及びＲＮＡ合成及び配列分析、遺伝子プローブの
構成、アフィニティ技術などに応用される。
の有機部分をＤＮＡ断片及びオリゴヌクレオチド類、特
に、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡに結合するために、及びＤ
ＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、タンパク質などを重
合体支持体に結合するために有用であり、自動及び手動
ＤＮＡ及びＲＮＡ合成及び配列分析、遺伝子プローブの
構成、アフィニティ技術などに応用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウー，サム リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061レッドウッド シティ カルロス ロード 450 (72)発明者 スミス，ロイド エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91030サウス パサデナ メリディアン アベニュー 612 (56)参考文献 Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．84：43943Ｍ（1976) Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．81：63723Ｆ（1974) Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．91：57094Ｓ（1979)
Claims (3)
- 【請求項１】 次式で表されるアミノ−誘導化重合体を
合成するための有機リン結合剤。 【化１】 式中：ｊは２または３であり、Ｒ1 はトリハロアセチル
である。Ｒ4 は６個までの炭素原子を含有する低級アル
キルである。 - 【請求項２】 ２−メトキシ−３−トリフルオロアセチ
ル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタンであ
る請求項１記載の有機リン結合剤。 - 【請求項３】 ２−メトキシ−３−トリフルオロアセチ
ル−１，３，２−オキサザホスファシクロヘキサンであ
る請求項１記載の有機リン結合剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5065993A JPH07121954B2 (ja) | 1986-09-20 | 1993-03-03 | アミノ−誘導化重合体を合成するための有機リン結合剤 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61505094A JPH06102670B2 (ja) | 1985-08-26 | 1986-09-20 | ２―置換―３―保護―１，３，２―オキサザホスファシクロアルカン類の合成方法 |
| JP5065993A JPH07121954B2 (ja) | 1986-09-20 | 1993-03-03 | アミノ−誘導化重合体を合成するための有機リン結合剤 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61505094A Division JPH06102670B2 (ja) | 1985-08-26 | 1986-09-20 | ２―置換―３―保護―１，３，２―オキサザホスファシクロアルカン類の合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06206889A JPH06206889A (ja) | 1994-07-26 |
| JPH07121954B2 true JPH07121954B2 (ja) | 1995-12-25 |
Family
ID=26407152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5065993A Expired - Fee Related JPH07121954B2 (ja) | 1986-09-20 | 1993-03-03 | アミノ−誘導化重合体を合成するための有機リン結合剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07121954B2 (ja) |
-
1993
- 1993-03-03 JP JP5065993A patent/JPH07121954B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．８１：６３７２３Ｆ（１９７４） |
| Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．８４：４３９４３Ｍ（１９７６） |
| Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．９１：５７０９４Ｓ（１９７９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06206889A (ja) | 1994-07-26 |
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