JP2787775B2 - Method for synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia labile groups on solid support - Google Patents
Method for synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia labile groups on solid supportInfo
- Publication number
- JP2787775B2 JP2787775B2 JP63320745A JP32074588A JP2787775B2 JP 2787775 B2 JP2787775 B2 JP 2787775B2 JP 63320745 A JP63320745 A JP 63320745A JP 32074588 A JP32074588 A JP 32074588A JP 2787775 B2 JP2787775 B2 JP 2787775B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- labile
- oligonucleotide
- solid support
- ammonia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims description 35
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 27
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 12
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 title claims description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 39
- -1 rhodamine phosphoramidite Chemical class 0.000 claims description 38
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 37
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 13
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 claims description 12
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 10
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000005233 alkylalcohol group Chemical group 0.000 claims description 7
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 claims description 4
- GELMWIVBBPAMIO-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-amine Chemical compound CCC(C)(C)N GELMWIVBBPAMIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WEHWNAOGRSTTBQ-UHFFFAOYSA-N dipropylamine Chemical compound CCCNCCC WEHWNAOGRSTTBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003890 succinate salts Chemical group 0.000 claims description 3
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical group [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 39
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 35
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 14
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 11
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 5
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 4
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- NPSVCXHBJVBBAD-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-(2-hydroxyethyl)acetamide Chemical compound OCCNC(=O)C(F)(F)F NPSVCXHBJVBBAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- YFYBXOIQXOOUCI-UHFFFAOYSA-N n-[[di(propan-2-yl)amino]-methoxyphosphanyl]-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(OC)N(C(C)C)C(C)C YFYBXOIQXOOUCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 3
- JJYPMNFTHPTTDI-UHFFFAOYSA-N 3-methylaniline Chemical compound CC1=CC=CC(N)=C1 JJYPMNFTHPTTDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-chlorophenyl)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[3,2-c]pyridine Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(C=CS2)=C2CCN1 CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- STSCVKRWJPWALQ-UHFFFAOYSA-N TRIFLUOROACETIC ACID ETHYL ESTER Chemical compound CCOC(=O)C(F)(F)F STSCVKRWJPWALQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQVISGXICTVSDQ-UHFFFAOYSA-O [c-]1nn[nH]n1.CC(C)[NH2+]C(C)C Chemical compound [c-]1nn[nH]n1.CC(C)[NH2+]C(C)C YQVISGXICTVSDQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000005012 alkyl thioether group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 2
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical class [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001973 tert-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- LOTWHTFZRDJSCL-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-(3-hydroxypropyl)acetamide Chemical compound OCCCNC(=O)C(F)(F)F LOTWHTFZRDJSCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- GDXXYJRQFQZYNL-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-1-ylmethyl carbamate Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C2=C1C(COC(=O)N)=CC=C2 GDXXYJRQFQZYNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000790917 Dioxys <bee> Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- WKUHJMVOGOONBO-UHFFFAOYSA-N N=C=S.ON(C(CC1)=O)C1=O Chemical compound N=C=S.ON(C(CC1)=O)C1=O WKUHJMVOGOONBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUFHADKWZMQVMD-UHFFFAOYSA-N NCCOP(N)O Chemical compound NCCOP(N)O YUFHADKWZMQVMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N Propanolamine Chemical compound NCCCO WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002339 acetoacetyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C(=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012042 active reagent Substances 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006242 amine protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000001316 cycloalkyl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000286 phenylethyl group Chemical class [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000587 piperidin-1-yl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000003548 sec-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000004953 trihalomethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
- C07F9/24—Esteramides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は一般的に固相支持体上におけるオリゴヌクレ
オチド類の合成方法、より詳しくは合成オリゴヌクレオ
チド類の蛍光染料による標識化方法に関する。The present invention relates generally to a method for synthesizing oligonucleotides on a solid support, and more particularly to a method for labeling synthetic oligonucleotides with a fluorescent dye.
合成オリゴヌクレオチド類は、相補的デオキシリボ核
酸（cDNA）及びゲノムDNAライブラリーのスクリーニン
グのためのプローブとして、及びDNAポリメラーゼ及び
逆転写酵素によるDNA合成のためのプライマーとして分
子生物学において広汎な応用を有する。 後者の応用としては、部分的タンパク質配列方法及び
タンパク質生成物のための感受性生物学的アッセイが利
用可能である場合には稀なメッセンジャーRNA（mRNA）
の同定のための技術、例えばガンマーインターフェロン
についてグレイ等（Gray et al,Nature 第295巻、503-
508頁、1982年）、及びジオキシ鎖停止方法によるDNAを
配列するための技術、例えば、スミス等（Smith et al,
Nucleic Acids Research、13巻、2399-2412頁 1985
年；シュライヤー等（Schreier et al,J.Mol.Biol.129
巻、169-172頁、1979年）；及びサンガー等（Sanger et
al,J.Mol.Biol.143巻、161-178頁、1980年）などが挙
げられる。 最近、DNA配列決定方法における改良は複数蛍光ラベ
ルを利用して単一カラムゲル上で自動的に配列決定を行
っている。例えば，スミス等（上掲）及びスミス等、Na
ture、321巻、674-679頁（1986年）。典型的には、蛍光
ラベルはプライマーの造築過程において、その様な方法
において最終工程（或いは一連の工程）において用いら
れるオリゴヌクレオチドプライマーに結合される。現
在、ホスファイト−トリエステル法において、新たに合
成されたオリゴヌクレオチドをその支持体から除去する
前に蛍光ラベルを結合するために三つまでの付加的段階
が必要とされている。先ず第一は、結合剤がヌクレオシ
ドホスホルアミダイトを添加するのに用いられる同一条
件下でオリゴヌクレオチドの５′末端に結合される。第
二に、結合剤が例えば保護基を除去することにより活性
化されて、一級アミンなどの反応性官能基を曝露する。
そして最後に、活性化染料が結合剤上の曝露官能基と反
応させられる。 分光的に分解可能な蛍光標識の組の選択において重要
なクラスの染料であるローダミン染料で結合されたオリ
ゴヌクレオチドを標識しようと試みる場合に更に複雑な
問題が生ずる、例えば、スミス等（上掲）；及びローケ
ン等（loken et al,Cytometry、５巻、152-159頁、1984
年）。オリゴヌクレオチドをその支持体から切断するた
めの主たる試薬は又、ローダミン染料を化学的に劣化さ
せ、それらの蛍光特性を激しく変化させる。この様に、
ローダミン染料が現在の固相合成方法に用いられる場合
には、それらはオリゴヌクレオチドが固相支持体から切
断された後に結合されなければならず、その結果付加的
工程を生じ、総合合成においてより大きな不便を生ず
る。 前記に鑑み、固相DNA合成における直接使用のための
染料−ホスホルアミダイト複合体が利用可能であればラ
ベルを結合するために必要な工程を減ずることにより標
識化プライマー合成の効率を改良させるものと思われ
る。 特に、ローダミン結合に必要とされる手動の液相合成
工程がローダミン染料の化学的完全性及び蛍光特性を保
存する切断試薬の利用可能性により省略することができ
るならば、幾つかのDNA配列決定系がより自動化に則し
たものとなると思われる。Synthetic oligonucleotides have widespread application in molecular biology as probes for screening of complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) and genomic DNA libraries, and as primers for DNA synthesis by DNA polymerase and reverse transcriptase. . The latter applications include partial protein sequencing methods and rare messenger RNA (mRNA) where sensitive biological assays for protein products are available.
Techniques for the identification of gamma-interferon, such as Gray et al. (Gray et al, Nature Vol. 295, 503-
508, 1982) and techniques for sequencing DNA by the dioxy chain termination method, such as Smith et al. (Smith et al,
Nucleic Acids Research, 13: 2399-2412 1985
Year; Schreier et al., J. Mol. Biol. 129
169-172, 1979); and Sanger et al.
al, J. Mol. Biol. 143, 161-178, 1980). Recently, improvements in DNA sequencing methods have utilized multiple fluorescent labels to automatically sequence on a single column gel. For example, Smith et al. (Above) and Smith et al., Na
, 321, pp. 674-679 (1986). Typically, the fluorescent label is attached to the oligonucleotide primer used in the final step (or series of steps) in such a manner during the construction of the primer. Currently, in the phosphite-triester method, up to three additional steps are required to attach the fluorescent label before removing the newly synthesized oligonucleotide from its support. First, the binding agent is attached to the 5 'end of the oligonucleotide under the same conditions used to add the nucleoside phosphoramidite. Second, the binder is activated, for example, by removing a protecting group, exposing a reactive functional group such as a primary amine.
And finally, the activating dye is reacted with the exposed functional groups on the binder. A further complication arises when attempting to label oligonucleotides bound with rhodamine dyes, an important class of dyes in the selection of a set of spectrally resolvable fluorescent labels, for example, Smith et al., Supra. And Loken et al. (Loken et al, Cytometry, 5, 152-159, 1984).
Year). The primary reagents for cleaving oligonucleotides from their supports also chemically degrade rhodamine dyes and drastically change their fluorescent properties. Like this
If rhodamine dyes are used in current solid phase synthesis methods, they must be attached after the oligonucleotide has been cleaved from the solid support, resulting in additional steps and a larger Causes inconvenience. In view of the foregoing, what would improve the efficiency of labeled primer synthesis by reducing the steps required to attach the label if a dye-phosphoramidite complex for direct use in solid phase DNA synthesis was available. I think that the. In particular, if the manual liquid phase synthesis step required for rhodamine conjugation can be omitted due to the availability of cleavage reagents that preserve the chemical integrity and fluorescent properties of the rhodamine dye, some DNA sequencing It is likely that the system will be more automated.
広義に、本発明はアンモニアに不安定な基で標識化さ
れたオリゴヌクレオチド類の合成方法に向けられたもの
である。本発明の一つの重要な側面は、三成分、即ち１
〜３個の炭素原子を有する低級アルキルアルコール，
水、及び３〜６個の炭素原子を有する非求核ヒンダード
アルキルアミンを含んでなる切断試薬により、アンモニ
ア無しに固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の塩基に
不安定な結合基の切断である。好ましくは、この切断試
薬の三つの成分は約1:1:1乃至約1:3:1（容量）の低級ア
ルコール：水：非−求核障害アルキルアミンの比で存在
する。より具体的には、本発明は、固相支持体上でのロ
ーダミン−標識化オリゴヌクレオチド類の合成方法を含
むものである。好ましくは、この後者の方法は合成方法
において、ローダミンホスホルアミダイト類の使用を含
むものである。 好ましくは、非求核ヒンダードアルキルアミンはイソ
プロピルアミン,t−ブチルアミン，ジエチルアミン，ピ
ペリジン,t−アミルアミン，ジイソプロピルアミン及び
ジプロピルアミンから選ばれる。最も好ましくは、非求
核ヒンダードアルキルアミンはｔ−ブチルアミンであ
る。 好ましくは低級アルキルアルコールはメタノール，エ
タノール，及びプロパノールよりなる群から選ばれる。
最も好ましくは、低級アルキルアルコールはメタノール
である。 好ましくは、塩基に不安定な結合基はコハク酸エステ
ルである。最も好ましくは、コハク酸エステルはオリゴ
ヌクレオチドの３′ヒドロキシ基によりオリゴヌクレオ
チドを固相支持体に結合する。 本発明の重要な側面は、オリゴヌクレオチド合成完了
時におけるオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合する
塩基に不安定な結合部分、例えばコハク酸エステルの切
断及び／又は塩基不安定アミノ保護基例えばベンゾイル
の除去である。 本発明のもう一つの重要な側面は上記反応がローダミ
ン劣化なしに行われることにより、固相支持体上におけ
るローダミン標識化オリゴヌクレオチドの完全な合成を
可能にすることである。Broadly, the present invention is directed to a method for synthesizing oligonucleotides labeled with an ammonia labile group. One important aspect of the present invention is that it has three components, namely, 1
Lower alkyl alcohols having up to 3 carbon atoms,
Cleavage of a base-labile linking group between a solid support and an oligonucleotide without ammonia by a cleavage reagent comprising water and a non-nucleophilic hindered alkylamine having 3 to 6 carbon atoms . Preferably, the three components of the cleavage reagent are present in a ratio of about 1: 1: 1 to about 1: 3: 1 (volume) lower alcohol: water: non-nucleophilically hindered alkylamine. More specifically, the present invention includes a method for synthesizing rhodamine-labeled oligonucleotides on a solid support. Preferably, this latter method involves the use of rhodamine phosphoramidites in a synthetic method. Preferably, the non-nucleophilic hindered alkylamine is selected from isopropylamine, t-butylamine, diethylamine, piperidine, t-amylamine, diisopropylamine and dipropylamine. Most preferably, the non-nucleophilic hindered alkylamine is t-butylamine. Preferably, the lower alkyl alcohol is selected from the group consisting of methanol, ethanol, and propanol.
Most preferably, the lower alkyl alcohol is methanol. Preferably, the base labile linking group is a succinate. Most preferably, the succinate binds the oligonucleotide to the solid support via the 3 'hydroxy group of the oligonucleotide. An important aspect of the invention is that at the completion of oligonucleotide synthesis, a base-labile binding moiety that binds the oligonucleotide to the solid support, such as cleavage of a succinate ester and / or a base-labile amino protecting group such as benzoyl. Elimination. Another important aspect of the present invention is that the reaction is performed without rhodamine degradation, thereby allowing complete synthesis of rhodamine-labeled oligonucleotide on a solid support.
本発明は固相支持体上のオリゴヌクレオチド類、特に
ローダミン染料で標識化されたオリゴヌクレオチド類の
合成方法を提供する。この方法の重要な特徴は、（１）
オリゴヌクレオチドを固相支持体間の結合基、通常はコ
ハク酸エステルをオリゴヌクレオチドが固相支持体から
遊離されるように加水分解することができ、（２）オリ
ゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンとアミノ保護
基、通常ベンゾイル或いはイソブチリルとの間の結合を
加水分解することができ、及び（３）オリゴヌクレオチ
ドに結合したローダミン染料の化学構造を変化させない
切断試薬の使用である。 本発明に用いられるローダミン染料は各種結合手段に
よりオリゴヌクレオチドに結合されてよい。例えば、後
で適当な誘導化ローダミン染料と反応させられてよい１
種以上の官能基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化
するためのいくつかの手段が利用可能である。例えば、
オリゴヌクレオチドはアミノ誘導化されてよく、適当な
ローダミン誘導体はイソチオシアネート−Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドなどである。アミノ或いはチオール官能
基を有するオリゴヌクレオチド類を誘導化するための方
法を開示する文献としては、コノリー等（Connolly et
al）、Nucleic Acids Research、13巻、4485-4402頁（1
985）；コノリー、Nucleic Acids Research、15巻、313
1-3139頁（1987）；ルタ（Ruth）、DNA、３巻、123頁
（1984）；ハラランビディス（Haralanbidis et al）、
Nucleic Acids Research、15巻、4857-4876頁（198
7）；スミス（Simith et al）、Nucleic Acids Researc
h、13巻、2399-2412頁（1985）が挙げられる。これらの
文献は茲に準用する。 好ましくは、ローダミン染料はローダミンホスホルア
ミダイトとしてオリゴヌクレオチドと結合される。 固相オリゴヌクレオチド合成についての「切断」とい
う用語は固相支持体にオリゴヌクレオチドを結合させる
結合の破壊を意味する。通常、切断は結合オリゴヌクレ
オチドの３′ヒドロキシルと固相支持体の間のコハク酸
エステル結合の加水分解を含む。 本発明において用いられる「脱保護」という用語はオ
リゴヌクレオチドの複素環塩基の環外アミンからの保護
基の除去を意味する。通常、脱保護は環外アミンとアミ
ノ保護基、例えばベンゾイル或いはイソブチリルなどよ
りなるアミド部分の加水分解を含む。文献において、
「脱保護」という用語は切断前のホスフェートジエステ
ルからの保護基の除去を含むより一般的に用いられてい
る場合がある。その様な保護基がメトキシである場合に
は、本発明において用いられる「脱保護」はそれらの除
去を含まない。この場合には、標準的チオフェルノール
含有試薬による追加の処理が必要である。 本発明において用いられる「オリゴヌクレオチド」と
いう用語は、少ないヌクレオチド例えば２〜20乃至多く
のヌクレオチド例えば20〜数百以上を含有するデオキシ
リボヌクレオチド或いはリボヌクレオチドのいづれかの
一本鎖を指す。より詳しくは、この用語は上記範囲の大
きさのデオキシリボヌクレオチドの一本鎖を指す。 本発明において用いられるアルキルアミンについての
「非求核」とは、脱保護時（アルキルアミンの存在下）
にアミド保護基の加水分解が全環外アミン−保護基複合
体が離脱基として作用するアルキルアミンを含む競走的
求核置換反応に対して支配的であって、かくして、ヌク
レオシド塩基を修飾することを意味する。 ローダミン染料については、ローダミン染料の炭素原
子数を示すために、カラー・インデックス（Colour Ind
ex），（Association of Textile Chemist、２版、197
1）付番方法が用いられる。キサンテン様構造における
炭素原子は下記の如くダッシュを付けた番号で示され、
９′−置換フェニルの炭素原子は下記に示される如くダ
ッシュを付けられない数により示される。 好ましくは、本発明において用いられるローダミン染
料は、下記一般式により規定される群から選ばれる。 式中、 Ｚはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いは
スルホネート、及びより好ましくはカルボキシレートで
ある。 Ｒ1及びＲ8は各々水素，ハロゲン,1〜８個の炭素原子
を有するアルキル、１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルエーテル或いは１〜８個の炭素原子を有するアルキル
チオエーテル、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と
共に各々２〜５個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。
好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素,1〜３個の炭素原子
を有するアルキルクロロ或いは１〜３個の炭素原子を有
するアルキルエーテルであり、及びＲ1はＲ2と共に、及
びＲ8はＲ7と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それ
ぞれ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖を形成する。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素
であり、及び、Ｒ1はＲ2と共に、及びＲ8はＲ7と共に各
々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素を６′炭素
に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を３′炭素に
結合する窒素に連結するアルキル鎖を形成する。 Ｒ2及びＲ7は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8と共に各
々上記の如く２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖で
ある。好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々１〜３個の炭素原
子を有するアルキルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及び
Ｒ7はＲ8と共に各々２〜３個の炭素原子を有し、それぞ
れ７′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び
２′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。最も好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々メチル或
いはエチルであり、及びＲ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8
と共に、各々３個の炭素原子を有し、それぞれ７′炭素
を６′炭素に結合する窒素に連結する、及び２′炭素を
３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。 Ｒ3及びＲ6は各々１〜８個の炭素原子を有するアルキ
ル、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々２〜
５個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に
結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素に結
合する窒素に連結するアルキル鎖である。好ましくは、
Ｒ3及びＲ6は各々１〜３個の炭素原子を有するアルキル
であり、及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々
２〜３個の炭素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭
素に結合する窒素に連結する、及び４′炭素を３′炭素
に結合する窒素に連結するアルキル鎖である。最も好ま
しくは、Ｒ3及びＲ6は各々メチル或いはエチルであり、
及びＲ3はＲ4と共に、及びＲ6はＲ5と共に各々３個の炭
素原子を有し、それぞれ５′炭素を６′炭素に結合する
窒素に連結し、及び４′炭素を３′炭素に結合する窒素
に連結するアルキル鎖である。 Ｒ4及びＲ5はそれぞれ水素、１〜８個の炭素原子を有
するアルキル、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有する
アルキルエーテル，或いは１〜８個の炭素原子を有する
アルキルチオエーテル、及び、Ｒ4はＲ3と共に及びＲ5
はＲ6と共に各々上記２〜５個の炭素原子を有するアル
キル鎖である。好ましくは、Ｒ4及びＲ5は各々水素，ク
ロロ,1〜３個の炭素原子を有するアルキル，或いは１〜
３個の炭素原子を有するアルキルエーテル、及びＲ4は
Ｒ3と共に、及びＲ5はＲ6と共に上記の如く２〜３個の
炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好ましくは、
Ｒ4及びＲ5は各々水素であり、及び、Ｒ4はＲ3と共に、
及びＲ5はＲ6と共に各々３個の炭素原子を有し、それぞ
れ５′炭素を６′炭素に結合する窒素に連結し、及び
４′炭素を３′炭素に結合する窒素に連結するアルキル
鎖である。 Ｌはその特性がそれが結合する基（本発明において
「相補的官能基」と称する）の性質に応じて異なる結合
基を表わす。結合官能基の具体例を表Ｉにそれらの相補
的官能基及び得られる結合基と共に掲げる。最も好まし
い結合官能基はヒドロキシル相補的官能基と反応させら
れた場合に、次いで酸化されてホスフェートエステル結
合基を与えるホスファイトエステル結合基を形成するホ
スホルアミダイトである。 Ｗ1,W2，及びＷ3は水素或いはクロロ、好ましくは水
素である。 この発明において用いられる「ローダミンＸ」（RO
X）と略記）はＲ1及びＲ2,R3及びＲ4,R5及びＲ6,R7及び
Ｒ8が一緒に上記の如く３個の炭素のアルキル鎖を形成
し、Ｂがカルボキシレートであり、及びＷ1,W2，及びＷ
3が水素であり、及び結合官能基がそれぞれ５−或いは
６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を指す。本発
明において用いられる「テトラメチルローダミン」
（「TMR」と略記）はＲ1,R4,R5,R8,W1,W2，及びＷ3が水
素であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＲ2,R3,R
6及びＲ7がメチルであり、結合官能基がそれぞれ５−或
いは６−炭素に結合している一般式Ｉの化合物を意味し
ている。 幾つかの本発明において用いるローダミン染料は、た
とえばEastman Kodak社（ロチェスター，ニューヨー
ク）、Molecular Probes社（ジャンクション シティ，
オレゴン州）、或いはResearch Organics（クリーブラ
ンド，オハイオ州）により市販されており、その他は米
国特許第2,242,572号、同第2,153,059号、同第3,822,27
0号、同第3,932,415号及び同第4,005,092号各明細書の
教示に従って合成することができ、これらの文献は全て
茲に準用する。 ROX及びTMRは本発明において使用する最も好ましいロ
ーダミン染料である。 ホスファイト−トリエステル、ホスホトリエステル、
及びＨ−ホスホネート化学による固相合成方法の詳細な
説明は広く利用可能である。例えば、イタクラ（Itakur
a,米国特許第4,401,796号明細書）；カルザース等（Car
uthers et al,米国特許第4,458,066号、及び同第4,500,
707号各明細書）；マテウッチ等（Matteucci et al,J.A
mer.Chem.Soc.103巻、3185〜3191頁、1981年）；カルザ
ース等（Caruthers et al,Genetic Engineering:4巻,1
〜17頁（198 年）；ジョーンズ（Jones）第２章、アッ
キンソン等（Atkinson et al）第３章、及びスプロート
等（Sproat et al）第４章、Grait編Oligonucleotide S
ynthesis;A Practical Approach（IRL Press,ワシント
ン,D.C.,1984年）；フレーラー等（Froehler et al,Tet
rahedron letters）27巻、469-472頁、1986）；ガレッ
グ等（Garegg et al、Tetrahedron Letters、27巻、405
1-4054頁及び4955-4058頁、1986）；及びフレーラー等
（Froehler et al,Nucleic Acids Research、14巻、539
9-5407頁、1986）。従って、これらの文献は茲に準用す
る。 好ましくは、本発明は、ホスファイトトリエステル法
によるローダミン−標識化オリゴヌクレオチドの合成を
含むものである。即ち、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トを成長鎖の５′ヒドロキシルと反応させることによ
り、ヌクレオチドを、ヌクレオチドの成長鎖に逐次添加
する。 特に、オリゴヌクレオチドはローダミンホスホルアミ
ダイトを結合するオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
ルと反応させることにより標識化される。 本発明のローダミンホスホルアミダイトは、先ずロー
ダミンの５−或いは６−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
（NHS）エステルをアミノアルコール、例えばエタノー
ルアミン、ヘキサノールアミンなどとN,N−ジメチルホ
ルムアミド（DMF）或いは同様な非プロトン極性溶媒中
で室温において反応させてローダミン染料の５−或いは
６−アルコールアミドを形成し、それを次いで標準手段
により反応液から分離する。このローダミン染料のアル
コールアミドを次いで触媒量のテトラゾール及びジイソ
プロピルアミンを含有するアセトニトリルにおいて室温
で過剰のジ−（N,N−ジイソプロピルアミノ）メトキシ
ホスフィンと反応させてローダミンホスホルアミダイト
を形成し、これを反応液から分離する。 一般的に、切断及び脱保護は本発明の切断試薬によ
り、先ず固相支持体に（塩基に不安定な結合基を介して
結合したオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドが固
相から放出されるように室温で約１〜２時間切断試薬に
曝露し、次いで放出されたオリゴヌクレオチドを含有す
る切断試薬を環外アミンに結合した保護基が除去される
ように約80〜約90℃で約20〜約60分間加熱することによ
り行われる。或いは又、脱保護工程は、より低温で行う
ことができるが、しかし、反応は完結までより長くかか
り、例えば55℃においては加熱は５時間行われる。 切断及び脱保護後、標識化或いは未標識化オリゴヌク
レオチドを標準的操作により精製する。例えば、Applie
d Biosystems Users Bulletin No.13（1987年４月１日
改訂）；ガイト（Gait）のOligonucleotide Synthesis:
A Practical Approach（IRL Press,ワシントン,D.C.,19
84年）の第５章及び第６章。The present invention provides a method for synthesizing oligonucleotides on a solid support, particularly oligonucleotides labeled with a rhodamine dye. Important features of this method are (1)
Oligonucleotides can be hydrolyzed to linking groups between solid supports, usually succinates, such that the oligonucleotides are released from the solid support, and (2) exocyclic heterocyclic bases of the oligonucleotide. The use of a cleavage reagent that can hydrolyze the bond between the amine and the amino protecting group, usually benzoyl or isobutyryl, and (3) does not alter the chemical structure of the rhodamine dye attached to the oligonucleotide. The rhodamine dye used in the present invention may be bound to the oligonucleotide by various binding means. For example, one that may later be reacted with a suitable derivatized rhodamine dye
Several means are available for derivatizing oligonucleotides with more than one functional group. For example,
Oligonucleotides may be amino-derivatized and suitable rhodamine derivatives include isothiocyanate-N-hydroxysuccinimide and the like. References disclosing methods for derivatizing oligonucleotides having amino or thiol functionality include Connolly et al.
al), Nucleic Acids Research, Volume 13, pages 4485-4402 (1
985); Connolly, Nucleic Acids Research, 15, 313
1-3139 (1987); Ruth, DNA, Vol. 3, 123 (1984); Haralanbidis et al,
Nucleic Acids Research, 15, 4857-4876 (198
7); Smith (Simith et al), Nucleic Acids Researc
h, vol. 13, pages 2399-2412 (1985). These documents apply mutatis mutandis. Preferably, the rhodamine dye is attached to the oligonucleotide as a rhodamine phosphoramidite. The term "cleavage" with respect to solid-phase oligonucleotide synthesis refers to the breaking of the bond that binds the oligonucleotide to the solid support. Usually, cleavage involves hydrolysis of a succinate bond between the 3 'hydroxyl of the binding oligonucleotide and the solid support. As used herein, the term "deprotection" refers to the removal of a protecting group from the exocyclic amine of a heterocyclic base of an oligonucleotide. Typically, deprotection involves hydrolysis of an amide moiety consisting of an exocyclic amine and an amino protecting group, such as benzoyl or isobutyryl. In the literature,
The term "deprotection" may be more commonly used to involve the removal of protecting groups from the phosphate diester prior to cleavage. When such protecting groups are methoxy, "deprotection" as used in the present invention does not include their removal. In this case, additional treatment with standard thiofernol-containing reagents is required. The term "oligonucleotide" as used in the present invention refers to any single strand of deoxyribonucleotides or ribonucleotides containing from as few nucleotides as 2 to 20 nucleotides, such as from 20 to several hundreds or more. More specifically, the term refers to a single strand of deoxyribonucleotide in the above range of sizes. “Non-nucleophilic” for an alkylamine used in the present invention means “when deprotected (in the presence of an alkylamine)”.
Hydrolysis of the amide protecting group is predominant over competitive nucleophilic substitution reactions involving alkylamines in which the all-exocyclic amine-protecting group complex acts as a leaving group, thus modifying the nucleoside base. Means For rhodamine dyes, the Color Index is used to indicate the number of carbon atoms in the rhodamine dye.
ex), (Association of Textile Chemist, 2nd edition, 197
1) Numbering method is used. Carbon atoms in xanthene-like structures are indicated by dashed numbers as follows:
The carbon atoms of the 9'-substituted phenyl are indicated by non-dashed numbers as shown below. Preferably, the rhodamine dye used in the present invention is selected from the group defined by the following general formula. Wherein Z is an anionic group, preferably a carboxylate or sulfonate, and more preferably a carboxylate. R 1 and R 8 are each hydrogen, halogen, alkyl having 1 to 8 carbon atoms, alkyl thioether having an alkyl ether or 1 to 8 carbon atoms having 1 to 8 carbon atoms, and, R 1 Has 2 to 5 carbon atoms each with R 2 and R 8 with R 7 , each linking a 7 ′ carbon to a nitrogen bonding to a 6 ′ carbon, and bonding a 2 ′ carbon to a 3 ′ carbon An alkyl chain linked to the nitrogen.
Preferably, R 1 and R 8 are each hydrogen, alkylchloro having 1 to 3 carbon atoms or alkyl ether having 1 to 3 carbon atoms, and R 1 is together with R 2 and R 8 is each have 2-3 carbon atoms with R 7, respectively 7 'carbon 6' linked to a nitrogen attached to the carbon, and 2 form an alkyl chain linking the nitrogen attached to the carbon '3 carbon' I do. Most preferably, R 1 and R 8 are each hydrogen, and R 1 has 3 carbon atoms each with R 2 and R 8 with R 7 each converting a 7 ′ carbon to a 6 ′ carbon. It forms an alkyl chain linking the connecting nitrogen to the nitrogen and connecting the 2 'carbon to the nitrogen connecting the 3' carbon. R 2 and R 7 are each alkyl having 1 to 8 carbon atoms, and R 2 is an alkyl chain having with R 1, and R 7 are 2 to 5 carbon atoms as each of the above together with R 8 It is. Preferably, R 2 and R 7 are each alkyl having 1-3 carbon atoms, and R 2 together with R 1, and R 7 each have 2-3 carbon atoms with R 8, An alkyl chain linking the 7 'carbon to the nitrogen linking the 6' carbon and the 2 'carbon to the nitrogen linking the 3' carbon, respectively. Most preferably, R 2 and R 7 are each methyl or ethyl, and R 2 is with R 1 and R 7 is R 8
And alkyl chains each having three carbon atoms, linking the 7 'carbon to the nitrogen linking the 6' carbon, and linking the 2 'carbon to the nitrogen linking the 3' carbon. Alkyl having R 3 and R 6 are each 1 to 8 carbon atoms, and R 3 together with R 4, and R 6 are each 2 with R 5
Alkyl chains having 5 carbon atoms, each linking a 5 'carbon to a nitrogen linking a 6' carbon and linking a 4 'carbon to a nitrogen linking a 3' carbon. Preferably,
R 3 and R 6 are each alkyl having 1 to 3 carbon atoms, and R 3 has 2 to 3 carbon atoms each with R 4 and R 6 has each 5 ′ with R 5 An alkyl chain linking the carbon to the nitrogen linking the 6 'carbon and the 4' carbon to the nitrogen linking the 3 'carbon. Most preferably, R 3 and R 6 are each methyl or ethyl;
And R 3 together with R 4 and R 6 together with R 5 each have 3 carbon atoms, each linking a 5 ′ carbon to a nitrogen linking a 6 ′ carbon, and a 4 ′ carbon to a 3 ′ carbon. An alkyl chain linked to the nitrogen to which it is attached. R 4 and R 5 are each hydrogen, alkyl having 1 to 8 carbon atoms, halogen, alkyl ether having 1 to 8 carbon atoms, or alkylthioether having 1 to 8 carbon atoms; 4 is with R 3 and R 5
Is an alkyl chain having 2 to 5 carbon atoms each with R 6 . Preferably, R 4 and R 5 are each hydrogen, chloro, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or 1 to
Alkyl ethers having 3 carbon atoms, and R 4 together with R 3 and R 5 together with R 6 are alkyl chains having 2-3 carbon atoms as described above. Most preferably,
R 4 and R 5 are each hydrogen, and R 4 together with R 3
And R 5 together with R 6 each have three carbon atoms, each linking a 5 ′ carbon to the nitrogen linking the 6 ′ carbon, and an alkyl chain linking the 4 ′ carbon to the nitrogen linking the 3 ′ carbon. It is. L represents a linking group whose properties depend on the nature of the group to which it is linked (referred to in the present invention as "complementary functional group"). Specific examples of linking functional groups are listed in Table I together with their complementary functional groups and the resulting linking groups. The most preferred linking function is a phosphoramidite that, when reacted with a hydroxyl-complementary function, then oxidizes to form a phosphite ester linking group that gives a phosphate ester linking group. W 1 , W 2 and W 3 are hydrogen or chloro, preferably hydrogen. The "rhodamine X" (RO
X)), wherein R 1 and R 2 , R 3 and R 4 , R 5 and R 6 , R 7 and R 8 together form an alkyl chain of 3 carbons as described above, and B is a carboxylate And W 1 , W 2 , and W
3 refers to compounds of the general formula I in which 3 is hydrogen and the linking function is respectively linked to the 5- or 6-carbon. "Tetramethylrhodamine" used in the present invention
(Abbreviated as "TMR") is R 1, R 4, R 5 , R 8, W 1, W 2, and W 3 are hydrogen, B is carboxylate, and R 2, R 3, R
6 and R 7 are methyl, meaning compounds of the general formula I in which the linking function is respectively linked to the 5- or 6-carbon. Some rhodamine dyes used in the present invention are, for example, Eastman Kodak (Rochester, NY), Molecular Probes (Junction City, NY).
Oregon) or Research Organics (Cleveland, Ohio); others are U.S. Pat. Nos. 2,242,572, 2,153,059, 3,822,27.
Nos. 3,932,415 and 4,005,092 can be synthesized in accordance with the teachings of the respective specifications, all of which are applied mutatis mutandis. ROX and TMR are the most preferred rhodamine dyes used in the present invention. Phosphite-triester, phosphotriester,
Detailed descriptions of solid-phase synthesis methods by and H-phosphonate chemistry are widely available. For example, Itakur
a, U.S. Pat. No. 4,401,796);
uthers et al, U.S. Pat.Nos. 4,458,066 and 4,500,
No. 707); Mateucci et al, JA
Mer.Chem.Soc. 103, 3185-3191, 1981); Calthers et al, Genetic Engineering: 4, 1
1717 (198); Jones Chapter 2, Atkinson et al Chapter 3, and Sproat et al Chapter 4, Grait Ed. Oligonucleotide S
ynthesis; A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 1984); Fröhler et al, Tet
Garedg et al, Tetrahedron Letters, 27, 405).
1-4054 and 4955-4058, 1986); and Fröhler et al, Nucleic Acids Research, 14, 539.
9-5407, 1986). Therefore, these documents apply mutatis mutandis. Preferably, the invention involves the synthesis of rhodamine-labeled oligonucleotides by the phosphite triester method. That is, nucleotides are sequentially added to a growing chain of nucleotides by reacting the nucleoside phosphoramidite with the 5 'hydroxyl of the growing chain. In particular, the oligonucleotide is labeled by reacting with the 5 'hydroxyl of the oligonucleotide that binds the rhodamine phosphoramidite. The rhodamine phosphoramidites of the present invention are prepared by first converting a 5- or 6-N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of rhodamine to an amino alcohol, such as ethanolamine, hexanolamine, etc., with N, N-dimethylformamide (DMF) or similar. Reaction at room temperature in an aprotic polar solvent to form the rhodamine dye 5- or 6-alcoholamide, which is then separated from the reaction by standard means. The alcohol amide of the rhodamine dye is then reacted with excess di- (N, N-diisopropylamino) methoxyphosphine at room temperature in acetonitrile containing a catalytic amount of tetrazole and diisopropylamine to form rhodamine phosphoramidite, which is Separate from the reaction solution. In general, cleavage and deprotection are carried out by the cleavage reagent of the present invention by first binding the oligonucleotide bound to the solid support via a base labile linking group at room temperature so that the oligonucleotide is released from the solid phase. With the cleavage reagent for about 1-2 hours, and then release the cleavage reagent containing the released oligonucleotide at about 80 to about 90 ° C. for about 20 to about 60 to remove any protecting groups attached to the exocyclic amine. Alternatively, the deprotection step can be performed at lower temperatures, but the reaction takes longer to complete, for example, at 55 ° C., heating is performed for 5 hours. After protection, the labeled or unlabeled oligonucleotide is purified by standard procedures, eg, Applie
d Biosystems Users Bulletin No. 13 (revised April 1, 1987); Gait's Oligonucleotide Synthesis:
A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 19
Chapters 5 and 6 of 1984).
以下の実施例は本発明を説明するのに役立つものであ
る。試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの値
は本発明を例示するのみであり、それを制限するものと
考えられてはならない。 実施例1.アミノアルキルホスホルアミダイト結合剤の調
製 以下に、アミノアルキルホスホルアミトの一般的製造
方法を開示する。大まかに言って、同一の操作がコノリ
ーによりヌクレイック・アシッズ・リサーチ、15巻3131
-3139頁（1987年）〔Connolly,Nucleic Acides Researc
h,Vol.15,pgs.3131〜3139（1987）〕に開示されてい
る。これらの化合物は固相支持体に結合したアミノ誘導
オリゴヌクレオチド類に有用である。本発明において有
用なアミノアルキルホスホルアミダイト類の一群は下記
一般式により定義される。 式中、Ｂ1は固相支持体及びオリゴヌクレオチド間の
塩基に不安定な結合基を切断することなしに除去するこ
とのできる酸に不安定な或いは塩基に不安定なアミノ保
護基を表わす。その様な基はグリンにより「有機合成に
おける保護基（Protective Groups in Organic Synthes
is）」、（John Wiley ＆ Sons,ニューヨーク、1981）
第７章に説明されており、この章は茲に準用する。好ま
しくは、塩基に不安定な保護基は複素環の窒素、或いは
その前駆体のそれと共に塩基に不安定なアミド及びカル
バメート保護基、好ましくはトリハロアセチル，アセト
アセチル及びフルオレニルメチルカルバメート、特に９
−フルオレニルメチルカルバメート及び９−（２−スル
ホ）−フルオレニルメチルカルバメート及びトリフルオ
ロアセチルである。好ましい酸に不安定な保護基として
は未誘導トリチル及びその低級（１〜３個の炭素原子を
含む）アルコキシ誘導体、特に４−モノメトキシトリチ
ルが挙げられる。Ｂ2及びＢ3はそれぞれ別々に水素，低
級アルキル，低級置換アルキル，特にハロ−，シアノ
−，或いはニトロ−置換低級アルキル，低級アシル，シ
アノ，ハロ，及びニトロを表わし、より好ましくはＢ2
及びＢ3は各々別々に水素，低級アルキル，及び低級ハ
ロアルキルを表わし、好ましくはＢ2及びＢ3は水素を表
わす。 Ｂ4は10個までの炭素原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アリール、アラルキル或いはシクロアルキルを
表わす。より好ましくは、Ｂ4は低級アルキル；電子引
抜きベータ−置換エチル、特にベータ−トリハロメチル
−、ベータ−シアノ−、特にベータ−スルホ−、ベータ
−ニトロ置換エチルなど；電子引抜き置換フェニルエチ
ル、特にハロ−、スルホ−、シアノ−、或いはニトロ−
置換フェニル；或いは電子引抜き置換フェニルを表わ
す。最も好ましくは、Ｂ4はメチル、ベータ−シアノエ
チル、或いは４−ニトロフェニルエチルを表わす。 本発明において用いられる「低級アルキル」という用
語は１〜６個の炭素原子を含む直鎖及び分岐鎖アルキル
基、例えばメチル，エチル，プロピル，イソプロピル,t
ert−ブチル，イソブチル,sec−ブチル，ネオペンチル,
tert−ペンチルなどを示す。「低級置換アルキル」と
は、「電子引抜き」置換基例えばハロ，シアノ，ニト
ロ，スルホ或いはモノ−，ジ−，或いはトリハロメチル
などを有する低級アルキルを示す。「低級ハロアルキ
ル」とは１個以上のハロゲン原子置換基、通常フルオ
ロ，クロロ，ブロモ或いはヨードを有する低級アルキル
を示す。「低級アシル」とは非二重結合炭素がハロ−，
シアノ−，或いはニトロ−置換基を有してもよい低級ア
ルキルよりなる１〜７個の炭素原子を含むアシルを示
す。「電子引抜き」とはある置換基のそれが離れた分子
の原子価電子を吸引する傾向、即ち、それが電子陰性で
あることを示す、マーチ，アドバンスド・オーガニック
・ケミストリー，第三版〔March,Advanced Organic Che
mistry,Third Ed.（John Wiley,ニューヨーク、1985
年）〕。 ｊは２〜10の範囲にある。 Ｒ′及びＲ″は各々別々に10個までの炭素原子を含有
するアルキル，アラルキル，シクロアルキル，及びシク
ロアルキルアルキルを表わす。好ましくは、Ｒ′及び
Ｒ″は各々別々に低級アルキルを表わし、最も好ましく
は、上記ホスホルアミダイト類が直接結合剤として用い
られる場合にはＲ′及びＲ″は別々にホスホルアミダイ
ト類の化学的安定性、従ってそれらの貯蔵寿命を高める
立体障害低級アルキルである。その様な立体障害低級ア
ルキルとしては、イソプロピル,t−ブチル，イソブチ
ル,sec−ブチル，ネオペチル,tert−ペンチル，イソペ
ンチル,sec−ペンチルなどが挙げられる。 Ｒ′及びＲ″は一緒に主鎖に５個までの及び合計10個
までの炭素原子を含有し，該鎖の両末端原子価結合が
Ｒ′及びＲ″が結合している窒素原子に結合しているア
ルキル鎖を形成するか、或いはＲ′及びＲ″はそれらが
結合する窒素原子と共に窒素、酸素及びイオウよりなる
群から選ばれる１個以上の追加のヘテロ原子を含有して
もよい飽和窒素複素環を形成する。より好ましくは、
Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にプロリジ
ノ，モルホリノ，或いはピペリジノを表わす。最も好ま
しくは、Ｒ′及びＲ″はそれらが結合する窒素と共にモ
ルホリノを形成する。 本発明において用いられるもう一つのアミノアルキル
ホスホルアミダイト類の群は次式で定義されるものであ
る。 （式中、Ｂ1,B4,R′及びＲ″は上記の通りであり、及
びｔは０〜８の範囲にあり、ｓは０〜８の範囲にあり、
但し、ｓ＋ｔは１〜８の範囲にある）。 上記アミノアルキルホスホルアミダイト類式II及びII
Iを合成するための一般的方法は次の工程を含んでな
る。下記一般式により規定されるハロ−置換−N,N−ジ
−置換−０−置換ホスフィン： （式中、Ｘはハロゲン、通常は塩素であり、及び
Ｒ′,R″及びＢ4上記の通りである） を下記一般式により規定されるアミノ−保護アルコール
アミン： （式中、Ｂ1,B2及びＢ3は上記の通りである）と反応
時に放出されるハロゲン酸を吸収する非求核塩基、例え
ばN,Nジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキル
アミンを含有するジクロロメタンとの非プロトン溶媒中
で反応させる。好ましくは、反応はアルゴンなどの不活
性雰囲気下に行われる。酸はホスホルアミダイト生成物
のアミンが陽子を加えて反応性にさせるので、反応液に
おける酸性条件は避けられるべきである。非求核塩基は
塩基と活性化ホスホルアミダイト類との間の副反応の可
能性を減少させる。 上記物質を反応後、以下に第一反応液と称する反応液
を穏やかな塩基性溶液で洗浄して非求核塩基の塩類を除
去する。最後に第一反応液をたとえばMgSO4,Na2SO4など
で乾燥させて、保護アミノアルキルホスホルアミダイト
を得る。 A.保護アミノエチルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（5.0ml、Aldrich Chemical社、ウィスコンシン
州、ミルウォーキー、より市販）を０℃において、アル
ゴン下に撹拌されたジクロロメタン（約40ml）中のＮ−
（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロアセ
タミド（3.9g），並びにジイソプロピルエチルアミン
（5.0ml）の溶液に滴加した。（Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドはラザラス
（Lazarus）及びベンコビック（Benkovic）によりJ.Am.
Chem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法に従って合成した：すなわち、50mlのクロロホルム中
のエチルトリフルオロアセテート（56.8g,0.4mol）を50
mlのクロロホルム中24.4g（0.4mol）のエタノールアミ
ンの撹拌された溶液に滴加した。この溶液を室温で５時
間撹拌し、回転蒸発させて溶媒を除去して、115℃（4.3
Torr）で蒸留し、58.5gの油を得、これは引掻くと結晶
化した。）室温で0.5時間撹拌後、反応液を0.2M炭酸カ
リウム溶液で２回及び塩水で１回洗浄し、乾燥させ（Mg
SO4）、減圧下に濃縮してＮ−（２−（Ｎ′,N′−ジイ
ソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）エチ
ル）−2,2,2−トリフルオロアセタミドを無色液体とし
て得た（7.77g）。1 Ｈ−NMR（CD2Cl2）：δ3.6（6H,m）、3.4（3H,d,J＝1
2）、1.2（12H,d,J＝6.5）31 Ｐ−NMR（CD2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） B.保護アミノプロピルホスホルアミダイトの調製 クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフ
ィン（3.7ml）を０℃において、アルゴン下に撹拌され
たジクロロメタン（約20ml）中のＮ−（３−ヒドロキシ
プロピル）−2,2,2−トリフルオロアセタミド（2.9g,3
−アミノ−１−プロパノール及びエチルトリフルオロア
セテートからラザラス及びベンコビックによりJ.Amer.C
hem.Soc.101巻、4300〜4312頁（1979）に開示される方
法と同様にして合成）、及びジイソプロピルエチルアミ
ン（3.7ml）の撹拌された溶液に滴加した。室温で３時
間撹拌後、反応液をヘキサン（100ml）に注いで撹拌し
た。混合物を沈澱させ、上澄液を分離し、減圧下に濃縮
してＮ−（３−（Ｎ′,N′−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィニルオキシ）プロピル）−2,2,2−トリフ
ルオロアセタミドを無色液体として得た（5.2g）。31 Ｐ−NMR（CH2Cl2，1Ｈデカップリング）：δ149
（ｓ） C.アミノエチルホスホルアミダイトによるオリゴヌクレ
オチドのアミン誘導化 固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′ヒド
ロキシルの脱トリチル化後９−フルオレニルメチル−保
護アミノエチルホスホルアミダイトをホスファイトトリ
エステル合成のための標準的アセトニトリル／テトラゾ
ール反応溶媒中の約0.2Mの濃度にて添加した。この９−
フルオレニルメチル−保護アミノエチルホスホルアミダ
イトはアグラワル等（Agrawal et al）によりヌクレイ
ック・アッシズ・リサーチ（Nucleic Acids Researc
h）,14巻6227頁（1986）にも開示されているように、Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）−2,2,2−トリフルオロア
セタミドをＮ−（２−ヒドロキシエチル）−９−フルオ
レニルメチルガルバメートに代えた他はパートＡの物質
と同様にして調製した。この９−フルオレニルメチル−
保護基は、80:20％（容量）のアセトニトリルと、ピペ
リジンの溶液により室温で除去した。上記反応はApplie
d Biosystemsモデル380Aなどの標準的自動化DNAシンセ
サイザー上で行った。 実施例II.ROX−ホスホルアミダイトの合成 97.1mg（0.158mmol）の５−及び６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミンのエタノールアミンアミド及び13.5mg（0.
079mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
の混合物を、乾燥アルゴンでパージし、8mlの乾燥（水
素化カルシウムから蒸留）アセトニトリルで希釈した。
0.40g（1.53mmol）のメトキシ−ビス−（ジイソプロピ
ルアミノ）ホスフィンを添加し、溶液をアルゴン下に室
温で撹拌した。２時間後に溶液を7mlづつのヘキサンで
４回洗浄し、0.5％トリエチルアミンを含有するクロロ
ホルムで200mlに希釈し、100mlの1:1 塩水：水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させ
た。ゴム状固体をヘキサンと共にすりつぶし、高真空下
に乾燥させ、この操作を黒色のさらさらした固体が得ら
れるまで繰返して113mgのROX−５−及びROX−６−ホス
ホルアミダイトを得た。 実施例III TMR−ホスホルアミダイトの合成 61.4mg（0.130mmol）の５−及び６−カルボキシルテ
トラメチルローダミンのエタノールアミンアミド混合物
及び0.005Mジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド
（0.0013mmol）の0.26mlのアセトニトリル溶液を合一し
て、＜0.1mm圧力で蒸発させ、次いでアルゴンでパージ
して10mlの乾燥（水素化カルシウムから蒸留）アセトニ
トリルで希釈した。0.22g（0.840mmol）のメトキシ−ビ
ス−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを添加し、溶
液を窒素下に室温で1.5時間撹拌した。得られた反応液
を5mlづつのヘキサンで５回洗浄し、0.5％のトリエチル
アミンを含有するクロロホルムで100mlに希釈し、60ml
の1:1の塩水：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、濾過し、ヘキサンと共にこすり、高真空下に蒸発乾
固させた。この操作を黒色のさらさらした固体が得られ
るまで繰返し、67.6mgのTMR−５−及びTMR−６−ホスホ
ルアミダイトを得た。 実施例IV 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護ヌクレオチドの1:2:1のメタノール：水:t−ブ
チルアミンによる切断及び脱保護 本例において、保護18−マ−オリゴヌクレオチドはAp
plied Biosystemsモデル380B DNAシンセサイザー上でホ
スファイトトリエステル法により合成した。通常の切断
試薬、水酸化アンモニウムの代わりに、それぞれ1:2:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンの本発明の切断
試薬を用いた。シンセサイザーを反応器内の固相支持体
及び結合オリゴヌクレオチドが逐次室温において1500秒
間（４×1500）切断試薬に曝露されるように再プログラ
ム化した。反応容器流出液を別の容器に集め、脱保護の
ために85℃で40分間加熱した。反応液を取出し、18−マ
−をHPLCにより反応液から分離した。取出し後、固相支
持体をABIモデルＢの標準的切断方法に従って濃水酸化
アンモニウムで処理した。この水酸化アンモニウム切断
からの反応液を次いでHPLCにより分析して追加のオリゴ
ヌクレオチド類が固相支持体から除去されたかどうかを
求めた。二つの反応液からクロマトグラフの比較は最初
の切断反応により100％のオリゴヌクレオチド類が固相
支持体から除去されたことを示した。 同一のオリゴヌクレオチドを1:2:1 メタノール：水:
t−ブチルアミンの切断試薬による切断工程の時間を、
４×1500秒の代わりに４×900秒にした他は同一方法で
再び合成した。HPLC分析は最初の切断反応において71％
のオリゴヌクレオチドが切断されたことを示した。 実施例Ｖ 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの1:1:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を、1:1:1
の比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一
のシンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行っ
た。HPLC分析は、約80％のオリゴヌクレオチドが固相支
持体から切断されたことを示した。 実施例VI 固相支持体にコハク酸エステルを介して結合
した保護オリゴヌクレオチドの2:2:1のメタノール：水:
t−ブチルアミンによる切断及び脱保護 本例における切断及び脱保護は、切断試薬を2:2:1の
比のメタノール：水:t−ブチルアミンにした他は同一の
シンセサイザ上で実施例IVと同一の方法により行った。
HPLC分析は約10％のオリゴヌクレオチドが固相支持体か
ら切断されたことを示した。 実施例VII TMR−及びROX−標準化オリゴヌクレオチド
の固相合成及び1:2:1のメタノール：水:t−ブチルアミ
ンによる切断及び脱保護 ROX及びTMR標準化オリゴヌクレオチドを別々に、Appl
ied Biosystemsモデル380B自動化DNAシンセサイザー上
で合成した。ホスファイトトリエステル化学を用いる同
等のDNAシンセサイザーも又、使用可能であった。標準
化は、ROXホスホルアミダイト或いはTMRホスホルアミダ
イトのいずれかを製造者によりヌクレオシドホスホルア
ミダイトを接合するために推薦された条件下に、固相支
持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシ
と反応させることにより達成された。カルザス等（Caru
thers et al），米国特許第4,415,732号明細書、及びカ
ルザス等、ジェネティック・エンジニヤリング（Geneti
c Engineering）,4巻,1〜17頁（1982）はApplied Biosy
stemsモデル380Bシンセサイザーにより用いられる化学
の詳細な説明を与えている。従って、これらの文献は、
それらの説明のために準用する。ROX及びTMRホスホルア
ミダイトは0.5Mテトラゾール／アセトニトリル溶液と組
合わせて0.2Mアセトニトリル溶液として用いられて合成
サイクルに活性試薬を形成した。切断及び脱保護は実施
例IVと同様にして行った。ROX及びTMR標準化オリゴヌク
レオチドの完全性はHPLC,ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及び蛍光ジデオキシDNA配列決定を用いた確実な試
料による比較により確認された。 前記本発明の好ましい実施態様の開示内容は例示及び
説明を目的として示されたものである。それは徹底的な
ものではなく、或いは本発明を開示された正確な形に限
定する趣旨のものではなく、明らかに上記開示に照らし
て多くの修正及び変化が可能である。これらの実施態様
は本発明の原理及び実際的応用を最良に説明することに
より当業者が本発明を各種実施態様において、又、考え
られる特別な用途に適した各種修正をもって最良に利用
できるように選ばれ、説明されたものである。本発明の
範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定されるも
のである。The following examples serve to illustrate the invention. The values of reagent concentration, temperature and other variable parameters are only illustrative of the present invention and should not be considered as limiting. Example 1. Preparation of an aminoalkyl phosphoramidite binder A general method for preparing an aminoalkyl phosphoramidite is disclosed below. Broadly speaking, the same operation was performed by Connolly at Nucleic Acids Research, Vol. 15, 3131
-3139 (1987) [Connolly, Nucleic Acides Researc
h, Vol. 15, pgs. 3131-3139 (1987)]. These compounds are useful for amino-derived oligonucleotides attached to a solid support. One group of aminoalkyl phosphoramidites useful in the present invention is defined by the following general formula: Wherein B 1 represents an acid-labile or base-labile amino protecting group that can be removed without cleaving the base-labile linking group between the solid support and the oligonucleotide. Such groups are described by Gulin in "Protective Groups in Organic Synthesizers".
is) ", (John Wiley & Sons, New York, 1981)
This is described in Chapter 7, and this section applies mutatis mutandis. Preferably, the base labile protecting group is a base labile amide and carbamate protecting group with that of the heterocycle nitrogen, or that of its precursor, preferably trihaloacetyl, acetoacetyl and fluorenylmethyl carbamate, especially 9
-Fluorenylmethyl carbamate and 9- (2-sulfo) -fluorenylmethyl carbamate and trifluoroacetyl. Preferred acid-labile protecting groups include underived trityl and its lower (containing 1 to 3 carbon atoms) alkoxy derivatives, especially 4-monomethoxytrityl. B 2 and B 3 each independently represent hydrogen, lower alkyl, lower substituted alkyl, especially halo-, cyano- or nitro-substituted lower alkyl, lower acyl, cyano, halo and nitro, more preferably B 2
And B 3 each independently represent hydrogen, lower alkyl, and lower haloalkyl, preferably B 2 and B 3 represent hydrogen. B 4 represents an alkyl containing up to 10 carbon atoms, alkenyl, aryl, aralkyl or cycloalkyl. More preferably, B 4 is lower alkyl; electron-extracted beta-substituted ethyl, especially beta-trihalomethyl-, beta-cyano-, especially beta-sulfo-, beta-nitro-substituted ethyl and the like; electron-substituted phenylethyl, especially halo. -, Sulfo-, cyano- or nitro-
Substituted phenyl; or electron-substituted substituted phenyl. Most preferably, B 4 is methyl, beta - represents cyanoethyl, or 4-nitrophenyl ethyl. The term "lower alkyl" as used in the present invention refers to straight and branched chain alkyl groups containing 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, t.
ert-butyl, isobutyl, sec-butyl, neopentyl,
tert-pentyl and the like. "Lower substituted alkyl" refers to lower alkyl having "electron withdrawing" substituents such as halo, cyano, nitro, sulfo or mono-, di-, or trihalomethyl. "Lower haloalkyl" refers to lower alkyl having one or more halogen atom substituents, usually fluoro, chloro, bromo or iodo. "Lower acyl" means that the non-double bond carbon is halo-,
Acyl containing 1 to 7 carbon atoms consisting of lower alkyl optionally having cyano or nitro substituents. "Electron abstraction" refers to the March, Advanced Organic Chemistry, 3rd edition [March, supra] which indicates that a substituent has a tendency to attract valence electrons of distant molecules, indicating that it is electronegative. Advanced Organic Che
mistry, Third Ed. (John Wiley, New York, 1985)
Year)〕. j is in the range of 2-10. R 'and R "each independently represent alkyl, aralkyl, cycloalkyl, and cycloalkylalkyl containing up to 10 carbon atoms. Preferably, R' and R" each independently represent lower alkyl; Preferably, when the phosphoramidites are used as a direct binder, R 'and R "are independently sterically hindered lower alkyls which increase the chemical stability of the phosphoramidites and thus their shelf life. Such sterically hindered lower alkyls include isopropyl, t-butyl, isobutyl, sec-butyl, neopentyl, tert-pentyl, isopentyl, sec-pentyl, etc. R 'and R "together have 5 in the main chain. And up to a total of 10 carbon atoms, the valence bonds at both ends of the chain being bound to the nitrogen atom to which R 'and R "are attached R 'and R "may form an alkyl chain, or may contain one or more additional heteroatoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur, together with the nitrogen atom to which they are attached. Form a ring. More preferably,
R 'and R "together with the nitrogen to which they are attached represent prolidino, morpholino or piperidino. Most preferably, R' and R" form morpholino with the nitrogen to which they are attached. Another group of aminoalkyl phosphoramidites used in the present invention are those defined by the following formula: Wherein B 1 , B 4 , R ′ and R ″ are as described above, and t is in the range of 0-8, s is in the range of 0-8,
However, s + t is in the range of 1 to 8). The aminoalkyl phosphoramidites of formulas II and II
A general method for synthesizing I comprises the following steps. Halo-substituted-N, N-di-substituted-0-substituted phosphines defined by the following general formula: Wherein X is a halogen, usually chlorine, and R ′, R ″ and B 4 are as defined above, with an amino-protected alcohol amine defined by the following general formula: (Wherein B 1 , B 2 and B 3 are as defined above) and dichloromethane containing a non-nucleophilic base absorbing the halogen acid released upon reaction, for example a trialkylamine such as N, N diisopropylethylamine In an aprotic solvent. Preferably, the reaction is performed under an inert atmosphere such as argon. Acidic conditions in the reaction should be avoided because the acid makes the phosphoramidite product amine reactive with the addition of protons. Non-nucleophilic bases reduce the potential for side reactions between the base and the activated phosphoramidites. After reacting the above substances, the reaction solution, hereinafter referred to as the first reaction solution, is washed with a mild basic solution to remove salts of non-nucleophilic bases. Finally, the first reaction solution is dried with, for example, MgSO 4 , Na 2 SO 4 or the like to obtain a protected aminoalkyl phosphoramidite. A. Preparation of Protected Aminoethyl Phosphoramidite Chloro-N, N-diisopropylaminomethoxyphosphine (5.0 ml, commercially available from Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) At 0 ° C. was stirred in dichloromethane (approx. N- in 40 ml)
(2-Hydroxyethyl) -2,2,2-trifluoroacetamide (3.9 g) and a solution of diisopropylethylamine (5.0 ml) were added dropwise. (N- (2-hydroxyethyl) -2,2,2-trifluoroacetamide was obtained from Lazarus and Benkovic in J. Am.
Chem. Soc. 101, 4300-4312 (1979). Synthesized according to the method disclosed in 50: ethyl trifluoroacetate (56.8 g, 0.4 mol) in 50 ml of chloroform.
To a stirred solution of 24.4 g (0.4 mol) ethanolamine in ml chloroform was added dropwise. The solution was stirred at room temperature for 5 hours, rotoevaporated to remove the solvent, and heated to 115 ° C (4.3
Distillation at Torr) gave 58.5 g of an oil which crystallized on scratching. ) After stirring at room temperature for 0.5 hour, the reaction solution was washed twice with 0.2 M potassium carbonate solution and once with brine, dried (Mg
SO 4 ) and concentrated under reduced pressure to give N- (2- (N ′, N′-diisopropylaminomethoxyphosphinyloxy) ethyl) -2,2,2-trifluoroacetamide as a colorless liquid ( 7.77g). 1 H-NMR (CD 2 Cl 2 ): δ 3.6 (6H, m), 3.4 (3H, d, J = 1)
2), 1.2 (12H, d, J = 6.5) 31 P-NMR (CD 2 Cl 2 , 1 H decoupling): δ149
(S) B. Preparation of Protected Aminopropylphosphoramidite Chloro-N, N-diisopropylaminomethoxyphosphine (3.7 ml) was added to N- (3- (3-methylaniline) in dichloromethane (about 20 ml) stirred at 0 ° C. under argon. (Hydroxypropyl) -2,2,2-trifluoroacetamide (2.9 g, 3
-Amino-1-propanol and ethyl trifluoroacetate by Lazarus and Benkovic to J. Amer.
hem. Soc. 101, 4300-4312 (1979)) and a stirred solution of diisopropylethylamine (3.7 ml). After stirring at room temperature for 3 hours, the reaction solution was poured into hexane (100 ml) and stirred. The mixture was allowed to settle, the supernatant was separated and concentrated under reduced pressure to give N- (3- (N ', N'-diisopropylaminomethoxyphosphinyloxy) propyl) -2,2,2-trifluoroacetate. The amide was obtained as a colorless liquid (5.2 g). 31 P-NMR (CH 2 Cl 2 , 1 H decoupling): δ149
(S) C. Amino Derivatization of Oligonucleotides with Aminoethyl Phosphoramidite After detritylation of the 5 'hydroxyl of the oligonucleotide bound to the solid support, the 9-fluorenylmethyl-protected aminoethyl phosphoramidite was phosphorylated. Added at a concentration of about 0.2M in a standard acetonitrile / tetrazole reaction solvent for phytotriester synthesis. This 9-
Fluorenylmethyl-protected aminoethyl phosphoramidites were prepared by Nucleic Acids Researc by Agrawal et al.
h), Vol. 14, p. 6227 (1986).
-Prepared as in Part A except that (2-hydroxyethyl) -2,2,2-trifluoroacetamide was replaced with N- (2-hydroxyethyl) -9-fluorenylmethylgalbamate did. This 9-fluorenylmethyl-
The protecting groups were removed at room temperature with a solution of 80: 20% (by volume) acetonitrile and piperidine. The above reaction is Applie
Performed on a standard automated DNA synthesizer such as d Biosystems model 380A. Example II. Synthesis of ROX-phosphoramidite 97.1 mg (0.158 mmol) of 5- and 6-carboxy-X
-Ethanolamine amide of rhodamine and 13.5 mg (0.
A mixture of (079 mmol) diisopropylammonium tetrazolide was purged with dry argon and diluted with 8 ml of dry (distilled from calcium hydride) acetonitrile.
0.40 g (1.53 mmol) of methoxy-bis- (diisopropylamino) phosphine was added and the solution was stirred at room temperature under argon. After 2 hours, the solution was washed four times with 7 ml portions of hexane, diluted to 200 ml with 0.5% triethylamine in chloroform, washed with 100 ml of 1: 1 brine: water, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated. Allowed to dry. The gummy solid was triturated with hexane and dried under high vacuum, and this procedure was repeated until a black, free-flowing solid was obtained, yielding 113 mg of ROX-5 and ROX-6-phosphoramidite. Example III Synthesis of TMR-phosphoramidite 61.4 mg (0.130 mmol) of a mixture of ethanolamine amide of 5- and 6-carboxyltetramethylrhodamine and a solution of 0.005 M diisopropylammonium tetrazolide (0.0013 mmol) in 0.26 ml of acetonitrile The combined, evaporated at <0.1 mm pressure, then purged with argon and diluted with 10 ml of dry (distilled from calcium hydride) acetonitrile. 0.22 g (0.840 mmol) of methoxy-bis- (diisopropylamino) phosphine was added and the solution was stirred at room temperature under nitrogen for 1.5 hours. The resulting reaction solution was washed 5 times with 5 ml portions of hexane, diluted to 100 ml with chloroform containing 0.5% triethylamine, and diluted with 60 ml.
Washed with 1: 1 brine: water, dried over sodium sulfate, filtered, rubbed with hexane and evaporated to dryness under high vacuum. This operation was repeated until a black, free-flowing solid was obtained, yielding 67.6 mg of TMR-5 and TMR-6-phosphoramidite. Example IV Cleavage and Deprotection of a Protected Nucleotide Linked to a Solid Support via Succinate with 1: 2: 1 Methanol: Water: t-Butylamine In this example, the protected 18-mer oligonucleotide was Ap
Synthesized by the phosphite triester method on a plied Biosystems model 380B DNA synthesizer. 1: 2: 1 each instead of the usual cleavage reagent, ammonium hydroxide
The cleavage reagent according to the invention of methanol: water: t-butylamine in the following ratio was used. The synthesizer was reprogrammed such that the solid support and the bound oligonucleotide in the reactor were sequentially exposed to the cleavage reagent for 1500 seconds (4 × 1500) at room temperature. The reaction vessel effluent was collected in a separate vessel and heated at 85 ° C. for 40 minutes for deprotection. The reaction solution was removed and the 18-mer was separated from the reaction solution by HPLC. After removal, the solid support was treated with concentrated ammonium hydroxide according to standard ABI model B cleavage methods. The reaction from this ammonium hydroxide cleavage was then analyzed by HPLC to determine if additional oligonucleotides had been removed from the solid support. A chromatographic comparison from the two reactions showed that 100% of the oligonucleotides were removed from the solid support by the first cleavage reaction. Identical oligonucleotides in 1: 2: 1 methanol: water:
The time of the cleavage step with the cleavage reagent of t-butylamine is
The synthesis was performed again in the same manner except that 4 × 900 seconds was used instead of 4 × 1500 seconds. HPLC analysis 71% in first cleavage reaction
Was cleaved. Example V 1: 1: 1 methanol: water of protected oligonucleotides attached to a solid support via succinate:
Cleavage and deprotection with t-butylamine Cleavage and deprotection in this example is performed by using a 1: 1: 1 cleavage reagent.
The same procedure as in Example IV was carried out on the same synthesizer except that methanol: water: t-butylamine was used in the following ratio. HPLC analysis indicated that about 80% of the oligonucleotides were cleaved from the solid support. Example VI Protected Oligonucleotide 2: 2: 1 Methanol: Water Attached to a Solid Support via Succinate:
Cleavage and deprotection with t-butylamine The cleavage and deprotection in this example was the same as Example IV on the same synthesizer except that the cleavage reagent was a 2: 2: 1 ratio of methanol: water: t-butylamine. Performed by the method.
HPLC analysis indicated that about 10% of the oligonucleotide was cleaved from the solid support. Example VII Solid Phase Synthesis of TMR- and ROX-Standardized Oligonucleotides and Cleavage and Deprotection with 1: 2: 1 Methanol: Water: t-Butylamine ROX and TMR Standardized Oligonucleotides Separately from Appl
Synthesized on an ied Biosystems model 380B automated DNA synthesizer. An equivalent DNA synthesizer using phosphite triester chemistry could also be used. Standardization is performed by combining either the ROX phosphoramidite or the TMR phosphoramidite with the 5 'hydroxy of the oligonucleotide bound to the solid support under conditions recommended by the manufacturer for conjugating the nucleoside phosphoramidite. This was achieved by reacting. Calsas etc. (Caru
thers et al), U.S. Patent No. 4,415,732, and Calzas et al. Genetic Engineering (Geneti
c Engineering), Volume 4, pages 1-17 (1982) is Applied Biosy
Gives a detailed description of the chemistry used by the stems model 380B synthesizer. Therefore, these documents
It applies mutatis mutandis for their explanation. ROX and TMR phosphoramidite were used as a 0.2 M acetonitrile solution in combination with a 0.5 M tetrazole / acetonitrile solution to form the active reagent in the synthesis cycle. Cleavage and deprotection were performed as in Example IV. The integrity of the ROX and TMR standardized oligonucleotides was confirmed by authentic sample comparison using HPLC, polyacrylamide gel electrophoresis and fluorescent dideoxy DNA sequencing. The disclosure of the preferred embodiment of the invention has been presented for the purposes of illustration and description. It is not exhaustive or intended to limit the invention to the precise form disclosed, and many modifications and variations are possible in light of the above disclosure. These embodiments best explain the principles and practical applications of the present invention to enable those skilled in the art to best utilize the invention in various embodiments and with various modifications appropriate to the particular application contemplated. Selected and explained. The scope of the present invention is defined by the appended claims.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティーブン ファング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト アドベ プレイ ス 420 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 21/00 C12N 15/10 C12N 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Stephen Fang United States of America 94306 Palo Alto Adobe Press 420 (58) Fields studied (Int. Cl. 6 , DB name) C07H 21/00 C12N 15/10 C12N 15 / 00 CA (STN) REGISTRY (STN) WPIDS (STN)
Claims (13)
塩基に不安定な結合基の切断方法であって、結合基が加
水分解するまで結合基を切断試薬に曝露する工程を含ん
でなり、切断試薬が低級アルキルアルコール、水、及び
３〜６個の炭素原子を有する非求核ヒンダードアルキル
アミンをそれぞれ約1:1:1乃至約1:3:1の容量比で含んで
なることを特徴とする方法。A method for cleaving a base-labile linking group between an oligonucleotide and a solid support, comprising exposing the linking group to a cleavage reagent until the linking group is hydrolyzed. Wherein the cleavage reagent comprises a lower alkyl alcohol, water, and a non-nucleophilic hindered alkylamine having 3 to 6 carbon atoms, each in a volume ratio of about 1: 1: 1 to about 1: 3: 1. A method characterized by the following.
エタノール及びプロパノールよりなる群から選ばれ、及
び該非求核ヒンダードアルキルアミンがイソプロピルア
ミン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジ
ン、ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミン、及びジ
プロピルアミンよりなる群から選ばれる特許請求の範囲
第１項記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the lower alkyl alcohol is methanol,
Claims wherein the non-nucleophilic hindered alkylamine is selected from the group consisting of ethanol and propanol, and wherein the non-nucleophilic hindered alkylamine is selected from the group consisting of isopropylamine, t-butylamine, diethylamine, piperidine, t-amylamine, diisopropylamine, and dipropylamine. The method of claim 1, wherein the method comprises:
求の範囲第２項記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein said linking group is a succinic ester.
チルアミンをそれぞれ約1:2:1の比で含んでなる特許請
求の範囲第３項記載の方法。4. The method of claim 3, wherein said cleavage reagent comprises methanol, water, and t-butylamine each in a ratio of about 1: 2: 1.
標識化されたオリゴヌクレオチド類の製法であって、下
記工程を含んでなることを特徴とする方法： 塩基に不安定な結合基により固相支持体に結合されたオ
リゴヌクレオチドを提供する工程； このオリゴヌクレオチドに１種以上のアンモニアに不安
定な基を結合してアンモニアに不安定な基で標識化され
たオリゴヌクレオチドを形成する工程；及び その塩基に不安定な結合基を切断試薬によりアンモニア
に不安定な基で標識化されたオリゴヌクレオチドが固相
支持体から遊離されるように切断する工程であって、 切断試薬が、低級アルキルアルコール、水、及び３〜６
個の炭素原子を含有する非求核ヒンダードアルキルアミ
ンをそれぞれ約1:1:1乃至約1:3:1の容量比で含んでなる
工程。5. A method for producing oligonucleotides labeled on a solid support with an ammonia-labile group, comprising the steps of: a base-labile bond. Providing an oligonucleotide bound to the solid support by a group; linking the oligonucleotide with one or more ammonia labile groups to form an oligonucleotide labeled with an ammonia labile group And cleaving the base-labile binding group with a cleavage reagent such that the oligonucleotide labeled with the ammonia-labile group is released from the solid support, wherein the cleavage reagent is , Lower alkyl alcohol, water, and 3-6
A non-nucleophilic hindered alkylamine containing carbon atoms in a volume ratio of about 1: 1: 1 to about 1: 3: 1, respectively.
オチドの３′水酸基と該固相支持体との間に共有結合を
形成する特許請求の範囲第５項に記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the base-labile linking group forms a covalent bond between the 3 'hydroxyl group of the oligonucleotide and the solid support.
ール、エタノール、及びプーパノールよりなる群から選
ばれ、（２）該非求核ヒンダードアルキルアミンがイソ
プロピルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、
ピペリジン、ｔ−アミルアミン、ジイソプロピルアミ
ン、及びジプロピルアミンよりなる群から選ばれ、およ
び（３）該塩基に不安定な結合基がコハク酸エステルで
ある特許請求の範囲第６項記載の方法。7. The method of claim 1, wherein (1) said lower alkyl alcohol is selected from the group consisting of methanol, ethanol, and propanol; and (2) said non-nucleophilic hindered alkylamine is isopropylamine, t-butylamine, diethylamine,
7. The method of claim 6, wherein the method is selected from the group consisting of piperidine, t-amylamine, diisopropylamine, and dipropylamine, and (3) the base-labile linking group is a succinate.
料分子に含まれる基である特許請求の範囲第７項記載の
方法。8. The method according to claim 7, wherein said ammonia-labile group is a group contained in a rhodamine dye molecule.
チルアミンをそれぞれ約1:2:1の比で含んでなる特許請
求の範囲第８項記載の方法。9. The method of claim 8 wherein said cleavage reagent comprises methanol, water, and t-butylamine each in a ratio of about 1: 2: 1.
のアンモニアに不安定な基を結合する該工程がローダミ
ンホスホルアミダイトを該オリゴヌクレオチドの５′ヒ
ドロキシルと反応させることを含む特許請求の範囲第８
項記載の方法。10. The method of claim 1 wherein the step of attaching one or more of the labile groups to the ammonia contained in the rhodamine dye molecule comprises reacting rhodamine phosphoramidite with the 5 'hydroxyl of the oligonucleotide. 8
The method described in the section.
染料分子に含まれる基である特許請求の範囲第５項記載
の方法。11. The method according to claim 5, wherein said ammonia-labile group is a group contained in a rhodamine dye molecule.
である特許請求の範囲第11項記載の方法。12. The method according to claim 11, wherein said rhodamine is tetramethylrhodamine.
請求の範囲第11項記載の方法。13. The method according to claim 11, wherein said rhodamine is rhodamine X.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US138,287 | 1987-12-24 | ||
| US07/138,287 US4965349A (en) | 1987-12-24 | 1987-12-24 | Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02796A JPH02796A (en) | 1990-01-05 |
| JP2787775B2 true JP2787775B2 (en) | 1998-08-20 |
Family
ID=22481345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63320745A Expired - Fee Related JP2787775B2 (en) | 1987-12-24 | 1988-12-21 | Method for synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia labile groups on solid support |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4965349A (en) |
| EP (2) | EP0323152B1 (en) |
| JP (1) | JP2787775B2 (en) |
| DE (2) | DE3853060T2 (en) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5231191A (en) * | 1987-12-24 | 1993-07-27 | Applied Biosystems, Inc. | Rhodamine phosphoramidite compounds |
| US4997928A (en) * | 1988-09-15 | 1991-03-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| US5262536A (en) * | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| US5366860A (en) * | 1989-09-29 | 1994-11-22 | Applied Biosystems, Inc. | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
| US5321131A (en) * | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
| US5316908A (en) * | 1990-07-13 | 1994-05-31 | Life Technologies, Inc. | Size markers for electrophoretic analysis of DNA |
| US5371241A (en) * | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
| US5573905A (en) * | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
| US5348868A (en) * | 1992-04-24 | 1994-09-20 | Beckman Instruments, Inc. | Methods and reagents for cleaving and deprotecting oligonucleotides |
| US5428148A (en) * | 1992-04-24 | 1995-06-27 | Beckman Instruments, Inc. | N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis |
| US5616700A (en) * | 1992-04-24 | 1997-04-01 | Beckman Instruments, Inc. | Processes for synthesizing nucleotides and modified nucleotides using N.sub. |
| US5643717A (en) * | 1992-12-16 | 1997-07-01 | Hybridon, Inc. | Substrate useful for separating modified oligonucleotides |
| US5627277A (en) * | 1992-12-16 | 1997-05-06 | Hybridon, Inc. | Method for analyzing oligonucleotide analogs |
| US5506103A (en) * | 1993-11-16 | 1996-04-09 | Hybridon, Inc. | Method for detecting charged oligonucleotides in biological fluids |
| EP0734457A1 (en) * | 1994-01-26 | 1996-10-02 | HYBRIDON, Inc. | Method of detecting sub-ppb levels of oligonucleotides in biological fluids |
| CA2215417A1 (en) * | 1995-03-15 | 1996-09-19 | City Of Hope | Disposable reagent storage and delivery cartridge |
| US6027890A (en) * | 1996-01-23 | 2000-02-22 | Rapigene, Inc. | Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays |
| US6312893B1 (en) | 1996-01-23 | 2001-11-06 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules |
| US6613508B1 (en) * | 1996-01-23 | 2003-09-02 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques |
| US5736626A (en) * | 1996-01-29 | 1998-04-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides |
| US6020481A (en) * | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
| US6080852A (en) | 1996-06-27 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | 4,7-dichlororhodamine dyes |
| US7550570B2 (en) * | 2000-05-25 | 2009-06-23 | Applied Biosystems, Llc. | 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides |
| US5874554A (en) * | 1996-12-13 | 1999-02-23 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Methods and solvent vehicles for reagent delivery in oligonucleotide synthesis using automated pulse jetting devices |
| US5760209A (en) * | 1997-03-03 | 1998-06-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Protecting group for synthesizing oligonucleotide analogs |
| US5902881A (en) | 1997-03-03 | 1999-05-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Reagent useful for synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs |
| US5756705A (en) * | 1997-03-05 | 1998-05-26 | Wang; Edge Renfeng | Method for labeling oligonucleotide with ammonia-sensitive ligands |
| US6054576A (en) * | 1997-10-02 | 2000-04-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of RNA |
| US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
| US6965041B1 (en) | 1999-03-24 | 2005-11-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
| ATE415409T1 (en) | 1999-05-24 | 2008-12-15 | Invitrogen Corp | A METHOD FOR DEPROTECTING LABELED OLIGONUCLEOTIDES |
| US6750357B1 (en) | 1999-06-25 | 2004-06-15 | Syngen, Inc. | Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents |
| US7019129B1 (en) | 2000-05-09 | 2006-03-28 | Biosearch Technologies, Inc. | Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer |
| DE60136715D1 (en) * | 2000-08-11 | 2009-01-08 | Nanogen Recognomics Gmbh | HYDRAZINE COMPONENTS AND HYDRATINE-MODIFIED BIOMOLECULES |
| US7101999B2 (en) | 2000-09-06 | 2006-09-05 | Evotec Ag | Oxazine derivatives |
| US6768005B2 (en) | 2000-12-20 | 2004-07-27 | Avecia Limited | Process |
| JP2004517089A (en) * | 2000-12-05 | 2004-06-10 | アベシア・リミテッド | Method for preparing phosphorothioate oligonucleotides |
| US6803200B2 (en) | 2000-12-12 | 2004-10-12 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for the release of nucleic acid molecules from solid matrices |
| US6664388B2 (en) | 2001-03-08 | 2003-12-16 | Applera Corporation | Reagents for oligonucleotide cleavage and deprotection |
| US7563618B2 (en) * | 2001-03-23 | 2009-07-21 | Geron Corporation | Oligonucleotide conjugates |
| AU2002245717A1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-10-08 | Geron Corporation | Oligonucleotide conjugates |
| US20030082547A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-05-01 | Ewing Gregory J. | Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays |
| US7355037B2 (en) | 2001-12-03 | 2008-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
| US20050165558A1 (en) * | 2002-02-26 | 2005-07-28 | Becker Robert G. | Sequence detection system calculator |
| US9809824B2 (en) | 2004-12-13 | 2017-11-07 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | CpG oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
| AU2007234451A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Atom Acquisition, Llc | Reagents useful for synthesizing rhodamine-labeled oligonucleotides |
| EP2036897B1 (en) * | 2007-09-04 | 2017-10-18 | Roche Diagnostics GmbH | Stable rhodamine labeling reagent |
| EP2268608A4 (en) | 2008-04-01 | 2012-01-11 | Biosearch Technologies Inc | Stabilized nucleic acid dark quencher-fluorophore probes |
| US9056885B2 (en) * | 2011-11-21 | 2015-06-16 | Promega Corporation | Carboxy X rhodamine analogs |
| CN111704644B (en) * | 2020-08-18 | 2020-12-04 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | Ammonolysis solution and ammonolysis method |
| CN114671921A (en) * | 2022-05-06 | 2022-06-28 | 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 | Large-scale oligonucleotide ammonolysis method |
| CN115850350A (en) * | 2022-12-22 | 2023-03-28 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | Ammonolysis solution and ammonolysis method |
| CN116102599A (en) * | 2022-12-29 | 2023-05-12 | 苏州梓熙生物科技有限公司 | Oligonucleotide ammonolysis method |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4415732A (en) * | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
| US4507433A (en) * | 1983-10-07 | 1985-03-26 | The Johns Hopkins University | Preparation of oligodeoxyribonucleoside alkyl or arylphosphonates |
| US4849513A (en) * | 1983-12-20 | 1989-07-18 | California Institute Of Technology | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups |
| SE466208B (en) * | 1983-12-20 | 1992-01-13 | California Inst Of Techn | SINGLE-STRENGTH AMINO DERIVATIVES OF OLIGON NUCLEOTIDES AND PROCEDURES FOR PRODUCING THEREOF |
| JPS622164A (en) * | 1985-06-25 | 1987-01-08 | シスカ・ダイアグノステイツクス・インコ−ポレ−テツド | Nucleic acid probe containing n4-(substituted amino) cytidine |
| US4659774A (en) * | 1985-11-01 | 1987-04-21 | American Hoechst Corporation | Support for solid-phase oligonucleotide synthesis |
| US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
| DE3642939A1 (en) * | 1986-06-03 | 1987-12-10 | Europ Lab Molekularbiolog | METHOD FOR DNA MARKING |
| EP0383803B1 (en) * | 1987-10-28 | 2000-05-03 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates |
-
1987
- 1987-12-24 US US07/138,287 patent/US4965349A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-21 JP JP63320745A patent/JP2787775B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-22 DE DE3853060T patent/DE3853060T2/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-22 DE DE3856481T patent/DE3856481T2/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-22 EP EP88312206A patent/EP0323152B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 EP EP94107016A patent/EP0617047B1/en not_active Revoked
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0323152A2 (en) | 1989-07-05 |
| EP0617047A1 (en) | 1994-09-28 |
| DE3853060D1 (en) | 1995-03-23 |
| DE3853060T2 (en) | 1995-10-19 |
| DE3856481D1 (en) | 2001-08-23 |
| EP0617047B1 (en) | 2001-07-18 |
| EP0323152B1 (en) | 1995-02-15 |
| JPH02796A (en) | 1990-01-05 |
| EP0323152A3 (en) | 1991-04-10 |
| US4965349A (en) | 1990-10-23 |
| DE3856481T2 (en) | 2002-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2787775B2 (en) | Method for synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia labile groups on solid support | |
| US5231191A (en) | Rhodamine phosphoramidite compounds | |
| US5367066A (en) | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites | |
| US5545730A (en) | Multifunctional nucleic acid monomer | |
| US5258506A (en) | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains | |
| KR101032008B1 (en) | Polynucleotide labelling reagent | |
| JP3081882B2 (en) | Orthogonal removal of hydroxyl protecting groups by reduction and their use in the chemical synthesis of oligonucleotides | |
| JPH01500748A (en) | Amino-derivatized phosphite and phosphate binders, phosphoramidite precursors and useful conjugates | |
| US5071974A (en) | Compositions and methods for the synthesis of oligonucleotides having 5'-phosphorylated termini | |
| JP2004507565A (en) | Linker phosphoramidites for oligonucleotide synthesis | |
| Tanaka et al. | Solid phase synthesis of oligoribonucleotides using the o-nitrobenzyl group for 2'-hydroxyl protection and H-phosphonate chemistry | |
| US5252760A (en) | Method of using colored phosphorylating reagents | |
| WO1986007362A1 (en) | Method for synthesizing deoxyoligonucleotides | |
| US7098326B2 (en) | Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides | |
| Hovinen et al. | Novel non-nucleosidic phosphoramidite building blocks for versatile functionalization of oligonucleotides at primary hydroxy groups | |
| US20030105056A1 (en) | Protected linker compounds | |
| JP2509863B2 (en) | Amino-derivatized polymer | |
| Kumar et al. | A new strategy for the synthesis of phosphorothioates of 2'-deoxyriboligonucleotides | |
| CA2088257A1 (en) | Incorporation of selectably clevable and/or abasic sites into oligonucleotide chains and reagents therefor | |
| JPH07165786A (en) | Uridines substituted at 5-position, its production and use thereof | |
| JPH07121954B2 (en) | Organophosphorus binders for the synthesis of amino-derivatized polymers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |